CZ353598A3 - Způsob zvýšení nebo blokování genové exprese pomocí promotorů genů glutamátdehydrogenázy, ß-N-hexózoaminidázy a gama-aktinu a použití takových promotorů pro výrobu antibiotik - Google Patents

Způsob zvýšení nebo blokování genové exprese pomocí promotorů genů glutamátdehydrogenázy, ß-N-hexózoaminidázy a gama-aktinu a použití takových promotorů pro výrobu antibiotik Download PDF

Info

Publication number
CZ353598A3
CZ353598A3 CZ983535A CZ353598A CZ353598A3 CZ 353598 A3 CZ353598 A3 CZ 353598A3 CZ 983535 A CZ983535 A CZ 983535A CZ 353598 A CZ353598 A CZ 353598A CZ 353598 A3 CZ353598 A3 CZ 353598A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
chrysogenum
sequence
dna
expression
Prior art date
Application number
CZ983535A
Other languages
English (en)
Inventor
Fuente José Luis Barredo
Saiz Marta Rodriguez
Valle Miguel Angel Moreno
De La Vieja Alfonso J. Collados
Maldonado Francisco Salto
Garcia Bruno Diez
Original Assignee
Antibioticos, S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Antibioticos, S. A. filed Critical Antibioticos, S. A.
Publication of CZ353598A3 publication Critical patent/CZ353598A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01052—Beta-N-acetylhexosaminidase (3.2.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Způsob zvýšení nebo blokování genové exprese pomocí promotorů genů glutamátdehydrogenázy, β-N-hexózoaminidázy a γ-aktinu a použití takových promotorů pro výrobu antibiotik
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká exprese genů gdh a hex z Pěnicillium chrysogenum a genu act z P. chrysogenum a Acremonium chrysogenum. Z analýzy nukleotidových sekvencí těchto genů se odvozuje existence promotorového úseku, který obsahuje místo počátku translace, a který může být použit k vytvoření výkonných expresních a sekrečních vektorů vhodných jak pro P. chrysogenum tak i A. chrysogenum a příbuzné druhy. Kromě toho se mohou tyto promotory využít pro blokování genové exprese pomocí „antisense (orientovaných proti smyslu transkripce) konstruktů. Exprese dalších genů vláknitých hub může být nasměrována pod kontrolu těchto promotorů, čímž se může zvýšit produkce antibiotik a/nebo vlastních proteinů.
Dosavadní stav techniky
P. chrysogenum a A. chrysogenum jsou průmyslově významné vláknité houby, neboť, mají schopnost vytvářet penicilín a cefalosporin. V uplynulém desetiletí se významně rozvinuly techniky genových manipulací použitelné pro oba mikroorganismy. K těmto technikám pro genové manipulace chrysogenum patří transformace
P. chrysogenum a A. protoplastů vektorem, který užívá gen rezistence R k fleomycinu (dále označovaný jako gen ble , Kolár M. et al., 1988, Gene 62, 127-134) jako selekční markér, a dále exprese dalších intaktních kopií požadovaných genů nebo nahrazení • ·
- 2 promotoru určitého genu jiným promotorem, který je schopen zlepšit expresi tohoto genu. Exprese homologních genů v houbách jako jsou P. chrysogenum nebo A. chrysogenum muže být negativně regulována, zatímco v případě heterologních genů se může stát, že jejich promotor není účinně rozpoznáván v těchto houbách. Aby se zabránilo takovým problémům, byly identifikovány a klonovány geny, které jsou exprimovány konstitutivně a jejichž exprese nepodléhá negativní katabolické regulaci, jejichž promotory jsou dále zvány „silné promotory. Obecně se má za to, že geny s vysokou úrovní exprese mají v promotorové úseku signál, který napomáhá vysoké úrovni transkripce a který hraje základní roli ve funkcích primárního buněčného metabolismu. K těmto genům patří gen kódující glutamátdehydrogenázu závislou na NADP (EC . 1.4.1.4) , dále označovaný jako gdh, β-N-hexózoaminidázu (EC.3.2.1.52), dále zvaný hex, a γ-aktin, dále zvaný act.
Existují dřívější publikace týkající se genů gdh, hex a act z mikroorganismů odlišných od těch, užívaných v předkládaném vynálezu. K relevantní bibliografii patří:
I) nukleotidová sekvence genu gdh houby Neurospora crassa (Kinnaird, J.H. a Fincham, J.R.S., 1983, Gene 26, 253-260) a regulace exprese genu gdhA z Aspergillus nidulans (Hawkins, A.R. et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 418, 105-111),
II) klonování a exprese genu hexl z Candida albicans (Canon,
R.D. et al., 1994, J. Bacteriol., 2640-2647), a
III) charakterizace genu act z A. nidulans (Fidel, S. et al., 1988, Gene 70, 283-293.
Expresi heterologních genů v P. chrysogenum pomocí promotorů z genů pcbC nebo penDE publikovali Cantwell, C.A. et al. , 1992 (Proč. R. Soc. London Ser. B268, 283-289). Kromě toho byly popsány také exprese heterologních genů • · • · · ·
- 3 v A. chrysogenum pomocí promotorů z genu β-isopropylmalátdehydrogenázy (zveřejněný japonský patent č. 80295/1989) a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (evropská patentová přihláška č. 0376226A1/1989).
Inaktivace genové exprese je někdy u průmyslových kmenů potřebná pro odstranění nežádoucí enzymové aktivity. Vzhledem k faktu, že úroveň ploidie mnoha průmyslových kmenů neumožňuje blokovat expresi přímým porušením genu, je třeba použít takový sytém inaktivace, který je nezávislý na úrovni ploidie organismu. Rozvoj technologie „antisense (orientovaných proti normálnímu smyslu transkripce) konstruktů, jejichž exprese je řízena silným promotorem, umožňuje přerušení genové exprese. Konstrukty tohoto typu jsou zvláště užitečné u průmyslových kmenů, neboů jejich úroveň ploidie (Kuenkel et al . , 1992, Appl. Microbiol. Biotech. 36, 499-502) komplikuje úplnou genovou inaktivaci. Použití „antisense konstruktů pro blokování enzymové aktivity bylo popsáno u kvasinek (Atkins, D. et al. , 1994, Biol. Chem. H-S 375, 721-729) a rostlin (Hamada, T., 1996, Transgenic Research 5, 115-121, John, M.E., 1996, Plant Mol. Biol. 30, 297-306). Promotor hex má tu zvláštní vlastnost, že kóduje extracelulární enzym, což umožňuje jeho použití pro expresi extracelulárních proteinů.
Dosud neexistují žádné publikace, popisující genové sekvence vláknitých hub uvedených v předkládaného vynálezu nebo enzymy syntetizované na základě jejich exprese. Dosud také nikdo nepublikoval použití silných promotorů genů z hub popsaných v předkládaného vynálezu pro expresi, sekreci nebo inaktivaci genové exprese.
• · · · • ·
- 4 Podstata vynálezu.
Použití silných promotorů k nadměrné expresi („overexpression dále nadexprese) určitých genů může vést ke zlepšení produkce penicilinu a cefalosporinu, a také k syntéze nových antibiotik odvozených od cefalosporinu.
Předkládaný vynález popisuje nový způsob získání kmenů P. chrysogenum a A. chrysogenum schopných exprimovat homologní nebo heterologní geny řízené silným promotorem. Charakterizace a následné použiti promotorů odpovídajících genům, které kódují glutamátdehydrogenázu závislou na NADP (EC.1.4.1.4) - gen gdh z P. chrysogenum, β-N-hexózoaminidázu (EC. 3 . 2 .1.52) - gen hex z P. chrysogenum, a γ-aktin - gen act z P. chrysogenum a A. chrysogenum jsou popsány ve vynálezu. Jedním z cílů předkládaného vynálezu je použití těchto promotorů k nadexpresi genů souvisejících s biosyntézou penicilinu a/nebo cefalosporinu ve výše zmíněných kmenech. Tyto promotory se také mohou použít k blokování genové exprese prostřednictvím „antisense konstruktů.
Předkládaný vynález je založen na P. chrysogenum a A. chrysogenum jakožto dárcích nukleové kyseliny. Jakmile byla purifikována genomová DNA, byly vytvořeny DNA knihovny pro oba mikroorganismy, jak popisují příklady 1 a 4, které byly podrobeny screeningu:
I) se syntetickými oligonukleotidy odpovídajícími genu gdh z N. crassa, aby bylo možné klonovat homologní gen z P. chrysogenum ,
II) s kombinací oligonukleotidů syntetizovaných na základě sekvence aminového konce β-N-hexózoaminidázy, aby se mohl klonovat gen hex z P. chrysogenum , a • · · · • · • · • · · · · · · > · · · · ·· · · · ···· • · · · · • ··· · · · · ·
- 5 III) s fragmentem genu act z A. nidulans, aby se klonovaly homologní geny z P. chrysogenum a A. chrysogenum.
Klony izolované na základě jejich schopnosti pozitivně hybridizovat s odpovídající sondou byly pak analyzovány a byla potvrzena přítomnost hledaných genů.
Gen gdh z P. chrysogenum byl identifikován v EcoRI fragmentu velikosti 7,2 kb a dvou BamHI fragmentech velikosti 2,9 a 1,5 kb. Restrikční mapa DNA obsahující tento gen je ukázána na obr. 1. Nukleotidová sekvence úseku 2 816 bp byla stanovena (sekvence id. č. 1) a obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) s významnným preferenčním vzorcem užití kodonů, jehož počáteční kodon translace ATG byl lokalizován v poloze 922 a terminační kodon translace byl lokalizován v poloze 2522. Byla také zjištěna přítomnost dvou intronů velikosti 159 bp a 56 bp v polohách 971 až 1130 a 1262 až 1318. Zmíněný ORF kóduje protein velikosti 49 837 Da, s izoelektrickým bodem 6,18, jehož sekvence 461 aminokyselin (sekvence id. č. 5) vykazuje 72,4% homologii s aminokyselinovou sekvencí enzymu glutamátdehydrogenázy závislé na NAD? z N. crassa. V promotorovém úseku byly nalezeny zóny bohaté na pyrimidiny, podobné těm zónám, které se vyskytují v silně exprimovaných genech, a také dva předpokládané TATA „boxy (t.j. úseky TATA sekvence, které byly v určitých promotorech hub nalezeny v poloze 30 až 50 bp „upstream (proti směru transkripce) od transkripčního počátku, viz Davis, M.A. a Hyneš, M.J., 1991, Gene Manipulation in Fungi, Academie Press, San Diego, California), a také CCAAT box (který se vyskytuje asi u 30 % promotorů eukaryotických genů ve vzdálenosti 50 až 200 bp „upstream od místa transkripčního počátku, viz Bucher, P., 1990, J. Mol. Biol. 212, 563-578). Tento promotor byl užit v P. chrysogenum a A. chrysogenum pro expresi genu pro • ·
- 6 β-galaktosidázy (dále označovaného lacZ) z E. coli a gen ble ze S. híndustanus. Pro tento účel byly zkonstruovány plazmidv pSKGSu a pALfleo7 (obr. 5), jak je popsáno v příkladu 1. Ze získaných výsledků lze odvodit, že promotor gdh (dále označovaný Pgdh) je schopen řídit expresi heterologních genů lacZ a bleR jak v P. chrysogenum tak i v A. chrysogenum a také v E. coli.
Rozvoj technologie „antisense konstruktů, jejichž ia silným promotorem, umožňuje přerušení Pro tento účel byl zkonstruován plazmid z se popisuje v části 1.3 příkladu 1. zvrdily možnost úplně nebo částečně nežádoucí enzymové aktivity u P. chrysogenum antisense konstruktu s hex z P. chrysogenum fragmentu velikosti 3,2 kb a
exprese je řízena
genové exprese. Pr
pALP888 (obr. 5) ,
Získané výsledky
blokovat nežádoucí
použitím „antisense
Gen hex z P.
byl identifikován v Sací Sáli fragmentu velikosti
2,1 kb. Restrikční mapa DNA obsahující tento gen je ukázána sekvence úseku 5240 bp byla 2) a potvrdilo se, že obsahuje s významným preferenčním na obr. 2. Nukleotídová stanovena (sekvence id. č. dva otevřené čtecí rámce (ORF) vzorcem užití kodonů, z nichž jeden odpovídá genu hex. Počáteční translační kodon ATG genu hex byl lokalizován v poloze 1324 a terminační kodon translace TGA byl lokalizován v poloze3112. Uvedený ORF nemá žádné introny a kóduje protein velikosti 66 545 Da, s izoelektrickým bodem 5,34, jehož sekvence 596 aminokyselin (sekvence id. č. 6) vykazuje 49,0% homologii s aminokyselinovou sekvencí enzymu β-N-hexózoaminidázy z Candida albicans. Kromě toho dedukovaná sekvence aminokyselin obsahuje polypeptidy chemicky určené z purifikovaného enzymu v polohách 19 až 40 a 99 až 120. V promotorovém úseku se nalézají zóny bohaté na pyrimidin a předpokládaný TATA box a CAAT box. Tento • · • ·
- 7 promotor byl použit k expresi genu ble ze S. hindustanus v P. chrysogenum. Pro tento účel byl zkonstruován plazmid pALP430 (obr. 6) jak je popsáno v příkladu 2. Ze získaných výsledků lze soudit, že promotor hex (dále zvaný Phex) je £ schopen řídit expresi heterologního genu ble v P. chrysogenum. Kromě toho skutečnost, že enzym β-Νhexózoaminidáza je proteinem v nadbytku vylučovaným z P. chryscgenum do kultivačního média, umožňuje použít gen hex pro expresi a sekreci homologních a heterologních proteinů v P. chryscgenum nebo příbuzných vláknitých houbách. Geny, které se mají exprimovat, se mohou fúzovat ve čtecím rámci s promotorovou oblastí, včetně signální sekvence genu hex pro sekreci anebo se mohou j inak fúzovat ve čtecím rámci s komplexním genem hex.
Gen act z P. chrysogenum (dále zvaný actPc) byl identifikován v BamHI fragmentu velikosti 5,2 kb, EcoRI fragmentu velikosti 4,9 kb a HindlII fragmentu velikosti
5,9 kb. Restrikční mapa DNA obsahující gen actPc je ukázána na obr. 3. Jakmile byla nukleotidová sekvence úseku 2994 bp byla stanovena (sekvence id. č. 3) potvrdila se existence otevřeného čtecího rámce (ORF) s významným preferenčním vzorcem užití. Počáteční translační kodon ATG genu act byl lokalizován v poloze 494 a terminační kodon translace TAA byl lokalizován v poloze 2250. Uvedený ORF má 5 intronú a kóduje protein velikosti 41 760 Da, s izoelektrickým bodem 5,51, jehož sekvence 375 aminokyselin (sekvence id. č. 7) vykazuje 98,1% homologii s aminokyselinovou sekvencí βaktinového proteinu z A. nidulans. V promotorovém úseku se nalézají dvě zóny bohaté na pyrimidin, předpokládaný TATA box a čtyři CAAT boxy. Tento promotor byl použit k expresi genu ble ze S. hindustanus v P. chrysogenum . Pro tento účel byl zkonstruován plazmid pALPfleol (obr. 6) jak je • · · » · · » · · 4 popsáno v příkladu 3. Ze získaných výsledků lze soudit, že promotor act z schopen řídit v P. chrysogenum Gen act z chrysogenum expresi (dále zvaný PactPc) je heterologního genu hle
i. chrysogenum (dále zvaný actAc) byl identifikován v Sail fragmentech velikosti 2,4 kb a 1,1 kb, Smál fragmentu o velikosti 3,9 kb a HindlII fragmentu velikosti 8,7 kb. Restrikční mapa DNA obsahující gen actAc je ukázána na obr. 4 3240 bp (sekvence id.
Určená nukleotidová sekvence úseku č. 4) potvrdila existenci otevřeného čtecího rámce (ORF) s významným preferenčním vzorcem užití kodonů. Počáteční translační kodon ATG byl nalezen v poloze 787 a terminační kodon translace TAA byl nalezen v poloze 2478. Uvedený ORF má 5 intronů a kóduje protein velikosti 41 612 Da, s izoelektrickým bodem 5,51, jehož sekvence 375 aminokyselin (sekvence id. č. 8) vykazuje 98,4% homologii a 98,1% identitu s aminokyselinovou sekvencí odpovídající β-aktinového proteinu z A. nidulans případně P. chrysogenum. V promotorovém úseku se nalézají zóny bohaté na pyrimidin a CAAT box, předpokládaný TATA box nebyl pozorován. Tento promotor byl použit k expresi genu bleR ze S. hindustanus v A. chrysogenum. Pro tento účel byl zkonstruován plazmid pALCfleol (obr. 6) jak je popsáno v příkladu 4. Ze získaných výsledků lze soudit, že promotor act z A. chrysogenum (dále zvaný PactAc) je schopen řídit expresi heterologního genu hle v A. chrysogenum.
Ve všech případech bylo dosaženo exprese heterologního genu řízené houbovým promotorem v P. chrysogenum nebo A. chrysogenum tím, že se fúzoval uvedený gen ve správném čtecím rámci. Ačkoliv geny lacZ a bleR byly exprimovány jako příklady, bylo by možné stejným způsobem exprimovat geny, které kódují enzymy účastnící se biosyntézy penicilinu:
- 9 pcbAB (α-aminoadipylcysteinylvalinsyntetáza), pcbC (syntéza isopenicilinu N) , penDE (acylkoA:6-APA acyltransferáza) , pel (ligáza fenylacetylkoA) a další, nebo cefalosporinu: pcbAB (cc-aminoadipylcysteinylvalinsyntetáza), pcbC (syntéza isopenicilinu N) , cefD (izomeráza isopenicilinu N) , cefEF (syntáza/hydroxyláza deacetoxycefalosporinu C), cefG (acetyltransferáza deacetylcefalosporinu C) a další. Gen, který má být exprimován, lze získat různými způsoby: izolovat z chromozomové DNA, syntetizovat cDNA z mRNA, syntetizovat zcela chemicky atd. Základní postupy pro správnou fúzi gen-promotor jsou popsány v Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, a v Asubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York, USA.
P. chrysogenum a A. chrysogenum byly použity jako hostitelské kmeny, ale jakékoliv příbuzné nebo mutantní kmeny z nich odvozené se mohou použit. Způsob přípravy protoplastů z P. chrysogenum a jejich transformace je založen na způsobu, který popsali Cantoral et al. V r. 1987 (Biotechnology 5: 494-497) a Diez et al. V r. 1987 (Curr. Genet. 12: 277-282) a který je popsán v příkladu 1. Příprava protoplastů a transformace A. chrysogenum jsou popsány v příkladu 4. V obou případech bylo využito antibiotikum fleomycin jako selekční markér a plazmidy pALfleo7, pALP480, pALPfleol nebo pALCfleol, které nesou gen ble , jehož exprese je řízena promotory Pgdh, Phex, PactPc a PactAc. Ale bylo by možné použít jakýkoliv markér, který je schopen selektivně oddělit transformované kmeny od ostatních, které nejsou transformované.
Transformanty se mohou pěstovat v kultivačním médiu obsahujícím zdroj uhlíku a dusíku, které mohou být • · asimilovány. Příklady zdrojů uhlíku jsou glukóza, sacharóza, laktóza, škrob, glycerin, organické kyseliny, alkoholy, mastné kyseliny a pod., buďto samotné nebo jejich kombinace. Příklady zdrojů dusíku jsou pepton, sladový extrakt, kvasnicový extrakt, výluh z kukuřice (kukuřičný liquor), gluten, močovina, amoniové soli, nitráty, NZ-aminy, síran amonný a pod., buďto samotné nebo jejich kombinace. Mezi anorganické soli, které se mohou užít jako složky kultivačního média, patří fosforečnany (např. fosforečnan draselný), sírany (síran sodný), chloridy (např. chlorid hořečnatý) a pod., a také železo, hořčík, vápník, mangan, kobalt a pod., které se mohou užít jako ionty. Kultivační podmínky jako je inkubační teplota, pH kultivačního média, aerace, čas inkubace atd. se musí zvolit a nastavit podle použitého kmene. Avšak obecně fermentace probíhá po 4 až 14 dnů v aerobních podmínkách při teplotě mezi 2 0 a 3 0 °C a pH mezi 5 a 9.
Stručně shrnuto, předkládaný vynález obsahuje:
I) fragmenty DNA obsahující promotory genů gdh a hex a act z P. chrysogenum a act gen z A. chrysogenum,
II) plazmidy obsahující výše zmíněné promotory společně s místem iniciace translace,
III) plazmid, ve kterém je strukturní gen nebo fragment kontrolu uvedených promotorů,
IV) kmeny P. chrysogenum a A. chrysogenum transformované uvedenými plazmidy,
V) transformované kmeny schopné exprimovat strukturní geny nebo „antisense DNA vložené do plazmidu pod kontrolu promotoru,
VI) transformované kmeny schopné vylučovat homologní nebo heterologní extracelulární proteiny pod kontrolou Phex.
homologní nebo heterologní „antisense DNA vložen pod • · ·· ·· ·
- 11 Následující příklady vynález podrobně popisují, aniž by ho jakkoliv omezovaly.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1.1. Klonování a charakterizace genu gdh z P. chrysogenum
S cílem klonovat gen gdh z P. chrysogenum byla vytvořena DNA knihovna ve fágovém vektoru XGEM12 postupy známými v oboru (viz Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989). Pro tento účel byla z houby izolována celková DNA postupem, který popsal Barredo et al. , 1994 (španělský patent P9400931) a částečně naštěpena restrikčním enzymem Sau3AI, fragmenty velikosti přibližně 20 kb byly purifikovány na sacharózovém gradientu (10 % až 40 %) . Tyto fragmenty byly ligovány s rameny vektoru, který byl předtím naštěpen BamHI a purifikován, a ligační směs byla zabalena („pakážována) in vitro pomocí soupravy Gigapack II Gold (Stratagene) podle pokynů výrobce. Balicí („pakážovací) reakční směs resuspendovaná v 500 μΐ SM byla použita k infekci E. coli LE392 pro titraci přítomných fágú a E. coli NM539 pro stanovení procenta rekombinantních fágú. E. coli NM539 je lyzogenní kmen fága P2 a vytváří lyžované plaky pouze v případě, že infikující fág nemá postradatelný centrální úsek. Titr fága byl 132 pfu/μΐ (celkem 66 000 pfu) v E. coli LE392 113 pfu/μΐ (celkem 56 500 pfu) v E. coli
NM539. To znamená, že asi 85 fágú neslo exogenní inzert DNA.
Počet rekombinantních fágů potřebný k vytvoření úplné knihovny byl vypočten podle rovnice: N = ln(1-p)/ln(1-f) , kde p je požadovaná pravděpodobnost, f je podíl genomu
- 12 • fl · · · · vybraného organismu přítomný v rekombinantě a N je potřebný počet rekombinant. Za předpokladu, že genom P. chrysogenum obsahuje asi 30 000 kb (Fierro et al. , 1993, Mol. Gen. Genet. 241: 573-578) a že průměrné zabalené inzerty byly velikosti 18 kb (přestože byly selektovány fragmenty velikosti 20 kb) úplná knihovna P. chrysogenum by měla být s 99,999% pravděpodobností získána z uvedeného získaného počtu rekombinant. Po sérii teoretických ověření byly
E. coli NM539 infikovány a úplná DNA knihovna byla nanesena na 5 Petriho misek o průměru 150 mm (přibližně 11 300 pfu/miska) a pak sebrána do 50 ml SM s 2,5 ml chlororformu a udržována při 4°C. Tímto způsobem byl kdykoliv dostupný pro vysetí na misky reprezentativní a dostatečný objem rekombinantního fága (5300 pfu/μΐ).
Přibližně 60 000 pfu bylo vyseto na 3 Petriho misky o průměru 150 mm a pak přeneseno na nitrocelulózové filtry (BamHI85, 0,4 μπι, Schleicher and Schuell) . Filtry pak byly hybridizovány standardním způsobem (viz Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, Τ. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989) se syntetickými oligonukleotidy odpovídajícími genu gdh z N. crassa. Celkem 10 pozitivních klonů bylo purifikováno cestou druhé a třetí hybridizace a jejich DNA byla naštěpena řadou restrikčních endonukleáz a analyzována technikou Southernova přenosu. Tímto způsobem byl identifikován gen gdh v EcoRI fragmentu velikosti 7,2 kb a dvou BamHI fragmentech velikosti 2,9 a 1,5 kb. Po odpovídajícím subklonování do plazmidů pBluescript I KS(+) (Stratagene) a pUC13 byly vytvořeny plazmidy pALP784 a pALP785, které odpovídají oběma orientacím fragmentu Sau3AI-XbaI velikosti 2,9 kb, který obsahuje gen gdh.
Restrikční mapa úseku DNA, který obsahuje tento gen, je ukázána na obr. 1.
Aby se určila nukleotidová sekvence genu, byla připravena řada klonů z plazmidů pALP784 a pALP785 metodou „odstranění báze („Erase a base, Promega) a pak byly sekvencovány pomocí soupravy „Sequenase (USB), v obou případech postupem doporučeným výrobcem. Získaná nukleotidová sekvence (sekvence id. č. 1) délky 2816 bp byla analyzována programem (DNASTAR) a potvrdilo se, že obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) s významným preferenčním vzorcem užití kodonů. Počáteční kodon translace ATG byl lokalizován v poloze 922 a terminační kodon translace byl lokalizován v poloze 2522. Byla také zjištěna přítomnost dvou intronů velikosti 159 bp a 56 bp v polohách 971 až 1130 a 1262 až 1318. Zmíněný ORF kóduje protein velikosti 49 837 Da, s izoelektrickým bodem 6,18, jehož sekvence 461 aminokyselin (sekvence id. č. 5) vykazuje 72,4% homologii s aminokyselinovou sekvencí enzymu glutamátdehydrogenázy závislé na NADP z N. crassa.
V promotorovém úseku byly nalezeny různé zóny bohaté na pyrimidiny, z nichž nejrozsáhlejší je lokalizována v poloze 766 až 796. Tyto zóny se nalézají v genech s vysokou expresí a leží bezprostředně „upstream od místa transkripčního počátku. Kromě toho jsou zde dva předpokládané TATA boxy (konsezuální sekvence u hub je TATAAA) v poloze 752 (TATATAATT) a 852 (TATAATTT). Tyto TATA boxy leží 30 a 50 bp „upstream od počátku translace a nejpravděpodobněji skutečný TATA box je ten ležící v poloze 752, tj . 42 bp „upstream od počátku transkripce. Sekvence CCAAT se nalézá v promotor úseku asi 30 % známých eukaryotických genů, a leží v poloze mezi 50 a 200 bp „upstream od počátku transkripce. CCAAT box leží v poloze 691 promotorového úseku • *
- 14 genu gdh, tj. asi 105 bp „upstream od předpokládaného místa počátku transkripce.
1.2. Exprese kontrolních genů v P. chrysogenum a A. chrysogenum řízená promotorem genu gdh
Transformace a selekce P. chrysogenum a A. chrysogenum byl proveden jak je popsáno v následujícím textu, v závislosti na jejich rezistenci k antibiotiku fleomycinu. pro tento účel bylo nutné zkonstruovat plazmid pALfleo7 o velikosti 5,4 kb, který nesl gen hleR ze S. hindustanus exprimovaný pod kontrolou Pgdh jakožto markér exprese v houbě, gen rezistence k chloramfenikolu jakožto markér pro E. coli a polylinker (vícečetné klonovací místo) z plazmid pBC KS( + ) (Stratagene).
Postupy použité pro přípravu protoplastů a vlastní transformaci P. chrysogenum byly popsány v Cantoral et al. , 1987, Biotechnology 5: 494-497) a Diez et al. , 1987, Curr.
Genet. 12: 277-282) a byly zde mírně modifikovány. Za prvé, P. chrysogenum se kultivovala v médiu PM (Aané, J. 1997, Agricultura 25) s přídavkem 10 % kvasnicového extraktu po 18 až 21 hodin při 25 °C a mycelium bylo izolováno filtrací přes nylonový filtr a opláchnuto 3 až 5 objemy 0,9% NaCl. Po osušení mezi filtračními papíry bylo resuspendováno (100 mg/ml) v protoplastovém pufru. Když byla suspenze mycélií homogenní, byl přidán jeden objem roztoku Caylázy (4 mg/ml, Cayla) v protoplastovém pufru a roztok se inkuboval 3 hodiny při 25 °C za protřepávání 100 rpm. Mikroskopicky se pozorovalo objevování protoplastů. Když se většina protoplastů uvolnila, byly separovány od mycélia filtrací přes nylonový filtr s velikostí pórů 30 μιτι. Suspenze protoplastů pak byla propláchnuta třikrát 0,7M KC1 a vždy odstředěna při 4000 g po 3 minuty mezi jednotlivými • · · ·
- 15 promytími. Precipitované protoplasty byly resuspendovány v 10 ml roztoku LCM a po stanovení koncentrace počítáním g
v Thomově komůrce byly neředěny na koncentraci 1 až 5 x 10 protoplastů/ ml v KCM. 100 pl tohoto roztoku bylo opatrně smícháno s 1 až 10 pg DNA a 10 pl PGM a směs se inkubovala v chlazené vodní lázni 20 minut. Pak se přidalo 500 ml PCM a směs byla udržována na teplotě místnosti 20 minut, pak se přidalo 600 pl KCM. Transformanty byly selektovány na základě přítomnosti genu rezistence k fleomycinu v plazmidech pALfleo7,pALP480 a pALPfleol růstem ve 30 pg/ml fleomycinu. 200 pl transformační reakční směsi se smíchalo s 5 ml média dle Czapecka s přídavkem sorbitolu (1M) a fleomycinu (30 pg/ml) a bylo naneseno společně s 5 ml téhož média na Petriho misku. Misky pak byly inkubovány při 25 °C dokud nebyly viditelné transformanty (4 až 8 dnů).
Postupy použité pro přípravu protoplastů a vlastní transformaci A. chrysogenum byly popsány v Gutierez et al. , 1991, Mol. Gen. Genet. 225: 56-64. Za prvé, kmen
A. chrysogenum se kultivoval v médiu po 2 0 až 24 hodin při 23 °C a mycelium bylo izolováno filtrací přes nylonový filtr a opláchnuto 3 až 5 objemy 0,9% NaCI. Po osušení mezi filtračními papíry bylo resuspendováno (50 mg/ml) v protoplastovém pufru. Když byla suspenze mycélií homogenní, byl přidán DTT do konečné koncentrace 10 mM a roztok se inkuboval 1 hodinu při 28 °C za protřepávání 150 rpm. Pak byl odstředěn 15 minut při 12 000 g a precipitát byl resuspendován ve 20 ml protoplastového pufru. Pak byl přidán jeden objem roztoku Caylázy (4 mg/ml, Cayla) v protoplastovém pufru a roztok se inkuboval 3 hodiny při 25 °C za protřepávání 100 rpm. Mikroskopicky se pozorovalo objevování protoplastů. Když se většina protoplastů uvolnila, byly separovány od mycélia filtrací přes nylonový • ·
- 16 filtr s velikostí pórů 25 μιπ. Suspenze protoplastů pak byla propláchnuta třikrát 0,7M KCl a vždy odstředěna při lOOOxg po 3 minuty mezi jednotlivými promytími. Precipitované protoplasty byly resuspendovány v 10 ml roztoku NCM a po stanovení koncentrace počítáním v Thomově komůrce byly naředěny na koncentraci 1 až 5 x 108 protoplastů/ ml v KCM. 100 μΐ tohoto roztoku bylo opatrně smícháno s 1 až 10 μ9 DNA a směs se inkubovala v chlazené vodní lázni 20 minut. Pak se přidal 1 ml CCM a směs byla udržována na teplotě místnosti dalších 20 minut. Směs byla odstředěna 5 minut při lOOOxg a sediment byl resuspendován v 800 ml pufru NCM. Transformanty byly selektovány na základě přítomnosti genu rezistence k fleomycinu v plazmidech pALfleo7 a pALPfleol růstem ve 10 μ9/τη1 fleomycinu. 200 μΐ transformační reakční směsi se smíchalo s 5 ml TSA média s přídavkem sacharózy (0,3M) a fleomycinu (10 μ9/ιη1) a bylo naneseno společně s 5 ml téhož média na Petriho misku. Misky pak byly inkubovány při 28 °C dokud nebyly viditelné transformanty (5 až 8 dnů).
Získané transformanty byly analyzovány na:
I) přítomnost DNA odpovídající plazmidu použitému pro transformaci,
II) existenci transkriptu odpovídajícího kontrolnímu genu a
III) enzymatickou aktivitu odpovídající exprimovanému genu. Celková DNA byla získána postupem který publikoval
Barredo et al. , 1994 (španělský patent P9400931) a byla analyzována metodou Southernova přenosu popsanou v Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989. Celková RNA byla izolována metodou popsanou v Asubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York, USA.
• · · · · ·
- 17 Získaná RNA byla uchovávána jako precipitát v etanolu při -20 °C. Aby s dala použít, byla izolována odstředěním při lOOOOxg po 20 minut. Rozdělení molekul RNA podle velikosti molekul bylo provedeno elektroforézou na agarózoformaldehydovém gelu. RNA pak byla přenesena na nitrocelulózový filtr a hybridizována se sondou, a to vše způsobem popsaným v Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989. Přítomnost hybridizačních pásů dosvědčila existenci transkriptů a tedy schopnost exprimovat bakteriální gen v hostitelské houbě P. chrysogenum nebo A. chrysogenum. Enzymová aktivita β-galaktozidázy byla u transformant hodnocena způsobem popsaným v Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989. Exprese genu rezistence k fleomycinu byla hodnocena na základě rezistence, kterou získaly P. chrysogenum a A. chrysogenum po inkubaci na pevném médiu dle Czapecka po 7 dní při 25 °C.
1.2.1. Exprese genu LacZ z E. coli v P. chrysogenum a E. coli pod kontrolou Pgdh
Gen lacZ z E. coli byl translačně fúzován s genem Pgdh s cílem exprimovat homologní v P. chrysogenum. Gen lacZ byl proto subklonován mezi místa EcoRI a Sáli plazmid pMLl (Carramolino et al. , 1989, Gene 77: 31-38), čímž vznikl plazmid pMLac. Pgdh byl pak vložen mei místa EcoRI a Smál v plazmidu pMLac, čímž vznikl plazmid pSKG (obr. 5). Nakonec byl vložen gen pro sulfonamidovou rezistenci (Carramolino et al. , 1989, Gene 77: 31-38) byl vložen do místa EcoRI v pSKG a byl tak vytvořen plazmid pSKGSu (Obr. 5) . U transformant P. chrysogenum obsahujících plazmid pSKGSu selektovaných na ·»··
- 18 ·· 00 » · · « I · · · • « · · <
• · 4 • 0 · · rezistenci k sulfonamidu byly provedeny analýzy na přítomnost plazmidu Southernovým přenosem a na přítomnost transkriptu odpovídajícího genu lacZ northernovým přenosem. Aktivita β-galaktosidázy byla měřena u transformant, které byly pozitivní ve dvou předchozích testech. Transformanty účinně exprimovaly gen lacZ z E. coli a bylo pozorováno, že úroveň β-galaktosidázové aktivity byla vyšší u těch transformant, které obsahovaly kopii plazmidu integrovanou v genomu než u transformant s jednou kopií exprimujících gen lacZ pod kontrolou promotoru genu pro tryptofan C (trpC). Plazmid pSKG byl zaveden do E. coli DH5a ( hlacZ) s cílem zjistit, zda Pgdh z P. chrysogenum je schopen řídit expresi lacZ v E. coli. Získané transformanty měly schopnost vytvářet modře zbarvené kolonie po 10 dnech inkubace při 25 °C v LB médiu, ke kterému se přidal isopropyl-β-Οgalaktozid (IPTG) a 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-^-Dgalaktozid. Výsledek potvrdil, že konstrukt Pgdh-lacZ exprimuje enzym β-galaktosidázu v E. Coli, i když s menší účinností než endogenní gen E. coli.
1.2.2. Exprese genu bleR ze S. hindustanus v P. chrysogenum a A. chrysogenum řízená promotorem Pgdh
Gen bleR bez svého promotoru byl získán z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. , 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) jakožto fragment Ncol-Apal o délce 1 100 bp. Tento fragment byl subklonován do plazmidu pUT713 předtím naštěpeného Ncol a Apal, čímž vznikl plazmid pALfleo5. Pgdh byl získán z pALP25 jako EcoRI-BamHI fragment dlouhý 726 bp a byl subklonován do pALfleo5 (předtím naštěpeného ECoRI a BamHI) a byl tak vytvořen pALfleo6. Tento plazmid má velikost
4,2 kb, exprese genu bleR je řízena promotorem Pgdh a obsahuje gen rezistence k ampicilinu jako markér pro
- 19 E. coli. S cílem nahradit tento markér byl izolován gen rezistence k chloramfenikolu, jako EcoRI-Notl fragment genu trpC (TtrpCj , plazmidu pBC KS Notl. To vedlo velikosti 5,4 kb, a A. chrysogenum byly a transformanty byly rezistence k fleomycinu obsahující Pgdh , ble a terminátor z z plazmidu pALfleo6 a ligován do (+)(Stratgene) naštěpeného EcoRI a k vytvoření plazmidu pALfleo7 (obr. 5) který nese gen bleR ze S. hindustanus řízený promotorem Pgdh jako selekční markér pro houby, gen rezistence k chloramfenikolu jako markér pro E. coli a polylinker z plazmidu pBC kS ( + ) . Sekvencování úseku fúze mezi Pgdh a bleR potvrdilo uspořádání genu bleR ve správném čtecím rámci.
Transformace P. chrysogenum provedeny plazmidem pALfleo7 selektovány na základě jejich v koncentraci 30 pg/ml a 10 pg/ml. Nejvyšší rezistence bylo dosaženo na pevném médiu, kde byly získány některé transformanty schopné růst v přítomnosti více než 100 pg/ml fleomycinu. U transformant selektovaných na rezistenci k fleomycinu byly provedeny analýzy na přítomnost plazmidu Southernovým přenosem a na existenci příslušného transkriptu northernovým přenosem a v obou případech byly výsledky pozitivní. Tyto výsledky potvrdily možnost exprimovat heterologní geny v P. chrysogenum a A. chrysogenum pod kontrolou promotoru Pgdh.
Plazmid pALfleo7 byl zaveden do E. coli, aby se zjistilo, zda Pgdh z P. chrysogenum je schopen řídit expresi genu bleR v E. coli. Získané transformanty měly schopnost růst na médiu LB s 0,2 pg/ml fleomycinu, nejmenší inhibující koncentrace fleomycinu byla menší než 0,025 pg/ml pro E. coli. Výsledek potvrdil, že Pgdh byl exprimován v E. Coli, i když s menší účinností než v P. chrysogenum.
• ·· ·· »· · · · · • · · ·· • · ···· ♦ • · · · ·*· ·· *· • · · · • · · • · * · • · · · ·· ·· ·
- 20 ·· ··♦·
E. coli DH5a transformované plazmidem pALfleo7 byly uloženy ve Španělské sbírce vzorových kultur (CECT) pod č. CECT4849. Ostatní plazmidy jako např. pALP784 a pALP785 se mohou získat z uloženého plazmidu jednoduše výběrem fragmentu Sau3AI-XbaI velikosti 2,9 kb pomocí hybridizace s promotorem genu gdh vloženého v pALfleo7 a subklonováním do pBluescriptl KS (+) nebo puC13.
1.3. „Antisense exprese v P. chrysogenum a A. chrysogenum řízená promotorem gdh
U průmyslových kmenů je někdy nezbytná pro odstranění nežádoucí enzymové aktivity. Vzhledem k faktu, že úroveň ploidie mnoha průmyslových kmenů neumožňuje blokovat expresi přímým porušením genu, je třeba použít takový sytém inaktivace, který je nezávislý na úrovni ploidie organismu. Rozvoj technologie „antisense (orientovaných proti normálnímu smyslu transkripce) konstruktů, jejichž exprese je řízena silným promotorem, umožňuje přerušení genové exprese.
Jako příklad takového přístupu je v následujícím textu popsáno použití Pgdh k inaktivaci exprese genu kódujícího fenylacetát-2-hydroxylázu (pahA) v P. chrysogenum. Nejdříve byl vytvořen plazmid pALP873 nesoucí Pgdh a TtrpC fúzované prostřednictvím jedinečného místa BamHI. Plazmid pALP873 byl naštěpen BamHI, konce byly doplněny pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy I a byl ligován s cDNA fragmentem velikosti 1 053 bp genu pahA získaným z plazmidu pALP555 štěpení EcoRV. Výsledný plazmid, nazvaný pALP874, byl vybrán, neboř nesl fragment genu pahH v orientaci „antisense (proti směru transkripce) vzhledem k Pgdh. Fragment EcoRI-Xbal velikosti 2,5 kb nesoucí „antisense kazetu byl purifikován, doplněn Klenowovým fragmentem • · a subklonován do EcoRV místa plazmidu pALfleo7, čímž vznikl plazmid pALP888. Tento plazmid je velký 7,9 kb a nese:
I) „antisense kazetu genu pahA řízeného Pgdh,
II) gen bleR jako slekční markér v houbách,
III) gen rezistence k chloramfenikolu jako markér v E. coli,
IV) polylinker plazmidu pBC KS (+).
Byla provedena transformace P. chrysogenum plazmidem pALP888 a transformanty byly selektovány na základě jejich rezistence k 30 μ9/ιη1 fleomycinu. Z vybraných transformant asi 20 % vykazovalo sníženou schopnost oxidovat kyselinu fenyloctovou, a některé zcela postrádaly detekovatelnou aktivitu. U těchto transformant byly provedeny testy na přítomnost plazmidu Southernovým přenosem a existenci „antisense transkriptu odpovídajícího genu pahA northernovým přenosem, pomocí sondy z oligonukleotidu odpovídajícího kódujícímu řetězci. V obou případech byly získány pozitivní výsledky, což potvrzuje možnost bud' úplně nebo alespoň částečně blokovat nežádoucí enzymovou aktivitu v P. chrysogenum pomocí „antisense konstruktu. Tyto výsledky se mohou extrapolovat na všechny vláknité houby a na všechny enzymy, a to použitím kteréhokoliv z promotorů popsaných v předkládaném vynálezu (Pgdh, Phex, PactPc a PactAc) nebo jiného dostupného promotoru.
Příklad 2
2.1. Klonování a charakterizace genu hex z P. chrysogenum
V myceliu P. chrysogenum získaném průmyslovou fermentací při výrobě penicilinu G byla prokázána přítomnost hlavního proteinu, který byl β-N-hexózoaminidáza. Aminokyselinová konce purifikovaného proteinu byla identifikován jako sekvence aminového stanovena Edmanovou degradační metodou a byly tak získány dvě odlišné sekvence:
• · · · · ·
A) Ala-Pro-Ser-Gly-Ile-His-Asn-Val-Asp-Val-(His)-Val-Val(Asp)-Asn-(Asp)-Ala-(Asp)-Leu-Gln-Tyr-(Gly)
B) Val-Gln-Val-Asn-Pro-Leu-Pro-Leu-Pro-Ala-Pro-(Arg)-(Arg)Ile-(Thr)-???-(Gly)-(Ser)-(Ser)-(Gly)-(Pro)-(Ile/Thr)-???(Val).
Na základě těchto sekvencí a za předpokládaného trendu ve využití kodonů, který existuje v řadě genů P. chrysogenum, byly navrženy následující kombinace oligonukleotidových primerů:
I) 5'TCGACGACGTGSACGTCSACGTTGTGGATGCC3
II) 5'CCGTAYTGSAGGTCRGCGTCGTTGTCGACGAC3'
III) 5GGGGCVGGSAGVGGTTTGACYTG3'
Gen hex z P. chrysogenum byl klonován pomocí knihovny a postupem popsaným v příkladu 1. Celkem bylo purifikováno 11 pozitivních klonů e jejich DNA byla naštěpena řadou restrikčních endonukleáz a analyzována technikou Southernova přenosu. Tímto způsobem byl gen hex identifikován v Sací fragmentu velikosti 3,2kb a Sáli fragmentu velikosti 2,1 kb. Subklonováním fragmentu Sall v obou orientacích do plazmidu pBC KS (+) vznikly plazmidy pALP295 a pALP303.
Pro stanovení nukleotidové sekvence genu hex byly použity plazmidy pALP295 a pALP303, a také plazmidy pALP319 a pALP461 (fragment BamHI velikosti 2,8 kb v obou orientacích), pALP388 a pALP 389 (fragment Sall velikosti 2,4 kb v obou orientacích) a pALP377 a pALP378 (fragment Pstl velikosti 1,2 kb v obou orientacích) (obr. 2) . Řada klonů z výše uvedených plazmidů byla připravena metodou „odstranění báze („Erase a base, Promega) a pak byly sekvencovány pomocí soupravy „Sequenase (USB), v obou případech postupem doporučeným výrobcem. Získaná nukleotidová sekvence (sekvence id. č. 2) délky 5240 bp byla analyzována programem Geneplot (DNASTAR) a potvrdilo · ·
- 23 99 *· se, že obsahuje dva otevřené čtecí rámce (ORF) s významným preferenčním vzorcem užití kodonů. Počáteční translační kodon ATG genu hex byl nalezen v poloze 1324 a terminační kodon translace TGA byl nalezen v poloze 3112. Uvedený ORF nemá žádné introny a kóduje protein velikosti 66 545 Da, s izoelektrickým bodem 5,34, jehož sekvence 596 aminokyselin (sekvence id. č. 6) vykazuje 49,0% homologii s aminokyselinovou sekvencí enzymu β-N-hexózoaminidázy z Candida albicans. Kromě toho dedukovaná sekvence aminokyselin obsahuje polypeptidy chemicky určené z purifikovaného enzymu v polohách 19 až 40 a 99 až 120. Rozpoznávací místo proteázy (Lys-Arg) se vyskytuje v poloze bezprostředně sousedící s aminokyselinovou sekvencí A) popsanou výše (aminokyseliny 97 až 98) .
V promotorovém úseku se nalézají dvě zóny bohaté na pyrimidin v polohách 1106 až 1128 a 1182 až 1200 a předpokládaný TATA box v poloze 1258 (ATAAATA) a CAAT box v poloze 1163.
2.2. Exprese genu bleR ze S. hindustanus v P. chrysogenum řízená Phex
I) transformace a selekce P. chrysogenum transformant, II) analýza DNA, III)analýza RNA a IV)enzymová měření byly provedeny stejně jako je popsáno v části 1.2 příkladu 1.
Pro expresi genu bleR pod kontrolou promotoru Phex bylo nejdříve zkonstruováno místo Ncol pro počáteční methionin nad ATG kodonem genu hex. To bylo provedeno pomocí PCR užitím následujících oligonukleotidú jako primerů:
5'CTCCATGGTGATAAGGTGAGTGACGATG3'
5'GTAAAACGACGGCCAGTG3'
Fragmenty DNA získané PCR byly subklonovány v obou orientacích do Smál místa v plazmídu pBC KS (+)(Stratagene),
- 24 čímž vznikly plazmidy pALP427 a pALP428. Inzerty v obou plazmidech byly sekvencovány pomocí souprav „Erase a base (Promega) a „Sequenase (USB) v obou případech podle instrukcí výrobce. Tak se ukázalo, že získaný gen Phex postrádá mutace a obsahuje Ncol míst nad kodonem ATG, který kóduje počáteční methionin proteinu.
Plazmid pALP427 byl vybrán pro subklonování genu bleR. Gen bleR bet promotorového úseku byl získán z plazmidu pUT737 (Mullanay et al. , 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) jako Ncol-Apal fragment velikosti 1 100 bp. Tento fragment byl pak subklonován do plazmidu pALP427 (nesoucího Phex) předtím naštěpeného Ncol a Apal, čímž vznikl plazmid pALP480 (obr. 6) . Tento plazmid je velký 5,4 kb, exprese genu bleR je řízena promotorem Phex, a dále obsahuje terminátor trpC genu za genem ble a gen rezistence k chloramfenikolu jako markér pro E. coli, a polylinker z plazmidu pBC KS ( + ) . Sekvencování úseku fúze mezi Phex a bleR potvrdilo, že gen je uspořádán ve správném čtecím rámci.
Transformace P. chrysogenum byla provedena plazmidem pALP480 a transformanty byly selektovány na základě jejich rezistence k fleomycinu v koncentraci 30 pg/ml. Nejvyšší rezistence bylo dosaženo na pevném médiu, kde byly získány některé transformanty schopné růst v přítomnosti více než 100 pg/ml fleomycinu. U transformant selektovaných na rezistenci k fleomycinu byly provedeny analýzy na přítomnost plazmidu Southernovým přenosem a na existenci příslušného transkriptu genu bleR northernovým přenosem a v obou případech byly výsledky pozitivní. Tyto výsledky potvrdily možnost exprimovat heterologní geny v P. chrysogenum pod kontrolou promotoru Pgdh.
E. coli DH5a transformované plazmidem pALP480 byly uloženy ve Španělské sbírce vzorových kultur (CECT) pod
- 25 č. CECT4852. Ostatní plazmidy jako např. pALP295, pALP319 a pALP388 se mohou získat z uloženého plazmidu jednoduše výběrem fragmentů Sáli velikosti 2,1 kb, BamHI velikosti 2,8kb, Pstl velikosti 1,2 a Sáli velikosti 2,4 kb pomocí hybridizace s promotorem genu hex vloženého v pALP480 a subklonováním do pBluescriptl KS (+).
2.3. Extracelulární produkce proteinů v P. chrysogenum použitím genu hex
Enzym β-N-hexózoaminidáza je proteinem v nadbytku secernovaným P. chrysogenum do kultivačního média v průmyslových fermentorech při výrobě peniclinu G, což umožňuje použít gen hex pro expresi a sekreci homologních a heterologních proteinů v P. chrysogenum nebo příbuzných vláknitých houbách.
Enzym má sekreční signální sekvenci následujícího složení:
Met-Lys-Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Thr-AlaSer-Ala (sekvence id. č. 6, aminokyseliny 1 až 18). Obecně mají signální peptidy tři konzervativní strukturní domény (Takizawa, N. et al. , 1994, Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications, Murooka, Y.
a Imanaka, T (ed), Marcel Dekker, Inc., New York):
I) pozitivně nabitý úsek aminového konce zvaný „n, který má obvykle 1 až 5 reziduí a je nezbytný pro účinnou translokaci proteinu pře membránu (Met-Lys),
II) hydrofóbní úsek zvaný „h tvořený 7 až 15 rezidui (PheAla-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu) a
III) polární úsek na karboxylovém konci, zvaný „c, tvořený obvykle 3 až 7 rezidui (Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala).
Intracelulárně tvořený pre-protein je opracován tím, že je štěpen ve štěpném místě tvořeném dvěma aminokyselinovými
zbytky (Lys-Arg, aminokyseliny 97 a 98 v sekvenci id. č. 6), čímž vzniká maturovaný protein.
Pokud jde o expresi a sekreci proteinů užitím genu hex, existují dvě možnosti:
I) fúzovat promotorovy úsek, včetně sekreční signální sekvence, s kódujícím úsekem požadovaného genu, který má být exprimován, a
II) fúzovat ve čtecím rámci úplný gen hex s kódujícím úsekem požadovaného genu, který má být exprimován.
Pomocí standardních postupů (viz Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, a Asubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York, USA.) je kterýkoliv odborník schopen použít promotor genu hex včetně sekreční signální sekvence, nebo případně celý gen, pro expresi a sekreci požadovaných proteinů v P. chrysogenum nebo příbuzných vláknitých houbách.
Příklad 3
3.1. Klonování a charakterizace genu act z P. chrysogenum
Gen act z P. chrysogenum byl klonován pomocí knihovny a postupem popsaným v příkladu 1. v tomto případě proběhla hybridizace s fragmentem Ncol-Clal velikosti 888bp pocházejícím z genu act z A. nidulans (Fidel et al. , 1988,
Gene 70: 283-293). Celkem bylo purifikováno 10 pozitivních klonů e jejich DNA byla naštěpena řadou restrikčních endonukleáz a analyzována technikou Southernova přenosu. Tímto způsobem byl gen act identifikován v BamHI fragmentu velikosti 5,2 kb, EcoRI velikosti 4,9 kb a HindlII fragmentu velikosti 5,9 kb. Subklonováním fragmentu HindlII v obou orientacích do plazmidů pBC KS (+) vznikly plazmidy pALP298 • · * ·
* a pALP299. Restrikční mapa DNA úseku obsahujícího gen act je ukázána na obr. 3.
Pro stanovení nukleotidové sekvence genu act byly použity výše zmíněné plazmidy. Byla z nich připravena řada klonů metodou „odstranění báze („Erase a base, Promega) a pak byly sekvencovány pomocí soupravy „Sequenase (USB), v obou případech postupem doporučeným výrobcem. Získaná nukleotidová sekvence (sekvence id. č. 3) délky 2994 bp byla analyzována programem Geneplot (DNASTAR) a potvrdilo se, že obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) s významným preferenčním vzorcem užití kodonú. Počáteční translační kodon ATG genu act byl nalezen v poloze 4 94 a terminační kodon translace TAA byl nalezen v poloze 2250. Uvedený ORF má 5 intronů v polohách 501 až 616, 649 až 845, 905 až 1046, 1078 až 1180 a 1953 až 2021 a kóduje protein velikosti 41 760 Da, s izoelektrickým bodem 5,51, jehož sekvence 375 aminokyselin (sekvence id. č. 7) vykazuje 98,1% homologii s aminokyselinovou sekvencí β-aktinového proteinu z A. nidulans. V promotorovém úseku se nalézají dvě rozsáhlé zóny bohaté na pyrimidin v polohách 356 až 404 a 418 až 469, předpokládaný TATA box v poloze 259 (TATAAAAAT) a čtyři CAAT boxy v polohách 174, 217, 230 a 337.
3.2. Exprese genu bleR v P. chrysogenum řízená promotorem PactPc
Pro expresi genu bleR pod kontrolou promotoru PactPc bylo nejdříve zkonstruováno místo Ncol nad ATG kodonem pro počáteční methionin genu hex. To bylo provedeno pomocí PCR užitím následujících oligonukleotidú jako primerů:
5'CTCCATGGTGACTGATTAAACAAGGGAC3'
5'GTAAAACGACGGCCAGTG3' (primer -20)
Fragmenty DNA získané PCR byly subklonovány v obou orientacích do Smál místa v plazmidu pBC KS (+)(Stratagene), čímž vznikly plazmidy pALPactl a pALPactž. Inzerty v obou plazmidech byly sekvencovány pomocí souprav „Erase a base (Promega) a „Sequenase (USB) v obou případech podle instrukcí výrobce. Tak se ukázalo, že získaný gen PactPc postrádá mutace a obsahuje Ncol míst nad kodonem ATG, který kóduje počáteční methionin proteinu.
Plazmid pALPactl byl vybrán pro subklonovani genu ble . Gen bleR bez promotorového úseku byl získán z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. , 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) jako Ncol-Apal fragment velikosti 1 100 bp. Tento fragment byl pak subklonován do plazmidu pALPactl (nesoucího PactPc) předtím naštěpeného Ncol a Apal, čímž vznikl plazmid pALPfleol (obr. 6) . Tento plazmid exprimuje gen bleR pod kontrolou promotoru PactPc, a dále obsahuje terminátor trpC genu za genem bleR a gen rezistence k chloramfenikolu jako markér pro E. coli, a polylinker z plazmidu pBC KS ( + ) . Sekvencování úseku fúze mezi PactPc a ble potvrdilo, že gen je uspořádán ve správném čtecím rámci.
Transformace P. chrysogenum byla provedena plazmidem pALPfleol a transformanty byly selektovány na základě jejich rezistence k fleomycinu v koncentraci 30 pg/ml. Nejvyšší rezistence bylo dosaženo na pevném médiu, kde byly získány některé transformanty schopné růst v přítomnosti více než 100 μg/ml fleomycinu. U transformant selektovaných na rezistenci k fleomycinu byly provedeny analýzy na přítomnost plazmidu Southernovým přenosem a na existenci příslušného transkriptu genu bleR northernovým přenosem a v obou případech byly výsledky pozitivní. Tyto výsledky potvrdily možnost exprimovat heterologní geny v P. chrysogenum pod kontrolou promotoru PactPc • · • · • · · · • · ·· • « · · ·
- 29 E. coli DH5a transformované plazmidem pALP315, který nese gen act, byly uloženy ve Španělské sbírce vzorových kultur (CECT) pod č. CECT4851. Plazmid pALP316 se může získat z uloženého plazmidů jednoduše subklonováním inzertu z pALP315 do místa EcoRI v plazmidů pBluescriptl KS (+) v opačné orientaci.
Příklad 4
4.1. Klonování a chararkterizace genu act z A. chrysogenum
S cílem klonovat gen act z A. chrysogenum byla vytvořena DNA knihovna ve fágovém vektoru ÁGEM12 jak je popsáno v příkladu 1. Titr fága byl 50 pfu/μΐ (celkem 25 000 pfu) v E. coli LE392 a 41 pfu/μΐ (celkem 20 000 pfu) v E. coli NM539. To znamenalo, že asi 82 % fágu neslo exogenní inzert a že úplná knihovna A. chrysogenum byla získána s 99,999% pravděpodobností. Po sérii teoretických ověření byly E. coli NM539 infikovány a úplná DNA knihovna byla nanesena na 3 Petriho misky o průměru 150 mm (přibližně 7000 pfu/miska) a pak sebrána do 50 ml SM s 2,5 ml chlororformu a udržována při 4°C. Tímto způsobem byl kdykoliv dostupný pro vysetí na misky reprezentativní a dostatečný objem rekombinantního fága (2100 pfu/μΐ).
Přibližně 20 000 pfu bylo vyseto na 2 Petriho misky o průměru 150 mm a pak přeneseno na nitrocelulózové filtry (Ba85, 0,4 μπι, Schleicher and Schuell) . Filtry pak byly hybridizovány standardním způsobem (viz Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989) s fragmentem Ncol-Clal velikosti 888 bp odpovídajícím genu act z A. nidulans. Celkem 5 pozitivních klonů bylo purifikováno a jejich DNA byla naštěpena řadou restrikčních endonukleáz a analyzována technikou Southernova přenosu. Gen • · · ·
- 30 act byl identifikován v HindlII fragmentu velikosti 8,7 kb. tento fragment byl subklonován v obou orientacích do plazmidu pBluescript I KS ( + ) (Stratagene), čímž vznikly plazmidy pALC52 a pALC53. Restrikční mapa DNA obsahující gen act je ukázána na obr. 4.
Plazmidy pALC52 a pALC53 byly použity k určení nukleotidové sekvence genu act. Byla připravena řada klonů z uvedených plazmidu metodou „odstranění báze („Erase a base, Promega) a pak byly sekvencovány pomocí soupravy „Sequenase (USB), v obou případech postupem doporučeným výrobcem. Získaná nukleotidová sekvence (sekvence id. č. 4) délky 3240 bp byla analyzována programem Geneplot (DNASTAR) a potvrdila se existence ORF s významnným preferenčním vzorcem užití kodonů. Počáteční translační kodon ATG byl nalezen v poloze 787 a terminační kodon translace TAA byl nalezen v poloze 2478. Uvedený ORF má 5 intronů v polohách 794 až 920, 952 až 1123, 1180 až 1289, 1321 až 1289, 1321 až 1410 a 2183 až 2249 a kóduje protein velikosti 41 612 Da, s izoelektrickým bodem 5,51, jehož sekvence 375 aminokyselin (sekvence id. č. 8) vykazuje 98,4% homologii a 98,1% identitu s aminokyselinovou sekvencí odpovídající β-aktinového proteinu z A. nidulans případně P. chrysogenum. V promotorovém úseku se nalézá zóna bohatá na pyrimidin v poloze 607 až 654, předpokládaný TATA box v poloze 747 (TTATAAAA) a CAAT box v poloze 338.
4.2. Exprese genu bleR v A. chrysogenum řízená promotorem PactAc
Plazmid pALCfleol (obr. 6), obsahující gen bleR exprimovaný pod kontrolou PactAc, terminátor genu trpC za genem bleR, gen rezistence k chloramfenikolu jako markér pro • · < · · ·
- 31 E. coli a polylinker z plazmidu pBC KS ( + ) byl zkonstruován pro účel exprese genu bleR řízené promotorem PactAc.
Gen bleR bez svého promotoru byl získán z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. , 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) jakožto fragment Ncol-Apal o délce 1 100 bp. Tento fragment byl fúzován ve čtecím rámci s PactAc s využitím faktu, že gen act má místo Ncol nad kodonem ATG, který kóduje počáteční methionin proteinu. Proto byl gen ble subklonovan do plazmidu pALCactl (nesoucího gen PactAc) předtím naštěpeného Ncol a Apal, čímž vznikl plazmid pALCfleol (obr. 6) . Sekvencování úseku fúze mezi PactAca bleR potvrdilo, uspořádání genu bleR ve správném čtecím rámci.
Transformace A. chrysogenum byla provedena plazmidem pALCfleol a transformanty byly selektovány na základě jejich rezistence k fleomycinu v koncentraci 10 μg/ml. Nejvyšší rezistence bylo dosaženo na pevném médiu, kde byly získány některé transformanty schopné růst v přítomnosti více než 30 μg/ml fleomycinu. U transformant selektovaných na rezistenci k fleomycinu byly provedeny analýzy na přítomnost plazmidu Southernovým přenosem a na existenci transkriptu genu bleR northernovým přenosem a v obou případech byly výsledky pozitivní. Tyto výsledky potvrdily možnost exprimovat heterologní geny v A. chrysogenum pod kontrolou promotoru PactAc.
E. coli DH5a transformované plazmidem pALC52 nesoucím gen act byly uloženy ve Španělské sbírce vzorových kultur (CECT) pod č. CECT4850. Plazmid pALC53 se může získat snadno z uloženého plazmidu subklonováním inzertu do místa Hindlll v pBluescriptl KS (+) v opačné orientaci.
Zavedení inzertů, přítomných v uložených plazmidech, pomocí hostitele E. coli do aktinomycet, Penicillium,
Aspergillus, Acremonium nebo Saccharomyces, je jen otázkou
- 32 rutinního postupu a výběru nejvhodnějších vektorů pro transformaci organismů zvolených druhů nebo čeledí.
Popis obrázků
Obr. 1. - Restrikční mapa genu gdh z P. chrysogenum , který kóduje enzym s aktivitou glutamátdehydrogenázy závislé na NADP (EC.1.4.1.4) .
Obr. 2. - Restrikční mapa genu hex z P. chrysogenum, který kóduje enzym s aktivitou β-N-hexózoaminidázy (EC.3.2.1.52).
Obr. 3. - Restrikční mapa genu act z P. chrysogenum, který kóduje γ-aktin.
Obr. 4. - Restrikční mapa genu act z A. chrysogenum, který kóduje γ-aktin.
Obr. 5. - Vektory pro expresi genu lacZ z E. coli, genu ble ze S. hindustanus a „„antisense fragment genu pahA z P. chrysogenum v P. chrysogenum a/nebo A.
pod kontrolou promotoru Pgdh.
chrysogenum
Obr. 6. - Vektory pro expresi genu ble ze S. hindustanus v P. chrysogenum a/nebo A. chrysogenum pod kontrolou promotorů Phex, PactPc a PactAc.
• » *'*» • · • · » « · ♦ · · a ·
SEZNAM SEKVENCÍ
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 1 CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 2816 párů baží TYP: nukleotidy TYP VLÁKNA: 2
TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: genomová DNA
HYPOTETICKÁ: ne
OPAČNÁ ORIENTACE: ne
PŮVODNÍ ZDROJ: Penicillium chrysogenum
BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ: plazmidy pALP784 a pALP785 POZICE V GENOMU: neznámá
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: kódující sekvence
POZICE: spojení (922...970, 1131...1261, 1379.
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 971...1130
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 1262...1318
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: gen gdh .2521)
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 1
GATCGCCGTT TATGGGATAG TGGGCACGTG ACAGAGCCTG CAGCCGAGTC AAATTGCCGA 60
AGTTGGCAGT TGGTGGCGGA GAACTCGAGA TTTTATTTGC GTTTATTTCG TTTATTTCGA 120
TTTTAGTTTT CCTATTTTTC CTATTTTGGT TGATTCCATC CAACTTTATA GGATACTACT 180
TCATAATAGG TCGATCATAG TACAAGCACC AACTCGTCGC ATCATGCATT TTCTGGGGTT 240
CGAATTCTTT ACTTAGAGTA AGGTTTCTCT CAGCCTCCTA ATAAACTACC TAGGTAGGTT 300
AAATTTACTT TTTAACATTT TATTTATTCA GAAGATTGTC GGAGAGGACC GATCCGAAGG 360
ACACGAATTG AACACGGAAG GGATATTAGG GACAAGGAAG ATTTAGGGAT AAAAAAACGA 420
GCTGTGATTG ATGGGAAGGT TAAAGTGTAG TAATGAAGGT GATGGGACCA AAAGGAGTGG 480
GAGAGATAAG CCAAATTCTG TGCAAATTCT GTGACCTTAA ACCATAAGAT AACATTGTTC 540
GGGCCCCGAA CTTCGGACGT TCTTCCCACG GAAAGGCAAA TCATTGGGTT TCATCGATTC 600
TCTTGGATCT TTATCCTAAT TCCCCGTGCA ACCTGGTCTT GGGGATTATT GTCGACTTGT 660
AGGCGCATTA ACCCATCTCC CGTCTTCCCT CCAATCAATC CCGGATTCTC TCGTCCGACT 720
CCGGCTTCGA CTCTCTCTCT CTCCACATCT CTATATAATT GTACACTCCC CCATCCCATT 780
CTTTTCTTCT CTTCTCATCT ACTCTCTTGA ATCTCAATTG TCTTAATACT CTCTCTGCTC 840
TTGTCTTTAT TTATAATTTA TTAGATCACT GCTTAGCATT GATCTACTTA CCTAAAAGCA 900
GAGTTAACAG TACCGGCCGA A ATG ATG CAA AAC CTT CCC TTC GAG CCT GAG 951
Met Met Gin Asn Leu Pro Phe Glu Pro Glu 15 10
TTC GAG CAG GCC TAC AAG G GTATGTCTCT TTTAATTTTT CCCTTTCTTA TTTCAA 1006 Phe Glu Gin Ala Tyr Lys
TTCCATATCG TCCATATCAC ACACTATTTC CCGACTCAAT TCCTTTACCC ATCGGCATCT 1066 TCCCGGCCTT TGGCTCCACC GGGGGCATAA TTTCGGGGTG ACTCAGCTAA CAATCCCGAA 1126 ACAG AG CTC GCC TCC ACT CTC GAG AAC TCC ACT CTT TTC CAG AAG AAG 1174
Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gin Lys Lys
20 25 30
CCC GAG TAC CGC AAG GCT CAG GTC TCT GTC CCC GAG CGT GTT 1222
Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gin Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val
35 40 45
ATT CAG TTC CGT GTT GTC TGG GAA GAT GAC AAA GGC CAG GTAAGACCTT 1271
Ile Gin Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Lys Gly Gin
50 55 60
TCTTTTTGAA AATGTCTAAT TAATTGCCAC ATGCTAATTC CGTTCAG GTC CAA ATC 1327 Val Gin Ile
AAC CGT GGA TAC CGT GTC CAG TTC AAC TCC GCT CTT GGC CCC TAC AAG 1375
Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gin Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys
65 70 75
GGT GGC CTC CGG CAC CCC ACG GTG AAC CTT TCC ATC CTC AAG TTC 1423
Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Thr Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe
80 85 90 95
CTC GGT TTC GAG CAG ATC TTC AAG AAT GCC CTC ACC GGC CTG AAC ATG 1471
Leu Gly Phe Glu Gin 100 Ile Phe Lys Asn Ala 105 Leu Thr Gly Leu Asn 110 Met
GGC GGT GGT AAG GGT GGA TCC GAC TTC GAC CCC AAG GGC AAG ACC GAT 1519
Gly Gly Gly Lys 115 Gly Gly Ser Asp Phe 120 Asp Pro Lys Gly Lys 125 Thr Asp
AAC GAG ATC CGC CGC TTC TGT GTC TCC TTC ATG ACC GAG CTG TGC AAG 1567
Asn Glu Ile 130 Arg Arg Phe Cys Val 135 Ser Phe Met Thr Glu 140 Leu Cys Lys
CAC ATC GGT GCC GAC ACC GAT GTT CCC GCC GGT GAT ATC GGT GTG ACC 1615
His Ile 145 Gly Ala Asp Thr Asp 150 Val Pro Ala Gly Asp 155 Ile Gly Val Thr
• ·
GGC CGC GAG GTT GGT TTC ATG TTC •GGC CAG TAC AAG AAG ATC CGC AAC 1663
Gly Arg Glu Val Gly Phe Met Phe Gly Gin Tyr Lys Lys Ile Arg Asn
160 165 170 175
CAG TGG GAG GGT GTC CTC ACC GGT AAG GGT GGC AGC TGG GGT GGT TCC 1711
Gin Trp Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser
180 185 190
CTC ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGT GTC GTC TAC TAC GTC GAG 1759
Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu
195 200 205
CAC ATG ATC CAG CAC GCC TCC GGC GGC AAG GAA TCC TTC GCT GGT AAG 1807
His Met Ile Gin His Ala Ser Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys
210 215 220
CGC GTC GCC ATC TCC GGT TCC GGA AAC GTC GCC CAG TAC GCC GCT CTC 1855
Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gin Tyr Ala Ala Leu
225 230 235
AAG GTC ATC GAG CTC GGT GGC TCC GTC ATC TCC CTC TCC GAC TCC CAG 1903
Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gin
240 245 250 255
GGT GCT CTC GTC CTG AAC GGC GAG GAG GGC TCC TTC ACC GCT GAG GAG 1951
Gly Ala Leu Val Leu Asn Gly Glu Glu Gly Ser Phe Thr Ala Glu Glu
260 265 270
ATC AAC ACC ATC GCT GAG ATC AAG GTC CAG CGC AAG CAG ATC GCC GAG 1999
Ile Asn Thr Ile Ala Glu Ile Lys Val Gin Arg Lys Gin Ile Ala Glu
275 280 285
CTC GCT ACC CAG GAC GCC TTC AGC TCC AAG TTC AAG TAC ATC CCC GGT 2047
Leu Ala Thr Gin Asp Ala Phe Ser Ser Lys Phe Lys Tyr Ile Pro Gly
290 295 300
GCC CGC CCC TGG ACC AAC ATC GCC GGC CGC ATC GAT GTC GCT CTC CCC 2095
Ala Arg Pro Trp Thr Asn Ile Ala Gly Arg Ile Asp Val Ala Leu Pro
305 310 315
TCC GCC ACC CAG AAC GAG GTC TCC GGC GAT GAG GCC AAG GCT CTC ATC 2143
Ser Ala Thr Gin Asn Glu Val Ser Gly Asp Glu Ala Lys Ala Leu Ile
320 325 330 335
GCC GCT GGC TGC AAG TTC ATC GCT GAG GGC TCC AAC ATG GGT TCC ACC 2191
Al a Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala C-lu Gly Ser Asn Met Gly Ser Thr
340 345 350
CAG GAG GCT ATC GAT GTC TTC GAG GCC CAC CGT GAT GCC AAC CCT GGT 2239
Gin Glu Ala Ile Asp Val Phe Glu Al a His Arg Asp Ala Asn Pro Gly
355 360 365
GCC GCT GCC ATC TGG TAC C-CC CCT GGT AAG GCC GCC AAC GCT GGT GGT 2287
Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly
370 375 380
GTT GCC GTC TCT GGT CTC GAG ATG GCC CAG AAC TCT GCC CGT GTC AAC 2335
Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gin Asn Ser Ala Arg Val Asn
365 390 395
TGG TCC CGT GAG GAG GTT GAC TCC CGT CTT AAG AAG ATT ATG GAG GAC 2383
Trp Ser Arg Glu Glu Val Asp Ser Arg Leu Lys Lys Ile Met Glu Asp
400 405 410 415
TGC TTC AAC AAC GGT CTC TCT ACT C-CT AAG GAG TAT GTC ACC CCT GCT 2431
Cys Phe Asn Asn Gly Leu Ser Thr Ala Lys Glu Tyr Val Thr Pro Ala
420 425 430
GAG GGT GTT CTT CCT TCC CTC GTG GCT GGC TCC AAC ATT GCT GGT TTC 2479
Glu Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Ala Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe
435 440 445
- 36 ACC AAG GTC GCT GAG GCC ATG AAG GAG CAC GGT GAC TGG TGG TAAATTAGTC 2531
Thr Lys Val Ala Glu Ala Met Lys Glu His Gly Asp Trp Trp
450 455 460
GCATCCCCAT TTATTCTGGG AGGTGTTCTG TGACGATTTC TGTCCTCTCT TAAGGAGAGG 2591 CAGCTTTGAT GCATTTTCTT TTCATTTAAA TAGCTTTTTA CCCTTTTTGT CAAGCGGGTT 2651 ACGGATAGAG GCGCTTGGTT TTCTCCACTG TTGCATTCGA TTGATATCCC CACTTGAGCA 2711 CCGCTGTTTG TTTTGGTTCT GCACTTGGGA CTGTCATGAT GATAATGAGA TACAATGAAT 2771 AACTTAAAAA TAATTGTGTG GTCTCGTAAA GTTGTAAACT CTAGA 2816
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 2
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 5240 párů baží TYP: nukleotidy TYP VLÁKNA: 2 TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: genomová DNA
HYPOTETICKÁ: ne
OPAČNÁ ORIENTACE: ne
PŮVODNÍ ZDROJ: Pěnici11ium chrysogenum
BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ: plazmidy pALP295 a pALP388 POZICE V GENOMŮ: neznámá ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: kódující sekvence POZICE: 1324 . . .3111
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: gen hex
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 2
GTCGACCTCG CAACAGTCGA GAAGCACGCC GCCTATCTCG CCCGCAGCGG GGTAACCGGC 60
CTAGTAACCC AGGGTAGCAA TGGCGAAGCC GTCCACCTAG ACCGGGAAGA ACGCAAGGCC 120
ATCACAGCCG CCACACGCCG CGCCGTGGAC GCAGCCGGCT ACAGCAACAT GCCGGTGATT 180
GCCGGCTGTG GCGCCGCCTC AACCCGTGAG ACCATCCAAT TCTGCCAGGA CTCCGGTGCA 240
GCAGGCGCCG ACGCTGTCCT CGTGCTCCCA CCCAGCTACT ACAAGTCCCT CGTGAGCACC 300
GAGTCCATGC ACGCCCACTT CCGGGCTGTG GCCGATGCCT CGCCCGTCCC TGTCCTCATC 360
TACAACTTCC CCGGCGTGCA GTCCGGCCTC GATCTCAGCT CAGATGATAT CTTAACTCTC 420
GCAGAACACC CCAATATCAT CGGCTGTAAG CTCACGTGCG GCAACACGGG TAAGTTGGCT 480
CGTGTTGCGG CGGCCAAGCC GGATTTCTTG ACTTTTGGTG GCTCGGCCGA TTTCACGCTG 540
CAGACGCTGG TTGTTGGTGG GGCGGGGATT ATCGGTGGCG TGGCTAACAT GATTCCTCGC 600
TCGTGTGTGC GTCTGATGGA GTTGTATCGT GCTGGGAAGG TTCAGGAGGC GCAGAAGGTG 660
CAGGCTATTG TTGCGCGCGC -GACTGGGCT GCTATCGATG GTGGCTTTAT CGCTGTTAAG 720
ACGGGCCTCC AAGCCTACCA CGGT7ACGGT GGTCTTCCTG GGCGGCCTTG TGTCGTGCCT 780
TCTGCTAAGG ATGCGGCAGC GATTCAGGAG GAGTTCCGGG AGGGAATGGA GCTGGAGAAG 840
• *
- 37 TCGTTGGAGT CCTAATGGAT ATAGTAGATT AAATCATGAT TACCAGAGAT CCCATGTGGA 900 GATTTCTATT CCTTTCCAGG GGTTTTCCAG GGGTTTTCCA GATGTTTTCC AGGTGTTTTC 960 CAAATGTTTC AGGTTGCTTC ATAGATCGAC AGACCGGTG? GACTGTGTCA TTTGCCAGTA 1020 GATCCGGAGA TCCCGTAGCT TTCCCCCTCT TTATCTTTTA ATATTTGTTG TTATATGGGA 1080 GTTCAAGTTG CATGTAGAGG TTGCACTCTC TCTCTCTCTC TTTCCCTTGA ATTATTTGAG 1140 TCCAAGGTGT GTTAGTTGTA TGCAATGTAA CTAGGGAGCT GTTTGTTTTT CCCCTTCCCC 1200 AGGGTTGCAT CCTGGGCCAT TCCCCATTCC GATGAAAGAT CGACAATGCA GCTAAACATA 1260 AATAGTTCTG GTTATCTCCT GGCCACAGTT TCTCTACTTT TCATCGTCAC TCACCTTATC 1320
AAC ATG Met AAG TTC GCC TCG GTG TTG AAT GTG CTC GGG GCC Ala CTG ACG GCT Ala 15 1368
Lys Phe Ala Ser 5 Val Leu Asn Val Leu 10 Gly Leu Thr
1
GCG TCC GCC GTC CAA GTG AAT CCA CTT CCC GCC CCC CGT AAC ATC ACC 1416
Ala Ser Ala Val Gin Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Asn Ile Thr
20 25 30
TGG GGA TCC TCC GGT CCA ATC CAA GTC AAC AAC TTG AAT CTC AAC GGT 1464
Trp Gly Ser Ser Gly Pro Ile Gin Val Asn Asn Leu Asn Leu Asn Gly
35 40 45
CCT CAC TCC CCT TTG CTC ACT CAA GCT TGG GAG CGA GCA TGG GAA ACC 1512
Pro His Ser Pro Leu Leu Thr Gin Ala Trp Glu Arg Ala Trp Glu Thr
50 55 60
ATC ACC ACC CTG CAA TGG GTT CCT GCT GCT GTT GAA TCC CCA ATC GCC 1560
Ile Thr Thr Leu Gin Trp Val Pro Ala Ala Val Glu Ser Pro Ile Ala
65 70 75
TCC TAT CCG GCC TTC CCC ACC TCG ACC CCT GTC TCC TCT GCC CCC AAG 1608
Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr Ser Thr Pro Val Ser Ser Ala Pro Lys
80 85 90 95
GCC AAA CGC GCG CCC TCC GGA ATC CAT AAC GTC GAT GTT CAT GTG GTG 1656
Ala Lys Arg Ala Pro Ser Gly Ile His Asn Val Asp Val His Val Val
100 105 110
GAC AAC GAT GCC GAT CTC CAA TAC GGT GTG GAT GAA TCC TAT ACA CTG 17 04
Asp Asn Asp Ala Asp Leu Gin Tyr Gly Val Asp Glu Ser Tyr Thr Leu
115 120 125
GTA GTG AGC GAT GGT ATC AGG ATC AAT CAG ACG GTC T<jG GGT 1752
Val Val Ser Asp Gly Gly 7 ' o Arg Ile Asn Ser Gin Thr Val Trp Gly
130 135 140
GTG TTG CAG GCA TTC ACC ACC CTG CAG CAG ATT ATC ATC TCG GAT GGG 1800
Val Leu Gin Ala Phe Thr Thr Leu Gin Gin Ile Ile Ile Ser Asp Gly
145 150 155
AAG GGC GGT TTG ATC ATT GAA CAG CCC GTC AAG ATC AAG GAT GCC CCG 1848
Lys Gly Gly Leu Ile Ile Glu Gin Pro Val Lys Ile Lys Asp Ala Pro
160 165 170 175
CTG TAC CCC CAT CGT GGT ATC ATG ATA GAC ACC GGG CGC AAC TTC ATT 1896
Leu Tyr Pro His Arg Gly Ile Met Ile Asp Thr Gly Arg Asn Phe Ile
180 185 190
ACC GTT CGC AAG CTC CTT GAG CAG ATC GAC GGT ATG GCC CTG TCC AAG 1944
Thr Val Arg Lys Leu Leu Glu Gin Ile Asp Gly Met Ala Leu Ser Lys
195 200 205
CTC AAT GTT CTC CAC TGG CAC TTG GAC GAT TCT CAG TCG TGG CCC ATG 1992
Leu Asn Val Leu His Trp His Leu Asp Asp Ser Gin Ser Trp Pro Met
210 215 220
CAG ATG AGC TCC TAC CCG GAG ATG ACC AAA GAT GCT TAC TCG CCT CGC 2040
Gin Met Ser Ser Tyr Pro Glu Met Thr Lys Asp Ala Tyr Ser Pro Arg
225 230 235
GAA ATC TAC ACC GAG CAC GAC ATG CGC GTG ATT GCC TAC GCA CGC 2088
Glu Ile Tyr Thr Glu His Asp Met Arg Arg Val Ile Ala Tyr Ala Arg
240 245 250 255
• ·
GCG CGA GGT GTC CGC GTC ATC CCC GAG GTC GAC ATG CCC GCC CAC TCA 2136
Ala Arg Gly Val Arg Val Ile Pro Glu Val Asp Met Pro Ala His Ser
260 265 270
GCC TCC GGC TGG CAG CAG GTC GAC CCG GAG ATC GTG GCA TGT GCC GAA 2184
Ala Ser Gly Trp Gin Gin Val Asp Pro Glu Ile Val Ala Cys Ala Glu
275 280 285
TCC TGG TGG TCG AAC GAC GTT TGG GCG GAG CAC ACC GCC GTC CAG CCG 2232
Ser Trp Trp Ser Asn Asp Val Trp Ala Glu His Thr Ala Val Gin Pro
290 295 300
AAC CCT GGC CAG CTC GAC ATT ATC TAC CCC AAG ACC TAC GAA GTT GTC 2280
Asn Pro Gly Gin Leu Asp Ile Ile Tyr Pro Lys Thr Tyr Glu Val Val
305 310 315
AAC AAT GTC TAC CAG GAA TTG TCT CGC ATC TTC AGC GAC AAC TTG TTC 2328
Asn Asn Val Tyr Gin Glu Leu Ser Arg Ile Phe Ser Asp Asn Leu Phe
320 325 330 335
CAC GTT GGT GCA GAC GAG ATC CAG CCC AAC TGC TAC AAC TAC AGC ACC 2376
His Val Gly Ala Asp Glu Ile Gin Pro Asn Cys Tyr Asn Tyr Ser Thr
340 345 350
CAT ATC ACT TGG TTT GCC GAG GAT CCC TCG CGC ACC TAC AAC GAC 2424
His Ile Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Asn Asp
355 360 365
CTT GCG CAG TAC TGG GTT GAC CAT TCC ATG CCC ATC TTC CGT AGT GTC 2472
Leu Ala Gin Tyr Trp Val Asp His Ser Met Pro Ile Phe Arg Ser Val
370 375 380
GGC GAC CAC CGC CGT CTT ATG ATG 1 ca GAG GAC ATA GCT ATC GCG ACT 2520
Gly Asp His Arg Arg Leu Met Met Trp Glu Asp Ile Ala Ile Ala Thr
385 390 395
GAA AGC GCC CAC GAC GTG CCC AAA GAC GTC ATC ATG CAG ACC TGG AAC 2568
Glu Ser Ala His Asp Val Pro Lys Asp Val Ile Met Gin Thr Trp Asn
400 405 410 415
AGC C-GC GAG GGT GAG k3O i. * * r* Aav ATC AAG AAA CTC ACC TCC GCC GGC TAC 2616
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asn Ile Lys Lys Leu Thr Ser Ala Gly Tyr
420 425 430
GAC GTT C-TC GTT TCG ACC TCC GAT TTC CTC TAC CTC GAC TGC GGG CGC 2664
Asp Val Val Val Ser Thr Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys Gly Arg
435 440 445
GGC GGC TAT GTC ACC AAC GAC GCC CGC TAC AAC GTG CAG AGC AAC ACC 2712
Gly Gly Tyx Val Thr Asn Asp Ala Arg Tyr Asn Val Gin Ser Asn Thr
450 455 460
GAC GGC GGA GTG AAC TTC AAC TAC GGC GGC GAC GGT GGC TCC TGG TGC 2760
Asp Gly Gly Val Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Ser Trp Cys
465 470 475
GCC CCC TAC AAG ACC TGG CAG CGC ATC TAC GAC TAC GAC TTC CTC ACG 2808
Ala Pro Tyr Lys Thr Trp Gin Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Phe Leu Thr
480 485 490 495
AAT CTC ACT TCC TCC GAA GCG AAG CAC ATT ATC GGC GCC GAG GCT CCT 2856
Asn Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lys His Ile Ile Gly Ala Glu Ala Pro
500 505 510
TTG TGG TCG GAG CAG GTC GAC GAT GTG ACC GTC TCC AGC GTG TTC TGG 2904
Leu Trp Ser Glu Gin Val Asp Asp Val Thr Val Ser Ser Val Phe Trp
515 520 525
CCT CGC GCT GCT GCT CTG GGT GAG CTT GTC TGG TCT GGT AAC CGT GAC 2952
Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Val Trp Ser Gly Asn Arg Asp
530 535 540
GCT ucl AGA AAG CGT ACC ACC AGC TTT ACT CAG CGT ATT CTG AAC 3000
Ala Ala Glv Arg Lys Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gin Arg Ile Leu Asn
545 550 555
TTC CGT GAA TAC CTC GTT GCC AAT GGT GTG ATG GCT ACT GCT CTT GTG 3048
Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Met Ala Thr Ala Leu Val
560 565 570 575
CCG AAG TAT TGT CTG CAG CAC CCT CAT GCT TGC GAC CTC TAT AAA AAC 3096
Pro Lys Tyr Cys Leu Gin His Pro His Ala Cys Asp Leu Tyr Lys Asn
580 585 590
CAG ACT GTA ATG TCT TGATTGTGGT TAAGCTGGAC TGCTAGTGAG CCTTACAACT 3151 Gin Thr Val Met Ser
595
GCCTGTTCGT CTGTATATAC TTATTCTATC TTCGATACCC AATTCCATTG GAATTTCTTC 3211 CAGGATACAT GTCCCTGATC AGTATACCAT TTCACGTCCA CATTCAATCT TCAGCAACAC 3271 GAATTTATCC AAACCAATCA CCACCCTAGA TCTACCACAA CACTACCTTT ATACATATCT 3331 ACTTGATACC CAATCCCATT CCAACCAGGC GCAAAAGGCG TGCCCAGTCC AAATCAAAAT 3391 CAGCCCCCCG AGCCCAACCC TCTCCACATA TCCATACCCT AATCAAAATC ACCTTAATCT 3451 AAACAAATCC ATCACGCCCA AGGACCCCAC AGACCTCCCC TTCCCAACCC ACCCAGTCCA 3511 CCTCCACAAA CCAAACCCCA AATCAGAACT GCCGTGCAAC TCTCCGTCTT AGAACTCGCC 3571 CTTCGGTCCC GTCCCGAACT TAGATGGGCT TCGGGACGGC TTGCTGTATG CACTATGCAT 3631 GTAGTACGGA GTACGCCGTA CACATGTAGT AGGGGATATA TGTATGTACT ATGTACGCAT 3691 GTTCGAGTAC GCAGTACGTA GTGTGGCATG CAGGTCAGCT AGCATTGGCA GTAGCATATA 3751 CGGCATAACC TACGCTATGC ATCTAATATT CTTCGGTATA TACCACATGG TACGGAATTA 3311 GATGCAATAC ATGTACATGT ACATGTGCAT ACCTAGGTAC AAAGTGAATC TCGTTATTGT 3871 ATGTCTAGTC GTGTATAAGT GTAGTCCCAT GTCATATATA CAAGCCCATA CCGCATCGGA 3931 GCAAACCAGC CCATTCAGAC ATCCCTGCTC GAAACCCAGT CTACGGATTG AGACCGGGCT 3991 GAGCTGGGGT TTGGGTGTTG CTGCATGCGT ACGCCTACAT ACGTAGGGAG ATATGTTGCA 4051 CAGGATGCAG GGAATGACAA ATTGACGAAT TGAGAAATAC GCGAGTGGTT AGATGTTAAT 4111 TCTCGTTCGG GATGTTTATG TTTACCTAGG TATACTGGCT GGGGGGTCGT CATACACGTG 4171 GGAATTTGTG GCAATCTGTC AGTGGCCAGG TCCTTGTTTG ATTTATATGT TTGGGATGGG 4231 GATGGTCAAT GGGTATTCCA AGGAGGATGT ATCATCTGCT TTACACCGTC CCTTGCCTGG 4291 GATTTGGATT GAATTCTTCT TTCCACGTCG ATGTAGATTC TTCCCCGGAG CTATTCGGGT 4351 ACAACCCTGG CTTCCATATA TCATGTGTCC ATACTAAGTA CAGACGCTTC GATTTCCGGT 4411 GCTC-CGAGTA GATCGGGAAC TGATCTCGCA TGTCTGTACA CGAAGGGTTG TACAAGCACG 4471 CGGTCGTTCT GCGTAACCGG TTGTTTATGT TATTGGATTT GGTATTCGTC TAATATGGAT 4531 GATTTGGGAT AAGCTTCTAT CCTGGGAATG GGTGCTTGGT ATAGTTCAGC CTAGTACTTC 4591 C-TCTTCTATG TGATATTTCC AAAATAGTAG TTTTCGGTAA GTATATCTCG TACCTTTGAC 4 6 51 TTTGGTTTGT GGTTTACGTC TTACCTGGCG TTTAGAGGGA GGGATAGGTT TCTGTATCAC 4711 CGTCGTGTTT CAACGTGGAT CGGGGTCCTT TCCCTGATAT ATATCTTGGC TTATGTTTCG 4771 TGCGGTAGTG CGGGTTCGTA TAATGCATGT CTGGTATATC ATACGGCATT AGTGACTGGG 4831 ACGTTGAGGT CGAGCTTGGT TTGAGGTTAC ATATATTGAG CCAAAATGGT CGAAAATATA 4891 TATCAACATT GCCAAAACAG AACTTCATTC GTTGGATGCC ATGCCAAATT GCTAATAGGT 4951 CTTGATCTTA CTCTGACTCC TATCTCATCT CACCTTGGTT ATTCGTTACA CAGCATTAAC 5011 CCCAAGAACC AGGTATAGTC TGATCGTGGA TGTGGGCCAC GACAAAATAG AAGGTCTCGT 5071 GTTTAGGGCG ACGAATCTGG GACTC-CATTC CAGACGGGCC TGCGGAGAAT TTGCAGCATT 5131 TTATATCTAC ATGGTTGTTC CCTGGTGTGT GTGGGTGTTT CATGATATAT CCTGGTCGAT 5191 TCTGACGTGC GTATGTATCG CTGGAAAGGC TCGTAGGGGC TGCGTCGAC 5240 • ·
- 40 INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 3
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 2994 párů baží TYP: nukleotidy TYP VLÁKNA: 2 TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: genomová DNA
HYPOTETICKÁ: ne
OPAČNÁ ORIENTACE: ne
PŮVODNÍ ZDROJ: Penicillium chrysogenum
BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ: plazmidy pALP315 a pALP316
POZICE V GENOMU: neznámá
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: kódující sekvence
POZICE: spojení (494...500, 617...647, 846...901,
1047...1077, 1181...1952, 2022...2249)
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 501...616
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 648...845
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 902...1046
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 1078...1180
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 1953...2021
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: gen act
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 3
GAATTCAGCA GCCTACGGAG TCCATAAGAC ACCAAGACAC AGCCATTGTA TGGATTATAT 60 ATGCCATGTA TGCCTGACAA TGCTGTATAA GTACTGTAAT ACAAGGTAAA CCCCCAACCC 120 GGTCAAGGTA CGTGTTCCCG CCGTACCCAA AAGGGTCCCC AAGAATGTCC ACGCAATACT 180 TTTAGGTAGA CATTGAAGGA ATCCAAGTGA GAAATTCAAT GAACATGAAC AATAGTTCTG 240 CCTTATAATC TTTATAAGTA TAAAAATCAG AAAGAGAATT ATATACAAAA GGGTAGATCT 3 00 GGAGGGGGTT CAGAGTTAAG GCCTCAGGCA GGCGCACAAT CCCAGCCATC ACAAACCCCT 360 CTCCACTCTT CCCTCTCTCT CTCTTCCTTC TTCCTTTCTC CCCTAATCCC AACTATATCC 420 • ·
CCTCTAACCT CTTTCCATCT TTCTTTTCTT TTTTCCCCTC TTCTCCCCTA AGTCCCTTGT 480 TTAATCAGTC ACA ATG GAG G GTATGTTATT CCAGTTGTGG CCACATCAGC AGCTTCCC 53 8
Met Glu 1
CGGAAGCTCC CCCCCCTGTT GGCCACAGCT TCGATTCCAT ATTTGCGAAT GACAACTAAC 598 CCGTATATCT CATTATAG AA GAA GTT GCT GCT CTC GTC ATC GAC AAT GG 647
Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly 5 10
GTATGTGCTA TACTTTTCCC CC-GAGCTTCT GGCTTGTGTT GGGGTCGCCA ACTCAGCCCC 707 GGTCGCAGTC GTTGCCACCC CTAATCCGCC CGCGACGGCA GATGGAATCC ATCCCAATGG 767
CTTTCCATCT CGCTCCACAA CTACCAGAGG GTGATCCAAA GACTACAAGA ACTATGATAC 827
TGATTATTTG CGATATAG T TCG GGT ATG TGT AAG GCC GGT TTC GCC GGT GAC 879
Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp 15 20
GAC GCA CCA CGA GCT GTT TTC C GTAAGTCCA ACCCCACAGA ATATGACACC 930
Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe 25 30
CCTCCTGTGC GAAGGCCGCC ATCCCACCAA CCCTTGCGTC GGATGGCTTC CCCTCTTTTG 990 CTTGGCTAGG AGGAACCTGG AACCTAGGAA ATCAAATAAC TGACAAAATT CAACAG 104 6
CT TCC ATT GTC GGT CGT CCC CGC CAC CAT GG GTAAATGATC CCCCCTTTTT 1097
Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly
35 40
TTTCCGGCTC GTTTCGGCTG TATACGCTAT ACGCAGCCAA TTTGATCC :CT AATGAACCAA 1157
AAAGAATACT AACATGGGCG Cí G T ATT ATG ATT GGT ATG GGT CAG AAG GAC 1208
Ile Met Ile Gly Met Gly Gin Lys Asp
45 50
TCG TAC GTT GGT GAT GAG CAG TCG AAG CGT GGT ATC CTC ACG CTC 1256
Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gin Ser Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu
55 60 65
CGT TAC CCT ATT GAG CAC GGT GTT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG 1304
Arg Tyr Pro Ile Glu His r* τ , ř <3 X y Val Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu
70 75 80
AAG ATC TGG CAC CAC ACC ——r. TAC AAC GAG CTC CGT GTT GCC CCC GAA 1352
Lys Ile Trp His His Thr o TV2T Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu
85 50 95
GAG CAC CCC ATT CTC TTG ACC GCT CCC ATC AAC CCC AAG C*TC AAC 1400
Glu His Pro Ile Leu Leu Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Phe Asn
100 105 110 115
CGT GAG AAG ATG ACC CAG ATC GTG TTC GAG ACC TTC AAC GCC CCC GCC 1448
Arg Glu Lys Met Thr Gin Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala
120 125 130
TTC TAC GTC TCC ATC CAG GCC GTT CTG TCC CTG TAC GCC TCC GGT CGT 1496
Phe Tyr Val Ser Ile Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg
135 140 145
ACC ACT GGT ATC GTT CTC GAG TCC GGT GAC GGT GTC ACC CAC GTC GTC 1544
Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val
150 155 160
CCC ATC TAC GAG GGT TTC TCT CTG CCC CAC GCT ATC TCG CGT GTC GAC 1592
Pro Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Leu Pro His Ala Ile Ser Arg Val Asp
165 170 175
ATG GCT GGC CGT GAT CTG ACC GAC TAC CTG ATG AAG ATC CTC GCT GAG 1640
Met Ala Gly Arg Asp Leu Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu
180 185 190 195
CGT GGT TAC ACT TTC TCC ACC ACC GCC GAG CGT GAA ATC GTC CGT GAC 1688
Arg Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp
ATC AAG GAG AAG CTT TGC TAC GTC GCC CTC GAC TTC GAG CAG GAG ATC 1736
Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gin Glu Ile
215 220 225
CAG ACC GCT TCC CAG AGC TCC AGC CTC GAG AAG TCC TAC GAG CTT CCC 1784
Gin Thr Ala Ser Gin Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro
230 235 240
GAT GGA CAG GTC ATC ACT ATT GGC AAC GAG CGC TTC CGT GCT CCT GAG 1832
Asp Gly Gin Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg Ala Pro Glu
245 250 255
GCT CTG TTC CAG CCT AAC GTT CTT GGC CTC GAG TCT GGC GGT ATC CAC 1880
Ala Leu Phe Gin Pro Asn Val Leu Gly Leu Glu Ser Gly Gly Ile His
260 265 270 275
GTC ACC ACC TTC AAC TCC ATC ATG AAG TGT GAT GTT GAT GTC CGT AAG 1928
Val Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp Val Arg Lys
280 285 290
GAT CTC TAC GGC AAC ATT GTC ATG GTAAGAAAAA AGCCTCCAGA GCTGATGTTG 1982
Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Met
295
CGCAAAGATC CCCACTAACA TACAACTCCT TTTTTTTAG TCT GGT GGT ACC ACC 2036
Ser Gly Gly Thr Thr 300
ATG TAC CCC GGT ATC TCC GAC CGT ATG CAG AAG GAG ATC ACT GCT CTT 2084
Met Tyr Pro Gly Ile Ser Asp Arg Met Gin Lys Glu Ile Thr Ala Leu
305 310 315 320
GCT CCT TCT TCC ATG AAG GTC AAG ATC ATC GCT CCC CCC GAG CGC AAG 2132
Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys
325 330 335
TAC TCC GTC TGG ATC GGT GGA TCC ATT CTG GCC TCC CTG TCG ACC TTC 2180
Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe
340 345 350
CAG CAG ATG TGG ATC TCC AAG CAG GAG TAC GAC GAG AGC GGT CCT TCC 2228
Gin Gin Met <RR- - - ±rp Ile Ser Lys Gin C-lu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser
355 360 365
ATC GTT CAC CGC AAG TGC TTC TAAGCTT TTT GCAGCACTTT ACTACTCGTJ 2279
Ile Val His Arg Lys Cys
370 375
TTCGCTCGTA CTTTCCTGGT GTATCAAAAA GCAGGATGGA GGCACTGGTG GATTGCAAGC 2339 GTTGTTGGAC TCGCATTATC AAGCGGATAG CCTGAAAATG GAATCTCGAT TTTAGTGGAA 2399 TAGAGTCGGT CGTTTTCTTT TTGTTACTCT TTACCTTACT CTTTACTCGA TCTCTATCCA 2459 TCCATTTCTG CTTTGAACCA TTTCACCTTT ACTCCATCTT TTTCCCTTTC CTCATTCGAA 2519 TCCGCTGTCC CGTCCACCTC TCTGATTGTT TTGCCTGGAC GGGTCTCTGG CGATGCGGCA 2579 TCAACAGTGT ACCTGTAGGG CAAGGATGTA TATGGAGTTG GTTGGCTATA GGGATTAGGT 2639 TGCGTTGTCC TTTTCGACGT CTTCTACGTC TTTGTTCTAG CCCCTTGCGT TGTCTTCAAC 2699 TAAACTGCCC TTGTCCGTAG CTTTTAACGT GACTTTGACT TCAAATATTC CACTGGTTCC 2759 TTGTATTCTG CTAGAAACGC TGGTTCAACG CTTGTTGAAT GTCTTCTATG TCCAACATCT 2819 ACAAGACGTA TCCGAGAAGA CAACAAAAAG GCTCTGAGGA AAGTCTACTA AAAACTTGGC 2879 CAGGCCGGAT TAGGCCTTTG TCATGGTTAT TGTACTGTCA TTCGATCAGT CCATATTGAT 2939 ATTCTGGGAA TATGTAGGCT GACGAGATAA ATGGCACGCA TTGGGTGTGT ATCTT 2994 • ·
- 43 INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 4
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 3240 párů baží TYP: nukleotidy TYP VLÁKNA: 2 TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: genomová DNA HYPOTETICKÁ: ne OPAČNÁ ORIENTACE: ne
PŮVODNÍ ZDROJ: Penicillium chrysogenum BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ: plazmidy pALC52 a pALC53 POZICE V GENOMU: neznámá
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: kódující sekvence
POZICE: spojení (787...793, 921...951, 1124...1179,
1290...1320, 1411. ..2182, 2250...2477)
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 794...920
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 952...1123
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 1180...1289
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 1321...1410
ZNAKY:
JMÉNO/OZNAČENÍ: intron POZICE: 2183...2249
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: gen act
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 4
GCCAGGCTGG CACCGGCCTG CCTTGATGCG AGATGCCTAC TCGTACTATG CCTACAGGTA 60
TGGGCTTTCC GCGTGTCGTC AGCTTGCGAC CGCGCGGCTG CTGACGACCC AAGGCAAGCT 120
GGTAACATGG CGGCACGAAA TTTCTCTCTG CCTGCTCGTC CTCTTGGTGT GGAGGGGTAC 180
GAGTGCAGGT ATGATGGGAC GGCAGAGGAG TGACGGAGGC TGTGCGGTTG GCACGAGTAC 240
TGTACGAGTA CTCGTACTGT AGGTGCAGCG ACTGTGGTGG TACTGCTAGG TGGAATTGGG 300
TCCAGCAGGC ATGCAGCTCC CAGCCACCGT CGTTAACCAA TCAGTTAAAG CAGCAACGCA 360
ACCCGCCCCC GTTTTTCTGC CAGAAATTTG GGCGGTGTCG TGCCCCCAGT CGCTGTTGCC 420
CGCCCTTGTC TGGTCGCCTA CAGGCTGCAC CACAGGTAAC AACAGCCCGC CCCAGGTCCT 480 »· »»··
- 44 TGTAGGTGCC CAGTGAGTGC CCGGTGCCCA CAAGTTTCTC GTGGCATCCA CTGGCGGACT 540
TGGAAGCCCA TCAGTGATGC TTCCCTCCTT TCCCCCTCCA CATCTCACTC AGCTCACGCA 600
AGCCAACCCT CTCTCCCCCC GTCTCCATTC CATCTTCTTC TCTCCACGAC CCTTAAGAGT 660
CCCTCCTGCT CACGTCGACC ATCCTTCGCT CCCAGCCCCA CGACATCTGC ATCGTCTGGG 720
CTTCTTGACA CTCTGTCATT TCTTCCTTAT AAAACCTCTT TACCGCTCTT CCCGTAATCC 780
GACGCC ATG GAG G GTACGTGTCG CCGCAACGCA CTCCCGCTTC CCCTACTACC CCTA 837
Met Glu 1
TCGCGC ATCCACACGG CGCCGCGATG CCTAGCCATC GCGAGGGTGC ATCGCAACGA CTT 896 GGCTAAC TGTTCTTCGC TTCACAG AG GAG GTC GCC GCC CTC GTT ATC GAC 946
Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp 5 10
AAT GG GTAAGCTCGC CCGCTGTCTC ACCGACATCC ATCGTCCCCC TGGCCTCTGT 1001
Asn Gly
CGAGATGGGA GCCTCCAGGG GTCCCTTCGA CGAGCGCGTC GATTGCCAAA ATCCAACGAG 1061
ATCGGGCCAT ACTGAGCCGA CACTCGTGTG TTTTCTGGAC ATTAGGACTG ACTTGATTCT 1121
AG T TCG GGT ATG TGC AAG GCC GGT TTC GCC GGT GAT GAT GCT CCC CGA 1169
Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg
20 25
GCT GTT TTC C GTAAGTACCC CACTTCCACC CGTCGAGCTC CCCAATTGTC CACCGCCAGG 1229 Ala Val Phe
GCGAGAAGGG GGCAGAACGG GGCAAACTGC ATCGCAAACA TGGCTAATTC GATGCGACAG 1289 CG TCC ATT GTC GGT CGT CCC CGC CAC CAT GG GTAAGTTTCC GGCCGCAGCC 1340
Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly
40
GACACCTCTC ACCCCCCCCC GGGGGGCTCC TAAGCGAGTC AGCGCTGGTT CTGACCGCTG 1400
GATACTATAG C ATC ATG ATC GGC ATG GGC CAG AAG GAC TCG TAC GTC GGT 1450
Ile Met Ile Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr Val Gly
45 50 55
GAC GAG GCT CAG TCC AAG CGT ATC CTC ACC CTG CGC TAC CCC ATT 1498
Asp Glu Ala Gin Ser Lys Arg Glv Ile Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Ile
60 65 70
GAG CAC A C-TT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAG ATC TGG CAC 1546
Glu His Gly Val Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His
75 80 85
CAC ACC TTC TAC AAC C-AG CTG CGT GTT GCC CCC GAG GAG CAC CCG GTC 1594
His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val
90 95 100
CTG CTC ACC GAG GCG CCC ATC AAC CCC AAG TCC AAC CGT GAG AAG ATG 1642
Leu Leu Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Ser Asn Arg Glu Lys Met
105 110 115
ACC CAG ATC GTC TTC GAG ACC TTC AAC GCC CCT GCC TTC TAC GTC TCC 1690
Thr Gin Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser
120 125 130 135
ATC CAG GCC GTC CTG TCA CTG TAC GCC TCC GGC CGT ACG ACC GGT ATC 1738
Ile Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile
14 0 145 150
GTC CTG GAC TCT GGT GAT GTC ACC CAC GTT GTC CCC ATC TAC GAG 1786
Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Ile Tyr Glu
155 160 165
GGT GCC CTG CCC CAC GCC ATT GCC CGT GTC GAC ATG GCT GGT CGT 1834
Gly Phe Ala Leu Pro His Ala Ile Ala Arg Val Asp Met Ala Gly Arg
170 175 180
GAT CTC ACC GAC TAC CTC ATG AAG ATC CTG GCC GAG CGC GGC TAC ACC 1882
Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu Arg Gly Tyr Thr
185 190 195
····
TTC TCC ACC ACG GCC GAG CGT GAG ATT GTC CGT GAC ATC AAG GAG AAG 1930
Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys
200 205 210 215
CTC TGC TAC GTC GCC CTC GAC TTC GAG CAG GAG ATC CAG ACT GCC GCC 1978
Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gin Glu Ile Gin Thr Ala Ala
220 225 230
CAG AGC TCC AGC CTG GAG AAG TCC TAC GAG CTT CCC GAC GGC CAG GTC 2026
Gin Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gin Val
235 240 245
ATC ACC ATT GGC AAT GAG CGC TTC CGT GCT CCC GAG GCT CTC TTC CAG 2074
Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gin
250 255 260
CCC TCC GTC CTG GGT CTC GAG AGC GGC GGC ATC CAC GTC ACC ACC TTC 2122
Pro Ser Val Leu Gly Leu Glu Ser Gly Gly Ile His Val Thr Thr Phe
265 270 275
AAC TCC ATC ATG AAG TGC GAC GTC GAT GTC CGT AAG GAT CTG TAC GGC 2170
Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly
280 285 290 295
AAC ATT GTC ATG GTAAGTCAGA TGCCGGGCCT GGAAGACACC TCATTTAGGA TCT 2225
Asn Ile Val Met
TGCTAAC ACCAATTTTT TTTTTAG TCT GGT GGT ACC ACC ATG TAC CCT GGC 2276
Ser Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly 300 305
CTC TCT GAC CGT ATG CAG AAG GAG ATC ACT GCT CTT GCT CCT TCT TCC 2324
Leu Ser Asp Arg Met Gin Lys Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser
310 315 320
ATG AAG GTC AAG ATC ATT GCT CCC CCG GAG CGC AAG TAC TCC GTC TGG 2372
Met Lys Val Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp
325 330 335 340
ATC GGT GGT TCC ATT CTG GCG TCT CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG 2420
Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gin Gin Met Trp
345 350 355
ATC TCG AAG CAG GAG TAC GAC GAG AGC GGC CCC TCC ATC GTC CAC CGC 246S
Ile Ser Lys Gin Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg
360 365 370
AAG TGC TTC TAAGGTATGT TGTCGTCGGG AAGCCGGATA CCCGAATGTA AGGTTGACAG 2527 Lys Cys Phe
375
GTTCGAAAAG ACAAGGCAAC CGGCCAGAAC CAAATCCTTC CACCCTCCGC AAAAGAACGC 2587 CAAGATGTCG GAGTCGGTGG CGACCGATGC AACGTCTACT CACGTGCGCG CGTATCCCAC 2647 TCAAGTCTCA TATTTACGAA AAGTTATTTC ACATGGTCAG GCGGTGGTGG GCGTTGCCTT 2707 TTCTCGGAAC AGACATGACG GCGGCCACTT TTGTAGTCGG ATGCGTTTAG GGATGCGAGC 2767 CTAGGGGTGT AGGAAGCTGA GGTTGATATA CAATAACTTT TTTTGCTTTC CGTTCTAGAC 2827 TCGTTCAATG GGAAGACGTG ACGGAATCGC TTGGCTGTCT AATAGCCAGC TTGATCAGGC 2887 GAGTCGGGTT GTTGTGTTTC GATGTTGAGA GGTGCACCAG CGTATTTGTA TGGCCGAGGT 2947 AGGTATTATG GTCTCGTATT TGCAACACTA GAGCTCGCTT GCTCGTTTTT ACCAGCAGTG 3007 TCCTCTGCCA TGCCGCGGCT CCGACTCTCG TCTGGCTTCT CAGACCGTGC CTCGTCAATA 3067 GTATTATCCC CCGTAGTAAC CTCCGCACTA GCCGGTTCTT TGTCGTCTTC CTGCTCGCCG 3127 ATGAGCTTCC TGTACTTGCG CCTCTTCTTC TTGTCGGCGC TGGCAGCCCT CTTCTGCTTG 3187 ATGCGCCCGA CCATGGCGGA CCGGCTCTGC TCCCCGTTGA GCAGCTCGTC GAC 3240 • 0 ··*·
- 46 INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 5
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 461 aminokyselin TYP: aminokyseliny TYP VLÁKNA: 1
TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: peptid
PŮVODNÍ ZDROJ: Penicillium chrysogenum
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: sekvence aminokyselin enzymu glutamátdehydrogenázy (EC.1.4.1.4) o molekulové hmotnosti 49837 Da
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 5
Met Met 2 Gin Asn Leu 5 Pro Phe Glu Pro Glu Phe Glu Gin Ala Tyr
10 15
Lys Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gin Lys
20 25 30
Lys Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gin Val Val Ser Val Pro Glu
35 40 45
Arg Val Ile Gin Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Lys Gly Gin
50 55 60
Val Gin Ile Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gin Phe Asn Ser Ala Leu
65 70 75
Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Thr Val Asn Leu
80 85 90
Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly he Glu Gin Ile Phe Lys Asn Ala
95 100 105
Leu Thr Gly Leu Asn Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe
110 115 120
Asp Pro Lys Gly Lys Thr Asp Asn Glu Ile Arg Arg Phe Cys Val
125 130 135
Ser Phe Met Thr Glu Leu Cys Lys His Ile Gly Ala Asp Thr Asp
140 145 150
Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Thr Gly Arg Glu Val Gly Phe
155 160 165
Met Phe Gly Gin Tyr Lys Lys Ile Arg Asn Gin Trp Glu Gly Val
170 175 180
Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro
185 190 195
Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu His Met Ile
200 205 210
Gin His Ala Ser Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Val
215 220 225
Ala Ile Ser Gly Ser 230 Gly Asn Val Ala Gin Tyr Ala Ala Leu Lys
235 240
Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gin
245 250 255
Gly Ala Leu Val Leu Asn Gly Glu Glu Gly Ser Phe Thr Ala Glu
260 265 270
Glu Ile Asn Thr Ile Ala Glu Ile Lys Val Gin Arg Lys Gin Ile
275 280 285
Ala Glu Leu Ala Thr Gin Asp Ala Phe Ser Ser Lys Phe Lys Tyr
290 295 300
Ile Pro Gly Ala Arg Pro Trp Thr Asn Ile Ala Gly Arg Ile Asp
305 310 315
Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gin Asn Glu Val Ser Gly Asp Glu
320 325 330
Ala Lys Ala Leu Ile Ala Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala Glu Gly
335 340 345
Ser Asn Met Gly Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asp Val Phe Glu Ala
350 355 360
His Arg Asp Ala Asn Pro Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro
365 370 375
Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu
380 385 390
Met Ala Gin Asn Ser Ala Arg Val Asn Trp Ser Arg Glu Glu Val
395 400 405
Asp Ser Arg Leu Lys Lys Ile Met Glu Asp Cys Phe Asn Asn Gly
410 415 420
Leu Ser Thr Ala Lys Glu Tyr Val Thr Pro Ala Glu Gly Val Leu
425 430 435
Pro Ser Leu Val Ala Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val
440 445 450
Ala Glu Ala Met Lys Glu His Gly Asp Trp Trp
455 460
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 6
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 596 aminokyselin TYP: aminokyseliny TYP VLÁKNA: 1
TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: peptid
PŮVODNÍ ZDROJ: Penicillium chrysogenum
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: sekvence aminokyselin enzymu β-N-acetylhexózaminidázy (EC.3.2.1.52) o molekulové hmotnosti 66545 Da • ·
- 48 POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 6
Met Lys Phe Ala Ser Val Leu Asn Val Leu Gly Ala Leu Thr Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ala Val Gin Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Asn Ile
20 25 30
Thr Trp Gly Ser Ser Gly Pro Ile Gin Val Asn Asn Leu Asn Leu
35 40 45
Asn Gly Pro His Ser Pro Leu Leu Thr Gin Ala Trp Glu Arg Ala
50 55 60
Trp Glu Thr Ile Thr Thr Leu Gin Trp Val Pro Ala Ala Val Glu
65 70 75
Ser Pro Ile Ala Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr Ser Thr Pro Val
80 85 90
Ser Ser Ala Pro Lys Ala Lys Arg Ala Pro Ser Gly Ile His Asn
95 100 105
Val Asp Val His Val Val Asp Asn Asp Ala Asp Leu Gin Tyr Gly
110 115 120
Val Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Val Val Ser Asp Gly Gly Ile Arg
125 130 135
Ile Asn Ser Gin Thr Val Trp Gly Val Leu Gin Ala Phe Thr Thr
140 145 150
Leu Gin Gin Ile Ile Ile Ser Asp Gly Lys Gly Gly Leu Ile Ile
155 160 165
Glu Gin Pro Val Lys Ile Lys Asp Ala Pro Leu Tyr Pro His Arg
170 175 180
Gly Ile Met Ile Asp Thr Gly Arg Asn Phe Ile Thr Val Arg Lys
185 190 195
Leu Leu Glu Gin Ile Asp Gly Met Ala Leu Ser Lys Leu Asn Val
200 205 210
Leu His Trp His Leu Asp Asp Ser C-ln Ser Trp Pro Met Gin Met
215 220 225
Ser Ser Tyr Pro Glu Met Thr Lys Asp Ala Tyr Ser Pro Arg Glu
230 235 240
Ile Tyr Thr Glu His Asp Met Arg Arg Val Ile Ala Tyr Ala Arg
245 250 255
Al a Arg Gly Val Arg Val Ile Pro Glu Val Asp Met Pro Ala His
260 265 270
Ser Ala Ser Gly Trp Gin C-ln Val Asp Pro Glu Ile Val Ala Cys
275 280 285
Ala Glu Ser Trp Trp Ser Asn Asp Val Trp Ala Glu His Thr Ala
290 295 300
Val Gin Pro Asn Pro Gly Gin Leu Asp Ile Ile Tyr Pro Lys Thr
305 310 315
Tyr Glu Val Val Asn Asn Val Tyr Gin Glu Leu Ser Arg Ile Phe
320 325 330
Ser Asp Asn Leu Phe His Val Gly Ala Asp Glu Ile Gin Pro Asn
335 340 345
Cys Tyr Asn Tyr Ser Thr His Ile Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp
350 355 360
Pro Ser Arg Thr Tyr Asn Asp Leu Ala Gin Tyr Trp Val Asp His
365 370 375
Ser Met Pro Ile Phe Arg Ser Val Gly Asp His Arg Arg Leu Met
380 385 390
• ·
Met Trp Glu Asp Ile 395 Ala Ile Ala Thr Glu Ser Ala His Asp Val
400 405
Pro Lys Asp Val Ile Met Gin Thr Trp Asn Ser Gly Glu Gly Glu
410 415 420
Gly Asn Ile Lys Lys Leu Thr Ser Ala Gly Tyr Asp Val Val Val
425 430 435
Ser Thr Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gly Tyr
440 445 450
Val Thr Asn Asp Ala Arg Tyr Asn Val Gin Ser Asn Thr Asp Gly
455 460 465
Gly Val Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Ser Trp Cys Ala
470 475 480
Pro Tyr Lys Thr Trp Gin Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Phe Leu Thr
485 490 495
Asn Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lys His Ile Ile Gly Ala Glu Ala
500 505 510
Pro Leu Trp Ser Glu Gin Val Asp Asp Val Thr Val Ser Ser Val
515 520 525
Phe Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Val Trp Ser Gly
530 535 540
Asn Arg Asp Ala Ala Gly Arg Lys Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gin
545 550 555
Arg Ile Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Met
560 565 570
Ala Thr Ala Leu Val Pro Lys Tyr Cys Leu Gin His Pro His Ala
575 580 585
Cys Asp Leu Tyr Lys Asn Gin Thr Val Met Ser
590 595
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 7
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 375 aminokyselin TYP: aminokyseliny TYP VLÁKNA: 1
TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: peptid
PŮVODNÍ ZDROJ: Penicillium chrysogenum
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: sekvence aminokyselin proteinu γ-aktinu o molekulové hmotnosti 41760 D • · • · « *
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 7
Met Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly Ser Gly
1 5 10 15
Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val
20 25 30
Phe Pro Ser Ile 7al Gly Arg Pro Arg His His Gly Ile Met Ile
35 40 45
Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tvr Val Gly Asp Glu Ala Gin Ser
50 55 60
Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Ile Glu His Gly Val
6 5 70 75
Val Thr Asn Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe
80 85 90
Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Ile Leu Leu
95 100 105
Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Phe Asn Arg Glu Lys Met Thr
110 115 120
Gin Ile Val Phe Glu Thr pb 0 Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser
125 130 135
Ile Gin A 2.3 Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly
140 145 150
Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Ile
155 160 165
Tyr Glu Gly □be Ser Leu Pro His Ala Ile Ser Arg Val Asp Met
170 175 180
Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu
195 190 195
Arg Gly Tvr Thr Phe Ser Thr Thr Ala Glu A_rg Glu Ile Val Arg
200 205 210
Asn Ile Lys Glu Lys Leu Cys Val Ala Leu Asp Phe Glu Gin
215 220 225
Glu Ile C-ln Thr Ala Ser Gin Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr
230 235 240
Glu Leu Pro Asp Gly Gin Val ~ 1 O Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe
245 250 255
Arg Al a Pro Glu Ala Leu Phe Gin Pro Asn Val Leu Gly Leu Glu
260 265 270
Ser Gly Gly Ile His Val Thr Thr ?hs Asn Ser Ile Met Lys Cys
275 280 285
Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Met Ser
290 295 300
Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Ile Ser Asp Arg Met Gin Lys
305 310 315
Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Ile Ile
320 325 330
Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile
335 340 345
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gin Gin Met Trp Ile Ser Lys Gin
350 355 360
Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe
365 370 375
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 8
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
DÉLKA: 375 aminokyselin TYP: aminokyseliny TYP VLÁKNA: 1
TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: peptid
PŮVODNÍ ZDROJ: Acremonium chrysogenum
ZNAKY:
DALŠÍ INFORMACE: sekvence aminokyselin proteinu γ-aktinu o molekulové hmotnosti 41612 Da
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM: 8
Met Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly Ser Gly
1 5 10 15
Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val
20 25 30
Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His His Gly Ile Met Ile
35 40 45
Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gin Ser
50 55 60
Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Ile Glu His Gly Val
65 70 75
Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe
80 85 90
Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu
95 100 105
Thr Glu Ala Pro Ile Asn Pro Lys Ser Asn Arg Glu Lys Met Thr
110 115 120
Gin Ile Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser
125 130 135
Ile Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly
140 145 150
Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Ile
155 160 165
Tyr Glu Gly Phe Ala Leu Pro His Ala Ile Ala Arg Val Asp Met
170 175 180
Ala Gly A.rg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile Leu Ala Glu
185 190 195
• ·
Arg Gly Tyr Thr Phe 200 Ser Thr Thr Ala Glu 205 Arg Glu Ile Val Arg 210
Asp Σ1 s Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gin
215 220 225
Glu Ile Gin Thr Al a Ala Gin Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr
230 235 240
Glu Leu Pro Asp Gly Gin Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe
245 250 255
Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gin Pro Ser Val Leu Gly Leu Glu
2S0 265 270
Ser Gly Gly Ile His Val -ry Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys
275 230 235
Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Met Ser
290 295 300
Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Arg Met Gin Lys
305 310 315
Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Ile Ile
320 325 330
Ala Pro Pro Asp Gly Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile
335 340 345
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gin Gin Met Trp Ile Ser Lys Thr
350 355 360
Glu Tyr Asp Glu Glu Arg Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe
3 65 370 375
• · · • · · · • · ·· • · · · · • · · ·· ··
Aonr- w

Claims (40)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob zvýšení nebo blokování v mikroorganismech vyznačuj ící se v mikroorganismech exprimují geny, sekvence nebo fragmenty DNA pod kontrolou z Penicillium chrysogenum.
    genové exprese se tím, že částečné genové promotoru genu gdh
  2. 2. Způsob zvýšení nebo blokování v mikroorganismech vyznačuj ící se v mikroorganismech exprimují geny, sekvence nebo fragmenty DNA pod kontrolou z Penicillium chrysogenum.
    genové exprese se tím, že částečné genové promotoru genu hex
  3. 3. Způsob extracelulární exprese v mikroorganismech, vyznačující se se v mikroorganismech exprimují geny fúzované s z Penicillium chrysogenum.
    proteinů tím, že genem hex
  4. 4. Způsob zvýšení nebo blokování v mikroorganismech vyznačuj ící se v mikroorganismech exprimují geny, genove exprese se tím, že částečné genové sekvence nebo fragmenty z Penicillium chrysogenum.
    DNA pod kontrolou genu act
  5. 5. Způsob zvýšení nebo blokování v mikroorganismech vyznačuj ící se v mikroorganismech exprimují geny, sekvence nebo fragmenty z Acremonium chrysogenum.
    DNA pod kontrolou genu act genove exprese se tím, že částečné genové • · ·
    - 54 6. Způsob podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se užije transformovaný mikroorganismus, který je
    eukaryotický organismus kromě Aspergillus nebo Acremonium. člověka, výhodně Penicillium, Ί. Způsob podle nároku 6, v y z n a č u j ící se • tím, že mikroorganismus, který se užij e, j e výhodně
    Penicillium chrysogenum, Apergillus nidulans nebo Acremonium chrysogenum.
  6. 8. Sloučenina DNA izolovaná z P. chrysogenum, která má velikost 2811 bp, je vázána restrikčními místy Sau3AI a Xbal, a obsahuje promotor genu gdh.
  7. 9. Sloučenina DNA izolovaná z P. chrysogenum, která má velikost 7737 bp, je vázána restrikčními místy BamHI a Sací, a obsahuje promotor genu hex.
  8. 10. Sloučenina DNA izolovaná z P. chrysogenum, která má velikost 4947 bp, je vázána restrikčními místy BglI a EcoRI, a obsahuje promotor genu act.
  9. 11. Sloučenina DNA izolovaná z A. chrysogenum, která má velikost 8650 bp, je vázána dvěma restrikčními místy HindlII, a obsahuje promotor genu act.
  10. 12. Sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 1, která obsahuje gen gdh z P. chrysogenum.
  11. 13. Sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 2, která obsahuje gen hex z P. chrysogenum.
    • · · · • · · · • · · · • · · · · · • ♦ · • · · • · · · • · · · • · · ·
    - 55
  12. 14. Sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 3, která obsahuje gen act z P. chrysogenum.
  13. 15. Sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 4, která obsahuje gen act z A. chrysogenum.
  14. 16. Nukleotidové sekvence, které jsou hybridizovatelné za restriktivních podmínek se sloučeninami DNA podle nároků 8 až 15.
  15. 17. Sekvence aminokyselin uvedená zde jako sekvence id. č. 5, která se shoduje s enzymem glutamátdehydrogenázou z P. chrysogenum.
  16. 18. Sekvence aminokyselin uvedená zde jako sekvence id. č. 6, která se shoduje s enzymem β-N-acetylhexózoaminidázou z P. chrysogenum.
  17. 19. Sekvence aminokyselin uvedená č. 7, která se shoduje s z P. chrysogenum.
  18. 20. Sekvence aminokyselin uvedená č. 8, která se shoduje s z A. chrysogenum.
    zde jako sekvence id. proteinem γ-aktinem zde jako sekvence id. proteinem γ-aktinem
  19. 21. Vektory, které nesou sloučeniny DNA podle nároků 8 až 16 nebo jejich fragmenty.
  20. 22. Vektory podle nároku 21, které se skládají z plazmidu.
    » · · · ·· ··
    56
  21. 23. Plazmidy podle nároku 22, které se skládají z pALP784, pALP785 a pALfleo7.
  22. 24. Plazmidy podle nároku 22, které se skládají z pALP295, pALP319, pALP377, pALP388 a pALP480.
  23. 25. Plazmidy podle nároku 22, které se skládají z pALP315 a pALP316.
  24. 26. Plazmidy podle nároku 22, které se skládají z pALC52 a pALC53.
  25. 27. Způsob získání transformovaných organismů kromě člověka se zvýšenou expresí homologních nebo heterologních genů, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
    a) zkonstruují se vektory, které nesou celé nebo částečné sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 1, 2, 3 nebo 4, nebo jejich rekombinantní sloučeniny DNA,
    b) vektory se vloží do hostitelského člověka, čímž se získají transformované exprimující homologní nebo heterologní geny,
    c) selektují se takové transformované organizmy, které mají zvýšenou expresi homologních nebo heterologních genů ve srovnání s kontrolními netransformovanými organizmy.
    organizmu kromě organizmy
  26. 28. Způsob získání transformovaných organismů kromě člověka, které jsou schopné vytvářet extracelulární proteiny, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
    ·· · • · • · ·· ··
    - 57 a) zkonstruuji se vektory, které nesou celou nebo částečnou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2, nebo její rekombinantní sloučeniny DNA,
    b) vektory se vloží do hostitelského organizmu kromě člověka, čímž se získají transformované organizmy, které exprimují a secernují alespoň jeden protein,
    c) selektují se takové transformované organizmy, které jsou schopné secernovat alespoň jeden protein ve větším množství než kontrolní netransformované organizmy.
  27. 29. Způsob získání transformovaných organismů kromě člověka, s expresí „antisense genu, který úplně nebo částečně blokuje jejich aktivitu, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
    a) zkonstruují se vektory, které nesou celé nebo částečné sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 1, 2, 3 nebo 4, nebo jejich rekombinantní sloučeniny DNA,
    b) vektory se vloží do hostitelského organizmu kromě člověka, čímž se získají transformované organizmy s „antisense genovou expresí,
    c) selektují se takové transformované organizmy, které mají úplně nebo částečně blokovanou expresi genu ve srovnání s kontrolními netransformovanými organizmy.
  28. 30. Způsob získání transformovaných organismů podle nároků 27 a 29, vyznačující se tím, že se užijí vektory podle nároků 21 až 26 nebo vektory z nich získané.
  29. 31. Způsob získání transformovaných organismů podle nároku 28,vyznačující se tím, že se užijí vektory podle nároku 24 nebo vektory z nich získané.
    - 58
  30. 32. Způsob získání transformovaných organismů podle nároků 27 až 31, vyznačující se tím, že se jako hostitelské organizmy užijí eukaryotické organizmy kromě člověka, výhodně Penicillium, Aspergillus nebo Acremonium.
  31. 33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že se užije mikroorganismus, který je výhodně Penicillium chrysogenum, Apergillus nidulans nebo Acremonium chrysogenum.
  32. 34. Způsob získání transformovaných organismů podle nároků 27 až 31, vyznačující se tím, že se jako hostitelský organizmus užije prokaryotický organizmus, výhodně Escherichia coli nebo aktinomyceta.
  33. 35. Transformovaný organizmus kromě člověka, do kterého byly vloženy sekvence DNA podle nároků 8 až 16, úplně nebo částečně obsažené ve vektorech podle nároků 21 až 26, získatelné způsoby podle nároků 27 až 34.
  34. 36. Transformovaný organizmus podle nároku 35, který je prokaryotický organizmus, výhodně Escherichia coli nebo aktinomyceta.
  35. 37. Transformovaný organizmus podle nároku eukaryotický organizmus, výhodně rodu Aspergillus, Acremonium nebo Saccharomyces.
    35, který je Penicillium,
  36. 38. Transformovaný organizmus podle nároku 36, který je výhodně Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum nebo Saccharomyces cerevisiae.
    » · · > · « ·» · ·
    - 59
  37. 39. Organizmus podle nároku 36, který je čistý kmen představovaný kmeny CECT4849, CECT4852, CECT4851 a CECT4850, nebo jejich mutant nebo jejich transformovaný derivát.
  38. 40. Použití transformovaných organizmů podle nároků 35 až 39 pro výrobu antibiotik.
  39. 41. Použití transformovaných organizmů podle nároků 35 až 39 pro výrobu penicilinu.
  40. 42. Použití transformovaných organizmů podle nároků 35 až 39 pro výrobu cefalosporinů.
CZ983535A 1997-03-05 1998-03-05 Způsob zvýšení nebo blokování genové exprese pomocí promotorů genů glutamátdehydrogenázy, ß-N-hexózoaminidázy a gama-aktinu a použití takových promotorů pro výrobu antibiotik CZ353598A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES009700482A ES2127697B1 (es) 1997-03-05 1997-03-05 Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ353598A3 true CZ353598A3 (cs) 1999-02-17

Family

ID=8298517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ983535A CZ353598A3 (cs) 1997-03-05 1998-03-05 Způsob zvýšení nebo blokování genové exprese pomocí promotorů genů glutamátdehydrogenázy, ß-N-hexózoaminidázy a gama-aktinu a použití takových promotorů pro výrobu antibiotik

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6300095B1 (cs)
JP (1) JP2000509613A (cs)
KR (1) KR20000065202A (cs)
CN (1) CN1219200A (cs)
AU (1) AU6101198A (cs)
CA (1) CA2253250A1 (cs)
CZ (1) CZ353598A3 (cs)
EE (1) EE9800381A (cs)
ES (3) ES2127697B1 (cs)
HU (1) HUP0000870A3 (cs)
IL (1) IL126647A0 (cs)
LT (1) LT4557B (cs)
LV (1) LV12264B (cs)
PL (1) PL329722A1 (cs)
SK (1) SK149598A3 (cs)
WO (1) WO1998039459A1 (cs)
ZA (1) ZA981896B (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.
US7378244B2 (en) * 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
ES2143408B1 (es) * 1998-04-02 2000-12-01 Urquima Sa Promotor y construcciones para expresion de proteinas recombinantes en hongos filamentosos.
WO2000052176A1 (de) * 1999-03-03 2000-09-08 Cilian Ag β-HEXOSAMINIDASE SOWIE DIESE KODIERENDE DNA-SEQUENZ AUS CILIATEN UND DEREN VERWENDUNG
EP2009093A3 (en) * 2004-09-22 2009-04-08 Bioworks, Inc. Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
EP1801221A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-27 Sandoz AG Promoter sequences
CN102127546B (zh) * 2010-11-24 2012-10-24 山东农业大学 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8508800D0 (en) * 1985-04-04 1985-05-09 Glaxo Group Ltd Microbiological process
FI864473A (fi) * 1985-11-20 1987-05-21 Panlabs Inc Sammansatta yttryckskassetter foer fungaltransformering.
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000509613A (ja) 2000-08-02
KR20000065202A (ko) 2000-11-06
HUP0000870A2 (en) 2000-07-28
AU6101198A (en) 1998-09-22
SK149598A3 (en) 2000-03-13
CA2253250A1 (en) 1998-09-11
LT98152A (en) 1999-06-25
HUP0000870A3 (en) 2001-09-28
ES2127697B1 (es) 2000-03-16
US6300095B1 (en) 2001-10-09
PL329722A1 (en) 1999-04-12
ES2149707B1 (es) 2001-05-16
ZA981896B (en) 1998-09-14
EE9800381A (et) 1999-04-15
LV12264B (en) 1999-10-20
LT4557B (lt) 1999-10-25
US6558921B1 (en) 2003-05-06
LV12264A (lv) 1999-04-20
ES2127697A1 (es) 1999-04-16
CN1219200A (zh) 1999-06-09
WO1998039459A1 (es) 1998-09-11
ES2149707A1 (es) 2000-11-01
IL126647A0 (en) 1999-08-17
ES2149706B1 (es) 2001-05-16
ES2149706A1 (es) 2000-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gasser et al. Structure and expression of cytosolic cyclophilin/peptidyl-prolyl cis-trans isomerase of higher plants and production of active tomato cyclophilin in Escherichia coli.
Kimura et al. Cloning of the blasticidin S deaminase gene (BSD) from Aspergillus terreus and its use as a selectable marker for Schizosaccharomyces pombe and Pyricularia oryzae
US5726032A (en) Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA
Inokoshi et al. Cerulenin-resistant mutants of Saccharomyces cerevisiae with an altered fatty acid synthase gene
Suzuki et al. Soybean nodule-specific uricase (Nodulin-35) is expressed and assembled into a functional tetrameric holoenzyme in Escherichia coli
Mathison et al. Cloning, characterization, and use in strain improvement of the Cephalosporium acremonium gene cefG encoding acetyl transferase
AU725340B2 (en) Improved methods for transforming Phaffia strains, transformed Phaffia strains so obtained and recombinant DNA in said methods
CA2205411A1 (en) Lysophospholipase produced from aspergillus by recombinant methods
EP1975237B1 (en) Beta-fructofuranosidase variants and uses thereof
US5795733A (en) Process for the efficient production of 7-ADCA via 3-(carboxyethylthio) propionyl-7-ADCA
CZ353598A3 (cs) Způsob zvýšení nebo blokování genové exprese pomocí promotorů genů glutamátdehydrogenázy, ß-N-hexózoaminidázy a gama-aktinu a použití takových promotorů pro výrobu antibiotik
US5516679A (en) Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum
GARCIA‐ALVAREZ et al. Molecular cloning of soluble aminopeptidases from Saccharomyces cerevisiae: Sequence analysis of aminopeptidase yscII, a putative zinc‐metallopeptidase
US5912413A (en) Isolation of SU1, a starch debranching enzyme, the product of the maize gene sugary1
Totsuka et al. Expression and mutation of soybean β‐amylase in Escherichia coli
CA2170611A1 (en) Glycerin-3-phosphate-dehydrogenase (gpdh)
US7485771B2 (en) Polypeptides and polynucleotides relating to the α- and β-subunits of glutamate dehydrogenases and methods of use
Szabo et al. The nucleotide sequence of POX18, a gene encoding a small oleate-inducible peroxisomal protein from Candida tropicalis
JP2002505587A (ja) Ｔ．バリアビリス由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼプロモーター
US6316251B1 (en) Gene, group of genes, and novel β-gluclosidase
MXPA98009198A (en) PROMOTERS OF THE GENES GLUTAMATE DESHYDROGENASE,&amp;bgr;-N-ACETYLHEXOSAMINIDASE AND$b(g)-ACTINE, AND THEIR USE IN SYSTEMS OF EXPRESSION, SECRETION AND ANTI-SENS IN FILAMENTARY FUNGI
US20020048781A1 (en) Direct production of desacetylcephalosporin C
JP2001501466A (ja) ロドスポリジウム・トルロイド由来のセファロスポリンエステラーゼ遺伝子
Sandrock et al. and lsolation of the Gene Encoding B,-Tomatinase from Septoria lycopersici
JP2003047471A (ja) 異種タンパク質の分泌生産に優れた改変酵母およびその酵母を用いた異種タンパク質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic