DE19741083A1 - Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Peroxidasen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Mangan-PeroxidasenInfo
- Publication number
- DE19741083A1 DE19741083A1 DE1997141083 DE19741083A DE19741083A1 DE 19741083 A1 DE19741083 A1 DE 19741083A1 DE 1997141083 DE1997141083 DE 1997141083 DE 19741083 A DE19741083 A DE 19741083A DE 19741083 A1 DE19741083 A1 DE 19741083A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- culture
- fixed
- fungus
- manganese
- nutrient
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Mangan-
Peroxidasen (MnP), wobei als Organismen Weißfäulepilze der Systemklasse
der Agaricales eingesetzt werden und diesen eine manganhaltige
Nährflüssigkeit zugesetzt wird.
Die Mangan-Peroxidasen (E.C. 1.11.1.13; Mn(H): H2O2 oxidoreductases)
sind O- und N-glykosylierte Enzyme mit einem Eisen-Protoporphyrin-IX-
Ringsystem im aktiven Zentrum. Mangan-Peroxidasen haben Molekular
gewichte zwischen 42 kDa und 49 kDa [De Jong, Dissertation Landbau-
Universität Wageningen (1993)]. Sie sind hochspezifische Enzyme, die
Mn2+-Ionen zu Mn3+-Ionen oxidieren. Ihre Fähigkeit eine große Zahl von
Reaktionen zu katalysieren, beruht auf der extrem hohen Oxidationskraft
dieser primär gebildeten Mn3+-Ionen [Forrester et al., Biochemical andBiophysical Research Communications 157 (3): 992-999 (1988)]. Die
Oxidationskraft der Mn3+-Ionen läßt sich durch den Einsatz sekundärer
Mediatoren verstärken. Es ist vorgeschlagen worden, das MnP-
Katalysesystem für Abwasserbehandlungen etc. zu verwenden.
Da Mangan-Peroxidasen in der Literatur bisher weniger Beachtung als die
Lignin-Peroxidasen bzw. Laccasen fanden, ist auch weit weniger über ihre
gezielte Produktion bekannt.
Es wurde versucht, die Ausbeute an ligninolytischen Enzymen durch
Pelletbildung des enzymbildenden Organismus zu erreichen. Die Versuche
von Janshekar und Fiechter (Joumal of Biotechnology 8 : 97-112, 1988)
wurden durch die Zerstörung der Pilzpellets durch Scherkräfte erschwert.
Eine Verminderung der Scherkräfte war nur durch hohen technischen
Aufwand zu erreichen. [Einsele, Finn, Samhaber: Mikrobiologische und
biochemische Verfahrenstechnik S. 150, Weinheim, (1985); Jäger und
Wandrey, physiology of immobilized cells, Amsterdam (1990); Call DE 41 34 716 C1].
Ebenso ist es möglich, die Ausbeute an ligninolytischen
Enzymen mittels Cokulturen zu erhöhen. Hierbei können jedoch über längere
Zeiträume keine definierten Bedingungen der Enzymherstellung
gewährleistet werden [DE-PS 41 34 716 C1].
Die Standardinkubationstemperatur für die Produktion von ligninolytischen
Enzymen ist 37°C [Laisola und Fiechter, FEMS Microbiology letters 29:
33-36 (1985); DE-PS 41 34 716 C1], was mit einem hohen Energieaufwand
verbunden ist.
Daneben sind alle bisher beschriebenen Verfahren zur Produktion pilzlicher
Exoenzyme durch stickstofflimitierende Wachstumsbedingungen gekennzeichnet [Mester et al., Applied Microbiol Biotechnol 44: 778-784 (1996)],
welche eine physiologische Instabilität der Organismen zur Folge haben
können.
Das in diesen Standard-Medien für die Produktion von ligninolytischen
Enzymen eingesetzte Dimethylsuccinat ist relativ kostenintensiv (FLUKA-
Katalog).
Aus der Literatur ist bekannt, daß zur Induktion von Exoenzymen
Veratrylaldehyd [Kirk et. al., Enzyme. Microbiol. Technol. 8: 376-384
(1986)], Benzaldehyde oder andere zum Teil toxische Elizitoren verwendet
wurden.
Durch Zugabe aromatischer Elicitoren (Veratrylaldehyd, o. ä.) zu
Ligninperoxidase-Bildung kann u. U. auch eine Stimulation der MnP bewirkt
werden.
Durch die bisher beschriebenen Induktionsmethoden sind immer
Mischaktivitäten ligninolytischer Enzyme und zu dem nur geringe MnP-
Aktivitäten erreicht worden [Niku Paavola et al., Joumal of Biotechnology
13: 211-221 (1990)].
Bisherige Versuche zur Produktion von ligninolytischen Enzymen,
einschließlich der MnP, waren also durch komplizierte Kultivierungs
methoden, insbesondere artifizielle Kulturmedien, Temperierierung sowie
durch die Induktion mit teuren Elicitoren, verbunden. Im Ergebnis wurden so
Lignin-Peroxidasen, Laccasen bzw. Mischaktivitäten aus verschiedensten
ligninolytischen Enzymen gewonnen.
Aufgabe der Erfindung ist es, weitgehend reine Mangan-Peroxidasen
innerhalb kürzester Zeit, mit geringem verfahrenstechnischem und
ökonomischem Aufwand sowie unmittelbar mit hoher Enzymausbeute zu
gewinnen. Insbesondere sollen keine nachfolgenden und zusätzlichen
Reinigungsschritte und auch keine teueren Medienzusätze erforderlich sein.
Darüber hinaus soll das Verfahren zur Anwendung der einzelnen
Weißfäulepilzkulturen als Ausgangsorganismus universell anwendbar sein.
Erfindungsgemäß werden die Pilzkultur zunächst auf einem Träger, z. B.
Glaswolle, Polyamid-Gewebe, Polyolefin-Gewebe oder Polyolefin-
Schwämme, fixiert und dann in einem Reaktionsgefäß zu dieser fixierten
Pilzkultur eine hochmanganhaltige Nährflüssigkeit, wie Succinat-/Phosphat
gepuffertes Kulturmedium mit Mangan-Zusatz, zugegeben. Zur Gewinnung
der Mangan-Peroxidasen wird die zugegebene Nährflüssigkeit in definierten
Zeitabständen, vorzugsweise zwischen zwei und sechs Kulturtagen, von der
auf dem Träger fixierten Pilzkultur aus dem Reaktionsgefäß abgezogen und
aufkonzentriert (vorzugsweise ultrafiltriert). Das Verfahren ermöglicht
sowohl eine fortwährende, semikontinuierliche Gewinnung der Mangan-
Peroxidasen (ähnlich dem Kefir-Prinzip), indem die abgezogene
Nährflüssigkeit durch neue ersetzt wird, als auch einen diskontinuierlichen
Betrieb, wobei nach Abtrennung der Nährflüssigkeit von der auf dem Träger
fixierten Pilzkultur, diese durch kühle Lagerung erhalten und die MnP-
Gewinnung bei Bedarf durch Zugabe der Nährflüssigkeit mit der gleichen
fixierten Pilzkultur neu gestartet bzw. weitergeführt werden kann. Durch das
Ultrafiltrieren der Nährflüssigkeit werden die Mangan-Peroxidasen mit einer
Anreicherung von mehr als 90% erzeugt. Zusätzliche oder nachträgliche
Reinigungsschritte sind nicht erforderlich. Die Gewinnung ist sehr effektiv,
da bereits ab einem Reaktionszeitraum von zwei bis drei Kulturtagen die
hochangereicherten Mangan-Peroxidasen aus der abgezogenen
Nährflüssigkeit gewonnen werden können. Unter Nutzung von physiologisch
hochaktiven natürlichen Isolaten von Weißfäulepilzen der Unterklasse der
Agaricales kann so in sehr kurzer Zeit MnP mit einer Aktivität von über 3000
U/l erzeugt werden (MnP-fremde Aktivitäten sind dabei geringer als 10%).
Für eine hohe Enzymausbeute kann die Nährflüssigkeit zur Vermeidung von
Konzentrationsgradienten um die fixierte Pilzkultur herum bewegt werden,
ohne daß zerstörende Scherkräfte (welche die MnP-produzierende Pilzkultur
beeinträchtigen) auf bei der Reaktion entstehende Mycelien zu
berücksichtigen wären. Das Verfahren ist unabhängig von einer
Temperierung, so daß die MnP-Gewinnung bei Raumtemperatur erfolgen
kann. Die Medienmenge kann frei gewählt werden. Eine Aufrechterhaltung
der Sterilität ist während der semikontinuierlichen Prozeßführung nicht
notwendig. Eine Begasung, z. B. mit Sauerstoff, ist ebenfalls nicht
erforderlich. Die Versorgung des Organismus mit Luft wird durch einfache
semipermeable Diffusionsbarriere gewährleistet. Die Induktion der MnP
erfolgt ausschließlich über Mn-Ionen als Induktoren. Teure Medienzusätze,
wie beispielsweise Dimethylsuccinat, und aufwendige Apparaturen sind nicht
erforderlich, wodurch die MnP-Gewinnung sehr kostengünstig ist.
Die Erfindung soll anhand nachstehender Ausführungsbeispiele näher
erläutert werden. Zum besseren Verständnis ist zum dritten
Ausführungsbeispiel eine Zeichnung beigefügt, welche den zeitlichen
Verlauf der Enzymaktivität dieser MnP-Gewinnung verdeutlicht.
In den Beispielen finden die folgenden Medien Verwendung.
Medium DM (2,2 Dimethylsuccinat-Medium), welches Glucose, Dikalium
hydrogenphosphat, 2,2-Dimethylsuccinat, Calciumchlorid, Hefeextrakt,
Ammoniumtartrat enthält.
Medium SM (Succinat-Medium), welches Glucose, Dikaliumhydrogen
phosphat, Succinat, Calciumchlorid, Hefeextrakt und Ammoniumtartrat
enthält.
Der pH-Wert wurde bei beiden Medien auf 4,0 eingestellt. Die Induktion der
Pilzkulturen erfolgt mittels Magnesiumsulfat, das die Mn(H)-Ionen
entsprechend der Notwendigkeit zur Verfügung stellt.
Es wird bei allen Beispielen keine Vorkultur im herkömmlichen Sinne
benötigt. Die Anzucht der Organismen auf Malz-Agar-Medium erfolgt
ausschließlich wegen des besseren Handlings. Die Organismen bewachsen
die Standard-Agar-Platten jeweils in 7 bis 10 Tagen.
Als enzymsekretierender Organismus diente in diesem Fall Clitocybula
dusenii b11. Das Polyolefin-Gewebe wurde mit 200 ml DM befeuchtet und
mit einem Inokulum von 7 mm Durchmesser beimpft. Nach 7 Kulturtagen
unter emersen Bedingungen wurden 300 ml DM aufgefüllt und die Pilzkultur
für 7 Tage mit 80 U/min bewegt. Die Enzymausbeute lag bei 2300 U/l.
In diesem Beispiel wurde Nematoloma frowardii b19 als Mangan-
Peroxidasen sekretierender Organismus verwendet. Das Trägermaterial, in
diesem Fall Glaswolle, wurde wie schon in Ausführungsbeispiel 1 behandelt;
lediglich das verwendeten Nährmedium war SM. Nach der ersten Ernte, bei
der 2000 U/l Enzym gewonnen werden konnten, wurde das SM ausgetauscht.
Nach weiteren 7 Tagen Kultivierung bei 80 U/min konnten 2300 U/l Enzym
geerntet werden. Die Kultur wurden nun ohne neues Medium 14 Tage bei
4 °C aufbewahrt. Nach dieser Ruhepause der Kultur auf dem feuchten
Trägermaterial wurde mit 500 ml DM aufgefüllt und bei 80 U/min kultiviert.
Die MnP-Ausbeute betrug 2100 U/min.
Der Organismus Clitocybula dusenii b11 wurde für dieses Beispiel auf
Polyolefin-modifizierte Zellulose-Mischgewebe immobilisiert. Als Medium
diente in diesem Versuch SM. Jeweils nach der Ernte des das Enzym
enthaltenden Kulturüberstandes wurde das Reaktionsgefäß mit 500 ml SM
nachgefüllt. Die in der Zeichnung dargestellte Tabelle spiegelt die
Enzymausbeuten wider. Die Einträge in der Tabelle geben jeweils die Ernten
zu den entsprechend fortgeführten Zeiträumen wieder. Zur ersten Ernte nach
14 Kulturtagen unter emersen Bedingungen ergab sich eine Enzymausbeute
von 180 U/l. Nach dem Abziehen der Nährflüssigkeit aus dem
Reaktionsgefäß und Nachfüllen von SM ergab die zweite Ernte nach den
nächsten vier Kulturtagen unter Bewegung der Nährflüssigkeit mit 80Upm
eine Enzymausbeute von 843 U/l. Nach Neuansatz von SM und weiteren
sechs Kulturtagen mit ebenfalls bewegter Nährflüssigkeit (80Upm) stieg die
Enzymausbeute in der dritten Ernte auf 1029 U/l. Die Enzymausbeute nach
der zehnten Ernte waren 3349 U/l.
Claims (14)
1. Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Peroxidasen, bei dem in einem
offenen Reaktionsgefäß Weißfäulepilzen der Systemklasse der Agaricales als
Pilzkultur eine manganhaltige Nährflüssigkeit zugesetzt wird, dadurch
gekennzeichnet, daß die Pilzkultur vor der Zugabe der Nährflüssigkeit auf
einem Träger fixiert wird und daß zur Gewinnung der Mangan-Peroxidasen
die zu der auf dem Träger fixierten Pilzkultur gegebene Nährflüssigkeit nach
einer definierten Reaktionszeit aus dem Reaktionsgefäß abgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Pilzkultur
eine Reinkultur aus der Gruppe Agaricales, z. B. Clitocybula dusenii (DSM
11679 vom 07.08.1997), Nematoloma frowardii (DSM 11680 vom
07.08.1997) oder Stropharia rugosoannulata, bzw. deren Mangan-
Peroxidasen-bildungsfähige Varianten oder Mutanten, auf dem Träger fixiert
werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus dem
Reaktionsgefäß abgeführte Nährflüssigkeit zur Konzentration der Mangan-
Peroxidasen ultrafiltriert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzkultur
auf Glaswolle als Träger fixiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzkultur
auf Polyamid-Gewebe als Träger fixiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzkultur
auf Polyolefin-Gewebe als Träger fixiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzkultur
auf Polyolefin-Schwämmen als Träger fixiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der auf dem
Träger fixierten Pilzkultur ein manganhaltiges Succinat-/Phosphat
gepuffertes Kulturmedium als Nährflüssigkeit zugegeben wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der auf dem
Träger fixierten Pilzkultur als Nährflüssigkeit Manganchlorid zugegeben
wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Nährflüssigkeit eine Mn-Konzentration von mehr als 100 µM aufweist.
11. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Nährflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß mit der auf dem Träger fixierten
Pilzkultur nach einer Reaktionszeit kleiner als zwei Wochen, vorzugsweise
zwischen zwei und sechs Kulturtagen, abgezogen und ultrafiltriert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur weiteren
MnP-Gewinnung (semikontinuierlicher Betrieb) die aus dem Reaktionsgefäß
von der auf dem Träger fixierten Pilzkultur abgezogene Nährflüssigkeit durch
neue ersetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Unterbrechung der MnP-Gewinnung (diskontinuierlicher Betrieb) die auf
dem Träger fixierte Pilzkultur ohne zugesetzte Nährflüssigkeit kühl,
vorzugsweise bei Temperaturen kleiner als 10°C, zwischengelagert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zweck der
Erhöhung der Enzymausbeute die Nährflüssigkeit um die auf dem Träger
fixierte Pilzkultur bewegt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997141083 DE19741083A1 (de) | 1997-09-18 | 1997-09-18 | Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Peroxidasen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997141083 DE19741083A1 (de) | 1997-09-18 | 1997-09-18 | Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Peroxidasen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19741083A1 true DE19741083A1 (de) | 1999-03-25 |
Family
ID=7842759
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1997141083 Withdrawn DE19741083A1 (de) | 1997-09-18 | 1997-09-18 | Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Peroxidasen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19741083A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018115173A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Rockwool International A/S | Binders with improved recycling properties |
-
1997
- 1997-09-18 DE DE1997141083 patent/DE19741083A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018115173A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Rockwool International A/S | Binders with improved recycling properties |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1234020B1 (de) | Behandlung von saatgut und pflanzen mit nützlichen bakterien | |
| DE69723369T2 (de) | Mikrobieller Stamm, Verfahren zum biologischen Abbau von organischen Verbindungen und Verfahren zur Engiftung der Umwelt damit | |
| DE2445254A1 (de) | Verfahren zur verminderung des nucleinsaeuregehaltes bei der herstellung von essbaren, protein enthaltenden stoffen | |
| DE2939269C2 (de) | Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure | |
| DE19741083A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Mangan-Peroxidasen | |
| DE3441690A1 (de) | Verfahren zur enzymatischen behandlung organischer stoffe und biomasse | |
| DE3938659C1 (de) | ||
| DE10043944B4 (de) | Verfahren zur Herstellung lignilolytischer Enzyme mittels holzbewohnender Pilze aus der Ordnung Agaricales | |
| DE2058371A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansaeure | |
| DE3843381C1 (de) | ||
| DE2125692B2 (de) | Verfahren zur herstellung eines naehrbodens fuer makropilze, insbesondere speisepilze | |
| EP0114630A2 (de) | Permeabilisiertes Schimmelpilzmycel mit intaktem immobilisiertem Glucoseoxidase-Katalasesystem sowie dessen Herstellung und Anwendung | |
| DE587819C (de) | Verfahren zur Herstellung von Gluconsaeure oder Citronensaeure und deren Salzen | |
| DE1195434B (de) | Verfahren zur Gewinnung von Nisin | |
| DE2002200C3 (de) | Zweistufiges biotechnisches Verfahren zur Züchtung einer L-Asparaginase-reichen Bakterienzellmasse | |
| DE2142916A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Enzymen mit Hilfe von Kohlenwasserstoffen | |
| DD154930A3 (de) | Wachstumsstimulator fuer den chamignon-anbau | |
| DE4239796A1 (de) | Verfahren zum Stimulieren von biologischen, insbesondere mikrobiologischen Prozessen | |
| AT309661B (de) | Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von geweichten Häuten mit proteolytischen Enzymen in alkalischer Flotte | |
| CH632637A5 (de) | Verfahren zur zuechtung von basidiomyzeten. | |
| DE102004009161A1 (de) | Optimierte Induktion und gerichtete selektive Festphasen-Kultivierung stabiler, mikrobieller Mischkulturen zur kontinuierlichen Herstellung definierter Enzym- und Metabolitgemische und Verfahren und Vorrichtung dazu | |
| DD277696A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von laccase | |
| DE1642581C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von alpha-D-Galactosidase | |
| DE1492703C (de) | Verfahren zur Herstellung von kandier ten Fruchten | |
| DD300781A7 (de) | Verfahren zur herstellung mikrobieller uratoxidase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8101 | Request for examination as to novelty | ||
| 8105 | Search report available | ||
| 8120 | Willingness to grant licenses paragraph 23 | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |