CA2209082A1 - Procede de production de ligine-peroxydase et de manganese-peroxydase a partir d'une culture de phanerochaete chrysosporium - Google Patents
Procede de production de ligine-peroxydase et de manganese-peroxydase a partir d'une culture de phanerochaete chrysosporiumInfo
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Abstract
L'invention est relative à de nouvelles souches de Phanerochaete chrysosporium, et à leurs utilisations pour la production de lignine-péroxydase et/ou de manganèse-péroxydase.
Description
CA 02209082 1997-06-27 'WO 96/21008 P~ k~5/01746 PROCBDE DE PRODUCTION DE LIGNINE-PEROXYDASE ET DE
MANGANESE-PEROXYDASE A PARTIR D'UNE CULTURE DE
~ PEAN~3ROCHAE~I'E CH~YSOSPO~I UP~.
La présente Invention est relative à un pro-~ 5 cédé de production de peroxydases à partir du champignon Phanerochaete chrysosporium.
Phanerochaete chrysosporium est un champignonassocié à la " pourriture blanche du bois ". C'est un hym~nomycète, qui ~ait partie de 1'ordre des aphylo-phorales et de la ~amille des corticaceae. I1 présente lapropriété de dégrader la lignine jusqu'à minéralisation (produits ~inaux : CO2 + H20).
Ce champignon produit des peroxydases exo-cellulaires : il s'agit en par~iculier des iso~ymes de la manganèse-peroxydase (MnPs) [KUWAHARA et al. FEBS Let., 169, p. 247-250, (1984)], et de celles de la lignine-peroxydase (LiPs) [TIEN M. et KIRK. T.K., Science, 221, p. 661-663, (1983); GLENN et al. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 114, p. 1077-1083]. Ces enzymes sont des hé~noprotéines glycosylées, dont la masse moléculaire moyenne est de 40 kDa [LEISOLA et al., J. Biol. Chem., 262 p. 419-424, (1984)].
Les manganèse-peroxydases et lignine-peroxydases sont capables de catalyser l'oxydation de nombreux substrats aromatiques, en particulier la li-gnine, en utilisant l~eau oxygénée comme cosubstrat. Ces propriétés trouvent leurs applications principales dans le domaine de la papeterie et celui du traitement des déchets.
Jusqu'à présent, ce sont essentiellement les lignine-peroxydases qui ont été utilisées dans ce type d'applications.
Par exemple, le Bre~et Fran~ais 2 574 427 décrit deux souches de Phanerochaete chrysosporium, possédant une acti~ité lignine-peroxydase particulièrement éle~ée, et leur culture sur un milieu h~r~ 1746 contenant une source d'azote assimilable, ainsi qu'une source de carbone assimilable, et une source de sels minéraux assimilables.
Il a également été proposé (Brevet Fr~n~
MANGANESE-PEROXYDASE A PARTIR D'UNE CULTURE DE
~ PEAN~3ROCHAE~I'E CH~YSOSPO~I UP~.
La présente Invention est relative à un pro-~ 5 cédé de production de peroxydases à partir du champignon Phanerochaete chrysosporium.
Phanerochaete chrysosporium est un champignonassocié à la " pourriture blanche du bois ". C'est un hym~nomycète, qui ~ait partie de 1'ordre des aphylo-phorales et de la ~amille des corticaceae. I1 présente lapropriété de dégrader la lignine jusqu'à minéralisation (produits ~inaux : CO2 + H20).
Ce champignon produit des peroxydases exo-cellulaires : il s'agit en par~iculier des iso~ymes de la manganèse-peroxydase (MnPs) [KUWAHARA et al. FEBS Let., 169, p. 247-250, (1984)], et de celles de la lignine-peroxydase (LiPs) [TIEN M. et KIRK. T.K., Science, 221, p. 661-663, (1983); GLENN et al. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 114, p. 1077-1083]. Ces enzymes sont des hé~noprotéines glycosylées, dont la masse moléculaire moyenne est de 40 kDa [LEISOLA et al., J. Biol. Chem., 262 p. 419-424, (1984)].
Les manganèse-peroxydases et lignine-peroxydases sont capables de catalyser l'oxydation de nombreux substrats aromatiques, en particulier la li-gnine, en utilisant l~eau oxygénée comme cosubstrat. Ces propriétés trouvent leurs applications principales dans le domaine de la papeterie et celui du traitement des déchets.
Jusqu'à présent, ce sont essentiellement les lignine-peroxydases qui ont été utilisées dans ce type d'applications.
Par exemple, le Bre~et Fran~ais 2 574 427 décrit deux souches de Phanerochaete chrysosporium, possédant une acti~ité lignine-peroxydase particulièrement éle~ée, et leur culture sur un milieu h~r~ 1746 contenant une source d'azote assimilable, ainsi qu'une source de carbone assimilable, et une source de sels minéraux assimilables.
Il a également été proposé (Brevet Fr~n~
2 600 077) de cultiver Ph~nerochaete chrysosporium sur un milieu de culture de base supplémenté avec des acides gras insaturés, et/ou des acides aminés naturels.
D'autres équipes ont proposé l'addition de détergent du type 'l'W~ [FAISON et KIRK , Appl. Environ.
Microbiol.(1985),49, p.299-304~, ou bien celle d'alcool vératrylique [LEISOLA et al., J. Biotechnol.(1985),3, p.97-107], afin d'augmenter la synthèse de la lignine-peroxydase.
L'équipe des Inventeurs a également, lors de travaux précédents, mis en évidence différents paramètres dont l'optimisation permettait d'augmenter la production de lignine-peroxydase : ajout d'acide oléique et/ou de phospholipides exogènes, contrôle de la température de culture, etc... Ces travaux ont abouti à la mise au point d'un procédé de production de lignine-peroxydase, qui fait l'objet du Brevet Européen 0 437 500.
Ce procédé comprend plusieurs étapes successives, chacune d'entre elles étant effectuée dans des conditions de culture différentes ; la première étape est effectuée sur milieu synthétique, comprenant des sels minéraux, une source de carbone et une source d'azote, en présence d'extrait de levure, d'une source de phospholipides, et d'acides gras émulsifiés ; le mycélium formé est alors cultivé dans un milieu de culture partiellement renouvelé, additionné d'alcool vératrylique, mais ne comprenant pas d'acides gras émulsifiés, et dont la teneur en phospholipides ne représente que 1/7 à 1/8 de celle du milieu de culture utilisé dans la première étape ; lors d'une troisième étape, le milieu est entièrement remplacé par un milieu neuf, comprenant la même proportion de phospholipides et - ~ CA 02209082 l997-06-27 ' W O 96~1008 P~ h~SJ'0~746 d'alcool vératrylique que celui de la deuxième étape, et la source de carbone, la source d'azote, et l'extrait de levure, au 1/4 de leur teneur dans le milieu de la premiere étape ; une quatrième étape de culture est enfin ef~ectuée dans un milieu dépourvu d'extrait de levure, de source de carbone, et d'acides gras émulsifiés, mais comprenant la même proportion de phospholipides et d'alcool vératrylique que celui des étapes précédentes.
-La lignine-peroxydase peut ensuite être ré-o cupérée à partir du milieu de culture. La mise en oeuvre de ce procédé permet d'accroître très significativement la teneur en enzyme i l'activité lignine-peroxydase dans le milieu est d'environ 240 U par litre et par jour.
~es recherches effectuées jusqu'à présent ont principalement porté sur l'accroissement de l'activité
lignine-peroxydase ; cependant, les manganèse-peroxydases apparaissent de plus en plus comme suscepti~les de jouer un rôle clef dans la biotransformation de composés aro-matiques polymériques de type lignine. En effet, con-trairement aux lignine-peroxydases dont l'activité est limitée par la faible pénétration des parois lignifiées par l'enzyme, les manganèse-peroxydases agissent par 1~intermédiaire d'espèces de faible poids moléculaire, diffusant aisément. En bref, le cycle catalytique des manganèse-peroxydases ~ait intervenir l'oxydation du Mn(II) en Mn(III) qui, après complexation à des acides organiques, génère des espèces oxydantes diffusantes capables de dépolymériser la lignine naturelle [WARIISHI
K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, p. 269-276, (l991)].
BONNARMB et JEFFRIES [J. Ferment. Bioeng.
70:158-163 (1990)] ont étudié la régulation de la production de lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase de Phanerochaete chrysosporium sous différentes conditions de culture ; ils ont ainsi obser~é ~ue la quantité de ces enzymes variait, en particulier, en ' ' W O 96121008 P~ h~5~1746 fonction de la concentration en Mn(II) : à ~aible concentration, la lignine-peroxydase est pré~érentielle-ment produite (760 nmol/ml.min dans les conditions optimales), tandis qu'à concentration élevée c'est la production de manganèse-peroxydase (950 nmol/ml,min dans les conditions optimales) qui est privilégiée.
Les Inventeurs se sont ~ixé pour but 1'augmentation de la production de peroxydases exocellulaires de Phanerochaete chrysosporium à partir de cultures de ce champignon, ainsi que l'augmentation du rapport MnP/LiP.
Dans ce but, les Inventeurs sont parvenus à
obtenir de nouvelles souches (dénommées ci-après MIC 3g0, MIC 249, et MIC 396) hypersécrétrices des peroxydases exocellulaires lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase. Ils ont en outre mis au point des conditions de culture spécifiques, pouvant être mises en oeuvre soit avec des cellules libres, soit avec des cellules immobilisées sur support. Ceci permet d'augmenter, de manière très si~nificative le r~n~m~nt en lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase, par rapport à celui obtenu avec les cultures de l'art antérieur : par exemple, les cultures obtenues con~o~",P,n~,tt à l'Invention peuvent produire environ 2 ~ois plus de lignine peroxydase que celles du Brevet EP 0 437 500 et l0 fois plus de manganèse-peroxydase que celles obtenues précP~emm~nt par BONNARME et JEFFRIES.
La mise en oeuvre de la présente Invention permet en outre de contrôler et de modifier, selon les besoins, le rapport manganèse-peroxydase/lignine-peroxydase. , La présente In~ention a pour objet les souchesde Phanerochaete chrysosporium MIC 249, MIC 390, et MIC
396, qui ont été déposées le 20 décembre 1994, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) tenue par l'Institut Pasteur, 26 rue du W O 96121008 P~ h9~J'~1746 Docteur Roux à Paris, sous les numéros respectifs I-1511, I-1512, et I-1513.
~ La présente invention a également pour objet un procédé de production de lignine-peroxydase et/ou de manganèse-peroxydase à partir d'une culture de Phanerochaete chrysosporium, lequel procéde est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une souche de Phanerochaete chrysosporium choisie dans le groupe constitué par les souches MIC ~49, MIC
390, et MIC 396 mentionnées ci-dessus.
Ces cultures sont réalisées, selon les techniques usuelles de culture de Phanerochaete chrysosporium, connues en elles-mêmes, à partir d'un inoculum constitué par des fragments mycéliens obtenus à
lS partir d'une préculture, ou de spores (2.105 spores par ml environ).
Le milieu de culture comprend au moins une source de car~one, au moins une source d'azote, des sels minéraux, des oligo-éléments, des vit~m;nes et il est additionné d'extrait de levure.
La concentration en source de carbone est de préférence comprise entre 5 et 20 g/l.
Une source de carbone préférentiellement utilisée comprend du glycérol, mais d'autres sources de 2s carbone assimilables plus lentement ou plus rapidement, sont uti lisables; seules ou en mélange ; il s'agit par exemple de sources de carbone telles que le maltose, le raffinose, l'amidon, le xylose, le rhamnose, l'arabinose, le fructose, le sorbitol, le mannose, le cellobiose, la cellulose.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, la source de carbone comprend au moins un phospholipide choisi dans le groupe constitué par la phosphatidylcholine (PC), la lysophosphatidylcholine (LPC), la phospha-tidyléthanolamine (PE), l'acylphosphatidyléthanolamine '' ' W O 96/21008 P~1/~K50V1746 (APE), le phosphatidylinositol (PI), l'acide phosphati-dique (AP), ou un mélange desdits phospholipides ; il peut s'agir dans ce cas d'un mélange de phospholipides reconstitué, ou bien d'un melange de phospholipides provenant d'une source naturelle, par exemple des phospholipides de soja. A~antageusement, si l'on utilise un mélange de phospholipides, celui-ci comprend plus de 25~ de phosphatidylinositol et moins de lS~ de PC.
De préférence, la concentration du phospholipide ou du mélange de phospholipides (reconstitués, ou issus du soja) est comprise entre 0,l et lO g/litre.
La source d'azote peut être par exemple constituée d'acides aminés, de nitrate de sodium ou d'un mélange de ces différentes sources d'azote, en combinaison avec l'extrait de levure. La concentration en source d'azote est de préférence comprise entre 0,S et 20 g/l .
Les sels minéraux assimilables comprennent les sels de potassium, de calcium et de magnésium, et sont utilisés à une concentration comprise entre 0,5 et lO0 mM.
Les oligo-éléments sont principalement com-posés de sul~ate de fer, de sul~ate de zinc, de sul~ate de manganèse, et de sul~ate de cuivre. Les concentrations en sul~ates de fer, de zinc, et de cuivre, sont les concentrations habituellement utilisées pour la culture de Phanerochaete chrysosporium, (cf. par exemple le Brevet Européen 0 437 500). La concentration en Mn2+ n'a a pas d'in~luence sur la production de manganèse-peroxydase dans les conditions de culture conformes à
l'Invention, et peut varier dans une gamme relativement large ; elle est de pré~érence comprise entre l et 600 mM .
Le milieu est aussi additionné d'une source de vit.~m; nes ; on peut par exemple utiliser un mélange de , wo s6nl00s ~ J~l746 vit~m;nPs dont la composition respecte celle donnée par [TATUM et al. Am. J. Bot., 37:38-46 (1950)]. Le mélange de vit~m~n~s est utilisé à une concentration comprise entre 0,001 g et 1 g par litre.
Par ailleurs, l'addition d'alcool vératrylique (0,4 mM environ) permet de maintenir la stabilité des enzymes produites.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, le milieu de culture est en outre supplémenté, en cours de culture, par ajout, à raison de 0,001 à 10 grammes par litre, d'au moins un élément activateur de la production d'enzymes et/ou protecteur de celles-ci ; cet élément activateur et/ou protecteur peut être constitué par l'un des constituants du milieu initial, ou par un mélange de plusieurs d'entre eux.
De préférence, cet élément activateur et~ou protecteur comprend de l'alcool vératrylique, qui est dans ce cas utilise à une concentration comprise entre 0,1 et 1 ~ u..e par litre. On peut ajouter également un supplement d'une source phospholipidique riche en phosphatidylinositol, qui est dans ce cas utilisee à
raison de 0,1 à 3 yrdl~LLes par litre.
Cet ajout peut être ef~ectue, sous ~orme de solution, d~emulsion, ou de liposomes, par addition d'un melange de surfactant (TWEEN 80 par exemple), avec des acides gras (C18:12, C18:2) et des phospholipides riches en phosphatidylinositol.
La supplémentation du milieu peut être e~fectuee de manière continue (pompe) ou discontinue.
La supplémentation en élément(s) activateur(s) et/ou protecteur(s) est e~ectuee lorsque la culture a atteint un stade de croissance tel que l'on se situe au début de l'expression des gènes codant pour les peroxydases (production des ARN messagers codant pour les manganèse-peroxydases et les lignine-peroxydases. Ce stade, qui a été défini expérimentalement, est atteint W O 96/210~8 PcTAFR9slol746 après une période qui peut varier selon les souches et les conditions de culture, mais qui représente généralement en~iron 2 jours de culture, à une température comprise entre 28~C et 40~C.
Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à
l'In~ention, les cultures peuvent être e~fectuées de manière connue en elle-même, soit avec des cellules immobilisées sur un support, soit avec des cellules libres.
Dans le cas des cellules immobilisées, celles-ci sont accrochées ou adsorbées sur un ou plusieurs supports hydrophobes, hydrophiles, ou neutres, dont la sur~ace est de préférence rugueuse, et comportant par exemple des alvéoles, des maillages (grillages ou écheveau), des creux, des trous. Ces supports, creux ou non, sont disposés de manière ordonnée ou non, ~ixe ou mobile dans la phase liquide constituée par le milieu nutriti~ approprié, et peuvent avoir des ~ormes variées (cylindrique ou cubique, en un ou plusieurs morceaux).
Ces supports de même que le milieu pourront être remplacés et/ou renouvelés en continu ou discontinu au cours de la culture.
A titre d'exemples non limitati~s de supports non-ordonnés fixes, on citera des anneaux cylindri~ues RASHIG, en grès, verre, métal, plastique ; des mousses de polyuréth~nnP, polyester, polyamide ; de la l;m~- 11 e métallique, ou plastique, des ~ils de plastique.
A titre d'exemples non limitatifs de supports ordonnés ~ixes, on citera des grilles ou maillages acier inoxydable, verre, plastique, polyuréth~nn~, polyester, Nylon, polyacrylate, polyamide, etc A titre d'exemples non limitati~s de supports mobiles dans la phase liquide, on citera des supports en polyuréth~nn~, polyester, polyamide, plastique extrudés.
Dans le cas des cellules libres, le mycélium se trouve sous ~orme de pelotes pouvant avoir un diamètre W O 96121008 ~ KS~ l746 de 0,5 à 5 mm. Les bioréacteurs employés sont de type colonne à bulle ou airlift (rapport diamètre/hauteur d/h = l/4 à l/6 env.) ou classique (d/h = l à l/2 env ), et possèdent un module d'agitation, spécifique ou non, par exemple : RUSHTON, hélice de bateau, MIG, ruban hélicoïdal simple ou double.
A~antageusement, les cultures sont e~fectuées sous aération et agitation du milieu.
L'aération du milieu est réalisée par 1'introduction d'air, d'oxygène pur ou de tout autre mélange de gaz assurant un apport en oxygene suffisant au micro-organisme, au moyen d'un dispositif permettant une dispersion homogène de ce gaz (verre ~ritté, canne).
L'agitation du milieu peut être effectuée mécaniquement. Elle peut aussi être obtenue de manière pneumatique par action directe du système d'aeration, ou par un système équivalent utilisé simult~n~m~nt.
Le niveau d'agitation et/ou d'aeration est choisi de manière à permettre une occupation initiale ho~ogène du support dans le cas des cellules immobilisées, et la formation de pelotes mycéliennes d'un diamètre moyen de 0,5 à 5 mm dans le cas de cellules libres, tout en limitant les contraintes de cisaillement subies par les hyphes mycéliens. Ce niveau pourra être 2s variable au cours de la duree de la culture.
Avantageusement, la periode d'incubation initiale (2 jours environ) se ~ait à une temperature de 37~C environ, et peut être suivie d'un changement de température favorable à la production de peroxydases, comme décrit par exemple dans le Brevet EP 0 437 500.
La production de manganèse-peroxydase et/ou celle de lignine-peroxydase, et en consequence, le rapport MnP/LiP peuvent être contrôles en fonction de l'âge de la culture et/ou de la présence d'activateurs, ainsi que des souches utilisées. On peut ainsi obtenir des cocktails enzymatiques majoritaires soit en I '' ' W O 96/21008 P~~ 1746 manganèse-peroxydase, soit en lignine-peroxydase (activité supérieure ou égale à 60~ de l'ensemble des activités manganèse-peroxydase et lignine-peroxydase).
Selon une variante du procédé con~orme à
l'Invention l'on peut en outre contrôler le rapport MnP/LiP, et augmenter préférentiellement soit la production de manganèse-peroxydase, soit la production de lignine-peroxydase. Cette variante est caractérisée en ce que :
- pour modi~ier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de manganèse-peroxydase, 1'on procède à
la culture de P~anerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 24 heures et in~érieure à 90 heures, en présence d'un mélange de phospholipides riche en phosphatidylinositol, tel que dé~ini ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l, de pré~érence de l'ordre de l,5 g/l ;
- pour modi~ier le rapport MnP/LiP en ~aveur de la production de li~nine-peroxydase, 1'on procède à la culture de Pha~eroc~aete chrysosporium pendant une durée supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en présence d'un mélange de phospholipides, tel que défini ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l.
Selon les applications, les jus de culture constituant ainsi des cocktails enzymatiques plus ou moins enrichis en manganèse-peroxydase ou en lignine-peroxydase, peuvent être utilisés directement, ou après concentration, par exemple par ultrafiltration. Le cas échéant, une purification sur colonne de type MONO-Q
(PHARMACIA BIOTECH S.A. ; France) est réalisée.
La présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé
conforme à l'Invention.
W O 96/21008 P~l/~n~5101746 Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
I.- ~TI~ISATION DE SO~CEES ~r~ ~TRICES
Les souches qui ont été sélectionnées con~or~m~nt à l'Invention sont les souches de Phanerochaete chrysosporium MIC 249 (CNCM I-1511), MIC
390 (CNCM I-1512), et MIC 396 (CNCM I-1513).
~LE 1 : CONP~R~T.~ON ~E LA PR~u~-llON DE LIGNINE-PEROXYn~-CF.~ ET DE MAN~N~-p~o~yn~-c~ PAR Dl~r~
SO~C~ES
La capacité de production des souches hypersécrétrices con~ormes à 1'Invention, MIC 249, MIC
390, et MIC 396, par rapport à la souche de ré~érence BKM-F-1767 (ATCC 24725), est vérifiée sur des cultures e~fectuées en Erlenmeyer de 250 ml, dans les conditions suivantes :
Composition du milieu :
Glycérol 10 g/l Tartrate disodique 2,3 g/l Tartrate de ~;~mmo~;um l,842 g/l KH2P04 2 g/l CaC12, 2H20 0,14 g/l MgS04, 7H20 0,70 g/l FeS04, 7H20 0,07 g/l ZnS04, 7H20 0,046 g/l MnS04, H20 0,035 g/l CuS04, 5H20 0,007 g/l Extrait de levure 1 g/l ~ Nat89 0,5 g/l Alcool vératrylique O,42 g/l Conditions de culture :
. Le milieu est réparti en conditions stériles à raison de 100 ml par erlenmeyer ; chaque erlenmeyer contient des cu~es de mousse de polyuréth~nne.
'' ' W O 96/21008 P~ K5~1746 . L'inoculation est réalisée à l'aide de fragments mycéliens d'une préculture.
. L'on procède à l'oxygénation des erlenmeyers au début de la culture (T0), puis à l'incubation à 37~C
sous agitation, à 90 ou 120 rpm.
. A partir de 48 h de culture l'on procède a l'oxygénation quotidienne des erlenmeyers et à la poursuite de l'incubation à 37~C sous agitation à 90 ou 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase sont mesurées au bout de 4 jours de culture selon les protocoles suivants :
- a) détermination de l'activité lignine-peroxydase : cette activité est déterminée en mesurant la vitesse d'oxydation de l'alcool vératrylique en aldéhyde correspo~nt, en présence de peroxyde d'hydrogène [TIEN
et KIRK, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2280-2284 (1984)]. La réaction est suivie, à 3Q~C, par spectrophotométrie à 310 nm. Le coefficient d'extinction molaire de l~aldéhyde vératrylique à cette longueur d'onde est de g300 M~1.cm~1.
L'activité dans le milieu est exprimée en nkatal.ml~l ou bien en unités/litre (U/l) : une unité
lignine-peroxydase correspond à une micromole d'aldéhyde vératrylique formé par minute.
- b) détermination de l'activité manganèse-peroxydase : cette activité est déterminée en mesurant la vitesse d'oxydation de la vanillylacétone en présence de MnSO4 [PASZCZYNSKI et al. FEMS Microbiol. Lett , 29:37-41 (lg85)]. La réaction est suivie, à 30~C, par spectrophotométrie à 334 nm. Le coefficient d'extinction molaire de la vanillylacétone à cette longueur d'onde est de 18300 M~1.cm~1.
L'activité dans le milieu est exprimée en nkatal.ml~l ou bien en unités/litre (U/l~ : une unité
W O96121008 ~ K5S/01746 manganèse-peroxydase correspond à une micromole de vanillylacétone formée par minute.
Les résultats sont résumés dans le tableau I
ci-dessous :
S TABLEAU I
SOUCHES A~llvll~ MnP A~llvllh LiP
(U/l) (U~l) Ces resultats montrent que dans ces conditions, la souche I-1511 (MIC 249) produit 4 fois plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la souche de référence BKM-F-1767 ; la souche I-1512 (MIC
390) produit environ 5 fois plus de manganèse-peroxydase et 2 ~ois plus de lignine-peroxydase que la souche BKM-F-1767, et la souche I-1513 (MIC 396) produit 2 fois plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la souche BKM-F-1767.
II - INFLu~ DE LA COMPOSITION D~ MTr.T~ ET DES
CONDITIONS DE C~LT~RE S~R LA PR~u~10N DES LIGNINE-pERoxyn~ ET DES MAN~ ~-PEROXYDASES
~ I~LE 2 : INFLu~N~b: DE L'AGE DE LA C~LT~RE.
La souche MIC 249 est mise en culture dans des, conditions identiques à celles indiquées ci-dessus à
l'exemple 1. L'incubation est effectuée à 37~C sous agitation à 90 rpm.
Les activites lignine-peroxydase et manganese-peroxydase sont mesurées a différents temps de culture, et le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont resumes dans le tableau II ci-dessous.
~ ~ CA 02209082 1997-06-27 W O 96~1008 P~l/rK~S/01746 TA-LEAU II
AGE DE LA A~llvll~ A~llvll~ RAPPORT
CULTURE(h) MnP (U/l) LiP (U/l) MnP/LiP
63 3270 1746 1,87 109,5 2694 2634 1,02 229 2346 4290 0,55 EXEMPLE 3 : INFLu~N~ DE LA ~uN~NLKATION EN
PHOSPHOLIPIDES.
La souche MIC 390 est mise en culture dans les conditions suivantes, sur un milieu de base dont la composition est la suivante :
Glycérol 10 g/l Tartrate disodique 2,3 g/l Tartrate de di~mmonium 1,842 g/l 1~ KH2P04 2 g/l CaC12, 2H20 0,14 g/l MgS04, 7H20 0,70 g/l FeS04, 7H20 0,07 g/l ZnS04, 7H20 0,046 g/l 2Q MnS04, H20 0,035 g/l CuS04, 5H20 0,007 g/l Extrait de leYure 1 g/l, Ce milieu de base est additionné d'un mélange de phospholipides, le NAT89, à des concentrations 25. comprises entre 0,5 g/l et 1,89 g/l.
Le NAT 89 est fourni par la Société NATTERMAN
PHOSPHOLIPID Gmbh (Cologne, Allemagne), et sa composition est la suivante :
- 12~ de phosphatidylcholine et de lysophos-phatidylcholine ;
- 31 ~ de phosphatidyléthanolamine et acyl-phosphatidyléthanolamine ;
- 27~ de phosphatidylinositol ;
- 30~ d'acide phosphatidique.
- ~ CA 02209082 1997-06-27 W O 96121008 ~ rn5shl746 Les cultures sont effectuées comme décrit à
l~Exemple 1. L'incubation est effectuée à 37~C sous agitation à 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèse-S peroxydase sont mesurées à l'optimum de production dansle milieu de culture, a savoir à 4,5 jours de culture.
Le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont indiques dans le tableau III ci-dessous.
TABLEAU III
10 CON~NlKATION A~llvll~ A~llvll~ RAPPORT
NAT89 (g/l) MnP (U/l) LiP (U/l) MnP/LiP
0,5 6564 1932 3,4 0,98 6780 1920 3,53 1,44 8664 1056 8,21 1,89 6474 384 16,86 III - PRO~u~lON EN REACT~uK DES LIGNINE-PEROXYn~ ET
DES MAN~NRCF-PERoXYn~F,~
~LE 4 : Cu~T~RE DANS ~N REAC-~uK A r~T-T-~T-~
INnUOBTT.T~2.~ SmR ~U~Kl - Le corps du bioreacteur contient le support d~immobilisation, qui est ici constitué par 2 cylindres concentriques realisés en grillage metallique (~il de 0,15 mm de diamètre) ayant une maille de 0,5 mm, des diamètres respectifs de 70 mm (cylindre extérieur) et 30 25 mm (cylindre intérieur) pour une hauteur de 2gO mm.
La composition du milieu de base est la sui-vante :
Glycérol 12,5 g/l Tartrate disodique2,875 g/l Tartrate de di~mm~nium 2,302 g/l KH2P04 Z,5 g/l CaCl2, 2H20 0,175 g/l MgS04, 7H20 0,875 g/l FeS04, 7H20 0,0875 g/l ZnS04, 7H20 0,0575 g/l MnS04, H20 0,0437 g/l ' I W O 96~1008 ~ll~KS~ 746 ~uS04, 5X20 0,0087 g/l Extrait de levure 1,25 g/l NAT89 0,625 g/l 2,5 litres de ce milieu sont introduits dans le bioreacteur et l'ensemble est sterilise par autocla-vage 30 min. à 120~C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37~C et est aere avec de 1'air atmospherique ~iltre, introduit à
un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circu-laire ou d'un fritté formant un bullage régulier situe ala base des cylindres métalliques, assurant a la fois une agitation et une aération homogène nécessaire à la ~orma-tion d'un film mycelien adequat.
L'inoculation est réalise à l'aide de frag-ments mycéliens d'une préculture.
Au bout de 48 heures de culture :
A) Le milieu est supplémenté stérilement par un mélange phospholipidique (NAT89) additionné d'alcool veratrylique (AVe).
Composition du melange :
- AVe 1,25 g - NAT89 0,30 B) Le bullage d'air est remplacé par du bul-lage d'oxygène pur à un debit de 20 l/h.
Les activites manganèse-peroxydase et lignine-peroxydase obtenues, dans ces conditions, avec la souche MIC 390 sont :
- activite MnP m~mllm 10000 U/l - activité LiP m~ mllm 2400 U/l.
W O 96/21008 ~ n~Slv1746 EXEMPLE 4 : C~T~RE D~ MICRO-ORGANISME DANS ~N REACTE~R A
rl;~T.T.~JT.~S T.TR~?FC: ~lY~E COLONNE A B~LLE
! La composition du milieu de ~ase est la sui-vante :
Glycérol 6,8 g/l Tartrate disodique 1,565 g/l Tartrate de di~mm~um 1,252 g/l KH2P04 1,334 g/l CaCl2, 2H20 0,094 g/l MgS04, 7H20 0,467 g/l FeS04, 7H20 0,0461 g/l ZnS04, 7H20 0,0310 g/l MnS04, H20 0,0232 g/l CuS04, 5H20 0,0046 g/l Extrait de levure 0,680 g/l NAT89 0,5 g/l 2,5 litres de ce milieu sont introduits dans le bioréacteur et l'ensemble est stérilisé par autocla-vage 30 min. à 120~C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37~C et aéré avec de l'air atmosphérique filtré introduit à un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circu-laire ou d'un fritté formant un bullage régulier, as-surant à la fois une agitation et une aération homogène 2~ nécessaire à la formation des pelotes mycéliennes.
L'inoculation est réalisé à l~aide de frag-ments mycéliens d'une préculture ou d~une solution de spores à 2 x 105 spores/ml.
Au bout de 24 h., les pelotes mycéliennes de 0,5 à 1 mm de diamètre environ sont formées et le débit d'air est réduit à 20 l/h.
Au bout de 48 h :
A) Le milieu est supplémenté stérilement par un mélange phospholipidique comprenant de l'alcool vératryli~ue (AVe).
r W O 96/21008 P~11~K5~/01746 Composition du mélange :
- Ave 1,05 g - Source de phospholipide 0,25 g B) Le bullage d'air est remplacé par du bul-S lage d'oxygène pur à un débit de 20 l/h.
Les résultats obtenus dans ces conditions avec la souche MIC 3gO sont :
- activité MnP m~lmllm: 3600 U/l - activité LiP m~i mllm 162 U/l .
D'autres équipes ont proposé l'addition de détergent du type 'l'W~ [FAISON et KIRK , Appl. Environ.
Microbiol.(1985),49, p.299-304~, ou bien celle d'alcool vératrylique [LEISOLA et al., J. Biotechnol.(1985),3, p.97-107], afin d'augmenter la synthèse de la lignine-peroxydase.
L'équipe des Inventeurs a également, lors de travaux précédents, mis en évidence différents paramètres dont l'optimisation permettait d'augmenter la production de lignine-peroxydase : ajout d'acide oléique et/ou de phospholipides exogènes, contrôle de la température de culture, etc... Ces travaux ont abouti à la mise au point d'un procédé de production de lignine-peroxydase, qui fait l'objet du Brevet Européen 0 437 500.
Ce procédé comprend plusieurs étapes successives, chacune d'entre elles étant effectuée dans des conditions de culture différentes ; la première étape est effectuée sur milieu synthétique, comprenant des sels minéraux, une source de carbone et une source d'azote, en présence d'extrait de levure, d'une source de phospholipides, et d'acides gras émulsifiés ; le mycélium formé est alors cultivé dans un milieu de culture partiellement renouvelé, additionné d'alcool vératrylique, mais ne comprenant pas d'acides gras émulsifiés, et dont la teneur en phospholipides ne représente que 1/7 à 1/8 de celle du milieu de culture utilisé dans la première étape ; lors d'une troisième étape, le milieu est entièrement remplacé par un milieu neuf, comprenant la même proportion de phospholipides et - ~ CA 02209082 l997-06-27 ' W O 96~1008 P~ h~SJ'0~746 d'alcool vératrylique que celui de la deuxième étape, et la source de carbone, la source d'azote, et l'extrait de levure, au 1/4 de leur teneur dans le milieu de la premiere étape ; une quatrième étape de culture est enfin ef~ectuée dans un milieu dépourvu d'extrait de levure, de source de carbone, et d'acides gras émulsifiés, mais comprenant la même proportion de phospholipides et d'alcool vératrylique que celui des étapes précédentes.
-La lignine-peroxydase peut ensuite être ré-o cupérée à partir du milieu de culture. La mise en oeuvre de ce procédé permet d'accroître très significativement la teneur en enzyme i l'activité lignine-peroxydase dans le milieu est d'environ 240 U par litre et par jour.
~es recherches effectuées jusqu'à présent ont principalement porté sur l'accroissement de l'activité
lignine-peroxydase ; cependant, les manganèse-peroxydases apparaissent de plus en plus comme suscepti~les de jouer un rôle clef dans la biotransformation de composés aro-matiques polymériques de type lignine. En effet, con-trairement aux lignine-peroxydases dont l'activité est limitée par la faible pénétration des parois lignifiées par l'enzyme, les manganèse-peroxydases agissent par 1~intermédiaire d'espèces de faible poids moléculaire, diffusant aisément. En bref, le cycle catalytique des manganèse-peroxydases ~ait intervenir l'oxydation du Mn(II) en Mn(III) qui, après complexation à des acides organiques, génère des espèces oxydantes diffusantes capables de dépolymériser la lignine naturelle [WARIISHI
K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, p. 269-276, (l991)].
BONNARMB et JEFFRIES [J. Ferment. Bioeng.
70:158-163 (1990)] ont étudié la régulation de la production de lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase de Phanerochaete chrysosporium sous différentes conditions de culture ; ils ont ainsi obser~é ~ue la quantité de ces enzymes variait, en particulier, en ' ' W O 96121008 P~ h~5~1746 fonction de la concentration en Mn(II) : à ~aible concentration, la lignine-peroxydase est pré~érentielle-ment produite (760 nmol/ml.min dans les conditions optimales), tandis qu'à concentration élevée c'est la production de manganèse-peroxydase (950 nmol/ml,min dans les conditions optimales) qui est privilégiée.
Les Inventeurs se sont ~ixé pour but 1'augmentation de la production de peroxydases exocellulaires de Phanerochaete chrysosporium à partir de cultures de ce champignon, ainsi que l'augmentation du rapport MnP/LiP.
Dans ce but, les Inventeurs sont parvenus à
obtenir de nouvelles souches (dénommées ci-après MIC 3g0, MIC 249, et MIC 396) hypersécrétrices des peroxydases exocellulaires lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase. Ils ont en outre mis au point des conditions de culture spécifiques, pouvant être mises en oeuvre soit avec des cellules libres, soit avec des cellules immobilisées sur support. Ceci permet d'augmenter, de manière très si~nificative le r~n~m~nt en lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase, par rapport à celui obtenu avec les cultures de l'art antérieur : par exemple, les cultures obtenues con~o~",P,n~,tt à l'Invention peuvent produire environ 2 ~ois plus de lignine peroxydase que celles du Brevet EP 0 437 500 et l0 fois plus de manganèse-peroxydase que celles obtenues précP~emm~nt par BONNARME et JEFFRIES.
La mise en oeuvre de la présente Invention permet en outre de contrôler et de modifier, selon les besoins, le rapport manganèse-peroxydase/lignine-peroxydase. , La présente In~ention a pour objet les souchesde Phanerochaete chrysosporium MIC 249, MIC 390, et MIC
396, qui ont été déposées le 20 décembre 1994, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) tenue par l'Institut Pasteur, 26 rue du W O 96121008 P~ h9~J'~1746 Docteur Roux à Paris, sous les numéros respectifs I-1511, I-1512, et I-1513.
~ La présente invention a également pour objet un procédé de production de lignine-peroxydase et/ou de manganèse-peroxydase à partir d'une culture de Phanerochaete chrysosporium, lequel procéde est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une souche de Phanerochaete chrysosporium choisie dans le groupe constitué par les souches MIC ~49, MIC
390, et MIC 396 mentionnées ci-dessus.
Ces cultures sont réalisées, selon les techniques usuelles de culture de Phanerochaete chrysosporium, connues en elles-mêmes, à partir d'un inoculum constitué par des fragments mycéliens obtenus à
lS partir d'une préculture, ou de spores (2.105 spores par ml environ).
Le milieu de culture comprend au moins une source de car~one, au moins une source d'azote, des sels minéraux, des oligo-éléments, des vit~m;nes et il est additionné d'extrait de levure.
La concentration en source de carbone est de préférence comprise entre 5 et 20 g/l.
Une source de carbone préférentiellement utilisée comprend du glycérol, mais d'autres sources de 2s carbone assimilables plus lentement ou plus rapidement, sont uti lisables; seules ou en mélange ; il s'agit par exemple de sources de carbone telles que le maltose, le raffinose, l'amidon, le xylose, le rhamnose, l'arabinose, le fructose, le sorbitol, le mannose, le cellobiose, la cellulose.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, la source de carbone comprend au moins un phospholipide choisi dans le groupe constitué par la phosphatidylcholine (PC), la lysophosphatidylcholine (LPC), la phospha-tidyléthanolamine (PE), l'acylphosphatidyléthanolamine '' ' W O 96/21008 P~1/~K50V1746 (APE), le phosphatidylinositol (PI), l'acide phosphati-dique (AP), ou un mélange desdits phospholipides ; il peut s'agir dans ce cas d'un mélange de phospholipides reconstitué, ou bien d'un melange de phospholipides provenant d'une source naturelle, par exemple des phospholipides de soja. A~antageusement, si l'on utilise un mélange de phospholipides, celui-ci comprend plus de 25~ de phosphatidylinositol et moins de lS~ de PC.
De préférence, la concentration du phospholipide ou du mélange de phospholipides (reconstitués, ou issus du soja) est comprise entre 0,l et lO g/litre.
La source d'azote peut être par exemple constituée d'acides aminés, de nitrate de sodium ou d'un mélange de ces différentes sources d'azote, en combinaison avec l'extrait de levure. La concentration en source d'azote est de préférence comprise entre 0,S et 20 g/l .
Les sels minéraux assimilables comprennent les sels de potassium, de calcium et de magnésium, et sont utilisés à une concentration comprise entre 0,5 et lO0 mM.
Les oligo-éléments sont principalement com-posés de sul~ate de fer, de sul~ate de zinc, de sul~ate de manganèse, et de sul~ate de cuivre. Les concentrations en sul~ates de fer, de zinc, et de cuivre, sont les concentrations habituellement utilisées pour la culture de Phanerochaete chrysosporium, (cf. par exemple le Brevet Européen 0 437 500). La concentration en Mn2+ n'a a pas d'in~luence sur la production de manganèse-peroxydase dans les conditions de culture conformes à
l'Invention, et peut varier dans une gamme relativement large ; elle est de pré~érence comprise entre l et 600 mM .
Le milieu est aussi additionné d'une source de vit.~m; nes ; on peut par exemple utiliser un mélange de , wo s6nl00s ~ J~l746 vit~m;nPs dont la composition respecte celle donnée par [TATUM et al. Am. J. Bot., 37:38-46 (1950)]. Le mélange de vit~m~n~s est utilisé à une concentration comprise entre 0,001 g et 1 g par litre.
Par ailleurs, l'addition d'alcool vératrylique (0,4 mM environ) permet de maintenir la stabilité des enzymes produites.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, le milieu de culture est en outre supplémenté, en cours de culture, par ajout, à raison de 0,001 à 10 grammes par litre, d'au moins un élément activateur de la production d'enzymes et/ou protecteur de celles-ci ; cet élément activateur et/ou protecteur peut être constitué par l'un des constituants du milieu initial, ou par un mélange de plusieurs d'entre eux.
De préférence, cet élément activateur et~ou protecteur comprend de l'alcool vératrylique, qui est dans ce cas utilise à une concentration comprise entre 0,1 et 1 ~ u..e par litre. On peut ajouter également un supplement d'une source phospholipidique riche en phosphatidylinositol, qui est dans ce cas utilisee à
raison de 0,1 à 3 yrdl~LLes par litre.
Cet ajout peut être ef~ectue, sous ~orme de solution, d~emulsion, ou de liposomes, par addition d'un melange de surfactant (TWEEN 80 par exemple), avec des acides gras (C18:12, C18:2) et des phospholipides riches en phosphatidylinositol.
La supplémentation du milieu peut être e~fectuee de manière continue (pompe) ou discontinue.
La supplémentation en élément(s) activateur(s) et/ou protecteur(s) est e~ectuee lorsque la culture a atteint un stade de croissance tel que l'on se situe au début de l'expression des gènes codant pour les peroxydases (production des ARN messagers codant pour les manganèse-peroxydases et les lignine-peroxydases. Ce stade, qui a été défini expérimentalement, est atteint W O 96/210~8 PcTAFR9slol746 après une période qui peut varier selon les souches et les conditions de culture, mais qui représente généralement en~iron 2 jours de culture, à une température comprise entre 28~C et 40~C.
Pour la mise en oeuvre du procédé conforme à
l'In~ention, les cultures peuvent être e~fectuées de manière connue en elle-même, soit avec des cellules immobilisées sur un support, soit avec des cellules libres.
Dans le cas des cellules immobilisées, celles-ci sont accrochées ou adsorbées sur un ou plusieurs supports hydrophobes, hydrophiles, ou neutres, dont la sur~ace est de préférence rugueuse, et comportant par exemple des alvéoles, des maillages (grillages ou écheveau), des creux, des trous. Ces supports, creux ou non, sont disposés de manière ordonnée ou non, ~ixe ou mobile dans la phase liquide constituée par le milieu nutriti~ approprié, et peuvent avoir des ~ormes variées (cylindrique ou cubique, en un ou plusieurs morceaux).
Ces supports de même que le milieu pourront être remplacés et/ou renouvelés en continu ou discontinu au cours de la culture.
A titre d'exemples non limitati~s de supports non-ordonnés fixes, on citera des anneaux cylindri~ues RASHIG, en grès, verre, métal, plastique ; des mousses de polyuréth~nnP, polyester, polyamide ; de la l;m~- 11 e métallique, ou plastique, des ~ils de plastique.
A titre d'exemples non limitatifs de supports ordonnés ~ixes, on citera des grilles ou maillages acier inoxydable, verre, plastique, polyuréth~nn~, polyester, Nylon, polyacrylate, polyamide, etc A titre d'exemples non limitati~s de supports mobiles dans la phase liquide, on citera des supports en polyuréth~nn~, polyester, polyamide, plastique extrudés.
Dans le cas des cellules libres, le mycélium se trouve sous ~orme de pelotes pouvant avoir un diamètre W O 96121008 ~ KS~ l746 de 0,5 à 5 mm. Les bioréacteurs employés sont de type colonne à bulle ou airlift (rapport diamètre/hauteur d/h = l/4 à l/6 env.) ou classique (d/h = l à l/2 env ), et possèdent un module d'agitation, spécifique ou non, par exemple : RUSHTON, hélice de bateau, MIG, ruban hélicoïdal simple ou double.
A~antageusement, les cultures sont e~fectuées sous aération et agitation du milieu.
L'aération du milieu est réalisée par 1'introduction d'air, d'oxygène pur ou de tout autre mélange de gaz assurant un apport en oxygene suffisant au micro-organisme, au moyen d'un dispositif permettant une dispersion homogène de ce gaz (verre ~ritté, canne).
L'agitation du milieu peut être effectuée mécaniquement. Elle peut aussi être obtenue de manière pneumatique par action directe du système d'aeration, ou par un système équivalent utilisé simult~n~m~nt.
Le niveau d'agitation et/ou d'aeration est choisi de manière à permettre une occupation initiale ho~ogène du support dans le cas des cellules immobilisées, et la formation de pelotes mycéliennes d'un diamètre moyen de 0,5 à 5 mm dans le cas de cellules libres, tout en limitant les contraintes de cisaillement subies par les hyphes mycéliens. Ce niveau pourra être 2s variable au cours de la duree de la culture.
Avantageusement, la periode d'incubation initiale (2 jours environ) se ~ait à une temperature de 37~C environ, et peut être suivie d'un changement de température favorable à la production de peroxydases, comme décrit par exemple dans le Brevet EP 0 437 500.
La production de manganèse-peroxydase et/ou celle de lignine-peroxydase, et en consequence, le rapport MnP/LiP peuvent être contrôles en fonction de l'âge de la culture et/ou de la présence d'activateurs, ainsi que des souches utilisées. On peut ainsi obtenir des cocktails enzymatiques majoritaires soit en I '' ' W O 96/21008 P~~ 1746 manganèse-peroxydase, soit en lignine-peroxydase (activité supérieure ou égale à 60~ de l'ensemble des activités manganèse-peroxydase et lignine-peroxydase).
Selon une variante du procédé con~orme à
l'Invention l'on peut en outre contrôler le rapport MnP/LiP, et augmenter préférentiellement soit la production de manganèse-peroxydase, soit la production de lignine-peroxydase. Cette variante est caractérisée en ce que :
- pour modi~ier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de manganèse-peroxydase, 1'on procède à
la culture de P~anerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 24 heures et in~érieure à 90 heures, en présence d'un mélange de phospholipides riche en phosphatidylinositol, tel que dé~ini ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l, de pré~érence de l'ordre de l,5 g/l ;
- pour modi~ier le rapport MnP/LiP en ~aveur de la production de li~nine-peroxydase, 1'on procède à la culture de Pha~eroc~aete chrysosporium pendant une durée supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en présence d'un mélange de phospholipides, tel que défini ci-dessus, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l.
Selon les applications, les jus de culture constituant ainsi des cocktails enzymatiques plus ou moins enrichis en manganèse-peroxydase ou en lignine-peroxydase, peuvent être utilisés directement, ou après concentration, par exemple par ultrafiltration. Le cas échéant, une purification sur colonne de type MONO-Q
(PHARMACIA BIOTECH S.A. ; France) est réalisée.
La présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé
conforme à l'Invention.
W O 96/21008 P~l/~n~5101746 Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
I.- ~TI~ISATION DE SO~CEES ~r~ ~TRICES
Les souches qui ont été sélectionnées con~or~m~nt à l'Invention sont les souches de Phanerochaete chrysosporium MIC 249 (CNCM I-1511), MIC
390 (CNCM I-1512), et MIC 396 (CNCM I-1513).
~LE 1 : CONP~R~T.~ON ~E LA PR~u~-llON DE LIGNINE-PEROXYn~-CF.~ ET DE MAN~N~-p~o~yn~-c~ PAR Dl~r~
SO~C~ES
La capacité de production des souches hypersécrétrices con~ormes à 1'Invention, MIC 249, MIC
390, et MIC 396, par rapport à la souche de ré~érence BKM-F-1767 (ATCC 24725), est vérifiée sur des cultures e~fectuées en Erlenmeyer de 250 ml, dans les conditions suivantes :
Composition du milieu :
Glycérol 10 g/l Tartrate disodique 2,3 g/l Tartrate de ~;~mmo~;um l,842 g/l KH2P04 2 g/l CaC12, 2H20 0,14 g/l MgS04, 7H20 0,70 g/l FeS04, 7H20 0,07 g/l ZnS04, 7H20 0,046 g/l MnS04, H20 0,035 g/l CuS04, 5H20 0,007 g/l Extrait de levure 1 g/l ~ Nat89 0,5 g/l Alcool vératrylique O,42 g/l Conditions de culture :
. Le milieu est réparti en conditions stériles à raison de 100 ml par erlenmeyer ; chaque erlenmeyer contient des cu~es de mousse de polyuréth~nne.
'' ' W O 96/21008 P~ K5~1746 . L'inoculation est réalisée à l'aide de fragments mycéliens d'une préculture.
. L'on procède à l'oxygénation des erlenmeyers au début de la culture (T0), puis à l'incubation à 37~C
sous agitation, à 90 ou 120 rpm.
. A partir de 48 h de culture l'on procède a l'oxygénation quotidienne des erlenmeyers et à la poursuite de l'incubation à 37~C sous agitation à 90 ou 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèse-peroxydase sont mesurées au bout de 4 jours de culture selon les protocoles suivants :
- a) détermination de l'activité lignine-peroxydase : cette activité est déterminée en mesurant la vitesse d'oxydation de l'alcool vératrylique en aldéhyde correspo~nt, en présence de peroxyde d'hydrogène [TIEN
et KIRK, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2280-2284 (1984)]. La réaction est suivie, à 3Q~C, par spectrophotométrie à 310 nm. Le coefficient d'extinction molaire de l~aldéhyde vératrylique à cette longueur d'onde est de g300 M~1.cm~1.
L'activité dans le milieu est exprimée en nkatal.ml~l ou bien en unités/litre (U/l) : une unité
lignine-peroxydase correspond à une micromole d'aldéhyde vératrylique formé par minute.
- b) détermination de l'activité manganèse-peroxydase : cette activité est déterminée en mesurant la vitesse d'oxydation de la vanillylacétone en présence de MnSO4 [PASZCZYNSKI et al. FEMS Microbiol. Lett , 29:37-41 (lg85)]. La réaction est suivie, à 30~C, par spectrophotométrie à 334 nm. Le coefficient d'extinction molaire de la vanillylacétone à cette longueur d'onde est de 18300 M~1.cm~1.
L'activité dans le milieu est exprimée en nkatal.ml~l ou bien en unités/litre (U/l~ : une unité
W O96121008 ~ K5S/01746 manganèse-peroxydase correspond à une micromole de vanillylacétone formée par minute.
Les résultats sont résumés dans le tableau I
ci-dessous :
S TABLEAU I
SOUCHES A~llvll~ MnP A~llvllh LiP
(U/l) (U~l) Ces resultats montrent que dans ces conditions, la souche I-1511 (MIC 249) produit 4 fois plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la souche de référence BKM-F-1767 ; la souche I-1512 (MIC
390) produit environ 5 fois plus de manganèse-peroxydase et 2 ~ois plus de lignine-peroxydase que la souche BKM-F-1767, et la souche I-1513 (MIC 396) produit 2 fois plus de manganèse-peroxydase et de lignine-peroxydase que la souche BKM-F-1767.
II - INFLu~ DE LA COMPOSITION D~ MTr.T~ ET DES
CONDITIONS DE C~LT~RE S~R LA PR~u~10N DES LIGNINE-pERoxyn~ ET DES MAN~ ~-PEROXYDASES
~ I~LE 2 : INFLu~N~b: DE L'AGE DE LA C~LT~RE.
La souche MIC 249 est mise en culture dans des, conditions identiques à celles indiquées ci-dessus à
l'exemple 1. L'incubation est effectuée à 37~C sous agitation à 90 rpm.
Les activites lignine-peroxydase et manganese-peroxydase sont mesurées a différents temps de culture, et le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont resumes dans le tableau II ci-dessous.
~ ~ CA 02209082 1997-06-27 W O 96~1008 P~l/rK~S/01746 TA-LEAU II
AGE DE LA A~llvll~ A~llvll~ RAPPORT
CULTURE(h) MnP (U/l) LiP (U/l) MnP/LiP
63 3270 1746 1,87 109,5 2694 2634 1,02 229 2346 4290 0,55 EXEMPLE 3 : INFLu~N~ DE LA ~uN~NLKATION EN
PHOSPHOLIPIDES.
La souche MIC 390 est mise en culture dans les conditions suivantes, sur un milieu de base dont la composition est la suivante :
Glycérol 10 g/l Tartrate disodique 2,3 g/l Tartrate de di~mmonium 1,842 g/l 1~ KH2P04 2 g/l CaC12, 2H20 0,14 g/l MgS04, 7H20 0,70 g/l FeS04, 7H20 0,07 g/l ZnS04, 7H20 0,046 g/l 2Q MnS04, H20 0,035 g/l CuS04, 5H20 0,007 g/l Extrait de leYure 1 g/l, Ce milieu de base est additionné d'un mélange de phospholipides, le NAT89, à des concentrations 25. comprises entre 0,5 g/l et 1,89 g/l.
Le NAT 89 est fourni par la Société NATTERMAN
PHOSPHOLIPID Gmbh (Cologne, Allemagne), et sa composition est la suivante :
- 12~ de phosphatidylcholine et de lysophos-phatidylcholine ;
- 31 ~ de phosphatidyléthanolamine et acyl-phosphatidyléthanolamine ;
- 27~ de phosphatidylinositol ;
- 30~ d'acide phosphatidique.
- ~ CA 02209082 1997-06-27 W O 96121008 ~ rn5shl746 Les cultures sont effectuées comme décrit à
l~Exemple 1. L'incubation est effectuée à 37~C sous agitation à 120 rpm.
Les activités lignine-peroxydase et manganèse-S peroxydase sont mesurées à l'optimum de production dansle milieu de culture, a savoir à 4,5 jours de culture.
Le rapport MnP/LiP est calculé. Les résultats sont indiques dans le tableau III ci-dessous.
TABLEAU III
10 CON~NlKATION A~llvll~ A~llvll~ RAPPORT
NAT89 (g/l) MnP (U/l) LiP (U/l) MnP/LiP
0,5 6564 1932 3,4 0,98 6780 1920 3,53 1,44 8664 1056 8,21 1,89 6474 384 16,86 III - PRO~u~lON EN REACT~uK DES LIGNINE-PEROXYn~ ET
DES MAN~NRCF-PERoXYn~F,~
~LE 4 : Cu~T~RE DANS ~N REAC-~uK A r~T-T-~T-~
INnUOBTT.T~2.~ SmR ~U~Kl - Le corps du bioreacteur contient le support d~immobilisation, qui est ici constitué par 2 cylindres concentriques realisés en grillage metallique (~il de 0,15 mm de diamètre) ayant une maille de 0,5 mm, des diamètres respectifs de 70 mm (cylindre extérieur) et 30 25 mm (cylindre intérieur) pour une hauteur de 2gO mm.
La composition du milieu de base est la sui-vante :
Glycérol 12,5 g/l Tartrate disodique2,875 g/l Tartrate de di~mm~nium 2,302 g/l KH2P04 Z,5 g/l CaCl2, 2H20 0,175 g/l MgS04, 7H20 0,875 g/l FeS04, 7H20 0,0875 g/l ZnS04, 7H20 0,0575 g/l MnS04, H20 0,0437 g/l ' I W O 96~1008 ~ll~KS~ 746 ~uS04, 5X20 0,0087 g/l Extrait de levure 1,25 g/l NAT89 0,625 g/l 2,5 litres de ce milieu sont introduits dans le bioreacteur et l'ensemble est sterilise par autocla-vage 30 min. à 120~C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37~C et est aere avec de 1'air atmospherique ~iltre, introduit à
un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circu-laire ou d'un fritté formant un bullage régulier situe ala base des cylindres métalliques, assurant a la fois une agitation et une aération homogène nécessaire à la ~orma-tion d'un film mycelien adequat.
L'inoculation est réalise à l'aide de frag-ments mycéliens d'une préculture.
Au bout de 48 heures de culture :
A) Le milieu est supplémenté stérilement par un mélange phospholipidique (NAT89) additionné d'alcool veratrylique (AVe).
Composition du melange :
- AVe 1,25 g - NAT89 0,30 B) Le bullage d'air est remplacé par du bul-lage d'oxygène pur à un debit de 20 l/h.
Les activites manganèse-peroxydase et lignine-peroxydase obtenues, dans ces conditions, avec la souche MIC 390 sont :
- activite MnP m~mllm 10000 U/l - activité LiP m~ mllm 2400 U/l.
W O 96/21008 ~ n~Slv1746 EXEMPLE 4 : C~T~RE D~ MICRO-ORGANISME DANS ~N REACTE~R A
rl;~T.T.~JT.~S T.TR~?FC: ~lY~E COLONNE A B~LLE
! La composition du milieu de ~ase est la sui-vante :
Glycérol 6,8 g/l Tartrate disodique 1,565 g/l Tartrate de di~mm~um 1,252 g/l KH2P04 1,334 g/l CaCl2, 2H20 0,094 g/l MgS04, 7H20 0,467 g/l FeS04, 7H20 0,0461 g/l ZnS04, 7H20 0,0310 g/l MnS04, H20 0,0232 g/l CuS04, 5H20 0,0046 g/l Extrait de levure 0,680 g/l NAT89 0,5 g/l 2,5 litres de ce milieu sont introduits dans le bioréacteur et l'ensemble est stérilisé par autocla-vage 30 min. à 120~C.
Le bioréacteur est alors thermostaté à 37~C et aéré avec de l'air atmosphérique filtré introduit à un débit de 40 l/h à l'aide d'une canne d'aération circu-laire ou d'un fritté formant un bullage régulier, as-surant à la fois une agitation et une aération homogène 2~ nécessaire à la formation des pelotes mycéliennes.
L'inoculation est réalisé à l~aide de frag-ments mycéliens d'une préculture ou d~une solution de spores à 2 x 105 spores/ml.
Au bout de 24 h., les pelotes mycéliennes de 0,5 à 1 mm de diamètre environ sont formées et le débit d'air est réduit à 20 l/h.
Au bout de 48 h :
A) Le milieu est supplémenté stérilement par un mélange phospholipidique comprenant de l'alcool vératryli~ue (AVe).
r W O 96/21008 P~11~K5~/01746 Composition du mélange :
- Ave 1,05 g - Source de phospholipide 0,25 g B) Le bullage d'air est remplacé par du bul-S lage d'oxygène pur à un débit de 20 l/h.
Les résultats obtenus dans ces conditions avec la souche MIC 3gO sont :
- activité MnP m~lmllm: 3600 U/l - activité LiP m~i mllm 162 U/l .
Claims (7)
1) Souches de phanerochaete chrysosporium, dénommées MIC 249, MIC 390, et MIC 396, déposées le 20 décembre 1994, auprès de la CNCM sous les numéros respectifs I-1511, I-1512, et I-1513.
2) Procédé de production de lignine-peroxydase et/ou de manganèse-peroxydase à partir d'une culture de Phanerochaete chrysosporium, lequel prodédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une souche de Phanerochaete chrysosporium choisie dans le groupe constitué par les souches MIC 249, MIC
390, et MIC 396 selon la revendication 1.
390, et MIC 396 selon la revendication 1.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de culture de Phanerochaete chrysosporium, est supplémenté, en cours de culture, par ajout d'alcool vératrylique, à une concentration comprise entre 0,1 et 1 gramme par litre, et/ou d'une source phospholipidique riche en phosphatidylinositol, à raison de 0,1 à 3 grammes par litre.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la supplémentation en phospholipides et/ou en alcool vératrylique est effectueé
après environ 2 jours de culture à une température comprise entre 28°C et 40°C.
après environ 2 jours de culture à une température comprise entre 28°C et 40°C.
5) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 4, permettant en outre l'augmentation préférentielle soit de la production de manganèse-peroxydase, soit de la production de lignine peroxydase, lequel procédé est caractérisé en ce que:
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de manganèse-paroxydase, l'on procède à
la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 24 heures et inférieure à 90 heures, en présense d'un mélange de phospholipides, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l ;
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de lignine-peroxydase, l ' on procède à la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en présence d'un mélange de phospholipides dont la concentration est comprise entre 0,5 et 5 g/l.
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de manganèse-paroxydase, l'on procède à
la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 24 heures et inférieure à 90 heures, en présense d'un mélange de phospholipides, à une concentration comprise entre 0,5 et 5 g/l ;
- pour modifier le rapport MnP/LiP en faveur de la production de lignine-peroxydase, l ' on procède à la culture de Phanerochaete chrysosporium pendant une durée supérieure à 90 heures et inférieure à 350 heures, en présence d'un mélange de phospholipides dont la concentration est comprise entre 0,5 et 5 g/l.
6) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 5, caracterisé en ce que l'on utilise une culture de cellules immobilisées sur un support.
7) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 5 , caracterisé en ce que l'on utilise une culture de cellules libres.
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