WO2000052176A1 - β-HEXOSAMINIDASE SOWIE DIESE KODIERENDE DNA-SEQUENZ AUS CILIATEN UND DEREN VERWENDUNG - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01052—Beta-N-acetylhexosaminidase (3.2.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)

Definitions

  • the invention relates to a nucleic acid coding for a ⁇ -hexosaminidase.
  • Bacterial expression systems based on E. coli or B. subtilis are used for the production of recombinant peptides or proteins such as e.g. Insulin, interleukin-2, tissue plasminogen activator, proteases and lipases are used.
  • the expression systems are mostly based on the use of genetic elements, such as the lac operon or tryptophan operon.
  • the foreign proteins are either produced in "inclusion bodies" within the cell or, when using expression systems based on ⁇ -lactamase genes, in the periplasmic space. The production of recombinant proteins in the surrounding fermentation medium has not been established. In the case of gram-positive bacteria, only cell-specific proteins have so far been almost exclusively incorporated and expressed in expression systems.
  • Yeasts such as S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis or Pichia pastoris
  • CONFIRMATION COPY are also used for the heterologous expression of recombinant proteins, such as human factor Xllla, bovine pro-chymosin or surface antigens.
  • the expression systems here are based on shuttle vectors (vector with a yeast and a bacterial component), which are based on the genetic elements of galacto-kinase epimerase, acid phosphatase or alcohol dehydrogenase.
  • the recombinant protein is produced in the cytoplasm of the cell.
  • yeast's own signal sequences such as that of the alpha factor
  • the expressed proteins can also be secreted into the fermentation medium. The glycosylation of secreted proteins takes place according to the "high-mannose" type.
  • Mammalia cells such as various rodent cell types (CHO cells, C127 cells) or monkeys (Vero, CV-1 or COS cells) are also used for heterologous expression of recombinant proteins.
  • the expression systems here are based on recombinant viruses (BPV vector) or on shuttle vectors. Viral SV40 enhancer / promoter systems or cellular enhancer elements are used to regulate expression.
  • the recombinant proteins, such as erythropoietin are secreted into the fermentation medium since the foreign genes usually already have signal sequences and these are understood by the expression system and used for targeting.
  • Ciliates such as Tetrahymena are also used for the biotechnological production of glycosylated, extracellular enzymes. Ciliates grow on inexpensive fermentation media using standard fermentation processes. Vectors based on the rDNA elements of the ciliate Tetrahymena are available for the transformation of such ciliates. To the heterologous Expression of bacterial proteins in ciliates, DNA constructs from Tetrahymena genes are used. If suitable genetic elements for regulating transcription, targeting and glycosylation of foreign proteins are available, ciliates are an ideal expression system for the cost-effective production of therapeutic recombinant proteins.
  • the cells In order to obtain the recombinant protein, the cells have to be broken open and the denatured, inactive protein has to be folded back for its function. This causes additional costly process steps and lowers the yield of the desired protein.
  • the glycosylation which is important for eukaryotic proteins, is completely omitted.
  • Gram-positive bacterial expression systems the degradation of the target protein due to high proteolytic activities in the fermentation broth is also problematic.
  • yeasts When using yeasts for heterologous expression, the desired target protein is often only produced in the cell from which it has to be removed by cell disruption. As with bacterial expression systems, this causes additional time-consuming and costly process steps. If yeast-specific signal peptides are used, the foreign proteins are not correctly spliced and glycosylated during secretion.
  • mammalia cell systems are used for the production of recombinant proteins, the desired proteins are extracellular, correctly spliced and glycosylated in the fermentation medium.
  • the disadvantage here is that low expression rate due to incorrect processing and inefficient translation of genes that were introduced into the genome of the production cell line via viral vectors.
  • the serum-containing fermentation media for mammalia cells are extremely cost-intensive.
  • the fermentation technology for the cell lines sensitive to shear force is complex and also expensive due to the designs for bubble-free aeration. Further problems arise from the high risk of infection of the cell lines by mycoplasmas and viruses. Taken together, the use of mammalia cells for the biotechnological production of recombinant proteins results in very high costs, safety requirements and low yields.
  • the object of the invention is to provide a DNA sequence for the expression of secreted proteins from ciliates.
  • the DNA sequence should make it possible to transfer heterologous proteins into the fermentation medium after transformation into ciliates in an expression system. This system is also said to achieve a high expression rate of the heterologous protein, which is removed from the cell in large quantities under culture conditions.
  • This object is achieved by a system in which a nucleic acid with a sequence with the Seq. ID. No. 1 coding for ß-hexosaminidase is used.
  • the DNA sequence according to the invention of the ⁇ -hexosaminidase contains, in particular, a signal and a propeptide, and, if appropriate, further genetic elements for targeting proteins.
  • the use of these sequences in a vector makes it possible to transport heterologously expressed proteins from the cell and thus to purify them from fermentation broth without cell disruption.
  • FIG. 1 shows a nucleic acid coding for ⁇ -hexosaminidase from ciliates.
  • FIG. 2 shows a corresponding expression product of the nucleic acid according to Seq. ID. No. 1. This protein according to Seq. ID. No. 2 is also the subject of the present invention.
  • the invention particularly relates to the signal sequence of the protein according to the invention. These are preferably amino acids 1 to 17 of the protein according to the invention.
  • the invention also relates to a nucleic acid which codes for the N-terminal fragment. It is preferably a fragment of the nucleic acids according to the invention, in particular with the nucleic acid sequence 1 to 51 according to FIG. 1.
  • Another aspect of the invention is the use of a nucleic acid sequence of acidic hydrolases according to the invention or parts thereof for the homologous or heterologous expression of recombinant proteins and peptides, and for homologous or heterologous recombination ("knock-out", "gene replacement”).
  • the invention also relates to a method in which the nucleic acid according to the invention coding for ⁇ -hexosaminidase or parts thereof with the enhancers, promoters, operators, origins, terminators, antibiotic resistances or other nucleic acids or DNA fragments or other nucleic acids or DNA fragments which are customary for homologous or heterologous expression or Sequences of any kind of viroids, viruses, bacteria, archezoes, protozoa, fungi, plants, animals or humans can be combined.
  • nucleic acid according to the invention or parts thereof is incorporated into a vector, a plasmid, a cosmid, a chromosome or minichromosome, a transposon, an IS element, an rDNA or any other type of circular or linear DNA or RNA.
  • nucleic acids which are at least 40% homologous with the nucleic acid according to Seq. ID. No. 1 is.
  • the protein according to Seq. ID. No. 2 can be modified without losing its function. So-called conservative exchanges of amino acids can be carried out, for example. For this, e.g. hydrophobic amino acids are interchanged.
  • the chromatographic fractions collected were tested with specific 4-nitro-phenyl substrates for acid hydrolases, the acid phosphatase (sPAse) and the ⁇ -hexosaminidase ( ⁇ -Hex), and the fractions with the highest ⁇ -hex activity were combined. These were concentrated by a further Amicon ultrafiltration and buffered in the start buffer for affinity chromatography.
  • the chromatographic fractions collected were tested for enzyme activities as described above, the fractions with the highest activity for an acidic hydrolase were combined and buffered in phosphate buffer (PB).
  • PB phosphate buffer
  • the hydrolase-containing chromatography fractions were combined from a total of eight purifications, concentrated, portioned and frozen until further characterization.
  • ⁇ -hexosaminidase-specific PCR primers were created. By comparing the sequences with the already existing ⁇ -hex sequences, it was possible to preselect the primer combinations for the RT-PCR. With this information, the first specific cDNA fragments were amplified and sequenced using RT-PCR from isolated total RNA, the quality of which had previously been checked by Northern hybridization. With the help of these fragments, sequence-specific primers were constructed, which were used for further PCR experiments. Each primer and each partial sequence obtained was checked by database comparison and before further experiments, among other things. checked for possibly overlooked vector sequences. The cDNA sequence was extended to the 5 'and 3' end by 5 'and 3' RACE. The completed sequence of the ⁇ -hex cDNA then served as the basis for further sequence analyzes.
  • the sequence of a ⁇ -hexosaminidase from the ciliate thus determined is as shown in FIG. 1.
  • the sequence is a total of 1836 base pairs including 5'- and 3'-untranslated regions of the ⁇ -hexosaminidase with an open reading frame ("open reading frame") of 1656 base pairs in length.
  • the complementary amino acid sequence is 551 amino acids long and is as shown in Figure 2.
  • the sequence of the ⁇ -hexosaminidase has a total of 9 glycosylation sites and contains a signal peptide and a pro-sequence for targeting the enzyme by the sorting mechanism of the cell.

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Abstract

Nucleinsäure kodierend für eine beta -Hexosaminidase aus Ciliaten.

Description

ß-Hexosaminidase sowie diese kodierende DNA-Seαuenz aus Ciliaten und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft eine Nucleinsäure kodierend für eine ß- Hexosaminidase.
Die Expression von Fremdproteinen in Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, oder Mammalia-Zellen ist für die biotechnologische Darstellung und Produktion rekombinanter Proteine von großer Bedeutung. Hierbei werden bakterielle Expressionssysteme auf der Basis von E. coli oder B. subtilis zur Produktion von rekombinanten Peptiden bzw. Proteinen wie z.B. Insulin, Interleukin-2, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Proteasen und Lipasen verwendet. Bei gram-negativen Bakterien basieren die Expressionssysteme meist auf der Verwendung von genetischen Elementen, wie dem lac-Operon oder dem Tryptophan-Operon. Dabei werden die wirtsfremden Proteine entweder in "inclusion bodies" (Einschlusskörper) innerhalb der Zelle produziert, oder, bei Verwendung von Expressionssystemen auf der Basis von ß-Lactamase-Genen, in den periplasmatischen Raum. Die Produktion von rekombinanten Proteinen in das umgebende Fermentationsmedium ist nicht etabliert. Bei grampositiven Bakterien werden bisher fast ausschließlich nur zelleigene Proteine in Expressionssysteme eingebaut und expremiert.
Hefen, wie S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis oder Pichia pastoris
BESTATIGUNGSKOPIE werden ebenfalls zur heterologen Expression rekombinanter Proteine, wie z.B. von humanem Faktor Xllla, bovinem Pro-Chymosin oder Oberflächenantigenen eingesetzt. Die Expressionssystem basieren hier auf Shuttle-Vektoren (Vektor mit einem Hefe- und einem bakteriellen Anteil), die auf den genetischen Elementen der Galakto-Kinase- Epimerase, der sauren Phosphatase oder Alkoholdehydrogenase aufgebaut sind. In der Regel wird das rekombinante Protein in das Cytoplasma der Zelle produziert. Bei Verwendung von hefeeigenen Signalsequenzen, wie der des Alpha-Faktors, können die exprimierten Proteine auch in das Fermentationsmedium sezerniert werden. Die Glykosylierung sezemierte Proteine erfolgt nach dem "high-mannose"- Typ.
Mammalia-Zellen, wie verschiedene Zelltypen von Nagern (CHO-Zellen, C127-Zellen) oder Affen (Vero-, CV-1- oder COS-Zellen) kommen ebenfalls zur heterologen Expression rekombinanter Proteine zum Einsatz. Die Expressionssysteme basieren hier auf rekombinanten Viren (BPV-Vektor) oder auf Shuttle-Vektoren. Zur Regulation der Expression werden virale SV40-Enhancer/Promotor-Systeme oder zelluläre Verstärker- Elemente eingesetzt. Die rekombinanten Proteine, wie Erythropoietin, werden in das Fermentationsmedium sezerniert, da die die Fremdgene in der Regel bereits Signalsequenzen mitbringen und diese vom Expressionssystem verstanden und zur Zielsteuerung verwendet werden.
Zur biotechnologischen Produktion von glykosylierten, extrazellulären Enzymen werden des weiteren Ciliaten wie beispielsweise Tetrahymena eingesetzt. Ciliaten wachsen auf kostengünstigen Fermentationsmedien unter Einsatz von Standartfermentationsverfahren. Zur Transformation solcher Ciliaten stehen Vektoren zur Verfügung, die auf den rDNA- Elementen des Ciliaten Tetrahymena basieren. Zur heterologen Expression von bakteriellen Proteinen in Ciliaten werden DNA- Konstrukte aus Genen von Tetrahymena eingesetzt. Wenn geeignete genetische Elemente zur Regulation der Transkription, der Zielsteuerung und der Glykosilierung von Fremdproteinen zur Verfügung stehen, sind Ciliaten ein ideales Expressionssystem zur kostengünstigen Produktion therapeutischer rekombinanter Proteine.
Die bisher verwendeten Gram negativen bakteriellen Expressionssysteme führen in der Regel zur Bildung von "inclusion bodies" in der Zelle, einhergehend mit einer Denaturierung der Proteine. Für die Gewinnung des rekombinanten Proteins müssen die Zellen aufgebrochen und das denaturierte, inaktive Protein für seine Funktion zurückgefaltet werden. Dies verursacht zusätzliche kostenintensive Verfahrensschritte und erniedrigt die Ausbeute des erwünschten Proteins. Die für eukaryontische Proteine wichtige Gkykosylierung unterbleibt völlig. Bei der Verwendung von Gram-positiven bakteriellen Expressionssystemen ist der Abbau des Zielproteins durch hohe proteolytische Aktivitäten in der Fermentationsbrühe zudem problematisch.
Bei der Verwendung von Hefen zur heterologen Expression wird das erwünschte Zielprotein häufig nur in die Zelle produziert, aus der es durch Zellaufschluss entfernt werden muss. Dies verursacht, wie bei bakteriellen Expressionssystemen, zusätzliche zeit- und kostenintensive Verfahrensschritte. Werden hefeeigene Signalpeptide verwendet, so werden die Fremdproteine bei der Sezernierung nicht korrekt gespleißt und glykosyliert.
Werden hingegen Mammalia-Zellsysteme zur Produktion von rekombinanten Proteinen eingesetzt, so liegen die erwünschten Proteine extrazellulär, korrekt gespleißt und glykosyliert im Fermentationsmedium vor. Nachteilig ist hier jedoch zum einen die niedrige Expressionsrate durch die fehlerhafte Prozessierung und ineffiziente Translation von Genen, die über virale Vektoren in das Genom der Produktionszelllinie eingebracht wurden. Zum anderen sind die serumhaltigen Fermentionsmedien für Mammalia-Zellen extrem kostenintensiv. Zudem ist die Fermentationstechnologie für die scherkraftempfindlichen Zelllinien auf Grund von Konstruktionen zur blasenfreien Belüftung aufwendig und ebenfalls kostspielig. Weitere Probleme ergeben sich durch die hohe Gefahr der Infektion der Zelllinien durch Mycoplasmen und Viren. Zusammengenommen hat die Verwendung von Mammalia-Zellen zur biotechnologischen Herstellung von rekombinanten Proteinen sehr hohe Kosten, Sicherheitsauflagen und niedrige Ausbeuten zur Folge.
Für den Einsatz von Ciliaten, wie Tetrahymena, gelten die oben genannten Nachteile bei der Produktion von Proteinen nicht. So werden beispielsweise einige saure Hydrolasen, die an der Verdauung von Nahrungspartikeln beteiligt sind, in großen Mengen und komplex glykosiliert aus der Zelle ausgeschleust.
Alam et al. beschreiben im J. Euk. Mikrobiol. 43 (4), 1996, Seiten 295 bis 303 die Klonierung eines Gens, das für die saure α-Glucosidase von Tetrahymena Pyriformis kodiert. Das Protein wird jedoch nur zu einem geringen Teil aus der Zelle ausgeschleust.
Bisher ist es jedoch nicht möglich, andere, fremde glykosylierte eukaryontische Proteine in Ciliaten zur Expression zu bringen, die gleichfalls in das Fermentationsmedium sezerniert werden. Ursache ist, das bisher die DNA-Sequenzen aus Ciliaten eigenen sezernierten sauren Hydrolasen unbekannt waren, die für die Konstruktion von Expressionsvektoren notwendig sind. Aufgabe der Erfindung ist es, eine DNA-Sequenz zur Expression von sezernierten Proteinen von Ciliaten bereitzustellen. Die DNA-Sequenz soll es ermöglichen, in einem Expressionsystem heterologe Proteine nach der Transformation in Ciliaten in das Fermentationsmedium zu verbringen. Dieses System soll auch eine hohe Expressionsrate des heterologen Proteins erreichen, das unter Kulturbedingungen in großen Mengen aus der Zelle ausgeschleust wird.
Diese Aufgabe wird durch ein System gelöst, bei dem eine Nucleinsäure mit einer Sequenz mit der Seq. ID. Nr. 1 codierend für ß- Hexosaminidase Verwendung findet.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz der ß-Hexosaminidase beinhaltet insbesondere ein Signal- und ein Propeptid, sowie gegebenenfalls weitere genetische Elemente zur Zielsteuerung von Proteinen. Die Verwendung dieser Sequenzen in einem Vektor ermöglicht es, heterolog exprimierte Proteine aus der Zelle zu transportieren und damit ohne Zellaufschluß aus Fermentationsbrühe aufzureinigen.
Figur 1 zeigt eine Nucleinsäure kodierend für ß-Hexosaminidase aus Ciliaten. Figur 2 zeigt ein entsprechendes Expressionsprodukt der Nucleinsäure gemäß Seq. ID. Nr. 1. Dieses Protein gemäß Seq. ID. Nr. 2 ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Signalsequenz des erfindungsgemäßen Proteins. Es handelt sich dabei bevorzugt um die Aminosäuren 1 bis 17 des erfindungsgemäßen Proteins. Auch eine Nucleinsäure, die für das N-terminale Fragment kodiert, ist Gegenstand der Erfindung. Es handelt sich dabei bevorzugt um eine Fragment der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, insbesondere mit der Nucleinsäuresequenz 1 bis 51 gemäß der Figur 1. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer Nucleinsäuresequenz von sauren Hydrolasen gemäß der Erfindung oder Teilen davon zur homologen oder heterologen Expression von rekombinanten Proteinen und Peptiden, sowie zur homologen oder heterologen Rekombination ("knock-out", "gene replacement").
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren, bei dem die für ß- Hexosaminidase kodierende erfindungsgemäße Nucleinsäure oder Teile davon mit den für homologe oder heterologe Expression üblichen Enhancer, Promotoren, Operatoren, Origins, Terminatoren, Antibiotikaresistenzen oder anderen Nucleinsäuren bzw. DNA- Fragmenten bzw. Sequenzen jeglicher Art von Viroiden, Viren, Bakterien, Archezoen, Protozoen, Pilzen, Pflanzen, Tieren oder Menschen kombiniert werden.
Insbesondere wird die erfindungsgemäße Nucleinsäure oder Teile davon in einen Vektor, ein Plasmid, ein Cosmid, ein Chromosom oder Minichromosom, ein Transposon, ein IS-Element, eine rDNA oder jede andere Art ringförmiger oder linearer DNA oder RNA eingebaut.
Dem Fachmann ist klar, dass erfindungsgemäß auch Nucleinsäuren eingesetzt werden können, die zu mindestens 40% homolog mit der Nucleinsäure gemäß Seq. ID. Nr. 1 ist. Auch das Protein gemäß Seq. ID. Nr. 2 kann modifiziert werden ohne die Funktion zu verlieren. So können beispielsweise sogenannte konservative Austausche von Aminosäuren durchgeführt werden. Dazu können z.B. hydrophobe Aminosäuren untereinander ausgetauscht werden.
Zur Aufreinigung und Isolierung ß-Hexosaminidase aus Ciliaten und zur Bestimmung der Sequenz können folgende Methoden verwendet werden. Dies wird an den folgenden Beispielen verdeutlicht. Beispiel 1
Aus insgesamt 3,2 L Zellkultur wurden Zellen des Ciliaten Tetrahymena der spätlogarithmischen Wachstumsphase in 400 ml_ Hungermedium (10 mM TRIS-HCI, pH 7,4) hineingewaschen und die Zellen unter Schütteln weitere 4 Stunden inkubiert. Anschließend wurde der zellfreie Kulturüberstand geerntet und durch eine Reihe Filter mit abnehmendem Porendurchmesser filtriert, um eventuell vorhandenes partikuläres Material zu entfernen. Das Filtrat wurde mit einer Amicon- Ultrafiltrationszelle eingeengt und in den Startpuffer für die anschließende Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) umgepuffert.
Die aufgefangenen Chromatographie-Fraktionen wurden mit spezifischen 4-Nitro-phenyl-Substraten für saure Hydrolasen, der saure Phosphatase (sPAse) und der ß-Hexosaminidase (ß-Hex), getestet und die Fraktionen mit der höchsten ß-Hex-Aktivität vereinigt. Diese wurden durch eine weitere Amicon-Ultrafiltration eingeengt und in den Startpuffer für die Affinitäts-Chromatographie umgepuffert. Die aufgefangenen Chromatographie-Fraktionen wurden, wie oben beschrieben, auf Enzymaktivitäten getestet, die Fraktionen mit der höchsten Aktivität für eine saure Hydrolase vereinigt und in Phosphat- Puffer (PB) umgepuffert. Aus insgesamt acht Aufreinigungen wurden die hydrolase-haltigen Chromatographie-Fraktionen zusammengefasst, eingeengt, portioniert und bis zur weiteren Charakterisierung eingefroren.
Ein Teil dieser so aufgereinigten Hydrolase wurde über 2D-SDS- Gelelektrophorese aufgetrennt (insgesamt acht Gele), der Hauptspot jeweils ausgestochen und gesammelt. Das in diesen Gelstücken vorhandene Protein, die ß-Hex, wurde mit der Protease Trypsin verdaut. Die so entstandenen Peptid-Fragmente wurden aus den Gelstückchen herausgelöst und über Reverse-Phase-HPLC (RP-HPLC) voneinander getrennt. Die Reinheit der HPLC- Fraktionen wurde mit einem massenspektroskopischen Verfahren (MALDI-MS) überprüft und die sauberen, d.h. die Fraktionen, die nur eine Peptid-Spezies einer definierten Masse enthielten, über Edman-Abbau von ihrem N-Terminus her sequenziert.
Anhand der Sequenz der Peptidfragmente, die durch den Trypsin- Verdau gewonnen wurden, wurden ß-Hexosaminidase-spezifische PCR- Primer erstellt. Durch Sequenz-Vergleich mit den bereits vorhandenen ß-Hex-Sequenzen konnte eine Vorauswahl der Primer-Kombinationen für die RT-PCR getroffen werden. Mit diesen Informationen wurde mittels RT-PCR aus isolierter Gesamt-RNA, deren Qualität vorher durch Northern-Hybridisierung überprüft wurde, erste spezifische cDNA- Fragmente amplifiziert und sequenziert. Mit Hilfe dieser Fragmente wurden sequenzspezifische Primer konstruiert, die für weitere PCR- Experimente eingesetzt wurden. Jeder Primer und jede gewonnene Teilsequenz wurde durch Datenbank-Abgleich und vor weiteren Experimenten u.a. auf eventuell übersehene Vektorsequenzen überprüft. Durch 5'- und 3'-RACE wurde die cDNA-Sequenz zum 5'- und 3'-Ende verlängert. Die so vervollständigte Sequenz der ß-Hex-cDNA diente dann als Basis für weiter Sequenzanalysen.
Die so ermittelte Sequenz einer ß-Hexosaminidase von aus dem Ciliaten lautet, wie in Figuren 1 aufgeführt. Bei der Sequenz handelt es sich um insgesamt 1836 Basenpaare inkl. 5'- und 3'-nichttranslatierten Bereichen der ß-Hexosaminidase mit einem offenen Leseraster ("open reading frame") von 1656 Basenpaaren Länge. Die komplementäre Aminosäuresequenz ist 551 Aminosäuren lang und lautet, wie in Figuren 2 aufgeführt. Das Sequenz der ß-Hexosaminidase besitzt insgesamt 9- Glykosylierungsstellen und enthält ein Signalpeptid, sowie eine proSequenz zur Zielsteuerung des Enzyms durch den Sortiermechanismus der Zelle.

Claims

Patentansprüche
1. Nucleinsäure kodierend für eine ß-Hexosaminidase aus Ciliaten.
2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine extrazelluläre ß-Hexosaminidase kodiert.
3. Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 3, gekennzeichnet durch die Nucleinsäuresequenz in Fig. 1 oder Teile davon, insbesonsdere mit der Seq. ID No. 1.
4. Ein Protein mit der Aminosäuresequenz der in Figuren 2 angegebenen Abfolge von Aminosäuren.
5. N-terminales Fragment des Proteins gemäß Anspruch 4, insbesondere mit der Sequenz MQKILLITFLLGIALAQ.
6. Nucleinsäure kodierend für das N-terminale Fragment gemäß Anspruch 5, insbesondere ein Fragment der Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. Verwendung einer Nucleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 oder 6 oder Teile davon zur homologen oder heterologen Expression von rekombinanten Proteinen und Peptiden, sowie zur homologen oder heterologen Rekombination ("knock-out", "gene replacement").
8. Ein Verfahren, bei dem die Nucleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, 6 oder Teile davon mit den für homologe oder heterologe Expression üblichen Enhancer, Promotoren, Operatoren, Origins, Terminatoren, Antibiotikaresistenzen oder anderen Nucleinsäuren bzw. DNA-Fragmenten bzw. Sequenzen jeglicher Art von Viroiden, Viren, Bakterien, Archezoen, Protozoen, Pilzen, Pflanzen, Tieren oder Menschen kombiniert wird.
9. Ein Verfahren, bei dem eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6 in einen Vektor, ein Plasmid, ein Cosmid, ein Chromosom oder Minichromosom, ein Transposon, ein IS- Element, eine rDNA oder jede andere Art ringförmiger oder linearer DNA oder RNA eingebaut oder verwendet wird.
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