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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Wirtszellen, die für die Herstellung
von rekombinanten Proteinen geeignet sind. Insbesondere betrifft
die Erfindung thermophile Pilzwirtszellen, die bei der Expression
rekombinanter Proteine, insbesondere von Enzymen, verwendet werden
können.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Verwendung rekombinanter Wirtszellen bei der Expression heterologer
Proteine hat in den letzten Jahren die Herstellung großer Mengen
von kommerziell wertvollen Proteinen stark vereinfacht, die ansonsten nur
durch Aufreinigung aus ihren nativen Quellen erhältlich sind. Derzeit besteht
eine breit angelegte Auswahl an Expressionssystemen, aus denen bei
der Herstellung eines gegebenen Proteins ausgewählt wird, einschließlich von
prokariotischen und eukariotischen Wirten. Die Wahl eines entsprechenden
Expressionssystems hängt
oft nicht nur von der Fähigkeit
der Wirtszelle zur Herstellung angemessener Ausbeuten des Proteins
in einem aktiven Zustand ab, sondern sie kann auch zu einem großen Ausmaß durch
die beabsichtigte Endanwendung des Proteins vorgegeben werden.
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Obwohl
Säugerzellen
und Hefezellen die am häufigsten
verwendeten eukariotischen Wirte sind, werden nun zunehmend filamentöse Pilze
als sehr geeignete Wirtszellen für
die rekombinante Proteinherstellung angesehen. Bestimmte Arten der
Gattung Aspergillus werden bereits wirksam als Wirtszellen zur rekombinanten
Proteinherstellung eingesetzt. Jedoch gibt es oft Probleme bei der
Bildung von zu dichten Mycelaggregaten, und mit ungleichmäßiger Verteilung,
die auch zu einem Mangel an Nährstoffen
und einer unproduktiven Situation führen. Die Art Aspergillus nidulans
wurde als mit rekombinanten Plasmiden transformiert beschrieben
(Ballance, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 112: 284–289, 1983),
allerdings wurde festgestellt, dass die Transformation in recht
geringer Häufigkeit
auftritt. Sowohl Aspergillus niger als auch Aspergillus oryzae wurden
als geeignet zur rekombinanten Herstellung von heterologen Proteinen
beschrieben. Obwohl diese Arten derzeit routinemäßig bei der rekombinanten Proteinherstellung
eingesetzt werden, haben sie auch spezifische Nachteile. Insbesondere
ist ihre Wachstumsmorphologie in Fermentern bei der Fermentation
nicht optimal, da die Viskosität
zum Ansteigen neigt, wenn die Biomasse zunimmt. Erhöhte Viskosität schränkt die
Fähigkeit
zum Mischen und Belüften
der Fermentationskultur ein, was zu Sauerstoff- und Nährstoffmangel
der Mycelien führt,
die darum nicht überlebensfähig und
unproduktiv werden. Außerdem
bestehen oft Probleme mit der Fermentation zu dichter Mycelaggregate
und mit deren ungleichmäßiger Verteilung,
was ebenfalls zum Mangel an Nährstoffen
führt.
Darum besteht für
kommerzielle Zwecke weiterhin ein Bedarf an Pilzwirten, die bei
der Expression von rekombinanten Proteinen verwendet werden können und
zufriedenstellende Wachstumsmerkmale aufweisen, wie schnelles Wachstum
und niedrige Viskosität,
wodurch sich die Produktivität
in Fermentern erhöht.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue rekombinante Pilzwirtszellen bereit,
deren Zellen Wachstumsmerkmale aufweisen, die zur Verwendung bei
der Herstellung von heterologen Proteinen in Fermentern besonders
gut geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Wirtszellen sind zum schnellen
Wachstum in der Lage, zeigen bei einer gegebenen Biomassekonzentration
niedrige Viskosität
und ergeben ein gleichmäßig verteiltes Mycel
mit einer Struktur, die lose genug ist, um eine ausreichende Diffusion
von Nährstoffen
zu sämtlichen
Teilen des Mycels zu ermöglichen.
Im Besonderen sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen thermophile
Fungi, die unter äquivalenten
Fermentationsbedingungen, beispielsweise bei der Batch-Fermentation
bei pH 5 in einem Salz-, Hefeextraktmedium, das 100 g/l Glucose
enthält,
Viskositätswerte
produzieren, beispielsweise gemessen in Pascal, die niedriger sind
als 80%, vorzugsweise niedriger als 50% und besonders bevorzugt
niedriger als 30% der unter den gleichen Bedingungen bei der gleichen
Biomasse von Aspergillus oryzae produzierten Viskositätswerte;
die bevorzugten Pilzwirte produzieren eine homogene, lose Struktur
des Mycels. Die Pilzwirtszellen werden aus der Gruppe ausgewählt, bestehend
aus Thielavia sp., Myceiophthora sp. und Sporotrichum sp. Darum
stellt die Erfindung rekombinante Wirtszellen, wie vorstehend definiert,
bereit, die ein Nukleinsäurefragment
umfassen, das ein heterologes Protein codiert, das hier so verstanden
wird, dass es auch Peptide einschließt, die durch die Wirtszelle
exprimiert werden kann. Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren
zur Herstellung von heterologen Proteinen bereit, welches das Kultivieren
einer erfindungsgemäßen Wirtszelle
unter Bedingungen, die zur Expression des heterologen Proteins von
Interesse geeignet sind, und die Wiedergewinnung des Proteins aus
der Kultur umfasst.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
die Viskosität
bei der Batch-Fermentation, gemessen in Pascal und extrapoliert
auf 30 g/l, einer Anzahl von thermophilen Pilzen im Vergleich mit
derjenigen von Aspergillus oryzae.
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3 zeigt die Southern-Hybridisierungsanalyse
von Gesamt-DNA, die aus untransformierten und Xylanase-Transformanten
von thermophilen Stämmen
isoliert wurden. Ein 1,2 kb HindIII-XhoI-Fragment von Humicola insolens-Xylanase-cDNA
wird als Sonde verwendet. Spur 1: Myceliophthora thermophila untransformiert;
Spur 2: Myceliophthora thermophila-Transformante Nr. 5; Spur 3:
Myceliophthora thermophila-Transformante Nr. 11; Spur 4: Acremonium
alabamense untransformiert; Spur 5: Acremonium alabamense-Transformante Nr.
5; Spur 6: Acremonium alabamense-Transformante Nr. 8; Spur 7: Sporotrichum
cellulophilum untransformiert; Spur 8: Sporotrichum cellulophilum-Transformante Nr.
6; Spur 9: Sporotrichum cellulophilum-Transformante Nr. 7.
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3 erläutert
die Zunahme in der Biomasse mit der Zeit für Thielavia terrestris 373
und eine nicht sporulierende Mutante desselben Stamms. Der Pfeil
gibt den Zeitpunkt an, zu dem der Stamm 373 zu sporulieren beginnt.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
kommerzielle Verwendung eines rekombinanten Proteins hängt weitgehend
von der Fähigkeit
ab, eine wirksame Produktion bei großtechnischer Fermentation zu
erreichen. Die Produktivität
bei den industriellen Fermentationen von Pilzen ist durch eine Anzahl
von Faktoren eingeschränkt.
Die allgemeinen Probleme betreffen die relativ hohe Viskosität im Vergleich
zu einzelligen Organismen, wie Saccaromyces cerevisiae und Bacillus
sp., und die oft sehr heterogene Mycelverteilung in dichten Aggregaten,
die dazu (ihren, dass ein Hauptteil des Mycels auf Grund O2-Mangels und/oder mangelnder Nährstoffdiffusion
zu sämtlichen
Zellen verhungert. Die hohe Viskosität vermindert die Sauerstoff-Transfergeschwindigkeit,
die in dem Fermenter erreicht werden kann, was wiederum die Gesamtenergie
beeinträchtigt,
die die Zelle produzieren kann, was zu einer niedrigeren Konzentration
an erhältlicher
produktiver Biomasse und zu einer niedrigeren Endproduktausbeute oder
zu längeren
Fermentationszeiten führt.
Darum ist offensichtlich, dass einfaches Erhöhen der Biomasse zur Erhöhung der
Ausbeute bei der Fermentation, ohne die entsprechende Morphologie,
die eine niedrige Viskosität
bewirkt, nicht angemessen ist. Es muss eine Zunahme in der produktiven
Biomasse erfolgen, um überhaupt
Vorteile zu erhalten.
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Es
wurde nun gefunden, dass eine Anzahl von thermophilen Pilzen unerwartet
bestimmte Wachstumsmerkmale aufweist, die sie zur Kultivierung in
Fermentern geeignet macht. Versuche zur Identifizierung von Pilzen
mit geeigneten Wachstumsmerkmalen beginnen als regelloses Screening
einer taxonomisch heterogenen Gruppe von thermophilen Pilzen unter
einer Vielzahl von Kulturbedingungen. Schüttelkolben-Evaluierungen konzentrieren
sich großenteils
auf die Bestimmung, ob die Kandidatenstämme, die zur rekombinanten Proteinherstellung
verwendet werden sollen, große
Mengen an extrazellulären
Proteinen und/oder Proteasen produzieren – beides sind unerwünschte Merkmale
in einer Zelle. Auch Wachstum und Morphologie eines jeden Stamms
beobachtet werden. Zunächst
wird davon ausgegangen, dass eine schnelle Wachstumsgeschwindigkeit
in Verbindung mit einer lockeren homogenen Verteilung von Mycelien,
die weder große
Pellets noch Aggregate in Kultur bilden, ein Hinweis auf einen guten
Kandidaten zur Verwendung im Fermenter ist. Auf der Grundlage dieses
Erstscreenings werden Stämme
der folgenden Arten zur Testung in Fermentern ausgewählt: Thermoascus
thermophilus, Mucor pusilus, Myceliophthora thermophila, Thielavia
terrestris, Acremonium alabamense (die imperfekte Form von Thielavia
terrestris), Talaromyces emersonii, und Sporotrichum cellulophilum.
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Die
Kandidatenstämme
werden in sechs 100 g/l Glucose-Batchfermentationsdurchläufen getestet, und
die Viskosität
wird ausgewertet, mit Aspergillus oryzae als Kontrolle. Mucor pusilus
erzeugt einen großen Mycelkuchen,
und Talaromyces-Stämme
erzeugen hohe Konzentrationen an Protease und werden darum aus den
weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Die Messwerte für die verbleibenden
Stämme,
die in Tabelle 1 zusammengestellt sind, zeigen, dass die Viskositätsniveaus
der Thermophilen, die getestet wurden, im Wesentlichen (d.h. mindestens
etwa 50%) niedriger sind als die Niveaus, die mit Aspergillus oryzae
bei gleichwertigen Biomassen festgestellt wurden. Eine Extrapolation
dieser Messwerte, die die Stämme
bei 30 g/l Biomasse vergleicht, zeigt 1. Streng
auf der Grundlage der Beobachtungen in Hinblick auf die Viskosität scheint Thielavia
terrestris das günstigste
Profil aufzuweisen. Die Mycelien in dieser Art sind homogen verteilt
und bilden eine lockere Struktur von geschlossenen stark verzweigten
Mycelien. Myceliophthora ist ähnlich
wie Thielavia, hat allerdings eine längliche und weniger verzweigte
Wuchsform, was eine etwas höhere
Viskosität als
bei Thielavia bewirkt. Sowohl Thermoascus als auch Sporotrichum
zeigen ebenfalls eine geeignete Morphologie und eine sehr niedrige
Viskosität.
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Zusätzlich zum
Aufweisen einer geeigneten Morphologie muss die Kandidatenwirtszelle
natürlich transformierbar
und in der Lage sein, heterologes Protein zu exprimieren. Obwohl
thermophile Pilze, z.B. Humicola grisea var. thermoidea bereits
transformiert wurden (Allison et al., Curr. Genet. 21: 225–229, 1992),
wurde die Expression von heterologen Proteinen in einer rekombinanten
Pilzzelle bisher noch nicht beschrieben. Es war darum zunächst unklar,
ob sich diese Thermophilen überhaupt
für die
rekombinante heterologe Proteinherstellung als geeignet erweisen
würden.
Allerdings können überraschenderweise,
wie in den Beispielen nachstehend gezeigt, die Standard-Aspergillus-Transformationsprotokolle
(wie beispielsweise beschrieben bei Christiansen et al., Bio/Technol.
6: 1419–1422)
zur Transformation eines großen
Teils der getesteten Stämme
verwendet werden. Somit stellen die erfindungsgemäßen thermophilen
Pilze die gesuchten Eigenschaften zur Verwendung als Wirtszellen
bei der rekombinanten Proteinherstellung in Fermentern sowohl hinsichtlich Transformierbarkeit
als auch vorteilhafter Morphologie bereit.
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Die
Verwendung von thermophilen Pilzen als Wirtszellen stellt auch weiter
Vorteile bereit. Zusätzlich zu
der niedrigeren, in Kultur dieser Pilze festgestellten Viskosität ist die
höhere
Temperatur, bei der sie gezüchtet
werden, bei einigen Arten für
eine schnellere Wachstumsgeschwindigkeit geeignet, als sie mit Nichtthermophilen
festgestellt wird. Dies wiederum führt zu einer schnelleren Akkumulation
von Biomasse, was zu einem relativ kurzen Fermentationszyklus führt. Auch
verringert bei der kontinuierlichen Fermentation die Kombination
der höheren
Temperaturen mit dem niedrigeren pH-Wert, den diese Pilze favorisieren,
das Risiko von Verunreinigung deutlich.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst jeden thermophilen Pilz, der die Viskositätsanforderungen,
wie vorstehend definiert, während
der Fermentation erfüllt. "Thermophiler Pilz" bedeutet jeden Pilz,
der optimales Wachstum bei einer Temperatur von mindestens etwa
40°C, vorzugsweise
zwischen 40 bis 50°C
aufweist. Dies schließt
die thermophilen Mitglieder der Gattungen Thielavia myceliophthora
und Sporotrichum ein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Thermophile
aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Stämmen
von Myceliophthora thermophila, Sporotrichum cellulophilum und Thielavia
terrestris besteht. Es ist selbstverständlich, dass für die zuvor
genannten Spezies die Erfindung sowohl den perfekten als auch den
Imperfekten Zustand, sowie weitere taxonomische Äquivalente, z.B. Amorphe, ohne
Rücksicht
auf den Artnamen, unter dem sie bekannt sind, einschließt. Beispielsweise
ist die imperfekte Form von Thielavia terrestris als Acremonium alabamense
bekannt, und Myceliophthora thermophilia ist Thielavia heterothallica.
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Weitere
Beispiele für
taxonomische Äquivalente
und andere geeignete Spezies können
beispielsweise gefunden werden bei Cannon, Mycopathologica 111:
75–83,
1990; Moustafa et al., Persoonia 14: 173–175, 1990; Stalpers, Stud.
Mycol. 24, 1984; Upadhyay et al., Mycopathologia 87: 71–80, 1984;
Subramanian et al., Cryptog. Mycol. 1: 175–185, 1980; Guarro et al.,
Mycotaxon 23: 419–427,
1985; Awao et al., Mycotaxon 16: 436–440, 1983; von Klopotek, Arch.
Microbiol. 98: 365–369,
1984; und Long et al., 1994, ATCC Names of Industrial Fungi, ATCC,
Rockville, Maryland. Fachleute erkennen unschwer die Identität entsprechender Äquivalente.
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Wie
die in den Beispielen dargestellten Ergebnisse zeigen, besitzen
mehrere Isolate einer jeden Art die Morphologie, die erforderlich
ist, um sie bei der Fermentation geeignet zu machen. Gezeigt wird
auch, dass die Fähigkeit
transformiert zu werden nicht auf eine einzige thermophile Art begrenzt
ist. Somit ist es selbstverständlich,
dass die Brauchbarkeit nicht auf ein einzelnes Isolat oder einen
einzelnen Stamm begrenzt ist, sondern dass sie stattdessen ein Merkmal
einer Gruppe von Arten ist. Die Fachleute erkennen, dass andere Stämme oder
Isolate dieser Arten ebenfalls bei der Expression der heterologen
Expression verwendet werden können.
Viele Stämme
einer jeden Art sind öffentlich
zugänglich
in den Sammlungen American Type Culture Collection (ATCC) 12301
Parklawn Drive, Rockville Maryland 20852, Agricultural Research
Service Culture Collection (NRRL) 1815 North University Street,
Peoria, Illinois 61604; Fungal Genetics Stock Center (FGSC), Kansas;
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder
Weg, 1B, D-3300 Braunschweig, Germany; Institute of Applied Microbiology
(IAM), Tokyo University 1-1,1-Chome,
Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113, Japan; Institute for Fermentation (IFO),
17–85
Jusohonmachi 2-chome, Yodogawaku, Osaka 532, Japan; und Centraal
Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn,
Netherlands und auch in der Kultursammlung der Fa. Novo Nordisk
Biotech, Davis, California zugänglich
sind.
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Die
Eignung von anderen thermophilen Pilzwirten zur Verwendung in Fermentern
kann durch die in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren
unschwer bestimmt werden. Kurz gesagt werden die Pilzkandidaten
auf Standard-Wachstumsmedium, wie Salze/Hefeextrakt, Soja, Kartoffelprotein,
oder auf einem beliebigen mit Glucose oder einer anderen entsprechenden
Kohlenstoffquelle angereicherten Medium kultiviert. Die Fermentation
wird bei einem pH von etwa 4 bis 7 und bei einer Temperatur von
etwa 37 bis 50°C, vorzugsweise
bei etwa 42 bis 46°C
durchgeführt.
Natürlich
wird berücksichtigt,
dass die Temperatur der Kontrollfermentation diejenige sein sollte,
die für
den Kontrollstamm optimal ist; für
A. oryzae bedeutet dies etwa 32 bis 36°C. Es ist möglich, diejenigen Stämme, die
zur Fermentation geeignet sind, durch Sichtinspektion der Mycelmorphologie
in den Schüttelkolben
quantitativ zu identifizieren; geeignete Stämme zeigen eine lockere homogene
Mycelanordnung mit vielen Verzweigungspunkten. Die Bestätigung der
Brauchbarkeit wird am besten in Fermentern durch Bewertung der tatsächlichen
Viskosität
des Kulturmediums zu verschiedenen Zeitpunkten der Fermentation
bestimmt. Die Viskositätsbestimmung
kann durch jedes aus der Technik bekannte Mittel vorgenommen werden,
z.B. Brookfield-Rotationsviskosimetrie
(definierter oder unbegrenzter Scherabstand und ein beliebiger Typ
von Spindelkonfiguration), kinematische Viskositätsröhrchen (Durchflussröhrchen),
Fallball-Viskosimeter
oder Becherviskosimeter. Vorzugsweise wird bei der Bewertung ein
Stamm von A. oryzae als Kontrolle eingeschlossen, mit dem die Viskosität des Stamm-Kandidaten
verglichen wird. Die bevorzugten Wirtszellen zeigen etwa 80% oder
weniger des Viskositätsniveaus,
das von einem A. oryzae-Stamm unter identischen Fermentationsbedingungen
erzeugt wird, vorzugsweise etwa 50% oder weniger und besonders bevorzugt
etwa 30% oder weniger.
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Der
Fachmann erkennt auch, dass die erfolgreiche Transformation der
beschriebenen Wirtsarten nicht auf die Verwendung der Vektoren,
Promotoren und Selektionsmarker, die speziell als Beispiel angegeben
sind, beschränkt
ist. Allgemein ausgedrückt,
sind diejenigen Techniken, die bei der Transformation von A. oryzae, A.
niger und A. nidulans geeignet sind, auch bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen
geeignet. Beispielsweise umfassen, obwohl die amdS-Selektionsmarker
bevorzugt sind, andere geeignete Selektionsmarker die Marker argB
(A. nidulans oder A. niger), trpC (A. niger oder A. nidulans), pyrG
(A. niger oder A. nidulans), sC (Selenat-Resistenz) oder Glufosinat-Resistenz
(A. oryzae)-Marker oder ihre Äquivalente
aus anderen Arten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der
Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die in diesen Arten
starke Transkriptionsaktivität
zeigt, und kann von Genen stammen, die sowohl extrazelluläre als auch
intrazelluläre Proteine
codieren, wie Amylasen, Xylanase, Glucoamylasen, Proteasen, Lipasen,
Cellulasen und glycolytische Enzyme. Solche geeigneten Promotoren
können
aus Genen für
A. oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Aspartamproteinase, A.
niger-Glucoamylase, A. niger-neutrale α-Amylase, A. niger-säurestabile α-Amylase und Rhizomucor miehei-Lipase
stammen. Beispiele für
Promotoren aus Genen für
glycolytische Enzyme sind TPI, ADH und PGK. Der Promotor kann auch
ein homologer Promotor sein, d.h. der Promotor für ein Gen, das gegenüber dem
verwendeten Wirtsstamm nativ ist. Ein geeigneter erfindungsgemäßer Promotor ist
der A. oryzae-TAKA-Amylase-Promotor. Die TAKA-Amylase ist eine gut
bekannte α-Amylase
(Toda et al., Proc. Japan Aca. 58 Ser. B.: 208–212, 1982). Die Promotorsequenz
kann auch mit Linkern versehen sein zum Einbringen spezifischer
Restriktionsstellen, die die Ligation der Promotorsequenz mit dem
Gen der Wahl oder mit einem ausgewählten Signalpeptid oder einer
Präregion
erleichtern. Terminatoren und Polyadenylierungssequenzen können ebenfalls
aus den gleichen Quellen wie die Promotoren stammen. Auch Enhancersequenzen
können
in das Konstrukt eingebaut werden.
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Zur
Vermeidung des notwendigen Aufbrechens der Zelle, um das exprimierte
Produkt zu erhalten und um die Menge an möglichem Abbau des exprimierten
Produkts innerhalb der Zelle zu minimieren, ist es bevorzugt, dass
das Produkt aus der Zelle nach außen sezerniert wird. Zu diesem
Zweck wird bei einer bevorzugten Ausführungsform das Gen von Interesse
an eine Präregion
gebunden, wie ein Signal- oder ein Leaderpeptid, das das exprimierte
Produkt in den Sekretionsweg der Zelle lenken kann. Die Präregion kann
von Genen für
jedes sezernierte Protein aus jedem Organismus stammen oder kann
die native Präregion
sein. Unter den geeigneten, zur Verfügung stehenden Quellen für eine solche
Präregion
ist ein Glucoamylasegen oder ein Amylasegen aus einer Aspergillus-Art,
ein Amylasegen aus einer Bacillus-Art, ein Lipase- oder Proteinasegen aus
Rhizomucor miehei, das Gen für
den α-Faktor aus Saccharomyces
cerevisiae oder das Kälber-Prochymosingen.
Besonders bevorzugt stammt die Präregion aus dem Gen für A. oryzae-TAKA-Amylase,
A. niger-neutrale Amylase, A. niger-säurestabile Amylase, B. licheniformis-α-Amylase,
die Maltogen-Amylase aus Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus α-Amylase
oder für
B. licheniformis-Subtilisin. Eine wirksame Signalsequenz ist das
A. oryzae-TAKA-Amylasesignal, das Rhizomucor miehei-Aspartamproteinasesignal
und das Rhizomucor miehei-Lipasesignal. Als Alternative kann auch
die zu dem Gen, das exprimiert wird, native Präregion verwendet werden.
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Das
Gen für
das gewünschte
Produkt, das mit der Promotor- und Terminatorsequenz funktionell
verknüpft
ist, kann in einen Vektor eingebracht werden, der den Selektionsmarker
enthält,
oder es kann auf einem getrennten Vektor oder einem Plasmid angeordnet
werden, das in der Lage ist, in das Genom des Wirtsstrangs eingebaut
zu werden. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein einziges
Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide sein, die
zusammen die in das Genom zu integrierende Gesamt-DNA enthalten.
Vektoren oder Plasmide können
lineare oder geschlossene ringförmige
Moleküle
sein. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird der Wirt mit zwei Vektoren transformiert, wovon einer
den Selektionsmarker und der andere die restliche einzubringende
heterologe DNA, einschließlich
des Promotors, des Gens für
das gewünschte
Protein und des Transcriptionsterminators und der Polyadenylierungssequenzen
enthält.
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Die
vorliegenden Wirtszellenarten können
zur Expression jedes prokariotischen oder eukariotischen heterologen
Peptids oder Proteins von Interesse verwendet werden und werden
vorzugsweise zur Expression von eukariotischen Peptiden oder Proteinen
verwendet. Die Art Thielavia terrestris ist insofern besonders geeignet,
als erkannt wird, dass sie eine sichere Historie aufweist. Von besonderem
Interesse für
diese Art ist ihre Verwendung bei der Expression von heterologen
Proteinen, insbesondere von Pilzenzymen. Die neuen Expressionssysteme
können
zur Expression von Enzymen verwendet werden, wie Katalase, Laccase,
Phenoloxidase, Oxidase, Oxidoreductase, Cellulase, Xylanase, Peroxidase,
Lipase, Hydrolase, Esterase, Cutinase, Protease und andere proteolytische
Enzyme, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Phytase, Lyase, Pectinase und
andere pektinolytische Enzyme, Amylase, Glucoamylase, α-Galactosidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase, β-Glucosidase, Mannosidase,
Isomerase, Invertase, Transferase, Ribonuclease, Chitinase, Mutanase und
Deoxyribonuclease. Für
die Fachleute ist es selbstverständlich,
dass der Begriff "Pilzenzyme" nicht nur native
Pilzenzyme, sondern auch diejenigen Pilzenzyme einschließt, die
durch Aminosäuresubstitutionen,
Deletionen, Additionen oder andere Modifikationen, die vorgenommen
werden können,
um die Aktivität,
Wärmestabilität, pH-Toleranz
und dergleichen zu verstärken,
modifiziert wurden.
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Die
vorliegenden Wirtszellen können
auch bei der rekombinanten Produktion von Proteinen eingesetzt werden,
die für
die Wirtszellen nativ sind. Beispiele für eine solche Verwendung umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, das Anordnen eines nativen Proteins eines Thermophilen unter
der Kontrolle eines anderen Promotors, um die Expression des Proteins
zu verstärken,
den Export eines nativen Proteins von Interesse aus der Zelle nach
außen
durch die Verwendung einer Signalsequenz zu fördern oder um die Kopienanzahl eines
Proteins zu erhöhen,
das normalerweise durch die betreffenden Wirtszellen produziert
wird. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch im Rahmen des
Begriffs "heterologes
Protein" eine solche
rekombinante Produktion von homologen Proteinen in dem Ausmaß, in dem
an einer solchen Expression die Verwendung genetischer, für die Wirtszelle
nicht nativer Elemente oder die Verwendung nativer Elemente, die
manipuliert wurden, um auf eine Weise zu wirken, die in der Wirtszelle
normalerweise nicht beobachtet wird, beteiligt ist.
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Wie
vorstehend angemerkt, befindet sich Thielavia terrestris auf Grund
seiner ausgezeichneten Morphologie unter den bevorzugten Arten zur
Verwendung bei der rekombinanten Proteinherstellung. Jedoch unterliegt
diese Art auch in einer submersen Kultur dem Biomassenverlust auf
Grund von Sporulation unter Bedingungen eingeschränkten Wachstums
(entweder Glucose oder Sauerstoff). Insbesondere können die
großen
Mengen von Mycelien, die während
der frühen
Fermentationsstadien produziert werden, schnell verschwinden, und
große
Mengen Sporen auftreten. Da die Mycelien die Produktionsorte der
rekombinanten Proteine sind, ist die Vermeidung der Sporulation
in Kultur wünschenswert.
Zu diesem Zweck wird eine nicht sporulierende Mutante von Thielavia
isoliert. Die Sporen werden ultraviolettem Licht ausgesetzt und
5 Tage kultiviert. Anschließend
werden die Mycelien auf Platten ausgestrichen und 24 h inkubiert.
Die 8 größten Kolonien
werden unter der Annahme ausgewählt,
dass Mycelfragmente schneller wachsen als Sporen, die zuerst keimen
müssen,
und werden in Schüttelkolben
getestet. Zwei der acht Kolonien zeigen in submerser Kultur keine
Sporulation; daher ist dies ein Anzeichen für einen erfolgversprechenden
Ansatz zur Produktion von nicht sporulierenden Stämmen, sofern
Bedarf entsteht.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nicht einschränkenden
Beispiele erläutert.
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I. Schüttelkolbenbewertung
von Thermophilen
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ASPO4-Medium
mit der folgenden Zusammensetzung mit variabler Kohlenstoffquelle
wird in Schüttelkolben
verwendet.
Hefeextrakt | 2
g/l |
MgSO4·7H2O | 1
g/l |
CaCl2 | 1
g/l |
KH2PO4 | 5
g/l |
Citronensäure | 2
g/l |
Spurenmetall* | 0,5
ml/l |
Harnstoff | 1
g/l |
(NH4)2SO4 | 2
g/l |
- * enthält
14,3 g/l ZnSO4·7H2O,
2,5 g/l CuSO4·5H2O,
0,5 g/l NiCl2·6H2O,
13,8 g/l FeSO4·7H2O,
8,5 g/l MnSO4·H2O,
und 3 g/l Citronensäure.
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Propylen-Schüttelkolben
(100 oder 500 ml) ohne Prallbleche werden verwendet, die bei 200
U/min bei einer Temperatur von 42 bis 44°C, pH 4,5 geschüttelt werden.
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Eine
Anzahl von thermophilen Stämmen
wird in Schüttelkolben
auf die folgenden Merkmale gescreent: (1) kräftiges Wachstum; (2) Proteaseproduktion;
(3) sezernierte Proteine; und (4) Mycelmorphologie. Zur Bestimmung
der Proteaseaktivität
wird der Überstand
aus der Kulturlösung
jeweils bei 2.500 U/min 5 min zentrifugiert und bei dem Casein-klärenden Plattenassay
eingesetzt, der die Proteasespiegel der verschiedenen Pilzspezies
bestimmt, die als potentielle Kandidaten zur rekombinanten Proteinexpression
bewertet werden.
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Der
Caseinplatten-Clearingassay wird wie folgt durchgeführt: das
Plattenmedium besteht aus 20 g/l entrahmter Milch, 20 g/l Agarose
und 0,2 M Citrat-Phosphatpuffer für die Tests, die bei pH 5 und
pH 7 durchgeführt
werden, und aus Glycin-NaOH-Puffer für die Tests, die bei pH 9 durchgeführt werden.
Milchpulver wird mit 100 ml Puffer vermischt und bei 60°C gehalten.
Agarose wird mit 400 ml Puffer vermischt und 5 min autoklaviert.
Nach leichtem Abkühlen
wird das warme Milchgemisch zugesetzt, und das Gemisch vorsichtig
2 bis 3 Mal zum Mischen invertiert. Das Medium wird unter Verwendung
von 50 bis 70 ml pro Platte zu 150-mm-Platten gegossen und bis zum Gebrauch
bei 5°C
gelagert.
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Unmittelbar
vor dem Gebrauch werden 12 Löcher
pro Platte in den Agar eingebracht. 25 μl Überstand aus der Fermentation
eines jeden Stammes werden zu einer Platte von jedem pH zugesetzt
und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Den pH-9-Platten wird 0,5 M Eisessig zugesetzt, um das
Casein auszufällen
und damit sich alle klaren Zonen sichtbar machen lassen. Jede Platte
wird anschließend
nach klarer Zonengröße (d.h.
von keine Zone bis > 2
cm im Durchmesser) und Zonentyp (d.h. klar, opak oder beide Typen)
bewertet.
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Die Überstände einer
jeden Kultur werden auch zur Bewertung der extrazellulären Proteinproduktion des
Stammes verwendet. Nach den Anweisungen des Herstellers hergestellte
Novex 8–16%
SDS-Polyacrylamid-Gradientengele werden zur Bewertung des Proteinprofils
verwendet. Eine 40-μl(48
h)-Probe von Kulturüberstand
wird mit 10 μl
5 × Dissoziationspuffer
(Dissoziationspuffer = 4 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8, 1 g SDS, 617 mg
Dithiothreitol, und steril destilliertes Wasser auf 10 ml) und Glycerin/Bromphenolblau
(10–20
mg zugesetzt zu etwa 10 ml 80–90%
Glycerin und 1–2
h zur Auflösung
in siedendes Wasser verbracht) gemischt, 5 min gekocht, abgekühlt, geladen
und bei 120 V laufen gelassen, bis der Bromphenolblau-Spurenfarbstoff
den Boden des Gels erreicht. Die Gele werden mit Commassie-Brilliantblau
gefärbt.
Diejenigen Isolate, die eine große Anzahl von Banden zeigen,
werden als weniger geeignete potentielle neue Wirte angesehen.
-
Das
Wachstum wird auf einer Skala von + bis +++ qualitativ bewertet.
Die Morphologie wird wie folgt abgestuft: 1-lange Hyphen in enger
Wechselwirkung mit sehr wenig Verzweigung; 2-viele Konidiensporen
mit sehr ausgeprägter
Verzweigung; 3-dünne,
lange, gerade Hyphen mit etwas Verzweigung; 4-dicke, kurze, unregelmäßige Hyphen
mit vielen Verzweigungen; 5-lockeres Mycel mit sehr ausgeprägter Verzweigung;
6-lockeres verzweigtes Mycel mit sehr homogener Mycelverteilung;
7-lange Hyphen in enger Wechselwirkung mit etwas Verzweigung. Die
Morphologien 5 und 6 werden als besonders erwünscht betrachtet.
-
5
Experimente in Schüttelkolben
werden durchgeführt,
wobei die Identität
und Menge der Kohlenstoffquelle wie folgt variiert werden: (1) Maltodextrin
10 g/l; (2) Glucose 10 g/l; (3) Maltodextrin 20 g/l; (4) 10 g/l
Avicell + 1 g/l Glucose [zur Induktion der Cellulasen]; (5) 30 g/l
Maltodextrin + 10 g/l Glucose. Die Isolate der getesteten Spezies
in einem oder mehreren der Experimente sind: Talaromyces emersonii,
T. byssochlamydoides, Thielavia terrestris, Thermoascus thermophilus,
T. aurantiacus, Malbranchea sulfurea, Melanocarpus albomyces, Sporotrichum
cellulophilum, Acremonium alabamense, Humicola grisea var. thermoidea,
Mucor pusilus, Myceliophthora thermophila, und Scytalidium thermophilum.
Mehrere dieser Stämme
zeigen unter einer oder mehreren der experimentellen vorstehend
definierten Bedingungen eine geeignete Morphologie und kräftiges Wachstum
auf. Unter den getesteten Bedingungen sezerniert keiner der getesteten
Stämme
hohe (> 1 g/l) Niveaus
eines Proteins, und es wird davon ausgegangen, dass sie einen sauberen
Proteinhintergrund aufweisen. Mehrere von diesen Stämmen zeigen
hohe Protease-Aktivität
(z.B. Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides), und
einige wachsen unter den getesteten Wachstumsbedingungen sehr schlecht (z.B.
Malbranchea sulfurea). Keine von diesen werden weiter getestet.
-
Im
Laufe dieser Bewertung wird das Ausmaß der Sporulation in submersen
Kulturen und auf Platten bestimmt. Die Fähigkeit zur Sporulierung auf
Platten ist für
eine geeignete Wirtszelle praktisch essentiell. Von der Spezies
von Interesse zeigen weder Thielavia terrestris noch Myceliophthora
thermophila auf normalen Pilzagarplatten irgendwelche Sporen. Verfahren
zur Sporulation werden dann für
diese beiden Arten entwickelt. Für
Myceliophthora wird Mycel zuerst auf Kartoffeldextroseagar (PDA;
Difco)-Platten 48 h bei 37°C
und dann über
Nacht bei 50°C
und anschließend
noch 24 bis 48 h bei 17°C
gezüchtet.
Temperaturstress löst
bei dieser Art offensichtlich die Sporulation aus.
-
Bei
Thielavia kann die Sporulation auf Platten ausgelöst werden,
indem zunächst
Mycel auf PDA-Platten 3 Tage lang in der normalen Atmosphäre eines
37°C-Inkubationsraums
inkubiert wird. Die Kultur wird anschließend in ein 1-l-Pyrex®-Becherglas
verbracht, das mit N2-Gas gespült, mit
einer Plastikumhüllung
verschlossen und für
48 h wieder in den 37-°C-Raum verbracht wird.
Die Platte wird aus dem Becherglas in die normale Atmosphäre des Raums
entnommen und 1 Woche inkubieren gelassen. Die Platte entwickelt
zwischen dem Vor- und Nach-N2-behandelten
Wachstum einen Ring von schmutzig-weißen Sporen. Diese Sporulierung
wird offensichtlich durch den Sauerstoffstress ausgelöst. Eingeschränkter Sauerstoff
sowie eingeschränkte
Glucose lösen
die Sporulation auch bei Thielavia in submersen Kulturen aus. In
der Tat erfolgt eine solche Sporulation spontan nach 3–4 Tagen
in ASPO4-Medium mit 20 g/l Glucose. Unter Fermentationsbedingungen
ist diese Sporulation jedoch unerwünscht, da die Mycelbiomasse
schnell verschwindet und durch Sporen ersetzt wird, wodurch die
Produktivität
herabgesetzt wird. Um dieses Problem zu beheben, wird ein nicht sporulierender
Stamm aus Thielavia terrestris E373 erzeugt. Ein Schüttelkolben
mit 106 UV-exponiertem (30 sec Exposition
führen
zu 40% Abtötung)
Sporen/ml Medium (ASPO4 mit 2 g/l Glucose) wird 5 Tage bei 42°C kultiviert.
Mycel aus dieser Kultur wird in 0,1% Tween-Lösung, ausgestrichen auf PDA-Platten,
verdünnt
und 24 h bei 42°C
inkubiert. Die 8 größten Kolonien
werden auf Grund der Annahme, ausgewählt dass Mycelfragmente schneller
wachsen als Sporen, die zuerst keimen müssen. Die selektierten Kolonien
werden in Schüttelkolben übergeführt; 2 der
8 selektierten Kolonien sporulieren in diesen submersen Kulturen überhaupt
nicht, während
die anderen 6 einen gewissen Grad an Sporulation zeigen.
-
Ausgewählt für die Anfangsuntersuchung
in Tankfermentation werden Thielavia terrestris (Stämme E373
und ATCC 20627), Myceliophthora thermophila (Stamm A421), Sporotrichum
cellulophilum (Stamm ATCC 20493) und Thermoascus thermophilus (Stämme 2050
und CBS 759.71). Mucor pusilus(Stamm A209), Acremonium alabamense
(A2082), Talaromyces emersonii (Stamm A577). Die mit "A" bezeichneten Stämme sind in der Kultursammlung
von Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich; die mit "E" bezeichneten Stämme sind in der Kultursammlung
von Novo Nordisk Entotech, Davis, California, erhältlich.
-
II. Fermenterbewertung
-
Das
bei der Tankfermentation verwendete Medium ist wie folgt:
| Charge |
MgSO4·7H2O | 2
g/l |
KH2PO4 | 5
g/l |
Citronensäure·1H2O | 4
g/l |
Hefeextrakt | 10
g/l |
NH4-Sulfat | 10
g/l |
CaCl2 | 2
g/l |
AMG-Spurenmetalle* | 0,5
ml/l |
Pluronic | 1
ml/l |
- * enthält
ZnSO4·7H2O 14,3 g/l; CuSO45H2O 2,5 g/l; NiCl2·6H2O 0,5 g/l; FeSO4·7H2O 13,8 g/l; MnSO4·H2O 8,5 g/l; Citronensäure 3,0 g/l.
-
Leitungswasser
wird verwendet, und der pH wird auf 6 vor dem Autoklavieren eingestellt.
-
Kohlenstoffquelle:
5% Glucose, zugesetzt zu 100 g/l bezogen auf das Anfangsvolumen
(21).
-
Die
Fermentation wird bei 42 bis 46°C,
pH 5,0, +/–0,1,
eingestellt mit H3PO4 oder
NaOH, durchgeführt. Es
werden die Applicon-Fermenter mit vergrößerter Impellergröße verwendet.
Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff
(DOT) wird bei > 20%
der Sättingungskonzentration
mit einer Belüftungsrate
von 1 Volumen pro Volumen pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit zwischen
800 bis 1.400 U/min gehalten.
-
Die
Biomassekonzentration wird durch das Trockenzellgewicht bestimmt.
20 ml der Kulturen werden über
zuvor gewogene 20-μm-Membranen
filtriert. Die Filterkuchen werden zweimal mit H2O
gewaschen, 48 h bei 96°C
getrocknet und gewogen. Die Viskosität wird mit einem Bohlin Reologi,
Inc. "Visco 88" bestimmt, welches
mit dem "C14"-Becher-und -Zylindersystem
ausgestattet ist. Der Systemschalter wird auf "1" eingestellt, und
die Geschwindigkeit wird auf "8" eingestellt. Dies
dreht den Zylinder im Becher mit 1.000 U/min und ergibt eine Schergeschwindigkeit
von 1.222/s. Ganzkulturproben werden aus den Fermentern entnommen
und innerhalb von 2 min mit einem Raumtemperaturinstrument gemessen.
Ungefähr
10 ml Probe werden in den Becher gegeben, der wiederum auf dem Visco
88 so fixiert ist, dass der Zylinder vollständig eingetaucht ist. Die Anfangsviskositätsablesung,
die innerhalb von Sekunden ab dem Start der Zylinderrotation erzeugt
wird, wird aufgezeichnet.
-
6
Fermentationsdurchläufe
von T. terrestris E373 und ATCC 20627, M. thermophila 421, S. cellulophilum
ATCC 20493, T. thermophilus A2050 und A. oryzae A1560 (Kontrolle)
werden auf die Viskosität
analysiert. Sämtliche
Durchläufe
sind 100 g/l Glucose-Batchfermentationen bei pH 5 und 1.100 U/min.
Die thermophilen Stämme
werden bei 42°C
gezüchtet,
und A. oryzae wird bei 37°C
gezüchtet.
Die Messwerte sind in Tabelle 1 dargestellt und zeigen die Viskositätswerte
in Pascal; je niedriger der Viskositätswert desto weniger viskos
ist die Kultur. Die gemessenen Viskositätsdaten beruhen auf frischen
Proben, die während
der ersten Sekunden der Testung in dem Rheometer gemessen werden.
Die extrapolierten Viskositätsdaten,
die die Stämme
bei 30 g/l Biomasse vergleichen, sind in 1 gezeigt.
-
Tabelle
1. Vergleichsviskositäten
von Thermophilen
-
-
Wie
die Daten zeigen, ist der bei weitem viskoseste Stamm der Kontrollstamm
A. oryzae. Die am wenigsten viskosen Stämme sind die beiden Thielavia-Stämme. Es
wird festgestellt, dass diese Stämme
in den Fermentern leicht gemischt und belüftet werden können und
ein sehr homogen dispergiertes Mycel zeigen, das eine lockere Struktur
eng zusammenhängender
stark verzweigter Mycelien bildet, die während des Wachstums kontinuierlich
auseinander brechen. Weder große
Pellets noch Aggregate werden gebildet.
-
Der
Myceliophtora-Stamm ist Thielavia sehr ähnlich, ergibt allerdings eine
längliche
und weniger verzweigte Wuchsform, was zu einer etwas größeren Viskosität führt. Die
Messungen mit Agremonia werden nicht erhalten, aber die Sichtinspektion
deutet daraufhin, dass sie eine Morphologie und Viskosität ähnlich Thielavia zeigt.
Thermoascus zeigt ebenfalls eine gute Morphologie, entsprechend
Thielavia. Sporotrichum ist morphologisch ebenfalls gut, produziert
allerdings große
Mengen eines grünen
Pigments und beginnt unter diesen Fermentationsbedingungen zu lysieren.
Mucor pusilus erzeugt eine weniger optimale Morphologie mit einem großen Mycelkuchen
und wird nicht weiter ausgewertet. Talaromyces wird ebenfalls nicht
weiter herangezogen, da es größere Mengen
an Proteaseaktivität
als die anderen Stämme
produziert. Tabelle 2 zeigt die Messwerte für die Wachstumsraten, gemessen
bei Biomassekonzentrationen von 2 bis 15 g/l, und für die Proteaseproduktion
der im Fermenter getesteten Stämme.
Die Wachstumsrate wird aus der Wachstumskurve abgeschätzt, wobei
eine fast lineare Biomassenzunahme von 2 bis 15 g/l Trockenbiomassekonzentration
(Biomasse wird durch Filtration, Trocknen und Wiegen des zurückbleibenden
Mycels auf dem Filter bestimmt) festgestellt wird.
-
Tabelle
2. Wachstumgsrate und Proteasebildung in Glucose-Batch-Fermentationen
bei pH 5 und 42°C
-
-
Ein
weiteres Verfahren zur Bewertung der Pilzmorphologie und zur Bestimmung,
wie geeignet sie für die
submerse Tankfermentation ist, besteht in dem Versuch, sehr hohe
Biomassekonzentration zu erhalten. Mit einzelligen Organismen, wie
E. coli und S. cerevisiae, ist es möglich, eine Biomassekonzentration
von nahe 100 g/l zu erreichen, allerdings ist es mit Pilzen sehr
schwierig, eine Konzentration von größer als 75 g/l zu erreichen.
Die Obergrenze (verursacht durch hohe Viskosität und mangelnde Sauerstoffübertragung)
für A. oryzae
und A. niger beträgt
etwa 50 bis 60 g/l. Thielavia terrestris E373 und die nicht sporulierende
vorstehend beschriebene Mutante werden in submerser Kultur getestet.
Die Fermentation erfolgt bei pH 5, 42°C und in einem Medium, das im
Vergleich zu den früher
beschriebenen Batch-Medium (200 g/l Glucose) doppelt so stark ist.
Die nicht sporulierende Mutante erreicht eine Biomasse von etwa
90 g/l nach 140 h (3). Dies ist bei
einer Pilzfermentation eine ungewöhnlich hohe Biomassekonzentration
und zeigt eindeutig die Überlegenheit
dieser Stämme
mit diesem Typ von Morphologie.
-
II. Expression von heterologen Genen in
Thermophilen
-
A.
Selektierbare Markervektoren. Der Vektor pJaL77 wird bei der Transformation
von Wirtszellen mit dem Hydromycin B-Resistenz-selektierbaren Marker
verwendet. Dieser Marker beruht auf dem E. coli-Hygromycin B-Phosphotransferasegen,
das vom TAKA-Promotor
kontrolliert wird. Kurz gesagt wird der Vektor wie folgt konstruiert.
Das Resistenz gegenüber
Hygromin B verleihende Gen wird von der Fa. Boehringer Mannheim
als Plasmid pHph-1 bezogen. Dieses Gen wird mit einem ATG-Codon
sowie mit geeigneten Restriktionssschnittstellen an den Amino- und
Carboxytermini durch PCR ausgestattet, wobei die folgenden Primer
verwendet werden: 5'-GCT
CAG AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCA ATG TCG CCT GAA CTC ACC GCG ACG
TCT-3' (N-terminal)
und 3'-CGT CCG AGG
GCA AAG GAA TAG CTCCAG AGATCT CAT GCT-5' (C-terminal). Das PCR-Fragment wird mit
den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI geschnitten und in die entsprechenden
Stellen in dem Aspergillus-Expressionsvektor pToC68 (wie beschrieben
in WO 91/17243) kloniert, um pJaL77 herzustellen.
-
Das
Plasmid pToC90, das den amdS-Marker enthält, wird durch Klonieren eines
2,7 kb XbaI-Fragment aus
p3SR2 (Hypes et al. Mol. Cell. Biol. 3(8): 1430–1439, 1983) in eine XbaI-Schnittstelle und
ein dephosphoryliertes pUC19-Plasmid hergestellt.
-
B
Expressionsvektor. Der Vektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids
p775 (
EP 238 023 ). Im
Gegensatz zu diesem Plasmid besitzt pHD414 eine Abfolge von einzigartigen
Restriktionsstellen zwischen dem TAKA-Promotor und dem AMG-Terminator.
Das Plasmid wird durch Entfernen eines etwa 200 bp langen Fragments
(das unerwünschte
RE-Stellen enthält)
am 3'-Ende des Terminators
und die anschließende
Entfernung eines ungefähr
250 bp langen Fragments am 5'-Ende
des Promotors, der ebenfalls unerwünschte Stellen enthält, konstruiert.
Die 200 bp-Region wird durch Spaltung mit NarI (positioniert in
dem pUC-Vektor)
und XbaI (unmittelbar 3' zu
dem Terminator), wobei die generierten Enden anschließend mit
Klenow-DNA-Polymerase + dNTP aufgefüllt werden, Reinigung des Vektorfragments
auf einem Gel und Religation des Vektorfragments entfernt. Dieses
Plasmid wird pHD413 genannt. pHD413 wird mit StuI (am 5'-Ende des Promotors
angeordnet) und PvuII (im pUC-Vektor) geschnitten, auf einem Gel
fraktioniert und religiert, was zu pHD414 führt. Ein Stamm von E. coli,
der das ungefähr
1.110 bp Xylanase-HindIII/XbaI-cDNA-Fragment in pYES enthält, wird
bei der DSM als DSM6995 hinterlegt. Das Xylanase-cDNA-Fragment wird aus
einem der Klone durch Spaltung mit HindIII/XbaI isoliert. Das Fragment
wird über
Agarosegelelektrophorese gereinigt, elektroeluiert und für Ligationsreaktionen
präpariert.
Das cDNA-Fragment wird in pHD414 ligiert, um pAXX40-1-1 herzustellen,
welches als NRRL B-21164 hinterlegt wird. Das Xylanasegen wird als
DSM (Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
6995 hinterlegt.
-
III. Transformation von thermophilen Wirten
-
Die
folgenden allgemeinen Verfahrensweisen werden bei der Transformation
von sämtlichen
getesteten Stämmen
verwendet, wobei Ausnahmen ausführlich
aufgeführt
sind:
100 ml von MY51-Medium (Maltodextrin, 30 g/l; MgSO4·7H2O, 2 g/l; K2PO4, 10 g/l; KH2SO4, 2 g/l; Citronensäure, 2 g/l; Hefeextrakt, 10
g/l; AMG-Spurenmetall, 0,5 ml; Harnstoff 1 g/l; (NH2)SO4, 2 g/l, pH 6,0) wird mit Mycelpfropfen
(2 cm Durchmesser) des zu transformierenden Stamms geimpft und unter
Schütteln
bei 42°C
14 h inkubiert. Das Mycel wird durch Filtration über Miracloth geerntet und
mit 200 ml 0,6 M MgSO4 gewaschen. Das Mycel
wird in 15 ml 1,2 M MgSO4, 10 mM NaH2PO4, pH = 5,8, suspendiert.
Die Suspension wird auf Eis gekühlt
und 1 ml Puffer, enthaltend 120 mg Novozyme® 234,
wird zugesetzt. Nach 5 min wird 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma Typ H25)
zugesetzt und die Inkubation mit sanftem Rühren 1–3 h je nach Stamm bei 30°C fortgesetzt,
bis eine große
Anzahl von Protoplasten in einer Probe, die unter dem Mikroskop
betrachtet wird, sichtbar ist. Für
Acremonium und Thielavia ist die Protoplasten-Ausbeute relativ gering,
und diese Stämme
erfordern eine längere
Inkubationszeit (2–3
h), bis genügend
Protoplasten zur Transformation erhalten werden.
-
Die
Suspension wird über
Miracloth filtriert, das Filtrat wird in ein Sterilröhrchen übergeführt und
mit 5 ml 0,5 M Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0, überschichtet.
Die Zentrifugation wird 15 min bei 2.500 U/min durchgeführt, und
die Protoplasten werden von der Oberfläche des MgSO4-Kissens
gesammelt. 2 Volumina STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5,
10 mM CaCl2) werden der Protoplastensuspension
zugesetzt, und das Gemisch wird 5 min bei 2.500 U/min zentrifugiert.
Das Protoplastenpellet wird in 3 ml STC resuspendiert und repelletisiert.
Dies wird wiederholt, und anschließend werden die Protoplasten
in 0,2–1
ml STC resuspendiert.
-
100 μl Protoplastensuspension
werden mit 5–25 μg der entsprechenden
DNA in 10 l STC vermischt. Jeder Stamm wird mit pAXX40-1-1 und mit
einem Plasmid, das einen selektierbaren Marker enthält, cotransformiert.
Plasmid pToC90 enthält
das A. nidulans-amdS-Gen
und wird zur Transformation und Selektion für das Wachstum auf Acetamid
als einziger Stickstoffquelle verwendet. Plasmid pJaL77 wird zur
Transformation und Selektion von Resistenz gegenüber Hygromycin B (150 μg/ml) verwendet.
-
Die
Gemische werden 25 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. 0,2 ml
von 60% PEG 4.000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 und
10 mM Tris-HCl pH = 7,5 werden zugesetzt und sorgfältig zweimal
vermischt, und schließlich
werden 0,85 ml der gleichen Lösung
zugesetzt und sorgfältig
vermischt. Das Gemisch wird 25 min bei Raumtemperatur stehen gelassen,
15 min bei 2.500 × g
zentrifugiert, und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert.
Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf den
entsprechenden Platten ausgestrichen. Die Protoplasten werden auf
Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113: 51–56, 1966) ausgestrichen,
die 1,0 M Saccharose, pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle
(wenn amdS der Selektionsmarker ist) und 20 mM CsCl zur Hemmung
des Hintergrundwachstums enthalten. Das Medium unterscheidet sich,
wenn hygB der Selektionsmarker ist, indem 10 mM Natriumnitrat als
Stickstoffquelle in Gegenwart von 150 μg/ml Hygromycin B verwendet
werden. Die Selektionsplatten werden 5 Tage bei 42°C inkubiert. Sämtliche
Transformanten, die auf dem COVE-Selektionsmedium wachsen, werden
auf COVE II-Platten (COVE-Medium ohne Calciumchlorid und mit einer
Saccharosekonzentration von 30 g/l) überführt, die AZCL-Xylan (0,2%)
und das jeweilige Selektionsmittel enthalten. Cotransformanten werden
durch die schnelle Bildung eines blauen Halo in und um die Pilzkolonie
identifiziert. Die Ergebnisse der Transformationsexperimente und die
Anzahl identifizierter Cotransformanten sind in Tabelle 3 angegeben.
-
Tabelle
3. Ergebnisse der Transformation von Thermophilen
-
Die
Hygromycin-Selektion ist in keinem der thermophilen Pilze, die untersucht
wurden, erfolgreich, vermutlich, weil der Promotor in diesen Stämmen nicht
wirksam ist. Mit der amdS-Selektion werden allerdings Transformanten
in sämtlichen
Stämmen
außer
Thermoascus erhalten. Die Cotransformationshäufigkeit liegt zwischen 20–40%.
-
D.
Bewertung von Xylanase-Expression in Transformanten. Sämtliche
Cotransformanten, die durch Xylanase-Plattenassays identifiziert
wurden, werden einer Schüttelkolbenbewertung
auf die Xylanase-Produktivität
unterzogen. M401-Medium der folgenden Zusammensetzung (g/l) wird
verwendet: Maltodextrin, 50,0; MgSO4·7H2O, 2,0; KH2PO4, 2,0; Citronensäure, 4,0; Hefeextrakt, 8,0;
AMG-Spurenmetall-Lösung,
0,5 ml; Ammoniumsulfat, 2,0; Harnstoff 1,0. Die Kulturen werden
bei 42°C
inkubiert, und die Xylanaseaktivität wird jeden Tag beginnend
nach 24 h gemessen. Die Xylanase-Aktivität in den Kulturlösungen wird
unter Verwendung von 0,2% AZCL-Xylan (Megazyme Co. Australia), suspendiert
in einem Citrat-Phosphat-Puffer,
pH 6,5, bestimmt. Das Kulturfluid wird verdünnt, in der Regel 100-fach,
und 10 μl
verdünntes
Kulturfluid werden mit 100 ml 0,2% AZCL-Xylan-Substrat vermischt.
Das Gemisch wird 30 min bei 42°C
inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird alle 5 min gut gemischt. Am
Ende der Inkubation wird das unverdaute Substrat durch Zentrifugation
bei 10.000 U/min 5 min präzipitiert.
Der blaue Farbstoff, der aus diesem Substrat freigesetzt wird, wird
durch die Extinktion bei 595 nm quantitativ bestimmt, und die Menge
an Enzymaktivität
in den Kulturlösungen
wird aus einem Standard berechnet, der mit einer Enzympräparation
mit bekannter Aktivität
hergestellt wird. Eine Endoxylanaseeinheit (EXU) wird relativ zu
einem Enzymstandard bestimmt, der unter identischen Bedingungen
hergestellt wird. Untransformierte Stämme werden ebenfalls unter
identischen Bedingungen gezüchtet
und mit den Transformanten verglichen.
-
Die
in 2 gezeigten Messwerte (auf der Grundlage des Aktivitätspeaks)
geben an, dass sämtliche untransformierten
Stämme
Xylanaseaktivität
auf sehr niedrigen Niveaus produzieren, während einige der Transformanten
eine bis zu 5- bis 10-fach höhere
Aktivität
als die untransformierten Stämme
produzieren. Die SDS-Page-Analyse des verbrauchten Kulturmediums
zeigt die Gegenwart einer 22 kD Humicola Xylanase-Protein-Bande
nur in den Transformanten, wenn auch auf sehr niedrigen Niveaus.
Dies erläutert
das Potential für
die Expression von heterologen Genen in thermophilen Pilzen. Die
Reihenfolge der Xylanase-Produktivität entspricht
der Reihenfolge Myceliophthora-Sporotrichum-Acremonium-Thielavia.
-
E. Bestätigung von Transformation und
Integration von Expressionsvektoren.
-
Um
unzweideutig die Transformation und Integration von Expressionsvektoren
zu zeigen, werden Southern Hybridisierungsanalysen unter Verwendung
von Gesamt-DNA durchgeführt,
die aus untransformierten und selektierten Transformanten aus jedem
Stamm isoliert wurde. Die zwei besten Transformanten aus jedem Stamm
werden für
Southern-Hybridisierungsanalysen
ausgewählt.
Die gesamte genomische DNA, die aus diesen Stämmen isoliert wurde, wird mit
EcoRI verdaut, die DNA-Fragmente werden auf 1% Agarosegel aufgetrennt
und geblottet. Da Thielavia und Acremonium das perfekte und imperfekte
Stadium des gleichen Stamms darstellen, wird nur DNA aus Acremonium
für die
Hybridisierungsexperimente verwendet. Zuerst wird der Blot mit dem
Aspergillus nidulans-amdS-Gen,
der zur Transformation verwendete Selektionsmarker, sondiert. Die
Ergebnisse zeigen die Gegenwart des amds-Gens nur in den Transformanten,
allerdings nicht in den untransformierten negativen Kontrollen.
Die Resondierung des gleichen Blots nach Abziehen der amdS-Sonde mit
einem 1,2 kD HindIII- und XhoI-Fragment von Humicola insolens-Xylanase-cDNA zeigt
Folgendes: Nur die Transformanten von Acremonia, jedoch nicht der
untransformierte Stamm, zeigen die Gegenwart von H. insolens-cDNA-Hybridisierungsbanden.
Nicht transformierte sowie transformierte Myceliophthora und Sporotrichum
zeigen die Gegenwart einer etwa 2 kb-Bande, die an die Sonde hybridisiert
(was möglicherweise
die Gegenwart von DNA-Sequenzen in diesen Stämmen, denen mit dem H. insolens-Xylanase-Gen
eine Homologie gemeinsam ist, anzeigt), während die Transformanten zusätzliche
hochmolekulare Banden zeigen, die an diese Sonde hybridisieren.