CN101679986B

CN101679986B - 哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶

Info

Publication number: CN101679986B
Application number: CN200880017652.9A
Authority: CN
Inventors: 索伦·F·拉森; 卡斯滕·斯乔霍尔姆; 拉斯·K·斯科夫
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2028-03-26
Also published as: MX289945B; MX2009010043A; JP5643083B2; US20080263688A1; US8663963B2; EP2129781B1; WO2008116878A1; DK2129781T3; CA2681392C; KR20100014593A; CN101679986A; US7923232B2; CA2681392A1; BRPI0808999A8; AU2008231749A1; JP2010522548A; US20110154519A1; ES2456960T3; PL2129781T3; BRPI0808999A2

Abstract

本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。所述多肽与源自蜂房哈夫尼菌的肌醇六磷酸酶相关，所述源自蜂房哈夫尼菌的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列在所附的序列表中显示为SEQ ID NO：10。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产和使用所述多肽的方法，特别是在动物饲料中。

Description

哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶

序列表和保藏的微生物

序列表

本申请含有序列表的纸本(paper copy)和计算机可读的形式。计算机可读形式的内容通过引用完全并入本文。

生物材料的保藏

从丹麦的土壤分离了产生肌醇六磷酸酶的细菌菌株。显示所述菌株产生具有酸性最适pH值和高热稳定性的肌醇六磷酸酶。该菌株被鉴定为蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)，根据布达佩斯条约的条款于2007年3月21日将它保藏在德意志微生物和细胞保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen)(DSMZ)，并给予以下登录号：

保藏物登录号保藏日期

蜂房哈夫尼菌NN020125 DSM 19197 2007年3月21日

发明领域

本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。所述多肽与源自蜂房哈夫尼菌的肌醇六磷酸酶相关，源自蜂房哈夫尼菌的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列在所附的序列表中显示为SEQ IDNO：10。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法，特别是在动物饲料中。

发明背景

肌醇六磷酸酶是公知的酶，将它们添加到动物、包括人类的食物中是有利的。肌醇六磷酸酶已经从许多来源中分离，包括许多真菌和细菌菌株。

本发明的目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的可选择的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本发明的多肽优选具有改变的、更优选的改进的性质，例如不同的底物特异性、更高的比活性、提高的稳定性(如，酸稳定性、热稳定性、和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)、改变的最适pH(如，更低或更高的最适pH)和/或动物饲料中的改进的性能(如，肌醇六磷酸酶的改进的释放和/或降解)。

发明概述

本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自下组：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与(i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413，和/或(ii)SEQ ID NO：10的成熟多肽部分具有至少75％的同一性；(b)(i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413和/或(ii)SEQ IDNO：10的成熟多肽部分包含一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或保守取代的变体；和/或(c)(i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413和/或(ii)SEQ ID NO：10的成熟多肽部分的片段。

本发明还涉及编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：(a)编码具有氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％的同一性；和(b)与SEQ ID NO：9的核苷酸100到1338具有至少75％同一性的多核苷酸。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生这些具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明进一步涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含与编码信号肽的核苷酸序列可操作连接的编码蛋白质的基因，所述编码信号肽的核苷酸序列由(i)SEQ ID NO：11的核苷酸1到99组成。

本发明还涉及在动物饲料中使用本发明的肌醇六磷酸酶的方法，以及含有所述多肽的动物饲料和动物饲料添加剂组合物。

本发明还涉及在发酵产物生产中使用本发明的肌醇六磷酸酶的方法，所述发酵产物如乙醇、啤酒、酒(wine)，其中所述发酵在本发明的肌醇六磷酸酶存在下进行。

本发明涉及用本发明的肌醇六磷酸酶处理蛋白质(包括植物蛋白)的方法。

附图的简要说明

图1显示了在剂量从125到500FYT/kg饲料的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)肌醇六磷酸酶之间的比较中，在体外温育之后残余的肌醇-磷酸结合的磷(inositol-phosphate bound phosphorous)。

图2显示了在剂量为250FYT/kg饲料和500FYT/kg饲料时的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和Peniophora lycii肌醇六磷酸酶之间，在体外温育之后残余的肌醇-磷酸结合的磷的比较。

图3显示了蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的经解析的晶体三维结构的结构坐标的附录。

定义

肌醇六磷酸酶活性：在本上下文中，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(肌醇六磷酸酶)是一种酶，其催化肌醇六磷酸(肌醇-六磷酸)水解为(1)肌醇和/或(2)其单-、二-、三-、四-和/或五-磷酸和(3)无机磷酸(inorganic phosphate)。

因特网上的ENZYME站点(www.expasy.ch/enzyme/)是与酶的命名法相关的信息的储藏库。其主要基于国际生物化学和分子生物学联合会(Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry andMolecular Biology)(IUB-MB)的命名委员会的建议，它描述了已提供了EC(酶委员会)编号的各种类型经表征的酶(Bairoch A.TheENZYME database，2000，Nucleic Acids Res 28：304-305)。也参见来自NC-IUBMB的酶命名手册，1992)。

根据ENZYME网站，三种不同类型的肌醇六磷酸酶是已知的：3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)、6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)和5-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.72)。就本发明而言，所有类型都包括在肌醇六磷酸酶的定义中。

在特定的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶的家族，其包括大肠杆菌(Escherichia coli)pH 2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌的肌醇六磷酸酶如泡盛曲霉(Aspergillus awamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC：3.1.3.8)(基因phyA和phyB)。组氨酸酸性磷酸酶共有两个序列相似性区域，每个区域以保守的组氨酸残基为中心。这两个组氨酸看起来涉及酶的催化机制。第一个组氨酸位于N-末端部分并形成磷-组氨酸中间物，而第二个位于C-末端部分，可能充当质子供体。

在进一步特定的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性位点基序，即，R-H-G-X-R-X-P，其中X表示任何氨基酸(参见SEQ ID NO：10中显示的成熟肌醇六磷酸酶的氨基酸18到24)。

就本发明而言，肌醇六磷酸酶活性以FYT的单位测定，一个FYT是在以下条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸的酶量：pH 5.5；温度37℃；底物：肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)浓度为0.0050mol/l。适合的肌醇六磷酸酶测定法是WO 00/20569的实施例1中描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混合料(premix)中的肌醇六磷酸酶活性。肌醇六磷酸酶活性还可以使用本文实施例的肌醇六磷酸酶测定法来确定。

最适pH：本发明的多肽的最适pH通过在多个pH值下使用预先确定的浓度的底物和固定的温育温度温育肌醇六磷酸酶来测定。然后由肌醇六磷酸酶活性对于pH值的图示(graph representation)来确定最适pH。在特定的实施方案中，使用FYT测定法，即，底物是5mM肌醇六磷酸钠，反应温度37℃，在多个pH值下以FYT单位测定活性，如在下文的实施例中所进行的。在另一个特定的实施方案中，使用任一个实施例的肌醇六磷酸酶测定法。相对低的最适pH是指pH 5.0以下，例如pH 4.5、4.0、3.5、3.0、2.5以下或甚至2.0以下的最适pH。相对高的最适pH是指pH 5.0以上，例如pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5以上或甚至9.0以上的最适pH。

分离的多肽：在此使用的术语“分离的多肽”是指一种多肽，其是至少20％纯的、优选至少40％纯的、更优选至少60％纯的、还更优选至少80％纯的、最优选至少90％纯的、甚至最优选至少95％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在此代表一种多肽制备物，其含有按重量计最多10％、优选最多8％、更优选最多6％、更优选最多5％、更优选最多4％、更优选最多3％、还更优选最多2％、最优选最多1％、甚至最优选最多0.5％的与之天然相关的其他多肽材料。因而，优选的是，基本上纯的多肽是按重量计至少92％纯的、优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、更优选至少98％纯的、还更优选至少99％纯的、最优选至少99.5％纯的、甚至最优选至少100％纯的在制备物中存在的总多肽材料。

本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。特别地，优选的是所述多肽处于“基本上纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上没有与之天然相关的其他多肽材料。例如，这可以通过本领域公知的重组方法或通过标准的纯化方法制备多肽来实现。

在此，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“处于分离形式的多肽”是同义的。

同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间同一性的程度，以及两个核苷酸序列之间同一性的程度，通过程序“align”来测定，其是一种Needleman-Wunsch比对(即，全局比对)，对于蛋白质和DNA比对都是有用的。默认的计分矩阵BLOSUM50和默认的同一性矩阵分别用于蛋白质和DNA比对。缺口中第一个残基的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16。而缺口中其他残基的罚分对于蛋白质是-2，对于DNA是-4。

“Align”是FASTA程序包版本v20u6的部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85：2444-2448，及W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP andFASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白质比对使用Smith-Waterman算法，没有缺口大小的限制(参见″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。

Needleman-Wunsch算法在Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecular Biology，48：443-453以及Myers和W.Miller在″OptimalAlignments inLinear Space″CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988)4：11-17中的比对程序中描述。

目标(或样品、或测试)序列和指定序列(例如，SEQ ID NO：10中所示的成熟肌醇六磷酸酶的氨基酸1至413)之间的同一性的程度可以如下测定：使用程序“align”排列序列。测定排列中完全匹配的数目(“N-perfect-match”)(完全匹配是指比对的相同位置上相同的氨基酸残基，在比对中通常用“|”指示)。确定特定序列的长度(氨基酸残基的数目)(“N-specified”，上述的实施例中＝413)。同一性的程度被计算为“N-perfect-match”与“N-specified”之间的比例(为了转变成同一性百分比，乘以100)。

在可选择的实施方案中，目标(或样品，或测试)序列和指定的序列(例如，SEQ IDNO：10的氨基酸1至413)之间的同一性程度如下测定：使用程序“align”排列两个序列。测定排列中完全匹配(“N-perfect-match”)的数量(完全匹配是指比对的相同位置上相同的氨基酸残基，在比对中通常用“|”指示)。还测定两个比对的序列的共有长度，即，比对的重叠部分中氨基酸的总数(“N-overlap”)。同一性的程度被计算为“N-perfect-match”与“N-overlap”之间的比例(为了转变成同一性百分比，乘以100)。在一个实施方案中，N-overlap包括由比对产生的尾随和前导缺口，如果有的话。在另一个实施方案中，N-overlap排除了比对产生的尾随和前导缺口，如果有的话。

在另一个可选择的实施方案中，目标(或样品，或测试)序列和指定的序列(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸1至413)之间的同一性程度如下测定：使用程序“align”排列序列。测定排列中完全匹配(“N-perfect-match”)的数量(完全匹配是指比对的相同位置上相同的氨基酸残基，在比对中通常用“|”指示)。确定目标序列的长度(氨基酸残基的数目)(“N-target”)。同一性的程度被计算为“N-perfect-match”与“N-target”之间的比例(为了转变成同一性百分比，乘以100)。

优选地，所述重叠是指定序列的至少20％(如上文定义的“N-overlap”，除以指定序列中氨基酸的数目(“N-specified”)并乘以100)，更优选至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％。这意味着当样品序列与指定序列比对时，指定序列的至少20％(优选的25-95％)的氨基酸最终(end up)包括在重叠中。

在可选的实施方案中，重叠是目标(或样品、或测试)序列的至少20％(如上文定义的“N-overlap”除以上文定义的“N-target”，并乘以100)，更优选至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％。这意味着当与指定序列比对时，目标序列的氨基酸的至少20％(优选25-95％)最终包括在重叠中。

多肽片段：术语“多肽片段”在此被定义为一种多肽，其从指定序列例如SEQ IDNO：10的成熟肽部分的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸，或其同源的序列，其中所述片段具有肌醇六磷酸酶活性。在特定的实施方案中，所述片段含有至少350、360、370、380、390、400、405或至少410个氨基酸残基。

子序列：术语“子序列”在此被定义为一种核苷酸序列，其从指定序列例如SEQ IDNO：9的成熟肽编码部分的5′和/或3′末端缺失一个或多个核苷酸，或其同源的序列，其中所述子序列编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在特定的实施方案中，所述子序列含有至少1050、1080、1110、1140、1170、1200、1215、1230、1245、1260、1275、1290、1305、1320或至少1335个核苷酸。

等位变体：术语“等位变体”在此代表占据同一染色体座位(locus)的基因的任何两种或更多可选择的形式。等位变体通过突变天然地发生，可以引起群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有改变)，或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸：在此使用的术语“基本上纯的多核苷酸”是指没有其他外来的或不需要的核苷酸、并处于适用于遗传工程化的蛋白质生产系统的形式的多核苷酸制备物。因而，基本上纯的多核苷酸含有含有按重量计最多10％、优选最多8％、更优选最多6％、更优选最多5％、更优选最多4％、更优选最多3％、还更优选最多2％、最优选最多1％、甚至最优选最多0.5％的与之天然地相关的其他多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5′和3′非翻译区域，例如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯的、优选至少92％纯的、更优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、还更优选至少98％纯的、最优选至少99％纯的和甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选的处于基本上纯的形式。特别地，优选的是在此公开的多核苷酸处于“基本上纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上没有与之天然地相关的其他多核苷酸材料。在此，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“处于分离形式的多核苷酸”是同义的。多核苷酸可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的来源的或任何其组合。

核酸构建体：在此使用的术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或者其被修饰以含有处于自然中不会存在的形式中的核酸的片段。当核酸构建体含有本发明的编码序列的表达所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。

控制序列：术语“控制序列”在此被定义为包括所有的组件，所述组件对于编码本发明的多肽的多核苷酸的表达是必需的或是有利的。每种控制序列可以相对编码所述多肽的核苷酸序列是天然的或外源的。这些控制序列包括但不限于，前导区、聚腺苷酸化序列、原肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。控制序列可以提供有接头，用于导入特定的限制性位点便于控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。

可操作连接的：术语“可操作连接的”在此表示一种结构，在其中控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适的位置，使得控制序列指导多肽的编码序列的表达。

编码序列：当在此使用时，术语“编码序列”是指核苷酸序列，其直接指定了它的蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，其通常从ATG起始密码子或可选择的起始密码子如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

成熟多肽部分：当在此使用时，术语“成熟多肽部分”或“成熟肽部分”是指被细胞分泌的多肽的部分，所述细胞含有编码所述多肽的多核苷酸作为它的遗传装备的部分。换句话说，成熟多肽部分是指，一旦信号肽完成了它指导编码的多肽进入细胞的分泌途径的功能，在信号肽部分被切割下之后残留的多肽的部分。SEQ ID NO：10的预测的信号肽部分是其氨基酸-33到-1，其是指SEQ ID NO：10的预测的成熟多肽部分相应于其氨基酸1至413。然而，可因宿主细胞而异发生轻微的变异，因而表达成熟多肽部分是优选的。

成熟多肽编码部分：当在此使用时，术语“成熟多肽编码部分”或“成熟多肽编码序列”是指编码多肽的多核苷酸的部分，所述多肽编码成熟多肽部分。例如，对于SEQ ID NO：9，预测的成熟多肽编码部分相应于核苷酸100到1338(编码SEQ ID NO：10的氨基酸1至413)。

表达：术语“表达”包括涉及多肽的生产中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在此被定义为线性或环状DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与用于其表达的其他核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如在此使用的，术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，其对于使用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的。

修饰：术语“修饰”在此是指指定多肽，例如由SEQ ID NO：10的氨基酸1至413构成的多肽的任何化学修饰，以及编码该多肽的DNA的遗传操作。修饰可以是氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及氨基酸侧链的替换。

人工变体：当在此使用时，术语“人工变体”是指由生物体产生的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，所述生物体表达SEQ ID NO：9的成熟肌醇六磷酸酶编码部分的修饰的核苷酸序列。所述修饰的核苷酸序列通过修饰SEQID NO：9中公开的核苷酸序列的成熟肌醇六磷酸酶编码部分的人工干预来获得。

发明的详细说明

具有肌醇六磷酸酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性并具有氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10的氨基酸1至413(即，成熟多肽)具有至少75％的同一性程度。

在特定的实施方案中，所述同一性程度是最小76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或至少99.9％，其具有肌醇六磷酸酶活性(在下文中“同源多肽”)。

在其他特定的实施方案中，所述同源多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：10的氨基酸1至413相差20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸。

在特定的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的成熟部分，或是其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在更进一步特定的实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至413，或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。

在第二方面，本发明涉及由多核苷酸编码的、具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸在至少中度(优选中度)严格条件下与(i)SEQ IDNO：9的核苷酸100到1338，(ii)SEQ ID NO：9的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)和(ii)的任一项的互补链，和/或(iv)(i)、(ii)、(iii)的子序列杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQID NO：9的子序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述子序列可以编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽片段。

在特定的实施方案中，所述杂交在至少中-高度、至少高度、或至少极高度严格条件下；优选在中-高度、高度或极高度严格条件下发生。

在可选择的实施方案中，所述杂交在极低度或低度严格条件下进行。

SEQ ID NO：9的核苷酸序列，或其子序列，以及SEQ ID NO：10的氨基酸序列，或其片段，可以用于设计核酸探针来根据本领域公知的方法从不同属或种的菌株中鉴定和克隆编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。特别地，这样的探针可以用于根据标准的Southern印迹操作与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这样的探针可以显著地短于完整序列，但应当长度是至少14、优选至少25、更优选至少35、最优选至少70个核苷酸。然而，优选的是核酸探针长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针长度可以是至少200个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少400个核苷酸、或最优选至少500个核苷酸。可以使用更长的探针，例如，长度至少600个核苷酸、优选至少700个核苷酸、更优选至少800个核苷酸或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。可以使用DNA和RNA探针。探针一般被标记用于检测相应的基因(例如，使用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白进行标记)。这些探针被本发明涵盖。

因而，可以从这些其他的生物体制备的基因组DNA文库筛选与上文描述的探针杂交并编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。来自这些其他生物体的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可以被转移到或固定到硝酸纤维或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：9或其子序列同源的克隆或DNA，载体材料在Southern印迹中使用。

就本发明而言，杂交是指核苷酸序列在极低度到极高度严格条件下杂交于与SEQID NO：9中所示核苷酸序列、其互补链、或其子序列相应的标记的核酸探针。在这些条件下与核酸探针杂交的分子可以使用X射线片来检测。

在特定的实施方案中，核酸探针是SEQ ID NO：1到8的任一个。在另一个特定的实施方案中，核酸探针是SEQ ID NO：9的核苷酸100到450、核苷酸450到900、或核苷酸900到1338的互补链。在进一步特定的实施方案中，核酸探针是编码SEQ ID NO：10的多肽的成熟部分的多核苷酸序列、或其子序列。在更进一步特定的实施方案中，核酸探针是SEQ ID NO：9，特别是其成熟多肽编码区的任一个。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，极低度到极高度严格条件被定义为，在42℃、在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA中，对于极低度和低度严格为25％甲酰胺，对于中度和中-高度严格为35％甲酰胺，或对于高度和极高度严格为50％甲酰胺下，根据标准的Southern印迹步骤，预杂交和杂交最佳12到24小时。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，载体材料在至少在45℃(极低度严格)、更优选至少在50℃(低度严格)、更优选至少在55℃(中度严格)、更优选至少在60℃(中-高度严格)、还更优选至少在65℃(高度严格)和最优选至少在70℃(极高度严格)下使用2×SSC、0.2％SDS最终洗涤三次各15分钟。

对于长度约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，严格条件被定义为在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1XDenhardt′s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA每mL下在低于根据Bolton和McCarthy的算法(1962，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 48：1390)计算的T_m约5℃到约10℃ 下，根据标准的Southern印迹步骤预杂交、杂交和杂交后洗涤。

对于长度约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，载体材料在低于计算的T_m 5℃到10℃下在6×SCC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，和使用6×SSC洗涤两次各15分钟。

在含有盐的杂交条件下，有效的T_m是控制成功的杂交所需的探针与滤纸结合的DNA之间同一性程度的条件。有效的T_m可以使用以下的公式确定，以确定在各种严格条件下两个DNA杂交所需的同一性程度。

有效的T_m＝81.5+16.6(log M[Na⁺])+0.41(％G+C)-0.72(％甲酰胺)

(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)

“G+C”是指探针中核苷酸G和T的含量。例如，对于中度严格，甲酰胺是35％，5×SSPE的Na⁺浓度是0.75M。

在一个方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性和以下物理化学性质(如对基本上纯的多肽所分析的)的分离的多肽：

(i)高比活性，例如大肠杆菌(E.coli)appA(SPTREMBL：Q8GN88)的比活性的至少50％的对肌醇六磷酸的比活性，所述比活性优选按照每mg肌醇六磷酸酶酶蛋白的FYT单位来测量；

(ii)酸稳定性；如

(a)相对于在HEPES缓冲液pH 7.0中在37℃温育过夜之后的残余活性，在甘氨酸/盐酸缓冲液pH 2.2中在37℃温育过夜之后是至少60％、优选至少65％、至少70％或至少75％的残余活性；

(b)相对于在HEPES缓冲液pH 7.0中在37℃下温育过夜之后的残余活性，在甘氨酸/盐酸缓冲液pH 3.0中在37℃温育过夜之后是至少80％、优选至少85％、至少90％或至少95％的残余活性；和/或

(c)与大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)的残余活性相比，在25、30、35或37℃，优选在37℃，和2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4或3.5的pH值，优选pH值2.2或3.0的甘氨酸/盐酸缓冲液中2小时温育之后残余的肌醇六磷酸酶活性是至少50％；

(iii)热稳定性，例如，与大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)的残余活性相比，在pH5.5和55、60、65、70、75、80、85或95℃，优选在70℃温育0.5、1、1.5或2小时，优选0.5小时之后残余的肌醇六磷酸酶活性是至少50％；

在备选方案中，差示扫描量热术(DSC)测量可以用于测定纯化的肌醇六磷酸酶蛋白质的变性温度Td。Td是蛋白质的热稳定性的指示：Td越高，热稳定性越高。DSC测量可以在各种pH值下进行，例如，使用来自Micro Cal.的VP-DSC。扫描以1.5℃/分钟的恒定扫描率从20到90℃进行。优选的pH值是4.0和5.5，优选4.0。在运行DSC之前，肌醇六磷酸酶被脱盐，例如使用在合适的缓冲液(例如，25mM醋酸钠pH 4.0；0.1M醋酸钠，pH5.5)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)进行。数据处理使用MicroCal Origin软件(版本4.10)进行，变性温度Td(也称为熔解温度Tm)被定义为在温谱图中的峰的顶端处的温度。

(iv)蛋白酶稳定性，如与大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)的残余活性相比，在20、25、30、35或37℃，优选37℃，和5.5的pH值，在0.1mg/ml胃蛋白酶存在下温育0.5、1、1.5或2小时，优选1小时之后残余的肌醇六磷酸酶活性是至少50％；和/或

(v)pH 5.0以下，例如pH 4.5、4.0、3.5、3.0、2.5以下或甚至2.0以下的最适pH，使用FYT测定法和/或使用实施例4的测定法如上文所述测定的。

在上述方面(i)的特定实施方案中，所述比活性是大肠杆菌app A的比活性的至少60、70、80、90、100、110、120、130、140或至少150％。在上述方面(ii)到(iv)的每一个的特定实施方案中，所述残余活性是大肠杆菌app A的残余活性的至少60、70、80、90、100、110、120、130、140或至少150％。

在第五方面，本发明的酶活性在pH 5.0和37℃对底物pNP-磷酸测量的，低于对底物肌醇六磷酸测量的酶活性的11％。优选地，所述比例是低于10％、9％、8％、7％、6％或低于5％。pNP与肌醇六磷酸水解的比例是酶的真实的肌醇六磷酸酶性质的指示。相对于对肌醇六磷酸的活性，高比值的对pNP的活性可能指示所讨论的酶是具有相对低底物特异性的磷酸酶，而低比例指示这是一种更为特异性地接受肌醇六磷酸作为底物的酶。

在第六个方面，与来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶相比，本发明的肌醇六磷酸酶具有在体外模型中更高的磷(P)释放，优选是其至少110％，更优选是其至少120％、130％或至少140％。在一个实施方案中，相对于来自Peniophora lycii、剂量也是0.25FYT/g饲料的肌醇六磷酸酶所释放的磷，在体外模型中，剂量为0.25FYT/g饲料的本发明的肌醇六磷酸酶释放至少150％的磷(P)。优选地，所述释放是至少155％、160％、165％、170％、175％或至少180％。在另一个实施方案中，相对于来自Peniophora lycii、剂量也是0.75FYT/g饲料的肌醇六磷酸酶所释放的磷，在体外模型中，剂量为0.75FYT/g饲料的本发明的肌醇六磷酸酶释放至少150％的磷(P)。优选地，所述释放是至少155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％或至少190％。

在第七个方面，使用0.25M Na-醋酸盐缓冲液pH 5.5，减去盲缓冲液(bufferblind substracted)，与在37℃和pH 5.5对1％(w/v)Na-肌醇六磷酸测定的活性(和残余活性)，在时间t＝0时的活性相比较，本发明的肌醇六磷酸酶在37℃在0.1M甘氨酸/HCl缓冲液，pH 2.0中温育4小时后具有残余活性为至少20％。在优选的实施方案中，所述残余活性是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。在另一个实施方案中，使用0.25M Na-醋酸盐缓冲液pH 5.5，减去盲缓冲液，与在37℃和pH 5.5对1％(w/v)Na-肌醇六磷酸测定的活性(和残余活性)，在时间t＝0时的活性相比较，本发明的肌醇六磷酸酶在37℃在0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.5中温育1天(24小时)后具有残余活性为至少20％。在优选的实施方案中，所述残余活性是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。

在第八个方面，本发明涉及SEQ ID NO：10或其成熟多肽包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的人工变体。插入可以处在分子之内，和/或处在分子的N-和/或C-末端，在此情况下被称为延伸。优选地，氨基酸改变对于性质是较不重要的，其是保守性氨基酸取代；小的缺失，通常为一个到约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；最多约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸区、抗原性表位或结合域，——换句话说：不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的改变。

保守取代的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。

保守取代的其他实例是用非标准氨基酸取代20个标准氨基酸(例如，4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)。保守取代还可以包括替换成不被遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸。“非天然氨基酸”在蛋白质合成之后被修饰，和/或在它们的侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以是化学上合成的，优选地，是商业上可获得的，并包括六氢吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸以及3，3-二甲基脯氨酸。

作为选择，氨基酸改变具有这样的性质，使得多肽的物理化学性质被改变。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性，改变底物特异性、改变最适pH，等等。

在亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法来鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子的每个残基中导入单个丙氨酸突变，测试产生的突变分子的生物学活性(即，肌醇六磷酸酶活性)来鉴定对于分子的活性是关键的氨基酸残基。也参见，Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点也可以通过结构的物理分析连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定，所述结构通过这些技术例如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和性标记来测定。参见，例如，de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份也可以根据与多肽的同一性来推定，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

使用已知的诱变、重组和/或重排的方法，随后是相关的筛选方法，例如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所公开的，可以进行并测试单个或多个氨基酸取代。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；U.S.Patent No.5,223,409；WO 92/06204)和区域-定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/重排方法可以与高通量的、自动化筛选方法组合来检测宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以使用本领域的标准方法从宿主细胞中回收并快速地测序。这些方法容许快速地确定目标多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且可以应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：10的氨基酸1至413的序列中氨基酸取代(优选的保守取代)、缺失和/或插入的总数是最多10个，优选最多9个，更优选最多8个，更优选最多7个，更优选最多6个，更优选最多5个，更优选最多4个，还更优选最多3个，最优选最多2个，和甚至最优选1个。

SEQ ID NO：10的氨基酸1至413的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10个，优选9个，更优选8个，更优选7个，更优选最多6个，更优选最多5个，更优选4个，还更优选3个，最优选2个，和甚至最优选1个。在备选方案中，SEQ ID NO：10的氨基酸1至413的序列中氨基酸取代(优选保守取代)、缺失和/或插入的总数是最多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12个或最多11个。

在具体的实施方案中，本发明的多肽是低变应原性变体，经设计以在暴露于动物包括人类时引起降低的免疫学反应。术语免疫学反应要理解为暴露于所述多肽的动物的免疫系统的任何反应。一种类型的免疫学反应是在暴露的动物中导致高水平的IgE的变应性应答。低变应原性变体可以使用本领域已知的技术来制备。例如，所述多肽可以与聚合物组分保护部分(polymermoieties shielding protions)、或涉及免疫学反应的多肽的表位缀合。与聚合物的缀合可以涉及聚合物与多肽的体外化学偶联，例如在WO 96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489中描述的。此外或作为选择，缀合可涉及聚合物与所述多肽的体内偶联。这样的缀合可以通过编码所述多肽的核苷酸序列的遗传工程化、插入编码多肽中其他糖基化位点的共有序列和在能够使所述多肽糖基化的宿主中表达所述多肽来实现，参见，例如WO00/26354。提供低变应原性变体的另一种方法是将编码所述多肽的核苷酸序列遗传工程化，以使得所述多肽自我寡聚化，使得多肽单体可以保护其他多肽单体的表位，从而降低寡聚体的抗原性。例如在WO96/16177中描述了这样的产物和它们的制备。免疫学反应中涉及的表位可以通过各种方法鉴定，例如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示方法、或EP561907中描述的随机方法。一旦已经鉴定了表位，可以通过已知的基因操作技术例如定点诱变(参见，例如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO00/22103)改变它的氨基酸序列以产生所述多肽的改变的免疫学性质，和/或聚合物的缀合可以足够接近所述聚合物的表位来进行以保护所述表位。

蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的三维结构

蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的三维结构(SEQ ID NO：10的氨基酸1至413)在附录中提供。根据x-射线结晶学方法的原则解析所述结构，例如，在X-Ray StructureDeterminations，Stout，G.K.和Jensen，L.H.，John Wiley andSons，Inc.NY 1989中所给出的。蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的解析的晶体结构的结构坐标以标准的PDB格式(ProteinDatabase Bank，BrookhavenNational Laboratory，Brookhaven，Conn.)给出，如附录中所列。要理解的是附录形成了本申请的一部分。附录提供了除氢原子以外的重原子的坐标。酶的前三个残基在晶体结构中是不可见的，氨基酸180和189之间的氨基酸残基也是。然而，180和189之间的结构利用组合了来自JACKAL程序包(wiki.c2b2.columbia.edu/honiglab_public/index.php/Software：Jackal)的同源性建模(参见，例如，Marti-Renom等，2000)程序NEST和称为CHARMm的模拟软件(//accelrys.com/products/scitegic/component-collections/charmm.html)的建模来构造。

具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获自任何属的微生物。就本发明而言，在此连同给定的来源使用的术语“获自”是指，由核苷酸序列编码的多肽是由该来源或已经插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生的。在优选的方面，获自给定来源的多肽分泌到细胞外。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，例如，大肠杆菌、耶尔森氏菌属(Yersinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、或假单胞菌属(Pseudomonas)多肽。在特定的实施方案中，所述多肽来源于变形细菌，如γ变形细菌(Gammaproteobacteria)，例如肠杆菌目(Enterobacteriales)，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。

在特定的方面，来自肠细菌科的多肽是哈夫尼菌属多肽，如蜂房哈夫尼菌菌种多肽。

本发明的多肽还可以是真菌多肽，如酵母多肽或丝状真菌多肽。

上述微生物的菌株是公众在许多培养物保藏所容易地获得的，例如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。

此外，这些多肽可以使用上述探针鉴定和获自其他来源，包括分离自大自然(例如，土壤、堆肥、水，等等)的微生物。从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域公知的。然后通过类似地筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库，可以获得多核苷酸。一旦用探针检测了编码多肽的多核苷酸序列，就可以利用本领域普通技术人员公知的技术来分离或克隆多核苷酸(参见，例如，Sambrook等，1989，上文)。

本发明的多肽还可以包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合在多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)上来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码所述多肽的编码序列使得它们处于阅读框中，并使融合多肽的表达处在相同启动子和终止子的控制之下。

多核苷酸

本发明还涉及具有编码本发明的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。在优选的方面，所述核苷酸序列在SEQ ID NO：9中列出。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列是SEQID NO：9的成熟多肽编码区。本发明还涵盖编码具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID NO：9。本发明还涉及SEQ ID NO：9的子序列，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的SEQ ID NO：10的片段。

本发明还涉及在SEQ ID NO：9的任一个的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变的突变多核苷酸，其中所述突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO：10的氨基酸1至413组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA分离、从cDNA制备，或其组合。从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸可以通过例如，使用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特征的克隆的DNA片段来实现。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其他核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接活化的转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。多核苷酸可以克隆自哈夫尼菌属的菌株或其他的或相关的生物体，因而，例如，可以是所述核苷酸序列的多肽编码区的等位变体或物种变体。

本发明还涉及具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ IDNO：9的成熟多肽编码序列(即，核苷酸100到1338)具有至少75％的同一性程度，并且其编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在特定的实施方案中，所述同一性的程度是至少在特定的实施方案中，所述同一性程度是至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或至少99.9％。在可选择的实施方案中，同一性的程度是至少75％、80％、85％、90％、94、97、98、98.0、98.1、98.2、或至少98.3％。

编码本发明的多肽的核苷酸序列的修饰可以是基本上类似于所述多肽的多肽的合成所必需的。术语“基本上类似于”所述多肽是指所述多肽的非天然存在的形式。这些多肽以某些工程化方式不同于从它的天然来源分离的多肽，例如，在比活性、热稳定性、最适pH等等方面不同的人工变体。变体序列可以在核苷酸序列的基础上构建，所述核苷酸序列作为SEQ ID NO：9的多肽编码区，例如其子序列而存在，和/或通过导入核苷酸取代来构建，所述核苷酸替换不产生由所述核苷酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列，但是其相应于意欲用于产生所述多肽的宿主生物体的密码子选择，或者通过导入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般性描述，参见，例如Ford等，1991，ProteinExpression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些替换可以在对于分子的功能关键的区域之外进行，并仍然产生活性的多肽。对于本发明的分离的多核苷酸编码的多肽的活性关键的、因而优选地不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法来鉴定，例如，定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见，例如Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子的每个带正电的残基中导入突变，测试产生的突变分子的肌醇六磷酸酶活性以鉴定对于分子的活性关键的氨基酸残基。底物-多肽相互作用的位点也可以通过三维结构的分析来确定，所述三维结构通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和性标记(参见，例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal of MolecularBiology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)的技术来确定。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，其在中度严格条件下，更优选中-高度严格条件下，还更优选高度严格条件下，和最优选极高度严格条件下与(i)SEQID NO：9的核苷酸100到1338，(ii)SEQ ID NO：9的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)和/或(ii)的任一项的互补链杂交；或其等位变体和子序列(Sambrook等，1989，上文)，如在此定义的。在可选择的实施方案中，所述杂交在极低度或低度严格条件下进行。

本发明还涉及通过(a)在极低度、低度、中度、中-高度、高度或极高度严格条件下使DNA的群体与(i)SEQ ID NO：9的核苷酸100到1338，(ii)SEQID NO：9的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)和/或(ii)的任一项的互补链杂交；和(b)分离编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的、杂交的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，其包含与一个或多个控制序列可操作连接的本发明的分离的多核苷酸，所述控制序列指导在所述编码序列与所述控制序列相容的条件下在适合的宿主细胞中表达。

编码本发明的多肽的分离的多核苷酸可以以各种方式操作以提供多肽的表达。取决于表达载体，在插入载体之前对多核苷酸的序列进行操作可以是理想的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域公知的。

控制序列可以是合适的启动子序列，即，由宿主细胞识别的、用于编码本发明的多肽的多核苷酸表达的核苷酸序列。启动子序列含有转录控制序列，其介导多肽的表达。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的以及杂合的启动子，可以从编码对所述宿主细胞是同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中的转录的适合的启动子的实例有，获自大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedingsof the National Academy ofSciences USA75：3727-3731)的启动子，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA80：21-25)。在″Usefulproteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94和在Sambrook等，1989上文中描述了更多的启动子。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适合的启动子的实例有获自如下酶的基因的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获自如下酶的基因：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)醇氧化酶(AOX1)。对于酵母宿主细胞其他有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

控制序列也可以是适合的转录终止子序列，一种由宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3′末端。在所选的宿主细胞中有功能的任何终止子可以在本发明中使用。

用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子获自如下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的优选的终止子获自如下酶的基因：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等，1992上文描述。

控制序列也可以是适合的前导序列，一种对于宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的5′末端。在所选的宿主细胞中有功能的任何前导序列可以在本发明中使用。

丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列获自如下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。

酵母宿主细胞的适合的前导序列获自如下酶的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，一种与核苷酸序列的3′末端可操作连接的序列，其在被转录时由宿主细胞识别作为向转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的信号。在所选的宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列可以在本发明中使用。

丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列获自如下酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellular Biology 15：5983-5990所描述。

控制序列可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列并指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5′末端可以天然地含有与编码分泌多肽的编码区的片段按照翻译阅读框天然连接的信号肽编码区。作为选择，编码序列的5′末端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码区。当编码序列天然地不含有信号肽编码区时，外源的信号肽编码区可能是需要的。作为选择，外源的信号肽编码区可以简单地替换天然的信号肽编码区来增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可以在本发明中使用。

细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是获自如下酶的基因的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述了更多的信号肽。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是获自如下酶的基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。Romanos等，1992上文，和Xiong等在Journal of AppliedMicrobiology 2005，98，418-428中描述了其他有用的信号肽编码区。

在优选的方面，所述信号肽编码区是SEQ ID NO：9的核苷酸1到99，其编码SEQ IDNO：10的氨基酸1到33。在另一个优选的方面，所述信号肽编码区是SEQ ID NO：11的核苷酸1到81，其编码SEQ ID NO：12的氨基酸1到27。

控制序列还可以是原肽编码区，其编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。产生的多肽被称为原多肽或原多肽(或在某些情况下酶原)。原多肽一般是无活性的，可以通过原肽的催化或自催化的裂解从原多肽转变为成熟的活性多肽。原肽编码区可以获自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)。

信号肽和原肽区域都存在于多肽的氨基末端，原肽区域位于紧挨多肽的氨基末端，信号肽区域位于紧挨原肽区域的氨基末端。

还希望的是添加调节序列，其容许相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节系统的实例有，引起基因表达响应于化学物质或物理刺激(包括调节化合物的存在)而被打开或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调节序列。调节序列的其他实例有允许基因扩增的那些。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，其包含本发明的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号。如上所述的各种核酸和控制序列可以连接在一起来产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制位点来容许编码多肽的核苷酸序列在这些位点的插入或取代。作为选择，可通过将核苷酸序列或包含序列的核酸构建体插入用于表达的合适载体中来表达本发明的核苷酸序列。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的合适的控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)其可以方便地进行重组DNA步骤并可以引起核苷酸序列的表达。载体的选择一般取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外的实体存在的载体，它的复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段(means)。作为选择，载体可以是当被导入宿主细胞中时整合到基因组中并且与它所整合的染色体一起被复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒，其一同含有要被导入宿主细胞的基因组中的总DNA，或可以使用转座子。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许容易地选择转化的细胞。可选择标记是一种基因，它的产物提供了杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性，等等。

条件性必需基因(conditionally essential gene)可以作为非抗生素的选择性标记发挥功能。细菌的条件性必需非抗生素选择标记的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它芽孢杆菌(Bacilli)的dal基因，它们仅当在缺乏D-丙氨酸的条件下培养细菌时是必需的。当在半乳糖存在下培养细胞或在引起半乳糖存在的培养基中培养细胞时，编码涉及UDP-半乳糖的转换(turnover)的酶的基因也可以在细胞中作为条件性必需标记发挥功能。这样的基因的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的编码UTP依赖性磷酸化酶(EC 2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依赖性尿苷酰转移酶(EC 2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC 5.1.3.2)的那些基因。在以木糖作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，芽孢杆菌的木糖异构酶基因例如xylA也可以用作选择性标记。在以葡糖酸作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，利用葡糖酸所需的基因，gntK，和gntP，也可以用作选择性标记。条件性必需基因的其它实例是本领域已知的。抗生素选择性标记赋予对这些抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。

酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在丝状真菌宿主细胞中使用的可选择标记包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺磷乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，所述元件允许载体整合入宿主细胞的基因组中或者载体在细胞中独立于基因组自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。作为选择，载体可以含有其他的核苷酸序列，用于指导通过同源重组在染色体的精确的位置整合到宿主细胞的基因组中。为了提高在精确的位置的整合的可能性，整合元件应当优选地含有足够数目的核酸，如100到10,000个碱基对，优选的400到10,000个碱基对，最优选的800到10,000个碱基对，其与相应的目标序列具有高度的同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的目标序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所关注的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中有功能的、介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在此被定义为允许质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例有允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4，ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离，和包含基因的质粒或载体的构建可以根据WO 00/24883中公开的方法实现。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过将所述序列的至少一个额外拷贝整合入宿主细胞基因组来获得，或者通过包括与所述多核苷酸一起的可扩增的选择标记基因来获得，其中能够通过在适当的选择剂存在下培养细胞来选择含有所述选择性标记基因的扩增拷贝，并由此含有所述多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接以上描述的元件来构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等，1989，上文)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞，其有利地用于所述多肽的重组生产。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，从而所述载体保持为染色体整合体或保持为自我复制的染色体外载体，如较早前描述的。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何子代，其由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞的微生物，例如原核生物，或非单细胞的微生物，例如真核生物。

有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种。在优选的方面，所述细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌。

例如，向细菌宿主细胞中导入DNA可以通过如下实现：原生质体转化(参见，例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见，例如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或接合(参见，例如Koehler和Thorne，1987，Joumal of Bacteriology169：5771-5278)。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(例如在Hawksworth等，1995，上文，171页中引述的)和所有的有丝分裂真菌(Hawksworth等，1995，上文)。

在优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”在用于本申请时包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，酵母应定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在还更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、(糖)酵母属(Saccharomyces)、裂殖(糖)酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。

在最优选的方面，所述酵母宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门(如Hawksworth等，1995，见上文所定义的)的所有丝状形式。丝状真菌的一般特征在于由几丁质或壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养性生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养性生长通过单细胞菌体的出芽(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在还更优选的方面中，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、篮状菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一最优选的方面中，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、绒毛栓菌(Trametes villosa)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体的转化以及细胞壁的再生的方法按照本身已知的方式来转化真菌细胞。曲菌属和木霉属宿主细胞的转化的适合的方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的适合的方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。酵母可以使用Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume194，pp182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，JournalofBacteriology153：163以及Hinnen等，1978，Proceedings of the National AcademyofSciences USA 75：1920所描述的步骤来转化。

生产方法

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于多肽的生产的条件下培养细胞，所述细胞处于其野生型形式中能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是哈夫尼菌属的，更优选的是蜂房哈夫尼菌。

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于多肽的生产的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于所述多肽的生产的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变的核苷酸序列，所述突变的核苷酸序列在SEQ ID NO：9的任一个的成熟多肽编码区中具有至少一个突变，其中所述突变的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：10的氨基酸1至413组成的多肽；和(b)回收所述多肽。

使用本领域已知的方法在适合于产生目的多肽的营养培养基中培养细菌宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离目的多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，它可以从细胞裂解物中回收。

可以使用对所述多肽特异性的、本领域已知的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、多肽产物的形成、或多肽底物的消失。例如，多肽测定法可以用于测定如本申请所述的多肽的活性。

产生的多肽可以使用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过本领域已知的各种方法来纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCHPublishers，New York，1989)。

转基因植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经使用编码具有本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可以从植物或植物部分中回收。可选择地，包含重组多肽的植物或植物部分可以如这样使用，用以改进食物或饲料的质量，例如，改进营养价值，适口性(palatability)和流变性质，或破坏抗营养(antinutritive)因子。

在一个具体的实施方案中，多肽靶向种子中的胚乳储藏泡(endospermstoragevacuole)。这可以通过将其合成为具有合适信号肽的前体来获得，参见Horvath等，于PNAS，2000年2月15日，97卷，4号，1914-1919页中。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或它们工程化的变体。单子叶植物的实例为草，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，禾本科(Poa))，牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)，黑麦草属(Lolium)，温带草例如剪股颖属(Agrostis)，以及谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高梁、黑小麦(triticale)(小麦(小麦属(Triticum))和黑麦(黑麦属(Secale))的稳定杂合体)，以及玉蜀黍(maize)(玉米(corn))。双子叶植物的实例为烟草、豆类，如向日葵(向日葵属(Helianthus))、棉花(棉属(Gossypium))、羽扇豆、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、菜豆(bean)以及大豆，和十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜，油菜籽(rape seed)，以及紧密关联的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。如例如美国专利第5,689,054号和美国专利第6,111,168号所述的低肌醇六磷酸植物为工程改造的植物的实例。

植物部分的实例为茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎，以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体，以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，不管组织来源如何，均认为是植物部分。同样，植物部分，如为促进本发明的应用而分离的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚，胚乳，糊粉和种皮(seedcoats)。

在本发明范围内还包含这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

可按照本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简要地，通过如下构建植物或植物细胞：将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体并入植物宿主基因组，并使得到的经修饰的植物或植物细胞增殖成为转基因植物或植物细胞。

方便地，表达构建体是核酸构建体，其包含编码本发明的多肽的核酸序列，所述核酸序列与在所选植物或植物部分中表达该核酸序列所需的合适的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含选择性标记用于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞以及对于将构建体引入所述植物所必需的DNA序列(后者依赖于要使用的DNA引入方法)。

调节序列，如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，例如基于期望何时、何处以及如何表达多肽来确定。例如，编码本发明的多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的细胞区室、组织或植物部分如种子或叶。调节序列是，例如，由Tague等，1988，Plant Physiology86：506所描述的。

对于组成型表达，可以使用下列启动子：35S-CaMV启动子(Franck等，1980，Cell21：285-294)，玉米泛素1(Christensen AH，Sharrock RA和Quail1992.Maizepolyubiquitin genes：structure，thermal perturbation of expressionandtranscript splicing，and promoter activity following transfer to protoplastsbyelectroporation)，或稻肌动蛋白1启动子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，McElroy D.和Wu R 1991，Analysis of rice Act1 5’region activity intransgenicrice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特异性的启动子可以是，例如，来自贮存库组织(storage sink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards &Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sinktissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性的启动子例如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白的启动子(Wu等，1998，Plantand Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白B4和来自蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)，来自种子油体蛋白(seed oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant andCell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮存蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其它种子特异性的启动子，例如，如WO 91/14772中所述。此外，启动子可以是叶特异性的启动子例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology 102：99l-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或损伤诱导型启动子如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，PlantMolecular Biology 22：573-588)。同样，启动子可以是可通过非生物(abiotic)处理例如温度、干旱或盐度变化而诱导的，或是可通过外源施加的激活启动子的物质而诱导的，所述物质例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脱落酸、赤霉酸和/或重金属。

启动子增强元件还可以用于在植物中获得多肽更高的表达。例如，启动子增强元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如，Xu等，1993，见上文公开了利用稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。

更进一步，可以针对研究的植物种类优化密码子选择以改进表达(参见上文提到的Horvath等)。

选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可以从本领域可获得的那些选择。

按照本领域已知的常规技术将核酸构建体并入植物基因组，这些技术包括农杆菌(Agrobacterium)-介导的转化，病毒介导的转化，显微注射，粒子轰击，生物弹射转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。

目前，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是用于生成转基因双子叶植物的优选方法(参见综述Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 19：15-38)，并且它还可以用于转化单子叶植物，尽管对于这些植物更通常使用其他转化方法。目前，生成转基因单子叶植物的优选方法，除了农杆菌方法外，是对胚愈伤组织或发育中的胚的粒子轰击(用转化DNA涂覆的微细的(microscopic)金或钨颗粒)(Christou，1992，PlantJournal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。可供选择的单子叶植物转化方法基于原生质体转化，如Omirulleh等，1993，Plant MolecularBiology21：415-428所述。

转化之后，按照本领域公知的方法选择并入了表达构建体的转化体并再生成为完整植株。通常将转化方法设计为在再生过程中或者在接下来的世代中可以选择性地去除选择基因，其利用例如使用两个分离的T-DNA构建体的共转化或者通过特定重组酶对选择基因进行位点特异性切除。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码具有本发明肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列；和(b)回收所述多肽。

转基因动物

本发明还涉及转基因的非人动物以及它们的产品或成分(element)，其实例为体液如乳和血，器官，肉和动物细胞。用于表达蛋白质的技术，例如在哺乳动物细胞中表达蛋白质的技术，是本领域已知的，参见例如手册ProteinExpression：A Practical Approach，Higgins和Hames(编)，Oxford UniversityPress(1999)，以及该系列中涉及基因转录、RNA加工和翻译后加工的其他三本手册。一般地说，为了制备转基因动物，用本发明编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列转化所选动物的所选细胞，从而表达并产生多肽。可以从动物回收多肽，例如从雌性动物的乳中，或可以将多肽表达以有益于动物本身，例如辅助动物的消化。动物的实例在下面标题为动物饲料的部分中提到。

为了产生转基因动物以着眼于从动物乳中回收多肽，可以将编码多肽的基因插入到所讨论的动物的受精卵中，例如使用包含合适的乳蛋白启动子和编码所述多肽的基因的转基因表达载体。将转基因表达载体显微注射进受精卵，优选永久整合入染色体。一旦卵开始生长和分裂，就将有潜力的胚胎植入代用的母体(surrogate mother)，并且鉴定出携带该转基因的动物。获得的动物随即可以通过常规饲养来繁殖(multiply)。多肽可以从动物乳中纯化，参见例如Meade，H.M.等(1999)：Expression of recombinant proteins in themilk oftransgenic animals，Gene expression systems：Using nature for the artofexpression.J.M.Fernandez和J.P.Hoeffler(编)，Academic Press。

在备选方案中，为了产生在其体细胞和/或生殖细胞的基因组中携带有包含异源转基因构建体的核酸序列的转基因非人动物，其中所述异源转基因构建体包含编码多肽的转基因，可以将该转基因与用于多肽的唾液腺特异性表达的第一调节序列可操作地连接，如WO 00/064247中所公开的。

组合物和用途

在更进一步的方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物，以及应用这些组合物的方法。

多肽组合物可以按照本领域已知的方法来制备，并且可以为液体或干组合物的形式。例如，多肽组合物可以以颗粒或微颗粒形式存在。要包括在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法来稳定化。

本发明的肌醇六磷酸酶可以在任何工业情境中用于降解，例如，肌醇六磷酸(盐)，肌醇六磷酸和/或肌醇的单，二，三，四和/或五磷酸盐。公知这些化合物的磷酸部分螯合二价和三价的阳离子如金属离子，包括但不限于(i.a.)营养必需离子钙、铁、锌和镁，以及痕量矿物锰、铜和钼。此外，肌醇六磷酸还在某种程度上通过静电相互作用结合蛋白。

因此，本发明的多肽的优选用途是用于动物饲料制备物(包括人类食物)中或用于这些制备物的添加剂中。

在一个具体的实施方案中，本发明的多肽可以用于改进动物饲料的营养价值。改进动物饲料(包括人类食物)的营养价值的非限定性实例是：改进饲料消化性；促进动物生长；改进饲料应用；改进蛋白质的生物利用度；提高可消化磷酸盐的水平；改进肌醇六磷酸盐的释放和/或降解；改进痕量矿物质的生物利用度；改进常量(macro)矿物质的生物利用度；消除添加补充性的磷酸盐、痕量矿物质和/或常量矿物质的需要；和/或改进卵壳质量。饲料的营养价值因此增加，并且可以改进动物的生长速率和/或重量增加(weight gain)和/或饲料转化率(即摄入的饲料重量相对于重量增加)。

此外，本发明的多肽可以用于降低粪便中的肌醇六磷酸(盐)水平。

动物、动物饲料和动物饲料添加剂

术语动物包括所有动物，包括人。动物的实例是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括，例如，动物如绵羊、山羊、马和家畜(cattle)，例如肉牛(beefcattle)、牛(cow)和小牛(young calves)。在一个具体的实施方案中，动物是非反刍的动物。非反刍动物包括单胃的动物，例如猪(pig or swine)(包括但不限于，小猪(piglet)，饲育猪(growing pig)和母猪(sow))；家禽如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于雏鸡(broiler chick)，蛋鸡(layers))；小牛；和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon)，鳟鱼(trout)，罗非鱼(tilapia)，鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp))；和甲壳类(包括但不限于虾(shrimp)和对虾(prawn))。

术语饲料或饲料组合物是指适合于动物摄入或意欲由动物摄入的任何化合物、制备物、混合物或组合物。

在按照本发明的用途中，可以在餐前、餐后或与进餐同时向动物喂食多肽。后者是优选的。

在一个具体的实施方案中，多肽，以其添加到饲料中的形式，或当其包括在饲料添加剂中时，是基本上(substantially)纯的。在一个具体的实施方案中它是确定的(well-defined)。术语“确定的”意味着肌醇六磷酸酶制备物是至少50％纯的，如由大小排阻层析所测定的(参见WO 01/58275的实施例12)。在其它的具体实施方案中，肌醇六磷酸酶制备物是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯的，如通过这种方法所测定的。

基本上纯的和/或确定的多肽制备物是有利的。例如，以正确剂量向饲料添加基本上不含干扰性或污染性的其它多肽的多肽要容易得多。术语以正确剂量添加具体是指获得恒定(consistent)和不变的(constant)结果的目的，以及基于期望的效果优化剂量的能力。

然而，对于在动物饲料中的使用，本发明的肌醇六磷酸酶多肽不需要那么纯；例如它可以包含其它多肽，在此情况下可以称其为肌醇六磷酸酶制备物。

肌醇六磷酸酶制备物可以(a)直接添加到饲料(或直接用于蛋白质的处理方法)，或(b)其可以用于产生一个或多个中间组合物，如随后添加到饲料中(或在处理方法中使用)的饲料添加剂或预混物。上述纯度的程度是指原始多肽制备物的纯度，无论按照上文的(a)或(b)使用。

具有这种数量级的纯度的多肽制备物尤其可使用重组产生方法来获得，而当通过传统发酵方法来产生多肽时，它们并不是那么容易获得并且还受到高得多的批次间差异(batch-to-batch variation)的影响。

这样的多肽制备物当然可以与其它多肽混合。

多肽可以以任何形式添加到饲料中，作为相对纯的多肽(be it as arelativelypure polypeptide)，或与意欲添加到动物饲料中的其他组分混合，即以动物饲料添加剂的形式，如所谓的动物饲料的预混物(pre-mixes)。

在进一步的方面本发明涉及在动物饲料中使用的组合物，如动物饲料，和动物饲料添加剂，例如预混物。

除本发明的多肽之外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质。饲料添加剂还可以包含至少一种常量矿物质(macro mineral)。

另外，任选的，饲料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；活性氧生成物(reactiveoxygen generating species)；和/或选自下列之中的至少一种其它多肽：肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)；磷脂酶Al(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。

在具体的实施方案中这些其它的多肽是确定的(如上面对肌醇六磷酸酶制备物所定义的)。

在特别优选的实施方案中，具有相对低的最适pH的本发明的肌醇六磷酸酶与至少一种具有更高最适pH的肌醇六磷酸酶组合。更高最适pH的肌醇六磷酸酶的优选实例是芽孢杆菌属肌醇六磷酸酶，例如来自地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的肌醇六磷酸酶，以及其具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物、变体或片段。

本发明的肌醇六磷酸酶还可以与其它肌醇六磷酸酶组合，例如子囊菌类(ascomycete)肌醇六磷酸酶如曲霉属肌醇六磷酸酶，例如源自无花果曲霉(Aspergillusficuum)、黑曲霉或泡盛曲霉；或担子菌类(basidiomycete)肌醇六磷酸酶，例如源自Peniophora lycii，平田头菇(Agrocybe pediades)，绒毛栓菌(Trametes pubescens)或卷边桩菇(Paxillus involutus)；或它们具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物、片段或变体。

因而，在本发明在动物饲料中的用途的优选实施方案中，以及在本发明的动物饲料添加剂和动物饲料的优选实施方案中，将本发明的肌醇六磷酸酶与这些肌醇六磷酸酶组合。

上述子囊菌类和担子菌类肌醇六磷酸酶，特别是源自Peniophora lycii的RONOZYME P肌醇六磷酸酶以及其衍生物、变体和片段，也可以与芽孢杆菌属肌醇六磷酸酶，特别是地衣芽孢杆菌肌醇六磷酸酶以及其衍生物、片段或变体组合，特别是用于动物饲料目的。

抗微生物肽(AMP’s)的实例是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、防卫素(Defensin)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer，2000)，Plectasins和他汀类(Statins)，包括在WO 03/044049和WO 03/048148中所公开的化合物和多肽，以及保持抗微生物活性的上述各项的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP’s)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽，以及保持抗真菌活性的它们的变体和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中所公开的。

多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸，二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)，二十碳五烯酸和γ-亚油酸。

活性氧生成物的实例是化学品如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；以及多肽如氧化酶、加氧酶或合成酶。

通常脂溶性和水溶性维生素，以及痕量矿物质形成意欲向饲料添加的所谓的预混物的部分，而常量矿物质则通常单独添加到饲料中。这些组合物类型中的任一种当富含本发明的多肽时便成为本发明的动物饲料添加剂。

在一个具体的实施方案中，意欲将本发明的动物饲料添加剂以0.01至10.0％；更具体为0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％表示每100克饲料中添加剂的克数)的水平包含于(或规定为必须包含于)动物饮食或饲料中。在预混物中尤其是这样。

下列是这些组分的非排他性实例列表：

脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐(panthothenate)，例如D-泛酸钙(Ca-D-panthothenate)。

痕量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

常量矿物质的实例是钙、磷和钠。

对这些组分的营养要求(用家禽和小猪/猪为例)在WO 01/58275的表A中列出。营养要求意味着这些组分在饮食中应该以指定的浓度提供。

在另一方面，本发明的动物饲料添加剂包含至少一个在WO 01/58275的表A中指定的个体组分。至少一个意味着，一个或多个，一个，或两个，或三个，或四个和以此类推多至全部的十三个，或多至全部的十五个个体组分。更具体地，这至少一个的个体组分以一种提供在表A第四列，或第五列，或第六列中指定的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包括在本发明的添加剂中。

本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食的特征可以如WO 01/58275表B第2-3列中所述。鱼的饮食的特征可以如该表B的第4列中所述。此外这样的鱼类饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

WO 01/58275对应于US 09/779334，将其通过提述并入。

本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外还包含至少一种本申请要求保护的多肽。

此外，或在(上述的粗蛋白含量的)替换方案中，本发明的动物饲料组合物具有含量为10-30MJ/kg的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的可用磷(available phosphorus)含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量是在WO 01/58275的表B中的范围2、3、4或5(R.2-5)中的任一之内。

粗蛋白是以氮(N)乘以因子6.25来计算的，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮含量由凯氏定氮法测定(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)。

可代谢能量的计算可以基于NRC出版物猪的营养需求，第九次修订版1988，猪营养学小组委员会，动物营养学委员会，农业部，国家科学委员会。国家学术出版社，华盛顿特区，第2-6页(Nutrient requirements in swine，ninthrevi sed edition 1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animalnutrition，board ofagriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6)，以及欧洲家禽饲料能量值表(European Table ofEnergy Values for PoultryFeed-stuffs)，Spelderholt家禽研究与拓展中心(Spelderholt centre for poultryresearch and extension)，7361 DA Beekbergen，荷兰。Grafisch bedrijf Ponsen &looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5。

在完整动物饮食中的钙、可用磷和氨基酸的饮食含量的计算是基于饲料表，如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid envoederwaarde van voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219pkLelystad.ISBN 90-72839-13-7。

在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种蛋白质。所述蛋白质可以是动物蛋白，例如肉和骨粉，和/或鱼粉；或其可以是植物蛋白。本文所用的术语植物蛋白是指任何化合物、组合物、制备物或混合物，其包括至少一种从植物得到或起源的蛋白质，包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在具体的实施方案中，植物蛋白的蛋白含量是至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。

植物蛋白可以源自植物蛋白源，如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料，例如大豆粉，羽扇豆粉(lupin meal)和油菜籽粉(rapeseed meal)。

在一个具体的实施方案中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆。

在另一具体的实施方案中，植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物的材料，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或昆诺阿藜(quinoa)。

植物蛋白源的其它实例是油菜籽、向日葵子(sunflower seed)、棉籽(cottonseed)和甘蓝(cabbage)。

大豆是优选的植物蛋白源。

植物蛋白源的其它实例是谷类如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高梁。

在更进一步的具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％玉米；和/或0-80％高梁；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。

例如，可以将动物饮食生产为糊状饲料(mash feed)(非颗粒的(nonpelleted))或颗粒饲料(pelleted feed)。通常地，将磨碎的饲料混合并根据对所讨论的物种的规格(specification)添加足量的必需维生素和矿物质。多肽可以作为固体或液体多肽配制物添加。例如，固体多肽配制物通常在混合步骤之前或期间添加；液体多肽制备物通常在造粒步骤之后添加。多肽也可以并入饲料添加剂或预混物中。

饮食中多肽的终浓度在每千克饮食0.01-200mg多肽蛋白的范围内，例如在0.1-10mg/kg动物饮食的范围内(典型剂量在250到2000FYT/kg动物饮食的范围内)

本发明的肌醇六磷酸酶当然应以有效的量应用，即以足够改进溶解和/或改进饲料营养价值的量应用。目前考虑多肽以一个或多个下列量(剂量范围)来施用：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50或0.10-10-所有这些范围均为每千克饲料中肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数(ppm)。

对于测定每千克饲料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数，将肌醇六磷酸酶从饲料组合物中纯化，并且使用相关的测定法来测定经纯化的肌醇六磷酸酶的比活性。像这样的饲料组合物的肌醇六磷酸酶活性也使用相同的测定法来确定，并基于这两种测定，计算以每千克饲料中肌醇六磷酸酶蛋白的毫克数表示的剂量。

相同的机理适用于测定饲料添加剂中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数。当然，如果可以获得用于制备饲料添加剂或饲料的肌醇六磷酸酶的样品，则从该样品中测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化肌醇六磷酸酶)。

产生发酵产物的方法

本发明的另一方面涉及用于产生发酵产物的方法，所述发酵产物如，例如乙醇、啤酒、酒或葡萄酒(wine)、干酒糟(distillers dried grains(DDG))，其中所述发酵在本发明的肌醇六磷酸酶存在下进行。发酵方法的实例包括，例如，WO 01/62947中描述的方法。发酵使用发酵微生物如酵母进行。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了用于生产发酵产物的方法，包括(a)在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，如酵母)含碳水化合物的材料(例如，淀粉)和(b)从所述发酵的含碳水化合物材料产生发酵产物。

在一个具体的实施方案中，本发明提供用于产生乙醇的方法，包括在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，如酵母)含碳水化合物的材料(例如，淀粉)，和从所述发酵的含碳水化合物材料产生或回收乙醇。

在另一实施方案中，本发明提供用于产生乙醇的方法，包括a)水解淀粉，例如，通过液化和/或糖化方法、粗淀粉水解方法进行，b)在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵所得淀粉，和c)产生乙醇。

肌醇六磷酸酶可以添加至发酵过程的任何合适的阶段并且可以添加在任何合适的组合物中，包括单独添加或与其它酶组合添加，所述其它酶如一种或多种α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶和/或纤维素酶。

在另一实施方案中，本发明提供用于产生乙醇的方法，包括水解生物质(biomass)，和在本发明的肌醇六磷酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，如酵母)获得的生物质。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，其包含与第一核苷酸序列可操作连接的编码蛋白质的基因，所述第一核苷酸序列由SEQ ID NO：9的核苷酸1到99组成，编码由SEQ ID NO：10的氨基酸1到33组成的信号肽，其中所述基因对于所述第一核苷酸序列是外源的。

本发明还涉及包含这种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及生产蛋白质的方法，包括：(a)在适合于产生蛋白质的条件下培养这种重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述第一核苷酸序列可以与其他控制序列单独地、或与其他控制序列组合地可操作连接于外源基因。这些其他控制序列是上文描述的。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在此不是指特定长度的编码的产物，因而，涵盖了肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖了组合以形成编码产物的两个或更多个多肽。蛋白质还包括杂合多肽，其包含获自至少两种不同蛋白质的部分或完整多肽序列的组合，所述至少两种不同蛋白质中的一种或多种对于所述宿主细胞可以是异源的或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质的天然存在的等位的和工程化的变体。

优选地，所述蛋白质是激素或其变体，多肽，例如酶，受体或其部分，抗体或其部分，或报道分子(reporter)。在更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在还更优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶酸裂解多肽、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解多肽、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

所述基因可以获自任何原核的、真核的或其他来源。

各种实施方案

以下是本发明的其他实施方案。还包括在此的是涉及核酸序列、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、产生多肽的方法、转基因植物和动物、以及各种用途、使用方法和饲料组合物/添加剂的相应的方面，所有如要求保护的。

一种分离的多肽，具有肌醇六磷酸酶活性，并与使用0.25M Na-醋酸盐缓冲液pH5.5，减去盲缓冲液，在37℃和pH 5.5对1％(w/v)Na-肌醇六磷酸盐测定的活性，在时间t＝0时的活性相比较，在37℃在0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.0中温育4小时后的残余活性为至少20％；

优选与i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性。

一种分离的多肽，具有肌醇六磷酸酶活性，并与使用0.25M Na-醋酸盐缓冲液pH5.5，减去盲缓冲液，在37℃和pH 5.5对1％(w/v)Na-肌醇六磷酸盐测定的活性，在时间t＝0时的活性相比较，在37℃和在0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.5中温育24小时之后的残余活性为至少20％；

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中所述多肽在pH 5.0和37℃对底物pNP-磷酸所测量的活性，是对底物肌醇六磷酸所测量的所述多肽活性的低于11％；优选与i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中与来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶相比，所述多肽具有更高的磷(P)释放；优选如在体外模型中测量的；和/或，其中所述多肽优选与i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中相对于来自Peniophoralycii、剂量也是0.25FYT/g饲料的肌醇六磷酸酶所释放的磷，剂量为0.25FYT/g饲料的所述多肽释放至少150％的磷(P)；和/或，其中所述多肽优选与i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中相对于来自Peniophoralycii、剂量也是0.75FYT/g饲料的肌醇六磷酸酶所释放的磷，剂量为0.75FYT/g饲料的所述多肽释放至少150％的磷(P)；和/或，其中所述多肽优选与i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性。

I.一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，选自由以下组成的组：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与(i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413，和/或(ii)SEQ IDNO：10的成熟多肽部分具有至少75％的同一性，(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中度严格条件下与如下杂交：(i)SEQ ID NO：9的核苷酸100到1338，(ii)SEQ ID NO：9的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)或(ii)的任一个的互补链；(c)(a)(i)-(a)(ii)的多肽的任一个的变体，包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入；以及(d)(a)(i)-(a)(ii)的多肽的任一个的片段。

II.一种分离的多核苷酸，包含编码I节的多肽的核苷酸序列。

III.一种编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸，选自由以下组成的组：(a)编码具有氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％的同一性，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性；(b)多核苷酸，其与SEQ IDNO：9的核苷酸100到1338具有至少75％的同一性，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性；和(c)多核苷酸，其在至少中度严格条件下与如下杂交：(i)SEQ ID NO：9的核苷酸100到1338，(ii)SEQ ID NO：9的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)或(ii)的任一个的互补链。

IV.II和III节的任一个的分离的多核苷酸，在SEQ ID NO：9的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变的核苷酸序列编码包含SEQID NO：10的氨基酸1至413的多肽。

V.一种核酸构建体，其包含与一个或多个控制序列可操作连接的II-IV节中任一个的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽在表达宿主中产生。

VI.重组表达载体，包含节V的核酸构建体。

VII.重组宿主细胞，包含节V的核酸构建体。

VIII.一种用于生产节I的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。

IX.一种用于生产节I的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

X.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码节I的多肽的多核苷酸转化。

XI.转基因的非人动物或其产物或组成部分，能够表达节I的多肽。

XII.至少一种节I的多肽在动物饲料中的用途。

XIII.至少一种节I的多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。

XIV.一种改善动物饲料的营养价值的方法，其中将至少一种节I的多肽添加于所述饲料。

XV.一种动物饲料添加剂，包含(a)至少一种节I的多肽；和(b)至少一种脂溶性维生素，(c)至少一种水溶维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质。

XVI.节XV的动物饲料添加剂，其进一步包含至少一种淀粉酶、至少一种另外的肌醇六磷酸酶、至少一种木聚糖酶、至少一种半乳聚糖酶、至少一种α-半乳糖苷酶、至少一种蛋白酶、至少一种磷脂酶和/或至少一种β-葡聚糖酶。

XVII.节XVI的动物饲料添加剂，其中所述另外的肌醇六磷酸酶具有最适pH，所述最适pH高于具有SEQ ID NO：10的氨基酸1至413的氨基酸序列的多肽的最适pH。

IIXX.一种动物饲料组合物，具有50到800g/kg的粗蛋白含量，并包含至少一种节I的多肽。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其包含，优选具有或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有至少75％的同一性，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％83％、84％85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％的同一性。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其包含，优选具有以下的序列

(i)SEQ ID NO：10的氨基酸1至413，和/或

(ii)SEQ ID NO：10的成熟多肽部分；或所述多肽

(a)是(i)-(ii)的多肽的任一个的变体，包含一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或保守取代；或

(b)是(i)-(ii)的多肽的任一个的片段。

通过以下实施例来进一步描述本发明，所述实施例不应被看作是限制本发明的范围。

实施例

实施例1.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶基因的克隆

用以下的组氨酸酸性磷酸酶(HAP)进行多重比对：appA大肠杆菌(SPTREMBL：Q8GN88)、法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii)DSM 13694肌醇六磷酸酶(geneseqp：aeh04533)、非丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)ATCC 25407肌醇六磷酸酶(geneseqp：aeh04535)、布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶(geneseqp：aeh04827)和ypo1648鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)CO92(SPTREMBL：Q8ZFP6)。在共有序列的基础上设计两个简并寡核苷酸引物：

2123fw：5′-CATGGTGTGCGNGCNCCNACNAA-3′(SEQ ID NO：1)

2065rev：5′-CCCACCAGGNGGNGTRTTRTCNGGYTG-3′(SEQ ID NO：2)，

其中Y代表T或C，R代表A或G，N代表A、C、G或T。

所述引物用于多个细菌菌种的PCR筛选，退火温度为40-50℃但通常作为降落程序，其以50℃开始然后在进行标准的PCR之前在接下来10个循环中每个循环退火温度降低1℃。

在蜂房哈夫尼菌(DSM19197)中鉴定出大约950bp PCR片段形式的部分肌醇六磷酸酶基因。

PCR片段从琼脂糖凝胶中分离，使用产生该片段的相同的PCR引物对该片段测序。通过翻译核苷酸序列，确认了该DNA片段是HAP肌醇六磷酸酶基因的一部分。

为了获得基因的全长核苷酸序列，使用DNA WALKING SPEEDUPTM试剂盒(来自Seegene，Inc.，2nd Fl.，Myungji Bldg.，142-21，Samsung-dong，Kangnam-gu，Seoul，135-090，Korea的DWSK-V102)，其被设计以捕获未知的目标位点。为此，设计6个特异性寡核苷酸并与试剂盒一起使用。

2328TSP1dw：5′-ACTTGCATCGACGTTGGCTG(SEQ ID NO：3)

2329TSP2dw：5′-ACTGAGCAGCAATGGAACTCTCTG(SEQ ID NO：4)

2330TSP3dw：5′-ACTGGGTTCCAATATCACGAGTC(SEQ ID NO：5)

2331TSP1up：5′-ATGGTGGATCGCTAAATCACACTG(SEQ ID NO：6)

2332TSP2up：5′-ACGTCTGCCCAAACATACACG(SEQ ID NO：7)

2333TSP3up：5′-ACCGCCCATCAGGCTAATC(SEQ ID NO：8)

编码来自蜂房哈夫尼菌DSM 19197的肌醇六磷酸酶的全长核苷酸序列在序列表SEQ ID NO：9中示出，相应编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：10中示出。SEQ ID NO：10的前33个氨基酸(即氨基酸-33到-1)是信号肽，如软件Signal P V3.0所预测的(参见www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

实施例2.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶基因的表达

来自地衣芽孢杆菌的天然蛋白酶Savinase^TM的27个氨基酸的信号肽编码多核苷酸，通过PCR按阅读框融合到编码来自蜂房哈夫尼菌的成熟肌醇六磷酸酶的基因上。信号肽编码序列在SEQ ID NO：11中示出，编码SEQ IDNO：12的信号肽。

编码融合多肽的DNA通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组上。基因构建体在三联启动子系统(如WO 99/43835中描述的)的控制下表达，所述三联启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包括mRNA稳定序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记，例如Diderichsen等，A useful cloning vector for Bacillussubtilis.Plasmid，30，p.312，1993在中所描述的。

氯霉素抗性转化体在PS-1培养基(10％蔗糖、4％大豆粉、1％Na₃PO₄-12H₂O、0.5％CaCO₃和0.01％普卢兰尼克酸(pluronic acid))中在30℃在250RPM振荡培养。在2-5天温育之后，取出上清液，通过将20微升的上清液施加到在含有0.1M醋酸钠pH 4.5和0.1％肌醇六磷酸的1％LSB-琼脂糖平板上穿孔的4mm直径孔洞中，来鉴定肌醇六磷酸酶活性。平板在37℃放置过夜，将包括0.25M CaCl₂和500mM MES(用4N NaOH调节到pH 6.5)的缓冲液倾倒在平板上。平板在室温下放置1h，然后鉴定清亮区(clear zone)作为肌醇磷酸磷酸酶或肌醇六磷酸酶活性。

通过DNA测序来分析几个肌醇六磷酸酶阳性转化体，以确保构建体的正确DNA序列。选择一个正确的克隆。

实施例3.哈夫尼菌NN020125肌醇六磷酸酶宿主的发酵

携带蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶构建体并能够表达肌醇六磷酸酶(成熟部分)的枯草芽孢杆菌的选择的克隆，在SK-1M培养基(酪蛋白酸钠(来自Arla的Miprodan 30)40g，麦芽糊精01(Glucidex 6，来自Roquette的目录号332203)200g，大豆粉50g，Dowfax 63N10(来自Dow的非离子表面活性剂)0.1ml，自来水加到1000ml，CaCO₃片0.5g/100ml)中在30℃以250rpm培养6天。

实施例4.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的纯化

具有肌醇六磷酸酶的发酵上清液首先在7200rpm和5℃离心1小时，并通过四个Whatman玻璃微纤维滤纸(2.7、1.6、1.2和0.7微米)的夹心过滤。在这之后，利用压力将溶液通过Seitz-EKS深度滤器无菌过滤。接下来，过滤的上清液如下预处理：

样品溶液用水洗涤，使用装备有10kDa截留超滤膜的超滤装置(Filtron，来自Filtron Technology Corporation)浓缩。然后用10％(w/v)乙酸将pH值调节到4.5，其产生较少的沉淀。在沉淀物中没有发现活性，通过具有0.22微米截留的Fast PES瓶顶部滤器过滤来除去它。

在预处理之后，通过在S-Scpharose上层析来纯化肌醇六磷酸酶，在XK26柱中大约50mL，用作缓冲液A 50mM醋酸钠pH 4.5，和缓冲液B 50mM醋酸钠+1M NaCl pH 4.5。来自柱的级分使用磷酸酶测定法(见下文)来分析活性，汇集具有活性的级分。

溶液中添加固体硫酸铵得到1.5M的终浓度，用6M HCl将pH值调节到6.0。含有肌醇六磷酸酶的溶液施加到丁基-琼脂糖柱上，在XK26柱中大约30mL，用作缓冲液A 25mM二-三(二-(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷))+1.5M硫酸铵pH 6.0，并用作缓冲液B为25mMbis-tris pH 6.0。来自柱的级分使用磷酸酶测定法(见下文)来分析活性，汇集具有活性的级分。最后，将含有纯化的肌醇六磷酸酶的溶液的缓冲液改变为50mM醋酸钠+0.1MNaCl，pH4.5，使用具有30kDa截留膜的Amicon ultra-15过滤设备来浓缩。

如根据SDS-PAGE所估计的，分子量是大约40kDa，纯度＞95％。

实施例5.活性测定法

磷酸酶活性的测定

将75微升含有肌醇六磷酸酶的酶溶液分配在微量滴定板的孔中，例如，NUNC269620，添加75微升底物(为制备底物，两个5mg对-硝基苯基磷酸片(Sigma，Cat.No.N-9389)溶于10ml 0.1M Na-醋酸盐缓冲液，pH 5.5中)。将平板密封，并在37℃以750rpm振荡温育15分钟。在温育时间之后，添加75微升停止试剂(停止试剂是水中的0.1M四硼酸二钠)，在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。

肌醇六磷酸酶活性的测定

在0.25M醋酸钠、0.005％(w/v)Tween-20pH5.5中适当稀释的75微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配在微量滴定板的孔中，例如NUNC 269620，添加75微升底物(通过将来自稻的100mg肌醇六磷酸钠(Aldrich Cat.No.274321)溶解在10ml 0.25M醋酸钠缓冲液，pH5.5中来制备)。将平板密封，并在37℃以750rpm振荡温育15分钟。在温育之后，添加75微升停止试剂(停止试剂通过混合10mL钼酸盐溶液(0.25％(w/v)氨溶液中的10％(w/v)七钼酸铵)10ml钒酸铵(0.24％来自Bie & Berntsen的商业产品，目录号LAB17650)和20ml 21.7％(w/v)硝酸来制备)，在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。肌醇六磷酸酶活性以FYT的单位表示，一个FYT是在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸的酶量。测量的肌醇六磷酸酶活性的绝对值可以通过参考从无机磷酸盐的合适的稀释物制成的标准曲线来获得，或参考从具有已知活性的肌醇六磷酸酶酶制备物的稀释物制成的标准曲线来获得(这种具有已知活性的标准酶制备物可从Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880Bagsvaerd请求获得)。

肌醇六磷酸酶比活性的测定

在醋酸钠缓冲液pH 5.5中测定肌醇六磷酸酶的比活性。肌醇六磷酸酶如上所述地高度纯化，即，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上仅鉴定出一个成分。

蛋白质浓度通过如下的氨基酸分析测定：将样品的一个等分试样在6MHCl，0.1％苯酚中在110℃在抽空的(evacuated)玻璃管中水解。产生的氨基酸使用根据厂家的说明书操作的Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统来定量。根据氨基酸的量，计算水解的等分量中蛋白质的总质量以及浓度。

肌醇六磷酸酶活性如上所述以FYT单位来测定，作为每mg肌醇六磷酸酶酶蛋白按FYT单位测量的肌醇六磷酸酶活性来计算比活性。

产生的比活性是980FYT/mg蛋白质。比活性在pH 5.5和37℃对肌醇六磷酸钠测定。

实施例6.肌醇六磷酸酶pH曲线的测定

如上文在“肌醇六磷酸酶活性的测定”部分中所述，在2.0到7.5的pH值范围中在37℃测定pH曲线(以0.5pH单位阶跃)，只是使用缓冲液混合物(50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mMBis-Tris代替0.25M醋酸钠pH5.5缓冲液。结果在下面的表1中概述。在2.0-7.5的范围中每个pH值得到的值是以标准化为最佳值的％表示的相对活性。

表1：pH曲线

实施例7.肌醇六磷酸酶等电点的测定

肌醇六磷酸酶的等电点pI使用如厂家描述来运行的等电聚焦凝胶(来自Invitrogen的Novex pH 310IEF凝胶，目录号EC6655A2)来测定。蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的pI是约7.4。

实施例8.肌醇六磷酸酶温度曲线

温度曲线(肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数)基本上如上文描述的(“肌醇六磷酸酶活性的测定”)在20-90℃的温度范围中对蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶进行测定。然而，在PCR管中而不是在微量滴定板中进行酶反应(100微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液+100微升底物)。在期望的温度下15分钟的反应期之后，试管冷却到20℃20秒，将150微升的每种反应混合物转移到微量滴定板。添加75微升的停止试剂，在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。结果在下面的表2中概述。每个温度得到的数字是标准化至最佳值的相对活性(以％表示)。

表2：温度曲线

实施例9.肌醇六磷酸酶热稳定性

在米曲霉和枯草芽孢杆菌中表达的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶通过差示扫描量热术(DSC)进行热稳定性测量，并与大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较(从Danisco A/S作为PHYZYME XP商业上可获得)。

蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的蛋白质样品的等分试样(如实施例4中所述纯化)相对于2×500ml 20mM Na-醋酸盐，pH 4.0在4℃在2-3h步骤，随后是过夜步骤中透析。样品经0.45μm过滤，用缓冲液稀释到约2A280单位。测量的精确吸光度值在以下显示的结果表中给出。透析缓冲液用作差示扫描量热术(DSC)中的参考。样品使用真空抽吸并搅动约10分钟来脱气。来自商业产品PHYZYME XP的大肠杆菌肌醇六磷酸酶的等分试样以如实施例4中所述类似的方式进行纯化。

以1.5℃/分钟的恒定的扫描率从20-80℃进行DSC扫描。过滤周期：16秒。在运行DSC之前，相对于合适的缓冲液(例如，0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.5或3.0；20mM醋酸钠pH 4.0；0.1M醋酸钠，pH 5.5；0.1M Tris-HCl，pH 7.0)透析肌醇六磷酸酶。数据处理使用MicroCalOrigin软件(版本4.10)进行，变性温度Td(也称为熔解温度Tm)被定义为在温谱图中的峰的顶端处的温度。为了探测解折叠过程的可逆性，在短暂的冷却阶段之后立即进行第二次扫描。对于第二次扫描，将峰面积(峰和基线之间的面积＝被比较的解折叠的焓)与第一次扫描的峰面积比较。大的峰(第一次扫描的峰面积的75-100％)被解释为可逆的解折叠/折叠过程。

在米曲霉和枯草芽孢杆菌中表达的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和大肠杆菌肌醇六磷酸酶的DSC的结果在以下的表3中概述。

表3.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和大肠杆菌肌醇六磷酸酶的比较的热稳定性

肌醇六磷酸酶	缓冲液	A280	Td第一次扫描(℃)	TD第二次扫描(℃)	2次扫描的相对峰大小(实际面积)
						曲霉表达的蜂房哈夫尼菌	20nMNaAcpH 4.0	3.2	70.2	70.3	大
芽孢杆菌表达的蜂房哈夫尼菌	20nMNaAcpH 4.0	1.6	70.1	70.3	大
						大肠杆菌	20nMNaAcpH 4.0	2.4	62.6	62.9	中

如在上表中说明的，蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶具有比大肠杆菌肌醇六磷酸酶更大的热稳定性。还清楚的是，蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的热稳定性不受表达宿主的影响。

实施例10.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和大肠杆菌肌醇六磷酸酶的胃蛋白水解抗性

蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和大肠杆菌肌醇六磷酸酶(PHYZYME XP，获自Danisco)的样品用胃蛋白酶(胃蛋白酶1：60000来自猪的胃粘膜，Wako162-18721，2900单位/mg，Lot SDK5232)在250mM甘氨酸缓冲液pH 3.0(约1000胃蛋白酶单位/mg肌醇六磷酸酶)中处理。在40℃振荡(750rpm)温育30分钟。在与胃蛋白酶温育之后，如实施例5所述测定肌醇六磷酸酶活性，并与同样方式处理的、但未添加胃蛋白酶的样品的活性进行比较。结果在下面的表4中概述。

表4.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和大肠杆菌肌醇六磷酸酶的胃蛋白水解抗性

肌醇六磷酸酶	平均(res.act.％)
			大肠杆菌	96	结果为95％和97％残余活性的两个运行的结果
蜂房哈夫尼菌	95.5	结果为97％和94％残余活性的两个运行的结果

因而，大肠杆菌肌醇六磷酸酶和蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶具有非常相似的胃蛋白水解抗性性质。

实施例11：蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶在动物饲料中在体外模型中的性能

在体外模型中，将蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶在动物饲料中的性能与布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的性能进行了比较。体外模型模拟了单胃动物中的胃肠条件，与体内的动物试验中获得的结果良好地关联。样品中的肌醇六磷酸酶活性如实施例5中“肌醇六磷酸酶活性的测定”下所述进行测定。如下进行比较：

然后制备由30％大豆粉和70％玉米粉组成、具有添加的CaCl₂至5g钙每kg饲料浓度的饲料样品，在40℃和pH 3.0预温育30分钟，随后添加胃蛋白酶(3000U/g饲料)和适当剂量的肌醇六磷酸酶(对于所有要测试的肌醇六磷酸酶使用相同的剂量以容许比较)，例如，0.1至1.0肌醇六磷酸酶单位FYT/g饲料。还包括了没有肌醇六磷酸酶活性的空白作为参考。然后将样品在40℃和pH 3.0温育60分钟，随后在pH 4.0温育30分钟。

终止反应，并通过添加HCl到0.5M的终浓度并在40℃温育2小时，随后一个冻融循环和40℃的1小时温育，来提取肌醇六磷酸和肌醇-磷酸。

肌醇六磷酸和肌醇-磷酸通过Chen等在Journal of Chromatography A(2003)vol.1018，pp.41-52所描述的高效离子层析来分离，并如Skoglund等在J.Agric.FoodChem.(1997)，vol.45，pp.431-436所述来定量。

图1显示了在125FYT/kg饲料、250FYT/kg饲料和500FYT/kg饲料的剂量下与布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶相比的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的剂量-反应。体外的肌醇六磷酸酶效果显示为体外温育之后样品中保留的残余肌醇-磷酸结合的磷(IP-P)，并与没有肌醇六磷酸酶的对照样品中保留的残余IP-P进行比较。给出的所有数字是4或5个重复(体外温育)的平均值和标准偏差。剂量为250FYT/kg的哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶将体外样品中残余IP-P的量降低到与125FYT/kg的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶大致相同的程度。

因而，哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶能够获得残余的肌醇-磷酸结合磷的量的非常良好的降低。

实施例12：蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和Peniophora lycii肌醇六磷酸酶在动物饲料中在体外模型中的性能

在250FYT/kg和500FYT/kg饲料的剂量下，蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶在体外模型中在动物饲料中的性能也与Peniophora lycii肌醇六磷酸酶的性能进行比较。根据如实施例11中所述的实验规程获得结果。如图2中所示，蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶比Peniophoralycii肌醇六磷酸酶更好地降低了体外样品中的残余IP-P的量。

Claims

1.具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其是由以下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有100％的同一性；其中该多肽是蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶。

2.分离的多核苷酸，由编码权利要求1的多肽的核苷酸序列组成。

3.编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸，是编码由以下氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10的氨基酸1至413具有100％的同一性；其中该多肽是蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶。

4.核酸构建体，其包含与一个或多个控制序列可操作连接的权利要求2或3的多核苷酸，所述控制序列指导权利要求1所述多肽在表达宿主中的产生。

5.重组表达载体，包含权利要求4的核酸构建体。

6.重组宿主细胞，包含权利要求4的核酸构建体。

7.用于产生权利要求1的多肽的方法，所述方法包括(a)在有助于所述多肽的产生的条件下培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

8.至少一种权利要求1的多肽在动物饲料中的用途。

9.至少一种权利要求1的多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。

10.一种改善动物饲料的营养价值的方法，其中向所述饲料加入至少一种权利要求1的多肽。

11.一种动物饲料添加剂，包含：

(a)至少一种权利要求1的多肽；和

(b)至少一种脂溶性维生素、至少一种水溶维生素、至少一种痕量矿物质或其组合。

12.权利要求11的动物饲料添加剂，其进一步包含至少一种淀粉酶、至少一种另外的肌醇六磷酸酶、至少一种木聚糖酶、至少一种半乳聚糖酶、至少一种α-半乳糖苷酶、至少一种蛋白酶、至少一种磷脂酶和/或至少一种β-葡聚糖酶。

13.一种动物饲料组合物，具有50到800g/kg的粗蛋白含量，并包含至少一种权利要求1的多肽。

14.一种生产发酵产物的方法，包括(a)在权利要求1的肌醇六磷酸酶存在下使用发酵微生物发酵含有碳水化合物的材料，和(b)从所述发酵的含有碳水化合物的材料产生发酵产物或发酵副产物。

15.权利要求14的方法，其中所述发酵产物是乙醇、酒或干酒糟。

16.权利要求14的方法，其中所述发酵产物是啤酒。