CN101663384B - 包含α-半乳糖苷酶的清洁组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含分离的α-半乳糖苷酶的清洁组合物。在一些特别优选的实施方案中，所述分离α-半乳糖苷酶包含与来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的α-半乳糖苷酶相关的氨基酸序列。本发明也提供在清洁应用中使用所述α-半乳糖苷酶的方法。

Description

包含α-半乳糖苷酶的清洁组合物
发明领域
本发明提供包含分离的α-半乳糖苷酶的清洁组合物。在一些特别优选的实施方案中，所述的分离α-半乳糖苷酶包含与来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的α-半乳糖苷酶相关的氨基酸序列。本发明也提供在清洁应用中使用该α-半乳糖苷酶的方法。
发明背景
洗涤剂和其他清洁组合物经常包括活性成分的复杂组合。例如，某些清洁产品含有表面活性剂系统、清洁用酶、漂白剂、助洗剂、抑泡剂、悬污剂、脱污剂、荧光增白剂、柔软剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀菌剂和香料。尽管当前洗涤剂复杂，不过仍存在难以去除的众多污渍。
发明简述
本发明提供了包含分离的α-半乳糖苷酶的清洁组合物。在一些特别优选的实施方案中，所述的分离α-半乳糖苷酶包含与来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的α-半乳糖苷酶相关的氨基酸序列。本发明也提供在清洁应用中使用这种α-半乳糖苷酶的方法。在一些实施方案中，所述清洁组合物还包含至少一种表面活性剂。在一些优选的实施方案中，所述清洁组合物具有至少约pH 5.0的工作pH。本发明也提供使用本发明的清洁组合物清洁物体的方法。
在一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶具有与里氏木霉α-半乳糖苷酶至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％同一性的氨基酸序列。在其他一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶与里氏木霉α-半乳糖苷酶免疫学交叉反应。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物是固体(例如，粉剂或片剂)，而在其他实施方案中，它们是液体、凝胶剂、泡沫剂或其他形式。在一些优选的实施方案中，将所述清洁组合物配制为衣物洗涤剂、盘碟洗涤剂或洗衣添加剂。因而在一些优选的实施方案中，所述清洁组合物还包含用于降解非淀粉食物多糖的至少一种额外酶，所述的额外酶包括，但不限于以下酶，如半纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶或木聚糖酶。在又一些优选的实施方案中，所述清洁组合物还包含用于降解其他污渍成分的至少一种额外酶，所述的额外酶包括，但不限以下酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、角质酶或氧化还原酶。实际上，与本发明的α-半乳糖苷酶组合使用的合适酶包括，但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、黑素酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或其混合物。在一些实施方案中，使用酶的组合(即“混合物”)，所述的组合包括与α-半乳糖苷酶联合的常规应用的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶。
本发明也提供用于清洁的方法，包括使所述分离的α-半乳糖苷酶与物体(例如织物或餐具)在适于该α-半乳糖苷酶活性的条件下接触以清洁此物体的步骤。在一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶与此物体在大于约pH 5的pH(例如范围约pH 5到约pH 6.5、约pH 6.5到约pH 7.5、约pH 7.5到约pH 8.5、约pH 9.5到约pH 10.5或约pH 10.5到约pH 11.5的pH)下接触。
在一些实施方案中，该物体是含有非淀粉食物多糖(例如半乳甘露聚糖胶，如瓜尔胶或利马豆胶)的弄脏的物体(例如被食品弄脏的物体)。此类食品包括，但不限于色拉调味料、冰淇淋、高营养奶、奶油冻、色拉调料和巧克力浆。
在一些优选的实施方案中，本发明的清洁组合物比不含α-半乳糖苷酶的相同清洁组合物更有效地从物体上去除污渍。
附图简述
与附图一起阅读时最佳地理解了以下详细描述的某些方面。根据常规实践，应当强调附图的各种特征不是按比例的。相反，为清晰起见，任意地扩大或缩小各种特征的尺度。附图中包括以下图：
图1显示pTrex3g载体的图谱。
图2显示了展示AGL1酶分析结果的SDS PAGE凝胶和两幅曲线图。
图3显示了展示AGL2酶分析结果的SDS PAGE凝胶和两幅曲线图。
图4显示了展示AGL3酶分析结果的SDS PAGE凝胶和两幅曲线图。
图5是显示β-甘露聚糖酶(NSP-20)、AGL1(NSP-6)、AGL2(NSP-8)和AGL3(NSP-9)对巧克力浆污渍的清洁活性的曲线图。
图6是显示β-甘露聚糖酶(NSP-20)和AGL1(NSP-6)对色拉调味料污渍的清洁活性的曲线图。
图7是显示AGL2(NSP-8)对瓜尔色素污渍的清洁活性的曲线图。
图8是显示β-甘露聚糖酶(NSP-20)和AGL2(NSP-8)对巧克力冰淇淋污渍的清洁活性的曲线图。
图9是显示在WFK自动洗碗机用洗涤剂(ADW)和AATCC衣物洗涤剂中β-甘露聚糖酶(NSP-20)、AGL1(NSP-6)、AGL2(NSP-8)和AGL3(NSP-9)对瓜尔色素污渍的清洁活性的曲线图。
发明详述
本发明提供包含分离的α-半乳糖苷酶的清洁组合物。在一些特别优选的实施方案中，所述的分离α-半乳糖苷酶包含与来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的α-半乳糖苷酶相关的氨基酸序列。本发明也提供在清洁应用中使用所述α-半乳糖苷酶的方法。
除非另外说明，本发明的实施涉及分子生物学、微生物学和重组DNA中常用的常规技术，它们在本领域技术人员能力范围内。此类技术是本领域技术人员已知的并且在本领域技术人员熟知的众多教材和参考书中描述。本文此前和以下提到的全部专利、专利申请、文章和出版物因而通过引用方式明确地并入本文。除非本文另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可用于实施本发明，然而在本文中描述了优选的方法和材料。因此，下文定义的术语通过参考本说明书作为整体进行更完整地描述。
另外，如本文中所用，单数“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地说明。数字范围包括定义该范围的数字。除非另外说明，核酸从左至右以5′至3′方向书写；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。应当理解本发明不限于所述的具体方法学、方案和试剂，因为根据本领域技术人员使用它们的背景，它们可以变化。
此外，本文中提供的标题不是本发明多个方面或实施方案的限制，其中所述的方面或实施方案可以通过参考作为一个整体的本说明书获得。因此，下文马上定义的术语通过参考作为一个整体的本说明书进行更充分地描述。然而，为了促进理解本发明，下文定义了众多术语。
意图在本说明书通篇范围内给出的每个最大数字界限包括每个较小的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较小的数字界限。在本说明书通篇范围中给出的每个最小的数字界限将包括每个较高的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较高的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个数字范围将包括落入这种较宽数字范围内的每个较窄的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较窄的数字范围。
在相关领域内引用的全部文件通过引用的方式并入本文；任意文件的引用不得解释为承认该文件是本发明的现有技术。
术语“重组”指不天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。重组分子可以含有以非天然存在方式连接的两个或多个天然存在的序列。重组细胞含有重组多核苷酸或多肽。
术语“异源性”指通常不相互连接的元件。例如，若宿主细胞产生一种异源性蛋白质，则该蛋白质是通常不在该宿主细胞中产生的蛋白质。类似地，与异源性编码序列有效连接的启动子是与编码序列有效连接的启动子，所述编码序列在野生型宿主细胞中通常不与所述启动子有效连接。就多核苷酸或蛋白质而言，术语“同源性”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。
“信号序列”是在蛋白质的氨基端部分存在的氨基酸序列，其促进该蛋白质的成熟形式分泌至细胞外部。信号序列的定义是一种功能性定义。成熟形式的胞外蛋白缺少信号序列，其中所述信号序列在分泌过程期间被切除。
“编码序列”是编码多肽的DNA区段。
术语“核酸”包括单链或双链的DNA、RNA及其化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地使用。
“载体”指被设计旨在将核酸导入一个或多个宿主细胞的多核苷酸。载体可以在不同宿主细胞中自主复制并且包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
如本文中所用的“表达载体”意指包含与合适调控序列有效连接的蛋白质编码区的DNA构建体，其中所述的合适调控序列能够实现该蛋白质在合适宿主细胞中表达。此类调控序列可以包括实现转录的启动子、控制转录以产生mRNA的任选操纵基因序列、编码mRNA中合适核糖体结合位点的序列和增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
“启动子”是启动下游核酸转录的调节序列。
术语“有效连接”指元件的排列，其中所述的排列允许所述元件功能性地关联。例如，若该启动子控制编码序列的转录，那么启动子与该编码序列有效连接。
术语“选择标记”指能够在宿主中表达的蛋白质，其中所述的蛋白质使得易于选择含有所导入核酸或载体的那些宿主。选择标记的实例包括，但不限于赋予宿主细胞代谢优势如营养优势的抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。
术语“衍生”包括术语“源自”、“获得”、“从......可获得”和“从......分离”。
“非致病”生物是对人不致病的生物。
如本文中所用的术语“回收”、“分离”和“分开”指从与其天然结合的至少一种成分中移出的蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。
如本文中所用，术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”用来指细胞时，意指该细胞具有整合至其基因组或作为附加体质粒的非天然性(例如异源性)核酸序列，其中所述的附加体质粒经多个世代仍被保留。
如本文中所用，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
在插入核酸序列至细胞的上下文中，术语“导入”意指“转染”、“转化”或“转导”并且包括将核酸序列掺入真核或原核细胞，其中所述核酸序列可以掺入该细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主性复制子或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“杂交”指一条核酸链通过如本领域已知的碱基配对作用与互补性链结合的过程。如果一条核酸与参考核酸序列在中等至高严格性杂交及洗涤条件下相互特异性杂交，那么认为这两条序列“选择性杂交”。中等至高严格性杂交是本领域技术人员熟知的。高严格性条件的一个实例包括在约42℃于50％甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，随后在室温于2×SSC和0.5％SDS中洗涤2次和在42℃于0.1×SSC和0.5％SDS中额外洗涤2次。
如本文中所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”指在从待清洁的物品(如织物、盘碟、隐形眼镜、其他固体基质、头发(香波)、皮肤(肥皂和霜剂)、牙齿(漱口液、牙膏)等)去除不希望的化合物(如污渍)中使用的组合物。不意图使本发明限于任何具体制剂，因为该术语包括为具体类型的预期清洁组合物和产品形式(例如，液体剂、凝胶剂、颗粒剂或喷雾剂组合物)所选择的任意材料/化合物，只要该组合物与此组合物中的主题酶相容即可。清洁组合物材料的具体选择通过考虑待清洁的表面、物品或织物和针对使用期间清洁条件的所需组合物的形式而轻易地做出。
该术语意图包括，但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬质表面清洁制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属柜台顶部(counter top)和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂、织物清新剂；织物柔软剂和纺织品与衣物预除斑剂(pre-spotters)以及盘碟洗涤剂)。
实际上，除非另外说明，如本文中所用的术语“清洁组合物”包括颗粒、片状或粉末形式的通用或强效洗涤剂，尤其清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式的通用洗涤剂，尤其强效液体(HDL)型洗涤剂；液体精细织物洗涤剂；盘碟手洗洗涤剂或轻垢盘碟洗涤剂，尤其高泡沫型的那些盘碟洗涤剂；洗碗机洗洗涤剂，包括家用和机构用的多种片状、颗粒、液体和冲洗辅助型洗碗机洗洗涤剂；液体清洁与消毒剂，包括抗菌性洗手液、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、轿车或毛毯香波、浴室清洁剂；发用香波和护发素；沐浴凝胶与泡沫浴清洁剂和金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”、预处理或衣物洗涤添加剂。
如本文中所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤制剂”用来指为了用在清洁弄脏物体的洗涤介质中所配制的组合物。在具体实施方案中，该术语用来指洗涤织物和/或衣物(例如“衣物洗涤剂”)。在备选实施方案中，该术语指其他洗涤剂，如用来清洁盘碟、餐具等的那些洗涤剂(例如“盘碟洗涤剂”)。不意图使本发明限于任何具体洗涤剂制剂或组合物。实际上，在一些实施方案中，除了α-半乳糖苷酶之外，该洗涤剂组合物含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白激活剂、上蓝剂与荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和/或增溶剂等。
如本文中所用，清洁组合物中的“增强性能”定义为提高对污渍的清洁作用(例如，去除和/或脱色)。在一些优选的实施方案中，此污渍是半乳甘露聚糖相关的污渍(例如，巧克力浆、色拉调味料、瓜尔胶等)，如通过标准洗涤循环后的常规评价所确定。
如本文中所用，术语“硬质表面清洁组合物”指用于清洁硬质表面如地板、墙壁、瓷砖、浴室和厨房固定设施等的洗涤剂组合物。此组合物以任意形式提供，包括，但不限于固体、液体、乳液等。
如本文中所用，“餐具洗涤组合物”指用于清洁盘碟的组合物的全部适宜形式，所述的全部适宜形式包括，但不限于粒剂、凝胶剂、乳剂和液体。
如本文中所用，“织物清洁组合物”指用于清洁织物的洗涤组合物的全部形式，所述的全部形式包括，但不限于粒剂、液体、凝胶剂、乳剂和棒剂。
如本文中所用，“纺织品”指机织织物，以及适于转换成或用作纱线、机织织物、针织物和非机织织物的短纤维和长丝。该术语包括由天然纤维及合成(例如人造)纤维制成的纱线。
如本文中所用，“纺织品材料”是针对纤维、纱线中间体、纱线、织物和由织物制成的产品(例如衣物和其他物品)的一般术语。
如本文中所用，“织物”包括任意的纺织材料。因此，意图该术语包括衣服，以及织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织材料。
如本文中所用，“α-半乳糖苷酶的有效量”指对于实现具体应用(例如清洁组合物等)中所要求的酶活性为必需的α-半乳糖苷酶的量。这种有效量由本领域技术人员轻易确定并且以众多因素为基础，如所用的具体酶变体、清洁应用、该清洁组合物的具体组成和是否需要液态或干态(例如颗粒状、棒状)组合物等。
术语“α-半乳糖苷酶”和alpha-半乳糖苷酶指水解α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖和半乳甘露聚糖)的非还原末端α-D-半乳糖残基的酶。根据IUBMB酶命名法，本文所述的α-半乳糖苷酶具有如EC 3.2.1.22所述的活性。本文所述α-半乳糖苷酶的系统命名是α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。
术语“弄脏的物体”指被另一种组合物玷污(例如弄脏)的物体(例如织物或盘碟)。术语“弄脏的物体”包括脏织物，如被含有非淀粉食物多糖的食品弄脏的脏衣物、亚麻布和织物。在某些实施方案中，污渍具有可见的颜色。
术语“非淀粉食物多糖”指在众多食品(例如沙司、奶油、奶制品、冰淇淋、奶油冻、高营养奶和色拉调味料)中作为填料、增稠剂、稳定剂或游离水结合剂使用的非淀粉多糖。瓜尔胶(一种从豆科灌木-瓜尔豆(guar bean)提取的可食用增稠剂)和从角豆树(carob tree)种子提取的槐豆胶是非淀粉食物多糖的实例。
术语“非淀粉食物多糖降解酶”指降解非淀粉食物多糖的酶。示例性酶包括，但不限于半纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶。
术语“半乳甘露聚糖胶”指由含有半乳糖残基及甘露糖残基的聚合物组成的植物来源的多糖。瓜尔胶、他拉胶、胡芦巴胶和槐豆胶是半乳甘露聚糖型胶。
术语“工作pH”指洗涤剂在使用期间的pH。例如，衣物洗涤剂的工作pH是该洗涤剂在洗衣机中洗涤或手工洗涤期间用来洗涤织物时的pH。类似地，盘碟洗涤剂的工作pH是该洗涤剂正在洗碗机或手工洗涤盘碟过程中使用时的pH。在一些实施方案中，将浓缩或固体形式的洗涤剂稀释或溶解，此后该洗涤剂的pH处在其工作pH。
术语“工作浓度”指使用期间洗涤剂中酶的浓度。例如，衣物洗涤剂中酶的工作浓度是该衣物洗涤剂用来在洗衣机中或手工洗涤期间洗涤织物时这种酶的浓度。类似地，盘碟洗涤剂中酶的工作浓度是在洗碗机中或手工洗涤期间使用该盘碟洗涤剂时这种酶的浓度。在一些实施方案中，将浓缩或固体形式的洗涤剂稀释或溶解，此后洗涤剂中酶的浓度处在其工作浓度。
本发明提供包含分离的α-半乳糖苷酶的清洁组合物，其中所述的分离α-半乳糖苷酶包含与里氏木霉α-半乳糖苷酶相关(例如至少约90％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，该清洁组合物包含至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，该清洁组合物具有至少约pH 5的工作pH。本发明也提供利用本文所提供的清洁组合物清洁物体的方法。
在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解本发明不限于所述的具体实施方案，因为这类实施方案当然可以变化。还应当理解本文所用的术语仅仅旨在描述具体实施方案，而不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
在提供值的范围的情况下，应当理解除非上下文明确说明，还具体地披露在这个范围的上限与下限之间的每个中间值至该下限的十分之一单位。本发明中包括在所述范围内任一所述值或中间值与这个所述范围内任一其他所述值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该范围内或排除在外，并且在两个界限值之任一者、这二者均不包含或均包含在所述较小范围内的情况下的每个范围也包括在本发明中，受所述范围中任何具体排除。在所述范围包括所述界限之一者或两者的情况下，本发明中也包括排除所包括的这些界限中任一者或两者的范围。
尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可以用于实施或测试本发明，然而现在描述示例性且优选的方法和材料。本文中提到的全部出版物通过引用的方式并入本文，旨在披露并描述与引用的所述出版物相关的方法和/或材料。
α-半乳糖苷酶
如上文指出，本发明提供包含α-半乳糖苷酶的清洁组合物。在一些实施方案中，所述α-半乳糖苷酶具有这样的氨基酸序列，其与野生型里氏木霉α-半乳糖苷酶的氨基酸序列有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性。此类酶的三个实例的氨基酸序列是本领域已知的(参见Margolles-Clark等，Eur.J.Biochem.，240：104-11[1996])。编码里氏木霉α-半乳糖苷酶1、2和3(AGL1、AGL2和AGL3)的mRNA的核苷酸序列以及这些酶的氨基酸序列已经保存在NCBI的GENBANK
Figure G2008800060950D00101
数据库，分别是登录号Z69253(GID：1580815)、Z69254(GID：1580817)和Z69255(GID：1580811)。这些GENBANK
Figure G2008800060950D00111
数据库登录项通过引用的方式完整并入本文，包括其中的核酸序列和蛋白质序列和对这些序列的注释。
超过500种不同α-半乳糖苷酶的氨基酸序列是已知的并且已经保存在NCBI的GENBANK
Figure G2008800060950D00112
数据库，包括来自哺乳动物(参见例如，登录号CAA29232；GID：757912)、植物(参见例如登录号NP 974447；GID：42572703)和细菌(参见例如登录号BAB38524；GID：13364578)的那些α-半乳糖苷酶。此外，已知至少5种α-半乳糖苷酶(包括来自人、稻和里氏木霉的那些α-半乳糖苷酶)的原子坐标(见例如，Golubev等，J.MoI.Biol.，339：413-422[2004])。在α-半乳糖苷酶(包括来自里氏木霉的那些α-半乳糖苷酶)中保守的氨基酸也是已知的(参见例如前文Margolles-Clark等；和NCBI保守结构域登录号COG3345.2)。
在其他一些实施方案中，所述α-半乳糖苷酶在免疫学上与野生型里氏木霉α-半乳糖苷酶相关，用于鉴定所述α-半乳糖苷酶的方法是分子生物学领域熟知的。
意图使用任意合适方法产生本发明的α-半乳糖苷酶。例如，在一些实施方案中，该酶(例如由革兰氏阴性生物如大肠杆菌(E.coli)分泌至周质或(例如由革兰氏阳性生物(如芽孢杆菌属(Bacillus)和放线菌属(Actinomycetes))或真核宿主(例如木霉、曲霉(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia))分泌至胞外空间。
在一些实施方案中，通过在里氏木霉宿主细胞中表达融合蛋白产生该α-半乳糖苷酶，其中所述的融合蛋白含有与该α-半乳糖苷酶有效连接的信号序列。在这些实施方案的一些中，该α-半乳糖苷酶被分泌至培养基内，其中从所述培养基收获该α-半乳糖苷酶。所述融合蛋白的信号序列包括促进蛋白质从木霉宿主细胞分泌的任意信号序列。在一些实施方案中，所用信号序列相对于木霉宿主细胞是内源性的，而在其他实施方案中，它是非内源性的。在其他一些实施方案中，它是已知从木霉(Trichoderma sp)宿主细胞被高水平分泌的蛋白质的信号序列。此类信号序列包括，但不限于：纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶III、α-淀粉酶、天冬氨酰蛋白酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、糖苷酶和大麦内肽酶B的信号序列{参见例如，Saarelainen，Appl。Environ.Microbiol.，63：4938-4940[1997])。在一些实施方案中，并且如实施例中进一步描述，该α-半乳糖苷酶利用其自身信号序列(即AGL1、AGL2或AGL3信号序列，如前文Margolles-Clark等中所述)进行分泌。
在一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶利用一种核酸产生，其中所述核酸包含：与编码α-半乳糖苷酶的核酸有效连接的编码信号序列的核酸，其中所述核酸的翻译产生了包含α-半乳糖苷酶部分的融合蛋白，所述的α-半乳糖苷酶部分具有N-末端信号序列用于从木霉宿主细胞分泌该α-半乳糖苷酶部分。
在一些实施方案中，除信号序列之外，该融合蛋白还含有“载体蛋白”，其中所述的载体蛋白是里氏木霉宿主细胞内源且被高水平分泌的蛋白质的一部分。合适的载体蛋白包括，但不限于里氏木霉甘露聚糖酶I(Man5A或MANI)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(Cel6A或CBHII){参见例如Paloheimo等，Appl.Environ.Microbiol.，69：7073-7082[2003])或里氏木霉纤维二糖水解酶I(CBHI)的那些载体蛋白。在一些实施方案中，该载体蛋白是包括CBHI核心区和部分CBHI接头区的截短里氏木霉CBHl蛋白。在一些实施方案中，本发明包括编码融合蛋白的核酸，其中所述的融合蛋白从氨基端至羧基端含有有效连接的信号序列、载体蛋白和α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶的编码序列进行密码子优化，以便在所用宿主细胞中表达该α-半乳糖苷酶。由于列出众多宿主细胞(包括里氏木霉)中每个密码子用法的密码子选择表是本领域已知的(参见例如Nakamura等，NuclAcids Res.，28：292[2000])或可容易衍生，故而容易地设计此类核酸以产生待表达的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。
除了编码序列外，在一些实施方案中，该核酸还包含对于在宿主细胞中表达所述α-半乳糖苷酶必需的其他元件。例如，在一些实施方案中，该核酸含有用于转录编码序列的启动子和转录终止子。示例性启动子包括，但不限于里氏木霉cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1和xln2启动子或其杂合体或截短形式。例如，在一些实施方案中，该启动子是里氏木霉cbh1启动子。合适的终止子包括，但不限于里氏木霉cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1和xln2终止子和众多其他终止子，包括例如来自黑曲霉(A.niger)或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶基因(参见前文Nunberg等[1984]和前文Boel等[1984])、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)邻氨基苯甲酸合酶基因、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶基因或构巢曲霉trpC(Punt等，Gene 56：117-124[1987])的终止子。在一些实施方案中，启动子和/或终止子相对于木霉宿主细胞是天然的，而在其他实施方案中，它们是非内源性的。
在一些实施方案中，里氏木霉宿主细胞用于表达所述α-半乳糖苷酶。在一些优选的实施方案中，遗传地修饰里氏木霉细胞以减少该细胞内源的分泌性蛋白质表达。在一些实施方案中，该细胞含有已经被缺失或失活的一个或多个天然基因，尤其编码分泌性蛋白质的基因。例如，在一些实施方案中，缺失或失活一个或多个蛋白酶编码基因(例如天冬氨酰蛋白酶编码基因；参见Berka等，Gene 86：153-162[1990]和美国专利号6,509,171)或纤维素酶编码基因。在一些实施方案中，木霉宿主细胞是在cbh1、cbh2和egl1与egl2基因中含有失活性缺失的里氏木霉宿主细胞，如WO 05/001036中描述。在一些实施方案中，上述核酸存在于木霉宿主细胞的核基因组内，而在其他实施方案中，它存在于该木霉宿主细胞内复制的质粒中。
意图使用众多合适技术(例如电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染[例如脂质转染法介导和DEAE-Dextrin介导的转染]、与磷酸钙DNA沉淀物孵育、DNA包被的微粒的高速轰击和原生质体融合)的任一项技术将所述核酸导入木霉宿主细胞。常见转化技术是本领域已知的(见例如美国专利号6,022,725；美国专利号6,103,490；美国专利号6,268,328和美国公开专利申请20060041113、20060040353、20060040353及20050208623，全部文献通过引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，制备用于转化的木霉包括从真菌菌丝体制备原生质体。(参见Campbell等，Curr.Genet.16：53-56[1989])。在一些实施方案中，菌丝体从萌发的营养性孢子获得。
在一些实施方案中，一旦α-半乳糖苷酶被分泌至培养基，则使用本领域已知的任一便利方法(例如通过沉淀法、离心法、亲和法、过滤法和任何其他方法)回收该α-半乳糖苷酶。例如，使用亲和层析法(Tilbeurgh等，FEBS Lett.，16：215[1984])；离子交换层析法(Goyal等，Biores.Technol.，36：37[1991]；Fliess等，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，17：314[1983]；Bhikhabhai等，J.Appl.Biochem.6：336[1984]；和Ellouz等，Chromatography 396：307[1987])，包括使用高分辨力材料的离子交换法(Medve等，(J.Chromatography A 808：153[1998]；疏水相互作用层析法(Tomaz和Queiroz，J.Chromatography A 865：123[1999]；双相分配法(Brumbauer等，(Bioseparation 7：287[1999])；乙醇沉淀法；反相HPLC；在硅胶或阳离子交换树脂(例如DEAE)上层析法；层析聚焦法；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀法；或凝胶过滤法(使用例如Sephadex G-75)。在一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶不从培养基的其他成分中纯化出来即使用。在这些实施方案的部分中，所述培养基仅进行浓缩并且随后不将所述蛋白质从生长培养基的其他成分中进一步纯化出来即使用，或不作任何其他修饰即使用。
清洁组合物
本发明提供包含上述α-半乳糖苷酶的清洁组合物。在一些实施方案中，该清洁组合物是织物清洁组合物(即衣物洗涤剂)、表面清洁组合物、盘碟清洁组合物或自动洗碗机用洗涤剂组合物。示例性清洁组合物的配方在通过引用方式并入本文的WO0001826中极详细地描述。
在一些实施方案中，主题清洁组合物(例如衣物或盘碟洗涤剂)含有约1％到约80％(例如约5％到约50％)(按重量计)的至少一种表面活性剂(例如非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂或其任意混合物)。示例性表面活性剂包括，但不限于烷基苯磺酸盐(ABS)，包括直链烷基苯磺酸盐和直链烷基磺酸钠、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇(例如，壬基苯氧基乙氧基化物或壬基酚)、二乙醇胺、三乙醇胺和单乙醇胺。在洗涤剂、尤其在衣物洗涤剂中可以存在的示例性表面活性剂于美国专利号3,664,961、3,919,678、4,222,905和4,239,659中描述。
在一些实施方案中，所述清洁组合物为固体(例如处于粉末或片状形式)或液体形式。在一些额外的实施方案中，所述清洁组合物还包含至少一种缓冲剂(例如碳酸钠、碳酸氢钠)、洗涤剂助洗剂、漂白剂、漂白激活剂、酶、酶稳定剂、增泡剂、抑制剂、防黯剂、防蚀剂、悬污剂、脱污剂、杀菌剂、pH调节剂、非助洗剂碱性源、螯合剂，有机或无机填充剂、溶剂、水溶助长剂、荧光增白剂、染料、香料等。在一些实施方案中，该清洁组合物作为衣物洗涤添加剂在使用前与洗涤剂组合。
在一些实施方案中，主题清洁组合物含有另外的非淀粉食物多糖降解酶(例如半纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶或果胶酸裂合酶)和任选的含有一种或多种额外的酶如蛋白酶，如枯草蛋白酶和/或SSI蛋白质、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、角质酶、脂肪酶、氧化还原酶等，用于去除其他污渍。
在洗涤清洁组合物中有用的多种其他成分也用于本文提供的组合物中，所述的其他成分包括其他活性成分、载体、水溶助长剂、加工助剂、染料或色素、用于液体制剂的溶剂等。在需要额外起泡作用的一些实施方案中，将增泡剂如C10-C16链烷醇酰胺掺入所述组合物，一般以约1％-约10％的水平。
在一些实施方案中，该洗涤剂组合物包含水和/或其他溶剂作为载体。适于使用低分子量伯醇或仲醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。一元醇优选用于增溶表面活性剂，不过也可使用多元醇，如含有约2个-约6个碳原子和约2个-约6个羟基的那些多元醇(例如1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)。在一些实施方案中，该组合物包含约5％-约90％(一般约10％-约50％)的此类载体。
在一些实施方案中，如此配制本文的洗涤剂组合物，从而在含水清洁操作中使用期间，洗涤水具有约5.0-约11.5的pH。因此，制成品通常在这个范围内配制。用于控制pH位于推荐使用水平上的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，该清洁组合物是一种自动餐具洗涤洗涤剂，其具有约pH 9.0-约pH 11.5、约pH9.0-约pH 9.5、约pH 9.5-约pH 10.0、约pH 10.0-约pH 10.5、约pH 10.5-约pH 11.0或约pH 11.0-约pH 11.5的工作pH。在一些其他实施方案中，该清洁组合物是一种液体衣物洗涤剂，其具有约pH 7.5-约pH 8.5、约pH7.5-约pH 8.0或约pH 8.0-约pH 8.5的工作pH。在一些其他实施方案中，该清洁组合物是一种固体衣物洗涤剂，其具有约pH 9.5-约pH 10.5、约pH9.5-约pH 10.0或约pH 10.0-约pH 10.5的工作pH。
本文所述的清洁组合物要求有效量的所述α-半乳糖苷酶。在一些实施方案中，该α-半乳糖苷酶在所述清洁组合物中的工作浓度是约0.01ppm(百万分之，w/v)-约100ppm、约0.01ppm-约0.05ppm、约0.05ppm-约0.1ppm、约0.1ppm-约0.5ppm、约0.5ppm-约1ppm、约1ppm-约5ppm、约5ppm-约10ppm或约10ppm-约100ppm。
多种漂白化合物如过碳酸盐、过硼酸盐等也可在本发明的清洁组合物中使用。在一些实施方案中，这些漂白化合物一般以按重量计约1％-约15％的水平存在。在一些额外的实施方案，此类组合物也含有本领域已知的漂白激活剂(例如四乙酰基乙二胺、壬酰氧基苯磺酸盐等)。使用水平一般是按重量计约1％-约10％。
多种脱污剂，尤其阴离子寡酯型脱污剂、多种螯合剂，尤其氨基膦酸盐和乙二胺二琥珀酸盐、多种粘质污渍去除剂，尤其乙氧基化四亚乙基戊胺、多种分散剂，尤其聚丙烯酸盐和聚天冬氨酸盐、多种增白剂，尤其阴离子增白剂、多种抑泡剂，尤其硅氧烷和仲醇、多种织物柔软剂，尤其蒙脱石等也可在本发明的组合物中以按重量计约1％-约35％的水平使用。标准配方是本领域技术人员熟知的。
酶稳定剂也可在本发明的清洁组合物中使用。此类稳定剂包括，但不限于丙二醇(优选约1％-约10％)、甲酸钠(优选约0.1％-约1％)和甲酸钙(优选约0.1％-约1％)。
在一些实施方案中，硬质表面清洁组合物和织物清洁组合物还包含按重量计约5％-约50％水平的多种助洗剂。常见助洗剂包括1-10微米沸石、多羧酸盐如柠檬酸盐和氧联二琥珀酸盐、层叠硅酸盐、磷酸盐等。其他常用助洗剂列于标准配方中。
其他任选成分包括螯合剂、粘质污渍去除/防再沉积剂、聚合物分散剂、漂白剂、增白剂、抑泡剂、溶剂和美观剂。
本发明的清洁组合物可在合适的清洁方法中使用。在一些实施方案中，该清洁方法包括：使分离的α-半乳糖苷酶与物体(例如织物或盘碟)在适于所述α-半乳糖苷酶活性的条件下接触以清洁该物体，其中所述的α-半乳糖苷酶包含与里氏木霉α-半乳糖苷酶相关的氨基酸序列。根据所用清洁组合物的工作pH，将所述α-半乳糖苷酶与该物体在例如约pH 5-约6.5、约pH 6.5-约7.5、约pH 7.5-约8.5、约pH 9.5-约10.5或约pH 10.0-约11.5的pH下接触。在一些实施方案中，该物体是弄脏的物体并且在一些其他实施方案中，该物体被含有非淀粉食物多糖如半乳甘露聚糖胶(例如，瓜尔胶或利马豆胶等)的食品弄脏。在一些其他实施方案中，该物体被巧克力浆、冰淇淋或色拉调味料弄脏。
本文所述的清洁组合物比不含α-半乳糖苷酶的同等清洁组合物在去除某些污渍(例如因含有半乳甘露聚糖多糖的食品所致的污渍)方面更有效。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物与不含α-半乳糖苷酶的其他同等清洁组合物相比，在污渍去除方面更有效。使用基于标准反射计的测定法，例如实施例4中描述的那种测定法，本发明的一些清洁组合物比不合α-半乳糖苷酶的同等清洁组合物多去除至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或至少约90％的污渍和/或使其褪色。
实验
以下实施例向本领域的普通技术人员提供如何产生并使用本发明的完整公开和描述，并且不意图限制本发明的范围，同时它们也不意图表示下文实验是所进行的全部或仅有实验。已经努力确保所用数字(量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另外说明，份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度以摄氏度计，并且压力是处于大气压或接近大气压。
实施例1
α-半乳糖苷酶基因的克隆
通过PCR使用以下引物扩增来自里氏木霉菌株QM6A的agl1、agl2、agl3和man1基因的编码序列：
  引物名称   序列   注释   SEQ IDNO
NSP061   GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGACCCCTCACTCGATTGACC   GatewayAG LI1正向   SEQ IDNO：1
NSP062   GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACCAGTTTCGGCACTTCTTGC   Gateway AGL1反向   SEQ IDNO：2
NSP081   GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCTCGGCGCTCCCTCTCC   Gateway AGL2正向   SEQ IDNO：3
NSP082   GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATGTCTGCTTCTCCAAAAACACC   Gateway AGL2反向   SEQ IDNO：4
NSP091   GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTCGCCCAGTGCTGCAGTTC   Gateway AGL3正向   SEQ IDNO：5
NSP092   GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAGTGAGTCCTTTTCAGGCGC   Gateway AGL3反向   SEQ IDNO：6
NSP201   GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGATGATGCTCTCAAAGAGTCTCC   Gateway MAN1正向   SEQ IDNO：7
NSP202   GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATGTATTCAGGCATTGCGAGTACC   Gateway MAN1反向   SEQ IDNO：8
并使用GATEWAYTM重组系统(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)克隆至pTREX3g载体。pTREX3g在WO05/001036的实施例6中详细描述。
实施例2
里氏木霉细胞的转化
全部载体通过粒子轰击法转移至最初从RL-P37(Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，20：46-53[1984]；美国专利号4,797,361)衍生的四重缺失(Achb1、Acbh2、Δegl1和Aegl2)里氏木霉菌株(WO 05/001036)或1A52pyr4-菌株中。
制备来自待转化的木霉菌株的孢子混悬液(约5×108个孢子/ml)。将100μl～200μl孢子悬浮液涂布在MM乙酰胺培养基的平板中心上(MM乙酰胺培养基具有以下组成：0.6g/L乙酰胺；1.68g/L CsCl；20g/L葡萄糖；20g/L KH2PO4；0.6g/L CaCl2.2H2O；1ml/L 1000×微量元素溶液；20g/LNoble琼脂；pH 5.5。1000×微量元素溶液含有5.0g/L FeSO4·7H2O、1.6g/LMnSO4·H2O、1.4g/L ZnSO4·7H2O和1.0g/L CoCl2·6H2O)。随后使该孢子混悬液在MM乙酰胺培养基的表面上干燥。
木霉细胞的生物射弹转化使用来自Bio-Rad(Hercules，CA)的Biolistic
Figure G2008800060950D00191
PDS-1000/氦粒子送递系统，按照制造商说明书完成(参见例如，WO 05/001036和美国专利公开号2006/0003408)。
实施例3
酶活性分析
在培养瓶中培育含有agl1、agl2、agl3和man1的载体的细胞培养物并且使用SDS PAGE分析来自每种培养物的上清液。对于每种培养上清液，使用4-硝苯基-α-D-吡喃半乳糖苷作为底物在Mcl1vaine缓冲液中测量α-半乳糖苷酶活性。酶活性测定法使用Sigma方案进行(α-半乳糖苷酶的酶测定法，Sigma产品信息；还参见McCleary，Meth.Enzymol.，160：627-632[1988]；和来自Megazyme公司黑曲霉和瓜尔豆的α-半乳糖苷酶技术数据页)，如下简述。
首先，0.10ml底物添加至16×125mm玻璃管，所述玻璃管随后在水浴中通过温育至少5分钟加热至想要的温度。随后，将0.10ml稀释的酶以15秒间隔添加至每只管内并涡旋混合酶与底物。该混合物在试验的预定温度(30℃、37℃、40℃、45℃、60℃和75℃)下温育5分钟。为终止反应，以相同的15秒间隔添加3.0ml的2％碳酸钠溶液。使溶液混合并从水浴取出所述管以在410nm下读数。
在这些实验中，将所述酶稀释液在每个pH下(pH2.1、2.5、3、4、5、6、7和8的Mcl1vaine；pH 4.5的0.1M乙酸钠)的适宜缓冲液中制备为10mM。初步试验的酶底物是4-硝苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(Sigma，目录号：877，MW：301.25)。在每个试验中包括空白，所述空白包含底物、终止试剂和酶空白(使用对硝基苯酚作为底物参照)。
图2-4中所示的SDS-PAGE凝胶表明对于每种上清液，产生了尺寸大致正确的蛋白质。在所用的分析条件下，AGL1(其具有预测分子量45.7kDa)具有pH 5的最适pH和约60℃的最适温度(图2)，AGL2(其具有预测分子量79.5kDa)具有pH 4-5的最适pH和约60℃的最适温度(图3)并且AGL3(其具有预测分子量66.3kDa)具有pH 2-4的最适pH、在pH 4.5下约60℃的最适温度和在pH 2.5下约45℃的最适温度(图4)。
实施例4
木霉α-半乳糖苷酶蛋白清洁活性的圆盘测定分析法
使用以下方法测试AGL1、AGL2和AGL3清洁被巧克力浆、色拉调味料和瓜尔胶色素弄脏的小块布样的能力。
用带有色素的色拉调味料(STC CFT CS-6)、巧克力浆(STC EMPA160)和瓜尔胶色素(STC CFT CS-43)弄脏棉质小块布样(Test Fabrics，Inc.WestPittston，PA，USA)。巧克力冰淇淋圆形物(10cm棉质小块布样上的4cm污渍)从Warwick-Equest Limited，Consett，County Durham，England获得。
用于微量平板测定法的小块布样用配备5/8英寸冲压裁剪机的B型纺织品冲床(textile Punch Press Mode1B)切成15cm圆形物(圆盘)。将单个圆盘置于24孔微量平板(Costar 3526)的各个孔内。将每升含有1.5mlAATCC HDL(标准液体洗涤剂)洗涤剂、50mMHepes缓冲液(pH 7.4)的1ml洗涤溶液添加至各孔。用正压式移液器(positive displacement pipette)添加1～20μg稀释的酶。所述AATCC 2003标准液体洗涤剂含有12％直链烷基磺酸盐、8％脂肪醇乙氧基化物、8％丙二醇、1.2％柠檬酸、4％脂防酸和4％氢氧化钠，余量是水。对照孔不含酶。该微量平板用其塑料盖盖好并在37℃温育，伴以100转/分钟柔和转动。4～16小时后，上清液通过抽吸去除并且每孔用1.5ml Dulbecco′s PBS(pH 7.3)洗涤3次并用1.5ml蒸馏水洗涤3次。每个圆盘从各孔取出并在空气中干燥过夜。圆盘以目视方式检查并且用在标准白色色板(standard white tile)上校正过的Minolta反射计CR-200分析。用数据的标准差百分数计算平均L值，每个对照和试验样品通常进行一式四份。
使用强效洗涤剂(HDD)或自动餐具洗涤机(ADW)洗涤剂的实验利用无磷酸盐的pH 10的0.015％～0.1％AATCC HDD和无磷酸盐的0.015％～0.1％WFK ADW洗涤剂B型进行。无增白剂的AATCC 1993标准参考强效洗涤剂含有18％直链烷基磺酸盐、2％直链脂肪醇乙氧基化物和碳酸钠至100％、25％ZeoliteA、18％碳酸钠、0.5％硅酸钠、22.13％硫酸钠、10％水分(moisture)和共聚物、酶或羧甲基纤维素的空间(6.28％)。无增白剂且无磷酸盐的WFK自动餐具洗涤机洗涤剂B型含有30％无水柠檬酸钠、12％马来酸钠盐、一水合过硼酸钠、2％四乙酰乙二胺、25％二硅酸钠、2％直链脂肪醇乙氧基化物和无水碳酸钠至100％。
在以下实施例和附图中，含有AGL1的蛋白质提取物称作NSP-6，含有AGL2的蛋白质提取物称作NSP-8并且含有AGL3的蛋白质提取物称作NSP-9。
如图5中所示，使用微量平板圆盘法，NSP-6(α-半乳糖苷酶1)、NSP-8(α-半乳糖苷酶2)和NSP-9(α-半乳糖苷酶3)在0.15％AATCC强效液体洗涤剂中对巧克力浆污渍显示优异的清洁作用。NSP-20是一种β-CWDE，是细胞壁降解酶的缩写。图6显示在0.022％的AATCC强效液体洗涤剂(pH 7.4)中α-半乳糖苷酶1对色拉调味料污渍的清洁作用。图7显示低浓度(0.5～1.0ppm)的NSP-8(α-半乳糖苷酶2)在0.15％AATCC强效液体洗涤剂中对瓜尔胶色素技术性污渍产生明显的清洁作用。
实施例5
木霉α-半乳糖苷酶蛋白质清洁活性的涤垢仪分析
涤垢仪研究使用了维持在37℃的7243S型6钵(pot)涤垢仪(U.S.Testing，Co.Inc.Hoboken，N.J.)。搅拌速度设为100转/分钟。将在棉质小块布样上的6个巧克力冰淇淋圆形物添加至1升含有6gpg硬度(稀释自含有1.735M氯化钙和0.67M氯化镁的15000gPg硬度贮存溶液)和50mMHepes缓冲液(pH 7.4)的AATCC HDL洗涤剂。
图8显示α-半乳糖苷酶2(NSP-8)在涤垢仪条件下以1ppm酶在30分钟内清洁了冰淇淋小块布样。
图9显示全部三种α-半乳糖苷酶并且尤其α-半乳糖苷酶2(NSP-8)在微量平板圆盘法中表现了明显的清洁作用(如实施例中所描述，在0.015％自动餐具洗涤机洗涤剂(WFK)(pH 10.5)或在0.015％AATCC固体衣物洗涤剂(pH 10.2)中以20ppm配制时)。
以上实施例证实里氏木霉α-半乳糖苷酶从被色拉调味料、巧克力浆、冰淇淋和瓜尔胶色素污渍弄脏的棉质小块布样上有效去除污渍。对瓜尔胶技术性污渍的活性可以作为清洁作用的基础，因为色拉调味料和冰淇淋经常含有瓜尔胶作为一种成分。测试的α-半乳糖苷酶在远超预期的pH范围内表现良好。
在以上说明书中提到的全部出版物和专利通过引用的方式并入本文。本发明的所述方法与系统的多种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见而不背离本发明的范围和精神。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案加以描述，然而应当理解本发明不应过分地受限于这类具体实施方案。实际上，本领域和/或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述方式的多种修改在本发明的范围以内。
已经描述了本发明的示例性实施方案，对于本领域技术人员而言显而易见的是可以对所披露的实施方案进行多种修改，并且此类修改应当属于本发明的范围。
本领域技术人员容易认识到本发明充分适于实施所述目标并且获得所提及的目的和优势，以及其中固有的那些目的和优势。本文所述的组合物和方法是代表性的并且不意图作为本发明范围的限制。本领域技术人员容易知道可以对本文披露的本发明进行各种替换和修改而不脱离本发明的范围和精神。
本文中示例性描述的本发明可以在缺少本文中未具体披露的任意要素、限制的情况下实施。已经使用的术语和表述作为描述性而非限制性术语使用，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所示或所述特性或其部分的任何等同方案，不过应当意识到在要求保护的本发明范围内可能存在多种修改。因此，应当理解尽管本发明已经通过示例性实施方案和任选特性具体披露，然而本领域技术人员可以对本文所披露概念进行修改和变型，并且认为此类修改和变型在如所附权利要求书所定义的本发明范围内。
本发明已经在本文中广义且一般性地加以描述。在该一般性公开的每个更窄的种类和亚类组也形成本发明的部分。这包括对本发明的一般描述使用限制条件或否定性限制条件，从所述类属中排除任一主题，不管所排除的材料是否在本文中具体提及。

Claims (19)

1.包含分离的α-半乳糖苷酶的清洁组合物，所述α-半乳糖苷酶包含与里氏木霉的α-半乳糖苷酶有至少90％同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的清洁组合物，且还包含至少一种表面活性剂。
3.权利要求1的清洁组合物，其中所述的清洁组合物具有大于pH 5的工作pH。
4.权利要求1的清洁组合物，其中所述的清洁组合物是固体。
5.权利要求1的清洁组合物，其中所述的清洁组合物是液体。
6.权利要求1的清洁组合物，其中所述的清洁组合物包含衣物洗涤剂。
7.权利要求1的清洁组合物，其中所述的清洁组合物包含盘碟洗涤剂。
8.权利要求1的清洁组合物，且还包含一种或多种额外的酶。
9.权利要求8的清洁组合物，其中所述额外的酶选自半纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、胶质裂合酶、蛋白酶、纤维素酶、角质酶、脂肪酶和氧化还原酶。
10.权利要求1的清洁组合物，其中所述的分离α-半乳糖苷酶与里氏木霉的α-半乳糖苷酶免疫学交叉反应。
11.一种清洁方法，包括：
将分离的α-半乳糖苷酶与物体在适于所述α-半乳糖苷酶活性的条件下接触以清洁所述物体，其中所述的α-半乳糖苷酶包含与里氏木霉α-半乳糖苷酶有至少90％同一性的氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述的α-半乳糖苷酶与所述物体在大于pH 5的pH下接触。
13.权利要求11的方法，其中所述物体是被弄脏的物体。
14.权利要求13的方法，其中所述被弄脏的物体包含非淀粉食物多糖。
15.权利要求14的方法，其中所述的非淀粉食物多糖是半乳甘露聚糖胶。
16.权利要求14的方法，其中所述的非淀粉食物多糖是瓜尔胶或利马豆胶。
17.权利要求13的方法，其中所述被弄脏的物体被巧克力浆、冰淇淋或色拉调味料弄脏。
18.权利要求11的方法，其中所述的物体是织物。
19.权利要求11的方法，其中所述的物体是餐具。
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