KR20000065202A - 유전자 글루탐산 탈수소효소, β­N­아세틸헥소사미니다제,γ­액틴의 프로모터 및 그의 사상균 발현, 분비 및 안티센스시스템에의 사용 - Google Patents

유전자 글루탐산 탈수소효소, β­N­아세틸헥소사미니다제,γ­액틴의 프로모터 및 그의 사상균 발현, 분비 및 안티센스시스템에의 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 글루탐산 탈수소효소, β-N-아세틸헥소사미니다제, γ-액틴의 프로모터 및 그의 사상균 발현, 분비 및 안티센스 시스템에의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 페니실륨 크리소게넘의 NADP-종속 글루탐산 탈수소효소(EC.1.4.1.4)(I)와, 페니실륨 크리소게넘의 β-N-아세틸헥소사미니다제(acetylhexosaminidase)(EC.3.3.1.52)(II)와, 그리고 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘의 γ-액틴(actin)(III)을 코드화시키는 유전자들의 프로모터들의 사용에 관한 것으로, 이러한 프로모터들은 페니실륨 크리소게넘, 아크레모늄 크리소게넘, 그리고 관련 종들 모두에 대해 유용한 강력한 발현 및 분비 벡터들의 구성을 위해 사용할 수 있다. 이 프로모터들은 또한 안티센스 구조를 통한 유전자 발현을 차단시키는 데 사용할 수 있다. 상기한 프로모터들의 제어 하에서 사상균내에서 다른 유전자들의 발현이 이루어지게 할 수 있고, 이에 따라 항생물질 및/또는 그에 고유적으로 존재하는 단백질의 생성을 증가시킬 수 있다.

Description

유전자 글루탐산 탈수소효소, β­Ｎ­아세틸헥소사미니다제, γ­액틴의 프로모터 및 그의 사상균 발현, 분비 및 안티센스 시스템에의 사용
페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘들은 페니실린 및 세팔로스포린(cepalosporin)을 생성할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 산업상 중요한 사상균들로서, 최근 10년간 이 두 미생물들에 적용할 수 있는 유전자 조작에 대한 개발이 상당수 있어 왔다. 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘들에 대한 유전자 조작 기술로는 플레오마이신(phleomycin) 저항 유전자(이하, "bleR유전자"라 칭함)(Kolar, M. 등등 (1988), Gene 62, 127-134)를 도태 마커(selection marker)로서 사용하는 벡터들에 의한 프로토플라스트의 형질 전환, 그리고 관심 있는 유전자들의 추가적인 완전한 복제체들에 대한 발현 및 문제의 유전자의 프로모토를 발현의 개선을 가능하게 하는 다른 프로모토로 교체시키게 하는 것을 들 수 있다. 페니실륨 크리소게넘 또는 아크레모늄 크리소게넘과 같은 균류에서의 상동 유전자들에 대한 발현은 음성적으로 조절 가능하지만 이성 유전자들의 경우는 그들의 프로모토를 상기한 균류로 부터 효과적으로 인식하기가 불가능할 수 있다. 이러한 문제점을 방지하기 위해서 종래에는 구성적으로 발현되고 바람직하게 그 발현에 의해 음성 이화 조절, 즉 소위 강력한 프로모토가 나타나지 않게 되어 있는 유전자들을 확인하여 그의 클론(clone)을 생성시켜 왔었다. 일반적으로, 고 발현 유전자들은 높은 전사레벨을 도모하고 주 세포대사에 포함되는 기능들과 관련하여 기본적인 역할을 하는 프로모토 영역에서 신호들을 갖는 것으로 여겨지고 있다. 이러한 유전자들로는 NADP-종속 글루탐산 탈수소효소(EC.1.4.1.4)(이하, "gdh 유전자"라 칭함), β-N-아세틸헥소사미니다제(acetylhexosaminidase)(EC.3.2.1.52)(이하, "hex 유전자"라 칭함), 그리고 γ-액틴(actin)(이하, "act 유전자"라 칭함)을 코드화시키는 유전자들을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 미생물들과는 다른 미생물들로 부터 얻은 gdh, hex, act 유전자들에 관한 문헌은 이미 다수가 있다. 가장 관련이 있는 서적목록으로는 첫째, 균 네우로스포라 크라싸(Neurospora crassa)의 gdh 유전자의 뉴클레오티드 서열(Kinnaird, J.H.와 Fincham, J.R.S. (1983), Gene 26, 253-260) 및 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의 gdhA 유전자의 발현 조절(Hawkins, A.R. 등등 (1989), Mol. Gen. Genet. 418, 105-111)과, 둘째, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 hexl 유전자의 클로닝(cloning) 및 발현(Cannon, R.D. 등등 (1994), J. Baceteriol. 2640-1647), 그리고 셋째, 아스퍼길러스 니둘란스의 act 유전자의 특징화(Fidel, S. 등등 (1988), Gene 70, 283-293)를 들 수 있다. 1992년도에 Cantwell, C.A. 등등은 pcbC 또는 penDE 유전자들의 프로모토들을 사용하여 페니실륨 크리소게넘형태의 이성 유전자들을 발현하는 것에 관한 논문을 발표하였다(Proc. R. Soc. London Ser. B 248, 283-289). 또한, β-이소프로필 말산 탈수소효소 유전자(일본 특허 공개 공보 제 80295/1989 호) 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 유전자(유럽 특허 출원 제 0376226A1/1989 호)의 프로모토들을 사용하여 아크레모늄 크리소게넘형태의 이성 유전자들을 발현하는 것에 관해서도 발표가 있었다.
바람직하지 않은 효소 활성을 배제시키기 위해서는 종종 산업 균주에서의 유전자 발현을 비활성화시키는 것이 필요하다. 대부분의 경우에는 많은 산업 균주들의 배수성 레벨때문에 직접적인 유전자 와해에 의한 발현 차단이 어렵고, 이 때문에 배수성 레벨과 무관하게 발현 비 활성화를 이루게 할 수 있는 시스템을 사용하는 것이 필요하다. 강력한 프로모토들의 제어 하에서 발현될 수 있는 안티센스 구조를 개발하면 유전자 발현의 와해가 가능해진다. 이러한 형태의 구조는 특히 산업 균주에 유용한데, 그 이유는 그러한 균주의 배수성 레벨(등등 (1992) Appl. Microbiol. Biotech. 36, 499-502)로는 완전한 유전자 비 활성화를 이루게 하기가 어렵기 때문이다. 효모에서의 효소 활성 차단을 위한 안티센스 구조의 사용(Atkins, D. 등등 (1994), Biol. Chem H-S 375, 721-729) 및 식물에서의 효소 활성 차단을 위한 안티센스 구조의 사용(Hamada, T. (1996), Transgenic Research 5, 115-121; John, M.E. (1996) Plant Mol. Biol. 30, 297-306)도 발표된 바 있다. hex 프로모토는 세포 외 단백질의 발현을 위해 사용 가능한 세포 외 효소에 대한 코드화의 특수한 특징을 가지고 있다.
그러나, 종래에는 본 발명에서 사용하는 사상균의 유전자 서열이나 그의 유전자 발현에 의해 합성된 효소의 유전자 서열을 설명하는 문헌이 전혀 없다. 또한, 유전자 발현, 분비, 또는 유전자 발현의 비 활성화를 위해 본 발명에서 설명하고 있는 균류의 유전자들의 강력한 프로모토들을 사용하는 것과 관련하여서도 종래에는 설명이 전혀 없다.
본 발명은 페니실륨 크리소게넘(Penicillium crysogenum)의 gdh 및 hex 유전자 및 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘(Acremonium crysogenum)의 act 유전자의 발현에 관련된 기술분야에 관한 것이다. 상기한 유전자들의 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 분석하면 번역개시부위(translation initiation site)를 포함하고, 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘 및 관련 종들 모두에 대해 유용한 강력한 발현 및 분비 벡터(vector)들을 구성하는데 사용할 수 있는 프로모토 영역의 존재를 추론할 수 있다. 이외에도, 상기한 프로모토들은 안티센스(anti-sense) 구성을 이용하여 유전자발현을 차단시키는 데 사용할 수 있다. 또한, 상기한 프로모토들에 의해 사상균 형태의 기타 유전자들의 발현을 조절하여 그러한 유전자내에 고유적으로 포함되는 항생물질 및/또는 단백질의 생성을 증가시키는 것이 가능하다.
도 1은 NADP-종속 글루탐산 탈수소효소 활성(EC.1.4.1.4)을 코드화시키는 페니실륨 크리소게넘의 gdh 유전자의 제한 지도.
도 2는 β-N-아세틸헥소사미니다제 효소 활성(EC.3.2.1.52)을 코드화시키는 페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자의 제한 지도.
도 3은 γ-액틴을 코드화시키는 페니실륨 크리소게넘의 act 유전자의 제한 지도.
도 4는 γ-액틴을 코드화시키는 아크레모늄 크리소게넘의 act 유전자의 제한 지도.
도 5는 프로모터 Pgdh하에서 페니실륨 크리소게넘 및/또는 아크레모늄 크리소게넘에서의 에스케리키아 콜리의 lacZ 유전자, 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자, 페니실륨 크리소게넘의 pahA 유전자의 안티센스 단편의 발현을 위한 벡터들을 도시하는 도면.
도 6은 프로모터 Phex, PactPc, PactAc하에서 페니실륨 크리소게넘 및/또는 아크레모늄 크리소게넘에서의 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자의 발현을 위한 벡터를 도시하는 도면.
서열목록
일반정보:
출원인:
성명: ANTIBIOTICOS, S.A.U.
가: Avda. de Burgos, 8-A
시: Madrid
주 또는 성: Madrid
국적: Spain
우편번호: 28036
전화번호: 91-3841200
펙스: 91-3841220
명칭: "유전자 글루탐산 탈수소효소, β-N-아세틸헥소사미니다제, γ-액틴의 프로모터 및 그의 사상균 발현, 분비 및 안티센스 시스템에의 사용"
서열 수:8
서신 주소:
기탁자: ANTIBIOTICOS, S.A.U.
가: Avda. de Burgos, 8-A
시: Madrid
주 또는 성: Madrid
국적: Spain
우편번호: 28036
컴퓨터 판독 형태:
매체 형태: 3.5" 디스크
컴퓨터: 퍼스널 컴퓨터
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법정 대리인에 관한 정보
성명: ALBERTO DE ELZABURU
등록 번호: 323/1
주소: Miguel Angel, 21
28010 - Madrid
통신 정보:
전화: 3085900
팩스: 3193810
텔렉스 또는 전자 메일: elzaburu@elzaburu.es
서열번호 1에 대한 정보
서열 특징
길이: 2816개 염기쌍
형태: 뉴클레오티드
가닥수: 2
토폴로지: 선형
분자 형태: 게놈 DNA
가상(hypothetical): 없음
안티센스: 없음
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
직접 공급원: 플라스미드 pALP784, pALP785
게놈내 위치: 불명
특징:
이름/키: 코드화 서열
위치: 연결(922...970, 1131...1261, 1319...2521)
특징:
이름/키: 인트론
위치: 971...1130
특징:
이름/키: 인트론
위치:1262...1318
특징:
기타 정보: gdh 유전자
서열번호 2에 대한 정보
서열 특징
길이: 5240개 염기쌍
형태: 뉴클레오티드
가닥수: 2
토폴로지: 선형
분자 형태: 게놈 DNA
가상: 없음
안티센스: 없음
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
직접 공급원: 플라스미드 pALP295, pALP388
게놈내 위치: 불명
특징:
이름/키: 코드화 서열
위치: 1324...3111
특징:
기타 정보: hex 유전자
서열번호 3에 대한 정보
서열 특징
길이: 2994개 염기쌍
형태: 뉴클레오티드
가닥수: 2
토폴로지: 선형
분자 형태: 게놈 DNA
가상: 없음
안티센스: 없음
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
직접 공급원: 플라스미드 pALP315, pALP316
게놈내 위치: 불명
특징:
이름/키: 코드화 서열
위치: 연결(494...500, 617...647, 846...901, 1047...1077, 1181...1952, 2202...2249)
특징:
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위치: 501...616
특징:
이름/키: 인트론
위치: 648...845
특징:
이름/키: 인트론
위치: 902...1046
특징:
이름/키: 인트론
위치: 1078...1180
특징:
이름/키: 인트론
위치: 1953...2021
특징:
기타 정보: act 유전자
서열번호 4에 대한 정보
서열 특징
길이: 3240개 염기쌍
형태: 뉴클레오티드
가닥수: 2
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분자 형태: 게놈 DNA
가상: 없음
안티센스: 없음
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
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특징:
이름/키: 코드화 서열
위치: 연결(787...793, 921...951, 1124...1179, 1290...1320, 1411...2182, 2250...2477)
특징:
이름/키: 인트론
위치: 794...920
특징:
이름/키: 인트론
위치:925...1123
특징:
이름/키: 인트론
위치:1180...1289
특징:
이름/키: 인트론
위치:1321...1410
특징:
이름/키: 인트론
위치:2183...2249
특징:
기타 정보: act 유전자
서열번호 5에 대한 정보
서열 특징
길이: 461개 아미노산
형태: 아미노산
가닥수: 1
토폴로지: 선형
분자 형태: 펩티드
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
특징:
기타 정보: 49837 Da의 분자량을 갖는 글루탐산 탈수소효소(EC.1.4.1.4)의 아미노산 서열
서열번호 6에 대한 정보
서열 특징
길이: 596개 아미노산
형태: 아미노산
가닥수: 1
토폴로지: 선형
분자 형태: 펩티드
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
특징:
기타 정보: 66545 Da의 분자량을 갖는 β-N-아세틸헥소사미니다제 효소(EC.3.2.1.52)의 아미노산 서열
서열번호 7에 대한 정보
서열 특징
길이: 375개 아미노산
형태: 아미노산
가닥수: 1
토폴로지: 선형
분자 형태: 펩티드
원 공급원: 페니시륨 크리소게넘
특징:
기타 정보: 41760 Da의 분자량을 갖는 γ-액틴 단백질의 아미노산 서열
서열번호 8에 대한 정보
서열 특징
길이: 375개 아미노산
형태: 아미노산
가닥수: 1
토폴로지: 선형
분자 형태: 펩티드
원 공급원: 아크레모늄 크리소게넘
특징:
기타 정보: 41612 Da의 분자량을 갖는 γ-액틴 단백질의 아미노산 서열
소정의 유전자들을 과 발현하기 위해 강력한 프로모토들을 사용하면 페니실린 또는 세팔로스포린의 생성에 개선이 이루어질 수 있고, 또한 세팔로스포린으로부터 유도된 새로운 항생물질의 합성이 가능하게 된다.
본 발명은 강력한 프로모토들의 제어 하에서 상동 유전자 또는 이성 유전자들을 발현할 수 있는 능력을 가지고 있는 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘의 균주들을 얻기 위한 신규의 공정을 설명하고 있다. 본 발명에서는 페니실륨 크리소게넘의 NADP-종속 글루탐산 탈수소효소(EC.1.4.1.4), 즉, gdh 유전자와, 페니실륨 크리소게넘의 β-N-아세틸헥소사미니다제(EC.3.2.1.52), 즉, hex 유전자와, 그리고 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘의 γ-액틴, 즉, act 유전자를 코드화시키는 유전자들에 상응하는 프로모토들의 특징화 및 후속 사용에 관해 설명하고 있다. 상기한 균주들에서의 페니실린 및/또는 세팔로스포린의 생합성에 관련된 유전자들의 과 발현을 위해 상기 프로모토들을 사용하는 것이 본 발명의 목적 중 하나다. 이러한 프로모토들은 또한 안티센스 구조에 의해 유전자 발현을 차단하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 핵산공여체로서의 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘에 근거를 두고 있다. 본 발명에 있어서는 일단 게놈 DNA를 정제한 후 두 미생물들의 DNA 라이브러리들을 실시예 1 및 실시예 4에서와 같이 구성하고, 그들을 (I) 페니실륨 크리소게넘의 상동 유전자에 대한 클론을 생성시키기 위해 네우로스포라 크라싸의 gdh 유전자에 상응하는 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, (II) 페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자에 대한 클론을 생성시키기 위해 효소 β-N-아세틸헥소사미니다제의 아미노말단 서열을 근거로 하여 합성된 올리고뉴클레오티디들의 조합을 사용하여, 그리고 (III) 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘의 상동 유전자들에 대한 클론을 생성시키기 위해 아스퍼길러스 니둘란스의 act 유전자의 단편을 사용하여 스크리닝(screening)하였다. 그 뒤에, 양성 하이브리디제이션(hybridization)을 발생시킬 수 있는 능력에 의해 정제된 상기 클론들을 대응 프로브(probe)를 사용하여 분석하여 원하는 유전자들의 존재여부를 결정하였다.
페니실륨 크리소게넘의 gdh 유전자는 7.2 kb의 EcoRI 단편에서 그리고 2.9 kb 및 1.5 kb의 두 BamHI 단편들에서 각기 확인되었다. 도1에는 이 페니실륨 크리소게넘의 gdh 유전자를 포함하는 DNA 영역에 대한 제한 지도가 도시되어 있다. 그 뒤에, 2,816 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)을 결정하였다. 이 뉴클레오티드 서열은 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)를 포함하고 있는데, 이에 있어 ATG 번역 개시 코돈은 922번째 위치에 있었으며, TAA 번역 종결 코돈은 2,522번째 위치에 있었다. 또한, 971 내지 1,130번째의 위치들 사이에서 그리고 1,262 내지 1,318번째의 위치들 사이에서 각기 159 bp 및 56 bp의 두 인트론(intron)들의 존재 여부를 결정하였다. 상기 오픈 리딩 프레임은 6.18의 등전위점에서 49,837 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 461 아미노산 서열(서열번호 5)은 네우로스포라 크라싸의 NADP-종속 글루탐산 탈수소효소의 아미노산 서열에 대해 72.4%의 동일성을 가지고 있다. 프로모토 영역에는 고 발현된 유전자들에서 나타나는 피리미딘 농후 영역들과, 두개의 추정 TATA 박스(이 박스는 전사 개시 부위의 상류측에서 30 내지 50 bp의 균들의 소정의 프로모토들에서 발견됨)(Davis, M.A.와 Hynes, M.J. (1991), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, California)들과, 하나의 CCAAT 박스(이 박스는 전사 개시 부위의 상류측에서 50 내지 200 bp의 진핵성 유전자들의 프로모토들의 약 30%에서 발견됨)(Bucher, P. (1990), J. Mol. Biol. 212: 563-578)가 존재한다. 그 뒤에, 이 프로모토를 사용하여 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘에서 β-글락토시다제(galactosidase)를 코드화시키는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 유전자(이하, "lacZ 유전자"라 칭함)와 에스. 힌더스타너스(S. hindustanus)의 bleR유전자를 발현시켰다. 이러한 목적을 위해 실시예 1에서와 같이 플라스미드(plasmid) pSKGSu와 pALfleo7(도5)을 구성하였다. 얻어진 결과에 따르면 gdh 프로모토(이하, "Pgdh"라 칭함)가 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘에서 모두 그리고 또한 에스케리키아 콜리에서 이성 lacZ 및 bleR유전자들의 발현을 제어할 수 있다는 점을 추론할 수 있다.
강력한 프로모토들의 제어 하에서 발현되는 안티센스 구조들의 개발에 따라 유전자 발현에 대한 방해가 가능하게 된다. 이러한 목적을 위해 실시예 1의 1.3절에서 설명하는 바와 같이 플라스미드 pALP888(도 5)을 구성하였다. 얻어진 결과에 따르면 Pgdh를 사용하면 안티센스 구조들의 사용에 의한 페니실륨 크리소게넘에서의 바람직하지 않은 효소 활성을 전체적으로 또는 부분적으로 차단할 수 있는 가능성이 있다는 것을 확인할 수 있다.
페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자는 3.2 kb 의 SacI 단편 및 2.1 kb의 SalI 단편에서 확인되었다. 도2에는 hex 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다. 그 뒤에, 5,240 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)을 결정하여 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 가지고 있고 하나가 상기 hex 유전자와 매치(match)되어 있는 두개의 오픈 리딩 프레임의 존재를 확인하였다. 상기 hex 유전자의 ATG 번역 개시 코돈은 1,324번째 위치에 있었으며, TGA 번역 종결 코돈은 3,112번째 위치에 있었다. 상기 오픈 리딩 프레임은 인트론을 가지고 있지 않으며, 5.34의 등전위점에서 66,545 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 461 아미노산 서열(서열번호 6)dms 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 β-N-아세틸헥소사미니다제 효소의 아미노산 서열에 대해 49.0%의 동일성을 가지고 있다. 또한, 추론된 아미노산 서열은 19 내지 40번째의 위치들에서 그리고 99 내지 120번째의 위치들에서 정제된 효소로 부터 화학적으로 결정된 폴리펩티드(polypeptide)들을 포함한다. 프로모토 영역에는 두개의 피리미딘 농후 영역들과, 하나의 추정 TATA 박스와, 하나의 CAAT 박스가 존재한다. 그 뒤에, 이 프로모토를 사용하여 페니실륨 크리소게넘에서 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자를 발현시켰다. 이러한 목적을 위해 실시예 2에서와 같이 플라스미드 pALP480(도6)을 구성하였다. 얻어진 결과에 따르면 hex 프로모토가 페니실륨 크리소게넘에서의 bleR유전자들의 발현을 제어할 수 있다는 점을 추론할 수 있다. 또한, 그 뒤에 효소 β-N-아세틸헥소사미니다제가 페니실륨 크리소게넘에 의해 배지에 충분히 분비되는 단백질이라는 점에 따라 hex 유전자를 페니실륨 크리소게넘 또는 관련 사상균에서의 상동 또는 이성 단백질의 발현 및 분비를 위해 사용하는 것이 가능하다. 발현될 유전자들은 해독틀에서 hex 유전자의 분비 신호 서열을 포함하는 프로모토 영역과 유합되거나, 아니면 해독틀에서 완전 hex 유전자와 유합될 수 있다.
페니실륨 크리소게넘의 act 유전자(이하, "actPc"라 칭함)는 5.2 kb 의 BamHI 단편과, 4.9 kb의 EcoRI 단편과, 5.9 kb의 HindIII 단편에서 확인되었다. 도3에는 actPc 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다. 그 뒤에, 2,994 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 결정하여 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임의 존재여부를 확인하였다. 이에 있어 ATG 번역 개시 코돈은 494번째 위치에 있었으며, TAA 번역 종결 코돈은 2,250번째 위치에 있었다. 상기 오픈 리딩 프레임은 5개의 인트론을 가지고 있으며, 5.51의 등전위점에서 41,760 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 375 아미노산 서열(서열번호 7)은 아스퍼길러스 니둘란스의 γ-액틴 단백질의 아미노산 서열에 대해 98.1%의 동일성을 가지고 있다. 또한, 프로모토 영역에는 두개의 피리미딘 농후 영역들과, 하나의 추론 TATA 박스와, 4개의 CAAT 박스들이 존재한다. 그 뒤에 이 프로모토를 사용하여 페니실륨 크리소게넘에서 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자를 발현시켰다. 이러한 목적을 위해 실시예 3에서와 같이 플라스미드 pALPfleo1(도6)을 구성하였다. 얻어진 결과에 따르면 페니실륨 크리소게넘의 act 프로모토가 페니실륨 크리소게넘에서의 이성 bleR유전자들의 발현을 제어할 수 있다는 점을 추론할 수 있다.
아크레모늄 크리소게넘의 act 유전자(이하, "actAc"라 칭함)는 2.4 kb 및 1.1 kb 의 SalI 단편과, 3.9 kb의 SmaI 단편과, 8.7 kb의 HindIII 단편에서 확인되었다. 도4에는 actAc 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다. 그 뒤에, 3,240 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 결정하여 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임의 존재여부를 확인하였다. 이에 있어 ATG 번역 개시 코돈은 787번째 위치에 있었으며, TAA 번역 종결 코돈은 2,478번째 위치에 있었다. 상기 오픈 리딩 프레임은 5개의 인트론을 가지고 있으며, 5.51의 등전위점에서 41,612 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 375 아미노산 서열(서열번호 8)은 아스퍼길러스 니둘란스 및 페니실륨 크리소게넘의 γ-액틴 단백질들에 대응하는 아미노산 서열에 대해 각기 98.4% 및 98.1%의 동일성을 가지고 있다. 또한, 프로모토 영역에는 피리미딘 농후 영역들과, 하나의 CAAT 박스가 존재하며, TATA 박스의 존재는 관찰되지 않는다. 그 뒤에 이 프로모토를 사용하여 아크레모늄 크리소게넘에서 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자를 발현시켰다. 이러한 목적을 위해 실시예 4에서와 같이 플라스미드 pALCfleo1(도6)을 구성하였다. 얻어진 결과에 따르면 아크레모늄 크리소게넘 act 프로모토(이하, "PactAc"라 칭함)가 아크레모늄 크리소게넘에서의 이성 bleR유전자들의 발현을 제어할 수 있다는 점을 추론할 수 있다.
모든 경우, 페니실륨 크리소게넘 또는 아크레모늄 크리소게넘에서의 이성 유전자의 발현은 정확한 해독틀에서 상기 유전자를 유합시킴으로써 이루어졌다. 비록 lacZ 및 bleR유전자들을 예를 들어 발현시켰으나, pcbAB(α-아미노아디필(aminoadipyl)-시스테이닐(cysteinyl)-발린(valine) 합성효소), pcbC(이소페니실린(isopehicillin) N 합성효소), penDE(아실(acyl)-CoA: 6-APA 아실트란스페라제(acyltransferase)), pcl(페닐아세틸-CoA 리가제(ligase)) 등등과 같은 페니실린의 생합성에 포함되는 효소들과, pcbAB(α-아미노아디필-시스테이닐-발린 합성효소), pcbC(이소페니실린 N 합성효소), cefD(이소페니실린 N 이성질화효소), cefEF(드아세톡시세팔로스포린(deacetoxycephalosporin) C 합성효소/히드록시화효소), cefG(드아세톡시세팔로스포린 아세틸트란스페라제) 등등과 같은 세팔로스포린의 생합성에 포함되는 효소들을 코드화시키는 유전자들을 상기한 바와 동일한 방식으로 발현시키는 것이 가능할 것이다. 발현시킬 유전자는 여러가지 방법을 사용하여, 즉, 염색체 DNA로부터의 격리방법, mRNA로부터의 cDNA 합성 방법, 화학적인 합성방법 등등을 사용하여 얻은 것일 수 있다. 정확한 프로모토-유전자 간 유합을 위한 기본적인 방법은 Sambrook, J. 등등의 "Molecular Cloning"("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼)(1989) 및 Ausubel 등등의 "Current Protocols in Molecular Biology"(John Wiley & Sons, New York, USA)(1987)에 기재되어 있다.
페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘을 숙주 균주로서 사용하였으나, 이들로부터 유도된 여하한 관련 균주 또는 돌연변이 균주를 사용할 수도 있다. 프로토플라스트의 생성 및 페니실륨 크리소게넘의 형질 전환을 위해 사용된 방법은 Cantoral 등등(Biotechnology 5: 494-497)(1987) 및등등(Curr. Genet. 12: 277-282)(1987)에 기재된 방법들을 기초로 한 것으로, 실시예 1에 기재되어 있다. 숙주균주의 생성 및 아크레모늄 크리소게넘의 형질 전환은 실시예 4에 기재되어 있다. 상기 두 경우 모두 도태 마커로서 항생 플레오마이신 및 각기 Pgdh, Phex, PactPc 및 PactAc의 제어 하에서 발현된 bleR유전자의 담체들인 pALfleo7, pALP480, pALPfleo1 또는 pALCfleo1과 같은 플라스미드를 사용하였다. 그러나, 형질 전환 균주들을 그렇지 않은 다른 균주들로부터 선택적으로 분리할 수 있는 것이면 어떠한 마커를 사용하는 것도 가능할 것이다.
형질 전환체는 서로 동화가능한 탄소 및 질소 공급원들을 함유하는 배지에서 성장될 수 있을 것이다. 탄소 공급원의 예로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 녹말, 글리세린, 유기산, 알콜, 지방산 등등의 단독 또는 조합을 들 수 있다. 질소 공급원의 예로는 펩톤, 맥아 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 글루텐, 요소, 암모늄 염, 질화물, NZ-아민, 황산 암모늄 등등의 단독 또는 조합을 들 수 있다. 배지의 성분으로서 사용할 수 있는 무기 염으로는 인산염(일례로, 인산 칼륨), 황산염(일례로, 황산 나트륨), 염화물(일례로, 염화 마그네슘) 등등을 들 수 있고, 철, 마그네슘, 칼슘, 망간, 코발트 등등을 이온으로서 사용할 수 있다. 배양온도, 배지의 pH, 통기, 배양시간 등등과 같은 배양조건은 사용되는 균주에 따라 선택 및 조절되어야만 한다. 그러나, 일반적으로 발효는 20℃ 내지 30℃의 온도, 5 내지 9의 pH, 그리고 통기 상태에서 4일 내지 14일간 행하게 된다.
요약해 보면 본 발명은 페니실륨 크리소게넘의 gdh, hex, act 유전자들과 아크레모늄 크리소게넘의 act 유전자의 프로모토들을 포함하는 DNA 단편들(I)과, 상기 프로모토들을 병합시키는 플라스미드들 및 그들의 번역 개시 부위들(II)과, 상기 프로모토들의 제어 하에서 상동 또는 이성 구조 유전자 또는 안티센스 DNA 단편이 위치되는 플라스미드들(III)과, 상기 플라스미드들에 의해 형질 전환된 페니실륨 크리소게넘 또는 아크레모늄 크리소게넘 균주들(IV)과, 상기 프로모토의 제어 하에서 상기 플라스미드에 위치된 상기 구조 유전자 또는 안티센스 DNA를 발현시킬 수 있는 형질 전환 균주(VI)와, Phex의 제어 하에서 상동 또는 이성 세포 외 단백질을 분비할 수 있는 형질 전환 균주(VII)를 포함한다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예들을 통해 구체적으로 설명하겠으나, 본 발명의 범위가 그러한 실시예들로 국한되는 것은 아니다.
(실시예 1)
1.1 페니실륨 크리소게넘의 gdh 유전자의 클로닝 및 특징화
페니실륨 크리소게넘의 gdh 유전자를 클로닝시킬 목적으로 소정의 확립된 방법들(Sambrook, J. 등등의 "Molecular Cloning"("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼)(1989))을 사용하여 파지(phage) 벡터 λGEM12에 DNA 라이브러리를 구성하였다. 이를 위해 상기 균(Barredo 등등의 스페인 특허 제 P9400931 호(1994)에 개재된 방법에 의해 정제된)의 전체 DNA를 Sau3AI로 부분적으로 분해시키고, 약 20 kb의 단편들을 소정의 수크로스 구배(10-40%)로 정제하였다. 이 단편들을 이미 BamHI로 분해되어 있고 정제되어 있는 상기 벡터의 아암(arm)들과 결찰시킨 후, Gigapack II Gold(Stratagene) 시스템을 사용하여 그 제조자의 지침에 따라 비트로(vitro)에 패캐징시켰다. 존재하는 파지들의 수를 적정(titration)할 수 있도록 에스케리키아 콜리 LE392의 감염을 이루게 하기 위해 그리고 재조합 파지들의 퍼센트를 결정할 목적으로 에스케리키아 콜리 NM539의 감염을 이루게 하게 위해 패캐징 반응물을 500 ㎕의 SM에 재현탁시킨 상태에서 이용하였다. 에스케리키아 콜리 NM539는 파지 P2의 용원성 균주로서 그를 감염시키는 파지가 없어도 무방한 중앙 영역이 결여된 경우 단지 용균반만을 생성시킨다. 에스케리키아 콜리 LE392에서는 파지 적정량이 132 pfu/㎕(총 66,000 pfu)였으며, 에스케리키아 콜리 NM539에서는 파지 적정량이 113 pfu/㎕(총 56,500 pfu)였다. 이는 파지들중 약 85%가 외생 DNA 인서트(insert)를 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다. 완전한 DNA 라이브러리를 만드는데 필요한 재조합 파지들의 수는 방정식: N=ln(l-p)/ln(l-f)(여기서, "p"는 요구되는 확률을 나타내고, "f"는 재조합체에 포함되는 선택 유기체의 게놈의 비율을 나타내고, "N"은 필요한 재조합체의 수를 나타낸다)을 사용하여 계산하였다. 페니실륨 크리소게넘의 게놈이 약 30,000 kb만큼 포함되었다고 가정(Fierro 등등의 Mol. Gen. Genet. 241: 573-578(1993))하고, 또한 패캐징된 인서트들의 평균이 18 kb라고 가정(20 kb부근의 크기들이 선택된 사실에 불구하고)했을 때 얻어진 재조합 파지들의 수가 99.999%의 확률을 갖는 페니실륨 크리소게넘 DNA 라이브러리가 얻어졌다. 이러한 일련의 이론적인 검증들을 행한 후 에스케리키아 콜리 NM539의 감염을 행하고, 150 mm 직경을 갖는 5개의 페트리 디쉬(Petri dish)들 상에 완전한 DNA 라이브러리를 확산배양시켰으며(페트리 디쉬당 약 11,300 pfu), 50 ㎖의 SM과 2.5 ㎖의 클로로포름에 수집하여 4℃로 유지시켰다. 이러한 방식으로 언제든지 떠낼(plate-out) 준비가 된 충분하고 전형적인 볼륨(volume)의 재조합 파지들(5,300 pfu/㎕)를 얻을 수 있었다.
150 mm 직경을 갖는 3개의 페트리 디쉬들 상에 약 60,000 pfu를 확산배양시킨 후 니트로셀룰로스 필터(BA85, 0.45 ㎛, Schleicher & Schuell)들로 이전시켰다. 그 뒤에 상기 필터들을 표준 프로토콜들(Sambrook, J. 등등의 "Molecular Cloning"("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼)(1989))을 사용하여 네우로스포라 크라싸의 gdh 유전자에 상응하는 합성 올리고뉴클레오티드들과 하이브리디제이션시켰다. 2차 및 3차 하이브리디제이션 사이클을 거쳐 총 10개의 양성 클론들을 정제시킨 후, 그들의 DNA를 일련의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 분해시켜 서던 블로트(Southern blot) 기술에 의해 분석하였다. 이러한 방식으로 7.2 kb의 EcoRI 단편 및 각기 2.9 kb 및 1.5 kb의 두 BamHI 단편들에서 gdh 유전자를 확인하였다. 플라스미드인 pBluescript I KS (+)(Stratagene) 및 pUC13에서 상응하는 서브 클로닝(sub-cloning)을 행한 후, gdh 유전자를 포함하는 2.9 kb의 Sau3AI-XbaI 단편의 두 정위(orientation)를 매치시키는 플라스미드 pALP784와 pALP785를 구성하였다. 도1에는 상기 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다.
gdh 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정할 목적으로 "염기 소거"방법(Promega)을 사용하여 플라스미드 pALP784와 pALP785로 부터 일련의 클론들을 구성하고, 그 뒤에 두 경우 모두 "시퀘나제(Sequenase)" 시험 키트(kit)(USB)를 이용하는 디디옥시뉴클레오티드 방법을 사용하여 제조자의 지침에 따라 서열을 결정하였다. 얻어진 2,816 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)를 제네플로트(Geneplot) 프로그램(DNASTAR)을 사용하여 분석한 결과, 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임의 존재를 확인하였다. ATG 번역 개시 코돈은 922번째 위치에 있었으며, TAA 번역 종결 코돈은 2,522번째 위치에 있었다. 또한, 971 내지 1,130번째의 위치들 사이에서 그리고 1,262 내지 1,318번째의 위치들 사이에서 각기 159 bp 및 56 bp의 두 인트론들의 존재를 확인하였다. 상기 오픈 리딩 프레임은 6.18의 등전위점에서 49,837 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 461 아미노산 서열(서열번호 5)는 네우로스포라 크라싸의 NADP-종속 글루탐산 탈수소효소의 아미노산 서열에 대해 72.4%의 동일성을 가지고 있다.
프로모토 영역에는 다양한 피리미딘 농후 영역들이 존재하는데, 특히 가장 큰 피리미딘 농후 영역은 766번째 위치 내지 796번째 위치사이에 존재한다. 이러한 영역들은 고 발현된 유전자들에서 나타나며, 전사 개시 부위의 바로 상류측에 위치한다. 이 외에도, 752번째 위치(이 경우, TATATAATT)와 852번째 위치(이 경우, TATAATTT)에 두개의 위치 추정 TATA 박스들(그들의 균내 공통서열은 TATAAA이다)이 존재한다. 이 TATA 박스들은 전사 개시 부위의 상류측에서 30 내지 50 bp의 균들에 존재하고, 이에 따라 진정한 TATA 박스는 752번째 위치, 즉, 전사 개시 부위의 상류측에서 42 bp에 존재할 가능성이 가장 크다. 전사 개시 부위의 상류측에서 50 내지 200 bp사이에 위치되는, 공지의 진핵성 유전자들의 30%의 프로모토 영역에는 서열 CCAAT가 존재한다. 이 CCAAT 박스는 gdh 유전자, 즉, 추정가능한 전사 개시 부위의 상류측에서 약 105 bp에 있는 프로모토 영역내의 691번째 위치에 존재한다.
1.2. gdh 프로모토하에서의 페니실륨 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘의 제어 유전자들의 발현
페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘의 형질 전환체들의 형질 전환 및 도태 공정을 항생 플레오마이신에 대한 저항에 따라 하기와 같이 행하였다. 이를 위해서는 5.4 kb의 크기를 가지고 있고, Pgdh의 제어 하에서 발현된 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자를 균의 마커로서 가지고 있고, 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항 유전자를 에스케리키아 콜리의 마커로서 가지고 있고, 플라스미드 pBC KS (+)(Stratagene)의 폴리링커(polylinker)를 가지고 있는 플라스미드 pALfleo7을 구성하는 것이 필요하였다.
프로토플라스트의 제조 및 페니실륨 크리소게넘의 형질 전환을 위해 사용한 방법은 1987년도에 Cantoral 등등(Biotechnology 5: 494-497) 및등등(Curr. Genet. 12: 277-282)에 의해 발표된 것이었다. 먼저, 페니실륨 크리소게넘을 PM이 한정된 배지(, J., (1997), Agricultura 25)에서 10%의 효모 추출물을 첨가한 상태에서 그리고 25℃에서 18 내지 21시간동안 성장시키고, 나일론 필터를 사용한 여과 공정에 의해 균사체를 회수한 후 3 내지 5 볼륨의 0.9% NaCl을 사용하여 세척하였다. 여과지사이의 균사체를 건조시킨 후 프로토플라스트 완충액에 재현탁(100 mg/㎖)시켰다. 미셀(micell) 현탁액이 균질한 것으로 판단되면 프로토플라스트 완충액내에서 4 mg/㎖의 농도를 갖는 소정 볼륨의 케일라자(Caylasa) 용액(Cayla)을 상기 현탁액에 첨가한 후 25℃에서 100 r.p.m.의 속도로 교반을 행하면서 3시간동안 배양을 행하였다. 이러한 상태에서 프로토플라스트들의 외관을 현미경으로 관찰하였다. 대부분의 프로토플라스트들이 방출된 후 30㎛의 구멍들을 갖는 나일론 필터를 사용한 여과공정에 의해 상기 프로토플라스트들을 균사체로부터 분리시켰다. 그 뒤에 프로토플라스트 현탁액을 0.7 M KCl을 사용하여 3회 세척하고, 세척공정들 사이에 400xg에서 3분간 원심분리공정을 행하였다. 그 뒤에 침전된 프로토플라스트들을 10 ㎖의 KCM 용액에 재 현탁시키고, 그의 농도를 토마 챔버(Thoma chamber)에서의 계수에 의해 추정한 후 KCM을 사용하여 1-5 x 108프로토플라스트/㎖로 조정하였다. 그 뒤에, 이 용액 100 ㎕를 1-10 ㎍의 DNA 및 10 ㎕의 PCM과 조심스럽게 혼합하고, 결과 혼합물을 냉수조에서 20분간 배양하였다. 그 뒤에, 500 ㎖의 PCM을 첨가하고, 결과 혼합물을 상온에서 20분간 유지시키고, 그뒤에 600 ㎕의 KCM을 첨가하였다. 형질 전환체들은 30 ㎍/㎖의 플레오마이신에서 성장시킬 수 있도록 플라스미드 pALfleo7, pALP480, pALPfleo1에 존재하는 플레오마이신 저항 유전자에 의해 주어지는 능력을 근거로 하여 선택하였다. 이러한 목적을 위해 200 ㎕의 형질 전환 반응물을 소르비톨(1 M)과 플레오마이신(30 ㎍/㎖)을 첨가한 상태에서 5 ㎖의 크자펙(Czapeck) 배지와 혼합한 후, 5 ㎖의 동일 배지와 함께 페트리 디쉬상에 확산배양시켰다. 그 후, 플레이트들을 형질 전환체들의 외관이 보일 때까지(4 내지 8일) 25℃에서 배양시켰다. 프로토플라스트의 생성 및 아크레모늄 크리소게넘의 형질 전환을 위해 사용한 방법은등등의 "Mol. Gen. Genet. 225: 56-64"(1991)에 기재된 것이었다. 먼저, 아크레모늄 크리소게넘의 균주를 MMC가 한정된 배지에서 그리고 28℃에서 20 내지 24시간동안 성장시키고, 나일론 필터를 사용한 여과 공정에 의해 균사체를 회수한 후 3 내지 5 볼륨의 0.9% NaCl을 사용하여 세척하였다. 여과지사이의 균사체를 건조시킨 후 프로토플라스트 완충액에 재 현탁(50 mg/㎖)시켰다. 미셀 현탁액이 균질한 것으로 판단되면 그 현탁액에 10 mM의 최종 농도를 갖는 DTT를 첨가한 후, 28℃에서 150 r.p.m.의 속도로 교반을 행하면서 1시간동안 배양을 행하였다. 그 뒤에 12,000xg에서 15분간 원심분리공정을 행하고, 결과 침전물을 20 ㎖의 프로토플라스트 완충액에 재 현탁시켰다. 그 뒤에, 프로토플라스트 완충액내에 4 mg/㎖의 농도를 갖는 소정 볼륨의 케일라자 용액(Cayla)을 첨가한 후 25℃에서 100 r.p.m.의 속도로 교반을 행하면서 3시간동안 배양을 행하였다. 이러한 상태에서 프로토플라스트들의 외관을 현미경으로 관찰하였다. 대부분의 프로토플라스트들이 방출된 후 25㎛의 구멍들을 갖는 나일론 필터를 사용한 여과공정에 의해 상기 프로토플라스트들을 균사체로부터 분리시켰다. 그 뒤에 프로토플라스트 현탁액을 0.7 M KCl을 사용하여 3회 세척하고, 세척공정들 사이에 1,000xg에서 3분간 원심분리공정을 행하였다. 그 뒤에 침전된 프로토플라스트들을 10 ㎖의 NCM 용액에 재 현탁시키고, 그의 농도를 토마 챔버에서의 계수에 의해 추정한 후 1-5 x 108프로토플라스트/㎖로 조정하였다. 그 뒤에, 이 용액 100 ㎕를 1-10 ㎍의 DNA와 조심스럽게 혼합하고, 결과 혼합물을 냉수조에서 20분간 배양하였다. 그 뒤에, 1 ㎖의 CCM을 첨가하고, 결과 혼합물을 상온에서 다시 20분간 배양시켰다. 결과 혼합물을 1,000xg에서 5분간 원심분리시켜, 결과 침전물을 800 ㎕의 NCM 완충액에 재 현탁시켰다. 형질 전환체들은 10 ㎍/㎖의 플레오마이신에서 성장시킬 수 있도록 플라스미드 pALfleo7, pALPfleo1에 존재하는 플레오마이신 저항 유전자에 의해 주어지는 능력을 근거로 하여 선택하였다. 이러한 목적을 위해 200 ㎕의 형질 전환 반응물을 수크로스(0.3 M)과 플레오마이신(10 ㎍/㎖)을 첨가한 상태에서 5 ㎖의 TSA 배지와 혼합한 후, 5 ㎖의 동일 배지와 함께 페트리 디쉬상에 확산배양시켰다. 그 후, 플레이트들을 형질 전환체들의 외관이 보일 때까지(5 내지 8일) 28℃에서 배양시켰다.
얻어진 형질 전환체에서, 형질 전환에 사용된 플라스미드에 대응하는 DNA의 존재 여부(I)와, 제어 유전자에 대응하는 전사체의 존재 여부(II)와, 발현된 유전자에 대응하는 효소 활성의 여부(III)를 분석하였다. 1994년도 Barredo 등등(스페인 특허 제 P9400931 호)이 설명한 조건들에 따라 DNA 전체를 얻은 후, 이것을 Sambrook, J. 등등의 "Molecular Cloning"("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼)(1989))에 기재된 방법에 따라 서던 블로트(Southern blot) 기술에 의해 분석하였다. RNA 전체는 Ausubel 등등의 "Current Protocols in Molecular Biology"(John Wiley & Sons, New York, USA)(1987)에 기재되어 있는 방법을 사용하여 정제시켰다. 얻어진 RNA를 -20℃에서 에탄올에 침전된 상태로 유지시켰다. 이 RNA를 사용하기 위해, 이 RNA를 4℃에서 그리고 10,000xg에서 20분간 원심분리를 행하여 회수하였다. 아가로스-포름알데히드(agarose-formaldehyde) 전기영동법(electrophoresis)에 의해 RNA분자들을 그의 분자 크기에 따라 분리하였다. 그 뒤에, RNA를 니트로셀룰로스 필터로 이전시켜 요구되는 프로브를 사용하여 하이브리디제이션시켰는데, 이 공정은 모두 Sambrook, J. 등등의 "Molecular Cloning"("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼)(1989))에 기재된 방법에 따라 행하였다. 하이브리디제이션 밴드들이 나타남에 따라 전사체의 존재, 그리고 그에 따른 숙주 균, 즉, 페니실륨 크리소게넘 또는 아크레모늄 크리소게넘에서의 균 유전자의 발현 능력이 판명되었다. Sambrook, J. 등등의 "Molecular Cloning"("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼)(1989))에 기재된 방법을 사용하여 상기 형질 전환체들에서의 β-갈락토시다제(galactosidase) 효소 활성을 평가하였다. 플레오마이신 저항 유전자의 발현은 크자펙 고형 배지에서 25℃로 7일간 배양한 후 페니실륨 크리소게넘 또는 아크레모늄 크리소게넘에 주어진 저항의 레벨을 근거로 하여 평가하였다.
1.2.1 Pgdh하에서의 페니실륨 크리소게넘에서의 에스케리키아 콜리의 lacZ 유전자 및 에스케리키아 콜리의 발현
에스케리키아 콜리의 lacZ 유전자를 페니실륨 크리소게넘에서 발현할 목적으로 번역에 의해 Pgdh와 유합시켰다. 이를 위해, lacZ 유전자를 플라스미드 pML1(Carramolino 등등의 1989년도 Gene 77: 31-38)의 EcoRI부위와 SalI부위사이에서 서브 클로닝시켜, 플라스미드 pMLac를 생성시켰다. 그 뒤에 pMLac의 EcoRI부위와 SalI부위사이에 Pgdh를 도입하여 플라스미드 pSKG를 생성시켰다 (도 5). 최종적으로, pSKG의 EcoRI부위에 설폰아미드 저항 유전자(Carramolino 등등의 1989년도 Gene 77: 31-38)를 도입하였다(도 5). 설폰아미드 저항을 위해 선택된 플라스미드 pSKGSu를 갖는 페니실륨 크리소게넘 형질 전환체에서 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위해 서던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였고, 또한 상기 페니실륨 크리소게넘 형질 전환체에서 lacZ 유전자에 대응하는 전사체의 존재 여부를 확인하기 위해 노던 블로트(Northern blot) 기술을 이용하여 분석을 행하였다. 그 뒤에 상기 두 분석에서 양성을 나타낸 형질 전환체들에서 β-갈락토시다제의 활성을 측정하였다. 상기 형질 전환체들은 에스케리키아 콜리의 lacZ 유전자를 효과적으로 발현시켰으며, β-갈락토시다제의 활성 레벨은 그의 게놈내에 병합된 플라스미드의 복제체에 포함된 경우가 트립토판(tryptophan) C 유전자 프로모터(trpC)의 제어 하에서 lacZ 유전자를 발현시킨 단일 복제 형질 전환체들의 경우보다 높게 되는 것을 관찰할 수 있었다.
페니실륨 크리소게넘의 Pgdh가 또한 에스케리키아 콜리의 lacZ 유전자의 발현을 지시할 수 있는 지의 여부를 판단할 목적으로 플라스미드 pSKG를 에스케리키아 콜리 DH5α(ΔlacZ)에 도입시켰다. 얻어진 형질 전환체들은 이소프로필-β-D-갈락토시드(galactoside)(IPTG)와 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토시드(X-gal)이 첨가된 LB 배지에서 25℃로 10일간 배양한 결과 청색 콜로니(colony)들을 생성시킬 수 있는 능력을 가지게 되었다. 이 결과로부터, Pgdh-lacZ 구조가 비록 에스케리키아 콜리의 내부출아성 lacZ 유전자의 경우보다는 덜 효율적이긴 하지만 에스케리키아 콜리에서 β-갈락토시다제 효소 활성을 발현시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
1.2.2. Pgdh 하에서 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘에서의 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자의 발현
플라스미드 pUT737(Mullaney 등등 (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45)로 부터 1,100 bp의 NcoI-ApaI 단편으로서 bleR유전자를 그의 프로모터 영역 없이 얻었다. 이 단편을 NcoI-ApaI로 미리 분해시킨 플라스미드 pUT713에서 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALfleo5를 생성시켰다. Pgdh는 pALP25로부터 726 bp의 EcoRI-BamHI 단편으로서 회수하였고, 이 단편을 pALfleo5(미리 EcoRI-BamHI로 분해시킨 상태의)에서 서브 클로닝시켜 pALfleo6을 생성시켰다. 이 최종 플라스미드는 4.2 kb의 크기를 가지고 있으며, bleR유전자를 에스케리키아 콜리내의 마커로서의 Pgdh 및 암피실린 저항 유전자의 제어 하에서 발현시켰다. 상기 후자의 마커를 클로람페니콜 저항 유전자로 대치시킬 목적으로 pALfleo6으로부터 Pgdh, bleR, 그리고 trpC 유전자의 터미네이터(TtrpC)를 포함하는 1,900 bp의 EcoRI-NotI 단편을 정제한 후 EcoRI-NotI에 의해 분해된 플라스미드 pBC KS (+)(Stratagene)에 결찰시켰다. 그 결과, 5.4 kb의 크기를 가지고 있고, Pgdh의 제어 하에서 발현된 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자를 균의 마커로서 가지고 있고, 클로람페니콜 저항 유전자를 에스케리키아 콜리의 마커로서 가지고 있고, 플라스미드 pBC KS (+)의 폴리링커를 가지고 있는 플라스미드 pALfleo7(도 5)가 얻어졌다. Pgdh와 bleR간의 유합 영역의 서열에 의해 정확한 해독틀 내에서의 후자 유전자의 배열이 확인되었다.
플라스미드 pALfleo7을 사용하여 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘의 형질 전환을 행하였는데, 이에 있어 형질 전환체들은 각각 30 및 10 ㎍/㎖ 의 플레오마이신에 대한 그들의 저항을 근거로 하여 선택하였다. 그 뒤에 상기 형질 전환체들의 최대 플레오마이신 저항 레벨을 고형 배지에서 확립하였는데, 상기 형질 전환체의 일부는 100 ㎍/㎖를 초과하는 플레오마이신의 존재 하에서 성장가능한 것이었다. 플레오마이신 저항을 위해 선택된 상기 형질 전환체들에서 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위해 서던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였고, 또한 상기 형질 전환체들에서 bleR유전자에 대응하는 전사체의 존재 여부를 확인하기 위해 노던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였는데, 이 두 경우 모두 양성 결과가 얻어졌다. 이 결과들로부터 Pgdh의 제어 하에서 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘에서 이성 유전자들을 발현시킬 수 있는 가능성을 확인하였다.
페니실륨 크리소게넘의 Pgdh가 또한 에스케리키아 콜리의 bleR유전자의 발현을 지시할 수 있는지의 여부를 판단할 목적으로 플라스미드 pALfleo7을 에스케리키아 콜리에 도입시켰다. 얻어진 형질 전환체들은 최소 억제 농도가 에스케리키아 콜리의 0.025 ㎍/㎖보다 낮은 0.2 ㎍/㎖의 플레오마이신을 포함하는 LB에서 성장할 수 있는 능력을 가지고 있었다. 이 결과로부터 Pgdh가 비록 페니실륨 크리소게넘에서 보다는 덜 효율적이긴 하지만 에스케리키아 콜리에서 발현되었다는 것을 확인할 수 있었다. 플라스미드 pALfleo7을 포함하는 에스케리키아 콜리 DH5α의 형질 전환체는 스페인 미생물기탁기관(Spanish Collection of Type Cultures (CECT))에 기탁번호 제 CECT4849 호로 기탁한 상태에 있다. pALP784 및 pALP785와 같은 다른 플라스미드들은 2.9 kb의 Sau3AI-XbaI 단편을 선택하여 pALfleo7에 포함된 gdh 유전자의 프로모터와 하이브리디제이션시킨 후 pBluescript I KS (+) 또는 pUC13에 서브 클로닝시키는 것에 의해 상기 기탁된 플라스미드로부터 얻을 수 있다.
1.3. gdh 프로모터하에서 페니실륨 크리소게넘과 아크레모늄 크리소게넘에서의 안티센스 발현
바람직하지 않은 효소 활성을 제거시키기 위해서는 종종 산업 균주에서의 유전자 발현을 비 활성화시키는 것이 필요하다. 많은 산업 균주들의 배수성 레벨로는 대부분 직접적인 유전자 와해에 의한 발현 차단을 이루게 하기가 어렵기 때문에 배수성 레벨과는 무관하게 발현을 비 활성화시킬 수 있는 시스템들을 사용하는 것이 필요하다. 강력한 프로모터들의 제어 하에서 발현된 안티센스 구조를 개발하면 유전자 발현의 차단이 가능할 수 있다.
일례로, 페니실륨 크리소게넘 내의 페닐아세테이트(phenylacetate) 2-하이드록시라제(hydroxylase)(pahA)를 코드화시키는 유전자의 발현을 비 활성화시키기 위해 Pgdh를 사용하는 것에 관하여 이하 설명한다. 먼저, 단일 BamHI 부위를 거쳐 유합된 Pgdh와 TtrpC를 갖는 플라스미드 pALP873을 구성하였다. 그 뒤에 플라스미드 pALP873을 BamHI에 의해 분해시킨 후 그의 단부들에 DNA 폴리머라제(polymerase) I의 클레노우(Klenow) 단편을 채우고, 이러한 상태에서 EcoRV 분해에 의해 플라스미드 pALP555로부터 얻은 pahA 유전자의 내부에서 1,053 bp의 cDNA 단편과 결찰시켰다. 결과 플라스미드로서 pALP874를 선택하였는데, 그 이유는 이 플라스미드가 Pgdh에 대한 안티센스 pahA 유전자 단편을 가지고 있었기 때문이다. 이 플라스미드로 부터 안티센스 카세트(cassette)를 갖는 2.5 kb의 EcoRI-XbaI 단편을 정제하였는데, 이 단편은 클레노우로 채워지고 플라스미드 pALfleo7의 EcoRV 부위에서 서브 클로닝되어 플라스미드 pALP888을 생성하였다. 이 최종 플라스미드는 7.9 kb의 크기를 갖는다는 점에서, 그리고 Pgdh의 제어하의 pahA 유전자의 안티센스 카세트(I)와, 균의 마커로서의 bleR유전자(II)와, 에스케리키아 콜리의 마커로서의 클로람페니콜 저항 유전자(III)와, 플라스미드 pBC KS (+)의 폴리링커(IV)를 가지고 있다는 점을 특징으로 하고 있다.
플라스미드 pALP888을 사용하여 페니실륨 크리소게넘의 형질 전환을 행하였는데, 이에 있어 형질 전환체들은 각각 30 ㎍/㎖ 의 플레오마이신에 대한 그들의 저항을 근거로 하여 선택하였다. 선택된 상기 형질 전환체들중 20%는 페닐아세틱산(phenylacetic acid)를 산화시킬 수 있는 능력이 감소되어 있었고, 그 중 일부는 그 능력이 검출할 수 없을 정도로 결여되어 있었다. 상기 형질 전환체들에서 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위해 서던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였고, 또한 상기 형질 전환체들에서 pahA 유전자에 대응하는 안티센스 전사체의 존재 여부를 확인하기 위해 프로브로서 코딩 스트랜드(coding strand)에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 노던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였다. 이 두 경우 모두 양성 결과가 얻어졌고, 이 결과들로부터 안티센스 구조들의 사용에 의해 페니실륨 크리소게넘에서의 바람직하지 않은 효소 활성을 전체적으로 또는 부분적으로 차단할 수 있는 가능성을 확인하였다. 이 결과들로부터 본 발명에서 기재하고 있는 여하한 프로모터들(Pgdh, Phex, PactPc, PactAc) 또는 입수가능한 다른 프로모터를 사용하여 관련 사상균 및 효소 활성을 추정할 수 있다.
(실시예 2)
2.1 페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자의 클로닝 및 특징화
페니실린 G 제조 조건하에서의 산업 발효 공정에 의해 얻어진 페니실륨 크리소게넘에서 정제 및 특징화 후 효소 β-N-아세틸헥소사미니다제가 되는 것으로 확인된 주 단백질의 존재 여부를 확인하였다. 정제된 상기 단백질의 아미노 말단의 아미노산 서열을 에드만(Edman) 열화방법을 사용하여 확인한 바, 다음과 같이 서로 다른 두 서열이 얻어졌다.
(A) Ala-Pro-Ser-Gly-Ile-His-Asn-Val-Asp-Val-(His)-Val-Val-(Asp)- Asn-(Asp)-Ala-(Asp)-Leu-Gln-Tyr-(Gly)
(B) Val-Gln-Val-Asn-Pro-Leu-Pro-Ala-Pro-(Arg)-(Arg)-Ile-(Thr)-???-(Gly)-
(Ser)-(Ser)-(Gly)-(Pro)-(Ile/Thr)-???-(Val)
이러한 서열에 근거하여 그리고 일련의 페니실륨 크리소게넘 유전자들에 코돈 사용 경향이 있는 것으로 가정하여 다음과 같은 합성 올리고뉴클레오티드들의 조합들을 구성하였다.
(I) 5' TCGACGACGTGSACGTCSACGTTGTGGATGCC 3'
(II) 5' CCGTAYTGSAGGTCRGCGTCGTTGTCGACGAC 3'
(III) 5' GGGGCVGGSAGVGGGTTGACYTG 3'
DNA 라이브러리와 실시예 1에서 설명한 과정들을 이용하여 페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자를 클로닝시켰다. 그 뒤에 총 11개의 양성 클론들을 정제하고 그들의 DNA를 일련의 제한 엔도뉴클레아제들을 사용하여 분해한 후 서던 블로트 기술을 이용하여 분석하였다. 이러한 방식으로 3.2 kb의 SacI 단편과 2.1 kb의 SalI 단편에서 hex 유전자를 확인하였다. 플라스미드 pBC KS (+)(Stratagene)에서 SalI 단편을 두 정위 모두로 클로닝시켜 플라스미드 pALP295와 pALP303을 생성시켰다. 도 2에는 hex 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다.
hex 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 상기한 플라스미드 pALP295와 pALP303, 그리고 pALP319와 pALP461(2.8 kb의 BamHI 단편의 두 정위), pALP388과 pALP389(2.4 kb의 SalI 단편의 두 정위), 그리고 pALP377과 pALP378(1.2 kb의 PstI 단편의 두 정위)(도 2)를 사용하였다. "염기 소거"방법(Promega)을 사용하여 상기 플라스미드들로 부터 일련의 클론들을 구성하고, 그 뒤에 두 경우 모두 "시퀘나제" 시험 키트(USB)를 이용하는 디디옥시뉴클레오티드 방법을 사용하여 제조자의 지침에 따라 서열을 결정하였다. 얻어진 5,240 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)를 제네플로트(Geneplot) 프로그램(DNASTAR)을 사용하여 분석한 결과, 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임의 존재를 확인하였다. hex 유전자의 ATG 번역 개시 코돈은 1,324번째 위치에 있었으며, TGA 번역 종결 코돈은 3,112번째 위치에 있었다. 상기 오픈 리딩 프레임은 인트론들을 가지고 있지 않으며, 5.34의 등전위점에서 66,545 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 596 아미노산 서열(서열번호 6)는 칸디다 알비칸스의 β-N-아세틸헥소사미니다제 효소의 아미노산 서열에 대해 49.0%의 동일성을 가지고 있다. 또한, 추론된 아미노산 서열은 19 내지 40번째의 위치들에서 그리고 99 내지 120번째의 위치들에서 정제된 효소로 부터 화학적으로 결정된 아미노산 서열들을 포함한다. 상기한 아미노산 서열 (A)에 바로 인접한 위치들(97번째 및 98번째 아미노산)에서는 프로테아제(protease) 인식 부위(Lys-Arg)가 존재한다.
프로모토 영역에는 1,106번째 위치와 1,128번째 위치사이에서 그리고 1,182번째 위치와 1,200번째 위치사이에서 두개의 피리미딘 농후 영역들이 존재하고, 1,258번째 위치에서 하나의 추정 TATA 박스(ATAAATA)가 존재하고, 1,163번째 위치에서 하나의 CAAT 박스가 존재한다.
2.2. Phex 하에서 페니실륨 크리소게넘에서의 에스. 힌더스타너스의 bleR유전자의 발현
페니실륨 크리소게넘 형질 전환체들의 형질 전환 및 도태(I), DNA 분석(II), RNA 분석(III), 그리고 효소 측정(IV) 공정들을 실시예 1의 1.2 절에서 설명한 바와 같이 행하였다.
Phex하에서 bleR유전자를 발현시키기 위해, 먼저 hex 유전자의 개사자 메티오닌(initiator methionine)을 코드화시키는 ATG 코돈 위에 NcoI 부위를 구성하였다. 이 과정은 다음의 올리고뉴클레오티드들을 프라이머(primer)로서 사용한 상태에서 PCR에 의해 행하였다.
5' CTCCATGGTGATAAGGTGAGTGACGATG 3'
5' GTAAAACGACGGCCAGTG 3' (Primer - 20)
PCR에 의해 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 pBC KS (+)(Stratagene)에서 SmaI 부위에서 두 정위 모두로 클로닝시켜 플라스미드 pALP427과 pALP428을 생성시켰다. 시험 키트 "염기 소거"(Promega)와 "시퀘나제"(USB)들을 사용하여 상기 두 플라스미드들의 인서트들을 각기 제조자의 지침에 따라 서열을 결정하였다. 이러한 방식으로 하여, 얻어진 Phex는 돌연변이가 없었고, 단백질의 개시자 메티오닌을 코드화시키는 ATG 위에서 NcoI 부위를 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
bleR유전자의 서브 클로닝을 수행하기 위해 선택한 플라스미드는 pALP427이었다. 플라스미드 pUT737(Mullaney 등등 (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45)로 부터 1,100 bp의 NcoI-ApaI 단편으로서 bleR유전자를 그의 프로모터 영역없이 얻었다. 이 단편을 NcoI-ApaI로 미리 분해시킨 플라스미드 pALP427에서 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALP480(도 6)을 생성시켰다. 이 최종 플라스미드는 5.4 kb의 크기를 가지고 있으며, Phex의 제어 하에서 발현된 bleR유전자와, 에스케리키아 콜리의 마커로서의 클로람페니콜 저항 유전자와, 플라스미드 pBC KS (+)의 폴리링커를 가지고 있다. Phex와 bleR간의 유합 영역의 서열에 의해 정확한 해독틀내에서의 후자 유전자의 배열이 확인되었다.
플라스미드 pALP480을 사용하여 페니실륨 크리소게넘의 형질 전환을 행하였는데, 이에 있어 형질 전환체들은 각각 30 ㎍/㎖ 의 플레오마이신에 대한 그들의 저항을 근거로 하여 선택하였다. 그 뒤에 상기 형질 전환체들의 최대 플레오마이신 저항 레벨을 고형 배지에서 확립하였는데, 상기 형질 전환체의 일부는 100 ㎍/㎖를 초과하는 플레오마이신의 존재하에서 성장가능한 것이었다. 플레오마이신 저항을 위해 선택된 상기 형질 전환체들에서 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위해 서던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였고, 또한 상기 형질 전환체들에서 bleR유전자에 대응하는 전사체의 존재 여부를 확인하기 위해 노던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였는데, 이 두 경우 모두 양성 결과가 얻어졌다. 이 결과들로 부터 Phex의 제어 하에서 페니실륨 크리소게넘에서 이성 유전자들을 발현시킬 수 있는 가능성을 확인하였다. 플라스미드 pALP480을 포함하는 에스케리키아 콜리 DH5α의 형질 전환체는 스페인 미생물기탁기관(Spanish Collection of Type Cultures (CECT))에 기탁번호 제 CECT4852 호로 기탁한 상태에 있다. 플라스미드 pALP295, pALP319, pALP377 및 pALP388들은 2.1 kb의 SalI, 2.8 kb의 BamHI, 1.2 kb의 PstI, 2.4 kb의 SalI을 각기 DNA 단편으로서 선택하여 pALP480에 포함된 hex 유전자의 프로모터와 하이브리디제이션시킨 후 pBluescript I KS (+)에 서브 클로닝시키는 것에 의해 상기 기탁된 플라스미드로 부터 얻을 수 있다.
2.3 hex 유전자를 사용한 페니실륨 크리소게넘에서의 단백질의 세포외 생성
효소 β-N-아세틸헥소사미니다제는 페니실린 G 제조 조건하에서의 산업 발효조들에서 페니실륨 크리소게넘에 의해 배지에 풍부하게 분비되는 단백질이다. 이 효소의 분비 능력에 따라 페니실륨 크리소게넘 또는 관련 사상균에서의 상동 또는 이성 단백질의 발현 및 분비를 위해 hex 유전자를 사용하는 것이 가능하게 된다.
상기 효소는 다음의 아미노산들로 구성되는 분비 신호 서열을 갖는다: Met-Lys-Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala (서열번호 6의 제 1 내지 제 18번째 아미노산들). 일반적으로, 신호 펩티드들은 보존된 3개의 구조 도메인(domain)들(Takizawa, N. 등등(1994), "Recombinant microbes for industrial and agricultural applications", Murooka, Y. and Imanaka, T. (eds), Marcel Dekker Inc., New York), 즉, 1 내지 5개의 잔체(residue)를 항상 가지고 있고, 막을 교차한 단백질의 효율적인 전류(translocation)를 위해 필요한, "n"으로 불리우는 양 전위의 아미노 말단 영역(I)(Met-Lys)과, 7 내지 15개의 잔체로 구성되는, "h"로 불리우는 소수성(hydropobic) 영역(II)(Ala-Ser-Val-Leu-Asn- Val-Leu)과, 3 내지 7개의 잔체로 구성되는, "c" 로 불리우는 카복실 단부의 극성 영역(III)(Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala)을 가지고 있다. 세포내에서 합성되는 전 단백질(preprotein)은 두개의 염기성 잔체로 구성되는 난할 부위(Lys-Arg, 서열 번호 6의 97번째 및 98번째 아미노산)를 통해 처리되어, 성숙 단백질을 생성한다.
hex 유전자를 사용하여 단백질들을 발현 및 분비시키는 경우 두 가지의 가능성, 즉, 해독틀에서 발현될 유전자의 코드화 영역에 분비 신호 서열을 포함하는 프로모터 영역을 유합시키는 가능성(I)과, 해독틀에서 발현될 유전자의 코드화 영역에 완전한 hex 유전자를 유합시키는 가능성(II)이 존재한다.
당해 기술분야에서 숙련된 자라면 누구나 분자생물학의 표준 기술들(Sambrook, J. 등등의 Molecular Cloning(1989): "Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼; Ausubel 등등 (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA)을 이용하여 페니실륨 크리소게넘 또는 관련 사상균에서의 중요한 단백질들의 발현 및 분비를 위해 hex 유전자 또는 그렇지 않으면 완전한 유전자의 분비 서열을 포함하는 프로모터를 사용할 수 있을 것이다.
(실시예 3)
3.1 페니실륨 크리소게넘의 act 유전자의 클로닝 및 특징화
실시예 1 에서 설명한 과정들과 DNA 라이브러리를 사용하여 페니실륨 크리소게넘의 act 유전자를 클로닝시켰다. 이 경우, 아스퍼길러스 니둘란스의 act 유전자(Fidel, S. 등등 (1988), Gene 70: 283-293)로 부터 얻은 888 bp의 NcoI-ClaI 단편을 사용하여 하이브리디제이션을 행하였다. 총 10개의 양성 클론들을 정제시킨 후, 그들의 DNA를 일련의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 분해시켜 서던 블로트 기술에 의해 분석하였다. 이러한 방식으로 5.2 kb의 BamHI 단편과, 4.9kb의 EcoRI 단편, 그리고 5.9kb의 HindIII 단편에서 act 유전자를 확인하였다. HindIII 단편을 플라스미드 pBluescript I KS (+)(Stratagene)에서 두 정위로 모두 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALP298과 pALP299를 생성시켰다. 또한, EcoRI 단편을 플라스미드 pBluescript I KS (+)(Stratagene)에서 두 정위로 모두 서브 클로닝시켜 pALP315와 pALP316을 생성시켰다. 도 3에는 상기 act 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다.
act 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정할 목적으로 상기한 플라스미드 pALP315와 pALP316을 사용하였다. "염기 소거(Erase a base)"방법(Promega)을 사용하여 상기 플라스미드들로 부터 일련의 클론들을 구성하고, 그 뒤에 두 경우 모두 "시퀘나제(Sequenase)" 시험 키트(USB)를 이용하는 디디옥시뉴클레오티드 방법을 사용하여 제조자의 지침에 따라 서열을 결정하였다. 얻어진 2,994 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 제네플로트 프로그램(DNASTAR)을 사용하여 분석한 결과, 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임의 존재를 확인하였다. act 유전자의 ATG 번역 개시 코돈은 494번째 위치에 있었으며, TAA 번역 종결 코돈은 2,250번째 위치에 있었다. 또한, 상기 오픈 리딩 프레임은 5개의 인트론들을 각각 501 내지 616번째의 위치들 사이에서, 649 내지 845번째의 위치들 사이에서, 905 내지 1,046번째의 위치들 사이에서, 1,078 내지 1,180번째의 위치들 사이에서, 그리고 1,953 내지 2,021번째의 위치들 사이에서 가지고 있으며, 5.51의 등전위점에서 41,760 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 375 아미노산 서열(서열번호 7)는 아스퍼길러스 니둘란스의 γ-액틴 단백질의 아미노산 서열에 대해 98.1%의 동일성을 가지고 있다. 프로모토 영역에는 356 내지 404번째의 위치들 사이에서 그리고 418 내지 469번째의 위치들 사이에서 두개의 큰 피리미딘 농후 영역들과, 259번째 위치에서 추정 TATA 박스(TATAAAAAT)와, 174, 217, 230, 337번째 위치에서 4개의 CAAT 박스들이 존재한다.
3.2. PactPC 하에서 페니실륨 크리소게넘에서의 bleR유전자의 발현
PactPC하에서 bleR유전자를 발현시키기 위해, 먼저 hex 유전자의 개시자 메티오닌(initiator methionine)을 코드화시키는 ATG 코돈 위에 NcoI 부위를 구성하였다. 이 과정은 다음의 올리고뉴클레오티드들을 프라이머(primer)로서 사용한 상태에서 PCR에 의해 행하였다.
5' CTCCATGGTGACTGATTAAACAAGGGAC 3'
5' GTAAAACGACGGCCAGTG 3' (프라이머 - 20)
PCR에 의해 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 pBC KS (+)(Stratagene)에서 SmaI 부위에서 두 정위 모두로 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALPact1과 pALPact2를 생성시켰다. 시험 키트 "염기 소거"(Promega)와 "시퀘나제"(USB)들을 사용하여 상기 두 플라스미드들의 인서트들을 각기 제조자의 지침에 따라 서열을 결정하였다. 이러한 방식으로 하여, 얻어진 Phex는 돌연변이가 없었고, 단백질의 개시자 메티오닌을 코드화시키는 ATG 위에서 NcoI 부위를 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
bleR유전자의 서브 클로닝을 수행하기 위해 선택한 플라스미드는 pALPact1이었다. 플라스미드 pUT737(Mullaney 등등 (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45)로 부터 1,100 bp의 NcoI-ApaI 단편으로서 bleR유전자를 그의 프로모터 영역없이 얻었다. 이 단편을 NcoI-ApaI로 미리 분해시킨 플라스미드 pALPact1(PactPc를 갖는)에서 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALPfleo1(도 6)을 생성시켰다. 이 최종 플라스미드는 PactPc의 제어 하에서 발현된 bleR유전자와, 에스케리키아 콜리의 마커로서의 클로람페니콜 저항 유전자와, 플라스미드 pBC KS (+)의 폴리링커를 가지고 있다. PactPc와 bleR간의 유합 영역의 서열에 의해 정확한 해독틀내에서의 후자 유전자의 배열이 확인되었다.
플라스미드 pALPfleo1을 사용하여 페니실륨 크리소게넘의 형질 전환을 행하였는데, 이에 있어 형질 전환체들은 각각 30 ㎍/㎖ 의 플레오마이신에 대한 그들의 저항을 근거로 하여 선택하였다. 그 뒤에 상기 형질 전환체들의 최대 플레오마이신 저항 레벨을 고형 배지에서 확립하였는데, 상기 형질 전환체의 일부는 100 ㎍/㎖를 초과하는 플레오마이신의 존재하에서 성장가능한 것이었다. 플레오마이신 저항을 위해 선택된 상기 형질 전환체들에서 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위해 서던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였고, 또한 상기 형질 전환체들에서 bleR유전자에 대응하는 전사체의 존재 여부를 확인하기 위해 노던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였는데, 이 두 경우 모두 양성 결과가 얻어졌다. 이 결과들로부터 PactPc의 제어 하에서 페니실륨 크리소게넘에서 이성 유전자들을 발현시킬 수 있는 가능성을 확인하였다. 플라스미드 pALP315를 포함하는 에스케리키아 콜리 DH5α의 형질 전환체는 스페인 미생물기탁기관(Spanish Collection of Type Cultures (CECT))에 기탁번호 제 CECT4851 호로 기탁한 상태에 있다. 플라스미드 pALP316은 단순히 pBluescript I KS (+)의 EcoRI 부위에서 pALP315 인서트를 반대 정위로 서브 클로닝시키는 것에 의해 상기 기탁된 플라스미드로부터 얻을 수 있다.
(실시예 4)
4.1 아크레모늄 크리소게넘의 act 유전자의 클로닝 및 특징화
아크레모늄 크리소게넘의 gdh 유전자를 클로닝시킬 목적으로 실시예 1의 1.1절에서 설명한 바와 같이 파지 벡터 λGEM12에 DNA 라이브러리를 구성하였다. 에스케리키아 콜리 LE392에서는 파지 적정량이 50 pfu/㎕(총 25,000 pfu)였으며, 에스케리키아 콜리 NM539에서는 파지 적정량이 41 pfu/㎕(총 20,500 pfu)였다. 이는 파지들중 약 82%가 외생 DNA 인서트(insert)를 가지고 있다는 것과 아크레모늄 크리소게넘 DNA 라이브러리가 99.999&의 확률로 얻어졌다는 것을 의미하는 것이다. 이러한 일련의 이론적인 검증들을 행한 후 에스케리키아 콜리 NM539의 감염을 행하고, 150 mm 직경을 갖는 3개의 페트리 디쉬들 상에 완전한 DNA 라이브러리를 확산배양시켰으며(페트리 디쉬당 약 7,000 pfu), 50 ㎖의 SM과 2.5 ㎖의 클로로포름에 수집하여 4℃로 유지시켰다. 이러한 방식으로 언제든지 떠낼 준비가 된 충분하고 전형적인 볼륨(volume)의 재조합 파지들(2,100 pfu/㎕)을 얻을 수 있었다.
150 mm 직경을 갖는 2개의 페트리 디쉬들 상에 약 20,000 pfu를 확산배양시킨 후 니트로셀룰로스 필터(BA85, 0.45 ㎛, Schleicher & Schuell)들로 이전시켰다. 그 뒤에 상기 필터들을 표준 프로토콜들(Molecular Cloning("Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA"의 실험용 매뉴얼))을 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스의 act 유전자에 상응하는 888 bp의 NcoI-ClaI 단편과 하이브리디제이션시켰다. 총 5개의 양성 클론들을 정제시킨 후, 그들의 DNA를 일련의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 분해시켜 서던 블로트 기술에 의해 분석하였다. 이러한 방식으로 8.7 kb의 HindIII 단편에서 act 유전자를 확인하였다. 이 단편을 플라스미드 pBluescript I KS (+)(Stratagene)에서 두 정위로 모두 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALC52와 pALC53을 생성시켰다. 도 4에는 상기 act 유전자를 포함하는 DNA 영역의 제한 지도가 도시되어 있다.
act 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정할 목적으로 상기한 플라스미드 pALC52와 pALC53을 사용하였다. "염기 소거(Erase a base)"방법(Promega)을 사용하여 상기 플라스미드들로부터 일련의 클론들을 구성하고, 그 뒤에 두 경우 모두 "시퀘나제(Sequenase)" 시험 키트(USB)를 이용하는 디디옥시뉴클레오티드 방법을 사용하여 제조자의 지침에 따라 서열을 결정하였다. 얻어진 3,240 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)를 제네플로트 프로그램(DNASTAR)을 사용하여 분석한 결과, 아주 두드러진 우선 코돈 사용 패턴을 갖는 오픈 리딩 프레임의 존재를 확인하였다. act 유전자의 ATG 번역 개시 코돈은 787번째 위치에 있었으며, TAA 번역 종결 코돈은 2,478번째 위치에 있었다. 또한, 상기 오픈 리딩 프레임은 5개의 인트론들을 각각 794 내지 920번째의 위치들 사이에서, 952 내지 1,123번째의 위치들 사이에서, 1,180 내지 1,289번째의 위치들 사이에서, 1,321 내지 1,410번째의 위치들 사이에서, 그리고 2,183 내지 2,249번째의 위치들 사이에서 가지고 있으며, 5.51의 등전위점에서 41,612 Da의 단백질을 코드화시키며, 이에 대한 375 아미노산 서열(서열번호 8)는 아스퍼길러스 니둘란스와 페니실륨 크리소게넘의 γ-액틴 단백질의 아미노산 서열에 대해 각기 98.4% 및 98.1%의 동일성을 가지고 있다. 프로모토 영역에는 607 내지 654번째의 위치들 사이에서 하나의 피리미딘 농후 영역과, 747번째 위치에서 하나의 추정 TATA 박스(TTATAAAA)와 338번째 위치에서 하나의 CAAT 박스가 존재한다.
4.2. PactAc 하에서 아크레모늄 크리소게넘에서의 bleR유전자의 발현
PactAc의 제어 하에서 bleR유전자를 발현시킬 목적으로 PactAc의 제어 하에서 발현된 bleR유전자와, bleR유전자하의 trpC 유전자의 터미네이터와, 에스케리키아 콜리의 마커로서의 클로람페니콜 저항 유전자와, 플라스미드 pBC KS (+)의 폴리링커를 포함하는 플라스미드 pALCfleo1(도 6)를 구성하였다.
플라스미드 pUT737(Mullaney 등등 (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45)로 부터 1,100 bp의 NcoI-ApaI 단편으로서 bleR유전자를 그의 프로모터 영역 없이 얻었다. 그 뒤에 이 단편을 해독틀에서 PactAc와 유합시킴으로써 act 유전자가 단백질의 개시자 메티오닌을 코드화시키는 ATG 위에서 NcoI 부위를 포함하고 있다는 사실을 이용할 수 있었다. 이를 위해 bleR유전자를 NcoI-ApaI로 미리 분해시킨 플라스미드 pALPact1(PactAc를 갖는)에서 서브 클로닝시켜 플라스미드 pALCfleo1(도 6)을 생성시켰다. 이 최종 플라스미드는 PactAc와 bleR간의 유합 영역의 서열에 의해 정확한 해독틀내에서의 후자 유전자의 배열이 확인되었다.
플라스미드 pALCfleo1을 사용하여 아크레모늄 크리소게넘의 형질 전환을 행하였는데, 이에 있어 형질 전환체들은 각각 10 ㎍/㎖ 의 플레오마이신에 대한 그들의 저항을 근거로 하여 선택하였다. 그 뒤에 상기 형질 전환체들의 최대 플레오마이신 저항 레벨을 고형 배지에서 확립하였는데, 상기 형질 전환체의 일부는 30 ㎍/㎖를 초과하는 플레오마이신의 존재 하에서 성장가능한 것이었다. 플레오마이신 저항을 위해 선택된 상기 형질 전환체들에서 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위해 서던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였고, 또한 상기 형질 전환체들에서 bleR유전자에 대응하는 전사체의 존재 여부를 확인하기 위해 노던 블로트 기술을 이용하여 분석을 행하였는데, 이 두 경우 모두 양성 결과가 얻어졌다. 이 결과들로부터 PactAc의 제어 하에서 아크레모늄 크리소게넘에서 이성 유전자들을 발현시킬 수 있는 가능성을 확인하였다. act 유전자를 갖는 플라스미드 pALC52를 포함하는 에스케리키아 콜리 DH5α의 형질 전환체는 스페인 미생물기탁기관(Spanish Collection of Type Cultures (CECT))에 기탁번호 제 CECT4850 호로 기탁한 상태에 있다. 플라스미드 pALC53은 단순히 pBluescript I KS (+)의 HindIII 부위에서 pALC52 인서트를 반대 정위로 서브 클로닝시키는 것에 의해 상기 기탁된 플라스미드로부터 얻을 수 있다.
에스케리키아 콜리를 숙주로서 사용하여 방선균류인 페니실륨, 아스퍼길러스, 아크레모늄 또는 사카로마이세스속에 상기한 기탁된 플라스미드들에 존재하는 인서트들을 도입하는 데에는 단지 기술적 과정상의 문제와 상기 속(genus) 또는 과(family)의 형질 전환을 위해 가장 적합한 벡터들을 선택하는 문제만이 있을 뿐이다.

Claims (42)

  1. 미생물 내에서의 유전자 발현을 증가 또는 차단시키는 방법에 있어서, 페니실륨 크리소제넘의 gdh 유전자의 프로모터의 제어 하에서 상기 미생물 내에서 유전자들, 부분 유전자 서열들 또는 DNA 단편들을 발현시키는 것을 특징으로 하는 미생물내에서의 유전자 발현 증가 또는 차단 방법.
  2. 미생물 내에서의 유전자 발현을 증가 또는 차단시키는 방법에 있어서, 페니실륨 크리소제넘의 hex 유전자의 프로모터의 제어 하에서 상기 미생물 내에서 유전자들, 부분 유전자 서열들 또는 DNA 단편들을 발현시키는 것을 특징으로 하는 미생물 내에서의 유전자 발현 증가 또는 차단 방법.
  3. 미생물 내에서의 단백질의 세포 외 발현 방법에 있어서, 상기 미생물 내에서 페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자와의 유전자 유합들을 발현시키는 것을 특징으로 하는 미생물 내에서의 단백질의 세포외 발현 방법.
  4. 미생물 내에서의 유전자 발현을 증가 또는 차단시키는 방법에 있어서, 페니실륨 크리소제넘의 act 유전자의 제어 하에서 상기 미생물 내에서 유전자들, 부분 유전자 서열들 또는 DNA 단편들을 발현시키는 것을 특징으로 하는 미생물 내에서의 유전자 발현 증가 또는 차단 방법.
  5. 미생물 내에서의 유전자 발현을 증가 또는 차단시키는 방법에 있어서, 아크레모늄 크리소게넘의 act 유전자의 제어 하에서 상기 미생물 내에서 유전자들, 부분 유전자 서열들 또는 DNA 단편들을 발현시키는 것을 특징으로 하는 미생물 내에서의 유전자 발현 증가 또는 차단 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질 전환된 미생물이 비인적(non-human) 진핵생물, 바람직하게는 페니실륨 크리소게넘, 아스퍼길러스 니둘란스 또는 아크레노늄 크리소게넘인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 사용된 미생물이 바람직하게 페니실륨 크리소게넘, 아스퍼길러스 니둘란스 또는 아크레노늄 크리소게넘인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. Sau3AI와 XbaI 제한 부위들로 구속된 2,811 bp의 페니실륨 크리소게넘으로부터 격리되어 있고 gdh 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 화합물.
  9. BamHI와 SacI 제한 부위들로 구속된 7,737 bp의 페니실륨 크리소게넘으로부터 격리되어 있고 hex 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 화합물.
  10. BglII와 EcoRI 제한 부위들로 구속된 4,947 bp의 페니실륨 크리소게넘으로부터 격리되어 있고 act 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 화합물.
  11. 두개의 HindIII 제한 부위들로 구속된 8,650 bp의 아크레모늄 크리소게넘으로부터 격리되어 있고 act 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 화합물.
  12. 페니실륨 크리소게넘의 gdh 유전자를 포함하는 서열번호 1의 DNA 서열.
  13. 페니실륨 크리소게넘의 hex 유전자를 포함하는 서열번호 2의 DNA 서열.
  14. 페니실륨 크리소게넘의 act 유전자를 포함하는 서열번호 3의 DNA 서열.
  15. 아크레모늄 크리소게넘의 act 유전자를 포함하는 서열번호 4의 DNA 서열.
  16. 제 8 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 DNA 화합물을 사용하여 제한 조건하에서 하이브리디제이션 가능한 뉴클레오티드 서열.
  17. 페니실륨 크리소게넘의 글루탐산 탈수소효소와 매치되는 서열번호 5의 아미노산 서열.
  18. 페니실륨 크리소게넘의 β-N-아세틸헥소사미니다제 효소와 매치되는 서열번호 6의 아미노산 서열.
  19. 페니실륨 크리소게넘의 γ-액틴 단백질과 매치되는 서열번호 7의 아미노산 서열.
  20. 아크레모늄 크리소게넘의 γ-액틴 단백질과 매치되는 서열번호 8의 아미노산 서열.
  21. 제 8 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 DNA 화합물 또는 그의 단편을 갖는 벡터.
  22. 제 21 항에 있어서, 플라스미드로 구성되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  23. 제 22 항에 있어서, pALP784, pALP785, pALfleo7로 구성되는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  24. 제 22 항에 있어서, pALP295, pALP319, pALP377, pALP388, pALP480으로 구성되는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  25. 제 22 항에 있어서, pALP315, pALP316으로 구성되는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  26. 제 22 항에 있어서, pALC52, pALC53으로 구성되는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  27. 상동 또는 이성 유전자들의 발현이 증가되게 형질 전환된 비인적 유기체를 생성시키는 방법에 있어서,
    전체적으로 또는 부분적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4, 또는 그의 재조합 DNA 화합물들을 포함하는 벡터들을 구성하는 단계(a)와,
    비인적 숙주 유기체들에 상기 벡터들을 도입하여 상동 또는 이성 유전자들 발현시키는 형질 전환된 유기체들을 생성시키는 단계(b)와,
    형질 전환되지 않은 제어 유기체들와 비교하여 상동 또는 이성 유전자의 발현 증가를 나타내는 형질 전환된 유기체들을 선택하는 단계(c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  28. 세포외 단백질을 생성시킬 수 있는 형질 전환된 비인적 유기체를 생성하는 방법에 있어서,
    전체적으로 또는 부분적으로 서열번호 2 또는 그의 재 조합 DNA 화합물들을 포함하는 벡터들을 구성하는 단계(a)와,
    비인적 숙주 유기체들에 상기 벡터들을 도입하여 하나 이상의 단백질을 발현 및 분비시키는 형질 전환된 유기체들을 생성시키는 단계(b)와,
    하나 이상의 단백질을 형질 전환되지 않은 제어 유기체들보다 높은 레벨로 분비시킬 수 있는 형질 전환된 유기체들을 선택하는 단계(c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  29. 안티센스 유전자를 발현시키고 활성이 전체적으로 또는 부분적으로 차단되게 되어 있는 형질 전환된 비인적 유기체를 생성시키는 방법에 있어서,
    전체적으로 또는 부분적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4, 또는 그의 재 조합 DNA 화합물들을 포함하는 벡터들을 구성하는 단계(a)와,
    비인적 숙주 유기체들에 상기 벡터들을 도입하여 안티센스 유전자를 발현시키는 형질 전환된 유기체들을 생성시키는 단계(b)와,
    형질 전환되지 않은 제어 유기체들와 비교하여 전체적으로 또는 부분적으로 유전자의 발현 차단을 나타내는 형질 전환된 유기체들을 선택하는 단계(c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  30. 제 27 항 또는 제 29 항에 있어서, 사용된 벡터들이 제 21 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 벡터이거나 그 벡터로부터 얻어진 벡터인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  31. 제 28 항에 있어서, 사용된 벡터들이 제 24 항의 벡터이거나 그 벡터로부터 얻어진 벡터인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  32. 제 27 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 숙주 유기체가 비인적 진핵생물, 바람직하게는 페니실륨 크리소게넘, 아스퍼길러스 니둘란스 또는 아크레노늄 크리소게넘인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 사용된 미생물은 바람직하게 페니실륨 크리소게넘, 아스퍼길러스 니둘란스 또는 아크레노늄 크리소게넘인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  34. 제 27 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 숙주 유기체는 원핵생물, 바람직하게 에스케리키아 콜리 또는 방선균류인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체의 생성방법.
  35. 제 21 항 내지 제 26 항의 벡터들에 전체적으로 또는 부분적으로 포함되고 제 27 항 내지 제 34 항의 방법에 의해 생성될 수 있는 제 8 항 내지 제 16 항의 DNA 서열이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 비인적 유기체.
  36. 제 35 항에 있어서, 원핵생물, 바람직하게 에스케리키아 콜리 또는 방선균류인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 유기체.
  37. 제 35 항에 있어서, 진핵생물, 바람직하게 페니실륨, 아스퍼길러스, 아크레노늄 또는 사카로마이세스속인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 유기체.
  38. 제 36 항에 있어서, 바람직하게 페니실륨 크리소게넘, 아스퍼길러스 니둘란스, 아크레노늄 크리소게넘, 또는 효모 균인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 유기체.
  39. 제 36 항에 있어서, CECT4849, CECT4852, CECT4851, CECT4850으로 표시되는 순수 균주들 또는 돌연변이체들 및 그의 형질 전환된 유도체들로 구성되는 것을 특징으로 하는 유기체.
  40. 제 35 항 내지 제 39 항의 형질 전환된 유기체의 항생물질의 제조에의 사용.
  41. 제 35 항 내지 제 39 항의 형질 전환된 유기체의 페니실린의 제조에의 사용.
  42. 제 35 항 내지 제 39 항의 형질 전환된 유기체의 세팔로스포린의 제조에의 사용.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) * 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.
US7378244B2 (en) * 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
ES2143408B1 (es) * 1998-04-02 2000-12-01 Urquima Sa Promotor y construcciones para expresion de proteinas recombinantes en hongos filamentosos.
WO2000052176A1 (de) * 1999-03-03 2000-09-08 Cilian Ag β-HEXOSAMINIDASE SOWIE DIESE KODIERENDE DNA-SEQUENZ AUS CILIATEN UND DEREN VERWENDUNG
WO2006036678A2 (en) * 2004-09-22 2006-04-06 Bioworks, Inc. Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
EP1801221A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-27 Sandoz AG Promoter sequences
CN102127546B (zh) * 2010-11-24 2012-10-24 山东农业大学 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8508800D0 (en) * 1985-04-04 1985-05-09 Glaxo Group Ltd Microbiological process
FI864473A (fi) * 1985-11-20 1987-05-21 Panlabs Inc Sammansatta yttryckskassetter foer fungaltransformering.
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

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