BRPI0808155A2 - Composições de limpeza compreendendo alfa-galactosidase - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA COMPREENDENDO ALFA-GALACTOSIDASE".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições de limpeza com5 preendendo uma enzima alfa-galactosidade isolada. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima alfa-galactosidase isolada compreende uma seqüência de aminoácidos que está relacionada a uma alfagalactosidase de Trichoderma reesei. A presente invenção também refere-se métodos de uso da alfa-galactosidase em aplicações de limpeza.

Antecedentes da Invenção

Composições detergentes e outras de limpeza frequentemente incluem uma combinação complexa de ingredientes ativos. Por exemplo, certos produtos de iimpeza contêm um sistema surfatante, enzimas para limpeza, agentes alvejantes, builders, supressores de espuma, agentes de 15 suspensão de sujeira, agentes de liberação de sujeira, abrilhantadores ópticos, agentes amaciantes, dispersantes, compostos inibidores da transferência de corante, abrasivos, bactericidas e perfumes. A despeito da complexidade dos atuais detergentes, há muitas manchas que são difíceis de remover.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a composições de limpeza compreendendo uma enzima alfa-galactosidade isolada. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima alfa-galactosidase isolada compreende uma seqüência de aminoácidos que está relacionada a uma alfa25 galactosidase de Trichoderma reesei. A presente invenção também refere-se a métodos de uso da mesma alfa-galactosidase em aplicações de limpeza. Em algumas modalidades, a composição de limpeza também compreende pelo menos um surfatante. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza têm um pH de trabalho que é de pelo menos cerca de pH 30 5,0. A presente invenção também apresenta métodos de limpeza de objetos usando as composições de limpeza da presente invenção.

Em algumas modalidades, a enzima alfa-galactosidase tem uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% idêntica a uma alfa-galactosidase de Trichoderma reesei. Em algumas outras modalidades, a enzima alfa-galactosidase tem rea5 ção cruzada imunologicamente com a alfa-galactosidase de Trichoderma reesei.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção são sólidas (por exemplo, um pó ou um comprimido), ao passo que, em outras modalidades, são líquidas, géis, espumas ou outras 10 formas. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza são formuladas como detergentes para lavar roupas, detergentes para lavar pratos ou aditivos para lavar roupas. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza também compreendem pelo menos uma enzima adicional, incluindo, mas não limitadas a, enzimas como hemicelulases, ma15 nanases, pectinases ou xilanases, utilizáveis para a degradação de polissacarídeos alimentares não-amido. Em algumas outras modalidades adicionais, as composições de limpeza também compreendem pelo menos uma enzima adicional, incluindo, mas não limitadas a, enzimas como proteases, amilases, celulases, lipases, cutinases ou óxido-redutases, para a degrada20 ção de outros componentes da mancha. De fato, enzimas adequadas que encontram uso em combinação com a alfa-galactosidase da presente invenção incluem, mas não se limitam a, hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, 25 pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitínase, Iacase e amilases ou suas misturas. Em algumas modalidades, usa-se uma combinação de enzimas (isto é, um "coquetel") compreendendo enzimas aplicáveis convencionais, como protease, lipase, cutinase e/ou celulase, juntamente com alfa-galactosidase.

A presente invenção também refere-se a métodos de limpeza,

incluindo as etapas de contato da enzima alfa-galactosidase isolada com um objeto (por exemplo, um tecido ou prato) sob condições adequadas para a atividade da enzima alfa-galactosidase, para limpar o objeto. Em algumas modalidades, a enzima alfa-galactosidase é contatada com o objeto a um pH que seja maior que cerca de pH 5 (por exemplo, um pH na faixa de cerca de pH 5 a cerca de pH 6,5, de cerca de pH 6,5 a cerca de pH 7,5, de cerca de 5 pH 7,5 a cerca de pH 8,5, de cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,5 ou de cerca de pH 10,5 a cerca de pH 11,5).

Em algumas modalidades, o objeto é um objeto sujo (por exemplo, um objeto manchado por um alimento) contendo um polissacarídeo alimentar não-amido (por exemplo, uma goma galactomanano, como goma 10 guar ou goma de feijão-de-lima). Esses alimentos incluem, mas não se limitam a, molhos para saladas, sorvete, milkshakes, musses, cremes para saladas e creme de chocolate.

Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza da presente invenção removem manchas de objetos mais eficazmente do que composições de limpeza equivalentes que não contenham alfagalactosidase.

Descrição dos Desenhos

Certos aspectos da descrição detalhada a seguir são melhor compreendidos quando lidos juntamente com os desenhos anexos. Deve-se 20 enfatizar que, de acordo com a prática comum, as várias características dos desenhos não estão em escala. Pelo contrário, as dimensões das várias características são arbitrariamente ampliadas ou reduzidas por razões de clareza. Estão incluídas nos desenhos a seguintes figuras: a figura 1 mostra um mapa do vetor pTrex3g.

a figura 2 mostra um gel SDS PAGE e dois gráficos mostrando

os resultados da análise da enzima AGL1.

a figura 3 mostra um gel SDS PAGE e dois gráficos mostrando os resultados da análise da enzima AGL2.

a figura 4 mostra um gel SDS PAGE e dois gráficos mostrando os resultados da análise da enzima AGL3.

a figura 5 é um gráfico mostrando a atividade de limpeza de beta-mananase (NSP-20), AGL1 (NSP-6), AGL2 (NSP-8) e AGL3 (NSP-9) em manchas de creme de chocolate.

a figura 6 é um gráfico mostrando a atividade de limpeza de beta-mananase (NSP-20) e AGL1 (NSP-6) em manchas de molho para saladas.

a figura 7 é um gráfico mostrando a atividade de AGL2 (NSP-8)

em manchas de pigmento guar.

a figura 8 é um gráfico mostrando a atividade de limpeza de beta-mananase (NSP-20) e AGL2 (NSP-8) em manchas de sorvete de chocolate.

a figura 9 é um gráfico mostrando a atividade de limpeza de be

ta-mananase (NSP-20), AGL1 (NSP-6), AGL2 (NSP-8) e AGL3 (NSP-9) em manchas de pigmento guar no detergente para lavadoras de pratos automáticas WFK e no detergente para lavagem de roupas AATCC.

Descrição da Invenção A presente invenção refere-se a composições de limpeza com

preendendo uma enzima alfa-galactosidade isolada. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima alfa-galactosidase isolada compreende uma seqüência de aminoácidos que está relacionada a uma alfagalactosidase de Trichoderma reesei. A presente invenção também refere-se a métodos de uso da alfa-galactosidase em aplicações de limpeza.

A menos que indicado de outra forma, a prática da presente invenção envolve técnicas convencionais comumente usadas em biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante, que estão no âmbito da técnica. Essas técnicas são conhecidas por aqueles versados na técnica e são des25 critas em inúmeros textos e trabalhos de referência bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Todas as patentes, pedidos de patentes, artigos e publicações aqui mencionados, tanto acima, quanto abaixo, são aqui expressamente incorporados por referência. A menos que aqui definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo 30 significado que o comumente compreendido por aqueles versados na técnica a que refere-se esta invenção. Emboras quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos encontrem uso na prática da presente invenção, descrevem-se aqui os métodos e materiais preferidos. Portanto, os termos definidos imediatamente abaixo são mais detalhadamente descritos com referência ao Relatório como um todo.

Da mesma forma, conforme aqui usado, o singular "um", "uma", 5 "o" e "a" inclui a referência plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. A menos que indicado de outra forma, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita, na orientação 5’ para 3’; as seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita, na orientação amino para 10 carbóxi, respectivamente. Deve-se entender que esta invenção não se limita à metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos, pois esses podem variar dependendo do contexto em que são usados por aqueles versados na técnica.

Além disso, os cabeçalhos aqui apresentados não são limitações 15 dos vários aspectos ou modalidades da invenção, que podem ser tidos por referência ao relatório como um todo. Portanto, os termos definidos imediatamente abaixo são mais detalhadamente definidos com referência ao relatório como um todo. Todavia, para facilitar o entendimento da invenção, alguns termos são definidos abaixo.

Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada neste

relatório inclua cada limitação numérica abaixo, como se essas limitações numéricas abaixo fossem expressamente escritas aqui. Cada limitação numérica mínima dada neste relatório incluirá cada limitação numérica acima, como se essas limitações numéricas acima fossem expressamente escritas 25 aqui. Cada faixa numérica dada neste relatório incluirá cada faixa numérica que seja delimitada por essa faixa numérica mais ampla, como se essas faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas aqui.

Todos os documentos citados são, na parte relevante, aqui incorporados por referência; a citação de qualquer documento não deve ser tomada como uma admissão de que seja técnica anterior com relação à presente invenção.

O termo "recombinante" refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídio que não ocorra naturalmente em uma célula hospedeira. Uma molécula recombinante pode conter duas ou mais seqüências de ocorrência natural que estejam ligadas entre si de uma maneira que não ocorra naturalmente. Uma célula recombinante contém um polinucleotídeo ou polipeptídio recombinante.

O termo "heterólogo" refere-se a elementos que não estejam normalmente associados entre si. Por exemplo, se uma célula hospedeira produz uma proteína heteróloga, essa proteína não é normalmente produzida nessa célula hospedeira. Da mesma forma, um promotor que esteja ope10 racionalmente ligado a uma seqüência codificadora heteróloga é um promotor que esteja operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora a que normalmente não esteja operacionalmente ligado em uma célula hospedeira do tipo selvagem. O termo "homólogo", com referência a um polinucleotídeo ou proteína, refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que ocorra natural15 mente em uma célula hospedeira.

Os termos "proteína" e "polipeptídio" são aqui usados de maneira intercambiável.

Uma "seqüência de sinal" é uma seqüência de aminoácidos presente na parte N-terminal de uma proteína que facilite a secreção da forma madura da proteína para fora da célula. A definição de uma seqüência de sinal é funcional. A forma madura da proteína extracelular é desprovida da seqüência de sinal, que é clivada durante o processo de secreção.

Uma "seqüência codificadora" é um segmento de DNA que codifique um polipeptídio.

O termo "ácido nucleico" engloba DNA, RNA, fita simples ou fita

dupla e suas modificações químicas. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são aqui usados de maneira intercambiável.

Um "vetor" refere-se a um polinucleotídeo projetado para introduzir ácidos nucleicos em uma ou mais células hospedeiras. Os vetores podem se replicar de maneira autônoma em diferentes células hospedeiras e incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores lançadores, plasmídios, partículas de fagos, cassetes e outros. Um "vetor de expressão", conforme aqui usado, significa um construto de DNA compreendendo uma região codificadora de proteína que esteja operacionalmente ligada a uma seqüência de controle adequada capaz de efetuar a expressão da proteína em uma célula hospedeira adequa5 da. Essas seqüências de controle podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma seqüência operadora opcional para controlar a transcrição para produzir mRNA, uma seqüência que codifique sítios de ligação a ribossomo adequados no mRNA e intensificadores e seqüências que controlem a terminação da transcrição e da tradução.

Um "promotor" é uma seqüência reguladora que inicie a transcri

ção de um ácido nucleico a jusante.

O termo "operacionalmente ligado" refere-se a um arranjo de eIementos que permita que estejam funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se controlar a transcrição da seqüência.

O termo "marcador seletivo" refere-se a uma proteína capaz de expressão em um hospedeiro que permita uma fácil seleção dos hospedeiros que contêm um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não se limitam a, antimicrobianos (por e20 xemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que confiram uma vantagem metabólica, como uma vantagem nutricional na célula hospedeira.

O termo "derivado" engloba os termos "originado de", "obtido", "obtenível em" e "isolado de".

Um organismo "não-patogênico" é um organismo que não seja

patogênico para seres humanos.

Os termos "recuperado", "isolado" e "separado", conforme aqui usados, referem-se a uma proteína, célula, ácido nucleico ou aminoácido que seja removido de pelo menos um componente com o qual esteja naturalmente associado.

Conforme aqui usado, os termos "transformado", "transformado de maneira estável" e "transgênico", usados com referência a uma célula, significam que a célula tem uma seqüência de ácido nucleico não-nativo (por exemplo, heterólogo) integrada em seu genoma ou como um plasmídio epissômico que seja mantido por múltiplas gerações.

Conforme aqui usado, o termo "expressão" refere-se ao proces5 so pelo qual um polipeptídio é produzido com base na seqüência de ácido nucleico de um gene. O processo inclui tanto a transcrição, quanto a tradução.

O termo "introduzido", no contexto da inserção de uma seqüência de ácido nucleico em uma célula, significa "transfecção", "transformação" 10 ou "transdução" e inclui a referência à incorporação de uma seqüência de ácido nucleico a uma célula eucariótica ou procariótica, em que a seqüência de ácido nucleico possa ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídio, plastídio ou DNA mitocondrial), convertida em um réplicon autônomo ou transitoriamente expressada (por exemplo, mRNA 15 transfectado).

O termo "hibridização" refere-se ao processo pelo qual uma fita do ácido nucleico se une a uma fita complementar mediante pareamento de bases, conforme conhecido na técnica. Um ácido nucleico é considerado como "seletivamente hibridizável" a uma seqüência de ácido nucleico de re20 ferência se as duas seqüências se hibridizarem especificamente entre si sob condições de hibridização e lavagem de rigor moderado a alto. Condições de hibridização de rigor moderado a alto são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Um exemplo de condições de alto rigor incluem hibridização a cerca de 42°C em 50% de formamida, 5X SSC, 5X solução de De25 nhardt, 0,5% de SDS e 100 μg/mL de DNA de veículo desnaturado, seguido por lavagem duas vezes em 2X SSC e 0,5% de SDS à temperatura ambiente e duas vezes mais em 0,1X SSC e 0,5% de SDS a 42°C.

Conforme aqui usado, "composição de limpeza" e "formulação de limpeza" referem-se a uma composição que encontra uso na remoção de compostos indesejáveis (por exemplo, uma mancha) de artigos a serem limpos, como tecido, pratos, lentes de contato, outros substratos sólidos, cabelo (xampus), pele (sabões e cremes), dentes (enxágues bucais, pastas de dentes) e outros. Não se pretende que a presente invenção se limite a qualquer formulação particular, pois os termos englobam qualquer material/composto selecionado para o tipo particular de composição de limpeza desejada e a forma do produto (por exemplo, líquido, gel, grânulo ou composição de s5 pray), contato que a composição seja compatível com a presente enzima na composição. A seleção específica de materiais da composição de limpeza é prontamente feita considerando-se a superfície, artigo ou tecido a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante o uso.

Pretende-se que os termos incluam, mas não se limitem a, com

posições detergentes (por exemplo, detergentes para roupas líquidos e/ou sólidos e detergentes para tecidos finos; formulações de limpeza de superfícies duras, como para vidro, madeira, cerâmica e suportes metálicos e janelas; agentes de limpeza de carpetes; agentes de limpeza de fornos; agentes 15 refrescantes de tecidos; amaciantes de tecidos; e pré-removedores de têxteis e roupas, assim como detergentes para pratos).

De fato, o termo "composição de limpeza", conforme aqui usado, inclui, a menos que indicado de outra forma, agentes de lavagem de uso geral ou de uso pesado na forma granular, de comprimido ou pó, particular20 mente detergentes de limpeza; agentes de lavagem de uso geral em forma líquida, de gel ou pasta, particularmente os tipos líquidos de uso pesado (HDL); detergentes para tecidos finos líquidos; agentes para lavagem de pratos a mão ou agentes para lavagem de pratos de uso leve, particularmente aqueles do tipo de alta espuma; agentes para lavagem de pratos em máqui25 na, incluindo os vários tipos em comprimidos, granulares, líquidos e auxiliares de enxágüe para uso doméstico e institucional; agentes de limpeza e desinfecção líquidos, incluindo lavagens para as mãos antibacterianas, barras de limpeza, enxágues bucais, agentes para limpeza de dentaduras, xampus para carros ou carpetes, agentes de limpeza de banheiros; xampus 30 para cabelos e enxágues para cabelos; géis para o banho e banhos de espuma e agentes de limpeza de metais; assim como auxiliares de limpeza, como aditivos de alvejantes e aditivos "de agarramento à mancha", prétratamento ou para roupas.

Conforme aqui usados, os termos "composição detergente" e "formulação detergente" são usados com referência a composições que sejam formuladas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em modalidades particulares, o termo é usado com referência à lavagem de tecidos e/ou roupas (por exemplo, "detergentes para roupas"). Em modalidades alternativas, o termo refere-se a outros detergentes, como aqueles usados para limpar pratos, talheres e outros (por exemplo, "detergentes para lavagem de pratos"). Não se pretende que a presente invenção se limite a qualquer formulação ou composição detergente particular. De fato, em algumas modalidades, as composições detergentes contêm surfatantes, transferase(s), enzimas hidrolíticas, óxido-redutases, builders, agentes alvejantes, ativadores de alvejantes, agentes de coloração azul e corantes fluorescentes, inibidores de aglomeração, agentes de mascaramento, ativadores de enzimas, antioxidantes e/ou solubilizadores e outros, além da alfagalactosidase.

Conforme aqui usado, "melhor desempenho" em uma composição de limpeza é definido como um aumento da limpeza (por exemplo, remoção e/ou descoloração) de manchas. Em algumas modalidades preferi20 das, as manchas são manchas relacionadas a galactomanano (por exemplo, creme de chocolate, molhos para saladas, guar e outras), conforme determinado por uma avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão.

Conforme aqui usado, o termo "composição de limpeza de superfícies duras" refere-se a composições detergentes para a limpeza de superfícies duras, como pisos, paredes, telhas, instalações de banheiros e cozinhas e outros. Essas composições são apresentadas em qualquer forma, incluindo, mas não limitadas a, sólidos, líquidos, emulsões e outras.

Conforme aqui usado, "composição para lavagem de pratos" refere-se a todas as formas adequadas para composições de lavagem de pratos, incluindo, mas não limitadas a, grânulos, géis, emulsões e líquidos.

Conforme aqui usado, "composição para limpeza de tecidos" refere-se a todas as formas de composições detergentes para a limpeza de tecidos, incluindo, mas não limitadas a, grânulos, líquidos, géis, emulsões e barras.

Conforme aqui usado, "têxtil" refere-se a tecidos, assim como a fibras e filamentos têxteis adequados para conversão em ou uso como fios, tecidos, malhas e tecidos não-tecidos. O termo engloba fios feitos de fibras naturais, assim como sintéticas (por exemplo, manufaturadas).

Conforme aqui usado, "materiais têxteis" é um termo genérico para fibras, intermediários de fios, fios, tecidos e produtos feitos com tecidos (por exemplo, roupas e outros artigos).

Conforme aqui usado, "tecido" engloba qualquer material têxtil.

Assim, pretende-se que o termo englobe roupas, assim como tecidos, fios, fibras, materiais não-tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos e qualquer outro material têxtil.

Conforme aqui usado, "quantidade eficaz de alfa-galactosidase" 15 refere-se à quantidade de enzima alfa-galactosidase necessária para se atingir a atividade enzimática requerida na aplicação específica (por exemplo, composição de limpeza e outras). Essas quantidades eficazes são prontamente determinadas por aqueles versados na técnica e baseiam-se em muitos fatores, como a variante de enzima particular usada, a aplicação de Iim20 peza, a composição específica da composição de limpeza e se é requerida uma composição líquida ou seca (por exemplo, granular, barra) e outros.

Os termos "α-galactosidase" e alfa-galactosidase referem-se a uma enzima que hidrolise resíduos alfa-D-galactose não-redutores terminais em alfa-D-galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose e galacto25 mananos. A alfa-galactosidase aqui descrita tem uma atividade descrita como EC 3.2.1.22, de acordo com a nomenclatura de enzimas IUBMB. O nome sistemático para a alfa-galactosidase aqui descrita é alfa-D-galactosídeo galacto-hidrolase.

O termo "objeto sujo" refere-se a um objeto (por exemplo, um tecido ou prato) que esteja sujo (por exemplo, manchado) com uma segunda composição. O termo "objeto sujo" engloba tecidos sujos, como roupas, lençóis e tecidos sujos, que estejam manchados com alimentos contendo polissacarídeos alimentares não-amido. Em certas modalidades, a mancha tem uma cor visível.

O termo "polissacarídeo alimentar não-amido" refere-se a um polissacarídeo não-amido que seja empregado como uma carga, espessan5 te, estabilizador ou aglutinante de água livre em muitos alimentos (por exemplo, molhos, cremes, laticínios, sorvetes, musses, milkshakes e molhos para saladas). A goma guar, um agente espessante comestível extraído da Ieguminosa feijão guar, e a goma de alfarroba, que é extraída das sementes da alfarrobeira, são exemplos de polissacarídeos alimentares não-amido.

O termo "enzima degradadora de polissacarídeo alimentar não

amido" refere-se a uma enzima que degrada polissacarídeos alimentares não-amido. Enzimas exemplificativas incluem, mas não se limitam a, hemiceiuiase, mananase, pectinase, xilanase, beta-galactosidase e alfagalactosidase.

O termo "goma galactomanano" refere-se a um polissacarídeo

derivado de planta que é composto por polímeros contendo resíduos galactose e manose. Goma guar, goma tara, goma fenugreek e goma de feijão são tipos de gomas galactomanano.

O termo "pH de trabalho" refere-se ao pH de um detergente du20 rante seu uso. Por exemplo, o pH de trabalho de um detergente para lavagem de roupas é o pH do detergente quando é usado para lavar tecidos em uma máquina de lavar ou durante a lavagem manual. Da mesma forma, o pH de trabalho de um detergente para lavar pratos é o pH desse detergente ao ser usado em uma máquina de lavar pratos ou na lavagem de pratos ma25 nual. Em algumas modalidades, detergentes que estejam em forma concentrada ou sólida são diluídos ou dissolvidos antes que o pH desse detergente esteja em seu pH de trabalho.

O termo "concentração de trabalho" refere-se à concentração de uma enzima em um detergente durante o uso. Por exemplo, a concentração de trabalho de uma enzima em um detergente para lavar roupas é a concentração dessa enzima quando o detergente para lavar roupas é usado para lavar tecidos em uma máquina de lavar ou durante a lavagem manual. Da mesma forma, a concentração de trabalho de uma enzima em um detergente para lavar pratos é a concentração dessa enzima no detergente quando é usado em uma máquina de lavar pratos ou durante a lavagem manual. Em algumas modalidades, detergentes que estejam em forma concentrada ou 5 sólida são diluídos ou dissolvidos antes que a concentração de uma enzima no detergente esteja em sua concentração de trabalho.

A presente invenção refere-se composições de limpeza compreendendo uma enzima alfa-galactosidase isolada compreendendo uma seqüência de aminoácidos que esteja relacionada (por exemplo, pelo menos 10 cerca de 90% idêntica) a uma alfa-galactosidase de Trichoderma reesei. Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende pelo menos um surfatante. Em algumas modalidades, a composição de limpeza tem um pH de trabalho que seja de pelo menos cerca de pH 5. A presente invenção também refere-se a métodos para a limpeza de objetos que utilizam as com15 posições de limpeza aqui descritas.

Antes de se descreverem modalidades exemplificativas em maiores detalhes, deve-se entender que esta invenção não se limita às modalidades particulares descritas, pois essas, evidentemente, podem variar. Também se deve entender que a terminologia aqui usada é apenas para fins 20 de descrever modalidades particulares e não pretende ser limitativa, pois o âmbito da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Embora se apresente uma faixa de valores, deve-se entender que cada valor intermediário, até um décimo da unidade do limite inferior, a 25 menos que o contexto claramente determine de outra forma, entre os limites superior e inferior dessa faixa também está especificamente apresentado. Cada faixa menor entre qualquer valor mencionado ou valor intermediário em uma faixa mencionada e qualquer outro valor mencionado ou intermediário nessa faixa mencionada está englobada pela invenção. Os limites superi30 or e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos da faixa, e cada faixa em que qualquer um, nenhum ou ambos os limites estejam incluídos nas faixas menores também está englobada peIa invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa mencionada. Quando a faixa mencionada inclui um ou ambos os limites, faixas que excluam qualquer um ou ambos os limites incluídos também estão incluídos na invenção.

5 Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen

tes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, descrevem-se agora métodos e materiais exemplificativos e preferidos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para expor e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.

Enzima Alfa-Galactosidase

Conforme acima indicado, a presente invenção refere-se a composições de limpeza compreendendo uma enzima alfa-galactosidase. Em algumas modalidades, a enzima alfa-galactosidase tem uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à seqüência de aminoácidos de uma alfagalactosidase de Trichoderma reesei de tipo selvagem. As seqüências de aminoácidos para três exemplos dessas enzimas são conhecidas na técnica (veja Margolles-Clark et al., Eur. J. Biochem., 240:104-11 [1996]). A seqüência de nucleotídeos do mRNA que codifica as enzimas alfa-galactosidase de Trichoderma reesei 1, 2 e 3 (AGL1, AGL2 e AGL3), assim como as seqüências de aminoácidos dessas enzimas, foram depositadas na base de dados GENBANK® do NCBI com os números de acesso Z69253 (GID: 1580815), Z69254 (GID: 1580817) e Z69255 (GID: 1580811), respectivamente. Esses acessos à base de dados GENBANK® são incorporados por referência em sua inteireza, incluindo as seqüências de ácidos nucleicos e proteínas e a anotação dessas seqüências.

As seqüências de aminoácidos para mais de 500 alfagalactosidases diferentes são conhecidas e foram depositadas na base de dados GENBANK® do NCBI, incluindo aquelas de mamíferos (veja, por exemplo, o n° de acesso CAA29232; GID: 757912), plantas (veja, por exemplo, o n° de acesso NP_974447; GID: 42572703) e bactérias (veja, por e5 xemplo, o n° de acesso BAB38524; GID: 13364578). Além disso, as coordenadas atômicas de pelo menos cinco enzimas alfa-galactosidase, incluindo aquelas de seres humanos, arroz e T. reesei (veja, por exemplo, Golubev et al., J. Mol. Biol., 339: 413-422 [2004]) são conhecidas. Os aminoácidos que são conservados em enzimas alfa-galactosidase, incluindo aquelas de T. 10 reesei, também são conhecidos (veja, por exemplo, Margolles-Clark et al., supra; e n° de acesso de domínio conservado COG3345.2 do NCBI).

Em algumas outras modalidades, a enzima alfa-galactosidase é imunologicamente relacionada a uma alfa-galactosidase de Trichoderma reesei de tipo selvagem, cujos métodos para identificação são bemconhecidos nas técnicas de biologia molecular.

Pretende-se que as enzimas alfa-galactosidase da presente invenção sejam produzidas usando-se qualquer método adequado. Por exemplo, em algumas modalidades, a enzima é secretada no periplasma (por exemplo, por organismos gram-positivos, como E. colí) ou no espaço extrace20 lular, por exemplo, por organismos gram-positivos (como Bacillus e Aetinomyeetes) ou hospedeiros eucarióticos (por exemplo, Triehoderma, Aspergillus, Saccharomyees e Piehia).

Em algumas modalidades, a enzima alfa-galactosidase é produzida por expressão de uma proteína de fusão contendo uma seqüência de 25 sinal operacionalmente ligada à enzima alfa-galactosidase em uma célula hospedeira de T. reesei. Em algumas dessas modalidades, a enzima alfagalactosidase é secretada no meio de cultura, de onde é colhida. A seqüência de sinal de uma dessas proteínas de fusão compreende qualquer seqüência de sinal que facilite a secreção da proteína pela célula hospedeira 30 de Triehoderma. Em algumas modalidades, a seqüência de sinal empregada é endógena à célula hospedeira de Triehoderma, ao passo que, em outras modalidades, é não endógena. Em algumas outras modalidades, é uma sequência de sinal de uma proteína que seja sabidamente altamente secretada por uma célula hospedeira de Triehoderma sp. Essa seqüência de sinal inclui, mas não se limita a, a seqüência de sinal de celobio-hidrolase I, celobiohidrolase II, endoglucanases I, endoglucanases II, endoglucanases III, alfa5 amilase, aspartil proteases, glucoamilase, mananase, glicosidase e endopeptidase B de cevada (veja, por exemplo, Saarelainen, Appl. Environ. Microbiol., 63: 4938-4940 [1997]). Em algumas modalidades, e conforme adicionalmente descrito nos Exemplos, a alfa-galactosidase é secretada usando sua própria seqüência de sinal (isto é, as seqüências de sinal de AGL1, A10 GL2 ou AGL3, conforme descrito em Margolles-Clark et al., supra).

Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase é produzida usando-se um ácido nucleico que compreende: um ácido nucleico codificador de seqüência de sinaí operacionalmente ligado a um ácido nucleico codificador de alfa-galactosidase, em que a tradução do ácido nucleico produz uma 15 proteína de fusão compreendendo uma parte alfa-galactosidase com uma seqüência de sinal N-terminal para secreção da parte alfa-galactosidade pela célula hospedeira de Triehoderma.

Em algumas modalidades, a proteína de fusão também contém, além de uma seqüência de sinal, uma "proteína de veículo" que é uma parte de uma proteína que é endógena a e altamente secretada pela célula hospedeira de T. reesei sp. Proteínas de veículo adequadas incluem, mas não se limitam a, as de mananase I de T. reesei (Man5A, ou MANI), celobiohidrolase Il de T. reesei (Cel6A, ou CBHII) (veja, por exemplo, Paloheimo et al., Appl. Environ. Microbiol., 69: 7073-7082 [2003]) ou celobio-hidrolase I de T. reesei (CBH1). Em algumas modalidades, a proteína de veículo é uma proteína CBH1 de T. reesei truncada que inclui a região de núcleo de CBH1 e parte da região de elo de CBH1. Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão contendo, da terminação amino para a terminação carbóxi, uma seqüência de sinal, uma proteína de veículo e uma alfa-galactosidase em ligação operacional.

Em algumas modalidades, a seqüência codificadora da alfagalactosidase é otimizada em termos de códons para expressão da alfagalactosidase na célula hospedeira usada. Como tabelas de uso de códons relacionando o uso de cada códon em muitas células hospedeiras, incluindo Triehoderma reesei, são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Nakamu5 ra et al., Nucl. Acids Res., 28: 292 [2000]) ou prontamente deriváveis, esses ácidos nucleicos são prontamente projetados para fornecer a seqüência de aminoácidos de uma alfa-galactosidase a ser expressada.

Além de uma seqüência codificadora, em algumas modalidades, o ácido nucleico também compreende outros elementos que são necessários para expressão da enzima alfa-galactosidase na célula hospedeira. Por exemplo, em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um promotor para transcrição da seqüência codificadora e um terminador de transcrição. Promotores exempüficativos incluem, mas não se limitam a, os promotores cbhl, cbh2, eg11, eg12, eg5, xln1 e xln2 de T. reesei, ou suas versões híbridas ou truncadas. Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor é um promotor cbhl de T. reesei. Terminadores adequados incluem, mas não se limitam a, os terminadores cbhl, cbh2, eg11, eg12, eg5, xln1 e xln2 de T. reesei, e muitos outros, incluindo, por exemplo, os terminadores dos genes de glucoamilase de A. niger ou A. awamori (veja, Nunberg et al., [1984], supra; e Boel et al., [1984], supra), dos genes de antranilato sintetase de Aspergilius nidulans, dos genes de TAKA amilase de Aspergillus oryzae ou trpC de A. nidulans (Punt et al., Gene 56: 117-124 [1987]). Em algumas modalidades, o promotor e/ou terminador são nativos da célula hospedeira de Triehoderma sp., ao passo que, em outras modalidades, são não endógenos.

Em algumas modalidades, emprega-se uma célula hospdeira de

7. reesei para expressão da enzima alfa-galactosidase. Em algumas modalidades preferidas, a células é geneticamente modificada para reduzir a expressão de proteínas secretadas que sejam endógenas à célula. Em algu30 mas modalidades, a célula contém um ou mais genes nativos, particularmente genes que codifiquem proteínas secretadas, que tenham sido deletadas ou inativadas. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais genes codificadores de protease (por exemplo, um gene codificador de aspartil protease; veja Berka et al., Gene 86: 153-162 [1990]; e patente norte-americana n° 6.509.171) ou genes codificadores de celulase são deletados ou inativos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de Triehoderma sp. é uma 5 célula hospedeira de T. reesei contendo deleções inativadores nos genes cbhl, cbh2 e egl1 e egl2, conforme descrito no WO 05/001036. Em algumas modalidades, o ácido nucleico acima descrito está presente no genoma nuclear da célula hospedeira de Triehoderma sp., ao passo que, em outras modalidades, está presente em um plasmídio que se replica na célula hosp10 deira de Triehoderma.

Pretende-se que o ácido nucleico seja introduzido na célula hospedeira de Triehoderma usando qualquer uma das inúmeras técnicas adequadas (por exemplo, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção [por exemplo, mediada por lipofecção e transfecção mediada por 15 DEAE-Dextrina], incubação com precipitado de fosfato de cálcio e DNA, bombardeamento a alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA e fusão de protoplastos). Técnicas de transformação genéricas são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, WO 05/001036, patente norte-americana n° 6.022.725, patente norte-americana n° 6.103.490, patente norte20 americana n° 6.268.328 e pedidos de patentes norte-americanas publicados 20060041113, 20060040353, 20060040353 e 20050208623, todos aqui incorporados por referência). Em algumas modalidades, a preparação de Triehoderma para transformação inclui a preparação de protoplastos a partir de micélios fúngicos (veja Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56 [1989]). Em 25 algumas modalidades, os micélios são obtidos de esporos vegetativos germinados.

Em algumas modalidades, uma vez secretada no meio de cultura, a enzima alfa-galactosidase é recuperada usando-se qualquer método conveniente (por exemplo, por precipitação, centrifugação, afinidade, filtra30 ção ou qualquer outro método) conhecido na técnica. Por exemplo, encontram uso cromatografia de afinidade (Tilbeurgh et al., FEBS Lett., 16:215 [1984]); métodos cromatográficos de troca de íons (Goyal et al., Biores. Technol. 36:37 [1991]; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 17:314 [1983]; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem. 6:336 [1984]; e Ellouz et al., Chromatography 396:307 [1987]), incluindo troca de íons usando materiais com alto poder de resolução (Medve et al., J. Chromatography A 808:153 [1998]); cromatografia de interação hidrofóbica (Tomaz e Queiroz, J. Chromatography A 865:123 [1999]); partição em duas fases (Brumbauer et al., Bioseparation 7:287 [1999]); precipitação com etanol; HPLC em fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátions (por exemplo, DEAE); cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; ou filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase é usada sem purificação dos outros componentes do meio de cultura. Em algumas dessas modalidades, o meio de cuitura é simplesmente concentrado e, então, usado sem purificação adicional da proteína dos componentes do meio de crescimento ou usado sem nenhuma modificação adicional.

Composições de Limpeza

A presente invenção refere-se a composições de limpeza compreendendo uma enzima alfa-galactosidase acima descrita. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é uma composição de limpeza de 20 tecidos (isto é, um detergente para lavagem de roupas), uma composição de limpeza de superfícies, uma composição de limpeza de pratos ou uma composição detergente para lavadora de pratos automática. Formulações para composições de limpeza exemplificativas são descritas em grandes detalhes no WO 0001826, que é aqui incorporada por referência.

Em algumas modalidades, a presente composição de limpeza

(por exemplo, detergente para lavagem de roupas ou de pratos) contém de cerca de 1 % a cerca de 80% (por exemplo, de cerca de 5% a cerca de 50%) (em peso) de pelo menos um surfatante (por exemplo, surfatantes nãoiônicos, surfatantes catiônicos, surfatantes aniônicos ou surfatantes zwitteri30 ônicos ou qualquer de suas misturas). Surfatantes exemplificativos incluem, mas não se limitam a, alquil benzeno sulfonato (ABS), incluindo alquil benzeno sulfonato linear e alquil sódio sulfonato linear, alquil fenóxi polietóxi etanol (por exemplo, nonil fenóxi etoxilato ou nonil fenol), dietanolamína, trietanolamina e monoetanolamina. Surfatantes exemplificativos que podem estar presentes em detergentes, particularmente detergentes para lavagem de roupas, são descritos nas patentes norte-americanas n— 3.664.961, 5 3.919.678, 4.222.905 e 4.239.659.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza estão em forma sólida (por exemplo, em forma de pó ou comprimido) ou líquida. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza também compreendem pelo menos um tampão (por exemplo, carbonato de sódio, bicar10 bonato de sódio), builder detergente, alvejante, ativador de alvejante, enzima, agente estabilizador de enzima, intensificador de espuma, supressor, agente antiembaçamento, agente anticorrosão, agente de suspensão de sujeita, agente de liberação de sujeita, germicida, agente de ajuste de pH, fonte de alcalinidade não-builder, agente quelante, carga orgânica ou inorgâni15 ca, solvente, hidrótropo, abrilhantador óptico, corante, perfume e outros. Em algumas modaliddes, a composição de limpeza é combinada com um detergente antes do uso como um aditivo para lavagem de roupas.

Em algumas modalidades, a presente composição de limpeza contém uma enzima degradadora de polissacarídeo alimentar não-amido 20 adicional (por exemplo, hemicelulase, mananase, pectinase, xilanase ou pectato liase) e, opcionalmente, uma ou mais enzimas adicionais, como uma protease, como subtilisina protease e/ou proteína SSI, lipase, amilase, celulase, cutinase, lipase, oxidorredutase e outras, para a remoção de outras manchas.

Uma ampla variedade de outros ingredientes utilizáveis em

composições de limpeza detergentes também encontra uso nas composições aqui apresentadas, incluindo outros ingredientes ativos, veículos, hidrótropos, auxiliares de processamento, corantes ou pigmentos, solventes para formulações líquidas e outros. Em algumas modalidades em que se deseja 30 uma formação adicional de espuma, intensificadores de espuma, como as C-io - Ci6 alcolamidas, são incorporados nas composições, tipicamente em níveis de cerca de 1% a cerca de 10%. Em algumas modalidades, as composições detergentes compreendem água e/ou outros solventes como veículos. Álcoois primários ou secundários de baixo peso molecular exemplificados por metanol, etanol, propanol e isopropanol são adequados para uso. Álcoois mono-hídricos são 5 preferidos para a solubilização de surfatantes, mas poliois, como aqueles contendo de cerca de 2 a cerca de 6 átomos de carbono e de cerca de 2 a cerca de 6 grupos hidróxi (por exemplo, 1,3-propanodiol, etileno glicol, glicerina e 1,2-propanodiol) também encontram uso. Em algumas modalidades, as composições compreendem de cerca de 5% a cerca de 90% (tipicamente 10 de cerca de 10% a cerca de 50%) desses veículos.

Em algumas modalidades, as presentes composições detergentes são formuladas de modo que, durante o uso em operações de limpeza aquosa, a água de lavagem tenha um pH entre cerca de 5,0 e cerca de 11,5. Assim, os produtos acabados são tipicamente formulados nessa faixa. Téc15 nicas para o controle do pH nos níveis de uso recomendados incluem o uso de tampões, álcalis, ácidos e outros, e são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente para lavagem de pratos automática que tem um pH de trabalho na faixa de cerca de pH 9,0 a cerca de pH 11,5, de cerca de pH 9,0 a cerca 20 de pH 9,5, de cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,0, de cerca de pH 10,0 a cerca de pH 10,5, de cerca de pH 10,5 a cerca de pH 11,0, ou de cerca de pH 11,0 a cerca de pH 11,5. Em algumas outras modalidades, a composição de limpeza é um detergente líquido para lavagem de roupas que tem um pH de trabalho na faixa de cerca de pH 7,5 a cerca de pH 8,5, de cerca de pH 25 7,5 a cerca de pH 8,0 ou de cerca de pH 8,0 a cerca de pH 8,5. Em algumas outras modalidades, a composição de limpeza é um detergente sólido para lavagem de roupas que tem um pH de trabalho na faixa de cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,5, de cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,0 ou de cerca de pH 10,0 a cerca de pH 10,5.

As composições de limpeza aqui descritas requerem uma quan

tidade eficaz da alfa-galactosidase. Em algumas modalidades, a concentração de trabalho da presente enzima alfa-galactosidade na composição de limpeza é de cerca de 0,01 ppm (partes por milhão, p/v) a cerca de 100 ppm, de cerca de 0,01 ppm a cerca de 0,05 ppm, de cerca de 0,05 ppm a cerca de 0,1 ppm, de cerca de 0,1 ppm a cerca de 0,5 ppm, de cerca de 0,5 ppm a cerca de 1 ppm, de cerca de 1 ppm a cerca de 5 ppm, de cerca de 5 ppm a 5 cerca de 10 ppm ou de cerca de 10 ppm a cerca de 100 ppm.

Vários compostos alvejantes, como os percarbonatos, perboratos e outros, também encontram uso nas composições de limpeza da presente invenção. Em algumas modalidades esses estão tipicamente presentes em níveis de cerca de 1% a cerca de 15% em peso. Em algumas moda10 Iidades adicionais, essas composições também contêm ativadores de alvejantes (por exemplo, tetra-acetil etilenodiamina, nonanoiloxibenzeno sulfonato e outros) conhecidos na técnica. Os níveis de uso tipicamente variam de cerca de 1% a cerca de 10% em peso.

Vários agentes de liberação de sujeira, particularmente do tipo 15 oligoéster aniônico, vários agentes quelantes, particularmente os aminofosfonatos e etilenodiaminadissuccinatos, vários agentes de remoção de sujeira de argila, particularmente tetraetileno pentamina etoxilada, vários agentes dispersantes, particularmente poliacrilatos e poliaspartatos, vários abrilhantadores, particularmente abrilhantadores aniônicos, vários supressores de 20 espuma, particularmente silicones e álcoois secundários, vários amaciantes de tecido, particularmente argilas esmectita e outros também encontram uso nas presentes composições, em níveis variando de cerca de 1% a cerca de 35% em peso. Formulários padronizados são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.

Estabilizadores de enzima também encontram uso nas composi

ções de limpeza da presente invenção. Esses estabilizadores incluem, mas não se limitam a, propileno glicol (de preferência de cerca de 1% a cerca de 10%), formiato de sódio (de preferência de cerca de 0,1% a cerca de 1%) e formiato de cálcio (de preferência de cerca de 0,1% a cerca de 1%).

Em algumas modalidades, composições de limpeza de superfí

cies duras e composições de limpeza de tecidos também compreendem vários builders em níveis de cerca de 5% a cerca de 50% em peso. Builders típicos incluem as zeolitas de 1 - 10 mícrons, policarboxilatos, como citrato e oxidossuccinatos, silicatos em camadas, fosfatos e outros. Outros builders convencionais são relacionados em formulários padronizados.

Outros ingredientes opcionais incluem agentes quelantes, agen5 tes de remoção/antirredeposição de sujeira de argila, agentes dispersantes poliméricos, alvejantes, abrilhantadores, supressores de espuma, solventes e agentes estéticos.

As presentes composições de limpeza encontram uso em métodos de limpeza adequados. Em algumas modalidades, os métodos de Iim10 peza incluem: o contato de uma enzima alfa-galactosidade isolada compreendendo uma seqüência de aminoácidos que seja relacionada a uma alfagalactosidade de Triehoderma reesei com um objeto (por exemplo, um tecido ou prato), sob condições adequadas para a atividade da dita enzima alfagalactosidase, para limpar o objeto. Dependendo do pH de trabalho da com15 posição de limpeza empregada, a enzima alfa-galactosidase é contatada com o objeto a um pH de, por exemplo, cerca de pH 5 a cerca de 6,5, de cerca de pH 6,5 a cerca de 7,5, de cerca de pH 7,5 a cerca de 8,5, de cerca de pH 9,5 a cerca de 10,5 ou de cerca de pH 10,0 a cerca de 11,5. Em algumas modalidades, o objeto é um objeto sujo e, em algumas outras moda20 lidades, o objeto está manchado com um alimento contendo um polissacarídeo alimentar não-amido, como uma goma galactomanano (por exemplo, goma guar ou goma de feijão-de-lima e outros). Em algumas modalidades adicionais, o objeto está manchado com creme de chocolate, sorvete ou molho para salada.

A composição de limpeza aqui descrita é mais eficaz na remo

ção de certas manchas (por exemplo, manchas de alimentos contendo polissacarídeos de galactomanano) do que composições de limpeza equivalentes que não contenham uma alfa-galactosidase. Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção é mais eficaz na remoção de 30 manchas em comparação com uma composição de limpeza de outra forma equivalente que não contenha enzima alfa-galactosidase. Usando-se um ensaio à base de refletômetro padrão, como o descrito no Exemplo 4, por exemplo, algumas composições de limpeza da presente invenção removem e/ou descolorem pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% mais manchas do que uma composição de limpeza equivalente que não contenha a alfa-galactosidase.

Parte Experimental

Os Exemplos a seguir proporcionam aos versados na técnica uma exposição e descrição completas de como preparar e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o âmbito da invenção nem se destinam 10 a representar que os experimentos abaixo sejam todos ou os únicos experimentos realizados. Foram despendidos esforços para assegurar a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura e outros), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser levados em consideração. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes 15 em peso, o peso molecular é o peso molecular médio em peso, a temperatura está em graus centígrados, e a pressão é a ou próxima da atmosférica. Exemplo 1

Clonagem de Genes de Alfa-galactosidase

As seqüências codificadoras dos genes agll, agl2, agl3 e man1 de Triehoderma reesei cepa QM6A foram amplificadas por PCR usándo-se os seguintes iniciadores:

Nome do Seqüência Notas SEQ iniciador ID NO NSP061 GGGGACAAGTTrGTACAAAAAAGCAGGCT Gateway SEQ atgacccctcactcgattoacc AGL1 direto ID NO:1 NSP062 G GG G ACCACTTTCrTA CA AG A A AG CTGGOT Gateway SEQ TCaccagtttcggcacttCTTGC AGL1 rever¬ ID so NO:2 NSP081 GGGGACAAGTTrGTACAAAAAAGCAGGCT Gateway SEQ ATGCTCGGCGCTCCCTCrCC AGL2 direto ID NO:3 NSP082 GGQGAÍXACTTTGTACAAGAAAGCTGGCT Gateway SEQ TCATGTCrGCTTCrCCAAAAACACC AGL2 rever¬ ID so NO:4 NSP091 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT Gateway SEQ ATGTCGCCCAGTGCTGCAGTTC AGL3 direto ID NO:5 NSP092 ggggaccactttgtacaagaaagctggot Gateway SEQ CTAGTGAGTCCfTrrCAGGCGC AGL3 rever¬ ID so NO:6 NSP201 GGGG ACA AGTTT GTACAAAAA AGCA GGCT Gateway SEQ ATGATGATGCTCTCAAAGAGTeTCC MAN1 direto ID NO:7 NSP202 GGGGACCAerTTGTACAAGAAAGCTGGGT Gateway SEQ TCATGTATTCAGGCATrGCGAGTACC MAN1 re¬ ID verso NO:8 e clonados no vetor pTREX3g usando o sistema de recombinação GATEWAY™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). O pTREX3g é descrito em detalhes no Exemplo 6 do WO 05/001036.

Exemplo 2

Transformação de Células de T. reesei

Todos os vetores foram transferidos para a cepa de T. reesei com deleção quádrupla (Achbl, Achb2, AegH e Aegl2) (WO 05/001036) originalmente derivada de RL-P37 (Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 20:46-53 [1984]; patente norte-americana n° 4.797.361) ou uma cepa 1A52pyr4' por bombardeamento de partículas.

Preparou-se uma suspensão de esporos (aproximadamente 5 x 108 esporos/mL) da cepa de Triehoderma a ser transformada. 100 μί - 200 μΙ_ de suspensão de esporos foram espalhados pelo centro de placas de meio MM acetamida (o meio MM acetamida tem a seguinte composição: 0,6 15 g/L de acetamida; 1,68 g/L de CsCI; 20 g/L de glicose; 20 g/L de KH2PO4; 0,6 g/L de CaCI2.2H20; 1 mL/L de solução de elementos residuais a 1000X; 20 g/L de ágar Noble; pH 5,5. A solução de elementos residuais 1000X continha 5,0 g/L de FeS04.7H20, 1,6 g/L de MnSO4-H2O, 1,4 g/L de ZnS04.7H20 e 1,0 g/L de CoCI2.6H20). Deixou-se a suspensão de esporos se20 car sobre a superfície do meio MM acetamida.

A transformação Bioiistic das céluias de Triehoderma foi realizada usando-se um Sistema de Distribuição de Partículas Biolistic® PDS1000/he da Bio-Rad (Hercules, CA), segundo as instruções do fabricante (veja, por exemplo, WO 05/001036 e a patente norte-americana publicada n° 2006/0003408).

5 Exemplo 3

Análise da Atividade da Enzima

Culturas de células contendo vetores para agll, agl2, agl3 e man1 foram cultivadas em um frasco de cultura, e o sobrenadante de cada uma das culturas foi analisado usando-se SDS PAGE. Para cada sobrena10 dante de cultura, a atividade de alfa-galactosidase foi medida em tampão Mcllvaine usando-se 4-nitrofenil-alfa-D-galactopiranosídeo como substrato. Os ensaios de atividade de enzima foram realizados usando-se o protocolo Sigma (Ensaio Enzimático de Alfa-gaiactosidase, Informações de Produtos Sigma; veja também McCIeary, Meth. Enzymol., 160:627-632 [1988]; e fo15 lhas de dados técnicos de alfa-galactosidase de A. niger e Semeadura em Guar, Megazyme), conforme resumidamente descrito abaixo.

Em primeiro lugar, 0,10 mL de substrato foram adicionados a tubos de vidro de 16 x 125 mm, que foram, então, aquecidos em um banho de água à temperatura, incubando-se pelo menos 5 min à temperatura deseja20 da. Então, 0,10 mL de enzima diluída foi adicionado a cada tubo a intervalos de 15 segundos e remoinhado para misturar a enzima com o substrato. As misturas foram incubadas durante 5 min às temperaturas prescritas para os testes (30°C, 37°C, 40°C, 45°C, 60°C e 75°C). Para parar a reação, 3,0 mL de carbonato de sódio a 2% foram adicionados nos mesmos intervalos de 15 25 segundos. As soluções foram misturadas, e os tubos removidos do banho de água para leitura a 410 nm.

Nesses experimentos, as diluições de enzima foram preparadas a 10 mM no tampão apropriado a cada pH (Mcllvaine com um pH de 2,1, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7; acetato de sódio a 80,1 M a pH 4,5). O substrato de enzima 30 para o teste primário foi 4-nitrofenil-alfa-D-galactopiranosídeo (Sigma, cat.: N0877, PM: 301,25). Foram incluídas amostras em branco em cada teste, incluindo substrato, reagente de finalização e amostras de enzima em branco (usou-se p-nitrofenol como substrato de referência).

Os géis de SDS-PAGE mostrados nas figuras 2-4 mostram que, para cada sobrenadante, produziu-se uma proteína com o tamanho aproximadamente correto. Sob as condições de ensaio usadas, AGL1 (que 5 tem um peso molecular previsto de 45,7 kDa) tinha um pH ótimo de pH 5 e uma temperatura ótima de cerca de 60°C (figura 2), AGL2 (que tem um peso molecular previsto de 79,5 kDa) tinha um pH ótimo de pH 4 - 5 e uma temperatura ótima de cerca de 60°C (figura 3), e AGL3 (que tem um peso molecular previsto de 66,3 kDa) tinha um pH ótimo de pH 2 - 4, uma temperatura 10 ótima de cerca de 60°C a pH 4,5 e uma temperatura ótima de 45°C a pH 2,5 (figura 4).

Exemplo 4

Análise por Ensaio em Disco da Atividade de Limpeza de Proteínas Alfagalactosidase de Triehoderma AGL1, AGL2 e AGL3 foram testadas quanto a sua capacidade

de limpar amostras de pano manchadas com creme de chocolate, molho para salada e pigmento guar usando o seguinte método.

Molho para saladas com pigmento (STC CFT CS-6), creme de chocolate (STC EMPA 160) e pigmento guar (STC CFT CS-43) foram apli20 cados a amostras de pano de algodão (Test Fabrics, Inc. West Pittston, PA, USA). Círculos de sorvete de chocolate (mancha de 4 cm sobre amostras de pano de algodão de 10 cm) foram obtidas na Warwick-Equest Limited, Consett, County Durham, Inglaterra.

As amostras de pano para o ensaio em microplaca foram corta25 das em círculos de 15 cm (discos) com a Prensa de Punção de Têxteis Modelo B equipada com um cortador de matriz de 15,875 mm (5/8 de polegada). Discos únicos foram colocados em cada poço de uma microplaca de 24 poços (Costar 3526). Um (1) mL de solução de lavagem contendo por litro 1,5 mL de detergente AATCC HDL (detergente líquido padrão), 50 mM de 30 tampão Hepes, pH 7,4, foi adicionado a cada poço. 1 a 20 μg de enzima diluída foram adicionados com uma pipeta de deslocamento positivo. O Detergente Líquido Padrão AATCC 2003 continha 12% de alquil sulfonatos Iineares, 8% de álcool etoxilatos, 8% de propanodiol, 1,2% de ácido cítrico, 4% de ácido graxo e 4% de hidróxido de sódio, com o restante sendo água. Os poços de controle não continham nenhuma enzima. A microplaca foi coberta com sua tampa de plástico e incubada a 37°C com 100 rpm de rotação sua5 ve. Após 4 - 16 h, os sobrenadantes foram removidos por aspiração, e cada poço foi lavado três vezes com 1,5 mL de PBS de Dulbecco, pH 7,3, e três vezes com 1,5 mL de água destilada. Cada disco foi removido de seu poço e secado durante uma noite ao ar. Os discos foram inspecionados visualmente e analisados com um Refletômetro Minolta CR-200 calibrado sobre uma te10 Iha branca padrão. Os valores L médios foram calculados com a porcentagem de desvio padrão dos dados, com, em geral, 4 replicatas por controle e amostra de teste.

Realizaram-se experimentos usando Detergente de Uso Pesado (HDD) e detergente de Lavagem de Pratos Automática (ADW) usaram de 0,015% a 0,1% de AATCC HDD sem fosfato, pH 10, e de 0,015% a 0,1% de detergente WFK ADW Tipo B sem fosfato. O detergente de uso pesado padrão de referência AATCC 1993 sem abrilhantador continha 18% de alquil sulfonatos lineares, 2% de álcool graxo linear etoxilato e carbonato de sódio para completar 100%, 25% de Zeolita A, 18% de soda calcinada, 0,5% de silicatos de sódio, 22,13% de sulfato de sódio, 10% de umidade e espaço (6,28%) para copolímeros, enzimas ou carbóxi metil celulose. O detergente para lavagem de pratos automática WFK Tipo B sem abrilhantador e sem fosfato continha 30% de citrato de sódio desidratado, 12% de sal sódico de ácido maléico, perborato de sódio mono-hidratado, 2% de tetra-acetil etilenodiamina, 25% de dissilicato de sódio, 2% de álcool graxo linear etoxilato e carbonato de sódio anidro para completar 100%.

Nos exemplos a seguir e figuras anexas, o extrato de proteína contendo AGL1 é chamado de NSP-6, o extrato de proteína contendo AGL2 é chamado de NSP-8, e o extrato de proteína contendo AGL3 é chamado de NSP-9.

Conforme mostrado na figura 5, NSP-6 (alfa-galactosidase 1), NSP-8 (alfa-galactosidase 2) e NSP-9 (alfa-galactosidase 3) mostraram excelente limpeza de manchas de creme de chocolate em detergente líquido de uso pesado AATCC a 0,15% usando o método de disco em microplaca. NSP-20, uma beta-CWDE, é uma abreviação para enzimas degradadoras de parede celular. A figura 6 mostra a limpeza de alfa-galactosidase 1 em man5 cha de molho para salada em detergente líquido de uso pesado AATCC a 0,022%, pH 7,4. A figura 7 mostra que baixas concentrações (0,5 a 1,0 ppm) de NSP-8 (alfa-galactosidase 2) proporcionam uma limpeza significativa de mancha técnica de pigmento guar em detergente líquido de uso pesado AATCC a 0,15%.

Exemplo 5

Análise Terqotométrica da Atividade de Limpeza de Proteínas Alfagalactosidase de Triehoderma

Estudos tergotométricos usaram um Tergotômetro de 6 potes Modelo 7243S (U.S. Testing, Co. Inc. Hoboken, NJ) mantido a 37°C. A velo15 cidade de agitação foi ajustada em 100 rpm. Seis círculos de sorvete de chocolate sobre amostras de pano de algodão foram adicionados a 1 litro de detergente AATCC HDL contendo 6 g/g de dureza (diluída de uma solução de estoque a 15.000 g/g de dureza contendo 1,735 M de cloreto de cálcio e 0,67 M de cloreto de magnésio) e 50 mM de tampão Hepes, pH 7,4.

A figura 8 mostra que a alfa-galactosidase 2 (NSP-8) limpa a

mostras de tecido com sorvete sob condições tergotométricas com 1 ppm de enzima em 30 min.

A figura 9 mostra que todas as três alfa-galactosidases e, particularmente, alfa-galactosidase 2 (NSP-8) mostraram limpeza significativa no método de disco em microplaca (conforme descrito no Exemplo quando dosadas a 20 ppm em detergente para lavagem de pratos automática a

0,015% (WFK), pH 10,5, ou em detergente sólido para lavagem de roupas AATCC a 0,015%, pH 10,2).

Os exemplos acima demonstram que enzimas alfagalactosidases de Triehoderma reesei removem sujeira de amostras de pano de algodão manchadas com molho para salada, creme de chocolate, sorvete e manchas de pigmento guar. A atividade em manchas técnicas de guar pode ser a base da limpeza, pois molho de salada e sorvetes frequentemente contêm goma guar como ingrediente. As enzimas alfa-galacosidase testadas têm bom desempenho em faixas de pH bem fora do esperado.

Todas as publicações e patentes mencionadas no relatório aci5 ma são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações do método e sistema da invenção descritos ficarão claros para aqueles versados na técnica, sem sair do âmbito e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita com relação a modalidades preferidas específicas, deve-se entender que a invenção não deve ser excessivamente limitada a 10 essas modalidades específicas. De fato, pretende-se que várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que sejam óbvias para aqueles versados na técnica e/ou campos relacionados estejam dentro do âmbito da presente invenção.

Tendo descrito modalidades exemplificativas da presente invenção, ficará claro para aqueles versados na técnica que se podem fazer várias modificações nas modalidades expostas, e que se pretende que essas modificações estejam dentro do âmbito da presente invenção.

Aqueles versados na técnica perceberão prontamente que a presente invenção se adapta bem aos objetivos e atinge as finalidades e 20 vantagens mencionadas, assim como aquelas aqui inerentes. As composições e métodos aqui descritos são representativos e não se destinam a ser limitações do âmbito da invenção. Ficará prontamente claro para aqueles versados na técnica que se podem fazer substituições e modificações na invenção aqui exposta sem sair do âmbito e espírito da invenção.

A invenção aqui ilustrativamente descrita pode ser adequada

mente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitações ou limitações que não sejam especificamente aqui expostos. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção de, no uso desses termos e 30 expressões, excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou suas partes, mas se reconhece que são possíveis várias modificações dentro do âmbito da invenção reivindicada. Assim, deve-se entender que, embora a presente invenção tenha sido especificamente exposta por modalidades exemplificativas e características opcionais, aqueles versados na técica podem recorrer a modificações e variações dos conceitos aqui expostos, e que essas modificações e variações são consideradas dentro do 5 âmbito desta invenção, conforme definida pelas reivindicações anexas.

A invenção foi ampla e genericamente descrita aqui. Todas as espécies mais estreitas e agrupamentos subgenéricos que se encontrem dentro da exposição genérica também fazem parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção, com uma condição ou limitação negativa 10 removendo qualquer matéria do gênero, independentemente de o material removido ter sido aqui especificamente citado ou não.

Claims (19)

1. Composição de limpeza compreendendo uma enzima alfagalactosidase isolada que compreende uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos cerca de 90% idêntica a uma alfa-galacotisade de Triehoderma reesei.

2. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente pelo menos um surfatante.

3. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita composição de limpeza tem um pH de trabalho que é maior que cerca de pH 5.

4. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita composição de limpeza é um sólido.

5. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita composição de limpeza é um líquido.

6. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita composição de limpeza compreende um detergente para lavagem de roupas.

7. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita composição de limpeza compreende um detergente para lavagem de pratos.

8. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais.

9. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 8, em que a dita enzima adicional é selecionada de hemicelulases, mananases, pectinases, amilases, xilanases, pectina liases, proteases, celulases, cutinases, lipases e óxido-redutases.

10. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita enzima alfa-galactosidase isolada tem reação cruzada imunoIogicamente com uma alfa-galactosidase de Triehoderma reesei.

11. Método de limpeza compreendendo: o contato de uma enzima alfa-galactosidase isolada compreendendo uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos aproximadamente idêntica a uma alfa-galactosidase de Triehoderma reesei com um objeto, sob condições adequadas para a atividade da dita enzima alfagalactosidase, para limpar o dito objeto.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a dita alfa-galactosidase é contatada com o dito objeto a um pH que seja maior que cerca de pH 5.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o dito objeto é um objeto sujo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o dito objeto sujo compreende um polissacarídeo alimentar não-amido.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o dito polissacarídeo alimentar não-amido é uma goma galactomanano.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o dito polissacarídeo alimentar não-amido é goma guar ou goma de feijão-de-lima.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o dito objeto sujo está manchado com creme de chocolate, sorvete ou molho para saladas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o dito objeto é tecido.

19. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o dito objeto são pratos.