DE10043944A1

DE10043944A1 - Verfahren zur Herstellung lignilolytischer Enzyme mittels holzbewohnender Pilze aus der Ordnung Agaricales

Info

Publication number: DE10043944A1
Application number: DE2000143944
Authority: DE
Inventors: Joerg Nueske; Uwe Dornberger; Martin Hofrichter; Katrin Scheibner; Bjoern Bieber
Original assignee: JENABIOS GmbH; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: JENABIOS GmbH; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2020-09-02
Also published as: WO2002018551A2; WO2002018551A3; AU2002213871A1; DE10043944B4

Abstract

Es soll ein wirtschaftliches und zeiteffektives Verfahren zur Enzymgewinnung mit hoher Produktausbeute und ohne besonderen gerätetechnischen Aufwand geschaffen werden. DOLLAR A Überraschend hat sich gezeigt, dass Enzyme von Pilzen aus der Ordnung Agaricales ohne Fixierung auf einen Träger in an sich bekannten Produktionsgefäßen, wie beispielsweise Rührkesselreaktor etc., gewonnen werden können, ohne bei der Enzymbildung in der Nährlösung die Scherkraftbelastung reduzieren zu müssen. DOLLAR A Die Enzymgewinnung ist besonders effektiv in einem zyklischen oder kontinuierlichen Prozess durchführbar. DOLLAR A Herstellung ligninolytischer Enzyme, insbesondere Manganperoxidase (MnP) und Ligninperoxidase (LiP), beispielsweise zum Abbau toxischer Fremdstoffe.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ligninolytischer Enzyme mittels holzbewohnender Pilze aus der Ordnung Agaricales, wobei ein Mycel in bekannter Weise auf einer Agaroberfläche angezogen und homogenisiert (mechanisch zerkleinert) wird. Das homogenisierte Mycel wird in eine Nährlösung überführt. Die Vorkultur wird in geschüttelter oder gerührter Form inkubiert und ggf. nochmals zerkleinert. Zur Enzymgewinnung wird die Vorkultur in ein Produktionsgefäß überführt und erneut einer Nährlösung ausgesetzt. Zur Ernte werden die Enzyme im Produktionsgefäß oder nach Abzug aus diesem von der Nährlösung separiert.

Manganperoxidase (MnP) und Ligninperoxidase (LiP) sind pilzliche Enzyme, die in der Lage sind, verschiedene aromatische Verbindungen, speziell Lignin aber auch verschiedene organische Fremdstoffe, zu oxidieren. Sie benutzen Wasserstoffperoxid als Cosubstrat. Es gibt zahlreiche Versuche, ligninolytische Enzyme (Ligninperoxidase, Manganperoxi dase) im industriellen Maßstab herzustellen. Im Mittelpunkt des Interesses stehen Weißfäulepilze aus der Ordnung Aphyllophorales und das Enzym Ligninperoxidase. Bevorzugt werden Phanerochaete chrysosporium und Coriolus versicolor (Trametes versicolor) genutzt.

So konnten bereits H. Janshekar und A. Fiechter (Journal of Biotechnology, 8, 1988, 97- 112), Jäger et al. (Applied and Environmental Microbiology, 50, 1985, 1274-1278), Reid et al. (Canadian J. of Microbiology 31, 1985, 88-90), Leisola und Fiechter (FEMS Microbiol. Letters 29, 1985, 33-36) Ligninperoxidase und Rodriguez et al. (Bioprocess Engineering 20, 1999, 531-535) Manganperoxidase sowie Laccase in submerser Kultur herstellen. Diese Verfahren sind auf relativ geringe Volumina beschränkt. Fermenter volumina von 30 l und mehr können nicht erfolgreich verwendet werden. Allen bekannten Verfahren ist der Nachteil gemeinsam, dass Maßnahmen zur Scherkraftreduktion getroffen werden müssen, weil nur dann ausreichend große Ausbeuten erreicht werden können. Es sind diverse scherkraftreduzierte Kulturverfahren bekannt, die zum Ziel haben, optimal strukturierte Mycelpellets zu erzeugen und zu erhalten. Ein Zerschlagen der Pellets und die Erzeugung von Mycelflocken muss vermieden werden. So werden spezielle Rührsysteme beschrieben (DE 41 34 716 C1; Einsele, Finn, Samhaber: Mikrobiologische und biochemische Verfahrenstechnik Weinheim 1985, 150; Einsele: Chem. Ing. Tech. 45, 1973, 1368; Rehm: Chem. Ing. Techn. 42, 1970, 583). Nachteilig ist es, dass hierfür kostenintensive Spezialtechnik verwendet werden muss. Das Problem der Maßstabs vergrößerung (up-scaling) ist bisher nicht gelöst. Die Ausbeuten sind deshalb relativ gering.

Andere Autoren lösen das Scherkraftproblem, indem sie mit immobilisierten, trägerfixier ten Zellen arbeiten (Rodriguez et al.: Bioprocess Engineering 20, 1999, 531-535; US 5,153,121; US 5,972,672; EP 0 300 867; Linko: Journal of Biotechnology 8, 1988, 162-170; DE 197 41 083 A1). Nachteilig ist, dass unter diesen Bedingungen ebenfalls nur geringe Volumina erreicht werden und spezielle Fermentorentwicklungen notwendig sind. Auch die Verwendung von Standkulturen ist ein gebräuchliches Verfahren (T. Mester und J. A. Field: FEMS Microbiology Letters 155, 1997, 161-168; Mester et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 1996, 778-784; Tien und Kirk: Science 221, 1983, 661-663). Nachteilig ist hier der hohe Raum- und Zeitbedarf, da die Pilze unter diesen Bedingungen nur langsam wachsen und eine große Oberfläche benötigt wird.

Es ist prinzipiell (DE 197 41 083 A1) bekannt, dass auch Pilze aus der Ordnung Agaricales zur Herstellung ligninolytischer Enzyme Verwendung finden können. Die Pilze wachsen dazu auf einen polymeren Träger auf. Man erzielt unter diesen Bedingungen hohe Manganperoxidaseaktivitäten. Ein wesentlicher Nachteil ist es jedoch, dass wiederum lediglich relativ begrenzte Kulturvolumina verwendet werden können.

Weiterhin werden den Produktionsmedien spezielle Zusätze hinzugefügt mit dem Ziel, die Ausbeute zu erhöhen. Faison und Kirk (Appl. Environ. Microbiol. 49, 1985, 299-304) setzen dem Medium ein Detergenz, Call (DE 41 34 716 C1) Benzaldehyde oder Hefen zu. Auch ungesättigte Fettsäuren und Aminosäuren werden verwendet (FR 2,600,077).

Spezielle Zusätze zu den Medien erhöhen die Kosten und erfordern zusätzliche Maßnahmen zur Schaumbekämpfung.

Es ist ebenfalls bekannt, dass man durch Anwendung geeigneter Induktoren LiP und MnP spezifisch induzieren kann (Bonnarme und Jeffries: J. Ferment. Bioeng. 70, 1990, 158-163; Leisola et al.: J. Biotechnol. 3, 1985, 97-107).

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein wirtschaftliches und zeiteffektives Verfahren zur Enzymgewinnung mit hoher Produktausbeute und ohne besonderen gerätetechnischen Aufwand zu schaffen.

Überraschend hat sich gezeigt, dass mit Pilzen aus der Ordnung Agaricales ohne Notwendigkeit der Fixierung auf einen Träger in an sich bekannten Produktionsgefäßen, wie beispielsweise Rührkesselreaktor, Fermentor etc., ligninolytische Enzyme gewonnen werden können, ohne bei der Enzymbildung in der Nährlösung die Scherkraftbelastung reduzieren zu müssen. Damit werden für diese Pilze keine besonderen Anforderungen an die Erzeugung der Vorkultur sowie an die Form und die Funktion des Produktionsgefäßes gestellt. Während bekannte Lösungen mitunter sehr spezielle und aufwendige Konstruktionen zur Aufbewahrung, Behandlung und Umwälzung aufweisen, um schädliche Wirkungen von Scherkräften auf das enzymbildende Mycel bzw. die enzymhaltige Nährlösung zu vermeiden oder wenigstens zu verringern, können erfindungsgemäß vorhandene Produktionsgefäße verwendet werden, ohne dass deren Größe, Form und Funktion nachteilige Einflüsse auf die Konsistenz der Nährlösung und auf die Enzymbildung ausüben. Auf diese Weise werden ein vergleichsweise wesentlich größerer Durchsatz und eine effektivere Enzymbildung ermöglicht. Besonders vorteilhaft haben sich einerseits die Verwendung von Nährlösung mit Acetat, beispielsweise in Form von Natrium- und/oder Ammoniumsalz, als Kohlenstoffquelle und Puffer und andererseits die Durchführung zyklischer bzw. kontinuierlicher Enzymgewinnungsprozesse erwiesen. So gelingt es, in herkömmlichen Produktionsgefäßen Enzyme zu ernten, wobei die Produktausbeute und die Zeiteffektivität in Relation zu den eingangs beschriebenen aktuellen Veröffentlichungen um ein Mehrfaches verbessert ist.

In einer Anwendung des Verfahrens werden die Pilzstämme Nematoloma frowardii b19 (DSM 11680) und Clitocybula dusenii b11 (DSM 11679) in einem einfachen Rührkesselreaktor kultiviert. Bei einem Kulturvolumen von 301 konnten Aktivitäten von ca. 2000 U/l (MnP) erreicht werden. Die Kulturdauer betrug hierbei 5-8 Tage. Überraschender Weise konnten Kulturvolumina genutzt werden, die bis zum 30-fachen gegenüber den eingangs zitierten bekannten Verfahren betragen, obwohl auf Grund der Verwendung von Scheibenrührern die Scherkräfte relativ groß waren. In einer weiteren Anwendung wurde die Raum-Zeit-Ausbeute durch gezielten Austausch des Produktionsmediums noch wesentlich erhöht. Darüber hinaus konnte die Produktionszeit auf 24-36 Stunden verkürzt werden. Die Ernte ist bei Verwendung von Na-Acetat zur Verfahrenssteuerung vorteilhaft über den pH-Wert kontrollierbar. In den bekannten Verfahren werden mindestens 48 Stunden benötigt. Durch bis zu zehnfachem Medien wechsel kann die Pilzkultur ebenfalls überraschend mehrere Wochen im produktiven Zustand gehalten werden und so mit einer Kultur bis zum zehnfachen des üblichen Fermentorvolumens als aktives enzymhaltiges Kulturfiltrat gewonnen werden.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Es zeigen:

Fig. 1 MnP-Bildung mit Nematoloma frowardii b19 (DSM 11680) im 30 l Rührkessel reaktor

Fig. 2 MnP-Bildung mit Nematoloma frowardii b19 (DSM 11680) im 5 l Rührkessel reaktor mit zyklischem Medienwechsel

Fig. 3 MnP-Bildung mit Clitocybula dusenii b11 (DSM 11679) 5 l Rührkesselreaktor mit zyklischem Medienwechsel

Ausführungsbeispiel 1

Als Stamm wird Nematoloma frowardii b19 (DSM 11680) verwendet. Zunächst werden Agarplatten beimpft und ca. zehn Tage bei 24°C bebrütet. Vier Platten werden mit einem Ultra-Turrax (IKA) in 200 ml Medium homogenisiert. Mit jeweils 20 ml dieses Homoge nisates werden drei 500 ml Erlenmeyerkolben, die je 200 ml Medium enthalten, beimpft. Diese Vorkultur wird zum Beimpfen eines 5 l Fermenters (B. Braun Biostat B) mit Scheibenrührer verwendet (Kulturdauer acht Tage). Nach vier- bis sechstägiger Inkubation (24°C) wird diese Kultur zum Beimpfen eines 30 l Fermentors (B. Braun Biostat P30) mit Scheibenrührer (300 RPM) verwendet. Die Kultur wird mit 0,75 m³/h belüftet. Fig. 1 zeigt das Wachstum und die MnP-Bildung unter den genannten Bedingungen.

Die Enzymausbeute betrug 1810 U/l bzw. 54.300 U Gesamtaktivität bzw. 258 U/l × Tag. Die MnP-Aktivität wird auf folgende Weise bestimmt: Die Aktivität wurde durch Messung der Rate bestimmt, mit der die Bildung des Mn³⁺-Malonat-Komplexes im Verlauf von einer Minute, nachdem die Reaktion durch Zugabe von H₂O₂ gestartet wurde, erfolgt (Wariishi et al. J. Biol. Chem. 267 (33), 1992, 23688-95).

Ausführungsbeispiel 2

Die Vorkulturen werden wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben durchgeführt. Nach Erreichen eines pH-Wertes von 5,1-5,6 im 5 l Fermentor werden Rührung und Belüftung abgestellt (ca. 30 min.). Nach dieser Zeit hat sich die pilzliche Biomasse am Fermentor boden abgesetzt. Das überstehende enzymhaltige Medium wird in geeigneter Weise abgelassen und das Enzym gewonnen. Es wird neues, steriles Medium aufgefüllt. Nach 2-3 Tagen bzw. erreichen eines pH-Wertes von 5,1-5,3 wird erneut geerntet. Auf diese Weise wird (solange es notwendig ist, bzw. bis das Mycel an Aktivität verliert) weiter verfahren. Je Zyklus können maximal 4,5 l enzymhaltige Kulturlösung mit einer durchschnittlichen Aktivität von 630 U/l erhalten werden. Das entspricht einer Gesamtaktivität von 19.840 U bzw. 248 U/l × Tag. Fig. 2 zeigt die Verläufe des pH-Wertes und der Enzymbildung (MnP) unter diesen Bedingungen.

Ausführungsbeispiel 3

Als Produktionsstamm wird Clitocybula dusenii b11 (DSM 11679) verwendet. Die Vorkultivierung erfolgt mit Ausnahme des verwendeten Pilzstammes wiederum entsprechend Ausführungsbeispiel 1. Es wird weiter wie im Ausführungsbeispiel 2 verfahren. Der Medienwechsel erfolgt bei pH-Werten zwischen 5,3 und 5,6. Im Verlauf von sechs Zyklen wird eine durchschnittliche Aktivität von 873,5 U/l erreicht. Das entspricht einer Gesamtaktivität von 23.584 U bzw. 332 U/l × Tag. Fig. 3 zeigt die Verläufe des pH-Wertes und der Enzymbildung unter diesen Bedingungen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung ligninolytischer Enzyme mittels holzbewohnender Pilze aus der Ordnung Agaricales, bei dem zur Erzeugung einer Vorkultur ein Mycel auf einer Agaroberfläche angezogen, mechanisch zerkleinert sowie in eine Nährlösung überführt und die Vorkultur anschließend inkubiert wird, bei dem die inkubierte Vorkultur ggf. homo genisiert, zur Enzymgewinnung in ein Produktionsgefäß überführt und erneut einer Nährlösung ausgesetzt wird und bei dem das Enzym durch Separierung aus der Nährlösung geerntet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym von dem Pilz aus der Ordnung Agaricales ohne Fixierung auf einem Träger in einem an sich bekannten Produktionsgefäß ohne Reduzierung der Scherkrafibelastung in der Nährlösung erzeugt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die inkubierte Vorkultur zur Enzymgewinnung in einen an sich bekannten Rührkesselreaktor überführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die inkubierte Vorkultur zur Enzymgewinnung in einen an sich bekannten Fermentor überführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die inkubierte Vorkultur zur Enzymgewinnung einer Nährlösung mit Acetat, beispielsweise als Natrium- und/oder Ammoniumsalz, als Kohlenstoffquelle und Puffer ausgesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung außer Acetat noch Glucose enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz für eine erneute Enzymgewinnung im Produktionsgefäß wiederverwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz im Produktionsgefäß von der Nährlösung separiert wird und zu seiner Wiederverwendung in diesem verbleibt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz nach Abzug aus dem Produktionsgefäß von der Nährlösung separiert und zu seiner Wiederverwendung in dieses rückgeführt wird.

9. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in Abhängigkeit des pH-Wertes der Nährlösung, vorzugsweise bei Erreichen eines pH-Wertes im Bereich zwischen 5,1 bis 5,6, geerntet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass für einen zyklischen Enzymgewinnungsprozess die enzymhaltige Nährlösung jeweils in Zeitabständen von vorzugsweise zwei bis drei Tagen aus dem Produktionsgefäß abgezogen und durch neue Nährlösung ersetzt wird.

11. Verfahren nach Ansprüchen 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymhaltige Nährlösung mit dem Enzym in einem kontinuierlichen Prozess aus dem Produktionsgefäß abgezogen und jeweils gleichzeitig durch neue Nährlösung ersetzt wird.