ES2377519T3 - Variantes de fitasa - Google Patents

Abstract

Variante de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N, C, T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931, 95R, H, M, N, S, T; 97V; 98G; 99D; 1021, 110Y, R, W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C, R; 157K; 160R; 163P; 183K, A, W, G; 185A, H, N, P, K; 187G; 190S, K; 191L, R, S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 2221, 234K, S; 248A, C, D, E, G, H, S, T; 286S; 321A; 323A; 324S, L; 328T; 330R; 334E, D, G; 343N; 344A, V, S; 345D, H; 347Q, P; 349M, K; 350T, M, I, L; 384S, A; 395G; 398T; 409S; 421 R, S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291 y 430M; donde (a) la variante tiene actividad de fitasa; (b) cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº : 2 y (c) la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº : 2 de al menos 75%.

Description

Variantes de fitasa

5 Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a variantes de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96. La invención también se refiere a las secuencias de ADN que codifican tales variantes, su producción en una célula huésped recombinante, al igual que a métodos de uso de

10 las variantes, en particular dentro del campo de piensos para animales. Una fitasa preferida progenitora es la fitasa de Peniophora que comprende la SEC ID nº: 2.

Antecedentes de la invención

15 [0002] EP 897010 titulada "Fitasas modificadas" divulga, entre otros, variantes determinadas de una fitasa de Aspergillus fumigatus. EP 897985 titulada "Fitasas de consenso" divulga, entre otros, una fitasa de consenso fúngica que puede ser diseñada con base en, entre otros, un alineamiento múltiple de diferentes fitasas de ascomicetos. WO 99/48380 titulada "Fitasas termoestables en la preparación de pienso y expresión en plantas" se refiere a ciertos aspectos del uso de fitasas termoestables. Ejemplos de fitasas termoestables son las varias fitasas de consenso listadas en la p. 30 debajo de la línea

20 en negrita. WO 00/43503 titulada "Fitasas mejoradas" se refiere entre otros a ciertas variantes de fitasa de termostabilidad aumentada, que se pueden diseñar por un proceso similar al descrito en EP 897985. Ejemplos de fitasas termoestables se muestran en p. 54-55 debajo de la línea en negrita. Estas fitasas tienen todas un porcentaje de identidad a la SEC ID nº: 2 inferior al 75%. EP 0 969 089 se refiere a formulaciones de fitasa que comprenden una fitasa y un agente estabilizante seleccionado de varios agentes, o alternativamente estabilizado por reticulación química. EP 0 969 089 además divulga el

25 uso de varias fitasas de consenso, tales como aquellas diseñadas a partir de varias secuencias de fitasa de Aspergillus (o fúngicas) (ver por ejemplo EP 897985), varias fitasas de basidiomicetos, y otras (Figs. 13 hasta 22 y 33). Las propiedades de algunas de estas fitasas de consenso, tales como la termostabilidad, temperatura óptima, perfiles de actividad del pH y especificidades del sustrato son comparadas (Figs. 23 a 32)

30 [0003] Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevas y mejoradas variantes de fitasa, en particular de termostabilidad mejorada y/o actividad específica aumentada.

Antecedentes de la técnica

35 [0004] Una fitasa derivada de Peniophora lycii se describe en WO 98/28408, y algunas variantes de las mismas en WO 99/49022 (ver por ejemplo reivindicación 31 a p. 76-77).

Resumen de la invención

40 [0005] La presente invención se refiere a una variante de una fitasa progenitora, de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N,C,T; 45A; 63N; 69A; 92L; 93I; 95R,H,M,N,S,T; 97V; 98G; 99D; 102I; 110Y, R,W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C,R; 157K; 160R; 163P; 183K,A,W,G; 185A,H,N,P,K; 187G; 190S,K; 191L,R,S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 222I; 234K,S; 248A,C,D,E,G,H,S,T; 286S; 321A; 323A; 324S,L; 328T; 330R;

45 334E,D,G; 343N; 344A,V,S; 345D,H; 347Q,P; 349M,K; 350T,M,I,L; 384s,A; 395G; 398T; 409S; 421R,S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 429I; y 430M; donde

(a) la variante tiene actividad de fitasa;

(b) cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº: 2 y 50 (c) la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº: 2 de al menos 75%.

[0006] La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican la variante de fitasa y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos al igual que a métodos para producir y usar las variantes de fitasa.

55 Breve descripción de las figuras

[0007] La Figura 1 proporciona las coordenadas para la estructura 3D de una fitasa de Peniophora lycii que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 2.

60 Descripción detallada de la invención

Estructura tridimensional de la fitasa de Peniophora

[0008] La estructura de la fitasa de Peniophora lycii fue resuelta conforme a los principios para los métodos cristalográficos por rayos X como se dan, por ejemplo, en X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. y Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina a una resolución de 2.2 Å usando el método de sustitución isomorfa se dan en la Fig. 1 en el formato estándar de PDB (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT). El fichero PDB de la figura 1 se refiere a una parte sólo de la secuencia de esta fitasa, es decir la parte correspondiente a los residuos 22-422 de SEC ID nº: 2.

Dinámica Molecular (MD)

[0009] Simulaciones de la Dinámica Molecular (MD) son indicativas de la movilidad de los aminoácidos en una estructura de proteína (véase McCammon, JA y Harvey, SC., (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press). Tal dinámica de proteína es frecuentemente comparada con los B-factores cristalográficos (véase Stout, GH y Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley). Al realizar la simulación por MD, por ejemplo, a temperaturas diferentes, la movilidad relacionada con la temperatura de los residuos es simulada. Las regiones con la movilidad o flexibilidad más alta (aquí fluctuaciones isotrópicas) se pueden sugerir para la mutagénesis aleatoria. Se entiende aquí que la alta movilidad encontrada en ciertas áreas de la proteína, puede ser térmicamente mejorada por la substitución de estos residuos.

[0010] Usando el programa CHARMM (Simulaciones Moleculares (MSI)), la estructura de la fitasa de Peniophora anteriormente descrita fue sometida a MD a 300, 350, 400, 450, y 500K durante 300 y 600ps y luego minimizada usando 300 pasos de Máxima Pendiente (Steepest Descent), 600 pasos de Gradientes Conjugados, y 3000 pasos de ABNR con una calidad de tolerancia de 0.001kcal/mol.

[0011] Las siguientes regiones sugeridas para mutagénesis resultan de las simulaciones por MD: MD a 300 y 400K sin agua: 37-48, 91-119, 232-238, 300-308, 325-335, 343-348; MD a 300 y 400K con agua: 407-412; MD a 300K sin agua: 229-236; MD en una caja de agua cúbica con bordes periódicos: 123-126, 154-157, 204-216, 284-289, 419-423.

[0012] Las siguientes regiones sugeridas para mutagénesis resultan de evaluaciones de los B-factores en la estructura en X: 73-83, 207-217.

[0013] Las regiones anteriores se pueden combinar de la siguiente manera: 37-48, 73-83, 91-119, 123-126, 154-157, 204217, 229-238, 284-289, 300-308, 325-335, 343-348, 407-412, 419-423.

[0014] Otras regiones que resultan de simulaciones por MD son: 154-163, 204-218, 323-335, 342-350.

[0015] Otras regiones que resultan de evaluación de B-factores son: 1-29, preferiblemente 1-28, 59-106, 169-171, 178-247, 339-344, 367-371, 417 en adelante. Regiones más preferidas son: 1-24, 69-94, 182-188, 199-220, 229-241, 368-370, 420

423.

Sitio activo y cubiertas de unión de sustrato

[0016] Programas conocidos en la técnica, tales como INSIGHTII de Molecular Simulations MSI, San Diego, California pueden utilizarse para definir cubiertas de sitio activo que comprenden aquellos residuos de aminoácidos que son muy próximos a los residuos catalíticos (H55, D319, R54). Cubiertas de unión de sustrato pueden también ser definidas, comprendiendo aquellos residuos de aminoácidos que están muy próximos al sitio de unión de sustrato (H55; R54; R139 N320) y que se puede prever por lo tanto que estén en contacto con el sustrato. Proximidad cercana puede ser definida como, por ejemplo, 0Å, 15Å, 16Å, o 20Å, de los residuos pertinentes. Información sobre la unión de sustrato se puede deducir quitando el ácido fítico o un derivado tal como inositol-1,4,5-trifosfato (base de datos Brookhaven archivo 1djx. Inositol-1,4,5-trifosfato) en el corte del sitio activo (los residuos formando la superficie del sitio activo.

Estrategia para preparar variantes

[0017] Con base en la estructura 3D de la figura 1 y la SEC ID nº: 2, y el estudio siguiente del sitio activo y cubiertas de unión de sustrato (16Å, preferiblemente 15Å, más preferiblemente 10Å), al igual que la dinámica molecular, las siguientes regiones fueron sugeridas para mutagénesis, principalmente con el propósito de mejorar la termostabilidad y/o aumentar la actividad específica: aminoácidos 26-31 69, 99-104, 135-142, 169-193, 253-266 o aminoácidos 321-323 de la SEC ID nº: 2.

[0018] Las siguientes posiciones de las regiones anteriores de la SEC ID nº: 2 son preferiblemente sometidas a mutagénesis: G26; P27; Y28; D29; P30; W59; P60; T61; S62; G63; A64; R65; S66; R67; Q68; V69; A99; D100; L102; P103; F104; A135; G136; D137; Q138; V141; D142; E169; E170; N177; N178; M179; P181; N182; D189; T191; W192; L193; Y253; Y254; D257; K258; Y259; Y260; T262; G265; N266; T321, y/o V323.

[0019] Las siguientes variantes son contempladas: G26S,A; P27X,M; Y28F,N,Q; D29S,T,A; F30X; W59X,F,Y; P60S; T61S; S62A; G63A,S; A64G,K,R,S; R65A; S66K,T; R67X,K,A,L,V,S; Q68E,D,N,M; V69X; A99X,D,S,E,N; D100X,S,E,N; L102V; P103X,E; F104X,L; A135S,D; G136X,S,D; D137S; Q138X,D,N; V141X; D142X; E169A; E170X,A,T; N177D; N178A, G,L; M179V,T; P181X,T,V; N182X,A; D189X; T191X; W192X; L193T,I; Y253N,G; Y254A,G; D257S; K258L; Y259X,F,P,W; Y260X,P,W; T262Y,V; G265X; N266Q; T321 Q,L,N; y/o V323I.

[0020] Residuos de aminoácidos o posiciones que señalan principalmente hacia el sustrato son los siguientes: P27; Y28; R65; R67; Q68; A99; D100; L102; A135; G136; D137; E169; N177; T191; W192; Y253; Y254; T262, y T321. Variantes que se alteran en una o más de estas posiciones son específicamente contempladas, por ejemplo variantes comprendiendo una alteración en al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez de estas posiciones. En una forma de realización particular, la variante comprende alteraciones en al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince, al menos dieciséis, al menos diez, al menos dieciocho, o en las diecinueve posiciones. Ejemplos de tales variantes son aquellas que comprenden al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o al menos diez mutaciones seleccionadas de las siguientes: P27X,M; Y28F,N,Q; R65A; R67X,K,A,L,V,S; Q68E,D,N,M; A99X,D,S,E,N; D100X,S,E,N; L102V; A135S,D; G136X,S,D; D137S; E169A; N177D; T191X; W192X; Y253N,G; Y254A,G; T262Y,V; y/o T321Q,L,N. En una forma de realización particular, la variante comprende al menos once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diez, al menos dieciocho, o diez de estas mutaciones.

Polipéptidos con actividad de fitasa

[0021] En el presente contexto un polipéptido con actividad de fitasa (una fitasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis del fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) a (1) mio-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o penta-fosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico.

[0022] En el presente contexto el término un sustrato de fitasa comprende, entre otros, ácido fítico y cualquier fitato (sal de ácido fítico), al igual que los fosfatos catalogados bajo (2) más arriba.

[0023] El sitio ENZYME en Internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de las enzimas. Está principalmente basado en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual se ha proporcionado un número EC (Comisión Enzimática) (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304305). Véase también el manual de nomeclatura enzimática de NC-IUBBM, 1992).

[0024] Según el sitio ENZYME, dos tipos diferentes de fitasas son conocidos: la llamada 3-fitasa (mio-inositol hexafosfato 3fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y la llamada 6-fitasa (mio-inositol hexafosfato 6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26). Para los fines de la presente invención, ambos tipos se incluyen en la definición de fitasa.

[0025] Para los fines de la presente invención la actividad de fitasa se determina en la unidad FYT, una FYT siendo la cantidad de enzima que libera 1 micro-mol de ortofosfato inorgánico por min. bajo las siguientes condiciones: pH 5.5; temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C6H6O24P6Na12) en una concentración de 0.0050 mol/l. Ensayos de fitasa adecuados son los ensayos FYT y FTU descritos en el Ejemplo 1 de WO 00/20569. FTU es para determinar la actividad de fitasa en el pienso y premezcla. El ensayo FYT está también descrito en ejemplo 2 aquí.

Fitasa progenitora

[0026] Una fitasa progenitora es una fitasa que es homóloga a la fitasa derivada de Peniophora lycii CBS 686.96. En el presente contexto, homóloga significa que tiene una identidad de al menos 75% a la SEC ID nº: 2 aquí, que corresponde a los aminoácidos a 17-439 de la secuencia de aminoácidos completa, incluyendo la parte del péptido señal, de una fitasa derivada de Peniophora lycii CBS 686.96 (SEC ID nº: 2 de WO 98/28408). Homología se determina como generalmente se describe abajo en la sección titulada homología de aminoácidos.

[0027] La fitasa progenitora puede ser un polipéptido de tipo salvaje o de origen natural o una variante alélica del mismo, o un fragmento del mismo que tiene actividad de fitasa, en particular una parte madura de la misma. Puede también ser una variante del mismo y/o un polipéptido sintético o creado genéticamente.

[0028] En una forma de realización particular la fitasa progenitora de tipo salvaje es una fitasa fúngica, tal como una fitasa filamentosa fúngica, o una fitasa de levadura. Un ejemplo de una fitasa de levadura es la fitasa de Schwanniomyces occidentalis descrita en US 5830732.

[0029] En otra forma de realización particular la fitasa fúngica progenitora de tipo salvaje se deriva de un hongo filamentoso, por ejemplo del filo Ascomycota o del filo Basidiomycota (una fitasa de ascomiceto, o una fitasa de basidiomiceto, respectivamente).

[0030] Ejemplos de fitasas de ascomiceto son aquellas derivadas de una cepa de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus awamori PHYA (SWISSPROT P34753, Gene 133:55-62 (1993), Aspergillus niger (ficuum) PHYA (SWISSPROT P34752, EP 420358, Gene 127:87-94 (1993), Aspergillus awamori PHYB (SWISSPROT P34755, Gene 133:55-62 (1993), Aspergillus niger PHYB (SWISSPROT P34754, Biochem. Biophys. Res. Commun. 195:53-57(1993)); o una cepa de Emericella, por ejemplo Emericella nidulans PHYB (SWISSPROT 000093, Biochim. Biophys. Acta 1353:217-223 (1997)); o una cepa de Thermomyces (Humicola), por ejemplo la fitasa de Thermomyces lanuginosus descrita en WO 97/35017. Otros ejemplos de fitasas de ascomicetos son descritos en EP 684313 (por ejemplo derivadas de cepas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, y Myceliophthora thermophila); JP 11000164 (una fitasa derivado de una cepa de Penicillium.); US 6139902 (una fitasa derivada de una cepa de Aspergillus), y WO 98/13480 (fitasa de Monascus anka).

[0031] Ejemplos de fitasas de basidiomiceto son las fitasas derivadas de Paxillus involutus, Trametes pubescens, Agrocybe pediades y Peniophora lycii (véase WO 98/28409).

[0032] Una fitasa preferida progenitora se deriva de una especie de Peniophora, preferiblemente de una cepa de Peniophora lycii, de la forma más preferible de la cepa Peniophora lycii CBS 686.96.

[0033] Será entendido que la definición de las especies mencionadas incluye los estados imperfectos y perfectos, y otros equivalentes taxonómicos por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que son conocidos. Expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

[0034] Cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivo, tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y colección de Patentes de Cutivos del Servicio de Investigación para la Agricultura, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0035] Además, tales polipéptidos se pueden identificar y obtener de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., suciedad, abonos, agua, etc.) usando sondas adecuadas. Técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales se conocen en la técnica. La secuencia de ácidos nucléicos puede luego derivar de forma similar seleccionando una biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), la secuencia puede ser aislada o clonada utilizando técnicas que se conocen por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0036] En todavía otra forma de realización particular la fitasa progenitora es una fitasa sintética. Una fitasa sintética es diseñada por el hombre, y expectativamente no se origina en la naturaleza. EP 897985 y WO 00/43503 revelan ejemplos de tales fitasas sintéticas fúngicas generalmente llamadas fitasas de consenso. Fitasas redistribuidas son otros ejemplos de una fitasa progenitora sintética o creada genéticamente, que se puede preparar como es generalmente conocido en la técnica, por ejemplo por mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR con la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR), o por mutagénesis aleatoria. También se incluye en el concepto de una fitasa sintética cualquier fitasa quimérica o híbrida, es decir una fitasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos fitasas.

[0037] La fitasa progenitora puede comprender la secuencia de aminoácidos especifica, o puede ser una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de fitasa. En una forma de realización, la fitasa progenitora comprende la secuencia de aminoácidos específica o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de fitasa. En otra forma de realización, la fitasa progenitora consiste en la secuencia de aminoácidos específica, o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene la actividad de fitasa.

[0038] Un fragmento de una secuencia de aminoácidos especifica es un polipéptido con uno o más aminoácidos eliminados del término amino y/o carboxilo de esta secuencia de aminoácidos. En una forma de realización, un fragmento contiene al menos 320, o al menos 340, o al menos 360, o al menos 380, o al menos 390, o al menos 400, o al menos 410, o al menos 420, o al menos 430, o al menos 440, o al menos 450 residuos de aminoácidos.

[0039] Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus

cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0040] La fitasa progenitora puede también ser una parte madura de cualquiera de las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia más arriba. Una parte madura significa una secuencia de aminoácidos madura y se refiere a aquella parte de una secuencia de aminoácidos que permanece después de que una parte del péptido señal potencial haya sido cortada.

[0041] En todavía otra forma de realización, la fitasa progenitora puede ser una variante de las fitasas a las que se hace referencia más arriba que comprende una sustitución, eliminación, y/o inserción de uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la fitasa variante puede diferir de la secuencia de aminoácidos especifica por una inserción o eliminación de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes. Preferiblemente, cambios aminoácidos son de una naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al pliegue y/o a la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido de enlace de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0042] Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los cambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly al igual que estos a la inversa.

Taxonomía de los microorganismos

[0043] Preguntas relativas a la taxonomía pueden ser resueltas consultando una base de datos de taxonomía, tal como el Navegador NCBI Taxonomy que está disponible en el siguiente sitio de internet: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/, y/o consultando los manuales de taxonomía. Para los objetivos presentes, un manual preferido en relación con la taxonomía fúngica es Dictionary of the Fungi, 9ª edición, editado por Kirk, P.M., P.F. Cannon, J.C. David & J.A. Stalpers, CAB Publishing, 2001 .

[0044] Una fitasa sintética, tal como una fitasa de consenso, una fitasa redistribuida, o una fitasa híbrida, puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos parciales que derivan de al menos dos fitasas de ascomicetos, al menos dos fitasas de basidiomicetos o de al menos un ascomiceto y al menos una fitasa de basidiomiceto. Estas fitasas de ascomiceto y de basidiomiceto de la cual deriva una secuencia de aminoácidos parcial puede, por ejemplo, ser cualquiera de aquellas fitasas específicas a las que se hace referencia en la presente.

[0045] En el presente contexto, una fitasa sintética derivada de al menos un hongo es una fitasa fúngica. Además, una fitasa sintética derivada sólo de fitasas de ascomiceto es una fitasa de ascomiceto; y una fitasa sintética derivada sólo de fitasas de basidiomiceto es una fitasa de basidiomiceto. Cualquier fitasa sintética derivada de al menos una fitasa de ascomiceto al igual que de al menos una fitasa de basidiomiceto se puede designar una fitasa de ascomiceto/basidiomiceto mezclada.

[0046] La designación fitasa de Peniophora significa una fitasa de tipo salvaje derivada de una especie del género Peniophora, incluyendo variantes alélicas, fragmentos o variantes de las mismas, o una fitasa sintética preparada con base en al menos una, preferiblemente al menos dos, fitasa(s) de Peniophora, más preferiblemente con base sólo en las fitasas de Peniophora. Ejemplos de especies de Peniophora son: Peniophora aurantiaca, P. cinerea, P. decorticans, P. duplex, P. ericsonii, P. incarnate, P. lycii, P. meridionalis, P. nuda, P. piceae, P. pini, P. pithya, P. polygonia, P. proxima, P. pseudo-pini,

P. rufa, P. versicolor, y especies simplemente clasificadas como Peniophora sp. Una especie preferida es Peniophora lycii. Una cepa preferida es Peniophora lycii CBS 686.96.

Homología de aminoácidos

[0047] La presente invención se refiere a fitasas con una secuencia de aminoácidos que tiene un cierto grado de identidad a la SEC ID nº: 2 (de ahora en adelante "fitasas homólogas").

[0048] Para fines de la presente invención el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, al igual que el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se determina por el programa "align" que es un alineamiento de Needleman-Wunsch (es decir, un alineamiento global) El programa se usa para el alineamiento de polipéptidos, al igual que de secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación por defecto BLOSUM50 se usa para alineamientos de polipéptidos, y la matriz de identidad por defecto se usa para alineamientos de nucleótidos. La penalización para el primer residuo de un espacio es -12 para polipéptidos y -16 para nucleótidos. Las penalizaciones para más residuos de un espacio son -2 para polipéptidos, y -4 para nucleótidos.

[0049] "Align" es parte del paquete FASTA versión v20u6 (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison wit FASTP and FASTA, " Methods in Enzymology 183:63-98) Los alineamientos de proteínas con FASTA usan el algoritmo de Smith-Waterman sin limitación en el tamaño del espacio (véase "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

[0050] En formas de realización particulares, la fitasa progenitora tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a la SEC ID nº: 2 de al menos aproximadamente 55%, o de al menos aproximadamente 60%, o de al menos aproximadamente 65%, o de al menos aproximadamente 70%, o de al menos aproximadamente 75% o de al menos aproximadamente 80%, o de al menos aproximadamente 85%, o de al menos aproximadamente 90%, o de al menos aproximadamente 91%, o de al menos aproximadamente 92%, o de al menos aproximadamente 93%, o de al menos aproximadamente 94%, o de al menos aproximadamente 95%, o de al menos aproximadamente 96%, o de al menos aproximadamente 97%, o de al menos aproximadamente 98%, o de al menos aproximadamente 99%.

[0051] En otra forma de realización particular, estas fitasas homólogas progenitoras tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por treinta, veinte, veinte, veinte, veinte, diez, dieciocho, diez, dieciséis, quince, catorce, trece, doce, once, diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o sólo un aminoácido(s) de la secuencia de aminoácidos especifica.

[0052] También la fitasa variante resultante es homóloga a la SEC ID nº: 2. En formas de realización particulares, la fitasa variante comprende o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a la SEC ID nº: 2 de al menos 75%, o de al menos aproximadamente 76%, o de al menos aproximadamente 77%, o de al menos aproximadamente 78%, o de al menos aproximadamente 79%, o de al menos aproximadamente 80%, o de al menos aproximadamente 82%, o de al menos aproximadamente 85%, o de al menos aproximadamente 87%, o de al menos aproximadamente 90%, o de al menos aproximadamente 92%, o de al menos aproximadamente 95%, o de al menos aproximadamente 97%.

Hibridación de ácidos nucleicos

[0053] En la alternativa, fitasas homólogas progenitoras, al igual que fitasas variantes, pueden ser definidas como siendo codificadas por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia preferiblemente baja, más preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente condiciones de astringencia media-alta, incluso más preferiblemente condiciones de astringencia alta, y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy alta con los nucleótidos 49-1320 de la SEC ID nº: 1, o una subsecuencia o una cadena complementaria de la misma (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, New York). Una subsecuencia puede ser al menos 100 nucleótidos, o al menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, o al menos 1300 nucleótidos. Por otra parte, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido que tiene la actividad enzimática pertinente.

[0054] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia muy baja a muy alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 !g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y bien 25% de formamida para astringencias bajas y muy bajas, 35% de formamida para astringencias medias y medias altas, o 50% de formamida para astringencias muy altas y altas, según procedimientos de transferencia de Southern estándares.

[0055] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada una durante 15 minutos usando 2 x SSC, 0.2% de SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia media alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta), y de la forma más preferible al menos a 70°C (astringencia muy alta).

[0056] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación, y post-hibridación de lavado a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of

Sciences USA 48:1390) en 0.9 M de NaCl, 0.09 M de Tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0.5% NP-40, 1X solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0.1 mM de ATP, y 0.2 mg de ARN de levadura por ml según procedimientos de transferencia de Southern estándares.

[0057] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0.1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada vez durante 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada.

Numeración de la posición

[0058] La nomenclatura usada aquí para definir posiciones de aminoácidos es básicamente como se describe en WO 99/49022, es decir con referencia a la secuencia de aminoácidos de la fitasa derivada de Peniophora lycii CBS 686.96, excepto que en el presente contexto la numeración comienza en S17 de la secuencia P_lycii mostrada en la Fig. 1 de WO 99/49022. Por consiguiente, los números de posición usados aquí difieren de los números de posición de WO 99/49022 por 16 (véase p. 14, línea 26, y Fig. 1 de WO 99/49022). Así, por ejemplo, S1 aquí es equivalente a S17 de WO 99/49022, y F8 aquí es equivalente a F24 de WO 99/49022.

[0059] La secuencia SEC ID nº: 2 comprende los aminoácidos -14-409 de la secuencia mostrada en Fig. 6 de WO 99/49022, los aminoácidos correspondientes a 16-439 de la secuencia P_lycii mostrada en la Fig. 1 de la misma.

[0060] Por consiguiente, en el presente contexto, la base para numerar las posiciones es la SEC ID nº: 2 empezando con S1 y terminando con E423. Una fitasa progenitora, al igual que una fitasa variante, puede comprender extensiones en comparación con la SEC ID nº: 2, es decir en los extremos N-terminal, y/o C-terminal de las mismas. Los aminoácidos de tales extensiones, si las hay, deben ser numerados como es usual en la técnica, es decir para una extensión C-terminal: 424, 425, 426 etcétera, y para una extensión N-terminal -1; -2; -3 etcétera.

Alteraciones, tales como sustituciones, deleciones, inserciones

[0061] En el presente contexto, los siguientes son ejemplos de varias maneras en las que una variante de fitasa - al menos en teoría, es decir en el papel - se puede derivar de una secuencia de aminoácidos progenitora: un aminoácido se puede sustituir con otro aminoácido; un aminoácido puede ser eliminado; un aminoácido puede ser insertado; así como cualquier combinación de cualquier número de tales alteraciones.

[0062] Para los fines presentes, el término sustitución se destina a incluir cualquier número de cualquier tipo de tales alteraciones. Ésta es una definición razonable, porque, por ejemplo, una eliminación se puede considerar como una sustitución de un aminoácido, AA, en una posición, nn, con nada, (). Tal sustitución puede ser designada: AAnn(). Asimismo, una inserción de sólo un aminoácido, BB, corriente abajo de un aminoácido, AA, en una posición, nn, puede ser designada: ()nnaBB. Y si dos aminoácidos, BB y CC, son insertados corriente abajo del aminoácido AA en la posición nn, esta sustitución (combinación de dos sustituciones) puede ser designada: ()nnaBB+()nnbCC, a los espacios creados entre los aminoácidos nn y nn+1 en la secuencia progenitora se le asigna las letras minúsculas o subíndices a, b, c etc. al número de posición anterior, aquí nn. Una coma (,) entre sustituyentes, como por ejemplo en la sustitución A327S,F,I,L significa "o bien", es decir que A327 se sustituye con S, o F, o I, o L. Un signo más (+) entre sustituciones, como por ejemplo en las sustituciones 29S+125D+324A significa "y", es decir que estas tres sustituciones únicas se combinan en una y la misma variante de fitasa. Esta nomenclatura que define alteraciones de aminoácidos es también básicamente como se describe en WO 99/49022 (véase p. 16 de la misma).

[0063] En la alternativa, en caso de que el término sustitución sea definido diferentemente, la presente invención se refiere a una variante de una fitasa progenitora, comprendiendo una alteración en al menos una posición seleccionada de los varios grupos de regiones indicados aquí, donde la(s) alteración(es) es(son) independientemente una inserción de al menos un aminoácido por debajo del aminoácido que ocupa la posición; una eliminación del aminoácido que ocupa la posición; y/o una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente; donde la variante tiene actividad de fitasa, y cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la enzima con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 2, y la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº: 2 de al menos 75%; y con la(s) condición(es) (d) tal y como se define aquí.

[0064] En el presente contexto, el término "una sustitución" significa al menos una sustitución. Al menos una significa una o más, por ejemplo una, o dos, o tres, o cuatro, o cinco, o seis, o siete, o ocho, o nueve, o diez, o doce, o catorce, o quince, o dieciséis, o dieciocho, o veinte, o veinte o veinte, o veinte, o veinte ocho, o treinta, etcétera, para incluir en principio, cualquier cantidad de sustituciones. Las variantes de la invención, no obstante, todavía deben ser, por ejemplo, al menos 75% idénticas a la SEC ID nº: 2, este porcentaje siendo determinado por el programa mencionado arriba. Las sustituciones se pueden aplicar en cualquier posición comprendida por cualquier región mencionada en la reivindicación 1, y las variantes

que comprenden combinaciones de cualquier cantidad y tipo de tales sustituciones están también incluidas. El término sustitución como se utiliza en este caso también incluye deleciones, al igual que extensiones, o inserciones, que se pueden añadir a la longitud de la secuencia correspondiente a la SEC ID nº: 2. En una forma de realización particular, el número de sustituciones es como mucho 200, o 175, o 150, o 125, o 120, o 110, o 106, o 105, o 100, o 90, o 80, o 70, o 60, o 50, o 40,

o 30, o 25.

[0065] Además, el término "una sustitución" abarca una sustitución en cualquiera de los otros diez aminoácidos naturales, o en otros aminoácidos, tales como aminoácidos no naturales. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido Q en la posición 20 incluye cada una de las siguientes sustituciones: 20A, 20C, 20D, 20E, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20N, 20P, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, o 20Y. Esto es, a propósito, equivalente a la designación 20X, donde X designa cualquier aminoácido. Estas sustituciones pueden también ser designadas Q20A, Q20C, Q20X, etc. Lo mismo se aplica por analogía a todas y cada una de las posiciones mencionadas aquí, para incluir específicamente aquí cualquiera de tales sustituciones.

Identificación de números de posición correspondientes

[0066] Para la fitasa progenitora de Peniophora lycii CBS 686.96, la numeración de posición se refiere a la numeración de la SEC ID nº: 2. Para una posición dada en otra fitasa - sea una fitasa progenitora o una variante - una posición correspondiente en la SEC ID nº: 2 puede siempre ser encontrada. O - alternativamente - una posición que corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la fitasa que comprende (o que tiene) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 2, puede siempre ser encontrada.

[0067] La secuencia de aminoácidos de una fitasa progenitora aparte de la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, o, sucesivamente, de una secuencia de aminoácidos de fitasa variante, es designada SEQ-X. Una posición correspondiente a la posición N de la SEC ID nº: 2 se encuentra de la siguiente manera: la secuencia de aminoácidos SEQ-X de la fitasa variante o progenitora se alinea con la SEC ID nº: 2 como se especifica arriba en la sección titulada homología de aminoácidos. Del alineamiento, la posición en la secuencia SEQ-X correspondiente a la posición N de la SEC ID nº: 2 puede ser derivada claramente y sin ambigüedad, usando los principios descritos más abajo.

[0068] Se hace referencia, sólo como ejemplo, a la Fig. 1 de WO 99/49022, asumiendo por simplicidad que las secuencias de A_pediades, A_fumigatus o T_lanuginosus son por ejemplo fitasas variantes que han sido alineadas con la fitasa de P_lycii, que suponemos corresponde a la SEC ID nº: 2 como se describe aquí (para los presentes fines deberían haber sido alineadas con la SEC ID nº: 2): Pregunta n°. 1: ¿Qué posición en A_pediades corresponde a S17 de P_lycii (dicha posición siendo, para los fines presentes, designada S1)? La respuesta es: A15. Pregunta n°. 2: ¿Qué posición en la fitasa designada A_fumigatus corresponde a 55b() de P_lycii (dicha posición siendo, para los fines presentes, designada 39b())? La respuesta es: S63. Pregunta n°. 3: ¿Qué posición en A_pediades corresponde a L31 de P_lycii (dicha posición siendo, para los fines presentes, designada L15)? La respuesta es: ()30d. Pregunta n°. 4: ¿Qué sustitución en P_lycii corresponde a una variante de fitasa, imaginaria, de T_lanuginosa con la sustitución G3L? La respuesta es: ()-6L (dicha sustitución siendo, para los fines presentes, designada ()-22L). SEQ-X puede ser una parte madura de la fitasa en cuestión, o puede también incluir una parte del péptido señal, o puede ser un fragmento de la fitasa madura que tiene actividad de fitasa, por ejemplo un fragmento de la misma longitud que la SEC ID nº: 2, o el fragmento que se extiende de S1 a E423 cuando se alinea con SEC ID nº: 2 como se describe en este caso.

Región y posición

[0069] En el presente contexto, el término región significa al menos una posición de una secuencia de aminoácidos de fitasa progenitora, el término posición designa un residuo de aminoácido de tal secuencia de aminoácidos. En una forma de realización, región significa una o más posiciones sucesivas de la secuencia de aminoácidos de fitasa progenitora, por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, etc., hasta cualquier número de posiciones consecutivas de la secuencia. Por consiguiente, una región puede consistir en una posición sólo, o puede consistir en cualquier número de posiciones consecutivas, tal como, por ejemplo, posición n°. 37, 38 y 39 o posición n°. 37, 38, 39, 40, y 41 o posición n°. 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 y 48. Para los fines presentes, estas tres regiones son designadas 37-39, 37-41, y 3748, respectivamente. Los bordes de estas regiones o rangos están incluidas en la región. La SEC ID nº: 2 es un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de fitasa progenitora preferida.

[0070] Una región comprende específicamente todas y cada una de las posiciones que abarca. Por ejemplo, la región 37-48 específicamente comprende cada una de las posiciones 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, y 48. Lo mismo se aplica por analogía a las otras regiones mencionadas aquí. Termostabilidad

[0071] Para los fines presentes, el término termoestable de un cierto polipéptido según se aplica en este contexto, se refiere a la temperatura de fusión, Tm, de tal polipéptido, según se determina usando la calorimetría diferencial de barrido (DSC por sus siglas en inglés) a un pH de 5.5: para un polipéptido termoestable, la Tm es al menos 61°C. En formas de realización particulares, la Tm es al menos 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100°C.

[0072] En la alternativa, el término termoestable se refiere a una temperatura de fusión de al menos 49°C, preferiblemente al menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o 90°C, según se determina usando DSC a un pH de 7.0.

[0073] En otra alternativa, el término termoestable se refiere a una temperatura de fusión de al menos 51 °C, preferiblemente al menos 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o 90°C, según se determina usando DSC a un pH de 3.0.

[0074] En una alternativa inmóvil más, el término termoestable se refiere a una temperatura de fusión de al menos 37°C, preferiblemente al menos 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o 90°C, según se determina usando DSC a un pH de 2.5.

[0075] Para la determinación de Tm, una muestra del polipéptido con una pureza de al menos 90% (o 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, o 98%) como se determina por SDS-PAGE puede ser utilizada. Incluso además, la muestra enzimática puede tener una concentración de entre 0.5 y 2.5 mg/ml de proteína (o entre 0.6 y 2.4, o entre 0.7 y 2.2, o entre 0.8 y 2.0 mg/ml de proteína), según se determina a partir de la absorbencia a 280 nm y basado en un coeficiente de extinción calculado a partir de la secuencia de aminoácidos de la enzima en cuestión.

[0076] La DSC se desarrolla con el pH deseado (p. ej. pH 5.5, 7.0, 3.0, o 2.5) y con un índice de calentamiento constante, por ejemplo de 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10°C/min. Ejemplos de tampones adecuados se mencionan en la Parte Experimental. Ejemplos de índices de calentamiento preferidos son 1.0, 1.5 o 2.0°C/min cuando se usa el equipamiento como se describe en el ejemplo 2 aquí. Para otros tipos de equipamiento con volúmenes de muestra más pequeños una estimación fiable de Tm puede ser obtenida usando un índice de calentamiento de, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o incluso 10°C /min.

[0077] En una forma de realización particular, la variante de fitasa de la invención es más termoestable que la fitasa progenitora. Una fitasa progenitora preferida para este propósito es la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96.

Actividad específica

[0078] El término, alta actividad específica mejorada o aumentada se refiere a una actividad específica de al menos 105%, relativa a la actividad específica de la fitasa progenitora según se ha determinado por el mismo procedimiento. En formas de realización particulares, la actividad específica relativa es al menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 o incluso 400%, aún relativa a la actividad específica de la fitasa progenitora según ha sido determinado por el mismo procedimiento.

[0079] En la alternativa, el término actividad específica alta se refiere a una actividad específica de al menos 200 FYT/mg de proteína enzimática (EP). En formas de realización particulares, la actividad específica es al menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 FYT/mg de EP.

[0080] La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de SDS poliacrilamida debería mostrar la presencia de sólo un componente). La concentración de proteína enzimática se puede determinar por análisis de aminoácidos, y la actividad de fitasa en unidades FYT. La actividad específica es una característica de la variante de fitasa específica en cuestión, y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa.

[0081] Véase ejemplo 3 para detalles adicionales.

[0082] La variante de fitasa según la invención es termoestable y/o de una alta actividad específica. En una forma de realización particular es termoestable. En otra forma de realización particular es de alta actividad específica. En una tercera forma de realización particular es termoestable, al igual que de una alta actividad específica. En formas de realización aún más particulares es (a) más termoestable que la fitasa progenitora; (b) de una actividad específica más alta en comparación

con la fitasa progenitora; o (c) más termoestable que la fitasa progenitora y de una actividad específica más alta en comparación con la fitasa progenitora.

Variantes poco alergénicas

[0083] Las variantes de fitasa pueden ser variantes hipoalergénicas, diseñadas para invocar una respuesta inmunológica reducida cuando se expone a animales, incluido el hombre. El término respuesta inmunológica debe ser entendido como cualquier reacción por el sistema inmunológico de un animal expuesto a la variante de fitasa. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Variantes hipoalergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo la variante de fitasa se puede conjugar con partes de protección de fracciones polímericas o epítopos de la variante de fitasa implicadas en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar el acoplamiento químico in vitro del polímero a la variante de fitasa, por ejemplo según se describe en WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, y/o WO 99/00489. La conjugación puede además o alternativamente implicar acoplamiento in vivo de polímeros a la variante de fitasa. Tal conjugación se puede conseguir por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de fitasa, insertando sitios de glicosilación adicionales de codificación de secuencias de consenso en la variante de fitasa y expresando la variante de fitasa en un huésped capaz de glicosilar la variante de fitasa, ver por ejemplo WO 00/26354. Otra manera de proveer variantes hipoalergénicas es crear por ingeniería genética la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de fitasa para causar que las variantes de fitasa se autoligomericen, consiguiendo que los monómeros de la variante de fitasa puedan proteger epítopos de otros monómeros de la variante de fitasa y así reducir la antigenicidad de los oligómeros. Tales productos y su preparación están descritos por ejemplo en WO 96/16177. Epítopos implicados en una respuesta inmunológica se pueden identificar por varios métodos tales como el método de exposición en fago descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el método aleatorio descrito en EP 561907. Una vez que un epítopo ha sido identificado, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para producir propiedades inmunológicas alteradas de la variante de fitasa por técnicas de manipulación génica conocidas tales como mutagénesis sitio dirigida (ver por ejemplo WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede realizarse en la proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al epítopo.

Secuencias de ácidos nucleicos y constructos

[0084] La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucléicos que codifica una variante de fitasa de según la invención.

[0085] El término "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a una secuencia de ácidos nucléicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente 40% pura, más preferiblemente al menos aproximadamente 60%, pura incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80% pura, y de la forma más preferible al menos aproximadamente 90% pura según se determina por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucléicos aislada se puede obtener por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucléicos desde su ubicación natural a un sitio diferente donde ésta será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido, inserción del fragmento en una molécula del vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán copias múltiples o clones de la secuencia de ácidos nucléicos. La secuencia de ácidos nucléicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintética, sintética, o cualquier combinación de las mismas.

[0086] Las secuencias de ácidos nucleicos según la invención se pueden preparar introduciendo al menos una mutación en la secuencia codificante de la fitasa progenitora o una subsecuencia de la misma, donde la secuencia de ácidos nucléicos mutante codifica una fitasa variante. La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucléicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede realizar por mutagénesis dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por mutagénesis dirigida, por mutagénesis aleatoria, o por mutagénesis aleatoria dopada, adicionada

o localizada .

[0087] La mutagénesis aleatoria es adecuadamente realizada bien como mutagénesis aleatoria específica de la región o localizada en al menos tres partes del gen que traduce para la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o en el gen entero. Cuando la mutagénesis se realiza por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje o adicionado se puede realizar de modo que los codones para aminoácidos indeseados son evitados. El oligonucleótido adicionado o dopado se puede incorporar en el ADN que codifica la enzima de fitasa por cualquier técnica, usando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa según se considere apropiado. [0088] Preferiblemente, el dopaje se realiza usando "dopaje aleatorio constante", en el que el porcentaje de tipo salvaje y

mutación en cada posición es predefinido. Además, el dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la introducción de nucleótidos determinados, y así una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje puede ser hecho, por ejemplo, para permitir la introducción de 90% de tipo salvaje y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se basa en la genética al igual que en las limitaciones estructurales de proteínas.

[0089] La mutagénesis aleatoria puede estar ventajosamente localizada en una parte de la fitasa progenitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando regiones determinadas de la enzima han sido identificadas por ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima.

[0090] Métodos alternativos para suministrar variantes según la invención incluyen la transposición de genes por ejemplo como se describe en WO 95/22625 o en WO 96/00343, y el proceso de derivación de consenso como se describe en EP 897985.

Constructos de ácidos nucleicos

[0091] Un constructo de ácidos nucléicos comprende una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. La expresión será entendida para incluir cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

Vector de expresión

[0092] Una secuencia de ácidos nucléicos que codifica una variante de fitasa según la invención puede ser expresada usando un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0093] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de glucoamilasa según la invención puede ser cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe ser introducido. El vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.

[0094] La variante de fitasa puede también ser coexpresada junto con al menos otra enzima de interés para el pienso para animales, tal como una xilanasa, una endoglucanasa, una endo-1,3(4)-beta-glucanasa, y/o una proteasa. Las enzimas se pueden coexpresar a partir de distintos vectores, a partir de un vector, o usando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se usan vectores diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables diferentes, y orígenes de replicación diferentes. Cuando se usa sólo un vector, los genes se pueden expresar a partir de uno o más promotores. Si se clonan bajo la regulación de un promotor (di- o multi-cistrónico), el orden en el que los genes son clonados puede afectar a los niveles de expresión de las proteínas. La variante de fitasa puede también ser expresada como una proteína de fusión, es decir que el gen que codifica la variante de fitasa ha sido fusionada en el marco con el gen que codifica otra proteína. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

Células huéspedes

[0095] La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de ácidos nucléicos según la invención, que es ventajosamente usada en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. El término "célula huésped" comprende cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0096] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, una célula eucariota, tal como una célula de animal, de mamífero, de insecto, vegetal, o fúngica. Células de animal preferidas son células animales no humanas.

[0097] En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica, o una célula de levadura, tal como una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromices, Pichia, Saccharomyces, Schizosacaromyces, o Yarrowia. La célula huésped fúngica puede ser una célula micótica filamentosa, tal como una célula de una especie de, pero no limitado a,

Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolipocladium, o Trichoderma.

[0098] Células unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacillus, o una célula de Streptomyces, o células de bacterias del ácido lático; o bacterias Gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. Bacterias del ácido lático incluyen, pero de forma no limitativa, especies de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, y Enterococcus.

Métodos de producción

[0099] La presente invención también se refiere a métodos para producir una fitasa de la presente invención que comprende

(a) cultivar una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la variante de fitasa; y (b) recuperar la variante de fitasa.

[0100] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de los métodos usando polipéptidos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, fermentación a gran escala o a pequeña escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten al polipéptido ser expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la fitasa se segrega en el medio nutritivo, ésta se puede recuperar directamente del medio. Si no es segregada, ésta se puede recuperar de lisatos celulares.

[0101] La fitasa resultante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede ser recuperada del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitados a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

[0102] Las fitasas de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas

[0103] La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de la planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido con actividad de fitasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta

o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta con el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, para mejorar el valor nutritivo, palatabilidad, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

[0104] En una forma de realización particular, el polipéptido es dirigido a las vacuolas de almacenamiento de endosperma en semillas. Esto se puede obtener sintetizándolo como un precursor con un péptido señal adecuado, ver Horvath et al en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, n°. 4, p. 1914-1919.

[0105] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (un dicot) o monocotiledónea (una monocot) o variantes creadas genéticamente de las mismas. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como festuca, lolium, cesped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (trigo).

[0106] Ejemplos de plantas dicot son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y planta crucífera (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo cercanamente relacionado de Arabidopsis thaliana. Plantas bajas en fitato como se describe por ejemplo en la patente US n°. 5,689,054 y patente US. n°. 6,111,168 son ejemplos de plantas creadas genéticamente. Ejemplos de partes de la planta son tallo, callo, hojas, raiz, frutas, semillas, y tubérculos. También tejidos de la planta específicos, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas, y citoplasma se consideran una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera una parte de la planta.

[0107] También incluidas dentro del campo de la presente invención están la progenie de tales plantas, partes de la planta y

células vegetales.

[0108] La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención se pueden construir conforme a métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye por que incorpora uno o más constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propaga la planta resultante modificada o célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.

[0109] Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazado con secuencias apropiadas reguladoras requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos en la planta o parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender una etiqueta seleccionable útil para identificar células huéspedes en las que el constructo de expresión ha sido integrado y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto depende del método de introducción de ADN que se utilice).

[0110] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias del promotor y del terminador y opcionalmente secuencias señal o de tránsito son determinadas, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde, y cómo se desea que el polipéptido sea expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, específica de la fase o del tejido, y el producto genético puede ser dirigido a un tejido específico o parte de planta tal como semillas o hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506 .

[0111] Para la expresión constitutiva, el promotor 35S-CaMV puede ser utilizado (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). Promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tal como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semillas tal como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de la proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de las hojas tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kyozuka et al., 1993, Fisiología de planta 102: 991-1000, el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible dañado tal como el promotor pin2 de patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).

[0112] Un elemento intensificador del promotor puede también ser usado para conseguir una mayor expresión de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento promotor intensificador puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra revelan el uso del primer intrón del gen de actina de arroz 1 para mejorar la expresión.

[0113] Además, el uso de codón se puede optimizar para las especies de la planta en cuestión para mejorar la expresión (ver Horvath et al a quien se hace referencia más arriba).

[0114] El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión se puede elegir de aquellos disponibles en la técnica.

[0115] El constructo de ácidos nucléicos se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0116] Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, ver Hooikas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 1538). No obstante también se puede usar para transformar monocotiledóneas, aunque otros métodos de transformación son generalmente preferidos para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de oro microscópico o de tungsteno revestidas con ADN transformante) de callos embrionarios o para desarrollar embriones (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

[0117] Después de la transformación, los transformantes que han incorporado en ellos el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica.

[0118] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica una variante de fitasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción de la variante de fitasa; y (b) recuperar la variante de fitasa.

Animales como huéspedes de expresión

[0119] La presente invención también se refiere a un animal transgénico no humano y productos o elementos del mismo, cuyos ejemplos son líquidos biológicos tales como leche y sangre, células de los órganos, de carne, y de animales. Técnicas para expresar proteínas, por ejemplo en células mamíferas, se conocen en la técnica, véase por ejemplo el manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), y los otros tres manuales en esta serie relacionados con la transcripción de genes, procesamiento del ARN, y procesamiento postraduccional. En términos generales, para preparar un animal transgénico, células seleccionadas de un animal seleccionado se transforman con una secuencia de ácidos nucléicos que codifica una variante de fitasa de la presente invención para expresar y producir la variante de fitasa. La variante de fitasa puede ser recuperada del animal, por ejemplo de la leche de animales hembra, o se puede expresar en beneficio del animal mismo, por ejemplo para ayudar a la digestión del animal. Ejemplos de animales son mencionados más abajo en la sección titulada pienso para animales y aditivos de pienso para animales.

[0120] Para producir un animal transgénico con el propósito de recuperar la variante de fitasa de la leche del animal, un gen que codifica la variante de fitasa se puede insertar en los huevos fertilizados de un animal en cuestión, por ejemplo usando un vector de expresión transgénico que comprende un promotor de proteínas de la leche adecuado, y el gen que codifica la variante de fitasa. El vector de expresión transgénico se microinyecta en ovarios fertilizados, y preferiblemente se integra permanentemente en el cromosoma. Una vez que el ovario comienza a crecer y a dividirse, el embrión potencial se implanta en una madre suplente, y los animales que llevan el transgen son identificados. El animal resultante puede después ser multiplicado por reproducción convencional. La variante de fitasa se puede purificar de la leche del animal, véase por ejemplo Meade, H.M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Fernandez y J. P. Hoeffler (eds.), Academic Press .

[0121] En la alternativa, para producir un animal transgénico no humano que lleva en el genoma de sus células somáticas y/o germinales una secuencia de ácidos nucléicos que incluye un constructo del transgen heterólogo que incluye un transgen que codifica la variante de fitasa, el transgen puede ser operativamente enlazado a una primera secuencia reguladora para la expresión específica de la glándula salival de la variante de fitasa, como se describe en WO 2000064247.

Pienso para animales y aditivos de pienso para animales

[0122] Para los fines presentes, el término animal incluye todos los animales, incluyendo seres humanos. En una forma de realización particular, las variantes de fitasa y las composiciones de la invención se pueden usar como un aditivo de pienso para animales no humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes, tales como vacas, ovejas y caballos. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluyendo, pero no limitados a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos y pollos (incluyendo pero no limitadas a pollos para asar, gallinas); terneros jóvenes; y peces (incluyendo pero no limitado a salmón).

[0123] El término pienso o composición alimentaria significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada para la ingesta por un animal. El pienso se puede proporcionar al animal antes, después, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

[0124] La composición de la invención, cuando se destina a la adición al pienso para animales, se puede designar como un aditivo de pienso. Tal aditivo siempre comprende la variante de fitasa en cuestión, preferiblemente en forma de composiciones estabilizadas líquidas o secas. El aditivo puede comprender otros componentes o ingredientes de pienso para animales. Las denominadas premezclas para pienso para animales son ejemplos particulares de tales aditivos de pienso. Premezclas pueden contener la(s) enzima(s) en cuestión, y además al menos una vitamina y/o al menos un mineral.

[0125] Por consiguiente, en una forma de realización particular, además de los polipéptidos componentes, la composición de la invención puede comprender o contener al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento. También al menos se puede incluir un macromineral. [0126] Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo vitamina K3.

[0127] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato.

[0128] Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto.

[0129] Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

[0130] Además, ingredientes opcionales de aditivos de pienso son agentes colorantes, compuestos de aroma, estabilizadores, enzimas adicionales, y péptidos antimicrobianos.

[0131] Componentes enzimáticos adicionales de la composición de la invención incluyen por lo menos un polipéptido con actividad de xilanasa; y/o al menos un polipéptido con actividad de endoglucanasa; y/o al menos un polipéptido con actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa; y/o al menos un polipéptido con actividad de proteasa.

[0132] Actividad de xilanasa puede ser medida usando cualquier ensayo, en el que un sustrato es empleado, que incluye 1,4-beta-D-xilosídico endo-enlaces en xilanos. Diferentes tipos de sustratos están disponibles para la determinación de actividad de xilanasa por ejemplo comprimidos de arabinoxilano reticulados de Xylazyme (de MegaZyme), o dispersiones de polvo insolubles y soluciones de arabinoxilano azo-teñidas.

[0133] Actividad de endoglucanasa puede ser determinada usando cualquier ensayo de endoglucanasa conocido en la técnica. Por ejemplo, varios sustratos con beta-glucano o de celulosa pueden ser aplicados. Un ensayo de endoglucanasa puede usar beta-glucano de cebada de AZCL, o preferiblemente (1) AZCL-HE-celulosa, o (2) Azo-CM-celulosa como un sustrato. En ambos casos, la degradación del sustrato se sigue espectrofotométricamente a OD595 (véase el método Megazyme para polisacáridos de AZCL para el ensayo de endo-hidrolasas a http://www.megazyme.com/booklets/AZCLPOL.pdf.

[0134] La actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa puede ser determinada usando cualquier ensayo de endo-1,3(4)-betaglucanasa conocido en la técnica. Un sustrato preferido para mediciones de actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa es un sustrato de cebada de glucano betareticulado azo-teñido, donde las mediciones se basan en principios de determinación espectrofotométricos.

[0135] La actividad de proteasa puede ser medida usando cualquier ensayo, en el que un sustrato es empleado, que incluye enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, y sustratos de pNA, tales como Suc-AAPF-pNA (disponibles por ejemplo de Sigma S-7388). Otro ejemplo es Protazyme AK (caseína reticulada teñida con azurina preparada como comprimidos por Megazyme T-PRAK). El Ejemplo 2 de WO 01/58276 describe ensayos de proteasa adecuados. Un ensayo preferido es el ensayo de Protazyme del Ejemplo 2D (el pH y temperatura deberían ser ajustados a la proteasa en cuestión según se ha descrito en general previamente).

[0136] Para evaluar la actividad de xilanasa, endoglucanasa, beta-1,3(4)-glucanasa y de proteasa el ensayo de pH y el ensayo de temperatura se deben adaptar a la enzima en cuestión (preferiblemente un pH cerca del pH óptimo, y una temperatura cerca de la temperatura óptima). Un pH de ensayo preferido es en el intervalo de 2-10, preferiblemente 3-9, más preferiblemente pH 3 o 4 o 5 o 6 o 7 o 8, por ejemplo pH 3 o pH 7. Una temperatura de ensayo preferida es en el intervalo de 20-80°C, preferiblemente 30-80°C, más preferiblemente 40-75°C, incluso más preferiblemente 40-60°C, preferiblemente 40 o 45 o 50°C. La actividad enzimática se define por referencia a ensayos ciegos apropiados, por ejemplo un tampón ciego.

[0137] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP) son CAP18, Leucocina A, Tripticina, Protegrina-1, Tanatina, lactoferrina, lactoferricina, y ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), y variantes o fragmentos de las mismas que retienen actividad antimicrobiana. Otros ejemplos son polipéptidos antifúngicos (AFP) tales como aquellos derivados de Aspergillus giganteus, y Aspergillus niger, al igual que variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y PCT/DK02/00289.

[0138] En una forma de realización particular, el aditivo de pienso de la invención está previsto que sea incluido (o prescrito que tenga que ser incluido) en dietas para animales o pienso a niveles de 0.0010-12.0%, o 0.0050-11.0%, o 0.0100-10.0%; más particularmente 0.05-5.0%; o 0.2-1.0% (% significando g de aditivo por 100 g de pienso). Esto es así en particular para premezclas.

[0139] Por consiguiente, las concentraciones de los componentes individuales del aditivo de pienso, por ejemplo la premezcla, se puede encontrar multiplicando la concentración en pienso final del mismo componente por, respectivamente, 10-10000, 20-2000 o 100-500 (en referencia a los tres porcentajes de intervalos de inclusión anteriores).

[0140] Las concentraciones en pienso finales de componentes de pienso importantes pueden reflejar los requisitos nutritivos del animal, que son generalmente conocidos por el nutricionista experto, y presentados en publicaciones tales como la siguiente: NRC, Nutrient requirements in swine, novena edición revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; y NRC, Nutrient requirements of poultry, novena edición revisada 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council, National Academy Press, Washington, D.C., 1994 .

[0141] La variante de fitasa debería por supuesto ser aplicada en el pienso para animales en una cantidad eficaz, es decir en una cantidad adecuada para mejorar el valor nutritivo del pienso. Es actualmente contemplado que se administra en las siguientes gamas de dosificación: 0.01-200 o 0.01-100 o 0.05-100 o 0.05-50 o 0.10-10 -todas estas gamas son en mg de proteína enzimática por kg de pienso (ppm).

[0142] Para determinar mg de proteína de fitasa por kg de pienso o aditivo de pienso, la enzima se purifica de la composición de pienso o el aditivo de pienso, y la actividad específica de la enzima purificada es determinada usando un ensayo pertinente. La actividad de fitasa de la composición alimentaria o el aditivo de pienso es también determinado usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, la dosificación en mg de proteína de fitasa por kg de pienso es calculado.

[0143] Por supuesto, si una muestra está disponible de la variante de fitasa usada para preparar el aditivo de pienso o el pienso, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la enzima de la composición de pienso o del aditivo).

[0144] La composición de la invención se puede preparar según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante la mezcla de la variante de fitasa con los ingredientes adicionales, si los hay.

[0145] Las composiciones de pienso o dietas para animales tienen un contenido relativamente alto de proteínas. Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteínas de 50-800, o 75-700, o 100600, o 110-500, o 120-490 g/kg, y comprende además una composición de la invención.

[0146] Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado más arriba), la composición de pienso para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30, o 11-28, o 11-26, o 12-25 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200, o 0.5-150, o 1-100, o 4-50 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200, o 0.5150, o 1- 100, o 1-50, o 1-25 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100, o 0.5-75, o 1-50, o 1-30 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0.1-150, o 0.5-125, o 1-80 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50, o 0.5-40, o 1-30 g/kg.

[0147] La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6.25, es decir proteína cruda (g/kg)= N (g/kg) x 6.25 como declarado en Animal Nutrition, 4ª Edición, Capítulo 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards y J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9 ). El contenido de nitrógeno se puede determinar por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14ª ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC). Pero también otros métodos pueden ser usados, tales como el método llamado Dumas en el que la muestra se combuste en oxígeno y la cantidad de gases nitrosos formados se analizan y se recalculan como nitrógeno.

[0148] La energía metabolizable puede ser calculada basándose en NRC publication Nutrient Requirements of Swine (1988) pp. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90- 71463-12-5.

[0149] En una forma de realización particular, la composición de pienso para animales según la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente de proteína. Ejemplos de proteínas vegetales o fuentes de proteína son semilla de soja, guisantes y semilla de colza de las familias leguminosae y brassica, y los cereales tales como cebada, maíz (grano), avena, arroz, centeno, sorgo y trigo.

[0150] En otras formas de realización particulares adicionales, la composición de pienso para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-10% de harina de pescado; y/o 0-20% de lactosuero.

[0151] Dietas para animales pueden por ejemplo ser fabricadas como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado. Típicamente, los materiales de pienso molidos se mezclan y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales se agregan según las especificaciones para las especies en cuestión.

[0152] La variante de fitasa de la invención se puede adicionar en forma de una formulación sólida o líquida enzimática, o en

forma de un aditivo de pienso, tal como una premezcla. Una composición sólida es típicamente añadida antes o durante la fase de mezcla; y una composición líquida es típicamente añadida después de la fase de granulación.

[0153] La variante de fitasa de la invención cuando se añade al pienso para animales conduce a un valor nutritivo del pienso mejorado, por ejemplo el índice de crecimiento y/o el aumento de peso y/o la conversión de pienso (es decir, el peso del pienso ingerido relativo al aumento de peso) del animal es/son mejorados. Estos resultados pueden ser debidos a, sucesivamente, uno o más de los siguientes efectos: Las fracciones de fosfato de cationes trivalentes y bivalentes de quelatos de ácido fítico tales como los iones metálicos, entre otros los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio al igual que los oligoelementos manganeso, cobre y molibdeno. Además, el ácido fítico también con un determinado alcance enlaza proteínas por interacción electroestática. A un pH por debajo del punto isoeléctrico, pl, de la proteína, la proteína cargada positivamente se enlaza directamente con fitato. A un pH por encima del pl, la proteína cargada negativamente se enlaza por medio de iones metálicos al fitato. El ácido fítico y sus sales, fitatos, son frecuentemente no metabolizados, puesto que no son absorbibles del sistema gastrointestinal, es decir ni su fósforo, ni los iones metálicos quelados, ni las proteínas enlazadas están nutricionalmente disponibles. Por consiguiente, como el fósforo es un elemento esencial para el crecimiento de todos los organismos, las preparaciones de alimentos y de pienso necesitan ser suplementadas con fosfato inorgánico. Bastante frecuentemente también los iones nutricionalmente esenciales tales como el hierro y el calcio, deben ser suplementados. Y, además, el valor nutritivo de una dieta dada disminuye, debido a la unión de proteínas por ácido fítico.

[0154] En formas de realización particulares el aumento de peso es al menos el 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,

o como mínimo el 110% del control (sin adición enzimática).

[0155] En formas de realización particulares adicionales, la conversión de pienso es como mucho (o no superior a) el 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 o como mucho el 90%, en comparación con el control (sin adición enzimática).

[0156] La composición de la invención puede también ser usada in vitro, por ejemplo para tratar proteínas vegetales. El término proteínas vegetales según se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada de un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos el 10, 20, 30, 40, 50, o el 60% (p/p). Ejemplos de proteínas vegetales o fuentes de proteínas son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (grano), arroz, y sorgo. Otros ejemplos son harina de semilla de soja, guisantes y harina de semilla de colza de las familias leguminosae y brassica.

[0157] La proteína vegetal o fuente de proteína es típicamente suspendida en un solvente, por ejemplo un solvente acuoso tal como agua, y los valores de pH y de temperatura son ajustados prestando la debida atención a las características de la variante de fitasa y enzimas adicionales, si las hay. La reacción enzimática es continuada hasta que el resultado deseado es conseguido, tras lo cual puede o no puede ser detenido inactivando la enzima, por ejemplo por una fase de tratamiento térmico.

[0158] En otra forma de realización particular de un proceso de tratamiento según la invención, las acciones enzimáticas son sostenidas, significando por ejemplo que la composición enzimática se añade a las proteínas vegetales o fuentes de proteína, pero la actividad enzimática por así decirlo no es activada hasta más tarde cuando se desee, una vez que las condiciones de reacción adecuadas son establecidas, o una vez que cualquier inhibidor enzimático es inactivado, o cualquier otro medio puede haber sido aplicado para posponer la acción de las enzimas.

Método para generar variantes de fitasa

[0159] Los métodos para generar una variante de una fitasa progenitora, donde la variante es más termoestable y/o tiene una actividad específica más alta que la fitasa progenitora, pueden comprender:

(d)

someter una secuencia de ADN que codifica la fitasa progenitora a mutagénesis aleatoria,

(e)

expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la fase (d) en una célula huésped, y

(f)

seleccionar las células huéspedes que expresan una variante de fitasa que es más termoestable y/o que tiene una actividad específica más alta que la fitasa progenitora.

[0160] La fase (d) del método anterior es preferiblemente realizada usando cebadores dopados, como se describe en la parte experimental.

[0161] Preferiblemente, el método anterior incluye las siguientes fases adicionales precedentes a las fases anteriores (d)-(f):

(a)

establecer una estructura 3D de una fitasa progenitora,

(b)

someter a la estructura 3D de (a) a simulaciones MD a temperaturas aumentadas;

(c)

identificar regiones en la secuencia de aminoácidos de la fitasa progenitora de alta movilidad (fluctuaciones isotrópicas) y sugerirlas para mutagénesis aleatoria, donde al menos una de las regiones identificadas en la fase (c) se enfocan en la fase (d).

[0162] La estructura de (a) se puede establecer por modelación por homología. Un modelo preferido es la estructura de la Fig. 1.

[0163] Ejemplos de temperaturas aumentadas son una o más de las siguientes temperaturas: 300K, 350K, 400K, 450K, 500K, y 550K.

[0164] La fitasa progenitora puede ser una fitasa progenitora de tipo salvaje, o variantes alélicas de las mismas, o fragmentos de las mismas que tienen actividad de fitasa, o partes maduras de las mismas, o variantes de las mismas, o polipéptidos sintéticos o creados genéticamente diseñados con base en las mismas. Los siguientes son ejemplos de fitasas progenitoras de tipo salvaje preferidas: fitasas fúngicas, tales como fitasas filamentosas fúngicas, o fitasas de levadura. Un ejemplo de una fitasa de levadura es la fitasa de Schwanniomyces occidentalis descrita en US 5830732. Ejemplos de fitasas filamentosas fúngicas son las fitasas derivadas del filo Ascomycota o del filo Basidiomycota (una fitasa de ascomiceto, o una fitasa de basidiomiceto, respectivamente). Ejemplos de fitasas de ascomiceto son aquellas derivadas de una cepa de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus awamori PHYA (SWISSPROT P34753, Gene 133:55-62 (1993), Aspergillus niger (ficuum) PHYA (SWISSPROT P34752, EP 420358, Gene 127:87-94 (1993), Aspergillus awamori PHYB (SWISSPROT P34755, Gene 133:55-62 (1993), Aspergillus niger PHYB (SWISSPROT P34754, Biochem. Biophys. Res. Commun. 195:5357(1993)); o una cepa de Emericella, por ejemplo Emericella nidulans PHYB (SWISSPROT 000093, Biochim. Biophys. Acta 1353:217-223 (1997)); o una cepa de Thermomyces (Humicola), por ejemplo la fitasa de Thermomyces lanuginosus descrita en WO 97/35017. Otros ejemplos de fitasas de ascomiceto son descritas en EP 684313 (por ejemplo derivadas de cepas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, y Myceliophthora thermophila); JP 11000164 (una fitasa derivada de una cepa de Penicillium.); US 6139902 (una fitasa derivada de una cepa de Aspergillus), y WO 98/13480 (fitasa de Monascus anka). Ejemplos de fitasas de basidiomiceto son las fitasas derivadas de Paxillus involutus, Trametes pubescens, Agrocybe pediades y Peniophora lycii (ver WO 98/28409).

[0165] Todavía, las fitasas de basidiomiceto son más preferidas, y una fitasa progenitora altamente preferida es la fitasa derivada de Peniphora lycii CBS 686.96 (así como variantes alélicas, fragmentos etc. de los mismos según se ha descrito en general anteriormente, al igual que fitasas homólogas).

[0166] Las siguientes fitasas y secuencias de fitasa de WO 00/43503 son ejemplos de fitasas sintéticas progenitoras preferidas: SEC ID nº: 22 (consenso de basidio), SEC ID nº: 24 (parte madura de fitasa-10 de consenso); SEC ID nº: 26 (fitasa-10 de consenso); SEC ID nº: 27 ( fitasa-11 de consenso), SEC ID nº: 31 (fitasa-10-termo(3)-Q50T- K91A de consenso), SEC ID nº: 36 (fitasa-12 de consenso), SEC ID nº: 91 (fitasa-3-termo(11)-Q50T de consenso), SEC ID nº: 93 (fitasa-3-termo(11)-Q50T-K91A de consenso), SEC ID nº: 95 (fitasa-10-termo(5)-Q50T de consenso); y SEC ID nº: 97 (fitasa-10-termo(5)-Q50T-K91A de consenso), fitasa-10-termo(3) de consenso, fitasa-10-termo(3)-Q50T de consenso, fitasa10-termo(3)-K91A de consenso, aminoácidos 27-467 de fitasa-10-termo(3) de consenso, aminoácidos 27- 467 de fitasa-10termo(3)-Q50T de consenso, aminoácidos 27-467 de fitasa-10-termo(3)-K91A de consenso.

[0167] Otros ejemplos de fitasas progenitoras sintéticas preferidas son: las variantes de una fitasa de Aspergillus fumigatus descrita en EP 897010, la fitasa de consenso fúngica y sus variantes descritas en EP 897985, las variantes de fitasa de Aspergillus fumigatus, y la fitasa designada fitasa-7 de consenso, al igual que las variantes de fitasa-1 de consenso descritas en WO 00/43503.

[0168] Un método de selección preferido para variantes de fitasa termoestables es la selección primaria descrita en el Ejemplo 1: Cultivar colonias candidatas (p. ej. una biblioteca de levadura) en un medio sólido apropiado (p. ej. placas de glucosa SC) durante un tiempo apropiado (p. ej. durante 3 días a 30°C), replicar en nuevas placas con filtros de nitrato, incubar durante un tiempo apropiado (p. ej. a 30°C durante 1 día), transferir filtros a placas de Na-fitato precalentadas a un pH apropiado (p. ej. pH5.5 y 53°C), incubar a una temperatura elevada durante un tiempo apropiado (p. ej. a 53°C durante la noche), eliminar filtros, y verter en una solución con iones de Ca (p. ej. 0.5M de solución de CaCl2), elegir colonias con zonas de compensación más grandes que la fitasa progenitora.

[0169] Otro método de selección preferido es la selección secundaria descrita en el Ejemplo 1 (sumergir el cultivo, estableciendo un perfil de actividad vs. temperatura de la fitasa en los sobrenadantes, seleccionar candidatos con un mejor rendimiento que la fitasa progenitora (la actividad más alta a la temperatura más alta es la mejor)). Para ambas de estas pruebas, temperaturas alternativas son aquellas indicadas arriba en la sección de termostabilidad. Los dos métodos se pueden usar en combinación/sucesión como se describe en el ejemplo 1.

[0170] Métodos de mutagénesis aleatoria preferidos son el dopaje, y la redistribución de oligonucleótidos adicionados.

[0171] En una forma de realización aún más preferida del método anterior para generar variantes de fitasa, el método se hace reiterativo, lo que significa que en una primera fase, la fitasa progenitora es una de las fitasas mencionadas arriba, por ejemplo la fitasa de Peniphora, en una segunda fase la fitasa progenitora es una variante X de la misma más termoestable, en una tercera fase la fitasa progenitora es otra variante Y de termostabilidad incluso más alta que X, etcétera.

[0172] Un método de selección preferido para la actividad específica mejorada es el método de selección primario al que se hace referencia en el Ejemplo 1. Otro método de selección preferido para una actividad específica mejorada es el método de selección secundario al que se hace referencia en el Ejemplo 1.

[0173] La invención también se refiere a un método para producir una variante de fitasa obtenible u obtenida por el método de generación de variantes de fitasa anteriormente descrito, que comprende (a) cultivar la célula huésped para producir un sobrenadante que comprende la variante; y (b) recuperar la variante.

[0174] La presente invención es posteriormente descrita por los siguientes ejemplos que no deberían ser interpretados como limitando el ámbito de la invención.

Formas de realización particulares

[0175] Un aspecto de la presente invención es la transferencia de mutaciones seleccionadas (positivas, es decir por ejemplo termostabilidad mejorada y/o actividad específica) en el esqueleto de fitasa de Peniophora por medio de un alineamiento por homología con otros esqueletos, preferiblemente esqueletos homólogos. Este concepto puede ser descrito de la siguiente manera: en cada una de las reivindicaciones y formas de realización adicionales particulares tales como aquellas listadas más abajo, sustituir "fitasa progenitora" con "fitasa derivada de Peniophora lycii CBS 686.96," y añadir la siguiente reivindicación: Variante de fitasa que es homóloga a la fitasa derivada de Peniophora lycii CBS 686.96, dicha variante comprendiendo una sustitución en al menos una posición que corresponde a aquellas reivindicadas y listadas en las formas de realización adicionales, la posición correspondiente siendo deducida por alineamiento de la fitasa homóloga con la SEC ID nº: 2 como se ha descrito anteriormente.

[0176] Varias formas de realización particulares de la variante de fitasa de la invención son reivindicadas, y se disponen formas de realización adicionales particulares más abajo. La invención también se refiere a los siguientes aspectos de las formas de realización a continuación: secuencias de ácidos nucleicos aisladas; constructos de ácidos nucleicos; vectores de expresión recombinantes; células huéspedes recombinantes; métodos para producir plantas transgénicas, o partes de la planta; animales transgénicos no humanos, o productos, o elementos de los mismos; composiciones tales como aditivos para piensos, y pienso para animales; métodos y procesos de uso; y usos (según se reivindica aquí). Una composición que comprende al menos una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones o cualquiera de las formas de realización anteriores está incluida aquí específicamente. El pienso para animales preferiblemente comprende al menos una proteína vegetal o fuente de proteína.

[0177] La invención se refiere a una variante de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N,C,T; 45A; 63N; 69A; 92L; 93I; 95R,H,M,N,S,T; 97V; 98G; 99D; 102I; 110Y,R,W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C,R; 157K; 160R; 163P; 183K,A,W,G; 185A,H,N,P,K; 187G; 190S,K; 191L,R,S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 222I; 234K,S; 248A,C,D,e,G,H,S,T; 286S; 321A; 323A; 324S,L; 328T; 330R; 334E,D,G; 343N; 344A,V,S; 345D,H; 347Q,P; 349M,K; 350T,M,I,L; 384S,A; 395G; 398T; 409S; 421R,S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 429I; y 430M; donde

(a)

la variante tiene actividad de fitasa;

(b)

cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº: 2 y

(c)

la variante tiene un porcentaje de identidad para la SEC ID nº: 2 de al menos 75%.

(i)

20R+95R+97V+98G;

(ii)

29N+1021;

[0178] La invención además proporciona variantes como se ha indicado anteriormente, que comprenden una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del siguiente grupo de sustituciones y combinaciones de sustituciones:

(iii) 29N+118A;

(iv)

29N+163P+324S;

(v)

29N+163P+324S+395G;

(vi)

29N+234S;

(vii) 29N+324S;

(viii) 29S;

(ix)

29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V;

(x)

29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S;

(xi)

29S+95H+110W+183W+324A+350V;

(xii) 29S+95M+110W+183W+324A+350V;

(xiii) 29S+95N+110R+183W+324A+350V;

(xiv) 29S+95R+110W+183W+324A+350V;

(xv) 29S+95S+110R+183W+324A+350V;

(xvi) 29S+95S+110W+183W+324A+350V;

(xvii) 29S+95T+110R+183W+324A+350V;

(xviii) 29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V;

(xix) 29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V;

(xx) 29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V;

(xxi) 29S+95T+110Y+157K+183W+185H+187R+190S+191R+248G+324A+350V;

(xxii) 29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V;

(xxiii) 29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V;

(xxiv) 29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V;

(xxv) 29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V;

(xxvi) 29S+95T+110Y+183W+185E+248S+324A+350V;

(xxvii) 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+321A+323A+324A+350V;

(xxviii) 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V;

(xxix) 29S+95T+110Y+183W+185H+187S+190K+191S+210G+222I+248G+324A+350 V;

(xxx) 29S+95T+110Y+183W+185K+248G+324A+349K+350L;

(xxxi) 29S+95T+110Y+183W+185K+248S+324A+350V;

(xxxii) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349A+350L;

(xxxiii) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350I;

(xxxiv) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350M;

(xxxv) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+350V;

(xxxvi) 29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V;

(xxxvii) 29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V;

(xxxviii) 29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V;

(xxxix) 29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V;

(xl) 29S+95T+110Y+183W+324A;

(xli) 29S+95T+110Y+183W+324A+350V;

(xlii) 29S+99D+125D+324A+334E+350V;

(xliii) 29S+110Y+183W+185N+324A+350V;

(xliv) 29S+125D+218T+324A+344S+350V;

(xlv) 29S+125D+234K+324A+330R;

(xlvi) 29S+125D+234K+324A+330R+395G;

(xlvii) 29S+125D+324A;

(xlviii) 29S+125D+324A+330R+395G;

(xlix) 29S+125D+324A+350V;

(l)

29S+183A+324A+350V;

(li)

29S+183G+324A+334E+344S+350V;

(lii) 29S+183W+324A+350V;

(liii) 29S+205S;

(liv) 29S+324A+350V;

(lv) 29T+324L;

(lvi) 45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M;

(lvii) 69A+334E;

(lviii) 99D+398T;

(lix) 114A+187G+194R+324S;

(lx) 218T+334G;

(lxi) 323A+324S;

(lxii) 324S;

(lxiii) 324S+328T;

(lxiv) 324S+345D+347Q;

(lxv) 324S+395G;

(lxvi) 330R;

(lxvii) 334D+343N+344V;

(lxviii) 334E+344A;

(lxix) 345H+347P+350V; y

(lxx) 350V.

Ejemplos

[0179] Los productos químicos usados fueron productos comerciales de al menos calidad reactiva.

Ejemplo 1: Preparación de variantes de PE, selección y aislamiento de variantes de termostabilidad mejorada y/o actividad específica

Principios Generales

[0180] Usando la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96 como una fitasa progenitora, y basándose en las regiones de interés descritas aquí, varias bibliotecas de la variante de fitasa fueron construidas y expresadas en la levadura (bibliotecas dopadas, y bibliotecas de redistribución de oligonucleótidos adicionados, cuyos ejemplos están descritos más abajo).

[0181] Selección de termostabilidad mejorada: las bibliotecas de levadura fueron sometidas a una selección primaria como se describe más abajo (réplica, filtro único) para seleccionar aquellas colonias que muestran actividad a 53°C.

[0182] Las colonias que muestran actividad a 53°C fueron transferidas a la selección secundaria como también se describe más abajo (cultivo en placas de 24 pocillos) para establecer un perfil de temperatura (actividad a 37°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C etc., como aplicable) para cada colonia.

[0183] Para colonias con mejor rendimiento que la fitasa progenitora de tipo salvaje de Peniophora, los plásmidos fueron aislados y retransformados en la levadura, y el experimento del perfil de temperatura fue repetido. De los experimentos del perfil de temperatura las siguientes figuras son calculadas: "Actividad relativa a 60°C/37°C," y/o "actividad relativa a 62°C/37°C," y/o "actividad relativa a 65°C/37°C," y/o "actividad relativa a 68°C/37°C," y/o "actividad relativa a 70°C/37°C," y/o "actividad relativa a 72°C/37°C," etcétera. En estas proporciones, la temperatura mencionada primero puede ser designada "la temperatura elevada de elección." Estos términos son definidos como la proporción de la actividad de fitasa a temperatura elevada (p. ej. 60 o 62°C), relativa a la actividad de fitasa a temperatura más baja (37°C), basado en los valores de actividad de fitasa obtenidos para los sobrenadantes en el método de selección secundaria (mediciones del perfil de temperatura). Las colonias en las que una o más de estas actividades relativas se mejoran en comparación con la fitasa progenitora fueron seleccionadas, el plásmido en cuestión fue secuenciado, y la variante correspondiente identificada como una variante de fitasa mejorada de la invención.

[0184] En una segunda ronda de selección, una variante de fitasa termoestable fue seleccionada como una nueva fitasa progenitora (esqueleto) y lo anterior fue repetido (temperaturas ajustadas según lo apropiado basándose en el rendimiento de este nuevo esqueleto).

[0185] Además, se construyeron variantes de combinación, y algunos focos potenciales fueron aleatorizados, y las variantes fueron evaluadas.

[0186] En una tercera ronda de selección, otra nueva variante de fitasa mejorada termoestable fue seleccionada como un nuevo esqueleto, y lo anterior fue repetido (temperaturas otra vez ajustadas en una dirección ascendente, por ejemplo la temperatura de la primera ronda de selección fue ahora aumentada a 63°C. Además, todavía algunas nuevas variantes de combinación fueron interpretadas, y otros sitios aparentemente interesantes fueron aleatorizados para encontrar un par óptimo de sustituciones.

[0187] Variantes adicionales fueron preparadas como se ha descrito en general anteriormente.

[0188] Selección para actividad específica mejorada: en la selección primaria, la biblioteca de levadura fue extendida en la placa de glucosa SC con fitato de calcio, y cultivada durante 3 días a 30°C. Los clones con halos más grandes fueron seleccionados y cultivados en placas de 24 pocillos con medio YPD. En la selección secundaria, la actividad de los sobrenadantes en pocillos fue controlada relativamente y los clones con actividad más alta fueron seleccionados. Los clones seleccionados fueron controlados para la actividad restante en placas tras la incubación a 80°C, pH4 durante 30min para deseleccionar variantes con termoestabilidad inferior. Los clones con termostabilidad alta fueron seleccionados y cultivados otra vez en placas de 24 pocillos para semi-purificación. Semi-purificación fue realizada uniendo la fitasa a conA-sefarosa 4B (Concanavalina A en Matriz de gel de sefarosa 4B de Amersham bioscience, Cat. N°. 17-0440-01) y eluyéndolo por 0.5M de metil-alfa-D-manopiranosida en PBS + 0.1% tween20 (PBS es NaCl de 8g/l, 0.2g/l KCI, 2.68g/l Na2HPO4 -7H2O, 0.24g/l KH2PO4 (pH7.4); y tween20 está comercialmente disponible de Bio-Rad, Cat. n°. 170- 6531). Los sobrenadantes semipurificados fueron luego involucrados en el análisis de inmunoelectroforesis en cohete después de haber sido ajustada la actividad a 30FYT/ml. Para la inmunoelectroforesis en cohete un anticuerpo policlonal cultivado en conejos contra la fitasa

de Peniophora purificada fue usado. Los clones con señales más pequeñas fueron seleccionados como variantes con mayor actividad específica (el área bajo el cohete siendo proporcional a la concentración del antígeno (la fitasa), es decir, cuanto más pequeña es el área, menor es la proteína de fitasa, y mayor es la actividad específica).

5 [0189] Ejemplos de variantes mejoradas se muestran en las Tablas 1-5 más abajo. Estas variantes muestran una actividad específica más alta y/o son más termoestables que la fitasa progenitora de Peniophora. En particular, en cuanto a termostabilidad, las variantes presentan valores más altos para "Actividad relativa a 60°C / 37°C," y/o "actividad relativa a 62°C/37°C," y/o "actividad relativa a 65°C/37°C," y/o "actividad relativa a 68°C/37°C," y/o "actividad relativa a 70°C/37°C," y/o "actividad relativa a 72°C/37°C, " y/o "actividad relativa a 74°C / 37°C," etc. (véanse también los resultados mostrados en

10 las Tablas 6-1 y 6-2). Variantes seleccionadas que resultan del método de selección de actividad específica se muestran en la Tabla 6-3 abajo. Todas estas variantes son expectativamente de una actividad específica incluso más alta que la variante designada "N" en la tabla 8.

[0190] Variantes seleccionadas fueron expresadas en Aspergillus oryzae IFO 4177 que se describe en WO 97/35956 y las

15 células transformadas fueron cultivadas en el medio MDU-2Bp a 25°C a 220 r.p.m. Las variantes de fitasa fueron purificadas del caldo de fermentación y caracterizadas adicionalmente en cuanto a la termostabilidad y/o actividad específica como se describe en el Ejemplo 2 y como se muestra en las Tablas 7-8.

Tabla 1

Variante de fitasa

Sustituciones

1

D29N+L163P+D187G+G194R+P324S

2

A99D+A398T

3

A334D+D343N+E344V

4

T114A+D187G+G194R+P324S

5

D29N

6

D29N+L102I

7

D29N+N234S

8

P324S+A328T

9

D29S+N205S

10

D29S+P324A+D350V+E183W+K95R+H110W

11

N234K

12

V323A+P324S

13

Q20R+K95R+G97V+V98G

14

T45A+D350V+deleción (P421-E423) +inserto (P421RRNSLEGRIM)

15

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248T+V349L+D350M

16

D29N+T118A

17

P324S+N345D+L347Q

18

N199S+V248A

19

D29T+P324L

20

D350V

21

A218T+A334G

22

L163P

23

V93I+N409S+P324S

24

A334E+E344A

25

P324S+A328T

26

G330R

27

V248A

28

V69A+A334E

29

T45A+A218T

Tabla 2

Variante de fitasa

Sustituciones

30

D29N+L163P+P324S+E395G

31

D29S+E125D+P324A+A334E+E344S+P421S

32

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248T+V349L+D350I

33

D29S+K95T+H110Y+E183W+D185K+V248S+P324A+D350V

34

D29S+E125D+P324A+N234K+G330R

35

D29N+P324S

36

D29S+E125D+P324A+G330R+E395G

37

D29S+E125D+P324A+N234K+E395G

38

D29S+P324A+E125D+D350V

39

D29S+P324A+E125D+D350V+T45A+V69A+A99D+H110Y+A334E+E344S

40

D29N+L163P+P324S

41

D29S+K95T+D350V+E183W+H110Y+D185E+V248S+P324A

42

P324S+E395G

43

D29S+P324A+E125D

Tabla 3

Variante de fitasa

Sustituciones

44

D29S+E125D+P324A+N234K+G330R+E395G

45

D29S+P324A+E125D

46

D29T

47

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248T+V349A+D350L

48

D29S+P324A+E125D+D350V+A99D+A334E

49

P324S

50

D29S+T45A+V248A+P324A+V349M+D350V+E395G

51

D29S+K95T+H110I+E183W+D185H+D187S+T190K+T191S+S210G+ M222I+V248G+P324A+D350V

52

D29S

53

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185P+V248G

Tabla 4

Variante de fitasa

Sustituciones

54

D29S+P324A+D350V+E183W+K95M+H110W

55

D29C

56

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248G+V349K+D350L

57

D29S+P324A+D350V+E183W+H110Y+D185N

58

D29S+P324A+E125D+D350V+A99D+A334E

59

N345H+L347P+D350V

60

D29S+P324A+E125D+D350T

61

D29S+P324A+E125D+D350V+N345H+L347P

62

P324A

63

D29S+K95R+D350V

64

D29S+K95T+H110i+E157K+E183W+D185H+D187R+T190S+T191R+ V248G+P324A+D350V

65

D29S+P324A+E125D+D350V+E344S+A218T

66

F92L

67

D29S+P324A+D350V

Tabla 5

Variante de fitasa

Sustituciones

68

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+T191L

69

D29S+P324A+D350V+E183W

70

D29S+P324A+E183W+K95T+H110Y

71

D29S+P324A+E125D+D350V+G63N+A218T+A334E+E183K+P421S

72

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185P+V248S

73

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+E125D+G286S

74

D29S+P324A+E125D+D350V

75

D29S+P324A+D350V+E183G+A334E+E344S

76

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110R

77

D29S+K95T+H110i+E183W+D185H+V248G+T321A+V323A+P324A+ D350V

78

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185H+V248G

79

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110i+G152A+G156C+E157Q+ L160R

80

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248A

81

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y

82

D29S+P324A+D350V+E183W+K95H+H110W

83

D29S+P324A+D350V+E183A

84

D29S+P324A+D350V+E183W+K95N+H110R

85

D29S+K95T+H110Y+E183W+D185K+V248T+P324A+D350V

86

D29S+P324A+D350V+E183W+K95S+H110W

87

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248E

88

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+G156R+E157Q

89

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248H

90

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248C

91

D29S+P324A+D350V+E183W+K95S+H110R

92

D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+V248D

Tabla 6-1

Variante de fitasa

Actividad relativa 60°C/37° C Actividad relativa 62°C/37° C Actividad relativa 65°C/37° C Actividad relativa 68°C/37° C Actividad relativa 70°C/37° C Actividad relativa 72°C/37° C Actividad relativa 74°C/37° C

Fitasa progenitora de Peniophora

70 30 15 - - - -

1

104 55 - -

2

95 50 - - - - -

3

120 70 - -

4

120 70 - -

5

195 175 - -

6

105 40 - -

7

94 47 - - - - -

8

115 65 - -

9

118 69 - -

10

106 60 - -

11

140 107 - -

12

150 130 80 - - - -

13

104 45 - -

14

130 75 - -

15

141 123 - -

16

179 130 - -

17

127 59 - -

18

104 42 - -

19

115 52 - -

20

126 65 - -

21

115 54 - -

22

102 53 - -

23

95 44 - - - - -

24

71 40 - - - - -

25

62 33 - - - - -

26

155 124 - -

27

- - 170; 183 73; 136 69 32

28

147 126 61 - - - -

29

- - 176 105 69 32

30

- - 109 Aprox. 95 -

31

- - 154 102 -

32

- - - 102 22

33

- - 186 125 49

34

150 30 - -

35

80 40 - - - - -

36

- 137 63 - - - -

37

- 156 81 - - - -

38

- 125 46 - - - -

39

- 130 52 24 - - -

40

- 169 165 119 - - -

41

- 145 126 72 - - -

42

115 84 35 - - - -

43

145 112 54 - - - -

44

- - - 90 Aprox. 70 - -

45

- - - 105 Aprox. 80 - -

46

- - - 96 Aprox. 70 - -

47

- - - 104 42 - -

48

- - - 120 57 - -

49

- - - 147 102 53 -

50

- - - 152 105 51 -

51

- - - 184 101 48 -

52

- - - - 115 88 31

53

- - - - 118 74 25

54

118 69 - - - - -

Tabla 6-2

Variante de fitasa

Actividad Relativa 68° C/37°C Actividad Relativa 70° C/37° C Actividad Relativa 72° C/37°C Actividad Relativa 74° C/37°C Actividad Relativa 75°C/37 °C Actividad Relativa 76°C/37 °C Actividad Relativa 78°C/37 °C Actividad Relativa 80°C/37 °C Actividad Relativa 81°C/37 °C Actividad Relativa 82°C/37 °C

55

- - - - - 92 66 -

56

- - - - - 83 54 -

57

- - - - 71 23 -

58

172 122 - - - - - - - -

59

- - - - 90 34 - -

60

- - - - - - - 126 100 51

61

- - - 95 51 - - -

62

- - - - 99 49 -

63

- - 1 13 101 23 - - - - -

64

- - - - - - - 110 94 45

65

- - - - - 74 38 -

66

- - 1 78 72 36 - - -

67

- - - - 36 8 -

68

- - - - - 61 32 -

69

- - - - 96 40 - -

70

- - - - - 69 38 -

71

- - - - - 102 52 - - -

72

- - - - 104 50 -

73

- - - - - 88 61 -

74

- - - - 98 36 - -

75

- - - - 71 27 - -

76

- - 1 31 110 60 42/56 16 - - -

77

- - - - 59 17 -

78

- - - - 81 28 - -

79

- - - - 91 32 - -

80

- - - - 76 24 - -

81

147 102 53 - - - - - - -

82

- - - - - 85 45 -

83

- - - - 91 31 -

84

- - - - - 85 67 -

85

- - - - - 60 -

86

- - - - - - - 122 105 58

87

- - - - - - - 102 62 -

Tabla 6-3

Variante de fitasa

Actividad específica (%)

N

100

Q

144

R

122

S

189

T

200

U

167

V

167

W

156

X

167

Y

133

Z

122

Cepas y plásmidos 5 [0191] E.coli DH12S (disponible de Gibco BRL) se usa para el rescate del plásmido de levadura.

[0192] pTMPP2ver2 es un vector transportador de S. cerevisiae y E.coli bajo el control de Promotor TPI, construido a partir de pJC039 descrito en WO 00/10038. Se usa para la construcción de bibliotecas, expresión en levaduras, selección y 10 secuenciación.

[0193] Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, su 4-539 se usa para la construcción de biblioteca de levadura y la expresión de las variantes de fitasa. Se describe en J. Biol. Chem. 272 (15), 9720- 9727, 1997).

15 Medios y sustratos 10X Solución Basal [0194]

66. 8 g/l Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCO)

100 g/l succinato 20 60 g/l NaOH

Glucosa SC [0195] 100 ml/l 20% glucosa (es decir, una concentración final de 2% = 2 g/100ml)

25 4 ml/l 5% treonina 10 ml/l 1% triptófano 25 ml/l 20% casamino ácidos 100 ml/l 10 X solución basal

30 [0196] La solución anterior es esterilizada usando un filtro de un tamaño de poro de 0.20μm. Agar y H2 O (aprox. 761ml) se someten juntos a autoclave, y la solución de glucosa SC separadamente esterilizada se añade a la solución de agar.

YPD [0197]

35 20 g/l Bacto peptona 10 g/l Extracto de levadura 100 ml/l 20% glucosa (esterilizada separadamente)

40 Placa de fitato de Na [0198] 100 ml/l 1M Tampón de acetato de Na (pH 5.5) 5 g/l Fitato de Na 30 g/l agar

45 Solución de PEG/LiAc [0199] 50ml 40% PEG4000 (esterilizado por autoclave) 1ml 5M Acetato de litio (esterilizado por autoclave)

50 Solución de metal traza [0200] FeSO4 x 7H2O 13. 90 g/l MnSO4 x 5 H2O 13. 60 g/l ZnCl2 6.80 g/l CuSO4 x 5 H2O 2.50 g/l NiCl2 x 6 H2O 0.24 g/l Acido cítrico x H2O 3.00 g/l

MDU-2Bp [0201] Maltosa x H2O 45 g/l Extracto de levadura 7 g/l MgSO4 x 7H2O 1 g/l NaCl 1 g/l K2SO4 2 g/l KH2PO4 12 g/l Solución de metal traza 0.5 ml/l

Métodos Actividad de fitasa, método de selección primaria [0202] Extender la biblioteca de levadura sobre placas de glucosa SC e incubar durante 3 días a 30°C. Replicar en nuevas placas de glucosa SC con filtros de nitrato usando tela de terciopelo. Incubar las placas a 30°C durante 1 día (o 20°C durante el fin de semana). Transferir los filtros a placas de fitato de Na al 0.5% precalentadas (pH5.5). Incubar las placas a la temperatura prescrita, por ejemplo 53°C, durante toda la noche (O/N). Eliminar los filtros y verter 0.5M de solución CaCl2. Encontrar los clones de levadura con zonas claras. Aislar los clones candidatos de la placa maestra e inocular a una nueva placa de glucosa SC y 1ml de medio YPD en placas de 24 pocillos.

Método de selección secundaria

[0203] Cultivar medio YPD en placas de 24 pocillos a 25°C durante 3 días a 180rpm. Centrifugar la placa / o sólo dejarla todavía durante una hora. Aplicar 5μl y 10μl de sobrenadantes a las placas de fitato de Na. Incubar las placas a 37°C y 53°C durante toda la noche. Controlar el diámetro de zonas claras. Controlar el perfil de temperatura del sobrenadante de aquellos clones que retienen actividad a 53°C, usar el ensayo de fitasa descrito en el ejemplo 2 más abajo (temperatura de ensayo según se prescriba).

Método para la construcción de biblioteca de levadura

[0204] Mezclar 0.5μl de vector (digerido con EcoRI-Notl) y 1μl de fragmentos de la PCR. Descongelar células competentes YNG318 en hielo. Mezclar 100μl de las células, la mezcla de ADN y 10μl de ADN portador (Clontech) en tubos de polipropileno de 12ml (Falcon 2059). Añadir 0.6ml de solución de PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30min a 30°C, y 200 r.p.m. Incubar durante 30 min a 42°C (choque térmico). Transferir a un tubo Eppendorf y centrifugar durante 5seg. Eliminar el sobrenadante y redisolver en 3ml de YPD. Incubar la suspensión celular durante 45min a 200rpm a 30°C. Verter la suspensión en placas de glucosa SC para dar aprox. 300clones/placa.

Construcción de bibliotecas

[0205] Bibliotecas dopadas se construyen por el método SOE (empalme por extensión por superposición, ver "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University Press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido de recombinación de levadura.

Otros métodos

[0206] La transformación de E.coli para construir bibliotecas y subclonación se realiza por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser). Plásmidos de ADN se preparan por el método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el Qiagen® Plasmid Kit. Fragmentos de ADN se recuperan de gel de agarosa por el equipo de extracción de gel Qiagen. PCR se realiza por el PTC-200 DNA Engine. El analizador genético ABI PRISM™ 310 se usa para la determinación de todas las secuencias de ADN. La transformación de levadura se realiza por el método de acetato de litio. El ADN total de levadura es extraído por el método de Robzyk y Kassir descrito en Nucleic acids research vol.20, No.14 (1992) 3790.

Cebadores generales para amplificación y secuenciación

[0207] Los cebadores siguientes se utilizan para hacer fragmentos de ADN que contienen cualquier fragmento mutado por el método SOE, o sólo para amplificar un gen de fitasa entero. SEC ID nº: 3:

620AM34 GAGTACTATCTTGCATTTGTAC TAGGAGTTTAGTGAACTTGC SEC ID nº: 4: 680AM35 ATGGTTATGGATTTCGGGGATTC TTCGAGCGTCCCAAAACC SEC ID nº: 5: AM34 TAGGAGTTTAGTGAACTTGC SEC ID nº: 6: AM35 TTCGAGCGTCCCAAAACC SEC ID nº: 7: 620 GAGTACTATCTTGCATTTGTAC SEC ID nº: 8:

680 ATGGTTATGGATTTCGGGGAT Ejemplos de cebadores para construcción de bibliotecas dopadas Región 229-236 [0208] Conforme a la práctica establecida, en las secuencias de nucleótidos especificadas más abajo, se usan códigos

especiales para nucleótidos. Estos son aparentes de, por ejemplo, http://www.cs.pitt.edu/ vanathi/na.html). Por ejemplo, K

designa G o T; Y designa C o T; R designa A o G; y N designa A o C o G o T. T229 VNN nucleótidos L230 INMKR aminoácidos S231 TVN aminoácidos S232 VNN nucleótidos G233 VNN nucleótidos N234 VNN nucleótidos A235 VNN nucleótidos S236 AMK aminoácidos o sólo A (difícil de obtener M y K)

Distribución de nucleótidos para L230INMKR: [0209] Nucleótido Base 1 Base 2 Base 3

G 0.0 3.0 46.6 A 12.5 6.5 7.7 T 0.0 90.4 45.7 C 87.5 0.0 0.0

[0210] Los cebadores siguientes se determinan en la región T229-S236: SEC ID nº: 9: Dope1 (62mer):

SEC ID nº: 10: Dope1 R (18mer):

45 Sistema de reacción PCR:

38. 9 !l H2 O 5 !l 10 X tampón de reacción 1 !l Klen Taq LA (CLONTECH) 4 !l 10 mM dNTPs 0.3!l X 2 100 cebadores de pmol/!l

0.5 !l pTMPP2 ver2 GTCGAACGGGCACATATC

1: A91 G3 T3 C3

2: C91 G3 A3 T3

3: G91 C3 A3 T3

4: T91 G3 A3 C3

5: T95 G5

11: C88 A12

12: T90 G3 A7

13: G47 A8 T45

14: G9 A91

15: G83 A4 T9 C4 Cebadores para construcción de bibliotecas de redistribución de oligonucleótidos adicionados [0211] SEC ID nº: 11:

L102TI (43mer): AGTTCGGCGTCGCCGATCTGAiCCCGTTCGGGGCTAACCAATC

SEC ID nº: 12:

VE248+251X (53mer): TATTTACCGCGGAGGAGTATVNNTCGTACVNNTACTACTATGACCTCGACAAG

SEC ID nº: 13:

V271Al (45mer): CCGGGAACGCTCTCGGTCCTRiCCAGGGCGTCGGATACGTCAATG

SEC ID nº: 14: G286X (42mer):

ATGAGCTGCTTGCACGCTTGACCVNNCAAGCCGTTCGAGACG

Construcción de variantes de fitasa por dopaje

[0212] La primera reacción PCR se efectuó con 2 pares de cebadores, 620AM34 y Dope1 R, y Dope1 con las mezclas de

nucleótidos anteriormente descritas y 680AM35 usando el siguiente sistema de reacción PCR y condiciones:

Condiciones:

1

98° C 10 seg

2

68° C 90 seg

1-2

30 ciclos

3

68° C 10min

[0213] Los fragmentos resultantes fueron purificados de gel y usados para el molde para la segunda reacción PCR. La segunda PCR se efectuó con 620 y 680 como cebadores usando las siguientes reacciones de la PCR y condiciones:

Sistema de reacción PCR:

38. 4 !l H2O 5 !l 10 X tampón de reacción 1 !l Klen Taq LA (CLONTECH) 4 !l 10 mM dNTPs 0.3!l X 2 100 cebadores de pmol/!l 0.5!l X 2 Fragmentos de la PCR

Condiciones:

1 98° C 10 seg 2 66° C 90 seg 1-2 30 ciclos 3 66° C 10min

45 Sistema de reacción PCR:

0.2, 0.5 y 1 pmol molde tratado de ADNsa 3, 6, 12x exceso molar de cada oligonucleótido mutagénico 1 perlas listas para el uso 0.1!l Polimerasa Pwo volumen final 25!l

Biblioteca de redistribución de oligonucleótidos adicionados

[0214] Bibliotecas adicionadas fueron construidas de la siguiente manera: reacción PCR para preparar un fragmento de gen de la variante fue realizada con KlenTaq polimerasa y AM34 y AM35 como cebadores como se ha descrito anteriormente, y el fragmento fue purificado en gel. Sobre 10 ug ADN/250!l fueron incubados con 0.8!l DNasel (Gibco BRL 18068-015) y 30!l 10X tampón a 25°C durante 7-10min. EDTA se añadió a una concentración final de 10mM que detuvo la reacción. Fragmentos de ADN de tamaño correcto (50-150bp) fueron purificados por filtro de vidrio Whatman. Luego los fragmentos tratados con ADNsa fueron reagrupados usando el siguiente sistema de reacción PCR y condiciones:

Condiciones:

1

94°C 2 min.

2

94°C 30 seg

3

45°C 30 seg

4

72°C 1 min.

2-4

30 ciclos

5

72°C 5 min.

[0215] Usar la mezcla de PCR anterior como un molde, una segunda reacción PCR se efectuó usando el siguiente sistema

de reacción PCR y condiciones: Sistema de reacción PCR:

0.2, 0.5, 1 y 2!l primera reacción PCR 2 perlas listas para el uso 0.3!l 100pmol cebador 1 (AM34) 0.3!l 100pmol cebador 2 (AM35) 0.1!l Polimerasa Pwo

Condiciones:

1

94°C 2 min.

2

94°C 30 seg

3

55°C 30 seg

4

72°C 90 seg

2-4

25 ciclos

5

72°C 10 min.

Ejemplo 2: Purificación y caracterización de variantes de fitasa

Purificación de variantes de fitasa

[0216] El caldo de cultivo de fermentaciones de Asperillus oryzae que expresa varias variantes seleccionadas de las tablas 1-5 más arriba (designadas con mayúsculas A-M), fue filtrado usando primero una serie de filtros GF de Millipore y luego un filtro HA de 0.45 !m (Millipore). Sulfato de amonio (AMS) fue luego añadido al filtrado a una concentración de 1.35 M, y el pH fue ajustado a pH 6. La muestra fue filtrada nuevamente (0.45 !m de filtro HA como antes) y cargada sobre una columna de 70 ml (volumen dependiente de la carga) de Fenil Sefarosa (XK26, Pharmacia) equilibrada en 1.35 M de AMS, 20 mM de succinato, pH 6. La columna fue lavada con 1.35 M de AMS, 20 mM de succinato, pH 6 antes de eluir la fitasa en un gradiente lineal de 1.35-0 M de AMS en 20 mM de succinato, pH 6 sobre 10 volúmenes de columna. El flujo fue establecido a 6 ml/min y las fracciones de 10 ml fueron recogidas. Fracciones con actividad y de pureza suficiente (según fue evaluado por SDS-PAGE) fueron agrupadas y dializadas durante la noche contra 50 mM de acetato sódico, pH 5.5. Al pool que contenía fitasa se le añadió después 20 mM de ácido tris-acético, pH 7.5 y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico bien en una columna de 8 ml de MonoQ o de Q-Sepharose más grande (Pharmacia) equilibrada en 20 mM de ácido tris-acético, pH 7.5. La fitasa fue eluida en un gradiente lineal de 0-0.5 M de NaCl en 20 mM de ácido tris-acético, pH

7.5 sobre 10 volúmenes de columna. Los índices de flujo y tamaños de fracciones fueron ajustados según escala de columna. Las fracciones que contenían actividad de fitasa y de pureza suficiente fueron agrupadas y concentradas en las membranas Amicon YM10 antes de dializar contra 50 mM de acetato sódico, pH 5.5.

SDS-PAGE

[0217] SDS-PAGE fue realizada usando Novex 4-20 Tris-glicina según las instrucciones del fabricante. Las variantes de fitasa según fueron purificadas de A. oryzae tuvieron un peso molecular, PM, alrededor de 65 kDa correspondiente a aproximadamente un 25% de carbohidrato.

Ensayo de actividad de fitasa, pH y perfiles de temperatura, prueba de estabilidad de temperatura

[0218] Muestras enzimáticas diluidas de 10 !l (diluidas en 0.1 M de acetato sódico, 0.01 % Tween20, pH 5.5) fueron adicionadas en 250 !l 5 mM (Sigma) de fitato de sodio en 0.1 M de acetato sódico, 0.01 % Tween20, pH 5.5 (pH ajustado

después de la disolución del fitato de sodio; el sustrato fue precalentado) e incubadas durante 30 minutos a 37°C. La reacción fue detenida añadiendo 250 !l 10 % ATC y fosfato libre fue medido añadiendo 500 !l 7.3 g FeSO4 en 100 ml de reactivo de molibdato (2.5 g (NH4)6 Mo7024 .4H20 en 8 ml H2SO4 diluido hasta 250 ml). La absorbencia a 750 nm fue medida en muestras de 200 !l en placas de microtitulación de 96 pocillos. Sustrato y formas preliminares enzimáticas fueron

5 incluidas. Una curva estándar de fosfato fue también incluida (0-2 mM fosfato). 1 FYT iguala la cantidad de enzima que libera 1 !mol de fosfato/min a las condiciones dadas.

[0219] Los perfiles de pH fueron obtenidos realizando el ensayo anterior a varios valores de pH en 50 mM tampones pH 3 (glicina HCl), pH 4-5.5 (acetato sódico), pH 6 (MES), pH 7-8 (Tris-HCl).

10 [0220] Perfiles de temperatura fueron obtenidos realizando el ensayo a las distintas temperaturas (precalentando el sustrato).

[0221] La estabilidad de la temperatura fue investigada preincubando las fitasas en 0.1 M de fosfato sódico, pH 5.5 a varias 15 temperaturas antes de medir la actividad residual.

[0222] Las variantes purificadas presentan perfiles de pH similares a la fitasa progenitora de P. lycii (todas teniendo un pH óptimo alrededor de pH 4-5).

20 Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

[0223] Calorimetría por análisis diferencial fue realizada a varios valores de pH usando VP-DSC de Micro Cal. Los barridos fueron realizados a una tasa de barrido constante de 1.5 °C/min de 20-90°C. Antes de realizar la DSC, las fitasas fueron desaladas usando columnas NAP-5 (Pharmacia) equilibradas en los tampones apropiados (p. ej. 0.1M glicina-HCl, pH 2.5 o

25 3.0, 0.1 M acetato sódico, pH 5.5, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.0). La manipulación de datos fue realizada usando el software MicroCal Origin.

[0224] La temperatura de fusión resultante, la Tm, se muestra en la tabla 7 más abajo. La termostabilidad de las variantes se mejora significativamente en comparación con la fitasa progenitora de Peniophora. La termostabilidad es considerada 30 dependiente del pH.

Tabla 7

Variante de fitasa

Tm (°C) a pH 2.5 Tm (°C) a pH 3.0 Tm (°C) a pH 5.5 Tm (°C) a pH 7.0

Fitasa progenitora de Peniophora

36.4 50.5 59.6 48.8

A

- - 62.7 -

B

- - 62.4 -

C

- - 65.0 -

D

- 52.2 70.5 69.6

E

43.5 58.5 72.6 -

F

42.2 - 73.5 -

G

44.5 - 73.1

H

48.1 - 78.0 -

49.9

- 79.8 -

J

- 49.0 75.6 -

K

52.1 - 80.6 -

L

59.6 - 82.0 -

M

53.1 - 80.5 -

35 Ejemplo 3: Actividad específica

[0225] La actividad específica de variantes seleccionadas de las Tablas 1-5 (aquí designado N, O y P) fue determinada en muestras altamente purificadas dializadas contra 20 mM de acetato sódico, pH 5.5. La pureza fue controlada previamente en un gel de SDS poli acrilamida que muestra la presencia de sólo un componente.

40 [0226] La concentración de proteína fue determinada por análisis de aminoácido de la siguiente manera: una alícuota de la muestra fue hidrolizada en 6N de HCl, 0.1% fenol durante 16 h a 110 C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes fueron cuantificados usando un sistema de análisis de aminoácidos 420A de Applied Biosysttems accionado según las instrucciones del fabricante. A partir de las cantidades de los aminoácidos, la masa total - y por tanto también la

concentración - de proteína en la alícuota hidrolizada puede ser calculada.

[0227] La actividad de fitasa fue determinada en las unidades de FYT, y la actividad específica fue calculada como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática de la variante de fitasa. [0228] Los resultados se muestran en la tabla 8 más abajo. Las figuras de actividad específica son relativas a la actividad

específica de la fitasa progenitora de Peniophora que fue establecida en 100%. Tabla 8

Variante de fitasa

Actividad específica (%)

Fitasa progenitora de Peniophora

100

N

147

O

117

P

114

Ejemplo 4: Pienso para animlaes y aditivos de pienso para animales comprendiendo una variante de fitasa

Aditivo de pienso para animales

15 [0229] 10 g de variante de fitasa n°. 1938 (calculado como proteína enzimática de fitasa) se añade a la premezcla siguiente (por kilo de premezcla):

5000000 IE Vitamina A 1000000 IE Vitamina D3 13333 mg Vitamina E 1000 mg Vitamina K3 750 mg Vitamina B1 2500 mg Vitamina B2 1500 mg Vitamina B6 7666 mcg Vitamina B12 12333 mg Niacina 33333 mcg Biotina 300 mg �?cido fólico 3000 mg Ca-D-pantotenato 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se

5.8 % Calcio 25 % Sodio

20 Pienso para animales

[0230] Éste es un ejemplo de un pienso para animales comprendiendo 0.03g/kg (30ppm) de variante E de fitasa (calculado como proteína enzimática de fitasa):

25 74.0% trigo 20.7% pastel de soja asada 5.0% aceite de soja

0.3 % de la premezcla anterior Los ingredientes son mezclados, y el pienso se aglomera a la temperatura deseada, por ejemplo 65, 75, 80, o incluso 85°C.

30 [0231] La invención descrita y reivindicada aquí no debe estar limitada en su alcance por las formas de realización específicas aquí descritas, ya que estas formas de realización están previstas como ilustraciones de diferentes aspectos de la invención. Cualquier forma de realización equivalente se destina a estar dentro del campo de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas y mostradas aquí se harán aparentes para los expertos

35 en la técnica de la descripción precedente. Tales modificaciones están también destinadas a estar dentro del campo de las

reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, la presente divulgación incluidas las definiciones predominará.

LISTADO DE SECUENCIAS

5 [0232]

<110> Novozymes A/S

<120> Variantes de fitasa

<130> 10261 10 <160> 14

<170> Versión de patentIn 3.1

<210> 1

<211> 1320

<212> ADN 15 <213> Peniophora lycii

<220>

<221> CDS

<222> (49)..(1320)

<223> 20 <220><221> péptido_sig<222> (1)..(48)<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 423

<212> PRT

<213> Peniophora lycii

<400> 2

<210> 3

<211> 42

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 620AM34

<220>

<221> misc_feature 10 <223> cebador

<400> 3 gagtactatc ttgcatttgt actaggagtt tagtgaactt gc 42

<210> 4

<211> 41 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 680AM35

<220> 20 <221> misc_feature

<223> cebador

<400> 4

atggttatgg atttcgggga ttcttcgagc gtcccaaaac c 41

<210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador AM34

<220>

<221> misc_feature

<223> cebador

<400> 5 taggagttta gtgaacttgc 20

<210> 6

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador AM35

<220>

<221> misc_feature

<223> cebador

<400> 6 ttcgagcgtc ccaaaacc 18

<210> 7

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 620

<220>

<221> misc_feature

<223> cebador

<400> 7 gagtactatc ttgcatttgt ca 22

<210> 8

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 680

<220>

<221> misc_feature

<223> cebador

<400> 8 atggttatgg atttcgggga t 21

<210> 9

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador Dope1

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> N en la posición 19 es 91%A, 3%G, 3%T, 3%C

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> N en la posición 20 es 91%c, 3%G, 3%A, 3%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> N en la posición 21 es G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N en la posición es 88%C, 12%A

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> N en la posición 23 es 90%T, 3%G, 7%A

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> N en la posición 24 es 47%G, 8%A, 45%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> N en la posición 25 es 9%G, 91%A

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> N en la posición 26 es 83%G, 4%A, 9%T, 4%C

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> N en la posición 27 es T

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> N en la posición 28 es 91%T, 3%G, 3%A, 3%C

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> N en la posición 29 es 91%C, 3%G, 3%A, 3%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> N en la posición 30 es G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> N en la posición 31 es 91%G, 3%C, 3%A, 3%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> N en la posición 32 es 91%G, 3%C, 3%A, 3%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> N en la posición 33 es G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> N en la posición 34 es 91%A, 3%G, 3%T, 3%C

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(35)

<223> N en la posición 35 es 91%A, 3%G, 3%T, 3%C

<220>

<221> misc_feature

<222> (36) .. (36)

<223> N en la posición 36 es 95%T, 5%G

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> N en la posición 38 es 91%C, 3%G, 3%A, 3%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> N en la posición 37 es 91%G, 3%C, 3%A, 3%T

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> N en la posición 39 es G o T <220><221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> N en la posición 40 es 95%T, 5%G

<400> 9

<210> 10

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador Dope1R

<220>

<221> misc_feature

<223> cebador

<400> 10 gtcgaacggg cacatatc 18

<210> 11

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador L102TI

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N en la posición 22 es C o T

<400> 11 agttcggcgt cgccgatctg ancccgttcg gggctaacca atc 43

<210> 12

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador VE248+251X

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> N en la posición 30 es A o C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> N en la posición 23 es A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N en la posición 22 es A o C o G o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> N en la posición 21 es A o C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) .. (31)

<223> N en la posición 31 es A o C o G o T

<220>

<221> misc feature

<222> (32)..(32)

<223> N en la posición 32 es A o C o G o T

<400> 12 tatttaccgc ggaggagtat nnntcgtacn nntactacta tgacctcgac aag 53

<210> 13

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador A271AI

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> N en la posición 21 es A o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N en la posición 22 es C o T

<400> 13 ccgggaacgc tctcggtcct nnccagggcg tcggatacgt caatg 45

<210> 14

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador G286X

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> N en la posición 24 es un o C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> N en las posiciones 25 y 26 son independientemente A o C o G o T

<400> 14 atgagctgct tgcacgcttg accnnncaag ccgttcgaga cg 42

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Variante de una fitasa progenitora de termostabilidad mejorada y/o actividad específica en comparación con la fitasa de Peniophora lycii CBS 686.96, la variante comprendiendo al menos una de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 20R; 29N,C,T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931, 95R,H,M,N,S,T; 97V; 98G; 99D; 1021, 110Y,R,W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C,R; 157K; 160R; 163P; 183K,A,W,G; 185A,H,N,P,K; 187G; 190S,K; 191L,R,S; 194R; 199S; 205S; 210G; 218T; 2221, 234K, S; 248A,C,D,E,G,H,S,T; 286S; 321A; 323A; 324S,L; 328T; 330R; 334E,D,G; 343N; 344A,V,S; 345D,H; 347Q,P; 349M,K; 350T,M,I,L; 384S,A; 395G; 398T; 409S; 421 R,S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291 y 430M; donde

   (a)

   la variante tiene actividad de fitasa;

   (b)

   cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº: 2 y

   (c)

   la variante tiene un porcentaje de identidad a la SEC ID nº: 2 de al menos 75%.

2. 2. Variante según la reivindicación 1, que comprende una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del siguiente grupo de sustituciones y combinaciones de sustituciones:

   (i)

   20R+95R+97V+98G;

   (ii)

   29N+1021;

   (iii) 29N+118A;

   (iv)

   29N+163P+324S;

   (v)

   29N+163P+324S+395G;

   (vi)

   29N+234S;

   (vii) 29N+324S;

   (viii) 29S;

   (ix)

   29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V;

   (x)

   29S+63N +125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S;

   (xi)

   29S+95H+110W+183W+324A+350V;

   (xii) 29S+95M+110W+183W+324A+350V;

   (xiii) 29S+95N+110R+183W+324A+350V;

   (xiv) 29S+95R+110W+183W+324A+350V;

   (xv) 29S+95S+110R+183W+324A+350V;

   (xvi) 29S+95S+110W+183W+324A+350V;

   (xvii) 29S+95T+110R+183W+324A+350V;

   (xviii) 29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V;

   (xix) 29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V;

   (xx) 29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V;

   (xxi) 29S+95T+110Y+157K+183W+185H+187R+190S+191R+248G+324A+350V;

   (xxii) 29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V;

   (xxiii) 29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V;

   (xxiv) 29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V;

   (xxv) 29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V;

   (xxvi) 29S+95T+110Y+183W+185E+248S+324A+350V;

   (xxvii) 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+321A+323A+324A+350V;

   (xxviii) 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V;

   (xxix) 29S+95T+110Y+183W+185H+187S+190K+191S+210G+222I+248G+324A+350 V;

   (xxx) 29S+95T+110Y+183W+185K+248G+324A+349K+350L;

   (xxxi) 29S+95T+110Y+183W+185K+248S+324A+350V;

   (xxxii) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349A+350L;

   (xxxiii) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350I;

   (xxxiv) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350M;

   (xxxv) 29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+350V;

   (xxxvi) 29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V;

   (xxxvii) 29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V;

   (xxxviii) 29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V;

   (xxxix) 29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V;

   (xl) 29S+95T+110Y+183W+324A;

   (xli) 29S+95T+110Y+183W+324A+350V;

   (xlii) 29S+99D+125D+324A+334E+350V;

   (xliii) 29S+110Y+183W+185N+324A+350V;

   (xliv) 29S+125D+218T+324A+344S+350V;

   (xlv) 29S+125D+234K+324A+330R;

   (xlvi) 29S+125D+234K+324A+330R+395G;

   (xlvii) 29S+125D+324A;

   (xlviii) 29S+125D+324A+330R+395G;

   (xlix) 29S+125D+324A+350V;

   (l)

   29S+183A+324A+350V;

   (li)

   29S+183G+324A+334E+344S+350V;

   (lii) 29S+183W+324A+350V;

   (liii) 29S+205S;

   (liv) 29S+324A+350V;

   (lv) 29T+324L;

   (lvi) 45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M;

   (lvii) 69A+334E;

   (lviii) 99D+398T;

   (lix) 114A+187G+194R+324S;

   (lx) 218T+334G;

   (lxi) 323A+324S;

   (lxii) 324S;

   (lxiii) 324S+328T;

   (lxiv) 324S+345D+347Q;

   (lxv) 324S+395G;

   (lxvi) 330R;

   (lxvii) 334D+343N+344V;

   (lxviii) 334E+344A;

   (lxix) 345H+347P+350V; y

   (lxx) 350V.

3. 3.

   Secuencia de ácidos nucléicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. 4.

   Constructo de ácidos nucléicos que comprende la secuencia de ácidos nucléicos según la reivindicación 3 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

5. 5.

   Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 4.

6. 6.

   Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 4 y/o el vector de expresión según la reivindicación 5.

7. 7.

   Método para la producción de la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende

   (a)

   cultivar la célula huésped según la reivindicación 6 para producir un sobrenadante que comprende la variante; y

   (b)

   recuperar la variante.

8. 8.

   Planta transgénica, o parte de la planta que expresa una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. 9.

   Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo que expresa una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1- 2.

10. 10.

    Composición que comprende al menos una variante de fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y

    (a)

    al menos una vitamina soluble en grasa;

    (b)

    al menos una vitamina soluble en agua; y/o

    (c)

    al menos un oligoelemento.

11. 11.

    Composición según la reivindicación 10 que comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: xilanasas, endoglucanasas, endo-1,3(4)-beta-glucanasas, y proteasas.

12. 12.

    Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 que es un aditivo de pienso para animales.

13. 13.

    Composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12.

14. 14.

    Método para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales, donde la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12 se añade al pienso.

15. 15.

    Proceso para reducir los niveles de fitato en el abono de origen animal que comprende alimentar a un animal con una cantidad eficaz del pienso según la reivindicación 13.

    5 16. Método para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprende el paso de añadir la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12 al menos a una proteína vegetal o fuente de proteína.
16. 17. Uso de la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las

    10 reivindicaciones 10-12 en el pienso para animales; en la preparación de pienso para animales; para mejorar el valor nutritivo del pienso para animales; para reducir los niveles de fitato en el abono de origen animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.