CN1117153C - 嗜热真菌表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含编码异源蛋白质的核酸序列的重组嗜热宿主细胞，以及利用该细胞产生重组蛋白质的方法。本发明的重组宿主在罐发酵中表现出比许多已知的真菌宿主细胞(例如曲霉属微生物)更好的形态，这一形态引起较低的粘度水平，从而提高产率。

Description

嗜热真菌表达系统
发明所属的技术领域
本发明涉及用于产生重组蛋白质的宿主细胞。具体地说，本发明涉及能用于表达重组蛋白质(特别是酶)的嗜热真菌宿主细胞。
发明背景
近年来重组宿主细胞在表达异源蛋白质上的使用已极大地简化了大量有商业价值的蛋白质的产生，所述的蛋白质过去只能从其天然来源分离纯化获得。现在，有可供选择的不同的表达系统用来产生任何给定的蛋白质，包括原核和真核宿主。合适的表达系统的选择不仅常常取决于宿主细胞产生足够量的活性状态的蛋白质的能力，也可以在很大程度上受所述蛋白质预期的最终用途的制约。
尽管哺乳动物和酵母细胞已十分普遍地用作真核宿主，但丝状真菌已开始被认为作为重组蛋白质产生之宿主细胞非常有用。曲霉属的某些种已有效地用作重组蛋白质产生之宿主细胞。不过常常有形成太浓密的菌丝体聚集体和非均匀分布的问题，这也会导致营养供应不足和不产生蛋白质的情形。已报道用重组质粒转化构巢曲霉(Ballance，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.112：284-289，1983)，但发现转化以很低的频率发生。也已报道黑曲霉和米曲霉两者在重组产生异源蛋白质上有用。虽然这些物种目前通常用于重组蛋白质产生，但它们不是没有其不利之处。具体地说，它们在发酵罐中的生长形态不最适宜发酵，因为粘度随生物量的增加容易变得相当高。增加的粘度限制了混合发酵培养物和向其通气的能力，导致菌丝体的氧和营养物供应不足，由此引起菌丝体不能存活和不产生蛋白质。而且，常常有形成太浓密的菌丝体聚集体和非均匀分布的问题，这也会导致营养供应不足。由此，从商业目的出发，仍然需要真菌宿主，这种宿主能够用于表达重组蛋白质而且表现出令人满意的生长特征(例如快速生长和低粘度)，从而提高发酵罐的生产能力。
发明概述
本发明提供了新的重组蛋白质真菌宿主细胞，该细胞表现出非常适用于在发酵罐中产生异源蛋白质的生长特征。本发明的宿主细胞能够快速生长，在给定的生物量浓度下表现出低的粘度，形成均匀分布的菌丝体，具有允许营养物向菌丝体各部分充分扩散的足够疏松的结构。具体地说，本发明的宿主细胞是嗜热真菌，该真菌产生的粘度值(如以帕斯卡表示的)低于在相同的发酵条件(例如，在盐、含有100g/l葡萄糖的酵母膏培养基中pH5下的间歇发酵)和相同的生物量下米曲霉产生的粘度值的80％，优选的是低于50％，最优选的是低于30％。优选的所述真菌宿主产生同源的疏松结构的菌丝体。最优选的所述真菌宿主细胞选自梭孢壳属、嗜热子囊菌、属毁丝霉属和孢子丝菌属的各种。因此，本发明提供了如上所限定的重组宿主细胞，该细胞包含编码异源蛋白质(本文中也理解为包括肽)的核酸片段，所说的蛋白质可以由所说宿主细胞表达。本发明还提供了产生异源蛋白质的方法，该方法包括在有益于表达所说的目标异源蛋白质的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养液中回收所说的蛋白质。
附图简要描述
图1说明几种嗜热真菌与米曲霉比较的在间歇发酵中推断到30g/l时的粘度(以帕斯卡表示)。
图2显示从未转化的嗜热菌株和其木聚糖酶转化体分离的总DNA的southern杂交分析结果。Humicola insolens的1.2kb HindIII-XhoI片段用作模板。1道：未转化的Myceliophthora thermophila；2道：Myceliophthora thermophila转化体#5；3道：Myceliophthorathermophila转化体#11；4道：未转化的Acremonium alabamense；5道：Acremonium alabamense转化体#5；6道：Acremoniumalabamense转化体#8；7道：未转化的Sporotrichum cellulophilum；8道：Sporotrichum cellulophilum转化体#6；9道：Sporotrichumcellulophilum转化体#7。
图3说明Thielavia terrestris 373和其无芽孢形成突变体在一段时间内生物量的增加。箭头表示所说373菌株开始形成芽孢时的时间点。
发明详述
任何重组蛋白质的商业用途极大地取决于在大规模发酵中获得有效产生的能力。在真菌工业发酵中，生产力受许多因素的限制。最常见的问题与以下因素有关：与单细胞生物体(例如酿酒酵母和芽孢杆菌的种)相比的相对高的粘度，和浓密聚集体状菌丝体通常的很不均匀的分布。由于氧气和/或营养物不能扩散到所有细胞，这便导致大多数菌丝体缺乏氧气和/或营养物。高粘度降低可到达发酵罐的氧气的转运率，依次对细胞产生的总能量发生不利的影响，从而引起可获得的生物量的较低浓度和较低的终产率或者较长的发酵时间。因此可以看出，没有导致低粘度的合适的形态，简单地增加生物量不足以在发酵中增加产率。为获得任何优点，必须增加产生性生物量。
现已发现许多嗜热真菌意想不到地表现出使其适于在发酵罐中培养的生长特征。鉴别具有有用的生长特征的真菌的尝试始于在各种条件下的分类学上的异源组的随机筛选。摇瓶评价主要集中在确定候选菌株是否产生胞外蛋白和/或蛋白酶(产生其中每一种对重组蛋白质产生来说都不是所用细胞的所需特征)。然而也观察各菌株的生长和形态。首先，快速生长并且具有疏松均匀的菌丝体分布，而在培养中既无大的沉淀又无聚集体形成被认为是用于发酵罐中的好的候选菌株的标志。基于这一初步筛选，选择下列物种在发酵罐中试验：Thermoascus thermophilus、Mucor pusilus、Myceliophthora thermophila、Thielavia terrestris、Acremoniumalabamense(Thielavia terrestris的不完全形式)、Talaromycesemersonii和Sporotrichum cellulophilum。
将候选菌株在100g/l葡萄糖中进行间歇发酵并分析粘度，以米曲霉为对照。Mucor pusilus产生大块菌丝体，踝节菌属菌株产生高水平的蛋白酶(因而不进行进一步的研究)，表1给出的其它菌株的数据说明被试嗜热菌株的粘度水平实质上(即至少约50％)低于在相等生物量下由米曲霉所观察到的水平。这些数据的推断值(包含30g/l菌株生物量)示于图1中。Thermoascus thermophilus表现出最有利的轮廓这一物种的菌丝体是均匀分散的，形成紧靠的高度分支菌丝体的松散结构。毁丝霉属类似于梭孢壳属，但具有伸长的较少分支的生长形式，形成比用梭孢壳属所见的高一些的粘度。踝节菌属和孢子丝菌属两者都都表现出有用的形态和非常低的粘度。
除了表现出有用的形态外，候选宿主菌株当然还必须是可转化的并且能够表达异源蛋白质。尽管嗜热真菌(例如灰腐质霉thermoidea变种)过去已被转化(Allison et al.，Curr.Genet.21：225-229，1992)，但异源蛋白质在重组真菌宿主细胞中的表达还未见报道。因此，开始还不清楚这些嗜热菌株最终是否能完全用于重组异源蛋白质产生中。然而，令人惊奇的是如以下实施例所示，标准的曲霉属转化方案(如例如Christiansen et al..Bio/Technol.6：1419-1422所描述的)可以用于转化大多数被试菌株。因此，就可转化性和有利的形态两者而言，本发明的嗜热真菌具有用作发酵罐中重组蛋白质产生之宿主细胞所必需的性质。
用嗜热真菌作为宿主细胞也具有其它优点。除了在培养这些真菌中观察到的较低的粘度外，它们生长的较高温度有益于某些物种比非嗜热菌株更快速的生长。这依次导致生物量更快速的积累，带来相对较短的发酵周期。在连续发酵中，这些真菌所喜爱的较高温度与较低pH的组合提供了污染危险性明显降低的条件。
本发明包含在发酵期间满足以上所述的粘度要求的任何嗜热真菌。“嗜热真菌”意指在至少约40℃(优选的在40-50℃之间)的温度下表现出最佳生长的任何真菌。它包括但不限于支顶孢属、Corynascus、梭孢壳属、毁丝霉属、嗜热子囊菌属、孢子丝菌属、毛壳菌属、栉霉属、Scytalidium和踝节菌属的嗜热成员。在优选的实施方案中所说的嗜热菌株选自Thermoascus thermophilus、Myceliophthora thermophila  、Sporotrichum cellulophilum和Thielavia terrestris的菌株。应当理解，对以上所述的物种，本发明包含完全和不完全状态两者以及其它分类学等同物(例如，增节变态体(anamorphs))，而不论其被称的物种名称。例如Thielavia terrestris的不完全形式称为Acremonium alabamense。可以从例如下列文献中找到分类学等同物和其它有用物种的别的例子：Cannon，Mycopathologica 111：75-83，1990；Moustafa et al.，Persoonia14：173-175，1990；Stalpers，Stud.Mycol.24，1984；Upadhyay et al.，Mycopathologia 87：71-80，1984；Subramanian et al.，Cryptog.Mycol.1：175-185，1980；Guarro et al.，Mycotaxon 23：419-427，1985；Awao et al.，Mycotaxon 16：436-440，1983；von Klopotek，Arch.Microbiol.98：365-369，1974；和Long et al.，1994，ATCC Names of IndustrialFungi，ATCC，Rockville，Maryland。本领域技术人员可以容易地识别合适的等同物。
实施例中给出的结果表明各物种的几种分离物具有使其在发酵中有用所需的形态。所说结果也说明被转化的能力不限于单个嗜热种。有用的不限于单个分离物或菌株，而是种的有特征的一组。本领域技术人员会认识到这些种的其它菌株或分离物也能用于异源蛋白质的表达。各个种的许多菌株是公众可从下列保藏单位获得的：美国典型培养物保藏中心(ATCC)12301 Parklawn Drive，Rockville Maryland 20852；农业研究服务培养物保藏中心(NRRL)1815 North University Street，Peoria，Illinois61604；真菌遗传材料保藏中心(FGSC)，Kansas；Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen(DSM)，Mascheroder Weg 1B，D-3300 Braunschweig，Germany；应用微生物学研究所(IAM)，TokyoUniversity 1-1，1-Chome，Yayoi，Bunkyo-ku，Tokyo 113，Japan；发酵研究所(IFO)，17-85 Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka532，Japan；和真菌菌种保藏中心(CBS)，Oosterstraat 1，3740 AGBaarn，Netherlands。也是可以从Novo Nordisk Biotech，Davis，California培养物保藏中心获得的。
可以用以下实施例描述的方法容易地确定其它嗜热真菌宿主用于发酵罐中的适合性。简言之，在标准生长培养基(例如盐/酵母膏、大豆、马铃薯蛋白质或补加有葡萄糖或其它合适碳源的任何培养基)上培养候选真菌。在约37-50℃(优选的约42-46℃)温度和约4-7的pH下进行发酵。当然地会认识到对照发酵的温度应是对对照菌株(例如米曲霉)最佳的温度，约为32-36℃。通过目测摇瓶中菌丝体形态定性识别那些对发酵有用的菌株是可能的。有用的菌株会显示出有许多分支点的松散均匀排列的菌丝体。通过评价发酵罐中各时间点培养基的实际粘度在发酵罐中很好地证实有用性。可以用任何本领域已知的方法测定粘度，所说的方法例如，Brookfield转动粘度测定法(限定的或非限定的剪切距离和任何类型的纺锤构型)、动力学粘度管(流过管子)、落球粘度计或杯式粘度计。优选地，评价中包含米曲霉菌株作为对照，将候选菌株的粘度值与其值比较。优选的宿主细胞表现出的粘度水平为相同发酵条件下米曲霉菌株产生的粘度的约80％或更低，优选的约50％或更低，最优选的约为30％或更低。
本领域技术人员也会认识到本文描述的宿主物种的成功的转化不限于特别说明的载体、启动子和选择标记。一般来说，用于转化米曲霉、黑曲霉和构巢曲霉的那些技术也适于本发明的宿主细胞。例如，虽然amdS选择标记是优选的，但其它有用的选择标记包括但不限于argB(构巢曲霉或黑曲霉)、trpC(黑曲霉或构巢曲霉)、pyrG(黑曲霉或构巢曲霉)、sC(硒酸盐抗性)或glufosinate抗性(米曲霉)标记，或它们的来源于其它种的等同物。所说的启动子可以是在这些种中表现出强转录活性的任何DNA序列，可以是来源于编码胞外和胞内蛋白质(例如淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶和糖酵解酶)两者的基因的。这类合适的启动子可以是来源于米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂肪酶基因的。来源于糖酵解酶基因启动子的例子是TPI、ADH和PGK。所说的启动子也可以是同源启动子，即，使用的宿主菌株天然的基因启动子。按照本发明的有用的启动子是米曲霉TAKA淀粉酶启动子。TAKA淀粉酶是公知的α-淀粉酶(Toda et al.，Proc.Japan Acad.58 Ser.B.：208-212，1982)。为了引入特定的限制位点有利于启动子序列与选择的基因或者选择的信号肽或前区(preregion)连接，启动子序列可以提供有接头。终止子和聚腺苷酸化序列也可以来源于与启动子相同的来源。增强子序列也可以插入进构建体。
为了避免需要破碎细胞获得表达产物，减小细胞内表达产物可能降解的量，产物分泌到细胞外是优选的。为此，在一个优选的实施方案中，将目标基因连接到可以引导表达产物到细胞分泌途径的前区(例如，信号肽和前导肽)上。所说的前区可以来源于任何生物体的任何分泌蛋白质基因，或者可以是天然前区。这种前区有用的可用源是曲霉属的葡糖苷酶或淀粉酶基因；芽孢杆菌的淀粉酶基因；RM的脂酶或蛋白酶基因；酿酒酵母α-因子的基因或小牛前凝乳酶基因。大多数优选的前区来源于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、芽孢杆菌NCIB 11837的麦芽淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因。有效的信号序列是米曲霉TAKA淀粉酶信号，RM天冬氨酸蛋白酶信号和RM脂酶信号。另外，也可以使用被表达基因的天然前区。功能性连接到启动子和终止子序列上的所需产物的基因可以掺入包含选择标记的载体，或者置于能够整合进宿主菌株基因组的不同载体或质粒上。载体系统可以是单个载体或质粒或者是共同包含待整合进基因组的总DNA的两个或多个载体或质粒。载体或质粒可以是线型的或封闭环状的分子。按照本发明优选的实施方案，用两个载体转化宿主，一个包含选择标记，包括剩下的待引入的异源DNA的另一个包含启动子、所需蛋白质的基因和转录终止子和聚腺苷酸化序列。
本发明的宿主细胞可用于表达任何目标原核或真核异源肽或蛋白质，优选地是用于表达真核肽或蛋白质。Thielavia terrestris特别有用是由于认识到其具有安全性历史，对这些种的特别的兴趣是用它们表达异源蛋白质，特别是真菌酶。所述的新表达系统可用于表达酶，例如过氧化氢酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化还原酶、纤维素酶、木聚糖酶、过氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角质酶、蛋白酶和其它蛋白分解酶、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、果胶酶和其它溶果胶酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、壳质酶、mutanase和脱氧核糖核酸酶。本领域技术人员会理解，术语“真菌酶”不仅包括天然真菌酶，而且包括经氨基酸取代、缺失、添加或其它可以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的修饰方法修饰的那些真菌酶。
本发明的宿主细胞也可以用于重组产生宿主细胞天然的蛋白质。这种使用的例子包括但不限于，把嗜热菌株的天然蛋白质置于不同启动子控制下，以增强蛋白质的表达，通过采用信号序列加快目标天然蛋白质转运出细胞，或者增加主体宿主细胞通常产生的蛋白质的拷贝数。因此，在术语“异源蛋白质”的范围内，本发明也包括达到以下程度的同源蛋白质的重组产生，所说的程度是这种表达包括使用宿主细胞非天然的遗传元件或者使用经操作以宿主细胞中正常情况下见不到的方式起作用的天然元件。
如上所述，由于其良好的形态，Thielavia terrestris属于用于重组蛋白质产生的优选的种。然而，在浸没培养中，该种在生长限制(葡萄糖或水)条件下由于孢子形成也丧失生物量。具体地说，发酵早期产生的大量菌丝体快速消失，大量孢子出现。由于菌丝体是产生重组蛋白质的来源，因此在培养中避免孢子形成是合乎需要的。为此，分离了不形成孢子的梭孢壳属突变体。将孢子置于紫外光下并培养5天。然后将菌丝体散布到平板上培养24小时。选择8个最大的菌落，假定菌丝体片段生长快于首先必须发育的孢子，在摇瓶中试验。在浸没培养中，8个菌落中的2个表现出不形成孢子，说明如果有需要，这一方法是产生不形成孢子的菌株的有活力的方法。
进一步用下列非限制性实施例说明本发明。I.嗜热菌的摇瓶评价
摇瓶中使用具有下列组份的ASPO4培养基(含有可变碳源)：
酵母膏              2g/l
MgSO47H2O        1g/l
CaCl2             1g/l
KH2PO4           5g/l
柠檬酸              2g/l
微量金属*          0.5ml/l
尿素                2g/l
(NH4)2SO4       2g/l*含有14.3g/l七水硫酸锌，五水硫酸铜，0.5g/l六水氯化镍，13.8g/l七水硫酸亚铁，8.5g/l一水硫酸锰和3g/l柠檬酸。
使用无挡板丙烯摇瓶(100或500ml)，于42-44℃温度和4.5pH在200rpm振荡。
在摇瓶中根据下列特征筛选大量的嗜热菌株：(1)生长活跃；(2)蛋白酶产生；(3)分泌蛋白质；(4)菌丝体形态。为确定蛋白酶活性，将各培养液上清液在2500rpm下离心5分钟，用于酪蛋白透明平板试验中，这一试验测定由作为重组蛋白质表达活性者被评价的各真菌物种所产生的蛋白酶水平。按如下进行酪蛋白透明平板试验。平板培养基的组成为20g/l脱脂乳，20g/l琼脂糖，供pH5和pH7下试验的0.2M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，和供pH9下试验的甘油氢氧化钠缓冲液。将奶粉与100ml缓冲液混合并保存在60℃下。将琼脂糖与400ml缓冲液混合并高压灭菌5分钟。稍微冷却后，加入温热的奶混合物，将混合物轻轻倒转2-3次进行混合。以每块平板50-70ml的量将培养基倒在150mm平板上，贮存直至使用。
临用之前，在每块平板的琼脂上制12个孔。将25μl各菌株发酵上清液加到各种pH值的一块平板上，在37℃培养过夜。向pH9的平板加入0.5M冰乙酸沉淀酪蛋白，使任何澄清带可见。根据澄清带的大小(即，从无带到直径大于2cm)带型(即，透明，不透明或两种类型)评价平板。
各培养物的上清液也用于评价菌株的胞外蛋白质产生。按制造者的说明制备Novex 8-16％SDS聚丙烯酰胺凝胶用于评定蛋白质轮廓。将40μl(48小时)培养上清液样品与10μl 5×离解缓冲液(离解缓冲液＝4mlTris-HCl，pH6.8；1gSDS；617mg二硫苏糖醇，加无菌蒸馏水至10ml)和甘油/溴酚蓝(10-20mg加到约10ml 80-90％甘油中，置于沸水中2小时以溶解)混合。煮沸5分钟，冷却，上样并在120V下电泳，直到溴酚蓝跟踪染料到达凝胶底部。凝胶用考马斯亮蓝染色。显示大量带的那些分离物被认为是作为潜在的新宿主不太合适的。
用+到+++等级定量评价生长。形态分成以下几类：1-具有很少支链的长的紧密相互作用的菌丝；2-许多分生孢子，具有非常长的支链；3-具有某些支链的稀长线型菌丝；4-厚短无规则菌丝，有许多支链；5-具有非常长的支链的松散菌丝；6-具有非常均匀菌丝分布松散菌丝；7-具有某些支链的长的紧密相互作用的菌丝。形态5和6被认为最合乎需要。
在摇瓶中进行5个实验，其中按以下改变碳源的种类和数量：(1)麦芽糖糊精10g/l；(2)葡萄糖10g/l；(3)麦芽糖糊精20g/l；(4)10g/l Avicell+1g/l葡萄糖〔为纤维素酶诱导作用〕；(5)30g/l麦芽糖糊精+10g/l葡萄糖。在一个或多个实验中待试物种的分离物是Talaromyces emersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Thielaviaterrestris、Thermoascus thermophilus、嗜热子囊菌、Malbrancheasulfurea、Melanocarpus albomyces、Sporotrichum cellulophilum、Acremonium alabamense、灰腐质霉thermoidea变种、Mucor pusilus、Myceliophthora thermophila和Scytalidium thermophilum。在以上所述的一种或多种实验条件下，这些菌株中的几个表现出有用的形态，并且活跃生长。在实验条件下，无被试菌株表现出分泌高水平(大于1g/l)的任何蛋白质，被认为具有干净的蛋白质基底。几个菌株(例如Talaromycesemersonii、Talaromyces byssochlamydoides)显示出高蛋白酶活性，在试验生长条件下某些菌株(例如Malbranchea sulfurea)生长非常缓慢。没有进行其它试验。
在这一评价过程中，测定浸没培养中在平板上孢子形成的程度。平板上孢子形成的能力对有用的宿主细胞是事实上自发的。在普通真菌琼脂平板上Thielavia terrestris和Myceliophthora thermophila两者都不显示出任何孢子。对毁丝霉属，使菌丝体首先在马铃薯葡萄糖琼脂(FDA；Difco)平板上于37℃生长48小时，然后在50℃生长过夜，接着于37℃生长另外的24-48小时。在这一物种中温度逆境(stress)明显地触发孢子形成。
对梭孢壳属，可以经首先于37℃培养室的普通氛围中在PDA平板上培养菌丝体诱导平板上的孢子形成。然后将培养物置于用氮气淹没的1升Pyrex烧杯中，用塑料包裹物密封，再回送到37℃室中48小时。在培养室普通氛围下从烧杯除去平板，在室中培养1周。在氮气处理之前和之后的生长之间，平板发育出一圈白色的孢子。这一孢子形成明显地由氧逆境触发。
在浸没培养中，氧有限和葡萄糖有限也引发梭孢壳属的孢子形成。事实上，在具有20g/l葡萄糖的ASPO4培养基中3-4天后，这种孢子形成自发发生。然而，在发酵条件下，这种孢子形成是不合乎需要的，因为菌丝体生物量迅速消失并被孢子取代，由此降低生产力。为了解决这一问题，从Thielavia terrestris E373产生不形成孢子的菌株。将具有106UV暴露过的(30秒暴露导致40％杀灭)孢子/ml培养基(具有2g/l葡萄糖的ASPO4)的摇瓶于42℃培养5天。选择8个最大的菌落，假定菌丝体片段生长快于首先必须发育的孢子。将选择的菌落转移到摇瓶中。在这些浸没培养物中，8个菌落中的2个表现出一点也不形成孢子，而其它6个表现出某些程度的孢子形成。
首先选择来在罐发酵中研究的是Thielavia terrestris(菌株E373和ATCC20627)、Myceliophthora thermophila(菌株A421)、Sporotrichum cellulophilum(菌株ATCC20493)和Thermoascusthermophilus(菌株2050和CBS 759.71)、Mucor pusilus(菌株A209)、Acremonium alabamense(A2082)、Talaromyces emersonii(菌株A577)。指定为“A”的菌株可以从Novo Nordisk A/S，Bagsv rd，Denmark培养物保藏中心获得；指定为“E”的菌株可以从Novo Nordisk Entotech，Davis，Calitornia培养物保藏中心获得。II.发酵罐评价
用于发酵罐的培养基如下：
MgSO47H2O      2g/l
KH2PO4         5g/l
一水柠檬酸        4g/l
酵母膏            10g/l
(NH4)2SO4     10g/l
CaCl2           2g/l
AMG微量金属*    0.5ml/l
Pluronic         1ml/l*含有14.3g/l七水硫酸锌，2.5g/l五水硫酸铜，0.5g/l六水氯化镍，13.8g/l七水硫酸亚铁，8.5g/l一水硫酸锰和3g/l柠檬酸。
使用自来水，高压灭菌前调节pH至6。
碳源基于起始体积(2l)按100g/l加入50％葡萄糖。
在pH5.0+/-0.1(用磷酸或氢氧化钠调节)下于42-46℃进行发酵。使用具有增大的叶轮的Applicon发酵罐。溶解氧的浓度(DOT)保持在大于20％饱和浓度，通气速率为每分钟每体积1体积，搅拌速率在800-1400rpm之间。
以干细胞重量估计生物量浓度。经事先过秤的20μm薄膜过滤20ml培养液。用水洗涤滤饼2次，于96℃干燥48小时并称重。用装有“C14”杯和圆筒系统的Bohlin Reologi，Inc.“Visco 88”测定粘度。系统开关设置为“1”，速度设置为“8”。以1000rpm转动杯内圆筒，传递1222/s剪切率。从发酵罐移去全部培养样品，在室温装置上于2分钟内测定。将约10毫升样品放入杯(依次连接到Visco 88上)中，完全浸没圆筒。记录圆筒旋转开始几秒钟内产生的起始粘度读数。
分析Thielavia terrestris E373和ATCC20627、Myceliophthorathermophila A421、Sporotrichum cellulophilum ATCC20493)、Thermoascus thermophilus 2050和米曲霉A1560(对照)的6种发酵物的粘度。每个发酵都是pH5和1100rpm下的100g/l葡萄糖间歇发酵。使嗜热菌株在42℃生长，使米曲霉在37℃生长。表1给出了显示以帕斯卡表示的粘度值的数据。帕斯卡值越低，培养物的粘性越小。测定的粘度数据是在电流计中试验的开始几秒中测定的新鲜样品的。比较在30g/l生物量时菌株的推断的的粘度数据示于图1中。
                   表1.嗜热菌比较的粘度
    菌株    时间(h)    生物量(g/l) 粘度(帕斯卡)
    米曲霉A1560     2443.551.5     34.136.927.6     0.4730.3990.217
    Thielaviaterrestris，E373     2443.5     28.233.5     0.0280.013
 嗜热毁丝霉，A421     2443.551.5     20.830.327.8     0.0450.0940.035
   Sporotrichumcellulophilum，ATCC20493     17.5244047     22.230.046.852.9     0.0650.0960.1440.178
    Thielaviaterrestris，ATCC2067     2440     6.151.1     0.0180.016
   Thermoascusthermophilus，A2050     404771.5112     17.422.431.636.6     0.0250.0370.0420.053
如数据所示，粘性高得多的菌株是对照米曲霉菌株。粘性最低的菌株是两种梭孢壳属菌株。这些菌株被观察到在发酵罐中易于混合和通气，并且显示出非常均匀分散的菌丝体，菌丝体形成密切相关的松散结构高度分支的菌丝体在生长期间连续被折断，既不形成大块也不形成聚集体。
毁丝霉属菌株非常类似梭孢壳属菌株，但给出伸长的较少分支的生长形式，产生稍微大一些的粘度。没有获得支顶孢属的测定值，但肉眼观察表明它表现出类似于梭孢壳属的形态和粘度。嗜热子囊菌属也显示出类似于梭孢壳属的好的形态。孢子丝菌属在形态学上也是好的，但产生大量的绿色色素，并且在这些发酵条件下开始裂解。Mucor pusilus不出现最优形态，具有大块菌丝体，未进行进一步分析。踝节菌属也未被进一步分析，因为其产生比其它菌株更高量的蛋白酶活性。表2说明在生物量的浓度为2-15g/l时测定的生长率和被试菌株在发酵罐中对蛋白酶的产生情况。从生长曲线估测生长率，其中从2-15g/l干生物量浓度(由过滤、干燥和称量滤器上剩下的重量测定生物量)观察到几乎线型生物量增加。
表2.在pH5 42℃下葡萄糖间歇发酵中的生长速率和蛋白酶形成
    菌株             相对于米曲      蛋白酶产生霉的生长率Thermoascus              1x      低蛋白酶thermophilusMucor pusilus            2.5x    非常高蛋白酶(全部)Myceliophthora           1x      非常高碱性蛋白酶thermophilaThielavia terrestris     3x      高酸性蛋白酶Acremonium alabamense    3x      高酸性蛋白酶Talaromyces emersonii    1x      非常高蛋白酶(主要是酸性)Sporotrichum             2x      某些蛋白酶(主要是酸cellulophilum                    性)
估计真菌形态和确定其是否适于浸没罐发酵的另一种方法是尝试获得非常高的生物量浓度。对单细胞生物体(例如大肠杆菌和酿酒酵母)，达到近l00g/l的生物量浓度是可能的，而对真菌达到大于75g/l的水平非常困难。米曲霉和黑曲霉的上限(由于高粘度和缺乏氧转移引起)是约50-60g/l。在浸没培养中试验以上所述的Thielavia terrestris E373和不形成芽孢的突变体。于pH5，42℃下在与以上所述的比较为双倍强度的间歇培养基(200g/l)中进行发酵。140小时后，不形成芽孢的突变体达到约90g/l的生物量(图3)。这是真菌发酵中异常高的生物量浓度，明显说明具有这一类型形态的菌株的优越性。II.异源基因在嗜热菌中的表达
A.选择标记载体  具有潮霉素B抗性标记的载体pJaL77用于转化宿主细胞。这一标记基于大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因，其在TAKA启动子控制下。简言之，按如下所述构建载体。从Boehringer Mannheim以质粒pHph-1购得赋予潮霉素B抗性的基因。经PCR使这一基因装配ATG密码子以及氨基和羧基末端的合适的限制位点，PCR采用的引物是：5’-GCT CAG AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCA ATG TCG CCTGAA CTC ACC GCG ACG TCT-3’(N-末端)和3’-CGT CCG AGG GCAAAG GAA TAG CTCCAG AGATCT CAG GCT-5’(C-末端)。用限制酶BamHI和XhoI切割PCR片段，克隆进曲霉属表达载体pToC68(如WO91/17243描述的)的相应位点，产生pJaL77。
通过将p3SR2(Hynes et al.，Mol.Cell.Biol.3(8)：1430-1439，1983)的2.7kb XbaI片段克隆进XbaI切割的脱磷酸化的pUC19质粒构建包含amdS标记的质粒pToC90。
B.表达载体载体pHD414是质粒p775(EP 238 023)的衍生物。与这一质粒相反，pHD414具有TAKA启动子和AMG终止子之间的一串单一限制位点。通过除去终止子3’末端的约200bp长片段(包含不需要的RE位点)，接着除去启动子5’末端的约250bp长片段(其也包含不需要的位点)构建该质粒。用NarI(位于pUC载体中)和XbaI(就在终止子3’)切割除去200bp区，接着用克列诺DNA聚合酶+dNTP填补产生末端，在凝胶上纯化载体片段并再连接载体片段。这一质粒称为pHD413。用StuI(位于启动子的5’末端)和PvuII(在pUC载体中)切割pHD413，在凝胶上分级分离并再连接，形成pHD414。包含pYES中约1100bp木聚糖酶HindII/XbaIcDNA片段的大肠杆菌菌株以DSM 6995在DSM保藏。经用HindII/XbaI切割从一个克隆分离木聚糖酶cDNA片段。经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱纯化该片段，为连接反应准备好。将所说的cDNA片段连接进pHD414产生pAXX40-1-1，其以NRRL B-21164保藏。所说的木聚糖酶基因以DSM(Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH)6995保藏。III.嗜热宿主的转化
除了指明的以外，下列一般性方案用于转化所有被试菌株：
用待转化菌株的菌丝体块(2cm直径)接种100mlMY51培养基(麦芽糖糊精，30g/l；七水硫酸镁，2g/l；K2PO4，10g/l；硫酸钾，2g/l；柠檬酸，2g/l；酵母膏，10g/l；AMG微量金属，0.5ml；尿素，1g/l；硫酸铵，2g/l；pH6.0)，于42℃振荡培养14小时。经米拉合金布(miracloth)过滤收获菌丝体，用200ml0.6M硫酸镁洗涤。将菌丝体悬浮在15毫升1.2M硫酸镁和10mM磷酸二氢钠(pH5.8)中。使悬液在冰上冷却，加入1ml包含120mg Novozyme_234的缓冲液。5分钟后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma H25型)，在轻轻搅拌下于30℃继续培养1-3小时(依据菌株而定)，直到在显微镜下观察时，样品中可见大量的原生质体。对支顶孢属和梭孢壳属，原生质体出现的效率(protoplastingefficiency)相对较低，这些菌株需要较长的培养时间(2-3小时)，直到获得转化的足够的原生质体。
悬液经米拉合金布过滤，将滤液转移到无菌管中，用5ml 0.6M山梨糖醇和100mM Tris-HCl(pH＝7.0)覆盖。在2500rpm下离心15分钟，从硫酸镁软垫顶部收集原生质体。将2体积STC(1.2M山梨糖醇，10mMTris-HCl pH＝7.5，10mM氯化钙)加到原生质体悬液中，在2500rpm下离心混合物5分钟。将原生质体悬液再悬浮到STC并再沉淀。重复这一操作，然后将原生质体再悬浮进0.1-1mlSTC中。
将100微升原生质体悬液与在10微升STC中的5-25微克合适的DNA混合。用pAXX40-1-1和含有选择标记的质粒共转化各菌株。质粒pToC90含有构巢曲霉amdS基因，用于转化和以乙酰胺为唯一氮源的生长选择。质粒pJaL77用于转化和潮霉素B(150微克/毫升)抗性选择。
将混合物置于室温下25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)，10mM氯化钙和10mM Tris-HCl(pH7.5)，小心混合两次，最后加入0.85ml相同的溶液并小心混合。将混合物置于室温下25分钟，在2500xg下离心15分钟，将沉淀再悬浮进2毫升1.2M山梨糖醇。在沉降一次以上后，将原生质体散布到合适的平板上。将原生质体散布到基本平板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113：51-56，1966)上，该平板包含1.0M蔗糖(pH＝7.0)，作为氮源的10mM乙酰胺(当amdS为选择标记时)和抑制基底生长的20mM CsCl。当hygB为选择标记时，培养基不同之点在于用10mM硝酸钠为氮源，并存在150微克/毫升潮霉素B。于42℃下培养选择平板5天。将所有在COVE选择培养基上生长的转化体转移到COV II(无氯化钙且蔗糖浓度为30g/l的COVE培养基)平板上，该平板含有AZCL-木聚糖(0.2％)和各自的选择试剂。由在真菌菌落中和其周围快速形成蓝色晕圈识别共转化体。表3给出了转化实验的结果和识别的共转化体的数量。
                  表3.嗜热菌转化的结果
    菌株    选择物  转化体数量 共转化体数量
  毁丝霉属     amdSHygB     420     180
  孢子丝菌属     amdSHygB     350     150
  梭孢壳属     amdSHygB     180     40
  枝顶孢属     amdSHygB     230     100
在所研究的任何嗜热真菌中潮霉素选择都不成功，可能是由于所说的启动子在这些菌株中无效。然而，用amdS选择，除了嗜热子囊菌属外在所有菌株中获得了转化体。共转化频率在20-40％之间。D.木聚糖酶在转化体中表达的估价
将由木聚糖酶平板试验识别的所有共转化体进行测定木聚糖酶产率的摇瓶振荡发酵估价。使用下列组成的M401培养基：麦芽糖糊精，50.0；七水硫酸镁，2.0；磷酸二氢钾，2.0；柠檬酸，4.0；酵母膏，8.0；AMG微量金属溶液，0.5ml；硫酸铵，2.0；尿素，1.0。于42℃振荡培养，从24小时开始每天测定木聚糖酶活性。用补充有柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH6.5)的0.2％-AZCL木聚糖(Megazyme Co.Australia)测定发酵液中的木聚糖酶活性。稀释培养液(通常是100倍)，将10微升稀释的培养液与1毫升0.2％-AZCL木聚糖底物混合。在42℃培养温育混合物30分钟。每5分钟充分混合反应混合物一次。培养结束时，经在10000rpm下离心5分钟沉淀未消化的底物。通过在595nm的吸收定量从这一底物释放的蓝色染料，从用已知活性的酶制剂制得的标准计算培养液的酶活性量。确定相对于在相同条件下制得的标准的内木聚糖酶单位(EXU)。也在相同的条件下培养未转化的菌株并与其转化体比较。
图2所示的数据(基于活性峰)说明所有未转化的菌株产生非常低水平的木聚糖酶活性，而某些转化体产生比未转化的菌株高达5-10倍的活性。用过的培养基的SDS-PAGE分析揭示出仅在转化体中存在22kd腐质霉属木聚糖酶蛋白质带(尽管水平很低)。这说明嗜热真菌中表达异源基因的潜能。木聚糖酶产产生能力顺序是以下顺序：毁丝霉属-孢子丝菌属-支顶孢属-梭孢壳属。E.表达载体的转化和整合证实
为了明确地说明表达载体的转化和整合，用从未转化的各菌株和其选择转化体分离的总DNA进行southern杂交。选择各菌株的两个最好的转化体用于southern杂交分析。用EcoRI消化从这些菌株分离的总基因组DNA，经1％琼脂糖凝胶分离DNA片段并进行印迹。因为梭孢壳属和支顶孢属代表相同菌株的有性和无性阶段，所以仅支顶孢属DNA用于杂交实验。首先用构巢曲霉amdS基因(用于转化的选择标记)探查印迹。结果表明仅在转化体中存在amdS基因，而在未转化的阴性对照中没有。在去掉amdS探针后，用Humicola insolens木聚糖酶cDNAD 1.2kb HindIII和XhoI片段再探查相同的印迹，结果为：仅支顶孢属转化体(而不是未转化菌株)显示出存在Humicola insolens cDNAD杂交带。未转化的毁丝霉属和孢子丝菌属以及它们的转化体显示出存在杂交到探针上的约2kb带(可能表示这些菌株中存在与Humicola insolens木聚糖酶基因有同源性的DNA序列)，而转化体还显示出另外的杂交到这一探针上的高分子量带。

Claims (21)

1.一种包含编码异源蛋白质的核酸序列的重组嗜热宿主细胞，该细胞是梭孢壳属、顶孢霉属、毁丝霉属或孢子丝菌属的成员。
2.权利要求1的细胞，其中所说的序列是可操作连接到启动子上的。
3.权利要求1的细胞，其中所说的蛋白质是真菌蛋白质。
4.权利要求3的细胞，其中所说的启动子是真菌启动子。
5.权利要求4的细胞，其中所说的启动子选自米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂肪酶启动子。
6.权利要求3的细胞，其中所说的蛋白质是真菌酶。
7.权利要求5的细胞，其中所说的酶选自过氧化氢酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化还原酶、纤维素酶、木聚糖酶、过氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角质酶、蛋白分解酶、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、溶果胶酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、壳质酶、mutanase和脱氧核糖核酸酶。
8.权利要求1的细胞，该细胞还包含选择标记。
9.权利要求7的细胞，其中所说的标记选自argB、trpC、pyrG、amdS、hygB、sC和glufosinate抗性。
10.一种产生目标蛋白质的方法，该方法包括在允许表达所述的蛋白质的条件下，培养重组嗜热宿主细胞，并且从培养液中回收所说的蛋白质，其中所说的细胞是梭孢壳属、顶孢霉属、毁丝霉属或孢子丝菌属的成员，包含可操作连接到启动子上之编码异源蛋白质的核酸序列。
11.权利要求10的方法，其中所说的蛋白质是真菌蛋白质。
12.权利要求10的方法，其中所说的启动子是真菌启动子。
13.权利要求10的方法，其中所说的蛋白质是真菌酶。
14.权利要求13的方法，其中所说的酶选自过氧化氢酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化还原酶、纤维素酶、木聚糖酶、过氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角质酶、蛋白分解酶、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、溶果胶酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、壳质酶、mutanase和脱氧核糖核酸酶。
15.权利要求10的方法，其中所说的细胞还包含选择标记。
16.权利要求15的方法，其中所说的标记选自argB、trpC、pyrG、amdS、hygB、sC和glufosinate抗性。
17.权利要求10的方法，其中所说的启动子选自米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂肪酶启动子。
18.权利要求13的方法，其中所说的宿主细胞是从Thielavia terrestris，Acremonium alabamense，嗜热毁丝霉或Sporotrichum cellulophilum获得的。
19.权利要求1的细胞，该细胞是从Thielavia terrestris，Acremoniumalabamense，嗜热毁丝霉或Sporotrichum cellulophilum获得的。
20.权利要求1的细胞，该细胞是从Thielavia terrestris获得的。
21.权利要求1的细胞，该细胞是从Thielavia terrestris的不形成孢子的突变体获得的。
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