CN1273590C - 酶颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有一个核心单位和一个壳单位的含酶颗粒，其中核心单位含有酶，而且被包裹在一个基本上没有酶的壳单位中，颗粒的直径和核心单位的直径的比至少为1.1。而且还公开了制备这样颗粒的方法和这些颗粒的应用。

Description

酶颗粒
本发明的技术领域
本发明涉及新的含有一种浓缩的酶核心的酶颗粒产品以及用于生产酶颗粒的方法。
本发明的背景技术
已知的酶颗粒制备技术包括：
a)喷雾干燥的产品，其中一种液体的含酶溶液在喷雾干燥塔中被雾化以形成小液滴，这种小液滴在顺干燥塔向下的途中被干燥形成一种含酶的颗粒材料。此方法可以生产非常小的颗粒(Michael S.Showell(编者)；粉末化的去污剂(Powdered detergents)；Surfactant ScineceSeries；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker)。
b)分层的产品，其中的酶用一个环绕预先形成的惰性核心颗粒的层包覆，其中一种含酶溶液典型地在流化床设备中被雾化，其中预先形成的惰性核心颗粒被流化，而且含酶溶液粘附在核心颗粒上并干燥直至留下干燥酶层于核心颗粒的表面上。如果一种所需大小的有用的核心颗粒可以被发现，用此方法就可以获得所需大小的颗粒。此类产品描述于例如WO 97/23606中。
c)吸收的核心颗粒，其中酶被吸收在核心的表面上和/或进入核心的表面，而不是包覆酶作为包绕核心的一层。这样一种方法描述于WO97/39116中。
d)挤压或造粒产品(pelletized products)，其中将一种含酶糊状物压成小丸或者在压力下被挤压进一个小孔，并被切成随后被干燥的颗粒。这样的颗粒通常具有一个可观的大小，原因是制成挤压孔的材料(通常是一个具有孔洞的盘)，对下降经过挤压孔的允许压力有一个限制。而且，当使用一个小的孔时，高的挤压压力增加了在酶糊状物中产生的热量，这对于酶是有害的(Michael S.Showell(编者)；粉末化的去污剂；Surfactant Scinece Series；1998；第71卷；第140-142页；MarcelDekker)。
e)制成颗粒状的产品(prilled products)或者，其中的酶粉末悬浮于熔化的蜡中，并将悬浮液喷雾，例如通过一个旋转盘式雾化器，进入一个液滴快速固化的冷却室(Michael S.Showell(编者)；粉末化的去污剂；Surfactant Scinece Series；1998；第71卷；第140-142页；MarcelDekker)。获得的产品是一种其中酶被均匀地分布在一种惰性材料的各处，而不是被浓缩在惰性材料的表面的产品。而且US 4,016,040和US4,713,245中涉及了此技术。
f)混合器制粒产品，其中将一种含酶液体加入一种传统制粒成分的干燥粉末组合物中。以一种适宜的比例混合液体和粉末，并且由于液体的水分被吸收入干燥粉末中，此干燥粉末的成分开始粘结并结块，并且微粒将增大，形成含酶的颗粒。这样一种方法描述于US 4,016,991(NOVONORDISK)和相关文件EP 170360 B1(NOVO NORDISK)、EP 304332 B1(NOVO NORDISK)、EP 304331(NOVO NORDISK)、WO 90/09440(NOVONORDISK)和WO 90/09428(NOVO NORDISK)中。在其中各种高剪切混合器可以用作制粒机的这样的方法的一个特殊产品中，由酶、填充剂和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以使颗粒加固，获得所谓的T-颗粒。被加固的颗粒(更坚固)，释放很少的酶尘(参见下文)。
US4,707,287公开了一种改进的颗粒酶组合物，它含有一个酶材料的核心和一个含有碱性缓冲液盐的保护性包衣。
JP 08073344的摘要中公开了包裹有酶的蜡胶囊。
US 5,230,822公开了用蜡包封的颗粒。
附图
没有附图
本发明概要
本发明涉及一种含有核心单位和壳单位的含酶颗粒，其中核心单位含有酶，而且被包裹在基本上没有酶的壳单位中，颗粒的直径和核心单位的直径的比至少为1.1。
在第二个方面，本发明涉及了用于制备酶核心单位和含有酶核心单位和壳单位的最终酶颗粒的方法。本发明还涉及含有酶颗粒的组合物例如食品/烘烤/面粉/生面团组合物或去污剂组合物以及这样的组合物在应用方面的用途。
在其它方面，本发明涉及了用于制备含酶核心颗粒单位的特定的制备方法。
本发明的详细说明
定义
此处所用的词组“颗粒的直径和核心单位的直径之间的比”(此后缩写为DG/DC)应理解为含有核心单位和壳单位的颗粒直径除以只是核心单位的直径。如果例如具有直径为100μm的核心单位用200μm厚的包衣层包覆，颗粒的直径将为(200+100+200)＝500μm，DG/DC为500μm/100μm＝5。
术语“活性”在有关酶制剂和酶颗粒或酶核心使用时，是指制剂、颗粒或核心中的酶在固定的标准条件下与一种标准底物反应能力的相对测定。活性用定义为在固定标准条件下每分钟每克所测样品反应底物的微摩尔数的单位测定(此后称作“标准测定”)。活性还可以是活性酶蛋白数量的测定。酶具有比活性，此比活性为标准测定中纯酶蛋白的活性。比活性还可以用定义为在固定标准条件下每分钟每克纯酶反应的底物微摩尔数的单位测定。当已知酶的比活性时，可以计算出样品中纯的酶蛋白的数量。如果在标准测定中，每分钟100微摩尔的底物与1g纯酶样品反应，酶的比活性为100个单位/g纯酶。如果在标准测定中，每分钟有50微摩尔的底物与1g未知酶活性的样品反应，样品的活性为50个单位/g，在样品中有0.5g纯酶蛋白。
术语粒子或颗粒的“大小”应理解为覆盖了在粒子或颗粒的最长尺寸中测定的颗粒直径。而且，颗粒的平均大小应理解为在颗粒的最长尺寸中测定的通过本发明的方法生产的颗粒的平均直径。术语“粒子大小分布”的含意应理解为产生于特定方法的颗粒的大小范围；关于它们的直径的颗粒的光谱或梯度分布。
粒子大小分布(PSD)可以用单个粒子的质量平均直径表示。D50表示的质量平均直径是50％质量的颗粒具有小于此值的直径，50％质量的颗粒具有大于此值的直径。数值D10和D90是指分别有10％和90％质量的颗粒具有比所述的值小的直径。“span”(跨度)应理解为PSD的宽度，表示为：
(D90-D10)/D50。
为了本发明的目的，粒子大小分布一般尽可能地窄。按照本发明，颗粒产品的跨度一般为不超过大约2.5，优选不超过大约2.0，更优选不超过大约1.5，最优选不超过大约1.0，例如在0.1至0.9之间。
术语“粒子(particle)”和“粒状(granulate)”或“颗粒(granule)”可以理解为主要是球形或近似球形的大分子大小的结构。
此处关于壳单位所用的术语“基本上没有酶”是指每克壳中的酶小于5mg。
术语“Rayleigh雾化器”应理解为具有生产低SPAN值液滴能力的雾化器(通常可以得到低于1.5的SPAN值，例如在0.9-1.3之间)，所述的雾化器其特征是包含喷雾部分和表面部分，表面部分包括至少一个孔洞。在一个优选实施方案中，Rayleigh雾化器是旋转雾化装置，在其中通过将液体分布至旋转的有孔洞的空圆柱体的内表面将液体雾化，液体经过圆柱体壁穿过孔洞而形成液滴。这样的雾化器描述于WO 94/21383的权利要求9-30和附图1-18和权利要求1-8中的雾化方法中，所有的内容合并于此作为参考。Rayleigh雾化器的原理和机械构造是本领域中已知的。
颗粒
在本发明的酶颗粒中，酶活性被浓缩入被基本上没有酶的壳单位或包衣包绕的中心核心单位中。此核心单位小于本领域中已知的核心单位，壳单位比本领域中已知的壳单位厚，而且为了使酶颗粒具有适用于酶颗粒已有应用的全部活性，大大地增加了核心单位中的酶活性。本发明较小的酶核心，可以被制成具有窄的粒子大小分布，这提供了通过独立地变化酶核心的大小和包绕的壳的厚度来控制酶活性的新的且灵活的制备方法。而且，本发明的酶颗粒具有环境上有益的特性例如低的粉尘和气味水平，降低的颗粒添加剂的含量和提高的酶储存稳定性。此产品可以具有天然的白色，这样避免了在另外的包衣中添加昂贵并且在环境上有害的色素例如二氧化钛的需要。
本发明的颗粒的特征在于具有这样一种结构，其中DG/DC至少为1.1，其含意是壳单位的厚度至少为核心单位直径的5％。当制备一种所需固定活性的颗粒时，在核心单位中浓缩的酶活性越多，可以制备越小的核心单位，而且可以制备越厚的壳单位。小的核心单位改良了颗粒的性质，并增加了颗粒制备的灵活性。因而在一个优选实施方式中，颗粒的DG/DC至少为1.5，优选至少为2，更优选至少为2.5，更优选至少为3，最优选至少为4。但是，DG/DC优选在大约100以下，优选在大约50以下，更优选在25以下，并且最优选在10以下。DG/DC的最优选的范围为约4至约6。
在酶颗粒的某些实施方式中，酶核心还含有一个包绕核心单位的薄膜层，以保护此核心单位不受壳单位中存在成分的影响。这种保护性的外薄膜层还可以用于其他目的，例如用于酶本身的稳定性和单位结构完整的稳定性，以及储存的目的。
酶核心单位本发明的酶位于酶核心单位内。在大小方面酶核心单位被设计为尽可能地小，但是应当包括用于制粒的必须的酶量，以及用于提供酶核心单位的结构稳定性和/或酶本身的物理和化学稳定性的成分。这样，酶核心单位将含有至少一种酶和任选的一种或多种赋形剂或添加剂。
如果本发明追求优点是，将昂贵添加剂例如酶稳定剂的分散或分布仅仅限制到颗粒的一小部分，则按照相对质量，颗粒的优选实施方式将核心单位的大小限制到构成不超过颗粒总质量的大约30％，例如不超过大约20％，例如不超过大约15％，优选不超过颗粒总质量的大约10％，例如不超过大约5％。
在本发明的优选实施方式中，酶核心单位的大小，按照其最长尺寸的直径，为不超过1000μm，优选不超过700μm或600μm，优选在100μm至500μm之间，例如在100μm至400μm之间，优选在200μm至300μm之间。相对于颗粒的总直径，酶核心单位的直径计划小于壳单位的直径，相对于颗粒的总直径，酶核心单位的直径是两种单位中的小的一个。
此目的是将酶内容物浓缩入总颗粒的小的中心部分。尽管这种小的部分，此处被称作酶核心单位，计划具有小尺寸，但是应当大到在用壳包衣成分制粒过程中足以防止与其他酶核心单位发生结块。为了防止在进一步加工期间，酶核心单位发生结块，酶核心单位的大小优选大于50μm，例如大于100μm。与此相对应的是，酶核心单位以重量计，至少为总质量的1％，例如至少为总质量的2％，例如至少为总质量的5％或10％。在一个优选实施方式中，核心组成颗粒的1％-5％w/w。
本发明的整体特征是将酶活性仅仅限制在核心单位中。本发明定义的颗粒的其他部分或成分，不计划含有酶。但是，正如本领域普通技术人员已知的，在最终颗粒的使用期间，酶可以分散或扩散至其他地方。
酶核心单位的物理状态可以是固体、液体或凝胶。
本发明的优选实施方式含有一种固体的酶核心单位。在本发明的一个实施方式中，当用它的壳单位包封时，酶核心单位是固体。此后，酶颗粒可以在粘合剂或酶核心中其他成分的熔点以上加热，以使这些成分扩散入壳单位的内部而导致酶核心孔隙率的增加。这将反过来又增加核心单位的溶解性。
酶
本申请上下文使用的酶可以任何酶或不同酶的任意组合。相应地，当提到“酶”时，通常应理解为包括单一的酶和一种以上的酶的组合。
应理解的是：术语“酶”包括酶的变体(例如用重组技术制备的)。这些酶的变体的例子公开于以下文献中：例如EP 251,446(Genencor)、WO 91/00345(Novo Nordisk)、EP 525,610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades NV)。本说明书和权利要求书中使用的酶的分类法与学术出版公司出版的生物化学和分子生物学国际联合会命名委员会1992年的建议一致(Recommendations(1992)of the Nomenclature Committeeof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，Academic Press，Inc.，1992)。
相应地，可以加入本发明颗粒中的酶的种类包括氧化还原酶(EC1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂解酶(EC4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
本发明上下文中优选的氧化还原酶是过氧化物酶(EC 1.11.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)，而优选的转移酶是以下任何亚类中的转移酶：
a)转移一碳基团的转移酶(EC 2.1)；
b)转移醛或酮残基的转移酶(EC 2.2)；酰基转移酶(EC 2.3)；
c)糖基转移酶(EC 2.4)；
d)转移除甲基外的烷基或芳香基的转移酶(EC 2.5)；以及
e)转移含氮基团的转移酶(EC 2.6)。
本发明上下文中最优选的转移酶的类型是转谷酰胺酶(transglutaminase)(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰基转移酶；EC2.3.2.13)。
适宜的转谷酰胺酶的进一步的例子描述于WO 96/06931(NovoNordisk A/S)。
本发明上下文中优选的水解酶是：羟基酯水解酶(EC 3.1.1.-)，例如脂酶(EC 3.1.1.3)；植酸酶(EC 3.1.3.-)，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)；糖苷酶(EC 3.2，它在本文称为“糖酶”的组的范围中)，例如α淀粉酶(EC 3.2.1.1)；肽酶(EC 3.4，也称为蛋白酶)；和其他的羰基水解酶。
在本文中，术语“糖酶”不仅用于表示能使尤其是五元和六元环结构的糖链(例如淀粉)断开的酶(即糖苷酶，EC 3.2)，还用于表示能使糖例如六元环结构产生异构的酶，如D-葡萄糖转化成五元环结构如D-果糖。
相关的糖酶包括以下各种(EC号在括号内)：α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.3)、纤维素酶(3.2.1.4)、内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、内切-1，4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、壳多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡萄糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖内切-1，3-β-D-葡萄糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精内切-1，6-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡萄糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖内切1，3-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1，4-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖内切-1，6-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、脱乙酰壳多糖酶(chitosanases)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。
商业上可获得的氧化还原酶(EC 1.-.-.-)包括GluzymeTM(可以从NovoNordisk A/S得到的酶)。
商业上可获得的蛋白酶(肽酶)包括KannaseTM、EverlaseTM、EsperaseTM、AlcalaseTM、NeutraseTM、DurazymTM、SavinaseTM、PyraseTM、Pancreatic Trypsin NOVO(PTN)、Bio-FeedTMPro和Clear-LensTMPro(所有都可以从Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦获得)。
其他商业上可获得的蛋白酶包括MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、OpticleanTM和PurafectTM(能够从Genencor International公司或Gist-Brocades得到)。
商业上可获得的脂酶的例子包括LipoprimeTM、LipolaseTM、LipolaseTMUltra、LipozymeTM、PalataseTM、NoVozymTM 435和LecitaseTM(所有都可以从Novo NordiskA/S得到)。
其他商业上可获得的脂酶包括LumafastTM(从GenencorInternational Inc.获得的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)脂酶)；LipomaxTM(从Gist Brocades/Genencor Int.Inc.获得的类产碱假单胞菌(Ps.Pseudoalcaligenes)脂酶)；和从Solvay酶中得到的芽胞杆菌属(Bacillus sp.)脂酶。另外的脂酶可以从其他的供应商处获得。
商业上可获得的糖酶的例子包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTM Alpha、Bio-FeedTM Beta、Bio FeedTM Plus、Bio-FeedTM Plus、NovozymeTM 188、CelluclastTM、CellusoftTM、CeremylTM、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、FinizymTM、FungamylTM、GamanaseTM、GlucanexTM、LactozymTM、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、PromozymeTM、PulpzymeTM、NovamylTM、TermamylTM、AMGTM(淀粉葡糖苷酶Novo)、MaltogenaseTM、SweetzymeTM和AquazymTM(所有都可以从Novo Nordisk A/S得到)。另外的糖酶可以从其他的供应商处获得。
本发明核心单位中的酶含量(以纯的酶蛋白计算)，一般在占酶核心单位重量的大约20％至100％的范围内，优选不少于按重量计的25％，例如不少于按重量计的30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
但是，一些酶具有很高的比活性，以致于需要较少重量的酶蛋白即可使核心单位保持高酶活性。因而，对于例如蛋白酶来说，优选的核心活性为至少60KNPU/g核心，更优选至少100KNPU/g核心，更优选至少200KNPU/g核心，最优选250KNPU/g核心。此处所用的蛋白酶活性的单位是Kilo Novo Protease Units每克样品(KNPU/g)。通过在标准测定中测量给定数量的核心的游离氨基基团的生成率(微摩尔/分钟)确定酶的活性，此游离的氨基基团是通过酶消化从溶液中的二-甲基-酪蛋白(DMC)中释放出的。通过记录同时进行的形成的游离氨基基团和添加的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的反应在420nm处光吸收的线性发展，监测生成率。并在50℃下在pH8.3硼酸缓冲液中进行消化DMC和颜色反应，反应9分钟然后测定3分钟。应要求可从Novo Nordisk A/S，丹麦，得到一个卷宗AF 220/1，这个卷宗合并于此作为参考。
一般地，对于所有酶，一种优选的核心活性至少是对于具有大于20％w/w的已知酶的核心，可以用已知方法测定的活性。
优选地，结晶或非结晶形式的酶在核心单位内均匀分布或分散。
终颗粒(被包衣的)的酶含量将相当地低。例如，终颗粒中的蛋白酶含量典型地将在1-20KNPU/g范围内，而对于α-淀粉酶，典型的活性是10-500KNU/g。对于脂酶，在50-400KLU/g范围内的活性一般是适宜的。
一种或多种酶的选择取决于颗粒的最终目的。术语“酶”和此术语的一些优选实施例早先已被确定(参见上文)。一种或多种酶或酶的类型，任选需要辅酶，任选作为多酶复合物的部分，任选作为酶原，可以存在于酶核心单位中。
本发明这种方面的一个实施方案包括结构化的酶核心单位，其中，含酶粒子簇集在酶核心单位内以形成一种成簇粒子(clusteved particle)核心单位。每种粒子含有相同或不同的酶，并且任选地可以被包衣。结构化酶核心单位的一个可替代的实施方式是一种分层酶核心单位的实施方式，其中，例如通过流化床层叠，用一种含酶层将一个惰性的能水合的核心颗粒层叠/包衣，以形成一种分层的酶核心单位。此结构化核心单位还可以由一种用含酶层层叠的含酶核心构成，以形成一种多层的酶核心单位。由含有两种或多种酶的结构化核心单位组成的颗粒被称为联合颗粒(co-granules)。这样的联合颗粒是商业上感兴趣的，部分原因是它们将壳单位材料的数量降到最小。典型的联合颗粒具有蛋白酶和淀粉酶活性，但是其他的组合，例如蛋白酶-脂酶-糖酶和许多其他的两种或三种活性和/或酶的组合，也是可以的。联合颗粒可以呈分层结构或呈成簇粒子的结构。
赋形剂
酶核心单位可以含有赋形剂或添加剂，它们可以在核心单位中充当特殊作用。赋形剂可以是本领域中常规使用的化合物，并且可以选自由下列组成的不具有限制作用的组：
-酶稳定剂。酶稳定剂或保护剂例如在制粒领域中常规使用的，可以是含酶单位的成分。稳定剂或保护剂可以归入几类：碱性或中性材料、还原剂、抗氧化剂和/或第一过渡系列金属离子的盐。这些当中的每一种可以与其它同类或不同类的保护剂联合使用。碱性保护剂的例子是通过活跃地中和例如氧化剂提供化学清除效果的碱金属硅酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐。还原性保护剂的例子是亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐或硫代硫酸盐，抗氧化剂的例子是甲硫氨酸、丁基化羟基甲苯(BHT)或丁基化羟基苯甲醚(BHA)。最优选的稳定剂是硫代硫酸盐，例如硫代硫酸钠或甲硫氨酸。而且，酶稳定剂可以是硼酸盐、硼砂、甲酸盐、二-和三羧酸和可逆的酶抑制剂例如具有巯基基团的有机化合物或烷基化或芳基化的硼酸。在WO96/21716中可以发现基于硼的稳定剂的实例，然而优选的一种基于硼酸的稳定剂是在WO 96/41859中描述的4-甲酰基-苯基-硼酸或其衍生物，这两篇公开的文献被合并于此作为参考。适用的酶稳定剂的其他的实例是明胶、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和脱脂奶粉末。酶稳定剂可以占核心单位的0.01-10％w/w，优选占核心单位的0.1-5％w/w，例如0.5-2.5％w/w。
-增溶剂。在其中单位是一种去污剂制剂的成分的情况下，酶核心单位的溶解性特别重要。正如本领域的普通技术人员所知，许多成分，通过许多方法，可以增加制剂的溶解性，并且，对于本领域普通技术人员是已知的典型的成分可以在国家药典中发现。因此，酶核心单位可以任选地含有用以增加酶核心单位溶解性的任意成分。这些成分通常使制剂在与水接触时发生膨胀，或者分解、破裂、爆裂或砸开。
-无机物，例如水溶性和/或水不溶性无机盐例如精细研磨的碱性硫酸盐、碱性碳酸盐和/或碱性盐酸盐，粘土例如高岭土(例如SpeswhiteTM、英国产白瓷土)、皂土、滑石、沸石、碳酸钙、和/或硅酸盐。
-粘合剂，例如具有高熔点或不确定的高熔点和具有非蜡性质的粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、糊精、聚乙烯醇、纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素、甲基纤维素或CMC。一种适宜的粘合剂是碳水化合物类粘合剂，如能从法国Roquette Freres得到的Glucidex 21DTM。
-蜡，例如具有25-150℃，优选35-80℃熔点温度的有机化合物。适宜的蜡包括聚乙二醇；聚丙烯或聚乙烯或其混合物；非离子表面活性剂；来自天然来源的蜡例如巴西棕榈蜡、小烛树蜡和蜂蜡；氢化的植物油或动物脂油；脂肪酸醇；单酸甘油酯和/或二酸甘油酯；脂肪酸和石蜡。
-纤维材料例如以纤维形式存在的纯的或不纯的纤维素。这可以是锯屑、纯的纤维状纤维素、棉花、或其他形式的纯的或不纯的纤维状纤维素。而且，可以使用基于纤维状纤维素的助滤剂。市场上有几种商标的纤维形式的纤维素，例如CEPOTM和ARBOCELLTM。纤维状纤维素助滤剂的有关实例是Arbocel BFC200TM和Arbocel BC200TM。而且，如EP 304331 B1中所述的合成纤维可以使用，而且，典型的纤维可以由聚乙烯、聚丙烯、聚酯、特别是尼龙、聚甲酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸化合物制成。
-交联剂例如与酶相匹配的表面活性剂例如乙氧基化醇，特别是具有10至80个乙氧基团的。它们可以在壳单位和酶核心单位两者中存在。
-悬浮剂、介质(在例如洗涤应用中增强颗粒溶解后的漂白作用)、和/或溶剂可以作为常规的制粒成分加入。
-粘度调节剂。粘度调节剂可以存在于核心单位中，如核心单位的制备中所述。
与本发明较小尺寸的核心单位有关的一个重要特征是其中含有赋形剂的体积远远小于已知核心单位的体积。对于计算在核心单位中赋形剂的最佳浓度来言，为获得这样浓度所需要的赋形剂的绝对数量减少。由于赋形剂通常是昂贵的特制化学品，因而，这种特征减少了本发明颗粒的生产费用。
壳单位
本发明的壳单位比已知的壳单位厚，优选厚度为至少25μm。更为优选的厚度为至少50μm，例如至少75μm，至少100μm，至少150μm，至少200μm，至少250μm，最优选至少为300μm。
壳单位含有一种或多种常规的壳或包衣成分例如WO 89/08694、WO89/08695、270608 B1和/或PA 1998 00876(在此发明的优先权日未出版的丹麦优先权申请)。在US 4,106,991、EP 170360、EP 304332、EP 304331、EP 458849、EP 458845、WO 97/39116、WO 92/12645A、WO89/08695、WO 89/08694、WO 87/07292、WO 91/06638、WO 92/13030、WO 93/07260、WO 93/07263、WO 96/38527、WO 96/16151、WO 97/23606、US 5,324,649、US 4,689,297、EP 206417、EP 193829、DE 4344215、DE 4322229A、DD 263790、JP 61162185 A和/或JP 58179492中可以发现常规包衣材料的其他实例。描述于PA 1998 00876的盐包衣层，尤其适用作本发明的壳单位。
壳单位组合物中所包含的组份可以选自上面“酶核心单位”部分所描述的赋形剂名单。其他的组份可以选自下列不具有限制作用的氯清除剂、增塑剂、色素、润滑剂(例如表面活性剂或抗静电剂)和香味剂名单。
在本发明的上下文中用于包衣层的增塑剂包括例如：多元醇，例如糖、糖醇或分子量小于1000的聚乙二醇(PEGs)；尿素，邻苯二甲酸酯例如邻苯二甲酸二丁基或二甲基酯；和水。
适宜的色素包括但不限于精细分散的增白剂，例如二氧化钛或高岭土，着色的色素，水溶性着色剂，及一或多种色素和水溶性着色剂的组合。
用于本文中时，术语“润滑剂”指任何降低表面摩擦力、使颗粒表面润滑、减少形成静电的趋势和/或降低颗粒脆碎性的成分。润滑剂通过降低包衣层中粘合剂的粘结性，在改进包衣过程方面也可以起到相关作用。因此润滑剂可以作为抗聚结剂和湿润剂。适宜的润滑剂的例子是聚乙二醇(PEGs)和乙氧基化脂肪醇。
在主要致力于去污剂组合物的实施方式中，可以向壳单位中添加本领域普通技术人员已知用于去污剂制剂的不同的“功能性”组份例如TAED、CMC、漂白剂、OBA、表面活性剂、香料以及其他的功能性组份。壳还可以任选地含有为了特异地用于可使用酶颗粒的食品工业、烘烤工业、添加剂工业、饲料工业、去污剂工业或其他工业而选择的功能性组份。
在本发明的优选实施方式中，本发明的颗粒用一种如合并于此作为参考的丹麦专利申请PA 1998 00876第5-9页中所述的具有高恒定湿度的保护性包衣层包衣。因而，在某些实施方式中，壳应当充当一种用于稳定核心单位中的酶活性的水分和/或漂白剂的屏障。而且，在可替代的实施方式中，壳单位在例如配料、压片的机械方法中充当一种机械的屏障。在某些实施方式中，壳单位具有足够的可压缩性和易弯曲性，能够使酶核心单位在结构意义上和活性方面均经得起压片处理。这潜在地最适用于去污剂制剂。
壳单位，在许多方面与常规的包绕含酶核心的壳单位或包衣层相似，除显著的区别外，那就是它比已知的壳单位厚，优选比已知的壳单位厚很多。而且，与常规的薄壳单位相反，本发明的壳单位含有极少的酶。在酶颗粒的制备期间，核心单位中的一些酶通常不希望地穿过或扩散进入壳单位，并且甚至到达颗粒的外表面。但是，在本发明中，壳单位增加的厚度减少了酶在壳中的相对含量，结果是单位重量壳的酶的数量保持得非常低。而且，通过增加壳单位的厚度，可以预防酶到达颗粒的外表面。这样，按照此处所用的定义，壳单位可以被认为基本上没有酶。本发明增加的壳单位的厚度，减轻了当处理干燥形式的颗粒时被释放的酶尘的数量，例如在众所周知的Heubach实验方法中确定的酶尘的数量。
壳单位为核心单位中的酶提供了保护，原因是它完全将核心单位的环境从包绕颗粒的环境中分离出来，核心单位中的酶通常是稳定的，颗粒外的环境通常对于酶是不利的。常规的薄壳单位提供较少的保护，并且必需在壳单位中加入昂贵的酶保护剂，它能中和从周围环境中穿过壳单位并进入核心单位的有害的成分。通过使用厚壳单位，通过核心单位和周围环境之间的距离，减少了这个过程。在一个优选的实施方式中，向壳单位中添加酶保护剂变得没有意义，而且壳单位基本上没有酶保护剂。在上下文中使用了术语“基本上没有”，其意味着不需要有目的地向壳单位中添加酶保护剂。但是，在制备颗粒的过程中，来源于核心单位的酶保护剂可以从核心单位经过或扩散入壳单位。因而，此术语的含义是壳单位中的酶保护剂的浓度为核心单位中浓度的不到10％w/w。当加工含有本发明颗粒的产品(例如饲料的蒸汽造粒)时，壳单位还可以保护核心单位中的酶。在某些条件下，在蒸汽过程中所使用的高温可以使酶变性，因此减少或破坏它们的活性。壳单位还含有赋予壳单位以抗热性的成分，或它的所有组合物使得壳单位将在一种酶仍然十分稳定的温度下熔化。这使得在酶紧靠的环境内的温度在某一时间内，不会上升到高于壳单位的熔点(所讨论的时间还取决于壳单位的厚度)。因而在(蒸汽)造粒过程中适于保护核心单位中的酶的壳单位，应当具有70-120℃的熔化温度或温度范围。
本发明壳单位的一个重要特征是增加的厚度和壳单位的组合物有助于颗粒的性质例如整体活性、颗粒的大小和密度。因而在本发明中，通过变化组合物和壳单位的厚度可以调整终颗粒的活性、大小和体积密度。对于一种给出的核心单位，较厚的壳单位和较重的壳单位组合物使终颗粒的活性降低、大小增加和体积密度增加。这意味着使用仅仅一种类型的核心单位可以制备适用于不同目的和应用的大范围的不同颗粒。这是可以达到的，原因是变化壳单位的厚度可以调整颗粒的性质例如活性、大小和密度，而并不引起壳单位发生机械、结构或保护性性质的严重恶化。
可以根据其目的，是作为去污剂、食品、烘烤剂、动物饲料或任何本领域普通技术人员已知的其他用途，改变壳单位的大小以满足生产者的需要。
而且，密度还是酶颗粒的一个重要特征。在含有酶颗粒的去污剂制剂的实例中，一种不适宜的颗粒密度导致去污剂组份分离，这将导致产品性能的不稳定。这是非常不想要的，并且此问题已经得到了许多关注。
在某些实施方式中，壳可以含有几层，每一层具有一种特殊作用。
在一种优选的实施方式中，壳具有一个液体润滑剂的外层。润滑剂的目的是给颗粒涂脂以增加颗粒的流动能力并抑制处理期间颗粒碰撞时产生的尘埃。润滑剂优选矿物油或非离子表面活性剂，特别优选的润滑剂是与其他壳材料不混溶的。
制备核心单位；壳单位和颗粒的方法
在致力于改进酶颗粒制剂的不间断的研究中(其不仅涉及颗粒的性质方面，而且涉及方法设计和经济设计)，现已开发了用于制备被一个厚壳单位包绕的具有高酶活性的小核心单位的概念上新的制备方法。因而本发明涉及一种用于制备具有核心-壳构型的含酶颗粒的方法，包括用壳包衣含酶核心的步骤，使得颗粒直径与核心单位直径的比至少为1∶1。
在此方法中，制备核心单位的方法可以在时间和地点上与在核心单位上包衣优选基本上不含酶的壳单位的方法完全分离，并且通过改变壳的厚度和组合物，以及通过制备具有窄的粒子大小分布和均匀的酶水平的核心单位，可以对所得颗粒的性质进行调整，并为特殊应用而定制。
当制备所需性质的酶颗粒时，一种其中用具有增加了厚度的壳包衣具有高的或浓缩的酶活性的核心单位的方法，提供了几种优点：
·可以独立于在核心单位上施用壳的方法，而制备核心单位，原因是终颗粒的例如大小、活性、密度、颜色、酶尘水平、气味、机械和物理强度等的性质，可以通过壳单位进行调整。这意味着使用仅仅几种基本类型的核心单位，就可以制备大范围的适用于不同目的和应用的不同颗粒。本发明的方法提供了巨大的合符逻辑的优点，原因是核心单位可以独立于包衣方法制备，并且可以作为独立的物理实体或产品中间体而在适当条件下稳定地运输和贮藏，根据需要，这些实体或中间体可以引入到包衣或包壳方法中，以产生设计用于特定应用的最终颗粒。贮藏条件优选那些其中湿度水平和温度是可控的条件，或其中酶核心被包装的那些条件，其在例如一个气密的容器中是稳定的。事实上，在制备核心单位和制备终颗粒之间可以在时间和地点上存在大的区别。在制备核心单位和将壳单位施用于终颗粒之间所存在时间差异或时间跨度可以是几小时(1-24小时)、几天(1-7天)、几星期(1-52星期)和甚至几年(1-5年)，而且此方法提供了在一个地理地区(例如一个国家)制备核心单位，在另一个地理区域(例如另一个国家)制备终颗粒。因而，可以以低费用容易地将储存稳定的核心单位装运至当地的完成地点，以便应用一种符合计划的当地市场特殊需要的壳单位。而且，此浓缩的酶核心单位降低了贮藏要求，并且减少了在包装、装运和处理方面的环境危害。
·由于在包衣或包壳方法中将终颗粒的许多性质赋予颗粒，因此，可以选择或开发提供核心单位的窄的颗粒粒度分布的制备核心单位的方法。由于进一步加工核心单位例如筛选、分离以及对超过或不足尺寸核心的再循环的需要的减少，因而此方法在制备期间减少了酶活性的损失。再循环方法是昂贵的并且可以招致酶活性的损失。
·通过减少再循环节约能量。
·通过减少再循环的比率增加生产能力。
·活性控制的改进。一旦活性和核心单位的大小被确定，通过测定终颗粒的大小，就可以即时容易地估计出活性和终颗粒的大小。
·在终颗粒活性方面的均一性增加。
核心单位的制备
用本领域普通技术人员已知的技术可以生产本发明的酶核心。适宜技术的不具有限制意义的实例是喷雾冷却、喷雾干燥、熔化制粒和高剪切制粒。还可以使用多种这些技术的结合。
在一个实施方式中，制备核心单位的方法是喷雾冷却方法。喷雾冷却方法是这样一种方法，其中在酶没有变性的温度下，将一种酶分散和/或溶解在一种熔化的物质中，并将混合物冷却至使加有酶的物质固化。此物质优选有机物，并且其熔化温度或熔化温度范围在20-150℃，优选在35-80℃。这样的物质常被称作“蜡”(参见Michael S.Showell(编者)；粉末化的去污剂；Surfactant Science Series；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker)。
在一个喷雾冷却方法中，通过将混合物雾化为液滴，并将液滴在冷却的气流中固化，典型地是在冷却塔中，完成含酶熔化蜡的混合物的固化，由此可以获得具有狭窄PSD的酶核心单位颗粒。
通过将一种优选纯化结晶或非结晶的酶(例如WO 91/09943中所述的)混合入熔化的蜡中，完成酶在熔化的蜡中的施加。在一个特别优选的实施方式中，酶和任选的其他成分是可以被分散或悬浮于熔化的蜡中的干粉末形式例如喷雾干燥产物。熔化蜡的雾化可以用许多方式完成，其中优选使用高速旋转的盘式雾化器、压力喷嘴、气动喷嘴或声波喷嘴，例如1990年5月9日至5月11日在阿姆斯特丹由专业进步中心(Centerfor professional advancement)举行的微胶囊研讨会的会议资料中所述的。通过冷却完成的液滴的固化优选在冷却容器例如一个塔中进行，其中将雾化的酶在熔化蜡中的分散体或溶液引入位于塔顶的冷空气流中，并在液滴穿过向塔底流的冷空气的同时，液滴发生固化。为了避免不需要的固化和在进料管道和雾化器中堵塞，熔化的蜡、酶和任选的其他成分优选在至少高于开始固化温度30℃以上的温度下向雾化器中进料。应该将用于冷却熔化蜡混合物的空气的量和温度调整至能够从熔化蜡的混合物中去掉足以能够固化的足够的热量(液体显热、固体的熔化潜热和固体显热)。在一个优选实施方式中，离开冷却塔的空气温度大约低于离开冷却塔的固体颗粒温度5℃以下。
喷雾冷却或喷雾骤冷的一般技术是本领域中已知的，并且可以使用例如K.Masters，化学工业中的应用，第14.10.1部分，第565-566页，喷雾干燥手册(Spray drying Handbook)，第3版，1979，George GoodwinLdt.伦敦，ISBN 0-7114-4924-4/John Wiley & Sons，纽约中描述的已知的仪器完成。
优选的特殊雾化器是Rayleigh雾化器，用此雾化器可以获得特别窄的粒子大小分布。这样的一种雾化器描述于WO 94/21383中。这种雾化器允许这样一种方法，该方法中由于具有各种各样的尺寸必须经过再处理的核心单位的数量相当的低。虽然喷雾冷却方法是一种能量非常有效的方法，其中熔化的热量大大小于蒸发的热量，但是由于能力限制和可能损失酶活性，不希望具有任何值得注意的产品的再循环。
作为一种可替换的方式，核心单位还可以通过下列方法制备，该方法包括制备熔化蜡中的酶和任选的其他成分的分散体，使蜡固化，将加有酶颗粒的固化蜡研磨/或碾碎，和任选地将颗粒变成圆形，例如用球形造粒方法。
基于蜡的核心单位(即含酶粒子)的另一种优选的可替换的制备方法是一种下列方法，它包括：
(a)将酶分散或溶解于熔化的蜡中，
(b)将此分散体移入液相例如油中，在该液相中此酶和蜡两者都不与之相混溶，
(c)形成酶-蜡分散体小液滴在此液相中的乳状液，
(d)冷却此液相和酶-蜡液滴，以将蜡固化为粒子，
(e)从此液相中分离出粒子。
为了本发明的目的，将此类型的方法表示为乳化制粒方法。
生产酶核心单位的另一个可能实施方式是一种用与喷雾冷却方法相同或相似类型的喷雾器优选Rayleigh喷雾器的特殊喷雾干燥方法。这仅仅需要一个大得足够能使较大量的液滴干燥至所需酶核心尺寸的喷雾干燥塔。这种方法途径将导致一个在能量和金钱投资两方面均非常有效的方法。
在本发明的另一个实施方式中，通过一种熔化制粒方法生产酶核心单位。熔化制粒方法是本领域普通技术人员已知的方法(参见Meltagglomeration with polyethylene glycols in high shear mixers，Torben Schaefer，The Royal Danish School of Pharmacy，1996)。优选在喷雾干燥之前，在酶方法中添加熔化粘合剂。
通过一种高剪切制粒方法制备酶核心，其中在被移入一个高剪切搅拌机之前，将如任何在前方法生产的喷雾干燥的酶粉末与例如纤维素、糊精和硫酸盐的成分混合。可以在水中加入粘合剂溶液和糖直至达到所需的平均颗粒尺寸。
此酶核心单位或者可以直接在制备后使用，或者以一种中间产品贮藏，以后，此产品可以在相同的生产地点被处理，或者装运至其他的专门化的生产地点，在此地点从相同的酶核心中可以生产出几种不同的产品。所以，与一次只能生产一种产品类型的现有技术相比，此方法非常的灵活。另外，在酶核心方法中，最小适宜的批量大小是非常小的，原因是此方法中的产品滞留量小。在此方法的一个实施方式中，在装运、贮藏之前，将一个薄的薄膜用于此酶核心单位上，或将其立即进一步加工成终颗粒。在某些实施方式中，薄膜层在随后的壳包衣步骤中是有益的，这是通过包括有助于粘合的材料实现的。
壳单位的施加
也可以使用本领域普通技术人员已知的技术例如机械包衣方法和/或流化床包衣方法完成壳单位的形成和施加。
包衣步骤即将壳添加在酶核心单位上，可以以一种其中将核心单位与包衣材料在一个搅拌机例如盘式制粒机中混合的纯机械包衣方法进行，或者以一种其中将核心流化并将壳材料的溶液或分散体喷在核心上的流化床包衣方法进行，或者以机械包衣和流化床包衣结合的方法完成。这些方法均可以使用，例如首先用流化床包衣增加酶核心的大小使之达到某一最小尺寸，然后用机械分层方法使之达到最终尺寸，或者仅使用它们中的一种。在包衣方法的优选实施方式中，壳的内部部分产生于流化床方法中。
为了提高生产率，机械包衣方法还可以与流化床干燥步骤联合使用。
酶颗粒的应用
本发明还涉及含有本发明酶颗粒的组合物。组合物可以是任意组合物，但是优选那些用于食品、烘烤和/或去污剂工业的组合物。因而此组合物可以是食品、发面面粉、生面团或去污剂组合物或一种加入这些组合物中的添加剂。本发明还包括此组合物的用途，例如用于改进食物例如面包或用于清洁物体例如一种含纤维素的织物。
如上所述的酶颗粒可以在多种工业中应用。而且，在每一种工业中，此颗粒均可以被定制以适合生产者的需要、市场的需要、最终用户的需要以及当地市场的“文化/社会”习惯。定制成此颗粒的整个制剂以适合于特殊需要的实例之一是在去污剂工业中作为一种后来在生产和加工阶段被使用的酶颗粒。日本市场需要一种有效的并对在短时间内冷水洗涤适用的颗粒；美国市场需要一种有效的并对结构化液体制剂和热自来水温度适用的颗粒；欧洲市场需要一种有效的并对热洗涤温度和长洗涤时间适用的颗粒；东南亚和亚洲市场需要一种有效的并对使用肥皂条手洗适用的颗粒。如果壳单位和最终的制剂单独制做，或者甚至在当地制做，所有这些市场均能被非常适宜地迎合。通过单独制备酶核心，使它们被运送至多种加工厂以服务于特殊市场的多种需要，来使本发明满足此要求。
用酶核心作烘烤添加剂
在本发明的一个特殊实施方式中，我们已经发现：我们对小的含有持久酶的核心单位的开发，在某些工业部门是有用的。在这些部门中，此核心单位本身可以使用。
在面粉碾磨和烘烤工业内酶的使用被很好地建立。但为了在面粉组合物中加入酶粒子，此粒子的大小不应该超过200μm的大小。这样小的粒子，常规只能以喷雾干燥产品的形式得到。但是，常规的喷雾干燥产品通常是非常小粒子的易碎结块，并且趋向于释放酶尘。在一些喷雾干燥方法中，最初在干燥步骤形成了非常小的粒子，这些粒子随后在喷雾干燥方法的末期结块或胶合在一起形成较大的在一定程度上易碎的结块。这样的结块粒子优选平均直径或大小在150-2000μm的范围内。在其他喷雾干燥方法中，例如使用WO 94/21383中的雾化装置，可以生产较小的无结块的较均匀粒子，这是由于雾化器的特殊设计所致。
因而，由于我们开发使用Rayleigh雾化器，本发明提供了一种喷雾干燥或喷雾冷却方法的酶，它含有平均大小在200μm以下的分散粒子。
因而，本发明提供了一种用于制备含有酶的粒子的方法，此方法包括通过Rayleigh雾化装置，将含有酶的液体原料雾化。此方法优选喷雾干燥方法，其中含酶的液体是水性的，或喷雾冷却方法，其中的液体是蜡。本发明还包括用此方法获得的含酶核心粒子的组合物，特别是含有此酶核心粒子的生面团改进剂组合物或含有生面团改进剂的面粉组合物。
关于大小，此实施方式的粒子具有低的平均直径，优选在50至300μm的范围内，特别优选在50至200μm的范围内，最优选在50至150μm的范围内。
水含量为10-15重量％的粒子，优选通过将喷雾干燥的粒子引入一个流化床干燥装置进一步干燥至一个较低的水含量例如在大约5％w/w以下，装置中的喷雾干燥粒子通过一个向上的优选加热和干燥的空气流流化，从流化的粒子中蒸发多余的水分。
在此实施方式的上下文中，还包括含有通过Rayleigh雾化器获得的酶粒子的组合物。优选的组合物为生面团或面粉组合物。
当在烘烤工业中使用酶时，某些酶的活性是优选的。面粉具有不定的淀粉酶含量导致烘烤质量的不同。为了使面粉标准化，添加淀粉酶可能是必须的。淀粉酶和戊聚糖酶通常提供用于酵母发酵的糖，增加面包的体积，减慢退减作用和降低陈腐率和由戊聚糖胶产生的粘性。下面给出糖酶的实例。
某些麦芽淀粉酶可以用于延长面包的货架时间2天或以上的时间，并不引起产品中的粘合性。通过从淀粉分子、低分子量的糖和糊精的非还原端断裂对胶化的淀粉进行选择性的修饰。淀粉以这样的方式修饰，以使退减较小可能地发生。所产生的低分子量糖，在不制造将导致终产品发粘的中等长度糊精的情况下，增加了烘烤商品的保水能力。在面包烘烤期间，酶被灭活，因此可以认为它是一种不需要必须在标签上标明的加工助剂。
通过真菌α-淀粉酶可以增加面包的体积，真菌α-淀粉酶还可以提供良好和均匀的面包心结构。
所述的α-淀粉酶是能够产生麦芽糖、糊精和葡萄糖的内切酶。在高于淀粉胶化温度的温度下，谷类的和一些细菌的α-淀粉酶被灭活，因此，当被加入小麦生面团时，导致面包体积小和面包内部发粘。真菌淀粉酶具有不耐热的优点并且仅仅在胶化温度以下即被灭活。
含有大量戊聚糖酶和半纤维素酶活性的酶制剂，可以使生面团易于处理、增加生面团的稳定性，并且可以促进面包新鲜、改善面包心的结构和增加体积。
通过水解面粉中的戊聚糖部分，将损失大量结合水的能力，然后这些水可以为淀粉和面筋所利用。面筋是易弯的并且可延伸的，而且淀粉更易于胶凝。戊聚糖酶可以与乳化剂联合使用，也可以替代乳化剂使用。
去污剂组合物
可以将本发明的酶颗粒加入，并因此成为去污剂组合物的一个成分。
本发明的去污剂组合物可以例如配制成其中包括了适用于污染的纺织物预处理的洗涤添加组合物以及加入了织物软化剂的漂洗组合物的手洗或机洗洗衣去污剂组合物，或配制成用于一般家用硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制成用于餐具的手洗或机洗操作的去污剂组合物。
在一个具体方面，本发明提供含有本发明酶的去污添加剂。该去污添加剂以及该去污剂组合物可以含有一或多种其它酶例如蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常，所选酶的性质应与所选的去污剂相适应，(即最适pH、与其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，并且该一种或多种酶应当以有效的量存在。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选微生物的碱性蛋白酶，或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶；尤其是来自芽胞杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO94/25583中的镰孢霉属蛋白酶。
有用的蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO98/20116和WO 98/34946中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的商业上可获得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂酶：合适的脂酶包括细菌或真菌来源的脂酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的脂酶的例子包括来自腐质霉属(同义词Thermomyces)的脂酶，例如EP 258 068和EP 305 216中描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂酶、或WO 96/13580中描述的来自H.insolens的脂酶；假单胞菌属(Pseudomonas)的脂酶例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331 376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属的菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂酶；芽胞杆菌属脂酶例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂酶。
其它例子包括例如描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中的脂酶变体。
优选的商业上可获得的脂酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)。
淀粉酶：适合的(α和/或β)淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰的突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。淀粉酶包括，例如，从芽胞杆菌属例如地衣芽孢杆菌的特定菌株中获得的α-淀粉酶，更详细的描述在GB 1,296,839中。
有用的淀粉酶的例子是描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO 97/43424中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可获得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/s)、RapidaseTM和PurastarTM(来自GenencorInternational Inc.)。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如由Humico1a insolens、Myceliophthorathermophila和尖镰孢产生的真菌纤维素酶，它们公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。
特别适合的纤维素酶是具有护色功能的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其它例子有例如描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纤维素酶变体。
商业上可获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovoNordisk A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor InternationalInc.)，以及KAC-500(B)TM(Kao公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞菌属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C.Cinereus)的过氧化物酶，和WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的它的变体。
商业上可获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可以通过加入含有一或多种酶的独立添加剂，或通过加入含有所有这些酶的组合添加剂，将这样的一种或多种去污剂酶包含在去污剂组合物中。本发明的去污剂添加剂即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制成含有一种或多种本发明的酶颗粒。
本发明的去污剂组合物可以是任何方便的形式例如条形、片剂、粉末、颗粒、糊或液体。液体去污剂可以是水性的，典型地含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或者是非水性的。
该去污剂组合物含有一或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子的包括半极性表面活性剂，和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。这些表面活性剂典型地按重量计以0.1％到60％的水平存在。
当被包括在内时，该去污剂通常含有大约1％到大约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。
当被包括在内时，该去污剂通常含有大约0.2％到大约40％的非离子表面活性剂例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺，或氨基葡糖(“葡糖酰胺”)的N-酰基N-烷基衍生物。
该去污剂可以含有0-65％的洗涤助剂或络合剂例如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸酯，碳酸盐，柠檬酸盐，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
该去污剂可以包含一或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
该去污剂可以含有漂白体系，该漂白体系可以包括H2O2来源物质例如过硼酸盐或过碳酸盐，并且可以与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰羟苯磺酸盐结合。或者，该漂白体系可以含有例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。
本发明去污剂组合物中的酶可以通过使用常规稳定剂来稳定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且该组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述的方法配制。
该去污剂还可以含有其它常规去污成分，例如包括粘土在内的织物调理剂、发泡助促进剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、光增亮剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂或香料。
目前正在设想，在该去污剂组合物中可以加入任何酶，尤其是本发明的酶，其加入量相当于每升洗涤液中加入0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液中加入0.05-5mg酶蛋白，尤其是每升洗涤液中加入0.1-1mg酶蛋白。
此外还可以将本发明的酶加入WO 97/07202中所公开的去污剂制品中，其中WO 97/07202在此以参考文献方式并入。
实施例
本发明通过下列非限制性实施例进行说明。
实施例1：
将固体含量为33％w/w的3kg Savinase酶(从Novo Nordisk A/S-丹麦获得的一种蛋白酶)浓缩物加入10％w/w的糊精粘合剂。此混合物中酶的活性近似为98KNPU/g。在进口空气温度为175℃、出口空气温度为60℃、由二流喷嘴并流雾化的MobileMinor实验室喷雾干燥器中喷雾干燥，获得平均颗粒大小约为20μm的粉末。所获得的粉末的酶活性近似为264KNPU/g。
在58℃至60℃的温度下，将所获得的粉末分散入1kg熔化的PEG4000中。此分散体通过在喷雾冷却塔中雾化而冷却。喷雾冷却塔采用以9000RPM运转的高速旋转雾化器。筛选获得的核心单位，分离出在200至225μm之间的部分。
实施例2：
重复实施例1，不同的是高速旋转雾化器用一种如WO 94/21383，实施例1，第19页，第12-36行喷雾冷却步骤中所述的Rayleigh雾化器替换。而且，Savinase酶用一种蛋白混合物(大豆蛋白)替换，PEG 4000用Lutensol AT-80蜡替换。蛋白载量为40wt％。用Malvern激光仪对所获得的粒子大小分布进行测定，获得下列结果：
  性质/RPM雾化器   3300   4300
  D10，μm   206   199
  D50，μm   320   273
  D90，μm   464   387
  Span   0.81   0.69
通过对相同样品的相当资料进行筛选分析，获得下列结果：
  性质/RPM雾化器   3300   4300
  D10，μm   203   185
  D50，μm   306   266
  D90，μm   397   350
  Span   0.63   0.62
从上述资料中可以明显看出：甚至采用高的蛋白载量，也获得了非常窄的大小分布。通过调整雾化器的转速，可以简单地获得所需的平均颗粒大小。这使得通过一种简单方法可以获得具有所需大小并且还具有窄PSD的酶核心，并且使得能够控制含有核心和壳的终酶颗粒的最终酶活性。
实施例3：
重复实施例1，不同的是喷雾冷却步骤用一种熔化制粒方法替换，酶粉末用一种市售的喷雾干燥的大豆蛋白粉(Soy-Co-Mill)替换。将350g此粉末与95g PEG 4000屑片混合，并加入一个垂直高剪切搅拌机(来源于比利时Pro-c-ept NV的Mi-Mi-Pro)中。使用1500rpm叶轮速度和5600rmp切碎速度，将粉末温度升至66℃。所获得的酶核心颗粒非常地紧密并且为球形，这大大改善了后来提供壳的包衣步骤。如果它们被要求在一个不移动的系统中固化，少量的没有结块的粉末可以粘着于颗粒表面上。所以，工业上将优选用流化床冷却器固化所获得的酶核心单位并对其进行分类。
实施例4：
重复实施例3，不同的是大豆蛋白粉用一种如实施例1中制备的喷雾干燥酶粉末代替，其中在喷雾干燥之前向酶浓缩物中加入的糊精粘合剂用PEG 4000代替。这提供了一种在熔化和混合方法之前将熔化的粘合剂分散在喷雾干燥粉末中的有效方法。
实施例5：
除喷雾冷却步骤外，重复实施例1。喷雾冷却步骤用高剪切制粒方法代替，其中喷雾干燥的酶粉末与10％w/w纤维素纤维、10％w/w糊精粘合剂混合。加入硫酸钠盐，高达1005w/w。将此混合物转移至水平50L高剪切搅拌机中，并在加入一种含有5％w/w糊精和5％w/w糖的粘合剂水溶液下混合，直至达到大约200μm的平均颗粒大小。湿的核心单位随后在一种流化床中干燥，使用的进口温度为90℃，直到产品温度达到60℃。筛选干燥的产品获得在180μm-250μm范围内的核心单位。所得的酶活性接近14KNPU/g。
实施例6：
除啧雾冷却步骤外，重复实施例1。喷雾冷却步骤用乳化制粒方法代替，其中100g喷雾干燥粉末被分散入100g熔化的PEG4000蜡中。随后，用一个Ultra Turrax搅拌器将此分散体乳化到加热至65℃大约1升的矿物油(Whiteway T15)中。所形成的在油中的酶-蜡分散体液滴的大小通过搅拌器的速度和加入一种乳化剂(SPAN 80，它是一种脱水山梨糖醇单-9-十八烯酸酯(油酸和来源于山梨糖醇的己糖醇酸酐的单酯))控制。当达到了所需液滴尺寸时，将油冷却至室温，并将固化的颗粒从油中滤出。计算所形成的核心单位为大约132KNPU/g。所获得的酶核心颗粒是非常紧密的，具有窄的PSD，并且这些中的大多数是完好的球形，这极大改善了后面的提供壳的包衣步骤。这是由于长时间的用来形成颗粒形状的表面张力和在固化期间引用于液滴上的非常低的剪切。
实施例7：
将如实施例5制备的8kg酶核心的进料加入一个流化床涂布器(coater)(Aeoromatic-Fielder精密涂布器，型号MP 2/3)中，以研究这样一种流化床方法用于酶核心最初包衣的可行性。此研究的目的是检验此方法用于包衣这样一种小的酶核心而不发生结块的可行性。
酶核心的最初性质为：
  性质   数值
  D10D50D90Span体积密度震实密度粒子密度Savinase活性   185μm218μm251μm0.300,797g/ml1,10g/ml2,22g/ml14,32KNPU/g
在此方法中，使用下列的包衣层：
 包衣层   施加的量
 外加的酶层2层：硫酸钠+水3层：HPMC+PEG400+水4层：PEG4000+水   2537g7850q1600q250g
所用的加工条件：进口空气温度125℃，产品温度50℃。
被包衣颗粒的最终性质为：
  性质   数值
  D10D50D90Span体积密度震实密度粒子密度Savinase活性   190μm241μm291μm0.421,00g/ml1,05g/ml1,82g/ml15,00
通过在一个刚性容器中震实(tapping)已知质量的粉末一定的次数(一般为100-1000次)，并测定粉末的最后体积，来测定震实密度(tapped density)。震实密度是体积与质量之比。通过让粉末容器自由地下落一个特定的距离(1-10mm)至一个硬的表面上，进行震实。HPMC是羟基-丙基-甲基-纤维素。
结果表明：此方法可以包衣如此小的核心单位，而不使核心单位发生结块，这是令人意想不到的。
实施例8：
在此实施例中，如WO 94/21383、实施例1，第19页，第12-36行所述，使用一种Rayleigh雾化器，通过喷雾干燥直接从液体浓缩物中制备酶核心。配制液体浓缩物以达到所需特性，例如强度、粘度和干燥特性。
使用下配方：
实验1：2500升酶浓缩物A、1750kg碳酸钙、750kg糖和400kg水。
实验2：2000升酶浓缩物B、1500kg碳酸钙、91kg糖和49kg水。
实验3：1400升酶浓缩物C、350kg碳酸钙、91kg糖和49kg水。
将所获得的酶核心筛选分析用于测定PSD，获得下列结果：
  性质/RPM雾化器   实验1：4000RPM   实验2：4000RPM  实验3：4000
  D10，μm   99   98  74
  D50，μm   192   192  201
  D90，μm   321   400  283
  Span   1,16   1,58  1,04
这些结果显示了包括来自于过滤器的细小部分的直接从喷雾干燥中获得的未经筛选产品的分布。
测定喷雾干燥的酶核心的粒子密度和酶强度，获得下列结果：
  实验/性质   粒子密度g/ml   KNPU(S)/g
  实验1   1,971   21,7
  实验2   1,780   37,2
  实验3   1,360   122
所生产的粒子基本上是球形的并且是致密的。后者可以从表4的真密度资料中看出。目前来源于高剪切制粒方法并具有可比性酶强度的酶颗粒，其真密度非常接近1.9g/ml。这些结果还表明：在喷雾干燥方法中可以使用Rayleigh雾化器，生产强的不发生结块的小尺寸和窄PSD的颗粒，它们适宜于作为作为生面团改进剂使用。

Claims (52)

1.含有核心单位和壳单位的含酶颗粒，其中核心单位含有酶，而且被包裹在基本上没有酶的壳单位中，颗粒的直径和核心单位的直径的比为至少1.1，并且核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的20％至100％重量。
2.权利要求1的含酶颗粒，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的30％-100％重量。
3.权利要求2的含酶颗粒，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的40％-100％重量。
4.权利要求3的含酶颗粒，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的60％-100％重量。
5.权利要求4的含酶颗粒，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的80％-100％重量。
6.权利要求1的含酶颗粒，其中颗粒的直径和核心单位的直径的比为至少2.5。
7.权利要求1的含酶颗粒，其中酶核心单位的大小，按照其最长尺寸的直径，为不超过1000μm。
8.权利要求7的含酶颗粒，其中酶核心单位的大小，按照其最长尺寸的直径，为100-500μm。
9.权利要求1的含酶颗粒，其中核心单位的大小，按照其与颗粒总质量相比的相对质量，不超过30％。
10.权利要求9的含酶颗粒，其中核心单位的大小，按照其与颗粒总质量相比的相对质量，不超过15％。
11.权利要求1的含酶颗粒，其中酶均匀地分散在酶核心单位内。
12.权利要求1的含酶颗粒，其中颗粒是含有一种以上类型酶的联合颗粒。
13.权利要求12的含酶颗粒，其中含酶粒子在酶核心单位内成簇。
14.权利要求12的含酶颗粒，其中核心单位是多层的。
15.权利要求1的含酶颗粒，还含有包绕核心单位的薄膜层，以保护此核心单位不受壳单位中存在的成分的影响。
16.含有多种权利要求1至15中任一项的酶颗粒的粒化酶产品，其中酶核心单位的粒子大小分布为，(D90-D10)/D50的比不超过2.5。
17.权利要求16的粒化酶产品，其中(D90-D10)/D50的比不超过1.0。
18.一种制备权利要求1-15任一项的含酶颗粒的方法，包括下列步骤：提供含酶的核心单位，并用基本上没有酶的壳包衣此核心单位，使得颗粒直径与核心单位直径之间的比为至少1.1，并且核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的20％至100％重量。
19.权利要求18的方法，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的40％-100％重量。
20.权利要求18的方法，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的60％-100％重量。
21.权利要求18的方法，其中核心单位中的酶含量，以纯的酶蛋白质计，为酶核心单位的80％-100％重量。
22.权利要求18的方法，其中颗粒直径与核心单位直径之间的比为至少2.5。
23.权利要求18的方法，其中酶核心单位的大小，按照其最长尺寸的直径，为不超过1000μm。
24.权利要求23的方法，其中酶核心单位的大小，按照其最长尺寸的直径，为100-500μm。
25.权利要求18的方法，其中核心单位的大小，按照其与颗粒总质量相比的相对质量，不超过30％。
26.权利要求18的方法，其中酶核心单位的大小，按照其与颗粒总质量相比的相对质量，不超过15％。
27.权利要求18的方法，其中酶均匀地分散在酶核心单位内。
28.权利要求18的方法，其中颗粒是含有一种以上类型酶的联合颗粒。
29.权利要求28的方法，其中含酶粒子在酶核心单位内成簇。
30.权利要求28的方法，其中核心单位是多层的。
31.权利要求18的方法，还包括在施加壳单位之前，在核心单位周围形成薄膜层，以保护此核心单位不受壳单位中存在的成分的影响。
32.权利要求18的方法，包括形成多种酶颗粒，其中酶颗粒的酶核心单位的粒子大小分布为，(D90-D10)/D50的比不超过2.5。
33.权利要求32的方法，其中(D90-D10)/D50的比不超过1.0。
34.权利要求18的方法，其中采用喷雾冷却方法、喷雾干燥方法、融化制粒方法、乳化制粒方法和/或高剪切制粒方法形成酶核心。
35.权利要求18的方法，其中采用任选地与流化床干燥步骤结合的机械包衣步骤形成壳单位。
36.权利要求18的方法，其中采用流化床包衣方法形成壳单位。
37.权利要求18的方法，其中核心单位在第一步骤中生产，然后在第二步骤的随后形成壳单位之前贮藏和/或装运，在贮藏和/或装运之前，此酶核心单位任选地用薄膜层包衣。
38.权利要求37的方法，其中第一步骤生产核心单位与第二步骤形成壳单位之间的时间跨度为1至24小时。
39.权利要求37的方法，其中第一步骤生产核心单位与第二步骤形成壳单位之间的时间跨度为1至7天。
40.一种含有权利要求1至15中任一项的含酶颗粒的组合物。
41.权利要求40的组合物，其中组合物为饲料添加剂。
42.权利要求40的组合物，其中组合物为去污剂添加剂。
43.权利要求40的组合物，其中组合物为饲料。
44.权利要求40的组合物，其中组合物为去污剂。
45.权利要求1至15中任一项的含酶颗粒用于改进面包的用途。
46.权利要求1至15中任一项的含酶颗粒用于改进饲料的用途。
47.权利要求44的去污剂组合物用于清洁物体的用途。
48.根据权利要求18的方法，其中含酶核心单位的制备包括
(a)将酶分散或溶解于熔化的蜡中，
(b)将此分散体移入液相中，在该液相中此酶和蜡两者都不与之相混溶，
(c)形成酶-蜡分散体小液滴在该液相中的乳状液，
(d)冷却此液相和酶-蜡液滴，以将蜡固化为粒子，
(e)从此液相中分离出该粒子。
49.根据权利要求18的方法，其中含酶核心单位的制备包括通过Rayleigh雾化装置将含酶液体原料雾化。
50.权利要求49的方法，其中液体是一种水性液体，并且该方法为喷雾干燥方法。
51.一种含有通过权利要求49的方法获得的粒子的生面团改进剂组合物。
52.一种含有权利要求51的生面团改进剂的面粉组合物。
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