WO2002018551A2 - Verfahren zur herstellung ligninolytischer enzyme mittels holzbewohnender pilze aus der ordnung agaricales - Google Patents

Verfahren zur herstellung ligninolytischer enzyme mittels holzbewohnender pilze aus der ordnung agaricales Download PDF

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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to a method for producing ligninolytic enzymes using wood-dwelling fungi from the Agaricales order, a mycelium being attracted and homogenized (mechanically comminuted) on an agar surface in a known manner.
  • the homogenized mycelium is overfilled in a nutrient solution.
  • the preculture is incubated in shaken or stirred form and comminuted again if necessary.
  • the enzyme is transferred to a production vessel and again exposed to a nutrient solution.
  • the enzymes are separated from the nutrient solution in the production vessel or after deduction from it.
  • Manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) are fungal enzymes found in the
  • ligninolytic enzymes lignin peroxidase, manganese peroxides
  • the focus of interest is on white rot fungi from the order Aphyllophorales and the enzyme lignin peroxidase.
  • Phanerochaete chrysosporium and Coriolus versicolor are preferably used.
  • H. Janshekar and A. Fiechter Journal of Biotechnology, 8, 1988, 97-112), Jäger et al. (Applied and Environmental Microbiology, 50, 1985, 1274-1278), Reid et al.
  • a disadvantage here is the high space and time required, since the mushrooms only grow slowly under these conditions and a large surface is required. It is known in principle (DE 197 41 083 AI) that fungi from the Agaricales order can also be used for the production of ligninolytic enzymes. For this purpose, the mushrooms grow on a polymeric support. High manganese peroxidase activities are achieved under these conditions.
  • a major disadvantage, however, is that only relatively limited culture volumes can be used. Furthermore, special additives are added to the production media with the aim of increasing the yield. Faison and Kirk (Appl. Environ. Microbiol.
  • the invention is therefore based on the object of creating an economical and time-effective method for enzyme production with a high product yield and without any particular technical outlay on equipment.
  • ligninolytic enzymes can be obtained with fungi from the Agaricales order without the need for fixation on a support in production vessels known per se, such as, for example, a stirred tank reactor, fermentor, etc., without reducing the shear force load during the enzyme formation in the nutrient solution have to.
  • production vessels known per se such as, for example, a stirred tank reactor, fermentor, etc.
  • these mushrooms do not have any special requirements regarding the production of the preculture or the shape and function of the production vessel.
  • the fungal strains Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) and Clitocybula dusenii bl l (DSM 11679) are cultivated in a simple stirred tank reactor. With a culture volume of 30 l, activities of approximately 2000 U / l (MnP) could be achieved. The cultivation period was 5-8 days. Surprisingly, culture volumes up to 30 times higher could be used compared to the known methods cited at the outset, although the shear forces were relatively large when using disc agitators. In another application, the space-time yield was significantly increased by specifically exchanging the production medium. In addition, the production time was reduced to 24-36 hours.
  • the harvest can advantageously be controlled via the pH value.
  • at least 48 hours are required.
  • the mushroom culture can also be kept surprisingly productive for several weeks and thus be obtained with a culture up to ten times the usual fermenter volume as an active enzyme-containing culture filtrate.
  • FIG. 1 MnP formation with Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) in a 30 1 stirred tank reactor.
  • FIG. 2 MnP formation with Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) in a 5 1 stirred tank reactor with cyclic media change.
  • FIG. 3 MnP Formation with Clitocybula dusenii bl l (DSM 11679) 5 1 stirred tank reactor with cyclic media change
  • Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) is used as the strain.
  • agar plates are inoculated and incubated at 24 ° C for about ten days.
  • Four plates are homogenized with an Ultra-Turrax (IKA) in 200 ml medium.
  • IKA Ultra-Turrax
  • 20 ml of this homogenate are inoculated with three 500 ml Erlenmeyer flasks, each containing 200 ml of medium.
  • This preculture is used to inoculate a 5 liter fermenter (B. Braun Biostat B) with a Scheiber stirrer (culture duration eight days).
  • Fig. 1 shows the growth and MnP formation under the conditions mentioned.
  • the enzyme yield was 1810 U / 1 or 54,300 U total activity or 258 U / 1 x day.
  • the MnP activity is determined in the following way: The activity was determined by measuring the rate at which the formation of the Mn + -monalonate complex takes place in the course of one minute after the reaction has been started by adding H 2 O 2 (Wariishi et al. J. Biol. Chem. 267 (33), 1992, 23688-95).
  • the precultures are carried out as described in Example 1. After a pH of 5.1-5.6 in the 5 l fermentor has been reached, stirring and aeration are switched off (approx. 30 min.). After this time, the fungal biomass settled on the bottom of the fermenter. The supernatant enzyme-containing medium is drained off in a suitable manner and the enzyme is obtained. New, sterile medium is filled up. After 2-3 days or when the pH value reaches 5.1-5.3, the crop is harvested again. In this way, the procedure is continued (as long as it is necessary or until the mycelium loses activity). A maximum of 4.5 1 enzyme-containing culture solution with an average activity of 630 U / 1 can be obtained per cycle. This corresponds to a total activity of 19,840 U or 248 U / 1 x day. Fig. 2 shows the courses of the pH and the enzyme formation (MnP) under these conditions.
  • Clitocybula dusenii bl 1 (DSM 11679) is used as the production strain. With the exception of the fungus strain used, the precultivation is again carried out in accordance with embodiment example 1. The procedure is continued as in embodiment example 2. The media change takes place at pH values between 5.3 and 5.6. An average activity of 873.5 U / 1 is achieved over six cycles. This corresponds to a total activity of 23,584 U or 332 U / 1 x day. 3 shows the courses of the pH and the enzyme formation under these conditions.

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Abstract

Es soll ein wirtschaftliches und zeiteffektives Verfahren zur Enzymgewinnung mit hoher Produktausbeute und ohne besonderen gerätetechnischen Aufwand geschaffen werden. Überraschend hat sich gezeigt, dass Enzyme von Pilzen aus der Ordnung Agaricales ohne Fixierung auf einen Träger in an sich bekannten Produktionsgefäßen, wie beispielsweise Rührkesselreaktor etc., gewonnen werden können, ohne bei der Enzymbildung in der Nährlösung die Scherkraftbelastung reduzieren zu müssen. Die Enzymgewinnung ist besonders effektiv in einem zyklischen oder kontinuierlichen Prozess durchführbar. Herstellung ligninolytischer Enzyme, insbesondere Manganperoxidase (MnP) und Ligninperoxidase (LiP), beispielsweise zum Abbau toxischer Fremdstoffe.

Description

Beschreibung der Erfindung
Verfahren zur Herstellung ligni ytischer Enzyme mittels holzbe olmender Pilze aus der Ordnung Agaricales
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ligninolytischer Enzyme mittels holzbewohnender Pilze aus der Ordnung Agaricales, wobei ein Mycel in bekannter Weise auf einer Agaroberfläche angezogen und homogenisiert (mechanisch zerkleinert) wird. Das homogenisierte Mycel wird in eine Nährlösung überfülπt. Die Vorkultur wird in geschüttelter oder gerührter Form inkubiert und ggf. nochmals zerkleinert. Zur Enzymgewinnung wird die Vorkultur in ein Produktionsgefäß überführt und erneut einer Nährlösung ausgesetzt. Zur Ernte werden die Enzyme im Produktionsgefäß oder nach Abzug aus diesem von der Nährlösung separiert. Manganperoxidase (MnP) und Ligninperoxidase (LiP) sind pilzliche Enzyme, die in der
I
Lage sind, verschiedene aromatische Verbindungen, speziell Lignin aber auch verschiedene organische Fremdstoffe, zu oxidieren. Sie benutzen Wasserstoffperoxid als
Cosubstrat.
Es gibt zahlreiche Versuche, ligninolytische Enzyme (Ligninperoxidase, Manganperoxi- dase) im industriellen Maßstab herzustellen. Im Mittelpunkt des Interesses stehen Weißfäulepilze aus der Ordnung Aphyllophorales und das Enzym Ligninperoxidase. Bevorzugt werden Phanerochaete chrysosporium und Coriolus versicolor (Trametes versicolor) genutzt. So konnten bereits H. Janshekar und A. Fiechter (Journal of Biotechnology, 8, 1988, 97- 112), Jäger et al. (Applied and Environmental Microbiology, 50, 1985,1274 -1278), Reid et al. (Canadian J.of Microbiology 31, 1985, 88-90), Leisola und Fiechter (FEMS Microbiol. Letters 29, 1985, 33-36) Ligninperoxidase und Rodriguez et al. (Bioprocess Engineering 20, 1999, 531-535) Manganperoxidase sowie Laccase in submerser Kultur herstellen. Diese Verfahren sind auf relativ geringe Volumina beschränkt. Fermenter- Volumina von 301 und mehr können nicht erfolgreich verwendet werden. Allen bekannten Verfahren ist der Nachteil gemeinsam, dass Maßnahmen zur Scherkraftreduktion getroffen werden müssen, weil nur dann ausreichend große Ausbeuten erreicht werden können. Es sind diverse scherkraftreduzierte Kulturverfahren bekannt, die zum Ziel haben, optimal strukturierte Mycelpellets zu erzeugen und zu erhalten. Ein Zerschlagen der Pellets und die Erzeugung von Mycelflocken muss vermieden werden. So werden spezielle Rührsysteme beschrieben (DE 41 34 716 Cl; Einsele, Finn, Samhaber: Mikrobiologische und biochemische Verfahrenstechnik Weinheim 1985, 150; Einsele: Chem. Ing. Tech. 45, 1973, 1368; Rehm: Chem. Ing. Techn. 42, 1970, 583). Nachteilig ist es, dass hierfür kostenintensive Spezialtechnik verwendet werden muss. Das Problem der Maßstabsvergrößerung (up-scaling) ist bisher nicht gelöst. Die Ausbeuten sind deshalb relativ gering. Andere Autoren lösen das Scherlαraftproblem, indem sie mit immobilisierten, trägerfixierten Zellen arbeiten (Rodriguez et al.: Bioprocess Engineering 20, 1999, 531-535; US 5,153,121; US 5,972,672; EP 0 300 867; Linko: Journal of Biotechnology 8, 1988, 162-170; DE 197 41 083 AI). Nachteilig ist, dass unter diesen Bedingungen ebenfalls nur geringe Volumina erreicht werden und spezielle Fermentorentwicklungen notwendig sind. Auch die Verwendung von Standkulturen ist ein gebräuchliches Verfahren (T. Mester und J. A. Field: FEMS Microbiology Letters 155, 1997, 161-168; Mester et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 1996, 778-784; Tien und Kirk: Science 221, 1983, 661-663). Nachteilig ist hier der hohe Raum- und Zeitbedarf, da die Pilze unter diesen Bedingungen nur langsam wachsen und eine große Oberfläche benötigt wird. Es ist prinzipiell (DE 197 41 083 AI) bekannt, dass auch Pilze aus der Ordnung Agaricales zur Herstellung ligninolytischer Enzyme Verwendung finden können. Die Pilze wachsen dazu auf einen polymeren Träger auf. Man erzielt unter diesen Bedingungen hohe Manganperoxidaseaktivitäten. Ein wesentlicher Nachteil ist es jedoch, dass wiederum lediglich relativ begrenzte Kulturvolumina verwendet werden können. Weiterhin werden den Produktionsmedien spezielle Zusätze hinzugefügt mit dem Ziel, die Ausbeute zu erhöhen. Faison und Kirk (Appl. Environ. Microbiol. 49, 1985, 299-304) setzen dem Medium ein Detergenz , Call (DE 41 34 716 Cl) Benzaldehyde oder Hefen zu. Auch ungesättigte Fettsäuren und Aminosäuren werden verwendet (FR 2,600,077). Spezielle Zusätze zu den Medien erhöhen die Kosten und erfordern zusätzliche Maßnahmen zur Schaumbekämpfung. Es ist ebenfalls bekannt, dass man durch Anwendung geeigneter Induktoren LiP und MnP spezifisch induzieren kann (Bonnarme und Jeffries: J. Ferment. Bioeng. 70, 1990, 158-163; Leisola et al: J. Biotechnol. 3, 1985, 97-107).
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein wirtschaftliches und zeiteffektives Verfahren zur Enzymgewinnung mit hoher Produktausbeute und ohne besonderen gerätetechnischen Aufwand zu schaffen.
Überraschend hat sich gezeigt, dass mit Pilzen aus der Ordnung Agaricales ohne Notwendigkeit der Fixierung auf einen Träger in an sich bekannten Produktionsgefäßen, wie beispielsweise Rührkesselreaktor, Fermentor etc., ligninolytische Enzyme gewonnen werden können, ohne bei der Enzymbildung in der Nährlösung die Scherkraftbelastung reduzieren zu müssen. Damit werden für diese Pilze keine besonderen Anforderungen an die Erzeugung der Vorkultur sowie an die Form und die Funktion des Produktionsgefäßes gestellt. Während bekannte Lösungen mitunter sehr spezielle und aufwendige Konstruktionen zur Aufbewahrung, Behandlung und Umwälzung aufweisen, um schädliche Wirkungen von Scherkräften auf das enzymbildende Mycel bzw. die enzymhaltige Nährlösung zu vermeiden oder wenigstens zu verringern, können erfindungsgemäß vorhandene Produktionsgefäße verwendet werden, ohne dass deren Größe, Form und Funktion nachteilige Einflüsse auf die Konsistenz der Nährlösung und auf die Enzymbildung ausüben. Auf diese Weise werden ein vergleichsweise wesentlich größerer Durchsatz und eine effektivere Enzymbildung ermöglicht. Besonders vorteilhaft haben sich einerseits die Verwendung von Nährlösung mit Acetat, beispielsweise in Form von Natrium- und/oder Ammoniumsalz, als Kohlenstoffquelle und Puffer und andererseits die Durchführung zyklischer bzw. kontinuierlicher Enzymgewinnungsprozesse erwiesen. So gelingt es, in herkömmlichen Produktionsgefäßen Enzyme zu ernten, wobei die Produktausbeute und die Zeiteffektivität in Relation zu den eingangs beschriebenen aktuellen Veröffentlichungen um ein Mehrfaches verbessert ist.
In einer Anwendung des Verfahrens werden die Pilzstämme Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) und Clitocybula dusenii bl l (DSM 11679) in einem einfachen Rührkesselreaktor kultiviert. Bei einem Kulturvolumen von 30 1 konnten Aktivitäten von ca. 2000 U/1 (MnP) erreicht werden. Die Kulturdauer betrug hierbei 5-8 Tage. Überraschender Weise konnten Kulturvolumina genutzt werden, die bis zum 30-fachen gegenüber den eingangs zitierten bekannten Verfahren betragen, obwohl auf Grand der Verwendung von Scheibenrührern die Scherkräfte relativ groß waren. In einer weiteren Anwendung wurde die Raum-Zeit-Ausbeute durch gezielten Austausch des Produktions- mediums noch wesentlich erhöht. Darüber hinaus konnte die Produktionszeit auf 24-36 Stunden verkürzt werden. Die Ernte ist bei Verwendung von Na-Acetat zur Verfahrenssteuerung vorteilhaft über den pH-Wert kontrollierbar. In den bekannten Verfahren werden mindestens 48 Stunden benötigt. Durch bis zu zehnfachem Medienwechsel kann die Pilzkultur ebenfalls überraschend mehrere Wochen im produktiven Zustand gehalten werden und so mit einer Kultur bis zum zehnfachen des üblichen Fermentorvolumens als aktives enzymhaltiges Kulturfiltrat gewonnen werden.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen: Fig. 1 : MnP-Bildung mit Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) im 30 1 Rührkesselreaktor Fig. 2: MnP-Bildung mit Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) im 5 1 Rührkesselreaktor mit zyklischem Medienwechsel Fig. 3: MnP-Bildung mit Clitocybula dusenii bl l (DSM 11679) 5 1 Rührkesselreaktor mit zyklischem Medienwechsel
Ausführungsbeispiel 1:
Als Stamm wird Nematoloma frowardii bl9 (DSM 11680) verwendet. Zunächst werden Agarplatten beimpft und ca. zehn Tage bei 24 °C bebrütet. Vier Platten werden mit einem Ultra-Turrax (IKA) in 200 ml Medium homogenisiert. Mit jeweils 20 ml dieses Homoge- nisates werden drei 500 ml Erlenmeyerkolben, die je 200 ml Medium enthalten, beimpft. Diese Vorkultur wird zum Beimpfen eines 5 1 Fermenters (B. Braun Biostat B) mit Scheiberirührer verwendet (Kulturdauer acht Tage). Nach vier- bis sechstägiger Inkubation (24 °C) wird diese Kultur zum Beimpfen eines 30 1 Fermentors (B. Braun Biostat P30) mit Scheibenrührer (300 RPM) verwendet. Die Kultur wird mit 0,75 m3/h belüftet. Fig. 1 zeigt das Wachstum und die MnP-Bildung unter den genannten Bedingungen. Die Enzymausbeute betrug 1810 U/1 bzw. 54.300 U Gesamtaktivität bzw. 258 U/1 x Tag. Die MnP -Aktivität wird auf folgende Weise bestimmt: Die Aktivität wurde durch Messung der Rate bestimmt, mit der die Bildung des Mn +-Malonat-Komplexes im Verlauf von einer Minute, nachdem die Reaktion durch Zugabe von H2O2 gestartet wurde, erfolgt (Wariishi et al. J. Biol. Chem. 267 (33), 1992, 23688-95).
Ausführungsbeispiel 2:
Die Vorkulturen werden wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben durchgeführt. Nach Erreichen eines pH-Wertes von 5,1-5,6 im 5 1 Fermentor werden Rührung und Belüftung abgestellt (ca. 30 min.). Nach dieser Zeit hat sich die pilzliche Biomasse am Fermentorboden abgesetzt. Das überstehende enzymhaltige Medium wird in geeigneter Weise abgelassen und das Enzym gewonnen. Es wird neues, steriles Medium aufgefüllt. Nach 2-3 Tagen bzw. erreichen eines pH- Wertes von 5,1-5,3 wird erneut geerntet. Auf diese Weise wird (solange es notwendig ist, bzw. bis das Mycel an Aktivität verliert) weiter verfahren. Je Zyklus können maximal 4,5 1 enzymhaltige Kulturlösung mit einer durchschnittlichen Aktivität von 630 U/1 erhalten werden. Das entspricht einer Gesamtaktivität von 19.840 U bzw. 248 U/1 x Tag. Fig. 2 zeigt die Verläufe des pH- Wertes und der Enzymbildung (MnP) unter diesen Bedingungen.
Ausführungsbeispiel 3 :
Als Produktionsstamm wird Clitocybula dusenii bl 1 (DSM 11679) verwendet. Die Vorkultivierung erfolgt mit Ausnahme des verwendeten Pilzstammes wiederum entsprechend Ausführangsbeispiel 1. Es wird weiter wie im Ausführangsbeispiel 2 verfahren. Der Medienwechsel erfolgt bei pH-Werten zwischen 5,3 und 5,6. Im Verlauf von sechs Zyklen wird eine durchschnittliche Aktivität von 873,5 U/1 erreicht. Das entspricht einer Gesamtaktivität von 23.584 U bzw. 332 U/1 x Tag. Fig. 3 zeigt die Verläufe des pH-Wertes und der Enzymbildung unter diesen Bedingungen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung ligninolytischer Enzyme mittels holzbewohnender Pilze aus der Ordnung Agaricales, bei dem zur Erzeugung einer Vorkultur ein Mycel auf einer Agaroberfläche angezogen, mechanisch zerkleinert sowie in eine Nährlösung überführt und die Vorkultur anschließend inkubiert wird, bei dem die inkubierte Vorkultur ggf. homogenisiert, zur Enzymgewinnung in ein Produktionsgefäß überführt und erneut einer Nährlösung ausgesetzt wird und bei dem das Enzym durch Separierang aus der Nährlösung geerntet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym von dem Pilz aus der Ordnung Agaricales ohne Fixierung auf einem Träger in einem an sich bekannten Produktionsgefäß ohne Reduzierung der Scherkraftbelastung in der Nährlösung erzeugt wird.
2. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass die inkubierte Vorkultur zur Enzymgewinnung in einen an sich bekannten Rührkesselreaktor überführt wird.
3. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass die inkubierte Vorkultur zur Enzymgewinnuiig in einen an sich bekannten Fermentor überführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die inkubierte Vorkultur zur Enzymgewinnuiig einer Näluiösung mit Acetat, beispielsweise als Natrium- und/oder
Ammoniumsalz, als Kohlenstoffquelle und Puffer ausgesetzt wird.
5. Verfahren nach Ansprach 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung außer Acetat noch Glucose enthält.
6. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz für eine erneute Enzymgewinnung im Produktionsgefäß wiederverwendet wird.
7. Verfahren nach Ansprach 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz im Produktionsgefäß von der Nährlösung separiert wird und zu seiner Wiederverwendung in diesem verbleibt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilz nach Abzug aus dem Produktionsgefäß von der Nährlösung separiert und zu seiner Wiederverwendung in dieses räckgeführt wird.
9. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in Abhängigkeit des pH- Wertes der Nährlösung, vorzugsweise bei Erreichen eines pH- Wertes im Bereich zwischen 5,1 bis 5,6, geerntet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass für einen zyklischen Enzymgewinnungsprozess die enzymhaltige Nährlösung jeweils in Zeitabständen von vorzugsweise zwei bis drei Tagen aus dem Produktionsgefäß abgezogen und durch neue Näluiösung ersetzt wird.
11. Verfahren nach Ansprüchen 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymhaltige Näluiösung mit dem Enzym in einem kontinuierlichen Prozess aus dem Produktionsgefäß abgezogen und jeweils gleichzeitig durch neue Nährlösung ersetzt wird.
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