FR2728911A1 - Procede de production de lignine-peroxydase et de manganese-peroxydase a partir d'une culture de phanerochaete chrysosporium - Google Patents

Procede de production de lignine-peroxydase et de manganese-peroxydase a partir d'une culture de phanerochaete chrysosporium Download PDF

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Abstract

L'invention est relative à de nouvelles souches de Phanerochaete chrysosporium, et à leurs utilisations pour la production de lignine-péroxydase et/ou de manganèse-péroxydase.

Description

La présente Invention est relative à un procédé de production de peroxydases à partir du champignon
Phanerochaete chrysosporium.
Phanerochaete chrysosporium est un champignon associé à la n pourriture blanche du bois ". C'est un hyménomycète, qui fait partie de l'ordre des aphylophorales et de la famille des corticaceae. I1 présente la propriété de dégrader la lignine jusqu'à minéralisation (produits finaux : CO2 + H20) -
Ce champignon produit des peroxydases exocellulaires : il s'agit en particulier des isozymes de la manganèse-peroxydase (MnPs) [KUWAHARA et al. FEBS Let., 169, p. 247-250, (1984)], et de celles de la lignineperoxydase (LiPs) [TIEN M. et KIRK. T.K., Science, 221, p. 661-663, (1983); GLENN et al. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 114, p. 1077-1083]. Ces enzymes sont des hémoprotéines glycosylées, dont la masse moléculaire moyenne est de 40 KDa [LEISOLA et al., J. Biol. Chem., 262 p. 419-424, (1984)].
Les manganèse-peroxydases et lignineperoxydases sont capables de catalyser l'oxydation de nombreux substrats aromatiques, en particulier la lignine, en utilisant l'eau oxygénée comme cosubstrat. Ces propriétés trouvent leurs applications principales dans le domaine de la papeterie et celui du traitement des déchets.
Jusqu'à présent, ce sont essentiellement les lignine-peroxydases qui ont été utilisées dans ce type d' applications.
Par exemple, le Brevet Français 2 574 427 décrit deux souches de Phanerochaete chrysosporium, possédant une activité lignine-peroxydase particulièrement élevée, et leur culture sur un milieu contenant une source d'azote assimilable, ainsi qu'une source de carbone assimilable, et une source de sels minéraux assimilables.
Il a également été proposé (Brevet Français 2 600 077) de cultiver Phanerochaete chrysosporium sur un milieu de culture de base supplémenté avec des acides gras insaturés, et/ou des acides aminés naturels.
D'autres équipes ont proposé l'addition de détergent du type TWEEN [FAISON et KIRK , Appl. Environ.
Microbiol.(1985),49, p.299-304], ou bien celle d'alcool vératrylique [LEISOLA et al., J.Biotechnol.(1985),3, p.97-107], afin d'augmenter la synthèse de la lignineperoxydase.
L'équipe des Inventeurs a également, lors de travaux précédents, mis en évidence différents paramètres dont l'optimisation permettait d'augmenter la production de lignine-peroxydase ajout d'acide oléique et/ou de phospholipides exogènes, contrôle de la température de culture, etc.. Ces travaux ont abouti à la mise au point d'un procédé de production de lignine-peroxydase, qui fait l'objet du Brevet Européen 0 437 500.
Ce procédé comprend plusieurs étapes successives, chacune d'entre elles étant effectuée dans des conditions de culture différentes ; la première étape est effectuée sur milieu synthétique, comprenant des sels minéraux, une source de carbone et une source d'azote, en présence d'extrait de levure, d'une source de phospholipides, et d'acides gras émulsifiés ; le mycélium formé est alors cultivé dans un milieu de culture partiellement renouvelé, additionné d'alcool vératrylique, mais ne comprenant pas d' acides gras émulsifiés, et dont la teneur en phospholipides ne représente que 1/7 à 1/8 de celle du milieu de culture utilisé dans la première étape ; lors d'une troisième étape, le milieu est entièrement remplacé par un milieu neuf, comprenant la même proportion de phospholipides et d'alcool vératrylique que celui de la deuxième étape, et la source de carbone, la source d'azote, et l'extrait de levure, au 1/4 de leur teneur dans le milieu de la première étape ; une quatrième étape de culture est enfin effectuée dans un milieu dépourvu d'extrait de levure, de source de carbone, et d'acides gras émulsifiés, mais comprenant la même proportion de phospholipides et d'alcool vératrylique que celui des étapes précédentes.
La lignine-peroxydase peut ensuite être récupérée à partir du milieu de culture. La mise en oeuvre de ce procédé permet d'accroître très significativement la teneur en enzyme ; l'activité lignine-peroxydase dans le milieu est d'environ 240 U par litre et par jour.
Les recherches effectuées jusqu'à présent ont principalement porté sur l'accroissement de l'activité lignine-peroxydase ; cependant, les manganèse-peroxydases apparaissent de plus en plus comme susceptibles de jouer un rôle clef dans la biotransformation de composés aromatiques polymériques de type lignine. En effet, contrairement aux lignine-peroxydases dont l'activité est limitée par la faible pénétration des parois lignifiées par l'enzyme, les manganèse-peroxydases agissent par l'intermédiaire d'espèces de faible poids moléculaire, diffusant aisément. En bref, le cycle catalytique des manganèse-peroxydases fait intervenir l'oxydation du
Mn(II) en Mn(III) qui, après complexation à des acides organiques, génère des espèces oxydantes diffusantes capables de dépolymériser la lignine naturelle [WARIISHI
K., et al., Biochem. Biophys.Res. Comm. 176, p. 269-276, (1991)].
BONNARME et JEFFRIES [J. Ferment. Bioeng.
70:158-163 (1990)] ont étudié la régulation dela production de lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase de Phanerochaete chrysosporum sous différentes conditions de culture ; ils ont ainsi observé que la quantité de ces enzymes variait, en particulier, en fonction de la concentration en Mn(II) à faible concentration, la lignine-peroxydase est préférentiellement produite (760 nmol/ml.min dans les conditions optimales), tandis qu'à concentration élevée c ' est la production de manganèseperoxydase (950 nmol/ml.min dans les conditions optimales) qui est privilégiée.
Les Inventeurs se sont fixé pour but l'augmentation de la production de peroxydases exocellulaires de Phanerochaete chrysosporium à partir de cultures de ce champignon, ainsi que l'augmentation du rapport MnP/LiP.
Dans ce but, les Inventeurs sont parvenus à obtenir de nouvelles souches (dénommées ci-après MIC 390,
MIC 249, et MIC 396) hypersécrétrices des peroxydases exocellulaires lignine-peroxydase et manganèseperoxydase. Ils ont en outre mis au point des conditions de culture spécifiques, pouvant être mises en oeuvre soit avec des cellules libres, soit avec des cellules immobilisées sur support. Ceci permet d'augmenter, de manière très significative le rendement en lignineperoxydase et manganèse-peroxydase, par rapport à celui obtenu avec les cultures de l'art antérieur . par exemple, les cultures obtenues conformément à l'Invention peuvent produire environ 2 fois plus de lignine peroxydase que celles du Brevet EP 0 437 500 et 10 fois plus de manganèse-peroxydase que celles obtenues précédemment par BONNARME et JEFFRIES.
La mise en oeuvre de la présente Invention permet en outre de contrôler et de modifier, selon les besoins, le rapport manganèse-peroxydase/lignineperoxydase.
La présente Invention a pour objet les souches de Phanerochaete chrysosporium MIC 249, MIC 390, et MIC 396, qui ont été déposées le 20 décembre 1994, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 26 rue du
Docteur Roux à Paris, sous les numéros respectifs I-1511, I-1512, et I-1513.
La présente invention a également pour objet un procédé de production de lignine-peroxydase et/ou de manganèse-peroxydase à partir d'une culture de
Phanerochaete chrysosporium, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une souche de Phanerochaete chrysosporium choisie dans le groupe constitué par les souches MIC 249, MIC 390, et MIC 396 mentionnées ci-dessus.
Ces cultures sont réalisées, selon les techniques usuelles de culture de Phanerochaete chrysosporium, connues en elles-mêmes, à partir d'un inoculum constitué par des fragments mycéliens obtenus à partir d'une préculture, ou de spores (2.105 spores par ml environ).
Le milieu de culture comprend au moins une source de carbone, au moins une source d'azote, des sels minéraux, des oligo-éléments, des vitamines et il est additionné d'extrait de levure.
La concentration en source de carbone est de préférence comprise entre 5 et 20 g/l.
Une source de carbone préférentiellement utilisée comprend du glycérol, mais d'autres sources de carbone assimilables plus lentement ou plus rapidement, sont utilisables, seules ou en mélange ; il s'agit par exemple de sources de carbone telles que le maltose, le raffinose, l'amidon, le xylose, le rhamnose, l'arabinose, le fructose, le sorbitol, le mannose, le cellobiose, la cellulose.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, la source de carbone comprend au moins un phospholipide choisi dans le groupe constitué par la phosphatidylcholine (PC), la lysophosphatidylcholine (LPC), la phosphatidyléthanolamine (PE), lacylphosphatidyléthanolamine (APE), le phosphatidylinositol (PI), l'acide phosphatidique (AP), ou un mélange desdits phospholipides ; il peut s'agir dans ce cas d'un mélange de phospholipides reconstitué, ou bien d'un mélange de phospholipides provenant d'une source naturelle, par exemple des phospholipides de soja. Avantageusement, si l'on utilise un mélange de phospholipides, celui-ci comprend plus de 25% de phosphatidyl-inositol et moins de 15% de PC.
De préférence, la concentration du phospholipide ou du mélange de phospholipides (reconstitués, ou issus du soja) est comprise entre 0,1 et 10 g/litre.
La source d'azote peut être par exemple constituée d'acides aminés, de nitrate de sodium ou d'un mélange de ces différentes sources d'azote, en combinaison avec l'extrait de levure. La concentration en source d'azote est de préférence comprise entre 0,5 et 20 g/l.
Les sels minéraux assimilables comprennent les sels de potassium, de calcium et de magnésium, et sont utilisés à une concentration comprise entre 0,5 et 100 mM.
Les oligo-éléments sont principalement composés de sulfate de fer, de sulfate de zinc, de sulfate de manganèse, et de sulfate de cuivre. Les concentrations en sulfates de fer, de zinc, et de cuivre, sont les concentrations habituellement utilisées pour la culture de Phanerochaete chrysosporium, (cf. par exemple le
Brevet Européen 0 437 500). La concentration en Mn2+ n' a pas d'influence sur la production de manganèse-peroxydase dans les conditions de culture conformes à l'Invention, et peut varier dans une gamme relativement large ; elle est de préférence comprise entre 1 et 600 mM.
Le milieu est aussi additionné d'une source de vitamines ; on peut par exemple utiliser un mélange de vitamines dont la composition respecte celle donnée par [TATUM et al. Am. J. Bot., 37:38-46 (1950)]. Le mélange de vitamines est utilisé à une concentration comprise entre 0,001 g et 1 g par litre.
Par ailleurs, l'addition d'alcool vératrylique (0,4 mM environ) permet de maintenir la stabilité des enzymes produites.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, le milieu de culture est en outre supplémenté, en cours de culture, par ajout, à raison de 0,001 à 10 grammes par litre, d'au moins un élément activateur de la production d'enzymes et/ou protecteur de celles-ci ; cet élément activateur et/ou protecteur peut être constitué par l'un des constituants du milieu initial, ou par un mélange de plusieurs d'entre eux.
De préférence, cet élément activateur et/ou protecteur comprend de l'alcool vératrylique, qui est dans ce cas utilisé à une concentration comprise entre 0,1 et 1 gramme par litre. On peut ajouter également un supplément d'une source phospholipidique riche en phosphatidyl-inositol, qui est dans ce cas utilisée à raison de 0,1 à 3 grammes par litre.
Cet ajout peut être effectué, sous forme de solution, d'émulsion, ou de liposomes, par addition d'un mélange de surfactant (TWEEN 80 par exemple), avec des acides gras (C18:12, C18:2) et des phospholipides riches en phosphatidyl-inositol.
La supplémentation du milieu peut être effectuée de manière continue (pompe) ou discontinue.
La supplémentation en élément(s) activateur(s) et/ou protecteur(s) est effectuée lorsque la culture a atteint un stade de croissance tel que l'on se situe au début de l'expression des gènes codant pour les peroxydases (production des ARN messagers codant pour les manganèse-peroxydases et et les lignine-peroxydases. Ce stade, qui a été défini expérimentalement, est atteint après une période qui peut varier selon les souches et les conditions de culture, mais qui représente généralement environ 2 jours de culture, à une température comprise entre 28'C et 40'C.
Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention, les cultures peuvent être effectuées de manière connue en elle-même, soit avec des cellules immobilisées sur un support, soit avec des cellules libres.
Dans le cas des cellules immobilisées, cellesci sont accrochées ou adsorbées sur un ou plusieurs supports hydrophobes, hydrophiles, ou neutres, dont la surface est de préférence rugueuse, et comportant par exemple des alvéoles, des maillages (grillages ou écheveau), des creux, des trous. Ces supports, creux ou non, sont disposés de manière ordonnée ou non, fixe ou mobile dans la phase liquide constituée par le milieu nutritif approprié, et peuvent avoir des formes variées (cylindrique ou cubique, en un ou plusieurs morceaux).
Ces support s de même que le milieu pourront être remplacés et/ou renouvelés en continu ou discontinu au cours de la culture.
A titre d'exemples non limitatifs de supports non-ordonnés fixes, on citera des anneaux cylindriques
RASHIG, en grès, verre, métal, plastique ; des mousses de polyuréthanne, polyester, polyamide ; de la limaille métallique, ou plastique, des fils de plastique.
A titre d'exemples non limitatifs de supports ordonnés fixes, on citera des grilles ou maillages acier inoxydable, verre, plastique, polyuréthanne, polyester, Nylon, polyacrylate, polyamide, etc...
A titre d'exemples non limitatifs de supports mobiles dans la phase liquide, on citera des supports en polyuréthanne, polyester, polyamide, plastique extrudés.
Dans le cas des cellules libres, le mycélium se trouve sous forme de pelotes pouvant avoir un diamètre de 0,5 à 5 mm. Les bioréacteurs employés sont de type colonne à bulle ou airlift (rapport diamètre/hauteur d/h = 1/4 à 1/6 env.) ou classique (d/h = 1 à 1/2 env.), et possèdent un module d'agitation, spécifique ou non, par exemple RUSHTON, hélice de bateau, NIG, ruban hélicoïdal simple ou double.
Avantageusement, les cultures sont effectuées sous aération et agitation du milieu.
L'aération du milieu est réalisée par l'introduction d'air, d'oxygène pur ou de tout autre mélange de gaz assurant un apport en oxygène suffisant au micro-organisme, au moyen d'un dispositif permettant une dispersion homogène de ce gaz (verre fritté, canne).
L'agitation du milieu peut être effectuée mécaniquement. Elle peut aussi être obtenue de manière pneumatique par action directe du système d'aération, ou par un système équivalent utilisé simultanément.
Le niveau d'agitation et/ou d'aération est choisi de manière à permettre une occupation initiale homogène du support dans le cas des cellules immobilisées, et la formation de pelotes mycéliennes d'un diamètre moyen de 0,5 à 5 mm dans le cas de cellules libres, tout en limitant les contraintes de cisaillement subies par les hyphes mycéliens. Ce niveau pourra être variable au cours de la durée de la culture.
Avantageusement, la période d'incubation initiale (2 jours environ) se fait à une température de 37 C environ, et peut être suivie d'un changement de température favorable à la production de peroxydases, comme décrit par exemple dans le Brevet EP 0 437 500.
La production de manganèse-peroxydase et/ou celle de lignine-peroxydase, et en conséquence, le rapport MnP/LiP peuvent être contrôlés en fonction de l'âge de la culture et/ou de la présence d'activateurs, ainsi que des souches utilisées. On peut ainsi obtenir des cocktails enzymatiques majoritaires soit en manganèse-peroxydase, soit en lignine-peroxydase (activité supérieure ou égale à 60% de l'ensemble des activités manganèse-peroxydase et lignine-peroxydase).
Selon une variante du procédé conforme à l'Invention l'on peut en outre contrôler le rapport
MnP/LiP, et augmenter préférentiellement soit la production de manganèse-peroxydase, soit la production de lignine-peroxydase. Cette variante est caractérisée en ce que
- pour modifier le rapport NnP/LiP en faveur de la production de manganèse-peroxydase, l'on procède à la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 24 heures et inférieure à 90 heures, en présence d'un mélange de phospholipides riche en phosphatidyl-inositol, tel que défini ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l, de préférence de l'ordre de 1,5 g/l
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de lignine-peroxydase, l'on procède à la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en présence d'un mélange de phospholipides, tel que défini ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l.
Selon les applications, les jus de culture constituant ainsi des cocktails enzymatiques plus ou moins enrichis en manganèse-peroxydase ou en lignineperoxydase, peuvent être utilisés directement, ou après concentration, par exemple par ultrafiltration. Le cas échéant, une purification sur colonne de type MONO-Q (PHARMACLA BIOTECH S.A. ; France) est réalisée.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention.
I1 doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
I.- UTILISATION DE SOUCHES
Les souches qui ont été sélectionnées conformément à l'Invention sont les souches de
Phanerochaete chrysosporium MIC 249 (CNCM I-1511), MIC 390 (CNCM I-1512), et MIC 396 (CNCM I-1513).
tr-PLE 1 : COMPARAISON DE LA PROD(JCTIOI ni LIGNINE-
PEROXYDASES ET DE MANGANESE-PEROXYDASES PAR DIFFERENTES
SOUCHES
La capacité de production des souches hypersécrétrices conformes à l'Invention, MIC 249, MIC 390, et MIC 396, par rapport à la souche de référence
BKM-F-1767 (ATCC 24725), est vérifiée sur des cultures effectuées en Erlenmeyer de 250 ml, dans les conditions suivantes
Composition du milieu
Glycérol 10 g/l
Tartrate disodique 2,3 g/l
Tartrate de diammonium 1,842 g/l
KH2P04 2 g/l
CaC12, 2H20 0,14 g/l
MgSO4, 7H20 0,70 g/l
FeS04, 7H20 0,07 g/l
ZnS04, 7H20 0,046 g/l
MnS04, H20 0,035 g/l
CuS04, 5H20 0,007 g/l
Extrait de levure 1 g/l
Nat89 0,5 g/l
Alcool vératrylique 0,42 g/l
Conditions de culture
Le milieu est réparti en conditions stériles à raison de 100 ml par erlenmeyer , chaque erlenmeyer contient des cubes de mousse de polyuréthane.
L'inoculation est réalisée à l'aide de fragments mycéliens d'une préculture.
L'on procède à l'oxygénation des erlenmeyers au début de la culture (TO), puis à l'incubation à 37 C sous agitation, à 90 ou 120 rpm.
A A partir de 48 h de culture l'on procède à l'oxygénation quotidienne des erlenmeyers et à la poursuite de l'incubation à 37'C sous agitation à 90 ou 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèseperoxydase sont mesurées au bout de 4 jours de culture selon les protocoles suivants
- a) détermination de l'activité lignineperoxydase : cette activité est déterminée en mesurant la vitesse d'oxydation de l'alcool vératrylique en aldéhyde correspondant, en présence de peroxyde d'hydrogène [TIEN et KIRK, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 81:2280-2284 (1984)1. La réaction est suivie, à 30 C, par spectrophotométrie à 310nm. Le coefficient d'extinction molaire de l'aldéhyde vératrylique à cette longueur d'onde est de 9300 M-l cm-l.
L'activité dans le milieu est exprimée en nkatal . ml - 1 ou bien en unités/litre (U/l) . une unité lignine-peroxydase correspond à une micromole d'aldéhyde vératrylique formé par minute.
- b) détermination de l'activité manganèseperoxydase : cette activité est déterminée en mesurant la vitesse d'oxydation de la vanillylacétone en présence de
MnSO4 [PASZCZYNSKI et al. FEMS Microbiol. Lett , 29:37-41 (1985)]. La réaction est suivie, à 30'C, par spectrophotométrie à 334nm. Le coefficient d'extinction molaire de la vanillylacétone à cette longueur d'onde est de 18300 M~l.cm 1
L'activité dans le milieu est exprimée en nkatal.ml1 ou bien en unités/litre (U/1) une unité manganèse-peroxydase correspond à une micromole de vanillylacétone formée par minute.
Les résultats sont résumés dans le tableau I ci-dessous
TABLEAU I
Figure img00130001
<tb> <SEP> SOUCHES <SEP> ACTIVITE <SEP> MnP <SEP> ACTIVITE <SEP> LiP
<tb> <SEP> (U/1) <SEP> (U/1)
<tb> ATCC <SEP> 24725 <SEP> 1200 <SEP> 900
<tb> <SEP> MIC <SEP> 249 <SEP> 4800 <SEP> 4200
<tb> <SEP> MIC <SEP> 390 <SEP> 5520 <SEP> 2040
<tb> <SEP> MIC <SEP> 396 <SEP> 3500 <SEP> 3150
<tb>
Ces résultats montrent que dans ces conditions, la souche I-1511 (MIC 249) produit 4 fois plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la souche de référence BKM-F-1767 ; la souche I-1512 (MIC 390) produit environ 5 fois plus de manganèse-peroxydase et 2 fois plus de lignine-peroxydase que la souche BKM-F1767, et la souche I-1513 (MIC 396) produit 2 fois plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la souche BKM-F-1767.

II - INFLUENCE DE LA COMPOSITION DU MILIEU ET DES
CONDITIONS DE CULTURE SUR LA PRODUCTION DES LIGNINE- PZROXYDAS S LT niS MANGANESE-PEROXYDASES
EXEMPLE 2 : INFLuswCk DE Low ni LLL CULTURE.
La souche MIC 249 est mise en culture dans des conditions identiques à celles indiquées ci-dessus à l'exemple 1. L'incubation est effectuée à 37'C sous agitation à 90 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèseperoxydase sont mesurées à différents temps de culture, et le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont résumés dans le tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Figure img00140001
<tb> AGE <SEP> DE <SEP> LA <SEP> ACTIVITE <SEP> ACTIVITE <SEP> RAPPORT
<tb> CULTURE(h) <SEP> MnP <SEP> (U/1) <SEP> LiP <SEP> (U/1) <SEP> MnP/LiP
<tb> <SEP> 63 <SEP> 3270 <SEP> 1746 <SEP> 1,87
<tb> <SEP> 109,5 <SEP> 2694 <SEP> 2634 <SEP> 1,02
<tb> <SEP> 229 <SEP> 2346 <SEP> 4290 <SEP> 0,55
<tb> EtEXPLE 3 : INFLUENCE ni LA CONC-'RAT'ION E
PHOSPHOLIPIDES.
La souche MIC 390 est mise en culture dans les conditions suivantes, sur un milieu de base dont la composition est la suivante
Glycérol 10 g/l
Tartrate disodique 2,3 g/l
Tartrate de diammonium 1,842 g/l
KH2P04 2 g/l
CaC12, 2H20 0,14 g/l
MgSO4, 7H20 0,70 g/l
FeS04, 7H20 0,07 g/l
ZnS04, 7H20 0,046 g/l
MnS04, H20 0,035 g/l
CuS04, 5H20 0,007 g/l
Extrait de levure 1 g/I,
Ce milieu de base est additionné d'un mélange de phospholipides, le NAT89, à des concentrations comprises entre 0,5 g/l et 1,89 g/l.
Le NAT 89 est fourni par la Société NATTERMAN
PHOSPHOLIPID Gmbh (Cologne, Allemagne), et sa composition est la suivante
- 12% de phosphatidylcholine et de lysophosphatidylcholine
- 31 % de phosphatidyléthanolamine et acyl phosphatidyléthanolamine ;
- 27% de phosphatidylinositol ;
- 30% d'acide phosphatidique.
Les cultures sont effectuées comme décrit à l'Exemple 1. L'incubation est effectuée à 37'C sous agitation à 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèseperoxydase sont mesurées à l'optimum de production dans le milieu de culture, à savoir à 4,5 jours de culture.
Le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont indiqués dans le tableau III ci-dessous.
TABLEAU III
Figure img00150001
<tb> CONCENTRATION <SEP> ACTIVITE <SEP> ACTIVITE <SEP> RAPPORT
<tb> NAT89 <SEP> (g/l) <SEP> MnP <SEP> (U/1) <SEP> LiP <SEP> (U/1) <SEP> MnP/LiP
<tb> <SEP> 0,5 <SEP> 6564 <SEP> 1932 <SEP> 3,4
<tb> <SEP> 0,98 <SEP> 6780 <SEP> 1920 <SEP> 3,53
<tb> <SEP> 1,44 <SEP> 8664 <SEP> 1056 <SEP> 8,21
<tb> <SEP> 1,89 <SEP> 6474 <SEP> 384 <SEP> 16,86
<tb>
III - PRODUCTION EN REACTEUR DES LIGNINE-PEROXYDASES ET DES MANGANESE-PEROXYDASES Ixn1PLK 4 CULTURE DANS UN REACTEUR A CELLULES
IMMOBILISEES SUR SUPPORT
Le corps du bioréacteur contient le support d'immobilisation, qui est ici constitué par 2 cylindres concentriques réalisés en grillage métallique (fil de 0,15 mm de diamètre) ayant une maille de 0,5 mm, des diamètres respectifs de 70 mm (cylindre extérieur) et 30 mm (cylindre intérieur) pour une hauteur de 290 mm.
La composition du milieu de base est la suivante
Glycérol 12,5 g/l
Tartrate disodique 2,875 g/l
Tartrate de diammonium 2,302 g/l
KH2P04 2,5 g/l
CaC12, 2H20 0,175 g/l
MgS04, 7H20 0,875 g/l
FeS04, 7H20 0,0875 g/l
ZnS04, 7H20 0,0575 g/l
NnS04, H20 0,0437 g/l
CuS04, 5H20 0,0087 g/l
Extrait de levure 1,25 g/l
NAT89 0,625 g/l
2,5 litres de ce milieu sont introduits dans le bioréacteur et l'ensemble est stérilisé par autoclavage 30 min. à 120'C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37 c et est aéré avec de l'air atmosphérique filtré, introduit à un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circulaire ou d'un fritté formant un bullage régulier situé à la base des cylindres métalliques, assurant à la fois une agitation et une aération homogène nécessaire à la formation d'un film mycélien adéquat.
L'inoculation est réalisé à l'aide de fragments mycéliens d'une préculture.
Au bout de 48 heures de culture
A) Le milieu est supplémenté stérilement par un mélange phospholipidique (NAT89) additionné d'alcool vératrylique (AVe).
Composition du mélange
- AVe 1,25 g
- NAT89 0,30
B) Le bullage d'air est remplacé par du bullage d'oxygène pur à un débit de 20 l/h.
Les activités manganèse-peroxydase et lignineperoxydase obtenues, dans ces conditions, avec la souche
MIC 390 sont
- activité MnP maximum : 10000 U/1
- activité LiP maximum : 2400 U/l.
EXEMPLE 4 : CULTURE DU MICRO-ORGANISME DANS UN REACTEUR A CELLULES LIBRES TYPE COLONNE A BULLE
La composition du milieu de base est la suivante
Glycérol 6,8 g/l
Tartrate disodique 1,565 g/l
Tartrate de diammonium 1,252 g/l
KH2PO4 1,334 g/l
CaCl2, 2H20 0,094 g/l
MgSO4, 7H20 0,467 g/l
FeSO4, 7H20 0,0461 g/l
ZnSO4, 7H20 0,0310 g/l
MnSO4, H20 0,0232 g/l
CuS04, 5H20 0,0046 g/l
Extrait de levure 0,680 g/l
NAT89 0,5 g/l
2,5 litres de ce milieu sont introduits dans le bioréacteur et l'ensemble est stérilisé par autoclavage 30 min. à 120-C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37'C et aéré avec de l'air atmosphérique filtré introduit à un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circulaire ou d'un fritté formant un bullage régulier, assurant à la fois une agitation et une aération homogène nécessaire à la formation des pelotes mycéliennes.
L'inoculation est réalisé à l'aide de fragments mycéliens d'une préculture ou d'une solution de spores à 2 x 105 spores/ml.
Au bout de 24 h., les pelotes mycéliennes de 0,5 à 1 mm de diamètre environ sont formées et le débit d'air est réduit à 20 l/h.
Au bout de 48 h
A) Le milieu est supplémenté stérilement par un mélange phospholipidique comprenant de l'alcool vératrylique (AVe).
Composition du mélange
- Ave 1,05 g
- Source de phospholipide 0,25 g
B) Le bullage d'air est remplacé par du bullage d'oxygène pur à un débit de 20 l/h.
Les résultats obtenus dans ces conditions avec la souche MIC 390 sont
- activité MnP maximum : 3600 U/l
- activité LiP maximum : 162 U/l.

Claims (7)

REVENDICATIONS
1) Souches de Phanerochaete chrysosporium, dénommées MIC 249, MIC 390, et MIC 396, déposées le 20 décembre 1994, auprès de la CNCM sous les numéros respectifs I-1511, I-1512, et I-1513.
2) Procédé de production de lignine-peroxydase et/ou de manganèse-peroxydase à partir d'une culture de
Phanerochaete chrysosporium, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une souche de Phanerochaete chrysosporium choisie dans le groupe constitué par les souches MIC 249, MIC 390, et MIC 396 selon la revendication 1.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de culture de
Phanerochaete chrysosporium, est supplémenté, en cours de culture, par ajout d'alcool vératrylique, à une concentration comprise entre 0,1 et 1 gramme par litre, et/ou d'une source phospholipidique riche en phosphatidyl-inositol, à raison de 0,1 à 3 grammes par litre.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la supplémentation en phospholipides et/ou en alcool vératrylique est effectuée après environ 2 jours de culture à une température comprise entre 28 C et 40'C.
5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, permettant en outre l'augmentation préférentielle soit de la production de manganèseperoxydase, soit de la production de lignine peroxydase, lequel procédé est caractérisé en ce que
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de manganèse-peroxydase, l'on procède à la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 24 heures et inférieure à 90 heures, en présence d'un mélange de phospholipides, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l ; ;
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de lignine-peroxydase, l'on procède à la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en présence d'un mélange de phospholipides dont la concentration est comprise entre 0,5 et 5 g/l.
6) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on utilise une culture de cellules immobilisées sur un support.
7) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on utilise une culture de cellules libres.
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