DD264455A1 - Verfahren zur synthese von chymosin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, durch welches das fuer die Kaeseherstellung benoetigte Chymosin nicht mehr aus dem Labmagen von Kaelbern gewonnen, sondern in beliebiger Menge synthetisch produziert werden kann; dabei soll sich aber das synthetisierte vom natuerlichen Chymosin in seiner chemischen Struktur nicht unterscheiden. Dazu wird ein isoliertes Chymosin-Gen in ein Promotor-Plasmid eingebaut, so dass in mehreren Stufen ein transformierbares Plasmid entsteht, welches in einen passenden Bacillus-Stamm transformiert wird. Nach submerser und aerober Vermehrung der Wirtszellen und Lyse der gewonnenen Zellmasse kann ein aktivierbares Prochymosin gewonnen werden. Fig. 1

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Chymosir.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das als Milchgerinnungsenzym unentbehrliche Chymosin wird aus dem proteolytisch unwirksamen Prochymosin gewonnen, das seinerseits wie allgemein bekannt und gebräuchlich aus dem Labmagen junger Wiederkäuer isoliert wird. Es steht deshalb nur im begrenzten Umfang zur Verfügung, und seine Herstellung auf diese Weise ist umständlich und teuer. Man hat deshalb seit langem versucht, das Prochymosin (oder ein gleichwertiges Pseudochymosin, dem einige N-terminalo Aminosäuren fehlen, ohne daß sich dieser Mangel negativ äußern würde) auf anderem Wege zu gewinnen. Es ist naheliegend, das Enzym in einem natürlichen, aber gentechnisch entsprechend veränderten Mikroorganismus zu synthetisieren, wie dies in der PCT-Anmeldung 8500382 bzw. den EP-Patentanmeldungen 133756 und 154351 bereits beispielsweise vorgeschlagen worden ist, die sich aber auf die Da iegung einer entsprechenden Aufgabenstellung beschränken und das zugehörige neue Verfahren nur in seinen Grundzügen beschreiben. Dies ist für die Durchführung der Synthese nicht ausreichend, weil eine produktive Sekretion bzw. der proteolytische Abbau chimärer, in dem betreffenden Wirts-Mikroorganismus fremder Proteine durch dessen Proteasen nicht ohne weiteres erfolgt, worauf bereits in „Proceedings of the National Academy of Sciences of USA" 79 (1982), S. 5582-5586 hingewiesen worden ist. Es ist zwar entsprechend den PCT-Anmeldungen 8503949 und 8601825 ► auch schon versucht worden, die Proteolyse von Fremdproteinen in den verwendeten Mikroorganismen zu vermeiden; für die Synthese von Prochymosin sind die vorgeschlagenen Verfahren aber nicht geeignet und auch nicht vorgesehen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Chymosin nach einem wirtschaftlichen, weitgehend synthetischen Verfahren in beliebiger Menge so herzustellen, daß seine Eigenschaften mit dem natürlich on Enzym übereinstimmen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat sich demzufolge die Aufgabe gestellt, die dargelegten Nachteile der bekannten vorgeschlagenen Methoden zu beseitigen und ein Prochymosin zu synthetisieren, das in seiner chemischen Struktur und seinen enzymatischen Eigenschaften dem aus dem Labmagen gewonnenen Enzym genau gleich ist. Durch Sekretion des von einem passenden Mikroorganismus gebildeten Prochymosins in eine Kulturlösung oder durch Fraktionierung des Zellextraktes soll das Enzym als filtriertes Konzentrat erzeugt werden. Im einzelnen ist eine geeignete Sekretions-Signal-Sequenz auszuwählen und die Primärstruktur in deren Bereich und im Bereich der Prochymosin-Sequenz der kodierenden DNS zu modifizieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die N-terminale cONS-Sequenz der isolierten Donor-DNS durch Einwirkung vor. Ligase so (auf einem 475-Bp-BamHI-Fragment aus einem Voktorplasmid ρ 10c 10) in ein Promotorplasmid pAp8 eingebaut wird, daß ein PlasmidpCHY3 entsteht, daß die C-terminalecDNS-Sequenz der gleichen Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem Kpnl-Hindlll-Fragment aus einem Vektorplasmid p211) in das Plasmid pCHY3 eingebaut wi d, daß ein Plasmid pCHYKH2 entsteht, und daß dtj Plasmid pCHYKH2 in bekannter Weise in Bacillus tränt.formiert wird, zweckmäßigerweise in geeignete Bacillus-siibtilis-Stämme. Die dabei transformierten Wirtszellen von Bacillus werden in geeigneter Weise submers und aerob vermehrt, wobei die gewonnene Zellmasse lysiert und daraus aktivierbares Prochymosin gewonnen wird.

Ausführungsbeispiel

Die weiteren Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden nachstehend an Hand der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: die Bildung eines Promotorpiasmids ρAp8, Fig. 2: die cDNS-Sequenz eines natürlichen Gens für Prochysin vom Rind, Fig.3: die Bildung des Plaswids pCHY3 und

Fig. 4: die Bildung des Plasmids pCHYKH 2 mit der vom N-terminalen BamHI- bis zum C-terminalen Beil-Ort vollständigen Sequenz des Prochymosin-Gans.

1. Herstellung von Promotorplasmid ρAp8

Chromosomale DNS eines Stammes von Bacillus amyloliquefaciens, isoliert nach der Methode von Saito und Miura (Saito, H., Miura, K.I., Biochim. Biophys. Acta 72 M963J, S. 619-629) und Plasmid-DNS eines Vek'orplasmids pPL603 (Williams, D.M., Duvall, EJ. und Lovoett, P. S., J. Bacteriol. 146 [1981 ], S. 1162-1165) werden mittels EcoRI in getrennten Ansätzen verdaut, deproteinisiert, ethanolgefällt, gewaschen (Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrock, J., Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, N. Y., 1982) und mit TE-Puffer (1OmM Tris-HCI, 1 mM EDTApH 7,5) gelöst, so daß eine Konzentration von je etwa 1 Mikrogramm pro 20 Mikroliter TE-Puffer erzielt wird. Die EcoRI-verdaute chromosomale DNS (etwa 2 Mikrogramm) und EcoRI-verdaute Plasmid-DNS (0,5 Mikrogramm) werden in einem Ansatz zu 20 Mikroliter in einer für T4-DNS-Ligase üblichen Reaktion unter Einsatz von etwa 2 Enzymeinheiten (Maniatis, T. et al. s.o.) ligiert.

Das Ligationsgemisch wird nach einer Methode von S.Chang und S.N.Cohen (Molec. Gen. Genet. 168 [19791, S. 111-115) in Protoplasten eines Bacillus-subtilis-Stammes transformiert. Die Sulektrion von Transformanten erfolgt auf DM3-Regenerationsmedium mit Zusatz von 20 Mikrogramm Cm/ml, 5 Mikrogramm Km/ml und 1 % unlöslicher Stärke. Die Transformanten-Kolonion werden anschließend auf Nährbodenplatten vereinzelt und bezüglich ihres Cm-(Chloramphenicol-)-Ristenzgrades überprüft. Von beispielsweise 8 Kolonien wurde bei einer Kolonie noch Wachstum auf Nähragarplatten mit 200 Mikrogramm/ml festgestellt. Das aus dieser Transformante (z. B. nach J. Bacteriol. 134 [1978[, S.318-329) nachweisbares und isolierte rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung ρAp8 (Fig. 1). Dieses Promotorplasmid unterscheidet sich vom \ ektorplasmid pPL603 durch ein etwa 270-Bp-lnsert im EcoRI-Ort.

2. Herstellung von Plasmid pCHY3

Benötigt wird gereinigte DNS von Promotorplasmid pApB und ein BamHI-Fragment über 474 Bp mit dem N-tcrminalen Teil des Gens für Kälber-Prochymosin. Das 474-Bp-Fragment wird aus einem Vektorplasmid ρ 10c 10 (DD-Patontschrift 'i36345; Folia biologica [Prahaj 31 [1985], S.71-85 und 81-92) gewonnen. Dazu werden etwa 10 Mikrogramm ρ 10c 10-DNS im ersten Schritt unter Standardbedingungen mittels Hindill und Sail verdaut (um von den im folgenden Schritt resultierenden drei BarnHI-Fragmenten die für die weitere Klonierung unerwünschten Fragmente über 1600 bzw. 3300Bp zu zerstören). N ich Deproteinisierung der Hind Ill-Sal l-verdauten DNS werden im zweiten Schritt etwa 2 Mikrogramm DNS unter Standardbedingungen mittels BamHI verdaut. Durch Agarosegel-Elektrophorese wird gezeigt, daß die für die nachfolgende Ligation unerwünschten BamH I-Fragmente (s. o.) tatsächlich durch die im ersten Schritt ausgeführte Hind IU-S"al I-Verdauung zerstört worden sind. Die so dreifach (HindIII, Sal I, BamHI) verdaute ρ 10c 10-DNS wird gereinigt und steht in^- TE-Puffer (etwa 8 Mikrogramm pro 10 Mikroliter) gelöst zur Verfügung. Zur Ligation werden etwa 1 Mikrogramm DNS des Promotorplasmids pApB unter Standardbedingungen Bcll-verdaut, anschließend deproteinisiert und im TE-Puffer (zu etwa 1 Mikrogramm/10 Mikroliter) gelöst. Zur Ligation werden 0,1 Mikrogramm BcI l-verdoute pApB-DNS in 1 Mikrogramm Hind IH-SaI l-BamH l-verdaute DNS des Vektorplasmids ρ 10c 10 unter Standardbedingungen ligiert. Nach Inkubation (4Std. bei 21⁰C) wird die Ligation durch Erhitzen auf 65°C (für 5 Minuten) beendet und die Transformation in einen Baciüus-subtilis-Stamm durchgeführt. Zur Transformation wird die bereits oben erwähnte Methode nach Chang und Cohen (1979) benutzt. Die Transformanten werden auf geeigneten DM3-Platten untdr Zusatz von 750 Mikrogramm/ml selektiort. Die erhaltenen Transformanten werden durch Ausstrich-Wachstum auf Nähragar hinsichtlich ihrer Cm-Resistenz überprüft; es werden so Cm-sensible Transformanten ermittelt, mittels Kolonie-Hybridisierung (Maniatis et al., 1982, Handbuch s.o.) gegen ein P-32-markiertes prochymosin-DNS-spezifisches Oligonukleotid Z3 GGTAACCCAGAAGTC hybridisiert und nach Exposition der Hybridisierungsfilter auf Röntgenfilm als Klone vorselektiert, die den N-terminalen Teil der Prochymosin-Soquenz enthalten. Von den so vorselektrierten Cm-sensiblen Transformanten wird (z. B. nach J. Bacteriul. 134 [ 1978], S. 318-329) Plasmid-DNS isoliert und mit den Restriktasen

EcoR I und Pst I mittels Standardmethoden verdaut, um die Lage des in den Gel I-Ort des Vektors Monierten BamH I-DNS-Fragments zu ermitteln. Bei gewünschter Orientierung sollte das kleine von zwei zu erwartenden Fragmenten 301 Bp (gegenüber 631 Bp im umgekehrton Falle) aufweisen. Das Plasmid einiger Trarisformantan weist stets die gewünschte Orientierung des BamH I-DNS-Fragmentes (zum Promotorplasmid pAp8 In Flg. 3) auf. Davon wird Plasmid pCHY 3 für die weiteren Arbeitsschritte ausgewählt, in geeigneter Weise vermehrt, isoliert und als gereinigte DNS-Probe bereitgestellt.

3. Herstellung von Plasmid PCHYKH2

Die Vervollständigung des Prochymosin-Gens (Fig. 2) erfordert unter Einsatz der oben unter 2. beschriebenen Verfahren die in Fig.4 veranschaulichten Schritte. Sie beinhalten a) die Behandlung des DNS von Plasmid pCHY3 nach Standardmethode mit dem Enzym Kpnl und Hind III, b) die Isolierung eines geeigneten Kpn I-Hind Ill-DNS-Fragmentes mit über etwa 1000Bp mittels Agarosegel-Elektrophorese und Elektro-Elution, welches außer dem C-terminalen Prochymosin-Gen über etwa 940Bp aus einem Vektor-Plasmid p211 (Koebenik, R., „Expression von Prochymosin in Escherichia coli", Dipl.-Arb. 1986, Mart.-Luther-Univ. Halle-Wittenberg) enthält, c) die Ligation von Kpn I-Hind lll-verdauter DNS des Vektors pCHY3 und des Kpn I-Hind IH-DNS-Fragmentes mittels Standard-Ligationsprozeduren und d) die Transormation nach Chang und Cohen, s. o. unter 1.) in Bacillus subtilis GSB-26 (s.o. unter 2.) oder in einen Bacillus-subtilis-Stamm GB500 (DD-Patentschrit 245444), so daß Tronsformanten-Kolonien erhalten werden, unter denen durch Koloniehybridisierung (s.o. unter 2.) mit P32-markierten synthesischen Oligonukleotiden Z1 (homolog zu dor Sequenz TGATCAGATCGCTT im C-terminalen Teil der Prochymosin-Sequenz, Fig. 2) bzw. Z3 (homolog zu der Sequenz GGGTACCCAGAAGTC im N-terminalen Teil der Prochymosin-Sequenz, Fig. 2) Transformantenkolonien ermittelt werden, die für die Oligonukleotide Z1 und Z3 eine positive Hybridisierungsantwort ergeben. Aus diesen Transformanten wird (z. B. nach J. Eacteriol. 134 (1978), S.318-329) Plasmid-DNS isoliert, nach Standard-Reinigung die DNS mittels Restriktaseverdauungen (vorzugsweise Pstl, Kpn I-Hind III, Ecorl, Hpal-Bglll) und elektrophoretischer Trennung in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert und nach der in Fig. 4 erwarteten Restriktionskarte für Plasmide mit der vollständigen Prochymosin-DNS verglichen. Das Plasmid, das der erwarteten Restriktionskarte entspricht, erhält die Bezeichnung pCHYKH 2.

4. Transormation in geeignete Wirtsstämme und Nachwels der Prochymosin-Synthese in Bacillus subtilis

Das so erhaltene Plasmid pCHYKH 2 w'rd in den proteasedefekten ßacillus-subtilis-Stamm GB 500 (DD-Patentschrift 245444) mit der Protoplasten-Transformationsmethode nach Chang und Cohen (s.o. unter 1.) transformiert. Plasmid pAp8 dient nach gleichartiger Transformation in den Bacillus-subtilis-tamm GB 500 als Kontrolle. Nach Überprüfung der Anwesenheit von Plasmid pCHYKH 2 bzw. pAp8 in den Wirtszellen des Bacilliis-subtilis-Stammes GB 500 werden Reinkulturen der Transformanten GB500-pCHYKH2 und GB500-pAp8 über 12,24 und 36 Stunden bei 37°C in einem für die Fermentor-Kultur von Bacillus subtilis geeigneten Nährmedium (z.B. Na-Succinat-LGS nach Biochem. Biophys. Res. Commun. 128(1985), S.601-606oder Glutamat-Casein-Medium nach Appl. Env.' Microbiol. 50 [1985), S. 503-507) durchgeführt. Wenn die Zellen aus diesen Kulturen in geeigneter Weise geerntet und zur l.yse gebracht werden, kann im Zellextrakt mittels SDS-PAGE nach Laemmli (Nature 227 [1970], S. 680-685) unter Verwendung der von Foltmann et al. (in FEBS Advanced Course on aspartic proteinases and their inhibitors, Prag 20-24.10.1984, published by Walter der Gruyter Berlin-New York) vorgeschlagen Casein-Enzymogrammtechnik oder nach üblichem Protein-Blottin (ζ. B. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 7611979), S. 4350-4354) unter Verwendung von chymosinspezifischen Antikörpern oder durch Bestimmung dor Milch-Clotting-Aktivität (z. B. nach Goff et al., Gene 27 [1984], S.35-46) Prochymosin nachgewiesen und bestimmt werden kann.

Claims (4)

1. Verfahren zur Synthese von Chymosin, bei dem

— ein genetischer Stoff, der zur Synthese von Prochymosin fähig ist, aus einem natürlichen tierischen Organ, beispielsweise einem Kälbermagen, isoliert wird,

— aus dem genetischen Stoff ein DNS-Fragment hergestellt wird, das als Donor-DNS verwendbar ist,

— die Donor-DNS in einom geeigneten genetischen Vektor, beispielsweise einem Vektorplasmid, eingebaut und mit einer Vektor-DNS zu einem DNS-Chimärenmolekül fusioniert wird,

— das DNS-Chimärenmolekül zum Zwecke seiner Vermehrung in geeignete Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen der Gattung Bacillus, transformiert wird und

— aus dem von den Wirtszellen intrazellulär erzeugten Enzym durch Fraktionierung der Zellextrakte schließlich Prochymosin gewonnen wird,

dadurch gekennzeichnet, daß

— die N-terminale cDNS-Sequenz der isolierten Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem 475-Bp-Bam HI-Fragment aus einem Vektorplasmid ρ 10c 10) in ein Promoterplasmid pAp 8 eingebaut wird, daß ein Plasmid pCHY 3 entsteht,

— die C-terminale cDNS-Sequenz der gleichen Donor-DNS durch Einwirkung von Ligase so (auf einem Kpn I-Hind Ill-Fragment aus einem Vektorplasmid p211) in das Plasmid pCHY 3 eingebaut wird, daß ein Plasmid pCHYKH 2 entsteht und

— das Plasmid pCHYKH 2 in bekannter Weise in Bacillus transformiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pCHYKH 2 in geeignete Bacillus-subtilis-Stämme oder andere geeignete Mikroorganismen transformiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dom Plasmid pCHYKH 2 transformierten Wirtszellan in geeigneter Weise submers und aerob vermehrt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene Zeümasse in geeigneter Weise zur Fraktionierung des gebildeten Prochymosins lysiert und daraus aktivierbares Prochymosin gewonnen wird.