CN1524120A - 超量产酶的转基因微生物 - Google Patents

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CN1524120A CNA018219810A CN01821981A CN1524120A CN 1524120 A CN1524120 A CN 1524120A CN A018219810 A CNA018219810 A CN A018219810A CN 01821981 A CN01821981 A CN 01821981A CN 1524120 A CN1524120 A CN 1524120A
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唐纳德·M·小马特森
黑尔姆・布林克豪斯
弗里德黑尔姆·布林克豪斯
L・彼得斯
兰迪·L·彼得斯
・西姆比耶达
史蒂文·西姆比耶达
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米歇尔·P·穆尔
尔・N・纳特西比德兹
努格扎尔·N·纳特西比德兹
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Abstract

本发明涉及一株经转化后超量产生α－半乳糖苷酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)。通过设计的PCR引物把α－半乳糖苷酶基因与纤维二糖水解酶基因的启动子和终止子相连，以便α－半乳糖苷酶能表达并从微生物中分泌出来。转化的微生物发酵培养后将α－半乳糖苷酶释放到上清液中，其酶活至少为20IU/ml。用大豆壳作为诱导物可以增加α－半乳糖苷酶的产量。上清液过滤浓缩后得到的液体产品可以添加到饲料和食品中，提高生物转化率。液体浓缩物也可以进行干燥，如喷雾干燥，以得到α－半乳糖苷酶干粉，这样可以延长产品的保质期。

Description

超量产酶的转基因微生物
                      发明背景
本发明广泛涉及超量产酶的转基因微生物，更具体地说，本发明涉及超量产酶、特别是α-半乳糖苷酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)(有时也被称作长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum))遗传转化体。
在欧洲和亚洲，根据动物饲料中所含谷物的种类添加不同的水解酶，这样做不仅可以提高饲料的转化率，还可增加牲畜加工后的利润，具有很强的商业可行性。添加的水解酶能够分解单胃动物不能完全消化的饲料中的复杂物质，如纤维素，半纤维素，植酸盐和α-半乳糖苷。有人曾尝试用大规模培养转基因生物的方法来生产大量的酶，而且分子和发酵技术也被用来开发可提高人和动物营养的具有附加值的蛋白质/酶产品。除这些技术外，本专利申请书还描述了获得高产酶的转基因微生物所需的几个基因表达盒的构建过程。
许多真细菌和真菌都分泌水解酶来分解它们周围环境中的复杂分子，产生更小的、更易被同化吸收的物质来供其生长所用(Coughlan，M.P.and L.G.Ljungdahl.1988.Comparative biochemistryof fungal and bacterial cellulolytic enzyme systems，11-30.In J.-P.Aubert，P.Beguin，and J.Millet(ed.)，Biochemistry and Genetics ofCellulose Degradation.Academic Press，San Diego，USA；Leschine，S.B.1995.Cellulose degradation in anaerobic environments. Annu.Rev. Microbiol.49：399-426)。用传统的遗传技术对自然界存在的野生菌株进行改造，得到的高产酶突变体已经在食品，饲料，纺织，烘烤和日用化学品工业中得到了商业应用(Eveleigh，D.E.and B.S.Montenecourt.1979.Increasing yields of extracellular enzymes. Adv. Appl.Microbiol.25：57-74；Ghosh，A.，B.K.Ghosh，H.TriminoVazquez，D.E.Eveleigh and B.S.Montenecourt.1984.Cellulase secretion from ahypercellulolytic mutant of Trichoderma reesei RUT-C30. Arch. Microbiol.140：126-133；Nieves，R.A.，C.l.Ehrman，W.S.Adney，R.T.Elander and M.E.Himmel.1998.Technical communication：survey andanalysis of commercial cellulase preparations suitable for biomassconversion to ethanol. World J.Microbiol.Biotechnol.14：301-304)。用传统遗传学技术改造的丝状真菌菌株所产生的蛋白量可以超过40g/升培养液，但其分泌的水解酶的性质和比例却没有显著的改变。而用分子生物学技术改造的菌株却可以从本质上对酶进行修饰，并且能够表达异源的基因(Harkki，A.，A.Mantyla，M.Penttila，S.Muttilainen，R.Buhler，P.Suominen，J.Knowles and H.Nevalainen.1991.Geneticengineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulaseprofiles. EnzymeMicrob.Technol.13：227-233；van Gorcom，R.F.，M.，P.J.Punt and C.A.M.J.J.van den Hondel.1994.Heterologous geneexpression inAspergillus，241-250.In K.A.Powell等(ed.)，The GenusAspergillus.Plenum Press，New York，USA)。特别是里氏木霉的cbhl(纤维二糖水解酶I)基因的强启动子已被广泛用于同源和异源表达系统中，驱动转基因的表达(Keranen，S.and M.Penttila.1995.Production of recombinant proteins in the filamentous fungusTrichoderma reesei. Curr.Biol.6：534-537)。
一个基因序列的精细结构特征，mRNA的稳定性和翻译效率，密码子选择的偏好，蛋白质折叠，宿主细胞蛋白酶对蛋白的降解和过量表达的蛋白对宿主的毒性都给目的蛋白的表达带来不可预知的负面影响。细胞生长特性，基因表达水平，胞内或分泌表达以及翻译后修饰也会影响细胞过量表达具有生物活性的重组蛋白的能力，而且这种影响不易预测与控制。特别是在某个特定的宿主细胞中过量表达一种特殊的蛋白时，重组DNA元件(cassette)的设计和构建就成为成功的主要决定因素(Makrides，S.C.1996.Strategies for achievinghigh-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol.Rev.60：512-538)。
在特定宿主细胞中表达特殊的目的蛋白所需的重组基因表达盒必须包括以下几个遗传组件：1)转录调节部分(启动子和终止子)；2)核糖体结合和翻译起始位点；3)蛋白质定位，在胞浆还是分泌到培养基中；4)用来挑选转化子的标记基因(Makrides，ibid.)。重组基因的高水平转录是重组蛋白高效表达所必需的。用高活性的启动子代替基因原来的内源性启动子可使蛋白的表达水平提高几倍。对转录过程的调控也有利于蛋白的表达，但却不是必需的。此外，在重组蛋白的N-末端加一个可切割的分泌信号可以使目的蛋白分泌到培养基中，从而简化蛋白的回收过程。抗生素抗性标记经常用作转化子筛选的遗传标记，但是考虑到人体致病菌中的抗性基因可能会因此而广泛传播，因此人们就开发了基于营养缺陷型突变株互补性的遗传标记。本专利申请书中所描述的表达盒利用了里氏木霉的cbh1基因的强启动子(包括Cbh I蛋白的信号肽序列)和终止子，并将它们连接到里氏木霉agl1(α-半乳糖苷酶)基因上。大肠杆菌的hph(潮霉素磷酸转移酶)基因也通过基因技术连接到表达盒上作为筛选标记(Carroll，A.M.，J.A.Sweigard and B.Valent.1994.Improved vectors for selectingresistance to hygromycin. Fungal Genet.Newsl.41：22)。
本专利申请书还描述了电穿孔(electroporation)作为一种遗传转化方法在基因导入并与宿主基因组整合中的用途。将外源DNA导入细胞的基因转移系统的发展是遗传学领域的一项革命，使人们可以在多种微生物中进行蛋白质的表达。一些真细菌(如枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌)天生就有吸收DNA的能力，而另一些种属(如大肠杆菌)必须通过化学诱导才能进入感受态。用电流加速DNA的吸收(电穿孔或电转化)极大地扩大了可以被转化的菌株的范围，而且使很多以前不能转化的生物也可以进行遗传操作了(Fiedler，S.and R.Wirth.1988.Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.Anal.Biochem.170：38-44)。将一定浓度的细胞和DNA混合，然后施加一个电压梯度，使细胞的脂质双层细胞膜上瞬时形成一些小孔，这样DNA就可通过被动扩散进入到细胞质中。但对于DNA整合到细胞基因组上或在细胞中进行自主复制的分子机制还没有完全搞清楚。
从20世纪80年代丝状真菌遗传转化的研究中发展了几种适用于链孢霉属，木霉属和曲霉属的可重复性方法(Penttil，M.，H.Nevalainen，M.Ratto，E.Salminen and J.Knowles.1987.A versatiletransformation system for the cellulolytic fungus Trichoderma reesei.Gene 61：155-164)。这些技术通常包括在一种渗透压稳定的溶液中，真菌细胞的细胞壁组分经酶消化后得到原生质体。然后把原生质体与DNA混合，DNA在CaCl2和聚乙二醇的帮助下进入细胞，其中的具体机制还不清楚。最后细胞壁再生，转化的菌株在一种选择培养基上生长。最近，电穿孔也已被用于丝状真菌原生质体DNA的吸收，不过转化的效率没有提高(Lemke，P.A.and M.Peng.1995.Geneticmanipulation of fungi by DNA-mediated transformation，109-139.In U.Kuck(ed.)，The Mycota II：Genetics and Biotechnology.Springer-Verlag，Berlin，Germany)。原生质体为基础的转化过程有很多不确定因素，如用来消化细胞壁所需的酶的活性，原生质体的脆性以及细胞壁再生困难等。
细胞或原生质体与DNA混合后在一个小电转杯中进行电穿孔试验，金属电极插在样品的两侧。高浓度的细胞(＞109/ml)悬浮在低电导缓冲液如水，10％甘油或者1M山梨醇中。电容器放电产生电脉冲，波形为指数衰变(Fiedler等，见上)。电极间的电压梯度是电场强度(E)，电场强度由V/d决定，其中V是施加电压，d是电极间的距离。电场强度是决定电穿孔是否成功最重要的参数，对于每个被转化的生物体要根据经验确定。
当电荷通过样品时，电极间的电压快速升高到最高初始电压(V0)，然后随时间下降。电压降至V0的1/e(～37％)所需要的时间称为时间常数，其为电穿孔的第二参数，在电穿孔时可以通过改变时间常数来提高转化的效率。时间常数，以毫秒计，由电阻(以欧姆计)和电容(以法拉计)决定，电阻和电容都可在电穿孔仪器上设定。样品的传导性能也会影响时间常数。电阻和电容的设定值必须由经验决定。
我们在这儿描述了里氏木霉，黑曲霉和A.awamori无性孢子(conidia)进行电穿孔遗传转化时，电学参数，生长条件和转化用DNA的拓扑学结构对转化效率的影响。在进行构巢曲菌(A.nidulans)和粗糙脉孢霉(N.crassa)的遗传转化时我们采用了无性孢子电穿孔而不是原生质体电穿孔技术(Chakraborty，B.N.，N.A.Patterson and M.Kapoor.1991.An electroporation-based system for high-efficiencytransformation of germinated conidia of filamentous fungi. Can.J. Microbiol.37：858-863；Sanchez，O.and J.Aguirre.1996.Efficienttransformation of Aspergillus nidulans by electroporation of germinatedconidia. Fungal Genet.Newslett.43：48-51)。
                       发明内容
本发明涉及高产酶、特别是α-半乳糖苷酶的里氏木霉遗传转化子。未被转化或者野生型的里氏木霉通常产生0.01～0.4IU/ml的α-半乳糖苷酶(Zeilinger，S.等.Conditions of formation，purification，andcharacterization of an a-galactosidase of Trichoderma reesei RUT C-30.Appl.Environ.Microbiol.59：1347-53)。用重组聚合酶链式反应(PCR)构建表达质粒，然后转化里氏木霉得到遗传转化子。转化后的里氏木霉在发酵罐(fermentor)中培养，诱导产生酶，之后从发酵液中分离目的酶蛋白。
更具体的说，我们制备的基因表达盒包括(a)编码目的酶氨基酸序列的DNA，(b)能够调控目的基因的mRNA在宿主细胞中表达转录的DNA序列和(c)另一个编码标记基因的DNA序列。在优选的实施方案中，里氏木霉的agl1(α-半乳糖苷酶I)，cbh1(纤维二糖水解酶I)和act(肌动蛋白)基因用PCR克隆之后用于构建基因表达元件。所述元件利用cbh1基因的启动子和终止子区域来驱动agl1的转录。大肠杆菌的hph基因编码潮霉素抗性基因，也连入每个基因表达盒中作为遗传转化中的选择性标记。
将α-半乳糖苷酶基因表达盒用电穿孔导入里氏木霉无性孢子中。把孢子和大量的基因表达盒放在一个电转杯中，然后施加一个延续时间和电场强度特定的电脉冲。结果表明获得木霉转化子的最适条件是40μl的样品，电场强度为15kV/cm，电转杯的电极间隔为0.1cm，时间常数为15ms，电容为50μF，电阻为300ohm。在木霉的电转化实验中用了两种形式的基因表达盒：线性和环形DNA。线性DNA的转化效率高于环形DNA。我们也对黑曲霉和A.awamori的无性孢子进行了电转化，不过最适条件稍有不同。部分萌发的黑曲霉孢子用水解酶处理后转化效率提高。遗传转化结果可以用PCR扩增验证，模板是从孢子或菌丝体中提取的基因组DNA，引物则用转化用DNA的特异性引物。
转化后的木霉属菌株被用于目的蛋白的发酵生产。根据宿主菌和最优的下游处理选择分批发酵(bach fermentation)，补料-分批发酵(fed-bach fermentation)或者连续发酵(continuous fermentation)方式进行发酵。在优选实施方案中使用了分批发酵，其中木霉属菌株把目的蛋白分泌到发酵液中。通过离心或过滤去掉细胞，然后浓缩上清液，利用喷雾干燥法得到目的蛋白，在优选的实施方案中为α-半乳糖苷酶。
在本说明书中所使用的术语“基因表达盒”(gene expressioncassette)是指一个线性或环状结构的基因，包括编码目的蛋白(与宿主细胞同源或异源的)氨基酸序列的DNA序列，调控目的基因在宿主中转录的DNA序列和另一个编码选择性标记的基因。
                    附图说明
图1：从里氏木霉RUT-C30总DNA中扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，第一道是DNA分子量标记，第二道是扩增的cbh1基因(～4.2kbp)，第三道是扩增的agl1基因(～1.6kbp)。
图2：用重组PCR改变与结构基因相连的基因调控序列的过程图示。
图3：从克隆的里氏木霉基因进行PCR扩增所得产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4：用重组PCR技术构建的里氏木霉agl1基因表达盒的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图5：α-半乳糖苷酶表达盒和质粒pKBE2001的详细图示，用重组PCR得到的连接区域也详细地显示出来。
图6：将里氏木霉RUT-C30重组质粒通过电穿孔转入里氏木霉后，用潮霉素B抗性标记进行筛选，对初步推测为转化子的菌株的基因组DNA进行PCR扩增所得产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图7：将质粒pKBE2002电转入A.awamori ATCC 11358和A.nigerKASN1后，用潮霉素B抗性标记进行筛选，之后对可能是转化子的菌株的基因组DNA进行PCR扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图8：本发明中用转化的菌株商品化生产α-半乳糖苷酶的发酵过程流程图。
                  具体实施方式
               实验1-表达盒的构建
        A.真菌和细菌菌株，培养基和培养条件
里氏木霉ATCC 56765(RUT-C30)由美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Manassas，VA.)提供。木霉通常以孢子形式保存在马铃薯葡聚糖琼脂斜面上(PDA；Sigma，St.Louis，MO)。为了分离总DNA方便，里氏木霉RUT-C30用Gaugy′s PM培养基(每升40.0g葡萄糖，2.0g酵母提取物，3.0g NaNO3，0.5g KCl，0.5g MgSO4·7 H2O，10mg FeSO4·7H2O和1.0g KH2PO4(Gaugy，D.andM.Fevre.1985.Regeneration and reversion of protoplasts from differentspecies of Penicillium. Microbios 44：285-293)培养。
木霉也可以用V8琼脂斜面(每升包括200ml V8原液(CampbellSoup Company，Camden，NJ)，1.5g CaCO3和15g BactoTM琼脂(BectonDickinson，Co.，Sparks，MD))培养。真菌还可以在InterLinkBiotechnologies，L.L.C.公司的ISP2培养基上生长(每升10.0g麦芽提取物，5.0g酵母提取物，1.0g Instant Ocean(Aquarium Systems，Mentor，OH)，10.0g土豆粉，5.0g葡萄糖和20.0g BactoTM琼脂)培养。真菌的培养温度为29℃，液体培养的转速为180-200rpm。
E.coli菌株XL1-blue MRF′(Stratagene，La Jolla，CA)和DH5α常用于克隆，载体的构建和质粒制备过程。E.coli菌株用Luria-Burtani(LB)培养基(每升10.0g NaCl，10.0g蛋白胨和5.0g酵母提取物)培养。在每升液体培养基中加入15g BactoTM琼脂就可制成LB固体培养基。细菌的培养温度为37℃，液体培养的转速为300rpm。
pCB1003质粒带有大肠杆菌的hph(潮霉素磷酸转移酶)基因，和所述hph基因可操作地连接于真菌基因贮藏中心(University ofKansas，Kansas City，Kansas)提供的构巢曲霉trpC基因启动子(Carroll等，见上)。根据需要向培养基中添加抗生素，对于细菌如大肠杆菌，通常每毫升培养基中添加10μg四环素或者50μg氨苄青霉素；而对于真菌菌株来说，一般添加100μg潮霉素B/ml培养基)。所有的培养基和试剂都需高压灭菌。
                     B.基因的克隆
E.coli质粒载体pBluescriptII KS+(Stratagene，La Jolla，CA)通常用于基因的克隆和表达载体的构建。DNA的限制性酶切消化，连接，琼脂糖凝胶纯化和定量都按标准的分子生物学方法来操作(Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Maniatis.1989.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，USA)。质粒和PCR产物的纯化，DNA修饰反应和从琼脂糖凝胶中回收DNA都使用商品化的试剂盒完成(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)。爱荷华州立大学的微化学专业的人员进行DNA序列的测定，并且用Lasergene软件包对序列进行组合和分析(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)。OLIGO软件程序(Molecular Biology Insights，Inc.，Cascade，CO)可帮助设计用于PCR和DNA序列测定的引物，而且利用该程序还可确定PCR反应的热循环条件。DNA引物设计以GenBank公共数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)或通过与爱荷华州立大学签订合同所获得的DNA序列资料为基础。
热稳定DNA聚合酶是从几个不同的来源购买的，使用时按厂家的建议，用他们所提供的反应缓冲液来进行PCR反应。我们用到的聚合酶包括：克隆的Pfu，PfuTurboTM，TaqPlus Precision和Taq2000TM(Stratagene，La Jolla，CA)，以及JumpStartTMTaq DNA聚合酶(Sigma，St.Louis，MO)。通常50ul PCR反应体系包括250ng的模板DNA，各种引物均为25pmol，各种脱氧核糖核酸均为10nmol，以及1.25～2.5个单位的DNA聚合酶，有时添加5％的DMSO有助于模板的变性。典型的热循环条件是：92-95℃变性10s～1min，在合适的温度下退火15s～1min，72℃延伸1min/kb扩增的DNA(Taq聚合酶)或者2min/kb扩增的DNA(Pfu聚合酶)，循环数为20-35)。PCR产物用0.6～2.0％琼脂糖凝胶分离，溴乙锭染色后，用紫外透射仪(305nm波长)观察并照相。
          C：里氏木霉RUT-C30总DNA的分离
从过夜培养的里氏木霉RUT-C30的培养液中分离总DNA。将大约107个孢子接种到50ml的Gaugy′s PM培养基中，29℃，200rpm培养72hr。然后取1ml培养物接种到50ml新鲜的Gaugy′s PM培养基中，29℃，200rpm培养22hr。从过夜培养的发酵液中离心分离菌丝体，然后重悬在5ml 1.2M山梨醇和100mM磷酸钾(pH5.6)组成的缓冲液中(其中还包括5mg/ml的Novozyme 234(Sigma，St.Louis，MO)，5mg/ml的Driselase(Sigma，St.Louis，MO)和100μg/ml的RNase(Sigma，St.Louis，MO))。30℃，200rpm温育2hr后，4,000xg离心10min收集原生质体。然后将原生质体重悬在1ml 1.2M山梨醇，50mM Tris缓冲液中(pH8)，缓冲液中还添加了50mM EDTA和50μl 20mg/ml的蛋白酶K(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)。将样品分为两等份(～600μl/份)，分别加入60μl 20％的SDS，温和地颠倒混匀15次。然后用600μl的苯酚(pH7.9)抽提两次，并且在第二次抽提前加入100μl的10mM Tris(pH8)-0.1mMEDTA(TE)缓冲液，使两相分离完全。之后样品再用酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)抽提两次，往水相中加入1/10体积(～75μl)3M的乙酸钠(pH 5.2)和2倍体积95％的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA集中Pasteur管的底部(Pasteur管底部为一个钩形结构)，空气干燥1min后将干燥的DNA溶于250μl无菌水中，然后沉淀，溶解，再次沉淀，溶解。-20℃过夜沉淀DNA，然后14,000xg离心20min收集并用500μl 70％的乙醇洗涤一次，空气干燥10min，用400ul TE重悬。然后将得到的里氏木霉RUT-C30 DNA(包括基因组DNA和线粒体DNA)溶液稀释200倍后，在260nm处测定吸光度，结果DNA浓度为280ng/μl，DNA总量为112μg。
                     D.基因克隆
利用PCR扩增从里氏木霉RUT-C30总DNA中克隆我们的目的基因-agl1(α-半乳糖苷酶)。在引物的5′端加上限制性内切酶的识别序列，这样扩增之后就可直接克隆到E.coli载体上(Scharf，S.J.1990.Cloning with PCR，84-91.In M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，andT.J.White(ed.)，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.Academic Press，San Diego，USA)。用同样的方法我们克隆了T.reesei的cbh1(纤维二糖水解酶I)和act(肌动蛋白)基因，随后和驱动结构基因转录的调控序列一起组装得到所需的基因表达盒。表一为克隆里氏木霉agl1，cbAl和act时所使用的引物序列。
表1：PCR扩增克隆基因使用的引物序列
基因1 Genbank序列号2  引物名称  引物序列3 Tm(℃)4  片断大小(bp)5
agl1 Z69253(Margolles-clark6)  tragl1.1  5’-TA GGTACCCATCTTCTACAGCGGACGGAGAG-3’ 60.7  1629
tragl1.2 5’-AT TCTAGATTTAGCAGGACAAGTCAGCCATAT-3’
 tregl1.2  5’-TAT GAATTCGACAGACCAGAGGCACGTCAAC-3’
cbh1 Z86235(Takashima7)和X69976(Wey8)  trcbh1.1  5’-TA TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTA-3’ 60.7  4216
 trcbh1.2  5’-TA GGTACCTTCATCTGAAGCCCCTGCCAGAGT-3’
act X75421(Matheucci9)  act3  5’-AT TCTAGACGAGCGAAGCAAACCCCCCCCAAA-3’ 63.2  394
 act5  5’-TA GGATCCGAGGCGGCGACAGGTGCACGTACC-3’
1 从里氏木霉RUT-C30总DNA中通过PCR反应扩增基因。
2 GenBank DNA序列资料可从NCBI(国家生物技术信息中心)获得，网址为http：//www.ncbi.nim.nih.gov/.
3 带有下划线的序列是为了克隆方便，在引物序列中加入的内切酶识别序列。GGATCC，Kpn I；TCTAGA，Xba I；AAGCTT，Hind III；GAATTC，EcoR I；GGATCC，BamH I.
4 PCR扩增时，里氏木霉RUT-C30模板DNA与引物的最适退火温度。
5 成功PCR产物的预期大小。
6 Margolles-Clark，E.，M.Tenkanen，E.Luonteri and M.Penttila.1996.Three a-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expressionin yeast. Eur.J.Biochem.240：104-111.
7 Takashima，S.，H.Iikura，A.Nakamura，H.Masaki and T.Uozumi.1996.Analysis of Crel binding sites in the Trichoderma reesei cbhl upstreamregion. FEMS Microbiol.Lett.145：361-366.
8 Wey，T.T.，T.H.Hseu and L.Huang.1994.Molecular cloning andsequence analysis of the cellobiolhydrolase I gene from Trichodermakoningii G-39. Curr.Microbiol.28：31-39.
9 Matheucci Jr.，E.，F.Henrique-Silva，S.El-Gogary，C.H.Rossini，A.Leite，J.E.Vera，J.C.Urioste，O.Crivellaro and H.El-Dorry.1995.Structure，organization and promoter expression of the actin encodinggene in Trichoderma reesei. Gene 161：103-106.
图1显示的是从里氏木霉RUT-C30总DNA进行PCR扩增1得产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。PCR后取2μl的样品加到0.6％的琼脂糖凝胶的加样孔中，20Volts/cm电泳25min，缓冲液为0.5％TAE。电泳之后，凝胶用1.5μg/ml的溴乙锭染色，然后用紫外透射仪观察核酸条带。在图1中，第一道是DNA分子量标准，第二道是扩增的cbh1基因(～4.2kbp)，第三道是agl1基因(～1.6kbp)。克隆的1有基因和调控序列通过测序进一步确定。
              E.目的酶表达载体的构建
在构建里氏木霉Agl1(α-半乳糖苷酶)表达用的重组DNA元件时，为了使基因调控序列和结构基因之间的连接精确，我们用长的重叠PCR引物进行了重组DNA扩增(表2和3；图2)(Higuchi，R.1990.Recombinant PCR，177183.In M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，and T.J.White(ed.)，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications.Academic Press，San Diego，USA)。里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子通过一系列的PCR反应连接到agl1基因上，代替内源性的启动子和终止子调节agl1基因的转录。
其中一个PCR反应是用引物cbag1和cbag2把与agl1基因5′端一致的序列加到Pcbh1基因的3′末端。Pcbh1片断包括cbhl转录起始密码子上游的500个核苷酸和cbhl结构基因中的前51个核苷酸，所述的51个核苷酸编码CbhI的信号肽部分。另一个PCR反应是用引物cbag5和cbag6把与agl1基因3′端一致的序列加到Tcbh1终止子的5′末端。前述的第一个PCR反应还在Pcbh1的5′端和Tcbh1的3′端引入了内切酶位点，以便将潮霉素B抗性标记基因连入。同样地，加到agl1 5′端的DNA序列与Pcbh1的3′端一致，agl1 3′端的DNA序列与Tcbh1的5′端一致(引物是cbag3和cbag4)。表2和图3列出了引物cbag1-6的核苷酸序列，这些引物分别为SEQ ID NO.1-6。
表2：用重组PCR组装里氏木霉agl1表达盒所用的引物
  引物名称   序列1    TM(℃)2   建立的连接3    片断大小(bp)4
  cbag1   5’-AT CTGCAGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATAC-3’     60.5   5’PstI    568
  cbag2   5’-ATCAGGCATCA CGATCGCACGAGCTGTGGCCAAGAA-3’   Pcbh1∷agl1
  cbag3   5’-GCCACAGCTCGTG CGATCGTGATGCCTGATGGAGTG-3’     64.4   Pcbh1∷agl1    1626
  cbag4   5’-TCGCACGGAGCTTTACCAGTTTCGGCACTTCTTGC-3’   agl1∷Tcbh1
  cbag5   5’-AGTGCCGAAACTGGTAAAGCTCCGTGCGAAAGCCT-3’     61.9   agl1∷Tcbh1    662
  cbag6   5’-AT GGATCCCTTGTGACGGTCCTCGGCTACGTTGTCATC-3’   3’BamH I
1 带有下划线的序列是为了克隆方便，在引物序列中加入的内切酶识别序列：CTGCAG，Pst I；CGATCG，Pvu I；GGATCC，BamH I.粗体显示的序列是agl1的结构基因。
2 PCR扩增时引物与模板退火的最适温度。
3 对于每对引物，给定的第一个连接是PCR产物5’端的新形成的DNA序列，第二个连接在3’端。
4 成功PCR扩增产物的预期大小。
图3显示了克隆的里氏木霉基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。PCR反应结束后取2μl的PCR产物加到0.6％的琼脂糖凝胶的加样孔中，20Volts/cm电泳25min，缓冲液为0.5％TAE。电泳之后，凝胶用1.5μg/ml的溴乙锭染色，然后用紫外透射仪观察核酸条带。在图1中，第一道是DNA分子量标准，第二道和第三道是以克隆的cbh1基因为模板，以cbag 1和cbag 2为引物扩增得到的568bp的Pcbh1片断，上样量分别是1μl和5μl；第四道和第五道是以克隆的agl1基因为模板，以cbag 3和cbag4为引物扩增得到的1.62kbp的agl1结构基因片断，上样量分别是1μl和5μl；第六道和第7道是以克隆的cbh1基因为模板，以cbag5和cbag6为引物扩增得到的662bp的Tcbh1片断，上样量分别是1μl和5μl。
第一轮PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳纯化后用作第二轮PCR反应的模板，其中启动子，结构基因和终止子片段以1∶1∶1的分子比组合。已经加到单个遗传组件上的5’和3’端序列作为连接子(adapter)，在结构基因和调控序列之间创造一个新的特异的连接。例如，从第一轮PCR反应得到的Pcbh1，agl1和Tcbh1的PCR产物混合后，用cbag1和cbag6引物扩增就可组装成2,795bp的agl1元件(图4)。
图4是利用重组PCR组装的里氏木霉agl1基因表达盒的琼脂糖凝胶电泳图谱。从前面的扩增反应中回收的Pcbh1，agl1和Tcbh1基因片段(图3)纯化后作为模板，用cbag1和cbag6再进行PCR扩增反应。PCR后取2μl的样品加到0.6％的琼脂糖凝胶中，20Volts/cm电泳25min，缓冲液为0.5％TAE。电泳之后，凝胶用1.5μg/ml的溴乙锭染色，然后用紫外透射仪观察核酸条带。图谱中的第一道是DNA分子量标准，第二道和第三道分别是1ul和5ul的PCR反应的样品，很明显，组合元件迁移到大约2.8kbp的位置。以类似的方式，我们将Pact(肌动蛋白基因启动子)和Tcbh1连接到带有hph基因的质粒pCB1003上，并加上相应的酶切位点(表3)。
表3：利用重组PCR技术克隆和组装HPH选择性标记使用的引物
  引物名称   序列1     TM(℃)2     建立的连接3     片断大小(bp)4
  hph3   5’-TA GGATCCATTGAAGGAGCATTTTTTGGGCTTGG-3’     61.5     5’BamH I     1393
  hph4   5’-AT TCTAGACTACTCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3’     3’XbaI
  acthph1   5’-AT GGATCCGGCCCGGAGTACCCCGAGCGAAGC-3’     61.5     5’BamH I     385
  acthph2   5’-TTCAGGCTTTTTCATGTGACTGATTAATGTATGAAGCTGAT-3’     Pact：hph
  acthph3   5’-ACATTAATCAGTCACATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3’     61.9     Pact：hph     1056
  acthph4   5’-CTTTCGCACGGAGCTTTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG-3’     hph：TcbhI
  acthph5   5’-CCGAGGGCAAAGGAATAAAGCTCCGTGCGAAAGCCTGAC-3’     59.6     hph：TcbhI     658
  acthph   5’-AT TCTAGAGACGGTCCTCGGCTACGTTGTCAT-3’     3’XbaI
1 带有下划线的序列是为了克隆方便，在引物序列中加入的内切酶的识别序列：GGATCC，BamH I；TCTAGA，Xba I；CGATCG，Pvu I；GGATCC，BamH I。粗体显示的序列是hph的结构基因。
2 PCR扩增时引物与模板退火的最适温度。
3对于每个引物对来说，所给的第一个连接是PCR产物5’端新形成的DNA序列，第二个连接则是3’端序列。
4 PCR扩增产物的预期大小。
agl1和hph重组元件分别组装，其中agl1重组元件带有Pst I和BamH I的酶切位点，而hph重组元件则带有BamH I和Xba I的酶切位点。酶切连接后得到的新的连接通过测序进一步验证。这样我们就利用BamH I将agl1基因元件插入到带有hph选择性标记基因的质粒上。目的基因和选择性标记基因可同时转录，并且目的基因位于标记基因的下游。图5显示的就是agl1表达盒通过BamH I位点插入到hph标记基因下游后组合而成的重组质粒pKBE2001，在Pst I和XbaI位点之间还有一段pbluescripeII KS+的序列。表4给出了构建这两个表达盒所需的遗传组件。
表4：几个遗传工程表达盒的遗传组件
 质粒名称1  目的酶2  表达盒的遗传组件3  元件大小(kbp)4
 pKBE2001  Agl1  PcbhI∷aglI∷TcbhI∷Pact∷hph∷TcbhI  4.83
 pKBE2002  Agl1  PcbhI∷aglI∷TcbhI∷PtrpC∷hph  4.18
1 在pBluescriptII KS+(Stratagene，La Jolla，CA)多克隆位点处组装表达盒
2 Egl I是里氏木霉的内切纤维素酶I，Agl I是里氏木霉的α-半乳糖苷酶I
3 表达盒的单个组分用PCR技术克隆后，再用重叠的“连接子”引物通过重组PCR组装得到。
4 每个组装完成的遗传工程表达盒的大小。
                     F.讨论
我们设计并构建了一个可在里氏木霉或其它丝状真菌中过量表达里氏木霉Agl I酶(α-半乳糖苷酶)的DNA基因元件。我们之所以选择里氏木霉作为遗传转化和蛋白表达的宿主菌株是因为它早就被用来生产商业应用的蛋白，安全性好，蛋白表达水平高而且可以很方便地进行基因操作和遗传转化。而曲霉也被广泛用于同源或异源蛋白的表达。
在转基因宿主细胞中，用来驱动重组基因转录的启动子序列是一个非常关键的因素。一般来说，丝状真菌基因启动子受控于一个复杂的全景式特异性基因调控网络，对于这种网络还没有清晰地描述和很好的理解。基因诱导和阻遏的分子机制可能涉及结合到启动子中特定的核苷酸序列上的蛋白和与RNA转录全酶复合体结合的转录因子。里氏木霉cbh1启动子就包括与阻遏和诱导基因转录的蛋白相结合的核苷酸基序(Ilmen，M.，M.-L.Onnela，S.Klemsdal，S.Keranen andM.Penttila.1996.Functional analysis of the cellobiohydrolase I promoterof the filamentous fungus Trichoderma reesei. Mol.Gen.Genet.253：303-314；van Gorcom等，supra)。在蛋白编码区域上游700～1500bp和翻译起始位点上游200bp的序列中就有至少6个与基因诱导有关的分解代谢阻遏物Crel的结合位点(Henrique-Silva，F.，S.El-Gogary，J.C.Carle-Urioste，E.Matheucci Jr.，O.Crivellaro and H.El-Dorry.1996.Tworegulatory regions controlling basal and cellulose-induced expression ofthe gene encoding cellobiohydrolase I of Trichoderma reesei are adjacentto its TATA box. Biochem.Biophys.Res.Commun.228：229-237)。在我们的表达盒中用到的cbh1启动子片断中没有分解代谢阻遏物的结合位点，但包含了所有已知的与转录诱导有关的位点，比如参与调节氮源代谢和pH的位点以及一些尚未证实的在各种生长条件下调控cbh1转录的位点。使用cbh1启动子时必须考虑到培养条件，要求能够诱导转录而不是抑制转录。与启动子相比，还不了解丝状真菌的基因的终止子序列的一级或二级结构的生物学意义。
在转化试验中可使用上述的α-半乳糖苷酶表达盒以生产过量表达α-半乳糖苷酶的转基因丝状真菌。
                     实验2-电穿孔
         A.真菌和细菌菌株、培养基和培养条件
里氏木霉ATCC 56765(RUT-C30)和A.awamori ATCC 11358来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。黑曲霉菌株KASN1由Kemin Biotechnology，L.C的生化小组分离得到。木霉通常以孢子形式保存在马铃薯葡聚糖琼脂斜面上(PDA；Sigma，St.Louis，MO)。曲霉属菌株也以孢子形式保存。木霉可以在V8琼脂斜面(每升包括200ml V8原液(Campbell SoupCompany，Camden，NJ)，1.5g CaCO3和15g BactoTM琼脂(BectonDickinson，Co.，Sparks，MD))上生长。真菌也可以用InterLinkBiotechnologies，L.L.C.公司的ISP2培养基(每升10.0g麦芽提取物，5.0g酵母提取物，1.0g Instant Ocean(Aquarium Systems，Mentor，OH)，10.0g土豆粉，5.0g葡萄糖和20.0g BactoTM琼脂)培养。真菌转化子筛选和电穿孔后的存活计数所用的培养基中需要添加0.1％的Triton X-100来限制克隆的生长。真菌的生长温度是29℃，液体培养的转速是180-200rpm。
E.coli菌株XL1-blue MRF′(Stratagene，La Jolla，CA)和DH5α常用于克隆，载体的构建和质粒的制备。E.coli菌株用Luria-Burtani(LB)培养基(每升10.0g NaCl，10.0g蛋白胨和5.0g酵母提取物)。在液体培养基中加入15g BactoTM琼脂/升就可制成LB固体培养基。细菌的培养的温度为37℃，液体培养转速为300rpm。
pCB1003质粒带有大肠杆菌的hph(潮霉素磷酸转移酶)基因和Fungal Genetics Stock Center(University of Kansas，Kansas City，Kansas)提供的构巢曲菌trpC基因的启动子序列(Sweigard，J.，F.Chumley，A.Carroll，L.Farrall and B.Valent.1997.A series of vectors for fungaltransformation. Fungal Genet.Newslett.44：52-53)。根据需要向培养基中添加不同的抗生素(一般细菌如大肠杆菌培养时，加入10μg四环素/ml或50μg氨苄青霉素/ml；真菌则一般加入100μg/ml的潮霉素B)，所有的培养基和试剂用高压灭菌消毒。
         B.用于电穿孔的目的酶表达盒的制备
按前面所说的，里氏木霉Agl 1(α-半乳糖苷酶)表达盒用长的重叠的PCR引物通过重组PCR技术来组装。E.coli的质粒载体pBluescript IIKS+(Stratagene，La Jolla，CA)用于重组元件的克隆。所有的DNA操作和分析都按标准过程进行，象质粒的纯化，PCR和DNA修饰反应产物的分离和从琼脂糖凝胶中回收DNA都使用商品化的试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)(Sambrook等，supra)。表4中列出了两个表达盒的遗传组件。
在T.reesei进行电穿孔试验前，表达盒要线性化，并用Pst I和Xba I内切酶使之从pKBE2001上消化下来。而曲霉电穿孔时则使用环状的pKBE2002。
             C.里氏木霉RUT-C30孢子的电穿孔
接种新鲜收集或冷冻保存的里氏木霉RUT-C30孢子到V8琼脂或者ISP2琼脂斜面上，30℃培养14天。然后把5ml的无菌水加到斜面培养基上，用一个微量加样器头(pipette tip)轻柔地刮取培养基表面的孢子。用Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)过滤除去孢子悬液中的碎片，稀释100倍后用血球计数器计数。从两个琼脂斜面收集的孢子悬液(10ml悬液)3500xg离心10min，然后用冷的1.2M山梨醇洗涤两次。之后用预冷的电转缓冲液(1.2M山梨醇，1％聚乙二醇重悬)，孢子浓度为2.5×109个/ml，40ul孢子悬液/1.5ml小离心管，放在冰上待用。每个样品中加入4～8ug的线性化的pKBE2001质粒，混匀后转移至0.1cm的电转杯中，先冰浴5min，再进行电转。Bio-Rad基因脉冲发生器II和脉冲控制调节器(Bio-Rad，Hercules，CA)提供作用电压和脉冲时间，用多种样品在很多不同试验中检测这两个参数对孢子转化的影响。电穿孔后，用1ml 1.2M的山梨醇洗涤后，取500ul涂PDA平板(75μg-100μg/ml潮霉素B)进行培养，筛选转化子。另外，把未电转的孢子稀释106倍后取双分各100ul铺PDA平板，用长出的克隆数与血球计得到的孢子数计算出芽百分比((克隆数/血球计得到的孢子数)×100＝％出芽率)。取双分的稀释105倍的电转后的孢子各100ul涂PDA平板，用长出的克隆的数目与未电转的孢子长出的克隆数计算杀伤率((1-(电转克隆数/未电转克隆数))×100＝％杀伤率)。通常30℃培养3天就可在选择性平板上观察到克隆，且新的克隆可不断出现直到保温11天。
               D.曲霉菌孢子的电穿孔
把新鲜收集或冷冻保存的黑曲霉KASN1或者A.awamori ATCC11358孢子接种到V8或者ISP2琼脂斜面上，30℃培养5～31天。然后加入5ml含有0.1％吐温80的无菌水到培养斜面上，用微量加样器头刮去表面的孢子，然后旋转震荡打散为孢子悬液，稀释1000倍计数。新鲜收集的孢子接种到盛有无菌的PD培养基(其中包含25μg/ml的2-脱氧-葡萄糖和10μg/ml的四环素)的锥形瓶中，接种体积为培养基体积的1/5，孢子浓度达到5×106个/ml。30℃培养2小时20分钟，转速为180～200rpm。这时孢子有点膨胀，再向培养液中加入β-葡糖醛酸(Sigma，St.Louis，MO)和Driselase(Sigma，St.Louis，MO)，终浓度分别是248U/ml和610μg/ml，然后继续震荡培养2个小时以上。6,000～8,000xg离心15min收集孢子，并用100ml冷的1.5M的山梨醇重悬。再离心沉淀，用35ml冷的山梨醇溶液洗涤，离心，之后再用10ml的山梨醇溶液洗涤，离心后重悬在1.2M冰冷的山梨醇溶液(通常用100-200μl)中，使孢子浓度达到2.5×109个/ml。在40μl的孢子悬液(总孢子数为108)中加入2～4μg的质粒pKBE2002(最大体积为5μl)，然后转移至电极间隔为0.1cm的电转杯中，冰上放置5min后进行电转。电转使用Bio-Rad基因脉冲发生器II和脉冲控制调节器(Bio-Rad，Hercules，CA)，通过采用多个样品的多次试验来测定其施加的电压和脉冲时间所产生的效果。电转后，加入1ml冷的PD培养基，1.2M山梨醇溶液并转移到1.5ml微量离心管中。高速离心后1min收集孢子，并用200μl PD培养基，1.2M山梨醇重悬沉淀。取100μl孢子悬液涂布有200μg/ml潮霉素B的ISP2平板，筛选转化子。把没有电转化的孢子稀释105倍后取双分各100ul铺PDA平板，用长出的克隆数与血球计得到的孢子数计算出芽率。取双分稀释104倍的电转后的孢子各100ul涂ISP2平板，用长出的克隆的数目与未电转的孢子长出的克隆数计算杀伤率。通常30℃培养3天就可在选择性平板上观察到克隆，且新的克隆可不断出现直到保温14天。
             E.木霉和曲霉遗传转化子的检测
把木霉或者曲霉电转后在潮霉素B选择性平板上长出的克隆，用无菌吸管转移到新鲜的PDA平板上。孢子形成后，再用无菌牙签转移到无菌的1.5ml离心管中，800瓦的微波处理3min。每个样品中加入30μl的TE(10mM Tris缓冲液，pH8，0.1mM EDTA)，剧烈震荡30秒。然后加入90μl Qiagen的凝胶抽提试剂(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，按使用手册回收总DNA，得到的纯化DNA最后溶解在50μl的EB(10mM Tris缓冲液，pH8)中。同样我们提取了里氏木霉RUT-C30，黑曲霉KASN1和A.awamori ATCC 11358等宿主菌的总DNA。每个纯化的DNA样品中取出0.5～2.5μl作为PCR反应的模板，引物为hph基因特异的引物(表6)。里氏木霉的actin基因的特异引物和质粒pCB1003(1ng)，表达盒中的hph基因分别用作阳性对照(Frohman，M.A.and G.R.Martin.1990.Detection of homologousrecombinants，228-236.In M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky and T.J.White(ed.)，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.Academic Press，San Diego，USA)。25μl的PCR反应体系除了模板外，还包括Taq 2000缓冲液(Strategene，LaJolla，CA)，5％DMSO，各引物的浓度为25pmol，每种脱氧核糖核酸10nmol和1.25单位的Taq 2000#DNA聚合酶。热循环条件是：94℃变性1min，然后93℃变性40s，58℃1min，72℃1min 10s，循环40次。
表6：遗传转化子的PCR筛选所用的引物
引物名称  特异性  序列 TM(℃)1  产物长度2
hph1  hph3基因，5’末端  5’-GCAAGGAATCGGTCAATACACT-3’ 58.9  550bp
hph2  hph基因，3’末端  5’-ACAGCCATCGGTCCAGAC-3’
act1  act4基因，5’末端  5’-GCGGGATCAAAGGGACAGATT-3’ 58.8  276bp
act2  act基因，3’末端  5’-GGAGGCTGATGGCGTTGTTAGA-3’
1 PCR扩增的最适退火温度。
2 PCR产物的预期大小。
3 克隆在pCB1003质粒中的E.coli hph基因的序列。
4 从GenBank得到的里氏木霉act基因，序列号为X75421。
          F.里氏木霉电穿孔条件的优化
里氏木霉RUT-C30孢子转化过程中涉及多个参数，改变这些参数并检测它们对转化的影响。作用电压及其作用时间是转化子形成非常关键的两个参数。孢子培养所用的培养基和电穿孔过程中所使用的渗透压稳定剂对转化的影响则较小。
RUT-C30孢子悬液与质粒pKBE2001(α-半乳糖苷酶表达盒)混合后进行电转，保持时间常数不变(大约15ms，电容为50μF，电阻是300Ohms)，电场强度在12.5kV/cm到22.5kV/cm之间变化。表7显示了不同电压下的转化产量和杀伤百分比。可以看到，当电场强度为15kV/cm时转化子产量最高，达到30个，孢子的死亡率为65％。
表7：电场强度对里氏木霉RUT-C30孢子转化的影响
KV/cm1  ％杀伤率2  转化子3
12.5  32  13
15.0  63  30
17.5  75  12
20.0  83  6
22.5  91  0
1电容为50uF，电阻是300Ohms，电转杯的电极间隔为0.1cm。
2杀伤百分比由电穿孔前后在平板上萌发生长的孢子数目决定。
3每个实验中表型转化子。
固定电场强度为15kV/cm，通过电容和电阻的变化来改变时间常数。表8给出了不同条件下的转化产量和百分比。结果表明在电场强度为15kV/cm，时间常数为14ms(电容为50μF，电阻为300Ohms)时转化子的产量最高，可以达到52个，而此时孢子的杀伤率为60％。因此在以后所有的实验中我们都把电场强度设置为15kV/cm，时间常数为14ms。
表8：时间常数对里氏木霉RUT-C30孢子转化的影响
 电容(μF)  电阻(Ohms)  时间常数(ms)1  ％杀伤率2  转化子数3
 50  100  5.1  32  8
 50  300  14  60  52
 50  500  17.5  88  18
1每个实验中的电场强度为15kV/cm。
2杀伤百分比由电穿孔前后在平板上萌发生长的孢子数目决定。
3每个实验中选择性平板上长出的克隆总数。
环形质粒pKBE2001和用Pst I和Xba I消化后的线性质粒对转化效率的影响也进行了检测。结果只有线性质粒电转里氏木霉孢子后有转化子长出，而环形质粒电转后没有形成转化子(数据没有显示)。
我们还检测了不同的培养基培养的里氏木霉RUT-C30孢子电转化效率的高低(表9)。V8琼脂上培养出的孢子数量最多，但转化效率却最低，每μg DNA只得到了一个转化子。与之相反，ISP2琼脂和PDA基质产生的孢子数远远少于V8，但转化效率却高的多，每μgDNA得到了12个转化子。
表9：培养基对里氏木霉RUT-C30孢子产量和转化效率的影响
 培养基  孢子数1  转化子数2
 V8琼脂  ＞5×108  0.5～1.2
 PDA  3.8～4.5×108  4～9
 ISP2  2.5～3×108  9～12.5
1孢子数是指用5ml无菌水从一个培养斜面上得到的孢子数目。
2转化子数是每ug DNA转化得到的转化子的数目。
为了制备真菌细胞原生质体或者提高某些细菌的电穿孔效率，经常在液体培养基中加入细胞壁弱化剂(Chakraborty等，见上；Fiedler等，见上)。我们测定了在固体培养基中加入2-脱氧-葡萄糖对孢子转化效率的影响。加到PDA培养基中的2-脱氧-葡萄糖的浓度分别为10、25、50和100μg/ml培养基，孢子长出后，用最优条件进行电穿孔试验。转化效率为3～7个转化子/μg DNA，但是加与不加2-脱氧-葡萄糖没有大的区别(数据未显示)。
电转后的孢子通常涂布在以1.2M山梨醇作为渗透压稳定剂的顶层琼脂培养基上。我们也使用了1摩尔的甘露醇和蔗糖作为渗透压稳定剂，不过转化产量与山梨醇相比并没有增加(数据未显示)。
               G.曲霉电穿孔过程的优化
我们检测了电穿孔方法和电学参数的改变对黑曲霉KASNI孢子转化的影响。试验中我们也用到了A.awamori ATCC 11358孢子，但对其电转条件没有进行优化。与里氏木霉孢子电穿孔试验相似，电场强度和持续时间对转化子的产生非常关键，而且在电穿孔前先用酶对孢子进行了处理。
部分萌发的，酶处理过的KASN1孢子与2～4μg环形质粒pKBE2002(α-半乳糖苷酶表达盒)混合后进行电转，电场强度为10.0kV/cm～22.5kV/cm，脉冲时间由电容和电阻决定，所使用的电容为25μF，电阻为200、400或600Ohms。表10显示了不同电学参数下的转化产量。可以看到电场强度为12.5kV/cm，电阻为400Ohms和电压为25μF(时间常数＝9.1ms)时的电转化产量最高，而且此时孢子的减少率为61％。
表10：电场强度和脉冲持续时间对黑曲霉菌株KASN1电转的影响
 KV/cm1             转化子数2
 200Ohms3  400Ohms  600Ohms
 10.0  1  ND  0
 12.5  1  16  1
 15.0  0  10  0
 17.5  3  8  0
 20.0  1  3  0
 22.5  ND4  6  ND
1电场强度由仪器的设置和电转杯的内径决定。
2不同条件下一个试验中在选择性平板上长出的克隆总数，每种条件下的实验进行两次。
3所有试验的电容为25μF。
4未测定。
我们还检测了在最适电学条件下，分别用葡糖醛酸酶和Driselase对孢子进行预处理对转化效率的影响。孢子在含有2-脱氧葡萄糖的PD培养基中孵育2小时20分钟后，加入葡糖醛酸酶和Driselase，浓度分别为347U/ml和860μg/ml，248U/ml和610μg/ml，184U/ml和460μg/ml。继续孵育两个小时后，离心洗涤孢子，进行电穿孔试验。实验表明当葡糖醛酸酶浓度为248U/ml，Driselase浓度为610μg/ml时结果最好(表11)。
表11：酶预处理对黑曲霉孢子转化的影响
酶1                  转化子数2
12.5KV/cm3  15KV/cm  17.5KV/cm
高 1  0  0
中 16  10  8
低 4  7  0
1高＝葡糖醛酸酶347U/ml和Driselase 860μg/ml；中＝葡糖醛酸酶248U/ml和Driselase 610μg/ml；低＝葡糖醛酸酶184U/ml和Driselase 460μg/ml。
2选择性平板上长出的克隆总数。
3每个试验的电容为25μF，电阻为400Ohms。
           H.木霉和曲霉遗传转化结果的检测
用线性质粒pKBE2001转化木霉后得到的潮霉素抗性表型克隆，其孢子或者菌丝体中提取基因组DNA，用PCR扩增来检测遗传转化的结果(图6)。用于DNA扩增的引物是hph基因和agl1表达克隆的特异引物，对照为里氏木霉actin基因。大约20％推定的转化子中能检测到hph基因(图6：550bp的带)，而在hph阳性的菌株中通常都能检测到agl1表达克隆(图6：476bp的带)。在几个hph阳性的菌株中没有检测到(数据未显示)，这表明重组时表达载体中的各组分没有连接好或者在插入到基因组后agl1表达克隆被剪切掉了。
曲霉转化后得到的潮霉素抗性表型的克隆培养后，收集其孢子或者菌丝体，提取基因组DNA，用PCR扩增验证遗传转化的结果(图7)。用于hph基因检测的引物与木霉的相同。检测的两个A.awamoriATCC 11358推定的转化子(图7：第3和4道，550的带)和三个带有潮霉素抗性的黑曲霉KASN1菌株(图7：第6、7和8道，550bp的带)都是hph阳性。经pKBE2000质粒电转入并经潮霉素B抗性筛选得到的推定的A.awamori ATCC 11358和黑曲霉KASN1中提取基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，所得产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。取10μl PCR产物，加到1％的琼脂糖凝胶中，20Volts/cm电泳25min。然后凝胶用溴乙锭染色，紫外透射仪观察。hph基因大小为550bp。M道为DNA分子量标准；第一道是质粒pKBE2002；第2道，A.awamori ATCC 11358；第3道，A.awamori#1；第4道，A.awamori#2；第5道，黑曲霉KASN1；第6道，黑曲霉#1；第7道，黑曲霉#2；第8道，黑曲霉#3。
                       I.讨论
本说明书描述了以孢子电穿孔技术为基础，以木霉和曲霉为宿主菌的遗传转化系统。转化DNA包括一个过量表达α-半乳糖苷酶(有重要商业价值的酶)的重组基因表达盒，其中还包括一个编码潮霉素B的抗性基因用作显性筛选标记。
木霉孢子电转化的最适条件为电场强度15kV/cm，时间常数为15ms，电容50μF和电阻300Ohms。而长枝木霉和T.harzianum原生质体电转化的最适条件是2.8kV/cm，25μF和800Ohms(Goldman，G.H.，M.van Montagu and A.Herrera-Estrella.1990.Transformation ofTrichoderma harzianum by high-voltage electric pulse. Curr.Genet.17：169-174；Sanchez-Torres，P.，R.Gonz lez，J.A.P rez-Gonz lez，L.Gonzlez-Candelas and D.Ramon.1994.Development of a transformationsystem for Trichoderma longibrachiatum and its use for constructingmulticopy transformants for the egll gene.Appl.Microbiol.Biotechnol.41：440-446)。很明显，与原生质体的脂质双层膜比起来，孢子的外层包被蛋白对于DNA进入的阻碍更大，因此电转时需要使用更大的电场强度。不过，孢子电穿孔后得到的转化子数量与原生质体电穿孔相似，为0.5～5个转化子/μg DNA。我们实验室在随后的实验中转化效率达到了150个转化子/μg DNA，与聚乙二醇介导的木霉属原生质体转化得到的转化子数为同一数量级(数据未显示)(Gruber，F.，J.Visser，C.P.Kubicek and L.H.de Graaff.1990.The development of a heterologoustransformation system for the cellulolytic fungus Trichoderma reeseibased in a pyrG-negative mutant strain. Curr.Genet.18：71-76；Penttila等，见上)。与原生质体相比，孢子电穿孔的优势在于孢子的制备不仅简单，而且生存力不会因为处理而降低。
在黑曲霉和A.awamori孢子电转时，必须先使孢子部分萌发，并用酶进行预处理后才能保证电转成功。我们用248U/ml的P-葡糖醛酸酶和610μg/ml的Driselase(包括地衣多糖酶，木聚糖酶和纤维素酶)处理孢子后，再进行电穿孔，条件为电场强度为12.5kV/cm，电容25μF和电阻400Ohms，结果电转化效率为5-6个转化子/μg DNA。我们用同样的方法电转了几种不同的真菌孢子，当部分萌发的孢子用1mg/ml的β-葡糖醛酸糖苷酶(大约100-1000U/ml的β-葡糖醛酸糖苷酶)预处理后，转化子的数量可以高达21个/μg DNA(Chakraborty等，见上；Sanchez等，见上)。除了构巢曲菌需要一个更低的电场强度，即5kV/cm(Sanchez等，见上)外，我们的最佳电学参数与用于其它真菌萌发孢子的相似。聚乙二醇介导的黑曲霉原生质体转化和黑曲霉孢子电转化的效率差不多(Ward，M.，K.H.Kodama and L.J.Wilson.1989.Transformation of Aspergillus awamori and A.niger byelectroporation. Exp.Mycol.13：289-293)。然而对于曲霉和木霉来说，其孢子的电转化过程比原生质体转化简单方便。
遗传转化后的丝状真菌的有丝分裂稳定性在不同种属中有1不同。比如100％T.harzianum的遗传转化子在没有选择压力的情况下繁殖几代后仍保持其转基因特性，而只有20％～80％的长枝木霉和里氏木霉转化子为稳定转化(Gruber等，见上；Sanchez-Torres等，见上)。与以前的结果一致，我们发现当带有hph选择性标记的显型里氏木霉转化子在无潮霉素B条件下培养之后，提取其基因组DNA进行PCR扩增，结果只有20％的转化子还有hph基因。而曲霉转基因菌株在没有选择压力的情况下稳定性要好得多(Sanchez-Torres等，见上)。虽然我们的样品量比较小，但是PCR扩增结果显示我们得到的5个显型的曲霉转化子都带有hph基因。
本专利申请中所描述的遗传转化操作和基因表达盒构建技术是重组DNA技术的基石，利用这两种技术，可以获得过量表达商品酶和蛋白的转基因微生物。有效的基因转化方法能提供大量的转基因微生物，然后经过酶/蛋白过量表达筛选，就可从中发现有潜力的生产菌株。
                    实验3-发酵生产
                      A.种子培养
按以上所述的遗传转化方法得到的里氏木霉菌株KBT2147被用作种子菌株。我们通过一系列的实验来优化发酵过程，生产大量的α-半乳糖苷酶。表12列出了真菌种子培养所用的培养介质。各组分的量是指每升培养基中的最大量。
表12-可溶的种子培养基
组分  含量
(NH4)2SO4  1.4g
KH2PO4  2.0g
尿素  0.3g
MgSO4(7H2O)  0.3g
FeSO4(7H2O)  0.005g
MnSO4(H2O)  0.0016g
ZnSO4(7H2O)  0.0014g
CoCl2(6H2O)  0.002g
蛋白胨  1.0g
吐温80  2.0g
葡萄糖  20.0g
纯水  1000.0g
在发酵罐中培养时可能需要添加0.01％的消泡剂。而氢氧化铵，氨气，O-磷酸，氢氧化钠，CO2，O2和/或压缩空气则可调节培养基的pH和可溶氧水平使其保持在理想水平。下面的表13中列出了真菌种子培养1需的培养基，各组分的量是指每升培养基中的最大量。
表13-V8琼脂培养基
    组分     含量
  V8原浆   200.0mL
  CaCO3   1.5g
  Bacto琼脂   15.0g
  纯水   1000.0g
                 B.发酵生长培养基
表14为用于α-半乳糖苷酶生产的培养基，各组分的量是指每升培养基中的最大量。
表14-生长介质
 组分 含量
 (NH4)2SO4 1.4g
 KH2PO4 2.0g
 尿素 0.3g
 MgSO4(7H2O) 0.3g
 FeSO4(7H2O) 0.005g
 MnSO4(H2O) 0.0016g
 ZnSO4(7H2O) 0.0014g
 CoCl2(6H2O) 0.002g
 蛋白胨 1.0g
 吐温80 2.0g
 α-乳糖 11.0g
 生物素 0.005g
 CaCl2 0.3g
 玉米浸出液 5.0g
 大豆壳 5.0g
 纯水 1000.0g
              C.培养、接种和收获的方法
根据培养体积不同选择合适大小的容器，如锥形瓶或发酵罐进行发酵培养。母种和生产种保存物放于-20℃或更低的温度。
接种体积通常在大约0.01％～大约10％之间，优选为大约0.05％～大约0.5％。把冷冻或者新鲜的培养物按合适的比例接种到培养基中，29℃±2℃培养18～144小时。通过测定生物量(即湿重)检测真菌的生长状况。如果真菌的生长不理想，则弃之不用。在收获之前，培养物要经肉眼检查以确定是否存在被污染的迹象。只有当培养物中的细菌和/或真菌污染物的量在可接受范围之内时才能收获。从接种到收获的最短时间为三天，最长为十天。然后将培养物转移到一个无菌容器中。
                     D.产品制备
通过离心，或优选地通过超滤或结合使用这两种方法浓缩收获的真菌培养物，使之浓缩至原来的50倍。浓缩后，加入山梨酸钾作为防腐剂或者稳定剂，山梨酸钾的浓度不超过0.1％。浓缩物可以以液体形式保存在大约2℃～大约7℃，或优选地通过130℃喷雾干燥后保存。干燥处理的浓缩物在通常的保存温度下可以保存两个月以上，可以达到一年或更长时间，而且效率不会降低。里氏木霉喷雾干燥的产品用碳酸钙(CaCO3)稀释使其达到理想的水平和活力。举个例子说，终产品为2500Kg，活力为12,000IU/mL，如果添加500Kg的碳酸钙，则可使其活力达到10,000IU/mL。
                   E.样品的发酵
用母种制备两个工作种子。母种(X)用V8琼脂斜面传代，然后收集第X+2代作为工作种子(X+2)，随后继续在V8琼脂斜面上传代培养。收集第X+4代作为(X+4)工作种子。把母种和工作种子冷冻保存。一般说来，2,500ml的Erlenmeyer锥形瓶中可以装1,000ml的NN种子培养基，接种量为1ml/烧瓶。
100L的发酵过程一般如下。29℃，200rpm种子培养40～52小时，然后按1％的接种比例把种子培养物接种到100,000ml的α-半乳糖苷酶发酵培养基中。在ABEC 150L的发酵罐中培养大约144小时，然后添加20％的半乳糖溶液，流加速度为0.2g/L/hr。发酵过程中需要添加大约50ml的止泡剂。发酵时使用了4个导流板和两个Rhuston叶轮。发酵罐的转速以使培养液中溶解氧的浓度保持在10％左右为宜，一般最大转速为150rpm。29℃发酵培养40～48小时后，把温度降低到27℃进入发酵持续期。培养液的pH可以自然降低，只要不超过设置的pH范围即可。然后用25％的氢氧化铵调节，使发酵持续期的pH维持在4.0。
5,000L发酵过程的流程如下。按1％的接种比例把1000ml的种子培养物接种到100,000ml的α-半乳糖苷酶发酵培养基中，在ABEC150L的发酵罐中孵育大约24小时。然后把50L的种子培养物再接种到5000L的α-半乳糖苷酶发酵培养基中，在ABEC 7500L的发酵罐中孵育大约144小时。后面的操作与100L发酵培养的过程相同。
用改进的Lowry蛋白分析法(Sigma)测定蛋白量。按照FoodChemical Codex，第四版(1996)第794-95页的方法，以PNPG为底物在37℃测定α-半乳糖苷酶活性。在整个发酵过程中，经常取样测定湿重。取1ml样品，13,000rpm离心5min，弃上清，颠倒干燥，注意在称重之前一定去掉壁上残留的上清。
接种后培养144小时后收获培养物，并把培养物的温度降至20℃。培养物用Alpha-Laval连续流式离心机以8L/min离心，上清通过中空纤维过滤器浓缩10～20倍(截流分子量为10,000，AG技术公司)。用水漂洗浓缩物，并把漂洗液添加到浓缩物中。浓缩物再次离心以去掉污染物或残留的生物量。在液体或者固体浓缩物中加入山梨酸钾，使其终浓度为0.1％，或者在液体浓缩物中加入终浓度为10％的山梨醇。最终产品中α-半乳糖苷酶的活力不低于1,000IU/g。图8所示是里氏木霉转化子大量生产α-半乳糖苷酶的优选实施方式中的流程图。
通过发酵试验确定α-半乳糖苷酶发酵生产的最优参数。这些参数在发酵的整个过程中不断调整。表15列出了三个100L和一个5000L发酵罐的发酵和下游加工的结果。表16则提供了这些发酵过程最终的液体发酵产品的分析数据。
批次1(100L)：接种后120小时检测发酵罐中的污染情况，结果活菌量为3×103个/ml。污染物的水平在下游加工过程中不断降低直至最终的混合完成。导入发酵罐中的最大空气流量为45L/min。最初72小时溶解氧含量平均为15％。培养物在生长最初的48小时并没有表现出典型的pH变化，因为没有看到pH的二次升高。pH自动控制仪把pH调节到pH 4.0之后就失效了，因此只能人工调节pH使之维持在4.0，在接种后的48到120小时共调节了四次，而且两次循环之间pH仍缓慢的降低。
批次2(100L)：发酵罐中没有检测到污染。在下游加工过程的一个阶段，活菌量达到了7.5×102个/ml。最大空气流量为70L/min，最初72小时溶解氧的平均含量为15％。发酵罐的转速控制设定得不正确，使得发酵罐150rpm培养了大约12个小时。
批次3(100L)：发酵罐中没有检测到污染。最大空气流量为73L/min，最初72小时溶解氧的平均含量为50％。pH自动控制仪把pH调节到pH4.0之后就失效了。培养物的pH降到了2.8，在被重新调节到4.0之前维持了大约30小时，因此在发酵期间发酵pH值为3.75。发酵培养的转速也是150rpm，以控制溶解氧的含量。
批次4(5,000L)：发酵罐中没有检测到污染。最大空气流量为3,000L/min，最初72小时溶解氧的平均含量大约是100％。
表15-发酵和下游加工的液体结果
        鉴定批次#      1      2      3      4
  种子培养时间(小时)     51.0     52.0     40.0     40.0
  种子湿重(mg/ml)     18.9     20.6     -     17.8
  传代次数     X+6     X+6     X+2     X+3
  总的生长时间(小时)     144     144     144     144
  最低pH     2.89     2.95     2.99     3.31
  (1X)湿重(mg/ml)     116     141     157     213
  (1X)α-半乳糖苷酶(IU/ml)     123     155     156.11     210
  (1X)蛋白(mg/ml)     9.45     9.86     15.94     ND
  补料体积(ml)     14,000     14,000     16,000     740,000
  补料时间(小时)     98     99.5     92.75     106.5
  补料速度(g/L/hr)     0.286     0.281     0.345     0.278
  浓度     15.34     19.35     13.79     10.74
  浓缩体积(ml)     6,973     5,168     6,744     424,000
  浓缩蛋白(mg/ml)     118.47     132.76     123.62     ND
  浓缩α-半乳糖苷酶(IU/ml)     1,674     1,937     1,900     2,537
  ％蛋白损失     13％     30％     48％     ND
  ％α-半乳糖苷酶损失     5％     35％     18％     7％
  终产品体积(ml)     9,518     8,875     8,833     ND
表16-分析配制的产物
     鉴定批次#     1     2     3      4
  α-半乳糖苷酶    1228    1308    1083    ＞1000
  USP 51无菌检测    失败    失败    失败    失败
  存活量    1,500    740,000    100    ND
  山梨醇    10.2    9.75    9.82    ND
  蛋白％    6.84    7.17    5.04    ND
  沙门氏菌    ND    ND    ND    ND
  大肠菌    ND    ND    ND    ND
  黄曲霉素(ppm)    ＜20    ＜20    ＜20    ＜20
  烟曲霉毒素(ppm)    ＜0.03    ＜0.03    ＜0.03    ＜0.03
  T-2(ppb)    ＜500    ＜500    ＜500    ＜500
  呕吐毒素(Vomitoxin)(ppm)    ＜1    ＜1    ＜1    ＜1
  玉米赤霉烯酮(ppb)    ＜1,000    ＜1,000    ＜1,000    ＜1,000
  红霉素    ND    ND    ND    ND
  青霉素    ND    ND    ND    ND
  氨苄青霉素    ND    ND    ND    ND
  链霉素    ND    ND    ND    ND
  四环素    ND    ND    ND    ND
尽管通过前述实施例已对本发明进行了相当详细的描述，但这些细节只是为举例说明。在不偏离所附权利要求书中描述的本发明精神和范围的前提下，本领于一般技术人员可以进行很多修饰和改良。
                               序列表
<110>凯敏工业公司
<120>超量产酶的转基因微生物
<130>USDAVB0003
<150>US 09/713,588
<151>2000-11-15
<160>6
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>木霉属
<400>1
atctgcagta tcgtgtaagg aggtttgtct gccgatac                          38
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>木霉属
<400>2
atcaggcatc acgatcgcac gagctgtggc caagaa                            36
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>木霉属
<400>3
gccacagctc gtgcgatcgt gatgcctgat ggagtg                            36
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>木霉属
<400>4
tcgcacggag ctttaccagt ttcggcactt cttgc                             35
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>木霉属
<400>5
 agtgccgaaa ctggtaaagc tccgtgcgaa agcct                            35
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>木霉属
<400>6
atggatccct tgtgacggtc ctcggctacg ttgtcatc                          38

Claims (17)

1.分离的丝状真菌，其表达的α-半乳糖苷酶的量比野生型菌株里氏木霉RUT-C30至少高5倍。
2.分离的丝状真菌，当用生产发酵培养基培养时，其表达的α-半乳糖苷酶活性至少为20IU/ml上清夜。
3.权利要求1的分离的真菌，其进一步包含多个拷贝的整合入其中的、来自里氏木霉的Agl1基因。
4.权利要求3的分离的真菌，其中Agl1基因可操纵地连接于至少一个调控序列，所述调控序列指导该Agl1基因的过量表达。
5.过量生产α-半乳糖苷酶的方法，其包含在合适的生长培养基中、在真菌可产生α-半乳糖苷酶的条件下培养权利要求1的丝状真菌的步骤。
6.权利要求5的方法，其中所述的生长培养基包括大豆壳。
7.权利要求5的方法，其进一步包含以浓缩物的形式分离α-半乳糖苷酶的步骤。
8.权利要求6的方法，其中所述的浓缩物被干燥。
9.用于转化丝状真菌的表达盒，其包含可操纵地连接到木霉α-半乳糖苷酶I基因上的木霉纤维二糖水解酶I基因的启动子和终止子。
10.权利要求9的表达盒，其中具有SEQ ID NO.2和3的核酸的重叠PCR引物包含所述纤维二糖水解酶I基因启动子和所述α-半乳糖苷酶I基因之间的连接部分。
11.权利要求9的表达盒，其中具有SEQ ID NO.4和5的核酸的重叠PCR引物包含所述纤维二糖水解酶I基因终止子和所述α-半乳糖苷酶I基因之间的连接部分。
12.权利要求1的真菌，其中所述的丝状真菌是里氏木霉菌株。
13.权利要求2的真菌，其中所述的丝状真菌是里氏木霉菌株。
14.转化的真菌细胞，其包含权利要求9的表达盒。
15.丝状宿主细胞的转化方法，该方法能够使所述的宿主细胞表达的α-半乳糖苷酶的水平比野生型的木霉高至少5倍，所述方法包含以下步骤：
(a)用权利要求9的表达盒处理宿主细胞，其条件为能够使所述的α-半乳糖苷酶I基因和所述的可操纵地连接的纤维二糖水解酶I基因的启动子和终止子整合到所述细胞的基因组中，从而完成细胞的转化；以及
(b)分离所述的过量表达和分泌该α-半乳糖苷酶的转化细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述的宿主细胞是里氏木霉。
17.生产α-半乳糖苷酶的方法，其包含在适合产生所述的α-半乳糖苷酶的条件下培养权利要求15的转化细胞并分离所述的α-半乳糖苷酶的步骤。
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