CN101177675B

CN101177675B - 肌醇六磷酸酶变体

Info

Publication number: CN101177675B
Application number: CN200710196282.7A
Authority: CN
Inventors: 松井知子; 克劳斯·C·富格尔桑; 阿伦·斯文德森; 福山志朗
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-04
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2023-02-04
Also published as: EP1474508A2; ATE533839T1; JP4426307B2; EP2295553A1; WO2003066847A3; ES2377519T3; CN100366736C; BRPI0307086B1; WO2003066847A2; AU2003203147A1; BR0307086A; CN1630719A; JP2010017193A; EP1474508B1; AU2003203147B2; JP2005516619A; CN101177675A; JP5405957B2

Abstract

本发明涉及的肌醇六磷酸酶变体来自与Peniophora lycii肌醇六磷酸酶同源的亲代肌醇六磷酸酶，并包括在对应于Peniophora lycii肌醇六磷酸酶位置的数个位置中的至少一个上的至少一个取代。所述变体的性质改进，具体为比活性和/或热稳定性比亲代肌醇六磷酸酶高，例如通过DSC测定，在pH 5.5Tm最多为82℃，和/或双倍比活性。本发明也涉及编码所述肌醇六磷酸酶变体的DNA，它们的生产方法，及其，例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。

Description

肌醇六磷酸酶变体

本申请是申请日为2003年2月4日、申请号为03803578.2(国际申请号为PCT/DK03/00067)、题目为“肌醇六磷酸酶变体”的分案申请。

技术领域

本发明涉及亲代肌醇六磷酸酶的变体，具体为热稳定性和/或比活性提高的变体。本发明也涉及编码此变体的DNA序列，在重组宿主细胞生产它们，以及使用所述变体的方法，具体在动物饲料领域。优选的亲代肌醇六磷酸酶是包含SEQ IDNO：2的隔孢伏革菌属(Peniophora)肌醇六磷酸酶。

技术背景

名称为“Modified phytases”的EP 897010公开了本文未现的(i.a.)烟曲霉(Aspergillus fumigatus)肌醇六磷酸酶的某些变体。名称为“Consensus phytases”的EP 897985公开了本文未现的可基于例如数个子囊菌肌醇六磷酸酶的序列多重比对设计的真菌共有(Consensus)肌醇六磷酸酶。名称为“Thermostable phytases in feedpreparation and plant expression”的WO 99/48380涉及使用热稳定的肌醇六磷酸酶的某些方面。热稳定的肌醇六磷酸酶的实施例见第30页粗线下列出的数个共有(consensus)肌醇六磷酸酶。名称为“Improved phytases”的WO 00/43503涉及本文未现的热稳定性增加的某些肌醇六磷酸酶变体，该变体可通过EP 897985所述类似的方法来设计。热稳定的肌醇六磷酸酶的实施例见第54-55页粗线下所示。这些肌醇六磷酸酶均与SEQ ID NO：2具有75％以下的百分比同一性。

本发明的一个目的是提供新的和改进的肌醇六磷酸酶变体，具体为热稳定性改进和/或比活性增加。

WO 98/28408中公开了来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶，并且WO99/49022中公开了它的某些变体(见例如在第76-77页的权利要求31)，然而已放弃了为了本发明目的的变体。

发明内容

本发明涉及亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；26；28-31；37-48；55-69；73-83；91-119；123-126；135-142；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；300-308；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；并且

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的一个位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下的Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：G26S；Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；A135S；D137Y；Q138D，S，G；D142A；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M322I；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；或L396R。

本发明也涉及编码所述肌醇六磷酸酶变体的分离的核酸序列，和包含所述核酸序列的核酸构建体，载体，及宿主细胞，以及生产并使用所述肌醇六磷酸酶变体的方法。

具体地说，本申请涉及如下方面：

(1)亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；26；28-31；37-48；55-69；73-83；91-119；123-126；135-142；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；300-308；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；和

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；和

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；和

(d)附带条件是所述变体不是选自如下的Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：G26S；Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，1；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；A135S；D137Y；Q138D，S，G；D142A；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251 D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M322I；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；和L396R。

(2)项1的变体，其含有的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：

(i)20R+95R+97V+98G；

(ii)29N+102I；

(iii)29N+118A；

(iv)29N+163P+324S；

(v)29N+163P+324S+395G；

(vi)29N+234S；

(vii)29N+324S；

(viii)29S；

(ix)29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V；

(x)29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S；

(xi)29S+95H+110W+183W+324A+350V；

(xii)29S+95M+110W+183W+324A+350V；

(xiii)29S+95N+110R+183W+324A+350V；

(xiv)29S+95R+110W+183W+324A+350V；

(xv)29S+95S+110R+183W+324A+350V；

(xvi)29S+95S+110W+183W+324A+350V；

(xvii)29S+95T+110R+183W+324A+350V；

(xviii)29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V；

(xix)29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V；

(xx)29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V；

(xxi)29S+95T+110Y+157K+183W+185H+187R+190S+191R+248G+324A+350V；

(xxii)29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V；

(xxiii)29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V；

(xxiv)29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V；

(xxv)29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V；

(xxvi)29S+95T+110Y+183W+185E+248S+324A+350V；

(xxvii)29S+95T+110Y+183W+185H+248G+321A+323A+324A+350V；

(xxviii)29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V；

(xxix)29S+95T+110Y+183W+185H+187S+190K+191S+210G+222I+248G+324A+350V；

(xxx)29S+95T+110Y+183W+185K+248G+324A+349K+350L；

(xxxi)29S+95T+110Y+183W+185K+248S+324A+350V；

(xxxii)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349A+350L；

(xxxiii)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350I；

(xxxiv)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+349L+350M；

(xxxv)29S+95T+110Y+183W+185K+248T+324A+350V；

(xxxvi)29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V；

(xxxvii)29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V；

(xxxviii)29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V；

(xxxix)29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V；

(xl)29S+95T+110Y+183W+324A；

(xli)29S+95T+110Y+183W+324A+350V；

(xlii)29S+99D+125D+324A+334E+350V；

(xliii)29S+110Y+183W+185N+324A+350V；

(xliv)29S+125D+218T+324A+344S+350V；

(xlv)29S+125D+234K+324A+330R；

(xlvi)29S+125D+234K+324A+330R+395G；

(xlvii)29S+125D+324A；

(xlviii)29S+125D+324A+330R+395G；

(xlix)29S+125D+324A+350V；

(l)29S+183A+324A+350V；

(li)29S+183G+324A+334E+344S+350V；

(lii)29S+183W+324A+350V；

(liii)29S+205S；

(liv)29S+324A+350V；

(Iv)29T+324L；

(Ivi)45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M；

(Ivii)69A+334E；

(Iviii)99D+398T；

(lix)114A+187G+194R+324S；

(Ix)218T+334G；

(Ixi)323A+324S；

(Ixii)324S；

(Ixiii)324S+328T；

(Ixiv)324S+345D+347Q；

(Ixv)324S+395G；

(Ixvi)330R；

(Ixvii)334D+343N+344V；

(Ixviii)334E+344A；

(Ixix)345H+347P+350V；和

(Ixx)350V。

(3)分离的核酸序列，其包含编码项1或2变体的核酸序列。

(4)核酸构建体，其包含项3的核酸序列，其可操纵连接到一或多个指导在适宜表达宿主生产所述多肽的可控序列。

(5)重组表达载体，其包含项4的核酸构建体。

(6)重组宿主细胞，其包含项4的核酸构建体和/或项5的表达载体。

(7)生产项1或2任一的变体的方法，其包含

(a)培养项6的宿主细胞来生产包含所述变体的上清；和

(b)回收所述变体。

(8)转基因植物，或植物部分，其能表达项1或2的肌醇六磷酸酶变体。

(9)转基因，非人动物，或产物，或其元件，其能表达项1或2的肌醇六磷酸酶变体。

(10)包含项1或2的至少一个肌醇六磷酸酶变体的组合物，和

(a)至少一种脂肪可溶维生素；

(b)至少一种水溶维生素；和/或

(c)至少一种痕量矿物质。

(11)项10的组合物，其还包含至少一个选自下述酶的酶：木聚糖酶，葡聚糖内切酶，内切-1，3(4)-β葡聚糖酶，和蛋白酶。

(12)项10或11的组合物，其为动物饲料添加剂。

(13)动物饲料组合物，其粗制蛋白质含量为50-800g/kg，并包含项1或2任一的变体或项10或12任一的组合物。

(14)提高动物饲料营养价值的方法，其中将项1或2任一的变体或项10或12任一的组合物加到所述饲料。

(15)降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法，包含喂给动物有效量的项13的饲料。

(16)处理植物蛋白质的方法，包含将项1或2任一的变体或项10或12任一的组合物加到至少一个植物蛋白质或蛋白质源的步骤。

(17)项1或2任一的变体或项10或12任一的组合物在如下的用途：在动物饲料中；在动物饲料制备中；为提高动物饲料营养价值；降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平；处理植物蛋白质；或从肌醇六磷酸酶底物释放磷。

附图说明

图1提供了含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的Peniophora lycii肌醇六磷酸酶3D结构的坐标。

发明详述

隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的三维结构

根据在X-Ray Structure Determination，Stout，G.K.and Jensen，L.H.，John Wiley & Sons，Inc.NY，1989给出的X-射线结晶(crystallographic)方法的原理得到所述Peniophora lycii肌醇六磷酸酶的结构。用同晶置换(isomorphous replacement)方法在2.2_分辨率下在图1以标准的PDB格式(Protein Data Bank，Brookhaven National Laboratory，Brookhaven，CT)给出所述晶体结构的结构坐标。图1的PDB文件仅涉及此肌醇六磷酸酶序列的一部分，也就是对应于SEQ ID NO：2的残基22-422的部分。

分子动力学(Dynamics)(MD)

分子动力学(MD)模拟(simulations)指示了所述氨基酸在蛋白质结构内的流动性(见McCammon，JA and Harvey，SC.，(1987)，“Dynamics of proteins andnucleic acids”，Cambridge University Press)。所述蛋白质的动力学通常可与所述结晶B因子(见Stout，GH and Jensen，LH，(1989)，“X-ray structuredetermination”，Wiley)相关。通过在例如不同温度进行所述MD模拟，可模拟残基与温度相关的流动性。建议随机诱变流动性或柔性(flexibility)(这里指各向同性波动(isotropic fluctuations))最高的区域。可以理解在所述蛋白质的某些区域发现的高流动性，可以通过取代这些残基来温度改进(thermallyimproved)。

用程序CHARMM(Molecular Simulations(MSI))，用MD在300，350，400，450，和500K处理上述的隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶结构300和600ps，然后用300steps Steepest Descent，600steps Conjugated Gradients，和3000stepsABNR以0.001kcal/mole的公差等级(tolerance grade)最小化。

由MD模拟产生如下建议的诱变区域：

300和400K无水MD：37-48，91-119，232-238，300-308，325-335，343-348；

300和400K有水MD：407-412；

300K无水MD：229-236；

有周期(period)边界(boundary)的立方水盒(water box)的MD：123-126，154-157，204-216，284-289，419-423。

由对X-结构中B-因子的评估产生如下建议的诱变区域：73-83，207-217。

上述区域可被组合如下：37-48；73-83；91-119；123-126；154-157；204-217；229-238；284-289；300-308；325-335；343-348；407-412；419-423。

得自MD模拟的其他区域是：154-163；204-218；323-335；342-350。

得自B-因子评估的其他区域是：1-29，优选1-28；59-106；169-171；178-247；339-344；367-371；417向前。更优选的区域是：1-24；69-94；182-188；199-220；229-241；368-370；420-423。

活性位点和底物结合壳(Shells)

可用本领域已知的程序，如Molecular Simulations MSI，San Diego，California的INSIGHTII来限定包含那些与所述催化残基(H55，D319，R54)很临近的氨基酸残基的活性位点壳。也可限定底物结合壳，其包含与所述底物结合位点(H55，R54，R139，N320)很临近并因此可期待与所述底物接触的那些氨基酸残基。很临近可被限定为与相关残基距离例如，0_，15_，16_，或20_。可通过将肌醇六磷酸或其衍生物如肌醇-1，4，5-三磷酸(Brookhavendatabase file ldjx.肌醇-1，4，5-三磷酸)楔入(dock)所述活性位点裂缝(cleft)(所述残基构成(making up)所述活性位点的表面)来推断底物结合的信息。

制备变体的策略

基于图1的3D-结构和SEQ ID NO：2，随后对活性位点和底物结合壳(16_，优选15_，更优选10_)的研究，以及分子动力学，主要为了改进热稳定性和/或增加比活性，建议对下述区域进行诱变：氨基酸26-31；55-69；99-104；135-142；169-193；253-266；或SEQ ID NO：2的氨基酸321-323。

优选对SEQ ID NO：2上述区域的下述位置进行诱变：G26，P27，Y28，D29，P30，W59，P60，T61，S62，G63，A64，R65，S66，R67，Q68，V69，A99，D100，L102，P103，F104，A135，G136，D137，Q138，V141，D142，E169，E170，N177，N178，M179，P181，N182，D189，T191，W192，L193，Y253，Y254，D257，K258，Y259，Y260，T262，G265，N266，T321，和/或V323。

包括下述变体：G26S，A；P27X，M；Y28F，N，Q；D29S，T，A；F30X；W59X，F，Y；P60S；T61S；S62A；G63A，S；A64G，K，R，S；R65A；S66K，T；R67X，K，A，L，V，S；Q68E，D，N，M；V69X；A99X，D，S，E，N；D100X，S，E，N；L102V；P103X，E；F104X，L；A135S，D；G136X，S，D；D137S；Q138X，D，N；V141X；D142X；E169A；E170X，A，T；N177D；N178A，G，L；M179V，T；P181X，T，V；N182X，A；D189X；T191X；W192X；L193T，I；Y253N，G；Y254A，G；D257S；K258L；Y259X，F，P，W；Y260X，P，W；T262Y，V；G265X；N266Q；T321Q，L，N；和/或V323I。

主要指向所述底物的氨基酸残基或位置如下：P27，Y28，R65，R67，Q68，A99，D100，L102，A135，G136，D137，E169，N177，T191，W192，Y253，Y254，T262，和T321。在一或多个这些位置改变的变体具体包括，例如包含在这些位置的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，或至少十个改变的变体。在具体实施方案中，所述变体包含在至少十一个，至少十二个，至少十三个，至少十四个，至少十五个，至少十六个，至少十七个，至少十八个，或在所有的十九个位置上的改变。所述变体的实施例是选自如下的那些包含至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，或至少十个突变的变体：P27X，M；Y28F，N，Q；R65A；R67X，K，A，L，V，S；Q68E，D，N，M；A99X，D，S，E，N；D100X，S，E，N；L102V；A135S，D；G136X，S，D；D137S；E169A；N177D；T191X；W192X；Y253N，G；Y254A，G；T262Y，V；和/或T321Q，L，N。在具体实施方案中，所述变体含有至少十一个，十二个，十三个，十四个，十五个，十六个，十七个，至少十八个，或十九个这些突变。

具有肌醇六磷酸酶活性的多肽

本文中，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(肌醇六磷酸酶)是催化肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸盐(hexakisphosphate))水解为(1)肌醇和/或(2)其一磷酸盐，二磷酸盐，三磷酸盐，四磷酸盐，和/或五磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。

本文中，术语肌醇六磷酸酶底物包括本文未示的肌醇六磷酸及任何肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸的盐)，及上面(2)所列的磷酸盐。

互联网上的ENZYME地址(http://www.expasy.ch/enzyme/)汇集了与酶命名相关的信息。它主要根据国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)的推荐并且它描述了每种提供了EC(酶学委员会)编号的定性的(characterized)酶(Bairoch A.The ENZYME database，2000，Nucleic Acids Res28：304-305)。也见NC-IUBMB的Enzyme Nomenclature手册，1992。

根据所述ENZYME地址，已知两种不同种类的肌醇六磷酸酶：所谓的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)及所谓的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸盐6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。本发明中，肌醇六磷酸酶的定义包括这两种类型。

本发明中以单位FYT测定所述肌醇六磷酸酶活性，一FYT为每分钟释放(liberates)1微摩尔无机正磷酸盐的酶。在下述条件：pH 5.5；温度37℃；底物：肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)浓度为0.0050mol/l。适当的肌醇六磷酸酶试验(assay)是WO 00/20569实施例1所述的FYT和FTU试验。FTU是为了测定饲料和预先混合物中的肌醇六磷酸酶活性。所述FYT试验也在本文实施例2描述。

亲代肌醇六磷酸酶

亲代肌醇六磷酸酶是与来自Peniophora lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。本文中，同源的是指与本文SEQ ID NO：2具有至少60％的同一性，所述的SEQ ID NO：2对应于所述完整(complete)氨基酸序列的氨基酸17-439，其包括来自Peniophora lycii CBS 686.96(WO 98/28408的SEQ ID NO：2)肌醇六磷酸酶的信号肽部分。通常如下氨基酸同源性部分所述来测定同源性。

所述亲代肌醇六磷酸酶可为野生型或自然出现的多肽，或其等位变体，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，特别是其成熟部分。它也可为其变体和/或遗传工程化或合成多肽。

在具体实施方案中所述野生型亲代肌醇六磷酸酶是真菌肌醇六磷酸酶，如丝状真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶的实施例是US 5830732所述的许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)肌醇六磷酸酶。

在另一具体实施方案中，所述野生型真菌亲代肌醇六磷酸酶来自丝状真菌，例如子囊菌(Ascomycota)门或担子菌(Basidiomycota)门(分别为子囊菌肌醇六磷酸酶，或担子菌肌醇六磷酸酶)。

子囊菌肌醇六磷酸酶的实施例来自曲霉(Aspergillus)的菌株，例如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)PHYA(SWISSPROT P34753，Gene 133：55-62(1993))，黑曲霉(Aspergillus niger)(无花果曲霉(ficuum))PHYA(SWISSPROTP34752，EP420358，Gene 127：87-94(1993))，泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755，Gene 133：55-62(1993))，黑曲霉PHYB(SWISSPROT P34754，Biochem.Biophys.Res.Commun.195：53-57(1993))；或翘孢霉属(Emericella)的菌株，例如构巢裸孢壳(Emericella nidulans)PHYB(SWISSPROT 000093，Biochim.Biophys.Acta 1353：217-223(1997))；或嗜热霉属(Thermomyces)(腐质霉属(Humicola))的菌株，例如WO 97/35017所述的细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)肌醇六磷酸酶。其他子囊菌肌醇六磷酸酶的实施例在公开EP 684313(例如来自烟曲霉，土曲霉(Aspergillusterreus)，和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；JP 11000164(来自青霉菌属(Penicillium)菌株的肌醇六磷酸酶)；US 6139902(来自曲霉菌株的肌醇六磷酸酶)，及WO 98/13480(Monascus anka肌醇六磷酸酶)。

担子菌肌醇六磷酸酶的实施例是所述来自卷边桩菇(Paxillus involutus)，绒毛栓菌(Trametes pubescens)，Agrocybe pediades和Peniophora lycii(见WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。

优选的亲代肌醇六磷酸酶来自隔孢伏革菌种，优选来自Peniophora lycii的菌株，最优选来自所述Peniophora lycii CBS 686.96的菌株。

不管上述种已知的种名，可以理解其定义包括完全(perfect)和不全阶段(imperfect states)，及其它分类学等效物(equivalent)例如，无性型。本领域技术人员很容易辨认适当等效物的同一性。

公众可容易地在数个培养物保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，真菌菌种保藏中心(CBS)，和农业研究机构保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)得到这些种的菌株。

另外，可用合适探针从其他来源，包括从自然(例如土壤，堆肥，水等)分离的微生物鉴定并得到所述多肽。从自然生长环境分离微生物的技术在本领域已知。然后可以通过类似筛选其它微生物的基因或cDNA文库得到所述氨基酸序列。一旦已用所述探针检测出编码多肽的氨基酸序列，可用本领域一般技术人员已知的技术(见例如，Sambrook等，1989，见上文)分离或克隆所述序列。

在另一具体实施方案中所述亲代肌醇六磷酸酶是合成的肌醇六磷酸酶。合成的肌醇六磷酸酶是人设计的，并希望不会在自然出现。EP 897985和WO 00/43503公开了这些合成的，真菌的肌醇六磷酸酶的实施例，通常叫做共有肌醇六磷酸酶。改组的(Shuffled)肌醇六磷酸酶是合成或遗传工程化的亲代肌醇六磷酸酶的其它实施例，可如本领域通常已知，例如通过定点诱变，通过PCR(用含有所需突变的PCR片段作为所述PCR反应的引物之一)，或通过随机诱变来制备它。合成的肌醇六磷酸酶的概念中还包括任何杂种的(hybrid)或嵌合的肌醇六磷酸酶，即肌醇六磷酸酶含有来自至少两个肌醇六磷酸酶的部分氨基酸序列的组合。

所述亲代肌醇六磷酸酶可含有所述特定氨基酸序列，或它可能是其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在一实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶含有所述特定氨基酸序列或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在另一实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶由特定氨基酸序列或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段组成。

特定氨基酸序列的片段是从此氨基酸序列氨基和/或羧基末端缺失一或多个氨基酸的多肽。在一实施方案中，所述片段包含至少150，或至少200，或至少250，或至少260，或至少280，或至少300，或至少320，或至少340，或至少360，或至少380，或至少390，或至少400，或至少410，或至少420，或至少430，或至少440，或至少450个氨基酸残基。

等位变体指占据相同染色体位点的基因的两或多个可选形式中的任一。等位变化通过突变自然出现，并且可导致种群内多态性(polymorphism)。基因突变可能是沉默的(所编码多肽无改变)或者可编码氨基酸序列改变的多肽。多肽的等位变体是基因等位变体所编码的多肽。

所述亲代肌醇六磷酸酶也可是上述任一氨基酸序列中的成熟部分。成熟部分指成熟的氨基酸序列并且指在已经剪切可能的信号肽部分后保留的氨基酸序列的那部分。

在另一实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶可以是上述肌醇六磷酸酶的变体，其包含一或多个氨基酸的取代，缺失，和/或插入。所述肌醇六磷酸酶变体的氨基酸序列可能不同于由于插入或缺失了一或多个氨基酸残基和/或用不同氨基酸残基取代一或多个氨基酸残基而特定的氨基酸序列。氨基酸变化优选性质次要(minor nature)的变化，即不显著影响所述蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小型(small)缺失，通常1到约30氨基酸；小型氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；至多约20-25残基的小接头(linker)肽；或通过改变净电荷或其他功能，如多组氨酸区(tract)，抗原表位或结合区来利于纯化的小型延伸。

保守取代的实施例在碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，及小(small)氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸)范围内。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域已知并在例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York中描述。最常出现的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/lle，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及这些的逆向方式。

微生物分类学(Taxonomy)

涉及分类学的问题可以通过参考分类数据库，如位于下述互联网址：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/的NCBI分类学浏览器，和/或通过参考分类学手册解决。本发明涉及的真菌分类的手册优选为Dictionary of the Fungi，9^th edition，Kirk，P.M.，P.F.Cannon，J.C.David & J.A.Stalpers编辑，CAB出版，2001。

合成的肌醇六磷酸酶，如共有的肌醇六磷酸酶，改组的肌醇六磷酸酶，或杂种的肌醇六磷酸酶可含有来自至少两种子囊菌肌醇六磷酸酶，至少两种担子菌肌醇六磷酸酶或来自至少一种子囊菌和至少一种担子菌肌醇六磷酸酶的部分氨基酸序列的组合。部分氨基酸序列所来自的这些子囊菌和担子菌肌醇六磷酸酶可为例如，任一本文所指的那些具体的肌醇六磷酸酶。

本文中，来自至少一个真菌的合成的肌醇六磷酸酶是真菌的肌醇六磷酸酶。另外，仅来自子囊菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是子囊菌肌醇六磷酸酶；并且仅来自担子菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是担子菌肌醇六磷酸酶。任何来自至少一种子囊菌肌醇六磷酸酶以及至少一种担子菌肌醇六磷酸酶的合成肌醇六磷酸酶可被命名为混合子囊菌/担子菌肌醇六磷酸酶。

命名隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶指来自隔孢伏革菌属的野生型肌醇六磷酸酶，包括其等位变体，片段或变体，或基于至少一种，优选至少两种隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，更优选只基于隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶制备的合成的肌醇六磷酸酶。隔孢伏革菌种的实施例为：Peniophora aurantiaca，灰隔孢伏革菌(P.cinerea)，P.decorticans，P.duplex，P.ericsonii，P.incarnate，P.lycii，P.meridionalis，裸隔孢伏革菌(P.nuda)，P.piceae，P.pini，P.pithya，P.polygonia，P.proxima，P.pseudo-pini，P.rufa，变色隔孢伏革菌(P.versicolor)，和被简单归类隔孢伏革菌的菌种。优选的种是Peniophora lycii。优选的菌株是Peniophoralycii CBS 686.96。

氨基酸同源性

本发明涉及具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2(下文“同源肌醇六磷酸酶”)有某种程度同一性的肌醇六磷酸酶。

本发明中，通过程序“align”，它是Needleman-Wunsch序列对比(即总体序列对比)来测定两氨基酸序列之间的同一性程度，以及两核苷酸序列之间的同一性程度。该程序可用于多肽，以及核苷酸序列的序列对比。所述缺省记分矩阵(matrix)BLOSUM50用于多肽序列对比，并且所述缺省同一性矩阵用于核苷酸序列对比。缺口的第一个残基的罚分对多肽是-12并且对核苷酸是-16。缺口的更多残基的罚分对多肽是-2，对核苷酸是-4。

“Align”是FASTA软件包版本v20u6(见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”，PNAS 85：2444-2448，及W.R.Pearson(1990)“Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA，”Methods in Enzymology 183：63-98)的一部分。FASTA蛋白质序列对比使用不限制缺口尺寸的Smith-Waterman算法(见“Smith-Waterman algorithm”，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。

在具体实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列与SEQ IDNO：2的同一性程度为至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％。

在另一具体实施方案中，这些同源的亲代肌醇六磷酸酶具有的氨基酸序列与所述特定的氨基酸序列差三十，二十五，二十二，二十一，二十，十九，十八，十七，十六，十五，十四，十三，十二，十一，十，九，八，七，六，五，四，三，二，或仅一个氨基酸。

所得变体肌醇六磷酸酶也与SEQ ID NO：2同源。在具体实施方案中，所述变体肌醇六磷酸酶含有或具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的同一性程度为至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约82％，或至少约85％，或至少约87％，或至少约90％，或至少约92％，或至少约95％，或至少约97％。

核酸杂交

可选的，同源的亲代肌醇六磷酸酶，以及变体肌醇六磷酸酶，可被定义为所述核酸序列所编码，该核酸序列在很低严格条件，优选低严格条件，更优选中度严格条件，更优选中高度严格条件，甚至更优选高度严格条件，而且最优选很高严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸49-1320，或其亚序列(subsequence)或互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，NewYork)。亚序列可为至少100个核苷酸，或至少200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，或至少1300个核苷酸。并且，所述亚序列可编码具有相关酶活性的多肽片段。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，从很低到很高的严格条件被限定为在42℃在5×SSPE，0.3％SDS，200pg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA，和25％甲酰胺(对于很低和低严格度)，35％甲酰胺(对于中度到中高度严格度)，或50％甲酰胺(对高度和很高严格度)中预杂交并杂交，之后是标准Southern印迹法步骤。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，最后洗涤所述载体物质3次，每次用2×SSC，0.2％SDS优选至少在45℃(很低严格度)，更优选至少在50℃(低严格度)，更优选至少在55℃(中严格度)，更优选至少在60℃(中高严格度)，甚至更优选至少在65℃(高严格度)，并最优选至少在70℃(很高严格度)洗涤15分钟。

对于长度约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，严格条件被限定为在低于使用根据Bolton和McCarthy的计算(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)所算出的T_m 5℃到10℃在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，以及每毫升0.2mg酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤，之后是标准Southern印迹法步骤。

对于长度约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，将所述载体物质用6×SCC加0.1％SDS洗涤15分钟一次，并用6×SSC在低于所计算的T_m 5℃到10℃洗涤15分钟各2次。

位置编号

本文用来限定氨基酸位置的命名基本如WO 99/49022所述，即参照来自Peniophora lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，除了本上下文的编号从WO 99/49022的图1所示的P_lycii序列S17开始。因此，本文所用的位置数与WO 99/49022的位置数相差16(见WO 99/49022第14页26行和图1)。由此可见，例如本文的S1等同于(equivalent to)WO 99/49022的S17，并且本文的F8等同于WO 99/49022的F24。

序列SEQ ID NO：2含有WO 99/49022的图6所示序列的氨基酸-14-409，对应其图1所示P_lycii序列的氨基酸16-439。

因此本上下文以从S1开始到E423终止的SEQ ID NO：2作为编号位置的基础。亲代肌醇六磷酸酶，以及变体肌醇六磷酸酶，可含有与SEQ ID NO：2相比的延伸(extension)，即在其N末端和/或C末端。如果存在延伸，此延伸的氨基酸将按本领域通常地来编号，即对于C末端延伸：424，425，426以此类推，而对于N末端延伸：-1，-2，-3以此类推。

改变，如取代，缺失，插入

本文中，下述为多种途径的实施例，其中至少理论上，即在文献(paper)中的肌醇六磷酸酶变体可来自亲代氨基酸序列：氨基酸可被另一氨基酸取代；可缺失氨基酸；可插入氨基酸；以及任何数量的这些改变的任何组合。

为本发明目的，术语取代指包括任何数量任何种类的此种改变。这是个合理限定，因为例如缺失可为氨基酸，AA，在已知位置nn为空白()取代。可命名此取代为：AAnn()。类推，仅在氨基酸，AA下游的已知位置nn插入一个氨基酸，BB，可被命名为：()nnaBB.并且如果将两个氨基酸，BB和CC在位置nn插入氨基酸AA的下游，可命名该取代(两个取代的结合)为：()nnaBB+()nnbCC，因此在亲代序列氨基酸nn和nn+1之间产生的所述缺口被指定小写(lower case)或脚标字母a、b、c等给前面的位置号，这里为nn。取代基之间的逗号(，)，如例如在A327S，F，I，L的取代中指“或”，即A327被S，或F，或I，或L取代。取代间的加号(+)，如例如在29S+125D+324A中的取代指“和”，即这三个单个取代在一个相同的肌醇六磷酸酶变体中组合。此限定氨基酸改变的命名也基本如WO 99/49022(见其16页)所述。

或者，在不同限定术语取代时，本发明涉及亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自本文所指的多组区域的至少一个位置的改变，其中所述改变在占据所述位置的氨基酸下游独立插入至少一个氨基酸；缺失占据所述位置的氨基酸；和/或用不同氨基酸取代占据所述位置的氨基酸；其中所述变体具有肌醇六磷酸酶活性，并且每个位置对应于具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的酶的氨基酸序列的一个位置，并且所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并附带如本文(d)所限。

本文中，术语“取代”指至少一个取代。至少一个指一或多个，例如一个，或两个，或三个，或四个，或五个，或六个，或七个，或八个，或九个，或十个，或十二个，或十四个，或十五个，或十六个，或十八个，或二十个，或二十二个，或二十四个，或二十五个，或二十八个，或三十个等等，以在大体上包括任何数量的取代。然而，本发明变体仍必须，例如与SEQ ID NO：2至少75％相同，此百分比是用上述程序测定的。可将所述取代应用到在权利要求1所提到的任何区域所包括的任何位置，并且也包括包含任何数量和种类此类取代的组合的变体。本文所用的取代也包括缺失以及延伸，或插入，其可增加对应于SEQ ID NO：2的所述序列的长度。在具体实施方案中，取代的数目最多为200，或175，或150，或125，或120，或110，或106，或105，或100，或90，或80，或70，或60，或50，或40，或30，或25。

而且，术语“取代”包括取代为其他十九个天然氨基酸中的任一个，或其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如在位置20氨基酸Q的取代包括下述取代中的每一个：20A，20C，20D，20E，20F，20G，20H，201，20K，20L，20M，20N，20P，20R，20S，20T，20V，20W，或20Y。附带地，这是名称20X的等效物(equivalent)，其中X指任何氨基酸。这些取代也能被命名为Q20A，Q20C，Q20X等。以此类推本文提到的每个位置，来具体包括任一本文的此类取代。

鉴定相应的位置编号

对于Peniophora lycii CBS 686.96的亲代肌醇六磷酸酶，所述位置编号涉及SEQ ID NO：2的编号。对于在另一肌醇六磷酸酶的已知位置，无论它是亲代还是变体肌醇六磷酸酶，总能在SEQ ID NO：2中发现对应位置。或者，在可选方案中，总能发现一个位置对应于包含(或具有)所述SEQ ID NO：2氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列上的一个位置。

将除了Peniophora lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶以外的亲代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，或反过来将(in turn)变体肌醇六磷酸酶的氨基酸序列命名为SEQ-X。发现对应SEQ ID NO：2的位置N的位置如下：亲代或变体肌醇六磷酸酶氨基酸序列SEQ-X与上面氨基酸同源性部分所述的SEQID NO：2序列比对。用下述原理，可以清楚无误地从所述序列对比得到序列SEQ-X上对应于SEQ ID NO：2的位置N的位置。

仅作为例子，参照WO 99/49022的图1，假设出于简单性(simplicity)，序列A_pediades，A_fumigatus或T_lanuginosus是例如已与我们假设对应于本文所述的SEQ ID NO：2的P_lycii肌醇六磷酸酶序列比对的变体肌醇六磷酸酶(为本发明目的它们应该与SEQ ID NO：2序列比对)：

问题1：A pediades的何位置对应于P_lycii的S17(为本发明目的，该位置被命名为S1)？该答案是：A15。

问题2：在命名为A_fumigatus的肌醇六磷酸酶的何位置对应于P_lycii的55b()(为本发明目的，该位置被命名为39b())？该答案是：S63。

问题3：A_pediades的何位置对应于P_lycii的L31(为本发明目的，该位置被命名为L15)？该答案是：()30d。

问题4：P_lycii的何取代对应于具有取代G3L的假设的(imaginative)T_lanuginosa肌醇六磷酸酶变体？该答案是：()-6L(为本发明目的，该取代被命名为()-22L)。

SEQ-X可以是所述(in question)肌醇六磷酸酶的成熟部分，或它也可包括信号肽部分，或它可以是所述具有肌醇六磷酸酶活性的成熟肌醇六磷酸酶的片段，例如SEQ ID NO：2相同长度的片段，或如本文所述与SEQ IDNO：2进行序列比对时从S1延伸到E423的片段。

区域和位置

本文中，术语区域指亲代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的至少一个位置，术语位置指此氨基酸序列的氨基酸残基。一实施方案中，区域指亲代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的一或多个连续位置，例如所述序列的一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个等等到任何数目的连续位置。因此，区域可仅由一个位置组成，或它可由任何数目的连续位置，如例如，位置37，38和39；或位置37，3 8，39，40和41；或位置37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47和48组成。为本发明目的，后三个区域分别被命名为37-39，37-41和37-48。这些区域或范围的边界都被包括在所述区域中。SEQ ID NO：2是优选的亲代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的实施例。

区域具体包括每个和每个它所包含(embrace)的位置。例如区域37-48具体包括所述位置37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47和48中的每个。以此类推应用到本文提到的其它区域。

热稳定性

为本发明目的，在某种多肽上下文所用的术语热稳定的涉及该多肽的熔解温度Tm，其通过在pH 5.5用差示扫描量热法(DSC)来测定：对于热稳定多肽，所述Tm为至少61℃。在具体实施方案中，所述Tm为至少62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100℃。

在可选方案中，所述术语热稳定涉及用DSC在pH 7.0测定的至少49℃，优选至少50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，或90℃的熔解温度。

在另一可选方案中，所述术语热稳定涉及用DSC在pH 3.0测定的至少51℃，优选至少52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，或90℃的熔解温度。

在另一可选方案中，所述术语热稳定涉及用DSC在pH 2.5测定的至少37℃，优选至少38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，77.5，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，或90℃的熔解温度。

为测定Tm，可使用通过SDS-PAGE测定纯度为至少90％(或91，92，93，94，95，96，97或98％)的多肽样本。另外，根据在吸光度280nm所测并且基于所述酶的氨基酸序列来计算的消光系数，所述酶样本浓度可为0.5-2.5mg/ml蛋白质(或0.6-2.4，或0.7-2.2，或0.8-2.0mg/ml蛋白质)。

在所需pH(例如pH 5.5，7.0，3.0或2.5)并以恒定加热速度，例如1，1.5，2，3，4，5，6，7，8，9或10℃/min进行DSC。适宜缓冲液的实施例如实验部分所述。在使用如本文实施例2所述的设备时优选加热速度的实施例是1.0，1.5或2.0℃/min。对于其他样品体积较小的其他类型的仪器来说，可用例如3，4，5，6，7，8，9或甚至10℃/min的加热速度来得到对Tm的可靠估计。

在具体实施方案中，本发明所述肌醇六磷酸酶变体比所述亲代肌醇六磷酸酶更加热稳定。此目的优选的亲代肌醇六磷酸酶是Peniophora lycii CBS686.96肌醇六磷酸酶。

比活性

术语比活性高，增高或提高指用同种方法测定，比活性是亲代肌醇六磷酸酶比活性的至少105％。在具体实施方案中，相对比活性为用同种方法测定为所述亲代肌醇六磷酸酶比活性的至少110，115，120，125，130，140，145，150，160，170，180，190，200，220，240，260，280，300，350或甚至400％。

或者可选，术语高比活性指比活性为至少200 FYT/mg酶蛋白质(EP)。在具体实施方案中，所述比活性为至少300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900或3000FYT/mg EP。

用高纯度样品测定比活性(SDS聚丙烯酰胺凝胶应该显示存在只有一种成分)。所述酶蛋白质浓度应通过氨基酸分析测定，并且所述肌醇六磷酸酶活性单位为FYT。比活性是所述特定肌醇六磷酸酶变体的性质，它通过每mg酶肌醇六磷酸变体酶蛋白质以单位FYT测定的肌醇六磷酸酶活性来计算。

更多细节见实施例3。

本发明所述肌醇六磷酸酶变体为热稳定的和/或比活性高。在具体实施方案中它是热稳定的。在另一具体实施方案中它的比活性高。在第三种具体实施方案中它是热稳定的，并且比活性高。在其它具体实施方案中(a)它比亲代肌醇六磷酸酶热稳定；(b)比亲代肌醇六磷酸酶比活性高；或(c)比亲代肌醇六磷酸酶热稳定并且比活性高。

低变应原(Low-allergenic)变体

具体实施方案中，本发明所述肌醇六磷酸酶变体(也)是低变应原变体，它被设计用来引发(invoke)与动物，包括人接触后下降的免疫应答。可理解术语免疫应答为由接触该肌醇六磷酸酶变体的动物免疫系统引起的任何反应。一种免疫应答是在接触动物内的造成IgE水平升高的变应原反应。低变应原变体可用本领域已知技术制备。例如所述肌醇六磷酸酶变体可与屏蔽(shielding)参与免疫应答的所述肌醇六磷酸酶变体的部分或表位的聚合物部分(moieties)偶联。与聚合物偶联可能涉及聚合物与所述肌醇六磷酸酶变体的体外化学偶连，例如如WO96/17929，WO98/30682，WO98/35026，和/或WO99/00489所述。偶连还可或另外可替换地涉及聚合物与所述肌醇六磷酸酶变体的体内偶连。实现该偶连可通过编码所述肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列的遗传工程化，在所述肌醇六磷酸酶变体中插入编码附加糖基化位点的共有序列，并在能够糖基化所述肌醇六磷酸酶变体的宿主表达此肌醇六磷酸酶变体，见例如WO 00/26354。另一种提供低变应原变体的方法是遗传工程化编码所述肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列从而造成所述肌醇六磷酸酶变体自身-寡聚体化(self-oligomerize)，结果为肌醇六磷酸酶变体单体可屏蔽其它肌醇六磷酸酶变体单体的表位并因而降低所述寡聚体的抗原性。该产物及它们的制备物例如见WO 96/16177所述。参与免疫应答的表位可用多种方法鉴定如WO 00/26230和WO 01/83559所述的噬菌体展示方法，或EP561907所述的随机途径。一旦鉴定了表位，就可改变其氨基酸序列来生产免疫性质改变的所述肌醇六磷酸酶变体，它所用的是已知基因操纵技术如定点诱变(见例如WO 00/26230，WO 00/26354和/或WO 00/22103)和/或可足够接近所述聚合物的表位来进行聚合物偶连以屏蔽该表位。

核酸序列和构建体

本发明也涉及包含编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的核酸序列。

术语“分离的核酸序列”指基本无其他核酸序列的核酸序列，例如，通过琼脂糖凝胶电泳测定纯度至少约20％，优选纯度至少约40％，更优选纯度至少约60％，甚至更优选纯度至少约80％，并且最优选纯度至少约90％。例如可通过遗传工程中应用的标准克隆方法，以将所述核酸序列从其天然位置重新定位到它将被复制的不同位置而获得分离的核酸序列。所述克隆方法可涉及剪切分离包含编码所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，将所述片段插入载体分子，并将所述重组载体并入复制所述核酸序列的多拷贝或克隆的宿主细胞。所述核酸序列可来自基因组，cDNA，RNA，半合成的，合成的来源，或其任何组合。

制备本发明核酸序列可通过向亲代肌醇六磷酸酶编码序列或其亚序列引入至少一个突变，其中所述突变核酸序列编码变体肌醇六磷酸酶。向所述核酸序列引入突变来将一个核苷酸变换为另一个核苷酸，这可用任一本领域已知方法通过定点诱变，例如通过定点诱变，通过随机诱变，或通过掺杂(doped)，掺入(spiked)，或定域(localized)随机诱变来完成。

随机诱变适合作为定域或区域特异的随机诱变来操作，所述的诱变位于翻译成所述氨基酸序列的基因的至少三个部分，或在整个基因内。当用寡核苷酸进行所述诱变时，在待改变位置上合成所述寡核苷酸的过程中可将三个非-亲代核苷酸掺杂或掺入所述寡核苷酸。可进行掺杂或掺入以避免不必需氨基酸的密码子。可将所述掺杂或掺入的寡核苷酸并入如编码所述肌醇六磷酸酶的DNA，通过应用认为合适的例如，PCR，LCR或任何DNA聚合酶和连接酶的任何技术。

优选，用“恒定(constant)随机掺杂”进行所述掺杂，其中每个位置的野生型和突变的百分比都被预先限定。并且，该掺杂可针对引入某种核苷酸的偏好，并进而优先引入一或多个特定氨基酸残基。可进行掺杂，例如，从而在每个位置允许引入90％野生型和10％突变。选择掺杂方案时另外的考虑是基于遗传和蛋白质-结构限制因素。

所述随机诱变可有利位于所述亲代肌醇六磷酸酶的一部分。当所述酶的某些区域已经被鉴定为对所述酶的给定性质特别重要时，这，例如可以是有利的。

提供本发明变体的可选方法包括例如，如WO95/22625或WO96/00343所述的基因改组，和如EP 897985所述的共有衍生(consensus derivation)方法。

核酸构建体

核酸构建体含有本发明核酸序列，其可操纵连接到一或多个控制序列，所述控制序列在与所述控制序列相容的情况下在合适宿主细胞中指导(direct)所述编码序列的表达。表达将被理解为包括任何涉及生产所述多肽的方法，包括但不限于转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰和分泌。

表达载体

编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列可使用表达载体表达，所述的表达载体通常包括编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号和可选抑制子基因或多种激活子(activator)基因的控制序列。

所述携带编码本发明葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)变体的DNA序列的重组表达载体可以为任何载体，其可方便地用重组DNA方法处理，并且选择载体通常依赖于它所引入的宿主细胞。此载体可以在引入宿主细胞时整合到所述宿主细胞基因组并与它所整合到的染色体一起复制。

所述肌醇六磷酸酶变体也可与至少一种动物饲料所需的其它酶共表达，如木聚糖酶，内切葡聚糖酶(endoglucanase)，内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(endo-1，3(4)-beta-glucanase)，和/或蛋白酶。该酶可从不同载体，从一个载体，或混合使用两种技术共表达。当用不同载体时，该载体可有不同选择性标记和不同的复制起点。当只使用一种载体时，该基因可从一或多个启动子表达。如果在单启动子(二或多顺反子)调节下克隆，所述基因克隆的顺序会影响所述蛋白质的表达水平。所述肌醇六磷酸酶变体也可作为融合蛋白质表达，即编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因已经按读码框融合到编码其他蛋白质的基因。此蛋白质可以是另一种酶或来自其它酶的功能域。

宿主细胞

本发明也涉及重组宿主细胞，包含在多肽重组生产中有利使用的本发明核酸序列。包含本发明核酸序列的载体是引入宿主细胞所以保持所述载体作为染色体整合体或自身复制染色体外载体。术语“宿主细胞”包括任何由于复制过程中出现突变而不等同于亲代细胞的亲代细胞后代。选择宿主细胞很大程度上依赖于编码所述多肽的基因及其来源。

所述宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核细胞，或非单细胞微生物，例如，真核细胞如动物，哺乳动物，昆虫，植物，或真菌细胞。优选动物细胞是非人动物细胞。

在优选实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞，或酵母细胞，如念珠菌属(Candida)，汉森氏酵母属(Hansenula)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母菌属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或西洋蓍霉(Yarrowia)细胞。所述真菌的宿主细胞可以是丝状真菌细胞，如一种细胞，包括但不限于，枝顶孢属(Acremonium)，曲霉属(Aspergillus)，镰孢菌属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，毛霉属(Mucor)，Myceliophthora，链孢霉属(Neurospora)，青霉菌属，梭孢壳属(Thielavia)，Tolypocladium，或木霉属(Trichoderma)。

可用的单细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)细胞，或链霉菌细胞，或乳酸细菌细胞；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas sp)。乳酸细菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)，乳酸杆菌属(Lactobacillus)，白联珠菌属(Leuconostoc)，链球菌属，片球菌属(Pediococcus)，和肠球菌属(Enterococcus)的菌种。

生产方法

本发明也涉及生产本发明肌醇六磷酸酶的方法包含(a)在有助于生产所述肌醇六磷酸酶变体条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶变体。

本发明生产方法中，在适合生产所述多肽的营养培养基中用本领域已知方法培养所述细胞。例如可在合适培养基中，在允许所述多肽表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐里用摇瓶培养，小规模或大规模发酵(包括连续，分批(batch)，补料分批(fed-batch)，或固态(solid state)发酵)培养所述细胞。所述培养在包含碳和氮源和无机盐的合适营养培养基，用本领域已知方法进行。合适培养基可商购或可根据公开组分(例如，见美国典型培养物保藏中心的目录)来制备。如果所述肌醇六磷酸酶分泌入所述营养培养基，可从所述培养基直接回收它。如其为不分泌型，可从细胞裂解物回收它。

所得肌醇六磷酸酶可用本领域已知方法回收。例如可用常用方法从营养培养基回收它，所述方法包括但不限于，离心，过滤，提取，喷雾干燥(spray-drying)，蒸发，或沉淀。

本发明肌醇六磷酸酶可用多种本领域已知方法纯化，所述方法包括但不限于，层析(chromatography)(例如，离子交换，亲和，疏水，色谱聚焦(chromatofocusing)，和尺寸排阻(size exclusion))，电泳方法(例如，制备等电聚焦)，差别溶解度(differential solubility)(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE，或提取法(见例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明也涉及用编码具有本发明肌醇六磷酸酶活性多肽的核酸序列转化的转基因植物，植物部分，或植物细胞从而表达和产生回收量(recoverablequantities)的所述多肽。所述多肽可从植物或植物部分回收。或者，含有所述重组多肽的植物或植物部分可被如此应用来提高食物或饲料的质量，例如，提高营养价值，可口性(palatability)和流变学(rheological)性质，或破坏抗营养(antinutritive)因子。

在具体实施方案中，所述多肽靶向种子中的胚乳贮藏泡(endospermstorage vacuoles)。可以通过合成带有合适信号肽的前体来得到它，见Horvath等PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。

所述转基因植物可为双子叶植物或单子叶植物或其工程化变体。单子叶植物实施例为草，如草地早熟禾(meadow grass)(莓系牧草(blue grass)，Poa)，牧草(forage grass)如羊茅属(festuca)，黑麦草属(lolium)，温带草(temperategrass)，如禾草属(Agrostis)，和谷物，例如，小麦，燕麦，黑麦(rye)，大麦，稻，高粱(sorghum)，和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实施例为烟草，豆类(legume)，如羽扇豆(lupin)，马铃薯，甜菜，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)，和十字花科植物(十字花(Brassicaceae)科)，如花椰菜，油菜籽，和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。例如美国专利5,689,054和美国专利6,111,168所述的低肌醇六磷酸盐植物是工程化植物的实施例。植物部分的实施例是茎，愈伤组织(callus)，叶，根，果实，种子和块茎。特定植物组织如叶绿体，质外体，线粒体，液泡，过氧化物酶体和胞质也被认为是植物部分。并且，任何植物细胞，无论来源于何种组织都被认为是植物部分。

本发明范围也包括此种植物，植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知方法构建。简言之，构建所述植物或植物细胞是通过引入一或多个编码本发明多肽的表达构建体到植物宿主基因组并将所得被修饰植物或植物细胞增殖(propagate)到转基因植物或植物细胞。

方便地，所述表达构建体为含有编码本发明多肽的核酸序列的核酸构建体，其可操纵地连接到在优选的植物或植物部分表达所述核酸序列所需的合适调控序列。并且，所述表达构建体可含有用于鉴定已整合入表达构建体的宿主细胞和将所述构建体引入所述植物所必要的DNA序列(后者依赖于所用的DNA引入方法)的选择性标记。

例如基于需要表达所述多肽的时间地点和方式来确定调控序列的选择，如启动子和终止子序列及可选信号或运输(transit)序列。例如，编码本发明多肽的基因表达可以是组成型的(constitutive)或诱导型的(inducible)，或可以是发育特异性的(developmental)，阶段特异性的(stage)或组织特异性的，并且所述基因产物可以靶向特定组织或植物部分如种子或叶子。调控序列，例如见Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成型表达，可用所述35S-CaMV启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294)。器官特异性启动子可为，例如来自储藏(storage)累积(sink)组织如种子，马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢累积组织如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子如来自稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆(Vicia faba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白质基因(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)，来自种子油(oil)体蛋白质(body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant andCell Physiology 39：935-941)，来自Brassica napus的贮藏蛋白质napA启动子，或任何其它本领域已知的种子特异性启动子，例如，如WO 91/14772所述。另外，所述启动子可以是叶子特异性启动子如来自稻或西红柿的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra and Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或创伤诱发(woundinducible)启动子如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology22：573-588)。

也可用启动子增强子元件来使所述酶在植物中较高表达。例如，所述启动子增强子元件可为位于所述启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等，1993，见上文公开了稻肌动蛋白1基因的首个内含子在增强表达中的用途。

又及，所述密码子用途可根据所述植物种最优化来提高表达(参照上面Horvath等)。

所述表达构建体的可选标记基因和任何其它部分可从本领域选择。

根据本领域常用技术将所述核酸构建体整合入所述植物基因组，包括土壤杆菌-介导的转化，病毒-介导的转化，显微注射，粒子轰击，基因枪(biolistic)转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Biol/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。

现在根癌土壤杆菌-介导的基因转移是产生转基因双子叶植物的优选方法(综述可见Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)。然而它也可用于转化单子叶植物，尽管其它转化方法通常对于这些植物优选。现在产生转基因单子叶植物优选方法是胚胎愈伤组织或发育中胚芽的粒子轰击(用转化DNA包被的显微金或钨粒子)(Christou，1992，PlantJournal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的替代方法是基于如Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所述的原生质体转化。

根据本领域熟知方法在转化后，选择已引入了表达构建体的转化体并再生(regenerate)入完整植物。

本发明也涉及生产本发明多肽的方法，其包含(a)在有助于生产所述肌醇六磷酸酶变体的条件下，培养包含编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶变体。

作为表达宿主的动物

本发明也涉及转基因，非人动物，和其产物或元件，其实施例是体液如奶和血，器官，肉和动物细胞。表达蛋白质的技术，例如在哺乳动物细胞中在本领域已知，见例如手册Protein Expression：A Practical Approach，Higginsand Hames(eds)，Oxford University Press(1999)及三本其他的系列手册涉及基因转录，RNA加工作用，和翻译后加工作用。通常制备转基因动物，用编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列转化选定动物的选定细胞从而表达并产生该肌醇六磷酸酶变体。可从所述动物，例如从雌性动物的奶回收所述肌醇六磷酸酶变体，或可能其表达对动物自身有利，例如辅助动物的消化。动物的实施例将在下述标题为动物饲料和动物饲料添加剂的部分提及。

为产生为从该动物的奶回收所述肌醇六磷酸酶变体的转基因动物，可将编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因插入所述动物的受精卵，例如通过使用含有合适奶蛋白质启动子的转基因表达载体，及编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因。将所述转基因表达载体显微注射到受精卵，并优选永久整合到所述染色体。一旦所述卵开始生长并分裂，将所述可能的(potential)胚胎植入替代(surrogate)母体，并鉴定出携带所述转基因的动物。然后可用常用饲养方法(breeding)繁殖所得动物。可从所述动物的奶纯化肌醇六磷酸酶变体，见例如Meade，H.M.等(1999)：Expression of Recombinant Proteins in the milkof transgenic animal，Gene Expression systems：Using nature for the art ofExpression.J.M.Fernandez and J.P.Hoeffler(eds.)，Academic Press。

或者，为产生在其体细胞和/或生殖细胞基因组中携带核酸序列的转基因非人动物，该核酸序列包括的异源转基因构建体包括编码所述肌醇六磷酸酶变体的转基因，可将所述转基因可操作连接到首个调控序列用于唾液腺来特异性表达所述肌醇六磷酸酶变体，如WO 2000064247所公开。

动物饲料和动物饲料添加剂

为本文目的，术语动物包括所有动物，包括人。在具体实施方案中，所述肌醇六磷酸酶变体和本发明组合物可用作非人动物的饲料添加剂。动物实施例为非反刍动物和反刍动物，如牛，羊和马。在具体实施方案中，所述动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃的(mono-gastric)动物，例如猪(包括但不限于小猪，生长(growing)猪和母猪)；家禽如火鸡和鸡(包括但不限于肉用仔鸡(broiler chicks)，下蛋的母鸡)；小牛犊；和鱼(包括但不限于鲑鱼)。

术语饲料或饲料组合物指任何适合或为了动物摄入的化合物，制备物，混合物，或组合物。将所述饲料喂给动物可在进食之前，之后或同时。优选后者。

本发明组合物，在为了添加到动物饲料中时，可被称为动物饲料添加剂。此添加剂常含有所述的肌醇六磷酸酶变体，优选以稳定(stabilized)液体或干燥组合物的形式。所述添加剂可含有其他动物饲料的组分或成分。所述动物饲料的预混合物(pre-mix)为此动物饲料添加剂的具体实施例。预混合物可含有所述的酶，及另外至少一种维生素和/或至少一种矿物质。

因此，在具体实施方案中，除了多肽组分，本发明组合物可含有或包含至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质。也可包括至少一种常量(macro)矿物质。

脂肪可溶性维生素的实施例是维生素A，维生素D3，维生素E，和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实施例是维生素B12，生物素和胆碱，维生素B1，维生素B2，维生素B6，维生素PP(niacin)，叶酸和泛酸盐(panthothenate)，例如D-泛酸钙。

痕量矿物质的实施例是锰，锌，铁，铜，碘，硒和钴。

常量矿物质的实施例是钙，磷和钠。

另外，可选的饲料添加成分是着色剂(colouring agents)，芳香化合物，稳定剂，附加酶，和抗微生物肽。

本发明组合物的附加酶成分包括至少一种具有木聚糖酶活性的多肽；和/或至少一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一种具有内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一种具有蛋白酶活性的多肽。

可用任何试验测定木聚糖酶活性，其中所用底物包括木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷内部连接(endo-linkage)。可得到用于测定木聚糖酶活性的不同类型的底物，例如Xylazyme交联的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)片剂(来自MegaZyme)，或偶氮(azo)-染色的阿拉伯木聚糖的不可溶粉末分散体(dispersion)和溶液。

可用任何本领域已知内切葡聚糖酶试验测定内切葡聚糖酶活性。例如可用多种含纤维素或β-葡聚糖的底物。内切葡聚糖酶试验可用AZCL-大麦β-葡聚糖，或优选(1)AZCL-HE-纤维素，或(2)偶氮-CM-纤维素作为底物。在两种情况，所述底物降解后在OD595分光光度计测量(见对于AZCL-多糖用于内(endo)-水解酶试验在http://www.megazyme.com/booklets/AZCLPOL.pdf的Megazyme方法)。

可用任何本领域已知的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶试验测定内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。测定内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的优选底物是交联的偶氮染色的β-葡聚糖大麦底物，其中所述测定是基于分光光度计测量的测定原理。

可用任何试验测定蛋白酶活性，其中所用底物包括与所述蛋白酶特异性有关的肽键。蛋白酶底物的实施例是酪蛋白，和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(例如购自Sigma S-7388)。另一实施例是ProtazymeAK(Megazyme T-PRAK制备为片剂的天青精(azurine)染色的交联酪蛋白)。WO 01/58276的实施例2描述了适合的蛋白酶试验。优选试验为实施例2D的Protazyme试验(如上通常所述按所述蛋白酶调节所述pH和温度)。

为试验木聚糖酶，内切葡聚糖酶，β-1，3(4)-葡聚糖酶和蛋白酶的活性，按所述酶调节试验pH和试验温度(优选接近最适pH的pH，和接近最适温度的温度)。优选试验pH在2-10，优选3-9的范围，更优选pH 3或4或5或6或7或8，例如pH 3或pH 7。优选试验温度在20-80℃，优选30-80℃，更优选40-75℃，甚至更优选40-60℃的范围，优选40或45或50℃。参照合适遮蔽物(blind)，例如缓冲遮蔽物限定所述酶活性。

抗微生物肽实施例(AMP′s)是CAP18，亮杀菌素A(Leucocin A)，Tritrpticin，内源性抗微生物多肽-1(Protegrin-1)，Thanatin，乳铁蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer，2000)，及其保留抗微生物活性的变体或片段。其他实施例是抗真菌的多肽(AFP′s)，如来自巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的那些多肽，及其保留抗真菌活性的变体和片段，见WO 94/01459和PCT/DK02/00289所公开。

在具体实施方案中，本发明动物饲料添加剂预期以0.0010-12.0％，或0.0050-11.0％，或0.0100-10.0％；更特别0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指每100克饲料中的克添加剂)的水平包括(或处方认为必须包括的)在动物饮食或饲料中。对于预混合物特别是这种情况。

因此，通过乘以同种组分在最终饲料内(in-feed)的浓度，分别为10-10000；20-2000；或100-500(指上述三个百分比所包括的间隔)可得到所述动物饲料添加剂，例如所述预混合物的单组分浓度。

重要饲料组分的最终饲料内浓度可反映所述动物的营养需要，其通常为有经验的营养学家所知，并且在如下公开文献中提供：NRC，Nutrientrequirements in swine，ninth revised edition 1988，subcommittee on swinenutrition，committee on aminal nutrition，board of agriculture，national researchcouncil.National Academy Press，Washington，D.C.1988；和NRC，Nutrientrequirements of poultry，ninth revised edition 1994，subcommittee on poultrynutrition，committee on aminal nutrition，board of agriculture，national researchcouncil，National Academy Press，Washington，D.C.，1994。

所述肌醇六磷酸酶变体当然应该以有效量，即以足以提高所述饲料营养价值的量应用到动物饲料中。现在预期它以下述剂量范围给药：0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10-所有这些范围均以每千克饲料毫克酶蛋白质(ppm)表示。

为测定每千克饲料或饲料添加剂的毫克肌醇六磷酸酶蛋白质，从所述饲料组合物或所述饲料添加剂纯化所述酶，并且用相关试验测定所述纯化酶的比活性。也用相同试验测定所述饲料组合物或所述饲料添加剂的肌醇六磷酸酶活性，并且基于这两项测定，计算每千克饲料的毫克肌醇六磷酸酶蛋白质剂量。

当然，如果存在用于制备所述饲料添加剂或所述饲料的肌醇六磷酸酶变体样品，就从此样品测定比活性(不需要从所述饲料组合物或添加剂纯化该酶)。

可根据本领域已知方法制备本发明组合物，例如通过将所述肌醇六磷酸酶变体与附加成分(如果有)混合。

动物饲料组合物或饮食的蛋白质含量相对较高。根据本发明的动物饲料组合物具有的粗制(crude)蛋白质含量为50-800，或75-700，或100-600，或110-500，或120-490g/kg，并还含有本发明组合物。

另外，或可替换地(对于上述粗制蛋白质的含量)，本发明动物饲料组合物代谢能量(metabolisable energy)含量为10-30，或11-28，或11-26，或12-25MJ/kg；和/或钙含量为0.1-200，或0.5-150，或1-100，或4-50g/kg；和/或可利用的(available)磷含量为0.1-200，或0.5-150，或1-100，或1-50，或1-25g/kg；和/或甲硫氨酸含量为0.1-100，或0.5-75，或1-50，或1-30g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸含量为0.1-150，或0.5-125，或1-80g/kg；和/或赖氨酸含量为0.5-50，或0.5-40，或1-30g/kg。

粗制蛋白质以氮(N)乘因子6.25来计算，即如Animal Nutrition，4^th edition，Chapter 13(Eds.P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh，LongmanScientific and Technical，1988，ISBN 0-582-40903-9)所述，粗制蛋白质(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。此氮含量可用凯氏(Kjeldahl)方法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethods of Analysis14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)测定。而且可用其他方法，如所谓的Dumas方法，在该法中所述样品在氧中燃烧并将所形成的氮气量作为氮来分析并重新计算。

计算代谢能量可基于NRC publication Nutrient Requirements of Swine(1988)pp.2-6，和the European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DA Beekbergen，TheNetherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5。

在一具体实施方案中，本发明所述动物饲料组合物包含至少一种植物蛋白质或蛋白质源。植物蛋白质或蛋白质源的实施例为来自豆科(leguminosae)和芥科(brassica)的大豆，豌豆和油菜籽，以及谷物如大麦，玉蜀黍(玉米)，燕麦，稻，黑麦，高粱和小麦。

在另一具体实施方案中，本发明所述动物饲料组合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉(meal)；和/或0-10％鱼粉(fish meal)；和/或0-20％乳清。

动物饮食可以例如被生产为糊状(mash)饲料(无颗粒(non-pelleted))或颗粒饲料。通常，混合所碾磨的(milled)饲料-原料(stuff)并根据所述种类的说明书来添加足够量的必需维生素和矿物质。

本发明所述肌醇六磷酸酶变体可以固体或液体酶制剂的形式，或饲料添加剂的形式，如预混合物来添加。通常在混合步骤前或之中添加固体组合物；并且通常在造粒(pellet)步骤后添加液体组合物。

当将本发明所述肌醇六磷酸酶变体添加到动物饲料时，会导致所述饲料的营养价值提高，例如所述动物的生产率(growth rate)和/或体重增加和/或饲料转化(conversion)(即摄取饲料重量相对体重增加)提高。这些结果可以反过来由于一或多个下述作用：所述肌醇六磷酸的磷酸盐部分螯合二价和三价阳离子如金属离子，即必需营养离子钙，铁，锌和镁以及所述痕量矿物质锰，铜和钼。除外，所述肌醇六磷酸也在某种程度上通过静电作用结合蛋白质。在所述蛋白质等电点，pI以下的pH时，带正电荷的蛋白质直接结合所述肌醇六磷酸盐。在pI以上的pH时，带负电荷的蛋白质通过金属离子结合到肌醇六磷酸盐。肌醇六磷酸及其盐，肌醇六磷酸盐通常不会被代谢(metabolized)，因为它们不从胃肠系统吸收，即从其中的磷，所述螯合金属离子，和所结合的蛋白质营养上都不可利用(nutritionally available)。因此，因为磷是所有有机体生长的必需元素，食物和饲料制剂需要补充无机磷酸盐。通常也必须补充营养必需离子如铁和钙。并且另外，因为通过肌醇六磷酸结合了蛋白质，已知饮食的营养价值降低。

在具体实施方案中所述体重增加为所述对照的至少101，102，103，104，105，106，107，108，109，或至少110％(无酶添加)。

在另一具体实施方案中所述饲料转化为与所述对照相比最多(或不超过)99，98，97，96，95，94，93，92，91或最多90％(无酶添加)。

所述本发明组合物也可体外使用，例如来处理植物蛋白质。本文所用的术语植物蛋白质涉及任何化合物，组合物，制剂或混合物，其包括至少一个衍生自或来自植物的蛋白质，包括修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在具体实施方案中所述植物蛋白质的蛋白质含量为至少10，20，30，40，50，或60％(w/w)。

植物蛋白质或蛋白质源的实施例为谷物如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉蜀黍(玉米)，稻和蜀黍。其它实施例为来自豆科和芥科的大豆粉，豌豆和油菜籽粉。

所述植物蛋白质或蛋白质源通常在溶剂，例如水性溶剂如水中悬浮，并由所述肌醇六磷酸酶变体及附加酶(如果有)的性质适当注意调节所述pH和温度值。继续所述酶反应直到达到所需效果，之后可通过灭活所述酶，例如通过热处理步骤，来使反应可能停止或可能不停止。

在本发明处理方法的另一具体实施方案，维持所述酶作用指，例如将所述酶组合物加入植物蛋白质或蛋白质源，但如此来说所述酶活性不被改变(switched)直到后面，一旦建立适当的反应条件，或一旦灭活任何酶抑制物，或无论应用什么其他途径来推迟所述酶的作用所需要时。

产生肌醇六磷酸酶变体的方法

另一方面，本发明涉及产生亲代肌醇六磷酸酶的变体的方法，其中所述变体比所述亲代肌醇六磷酸酶热稳定性和/或比活性更高，所述方法包含：

(d)随机诱变编码所述亲代肌醇六磷酸酶的DNA序列；

(e)在宿主细胞中表达在步骤(d)中获得的所述突变DNA序列，和

(f)筛选表达肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该变体比所述亲代肌醇六磷酸酶热稳定性和/或比活性更高。

本发明上述方法的步骤(d)如实验部分所述，优选用掺杂引物(dopedprimer)进行。

在优选实施方案中，上述方法包括下述在上述步骤(d)-(f)前的附加步骤：

(a)建立亲代肌醇六磷酸酶的3D结构；

(b)在升高的温度下对(a)的3D结构进行MD模拟；

(c)鉴定在所述高流动性(各向同性波动)亲代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列中的区域并建议随机诱变这些，其中至少一个步骤(c)中鉴定的区域在步骤(d)中被靶向(targeted)。

所述(a)的结构可用同源建模(modelling)建立。优选模型是图1的结构。

高温的实施例是一或多个下述温度：300K，350K，400K，450K，500K，和550K。

本发明这方面，所述亲代肌醇六磷酸酶可以是野生型亲代肌醇六磷酸酶，或其等位变体，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，或其成熟部分，或其变体，或在其基础上设计的遗传工程化或合成的多肽。下述为优选野生型亲代肌醇六磷酸酶的实施例：真菌的肌醇六磷酸酶，如丝状真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶实施例是US 5830732所述的许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)肌醇六磷酸酶。丝状真菌的肌醇六磷酸酶实施例是来自子囊菌门或担子菌门的肌醇六磷酸酶(分别为子囊菌肌醇六磷酸酶，或担子菌肌醇六磷酸酶)。子囊菌肌醇六磷酸酶实施例是那些来自曲霉属的菌株，例如泡盛曲霉PHYA(SWISSPROT P34753，Gene 133：55-62(1993))，黑曲霉(无花果曲霉)PHYA(SWISSPROT P34752，EP420358，Gene 127：87-94(1993))，泡盛曲霉PHYB(SWISSPROT P34755，Gene 133：55-62(1993))，黑曲霉PHYB(SWISSPROT P34754，Biochem.Biophys.Res.Commun.195：53-57(1993))；或翘孢霉属的菌株，例如构巢裸孢壳PHYB(SWISSPROT 000093，Biochim.Biophys.Acta 1353：217-223(1997))；或嗜热霉属(腐质霉属)的菌株，例如WO 97/35017所述的细毛嗜热霉肌醇六磷酸酶。其他子囊菌肌醇六磷酸酶的实施例公开在EP 684313(例如来自烟曲霉，土曲霉，和嗜热毁丝霉的菌株；JP 11000164(来自青霉菌属菌株的肌醇六磷酸酶)；US 6139902(来自曲霉菌株的肌醇六磷酸酶)，及WO 98/13480(Monascus anka肌醇六磷酸酶)中。担子菌肌醇六磷酸酶的实施例是所述来自卷边桩菇(Paxillus involutus)，绒毛栓菌(Trametes pubescens)，Agrocybepediades和Peniophora lycii(见WO 98/28409)的肌醇六磷酸酶。

也为本发明这方面的目的，最优选所述担子菌肌醇六磷酸酶，并且很优选的亲代肌醇六磷酸酶是来自Peniphora lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶(以及上面通常所述的其等位变体，片段等，以及同源肌醇六磷酸酶)。

也为本发明这方面的目的，WO 00/43503的下述肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸酶序列是优选合成的亲代肌醇六磷酸酶的实施例：SEQ ID NO：22(担子(basidio)共有)，SEQ ID NO：24(共有肌醇六磷酸酶-10的成熟部分)；SEQ IDNO：26(共有肌醇六磷酸酶-10)；SEQ ID NO：27(共有肌醇六磷酸酶-11)，SEQID NO：31(共有肌醇六磷酸酶-10-热(thermo)(3)-Q50T-K91A)，SEQ ID NO：36(共有肌醇六磷酸酶-12)，SEQ ID NO：91(共有肌醇六磷酸酶-3-热(11)-Q50T)，SEQ ID NO：93(共有肌醇六磷酸酶-3-热(11)-Q50T-K91A)，SEQIDNO：95(共有肌醇六磷酸酶-10-热(5)-Q50T)；和SEQ ID NO：97(共有肌醇六磷酸酶-10-热(5)-Q50T-K91A)，共有肌醇六磷酸酶-10-热(3)，共有-肌醇六磷酸酶-10-热(3)-Q50T，共有-肌醇六磷酸酶-10-热(3)-K91A，共有肌醇六磷酸酶-10-热(3)的氨基酸27-467，共有肌醇六磷酸酶-10-热(3)-Q50T的氨基酸27-467，共有肌醇六磷酸酶-10-热(3)-K91A的氨基酸27-467。

其他优选合成的亲代肌醇六磷酸酶的实施例是：在EP 897010公开的烟曲霉肌醇六磷酸酶变体，在EP 897985公开的真菌的共有肌醇六磷酸酶及其变体，在WO 00/43503公开的烟曲霉肌醇六磷酸酶变体，和命名为共有肌醇六磷酸酶-7的肌醇六磷酸酶，以及共有肌醇六磷酸酶-1的变体。

筛选热稳定的肌醇六磷酸酶变体的优选方法是实施例1所述的初次(primary)筛选：在适宜固体培养基(例如SC-葡萄糖平板)培养候选菌落(例如酵母文库)适当的时间(例如30℃3天)，用硝化滤膜(filter)将平板复制到新平板，温育适当时间(例如30℃1天)，在适宜pH(例如pH 5.5和53℃)将滤膜转移到预热的肌醇六磷酸钠平板，在升高的温度温育适当的时间(例如在53℃过夜)，移去(remove)滤膜，并倒入含Ca离子的溶液(例如0.5M CaCl₂溶液)，选出比所述亲代肌醇六磷酸酶具有更大的清楚边界(clearing zones)菌落。

另一优选筛选方法是如实施例1所述的二次(secondary)筛选(浸没(submerse)培养，建立上清的肌醇六磷酸酶活性对比温度的曲线，选择比所述亲代肌醇六磷酸酶操作更好的候选(在较高温度活性越高越好))。对这两个实验，在热稳定性部分指出那些可选温度。可如实施例1所述在结合/连续中应用所述两种方法。

优选随机诱变方法是掺杂的，及掺入寡改组(oligo shuffling)。

上述产生肌醇六磷酸酶变体方法甚至更优选实施方案中，所述方法可重复(iterative)，指在第一步，所述亲代肌醇六磷酸酶是上述肌醇六磷酸酶之一，例如所述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，在第二步所述亲代肌醇六磷酸酶是比其热稳定更高的变体X，第三步中所述亲代肌醇六磷酸酶是比X热稳定性甚至更高的变体Y，以此类推。

比活性提高的优选筛选方法是实施例1所指的初次筛选方法。另一比活性提高的优选筛选方法是实施例1所指的二次筛选方法。

本发明也涉及生产可得到的或通过上述产生肌醇六磷酸酶变体的方法可得到的肌醇六磷酸酶变体的方法，包含(a)培养宿主细胞来生产包含所述变体的上清；并(b)回收所述变体。

进一步通过下述实施例描述本发明，其不应作为限制本发明范围。

具体实施方案

本发明一方面是在隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶骨架通过与其他骨架，优选同源骨架的同源性序列对比，转移所选的(阳性，就是说例如热稳定性和/或比活性提高)突变。此概念可如下描述：在如下面所列举的那些权利要求和附加具体实施方案中的每一个，用“来自Peniophora lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶”取代“亲代肌醇六磷酸酶”并加入下述权利要求：与来自Peniophoralycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶变体，该变体包含在对应于那些在附加实施方案所要求并列举的至少一个位置的取代，通过将所述同源的肌醇六磷酸酶与如上SEQ ID NO：2序列比对推导出所述对应位置。

要求了本发明所述肌醇六磷酸酶变体的多种具体实施方案，并且在如下列举了附加具体实施方案。本发明也涉及下述实施方案的下述方面：分离的核酸序列；核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；生产方法；转基因植物，或植物部分；转基因非人动物，或产品，或其组分/元素(元件)；组合物如饲料添加剂，和动物饲料；使用的方法和过程；及用途(如本文所要求的)。本文具体包括的组合物包含至少一个任何所述权利要求或任何上述实施方案的肌醇六磷酸酶变体。所述动物饲料优选含有至少一种植物蛋白质或蛋白质源。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在至少一个选自如下的位置的取代：20；26；28；29；30；31；37；38；39；40；41；42；43；44；45；46；47；48；55；56；57；58；59；60；61；62；63；64；65；66；67；68；69；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；91；92；93；94；95；96；97；98；99；100；101；102；103；104；105；106；107；108；109；110；111；112；113；114；115；116；117；118；119；123；124；125；126；135；136；137；138；139；140；141；142；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；169；170；171；172；173；174；175；176；177；178；179；180；181；182；183；184；185；186；187；188；189；190；191；192；193；194；195；196；197；198；199；204；205；206；207；208；209；210；211，212；213；214；215；216；217；218；219；220；221；222；229；230；231；232；233；234；235；236；237；238；248；249；250；251；252；253；254；255；256；257；258；259；260；261；262；263；264；265；266；284；285；286；287；288；289；300；301；302；303；304；305；306；307；308；321；322；323；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；343；344；345；346；347；348；349；350；384；385；386；387；388；389；390；391；392；393；394；395；396；397；398；407；408；409；410；411；412；419；420；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；和

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下的Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：G26S；Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；A135S；D137Y；Q138D，S，G；D142A；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179 T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M322I；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；和L396R。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；26；28-31；37-48；55-69；73-83；91-119；123-126；135-142；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；300-308；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；并且

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的一个位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置26；28；29；31；42；45；46；59；62；64；65；66；67；68；74；99；100；102；103；104；107；109；110；111；112；116；135；137；138；142；154f；155；156；157；169；170；171；171a；174；177；178；179；182；184；185；185e；186；187；187a；188；189；195；199；204；207；216；217；219；220；221；222；230；235e；248；249；251；254；255；257；259；262；264；286；287；288；321 322；323；324；327；332；333；344；346；348；349；350；388；393；395；和396的所述变体选自：26A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；28A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W；29A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；31A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；42C，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；46A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；59A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；62A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；64C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；65C，D，F，H，I，K，L，M，N，P，S，T，V，W，Y；66A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；67C，D，E，F，G，H，L，M，N，P，S，T，V，W，Y；68A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，R，S，T，W；74C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；99C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y100A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；103A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；104A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；107A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，V，W，Y；109A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，T，V，W，Y；110A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；111A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y；112C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；116A，C，D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；135C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；137A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；138A，C，E，F，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；142C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；154fA，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；155A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；156A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；169A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；170C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；171C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；171aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；174C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，V，W，Y；177A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；178A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，V，W，Y；179A，C，D，E，F，G，H，I，K，N，P，Q，R，S，W，Y；182C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，W，Y；184A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；185A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；186C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；187A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；188C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，W，Y；189A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；195A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；199C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；204A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；207C，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；216A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；217A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；219A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，V，W；220A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，V，W；221A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；222A，C，D，E，F，G，H，I，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；230A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；235eA，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；249C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；251A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；254C，D，E，F，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；255A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；257A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；259A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；262A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；264C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；286A，C，D，E，F，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；287A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；288C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；321A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，R，V，W，Y；322A，C，D，E，F，G，H，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；327C，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；332A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；333A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；346A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；348A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；349C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；388C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；393A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；395A，C，D，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；和396A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；28-31；37-48；55-69；91-119；123-126；152-163；169-199；204-222；229-238；248-266；284-289；321-335；343-350；384-398；407-412；和419-430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；并且

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下的Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：Y28N；D29S；F31Y；E42D，K，A；T45R；V46I；W59F；S62D；A64K；R65Q，E，G，A；S66T；R67A，I，Q，K；Q68Y，V，I；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；E169S；E170A，P；G171A；()171aS；T174P，A；N177S；N178S，T；M179T，V，L；N182A，V；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L219Y，T；T220Y，N；L221F；M222L；L230V；()235eE，Q；V248R，I；S249Q，A；E251 D；Y254A，L，G；D255N；D257K；Y259F；T262H；P264A；G286R，H；Q287K，S；A288P；T321Q，S，G；M322I；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；G388A；V393R；E395K，T；和L396R。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下的至少一个位置的取代：20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；190；191；194；199；205；210；218；222；234；248；286；321；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；T45R；A99N；L102V；H110S，V；G156P；E157Q，S；D185E；()185eT；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；M222L；V248R，I；G286R，H；T321Q，S，G；V323I；P324A；E344R；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下的至少一个位置的取代：20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；190；191；194；199；205；210；218；222；234；248；286；321；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)其中在位置29；45；99；102；110；156；157；185；185e；187；187a；199；222；248；286；321；323；324；344；349；350；和395的所述变体选自：29A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；99C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；110A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；156A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；185A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；187A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；222A，C，D，E，F，G，H，I，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；321A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，R，V，W，Y；323A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；349C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；和395A，C，D，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。

所述权利要求或任何上述实施方案的变体，其含有至少一个选自如下的取代：20R；29N，C，T；45A；63N；69A；92L；93I；95R，H，M，N，S，T；97V；98G；99D；102I；110Y，R，W；114A；118A；125D；152A；156C，R；157K；160R；163P；183K，A，W，G；185A，H，N，P，K；187G；190S，K；191L，R，S；194R；199S；205S；210G；218T；222I；234K，S；248A，C，D，E，G，H，S，T；286S；321A；323A；324S，L；328T；330R；334E，D，G；343N；344A，V，S；345D，H；347Q，P；349M，K；D350T，M，I，L；384S，A；395G；398T；409S；421R，S；422R；423N；424S；425L；426E；427G；428R；429I；和430M。

所述权利要求或任何上述实施方案的变体，其中所述亲代肌醇六磷酸酶i)具有的核酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少约60％，优选至少60％的同一性；ii)在低严格条件与SEQ ID NO：1的核苷酸49-1320或其互补链杂交的氨基酸序列所编码；iii)为真菌的肌醇六磷酸酶，优选担子菌肌醇六磷酸酶或混合的子囊菌/担子菌肌醇六磷酸酶，如隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，例如来自Peniophora lycii，例如Peniophora lycii CBS 686.96的肌醇六磷酸酶。

所述权利要求或任何上述和下述实施方案的肌醇六磷酸酶变体，其为热稳定的和/或比活性高，优选比所述亲代肌醇六磷酸酶热稳定性和/或比活性更高。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且(c)所述变体与SEQ IDNO：2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；S155N；()154fH；G156P；E157Q，S；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代：20；29；37；38；39；40；41；42；43；44；45；46；47；48；63；69；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；91；92；93；94；95；96；97；98；99；100；101；102；103；104；105；106；107；108；109；110；111；112；113；114；115；116；117；118；119；123；124；125；126；154；155；156；157；163；183；187；194；199；204；205；206；207；208；209；210；211，212；213；214；215；216；217；218；229；230；231；232；233；234；235；236；237；238；248；300；301；302；303；304；305；306；307；308；323；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；343；344；345；346；347；348；349；350；384；395；398；407；408；409；410；411；412；419；420；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且(c)所述变体与SEQID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；S155N；()154fH；G156P；E157Q，S；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且(c)所述变体与SEQ IDNO：2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，42，45，46，74，99，100，102，103，104，107，109，110，111，112，116，155，154，156，157，187，187a，199，204，207，216，217，230，235e，248，286，287，288，323，324，327，332，333，344，346，348，349，350，395的所述变体选自：29A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；42C，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；46A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；74C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；99C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；100A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；103A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；104A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；107A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，V，W，Y；109A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，T，V，W，Y；110A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；111A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y；112C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；116A，C，D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；155C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；154fA，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；156A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；187A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；204A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；207C，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；216A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；217A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；230A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；235eA，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；287A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；288C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；327C，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；332A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；333A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；346A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；348A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；349C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；和395A，C，D，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代：20；29；45；63；69；95；97；98；99；102；114；118；125；163；183；187；194；199；205；218；234；248；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；T45R；A99N；L102V；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；V248R，I；V323I；P324A；E344R；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且(c)所述变体与SEQ IDNO：2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，45，99，102，187，187a，199，248，323，324，344，349，350，和395的所述变体选自：29A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；99C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；187A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；323A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；349C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；和395A，C，D，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。

上述任何实施方案的变体含有选自如下的至少一个取代：20R；29N，C，T；45A；63N；69A；92L；93I；95R；97V；98G；99D；102I；110Y；114A；118A；125D；163P；183K；187G；194R；199S；205S；218T；234K，S；248A；323A；324S，L；328T；330R；334E，D，G；343N；344A，V，S；345D，H；347Q，P；V349M；D350V，T；384S，A；395G；398T；409S；421R，S；422R；423N；424S；425L；426E；427G；428R；429I；和430M。

上述任何实施方案的变体，该变体含有一个选自如下取代或取代组合的取代或取代组合：20R+95R+97V+98G；29N+102I；29N+118A；29N+234S；29N+324S；29N+163P+324S；29N+163P+324S+395G；29S；29S+205S；29S+125D+324A；29S+324A+350V；29S+125D+324A+350V；29S+125D+324A+234K+330R；29S+125D+324A+330R+395G；29S+99D+125D+324A+334E+350V；29S+125D+324A+218T+344S+350V；29S+125D+324A+234K+330R+395G；29S+324A+125D+350V+63N+218T+334E+183K+421S；29S+324A+125D+350V+45A+69A+99D+110Y+334E+344S；29T+324L；45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M；69A+334E；99D+398T；114A+187G+194R+324S；114A+187G+194R+324S；218T+334G；323A+324S；324S；324S+328T；324S+395G；324S+345D+347Q；330R；334E+344A；334D+343N+344V；345H+347P+350V；和350V。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；29；37-40；45；47-48；63；69；73-83；91-98；99；102；103；110；113-119；123-125；154-157；163；183；187；194；199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-324；328-335；343-347；349；350；384；395；398；407-412；和419-430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；T45R；K74R，A；A99N；L102V；P103E；H110S，V；M116F，I，L；S155N；()154fH；G156P；E157Q，S；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V323I；P324A；F332Y；N333P；E344R；R346P；V349L，A，S；D350K，A；和E395K，T。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代：20；29；37-48；63；69；73-83；91-119；123-126；152-163；183-199；204-218；229-238；248；284-289；300-308；323-335；343-350；384；395；398；407-412；和419-430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188Q，S，A，V；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代：20；29；37；38；39；40；41；42；43；44；45；46；47；48；63；69；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；91；92；93；94；95；96；97；98；99；100；101；102；103；104；105；106；107；108；109；110；111；112；113；114；115；116；117；118；119；123；124；125；126；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；183；184；185；186；187；188；189；190；191；192；193；194；195；196；197；198；199；204；205；206；207；208；209；210；211，212；213；214；215；216；217；218；229；230；231；232；233；234；235；236；237；238；248；284；285；286；287；288；289；300；301；302；303；304；305；306；307；308；323；324；325；326；327；328；329；330；331；332；333；334；335；343；344；345；346；347；348；349；350；384；395；398；407；408；409；410；411；412；419；420；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；E42D，K，A；T45R；V46I；K74R，A；A99N；D100S；L102V；P103E；F104L；N107T，Q；S109M；H110S，V；Q111E，N；T112A，S；M116F，I，L；()154fH；S155N；G156P；E157Q，S；V184G；D185E；()185eT；G186S，A；D187R，K，S；()187aV，T；E188QSAV；S189E；V195L；N199A，P；L204N；A207D，H；S216T；D217E；L230V；()235eE，Q；V248R，I；G286R，H；Q287K，S；A288P；V323I；P324A；A327S，F，I，L；F332Y；N333P；E344R；R346P；W348F；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，42，45，46，74，99，100，102，103，104，107，109，110，111，112，116，154，155，156，157，184，185，185e，186，187，187a，188，189，195，199，204，207，216，217，230，235e，248，286，287，288，323，324，327，332，333，344，346，348，349，350，395的所述变体选自：29A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；42C，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；46A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；74C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；99C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；100A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；103A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；104A，C，D，E，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；107A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，V，W，Y；109A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，T，V，W，Y；110A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；111A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，P，R，S，T，V，W，Y；112C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；116A，C，D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；154fA，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；155A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，T，V，W，Y；156A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；184A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；185A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；186C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；187A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；188C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，W，Y；189A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；195A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；199C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；204A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；207C，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；216A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y；217A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；230A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；235eA，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；287A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；288C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；327C，D，E，G，H，K，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；332A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W；333A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；346A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y；348A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，Y；349C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；和395A，C，D，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。

亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代：20；29；45；63；69；92；93；95；97；98；99；102；110；114；118；125；152；156；157；160；163；183；185；187；194；199；205；218；234；248；286；323；324；328；330；334；343；344；345；347；349；350；384；395；398；409；421；422；423；424；425；426；427；428；429；430；其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且

(d)附带所述变体不是选自如下Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶的变体：D29S；T45R；A99N；L102V；H110S，V；G156P；E157Q，S；D185E；()185eT；D187R，K，S；()187aV，T；N199A，P；V248R，I；G286R，H；V323I；P324A；E344R；V349L，A，S；D350S，V；和E395K，T。

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；并且

(c)所述变体与SEQ ID NO：2具有至少75％的百分比同一性；并且其中在位置29，45，99，102，110；156；157；185；185e；187，187a，199，248，286；323，324，344，349，350，和395的所述变体选自：29A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y；45A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，V，W，Y；99C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，Y；102A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；110A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；156A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；157A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，T，V，W，Y；185A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y；185eA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y；187A，C，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，T，V，W，Y；187aA，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，W，Y；199C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，R，S，T，V，W，Y；248A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，S，T，W，Y；286A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；323A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y；324C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y；344A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，Y；349C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，T，W，Y；350A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W，Y；和395A，C，D，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，Y。

任何上述实施方案的所述变体，其含有至少一个选自如下的取代：20R；29N，C，T；45A；63N；69A；92L；93I；95R，H，M，N，S，T；97V；98G；99D；102I；110Y，R，W；114A；118A；125D；152A；156C，R；160R；163P；183K，A，W，G；185A，H，N，P；187G；191L；194R；199S；205S；218T；234K，S；248A，C，D，E，G，H，S；286S；323A；324S，L；328T；330R；334E，D，G；343N；344A，V，S；345D，H；347Q，P；V349M；D350T；384S，A；395G；398T；409S；421R，S；422R；423N；424S；425L；426E；427G；428R；429I；和430M。

任何上述实施方案的所述变体，其含有一个选自如下取代或取代组合的取代或取代组合：20R+95R+97V+98G；29N+102I；29N+118A；29N+163P+324S；29N+163P+324S+395G；29N+234S；29N+324S；29S；29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V；29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S；29S+95H+110W+183W+324A+350V；29S+95M+110W+183W+324A+350V；29S+95N+110R+183W+324A+350V；29S+95R+110W+183W+324A+350V；29S+95S+110R+183W+324A+350V；29S+95S+110W+183W+324A+350V；29S+95T+110R+183W+324A+350V；29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V；29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V；29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248A+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V；29S+95T+110Y+183W+324A；29S+95T+110Y+183W+324A+350V；29S+99D+125D+324A+334E+350V；29S+110Y+183W+185N+324A+350V；29S+125D+218T+324A+344S+350V；29S+125D+234K+324A+330R；29S+125D+234K+324A+330R+395G；29S+125D+324A；29S+125D+324A+330R+395G；29S+125D+324A+350V；29S+183A+324A+350V；29S+183G+324A+334E+344S+350V；29S+183W+324A+350V；29S+205S；29S+324A+350V；29T+324L；45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+429I+430M；69A+334E；99D+398T；114A+187G+194R+324S；218T+334G；323A+324S；324S；324S+328T；324S+345D+347Q；324S+395G；330R；334D+343N+344V；334E+344A；345H+347P+350V；和350V。

实施例

所用化学品至少是试剂级别的商品。

实施例1：制备PE-变体，筛选并分离热稳定性和/或比活性提高的变体

一般原理

用Peniophora lycii CBS 686.96肌醇六磷酸酶作为亲代肌醇六磷酸酶，基于本文所述目标区域，构建多个肌醇六磷酸酶变体文库并在酵母(掺杂文库，及掺入的寡聚物改组文库，下述其实施例)中表达。

提高热稳定性的筛选：将所述酵母文库如下进行初次筛选(复制，单滤膜)来选择在53℃显示活性的那些菌落。

将在53℃显示活性的菌落也如下转到二次筛选(24孔板培养)来建立每个菌落的温度曲线(在可用的37℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，70℃，72℃等的活性)。

对于比野生型亲代隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶表现更好的菌落，将所述质粒分离并重新转化如酵母，并重复所述温度曲线试验。从所述温度曲线试验计算得到下图：“60℃/37℃的相对活性”，和/或“62℃/37℃的相对活性”，和/或“65℃/37℃的相对活性”，和/或“68℃/37℃的相对活性”，和/或“70℃/37℃的相对活性”，和/或“72℃/37℃的相对活性”，等等。在这些比率中，可将首次提及的温度命名为“优选的高温”。基于从二次筛选方法(温度曲线测定)的上清所获得的肌醇六磷酸酶活性值，将这些术语限定为所述肌醇六磷酸酶在高温(例如60或62℃)的活性相对在较低温度(37℃)的肌醇六磷酸酶活性的比率。选择相对活性中的一个活多个比所述亲代肌醇六磷酸酶提高的菌落，测序所述质粒并将相应变体鉴定为本发明改进的肌醇六磷酸酶变体。

在第二轮筛选中，选择热稳定的肌醇六磷酸酶变体作为新的亲代肌醇六磷酸酶(骨架)并重复上述(基于新骨架的性能适当调节温度)。

另外，构建组合变体，并随机化一些可能的热突变点(hot spot)，并检测变体。

在第三轮筛选中，选择进一步改进的新的热稳定的肌醇六磷酸酶变体作为新的骨架并重复上述(再次上(upward)调温度)，例如现在将所述第一轮筛选温度升高到63℃。另外，还分析(construed)一些新的组合变体，并且将其他明显令人感兴趣的位点随机化来发现取代的最佳配对。

通常如上述制备其它变体。

提高比活性的筛选：在初次筛选中，将所述酵母文库涂布在含肌醇六磷酸钙的SC-葡萄糖平板上，并在30℃培养3天。选择晕圈(halo)较大的克隆并在含YPD培养基的24孔板中培养。在二次筛选中，相对地检查所述孔中上清的活性并且选择活性较高的克隆。在80℃，pH 4培养30分钟来去消选择(deselect)热稳定性较低的变体后，检查平板上所选克隆的剩余活性。选择热稳定性较高的克隆并再次在24孔板培养来进行半纯化(semi-purification)。进行半纯化通过将肌醇六磷酸酶结合到conA-sepharose4B(Concanavalin A在Amersham bioscience，Cat.No.17-0440-01的Sepharose4B凝胶基质中)并用0.5M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷(mannopyranoside)在PBS+0.1％tween20(PBS为8g/l NaCl，0.2g/l KCl，2.68g/l Na₂HPO₄-7H₂O，0.24g/lKH₂PO₄(pH 7.4)中洗脱；tween 20商业上可由Bio-Rad，Cat.no.170-6531得到)。然后在已经调节所述活性到30FYT/ml后将所述半纯化上清上样到火箭免疫电泳分析中。在火箭免疫电泳中使用兔中产生的(raised)的抗-纯化隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的多克隆抗体。选择所述信号较小的克隆作为比活性较高的变体(所述火箭电泳(rocket)的面积与所述抗原(肌醇六磷酸酶)的浓度成比例，即面积越小，肌醇六磷酸酶蛋白质越少，所述比活性越高)。

改进的变体实施例见下表1-5所示。这些变体比所述隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶显示出更高的比活性和/或热稳定性更高。具体地，就热稳定性而言，所述变体显示“60℃/37℃的相对活性”，和/或“62℃/37℃的相对活性”，和/或“65℃/37℃的相对活性”，和/或“68℃/37℃的相对活性”，和/或“70℃/37℃的相对活性”，和/或“72℃/37℃的相对活性”，和/或“74℃/37℃的相对活性”等的值更高。(这些结果见表6-1和6-2所示)。由比活性筛选方法得到的选择变体见下表6-3所示。所有这些变体都期望比表8中命名为“N”的所述变体具有甚至更高的比活性。

在公开于WO 97/35956的米曲霉IFO 4177中表达选择的变体并在培养基MDU-2Bp在25℃以220rpm培养所述转化的细胞。从发酵液(fermentationbroth)纯化所述肌醇六磷酸酶变体并进一步如实施例2所述依照热稳定性和/或比活性来定性，显示于表7-8。

表1

肌醇六磷酸酶变体	取代
		1	D29N+L163P+D187G+G194R+P324S
2	A99D+A398T
		3	A334D+D343N+E344V
4	T114A+D187G+G194R+P324S
		5	D29N
6	D29N+L102I
		7	D29N+N234S
8	P324S+A328T
		9	D29S+N205S
10	D29S+P324A+D350V+E183W+K95R+H110W
		11	N234K
12	V323A+P324S
		13	Q20R+K95R+G97V+V98G
14	T45A+D350V+缺失(P421-E423)+插入(P421RRNSLEGRIM)
		15	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248T+V349L+D350M
16	D29N+T118A
		17	P324S+N345D+L347Q
18	N199S+V248A
		19	D29T+P324L

肌醇六磷酸酶变体	取代
		20	D350V
21	A218T+A334G
		22	L163P
23	V93I+N409S+P324S
		24	A334E+E344A
25	P324S+A328T
		26	G330R
27	V248A
		28	V69A+A334E
29	T45A+A218T

表2

肌醇六磷酸酶变体	取代
		30	D29N+L163P+P324S+E395G
31	D29S+E125D+P324A+A334E+E344S+P421S
		32	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248T+V349L+D350I
33	D29S+K95T+H110Y+E183W+D185K+V248S+P324A+D350V
		34	D29S+E125D+P324A+N234K+G330R
35	D29N+P324S
		36	D29S+E125D+P324A+G330R+E395G
37	D29S+E125D+P324A+N234K+E395G
		38	D29S+P324A+E125D+D350V
39	D29S+P324A+E125D+D350V+T45A+V69A+A99D+H110Y+A334E+E344S
		40	D29N+L163P+P324S
41	D29S+K95T+D350V+E183W+H110Y+D185E+V248S+P324A
		42	P324S+E395G
43	D29S+P324A+E125D

表3

肌醇六磷酸酶变体	取代
		44	D29S+E125D+P324A+N234K+G330R+E395G
45	D29S+P324A+E125D
		46	D29T
47	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248T+V349A+D350L
		48	D29S+P324A+E125D+D350V+A99D+A334E
49	P324S
		50	D29S+T45A+V248A+P324A+V349M+D350V+E395G
51	D29S+K95T+H110Y+E183W+D185H+D187S+T190K+T191S+S210G+M222I+V248G+P324A+D350V
		52	D29S
53	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185P+V248G

表4

肌醇六磷酸酶变体	取代
		54	D29S+P324A+D350V+E183W+K95M+H110W
55	D29C
		56	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185K+V248G+V349K+D350L
57	D29S+P324A+D350V+E183W+H110Y+D185N
		58	D29S+P324A+E125D+D350V+A99D+A334E
59	N345H+L347P+D350V
		60	D29S+P324A+E125D+D350T
61	D29S+P324A+E125D+D350V+N345H+L347P
		62	P324A
63	D29S+K95R+D350V
		64	D29S+K95T+H110Y+E157K+E183W+D185H+D187R+T190S+T191R+V248G+P324A+D350V
65	D29S+P324A+E125D+D350V+E344S+A218T
		66	F92L
67	D29S+P324A+D350V

表5

肌醇六磷酸酶变体	取代
		68	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+T191L
69	D29S+P324A+D350V+E183W
		70	D29S+P324A+E183W+K95T+H110Y
71	D29S+P324A+E125D+D350V+G63N+A218T+A334E+E183K+P421S
		72	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185P+V248S
73	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+E125D+G286S
		74	D29S+P324A+E125D+D350V
75	D29S+P324A+D350V+E183G+A334E+E344S
		76	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110R
77	D29S+K95T+H110Y+E183W+D185H+V248G+T321A+V323A+P324A+D350V
		78	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185H+V248G
79	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+G152A+G156C+E157Q+L160R
		80	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248A
81	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y
		82	D29S+P324A+D350V+E183W+K95H+H110W
83	D29S+P324A+D350V+E183A
		84	D29S+P324A+D350V+E183W+K95N+H110R
85	D29S+K95T+H110Y+E183W+D185K+V248T+P324A+D350V
		86	D29S+P324A+D350V+E183W+K95S+H110W
87	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248E
		88	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+G156R+E157Q
89	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248H
		90	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248C
91	D29S+P324A+D350V+E183W+K95S+H110R
		92	D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+V248D

表6-1

肌醇六磷酸酶变体	相对活性60℃/37℃	相对活性62℃/37℃	相对活性65℃/37℃	相对活性68℃/37℃	相对活性70℃/37℃	相对活性72℃/37℃	相对活性74℃/37℃
								隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶	70	30	15	-	-	-	-
1	104	55	-	-	-	-	-
								2	95	50	-	-	-	-	-
3	120	70	-	-	-	-	-
								4	120	70	-	-	-	-	-
5	195	175	-	-	-	-	-
								6	105	40	-	-	-	-	-
7	94	47	-	-	-	-	-
								8	115	65	-	-	-	-	-
9	118	69	-	-	-	-	-
								10	106	60	-	-	-	-	-
11	140	107	-	-	-	-	-
								12	150	130	80	-	-	-	-
13	104	45	-	-	-	-	-
								14	130	75	-	-	-	-	-
15	141	123	-	-	-	-	-
								16	179	130	-	-	-	-	-
17	127	59	-	-	-	-	-
								18	104	42	-	-	-	-	-
19	115	52	-	-	-	-	-
								20	126	65	-	-	-	-	-
21	115	54	-	-	-	-	-
								22	102	53	-	-	-	-	-
23	95	44	-	-	-	-	-
								24	71	40	-	-	-	-	-
25	62	33	-	-	-	-	-
								26	155	124	-	-	-	-	-
27	-	-	-	170，183	73，136	69	32
								28	147	126	61	-	-	-	-
29	-	-	-	176	105	69	32

肌醇六磷酸酶变体	相对活性60℃/37℃	相对活性62℃/37℃	相对活性65℃/37℃	相对活性68℃/37℃	相对活性70℃/37℃	相对活性72℃/37℃	相对活性74℃/37℃
								30	-	-	-	109	App.95	-	-
31	-	-	-	154	102	-	-
								32	-	-	-	-	-	102	22
33	-	-	-	-	186	125	49
								34	150	30	-	-	-	-	-
35	80	40	-	-	-	-	-
								36	-	137	63	-	-	-	-
37	-	156	81	-	-	-	-
								38	-	125	46	-	-	-	-
39	-	130	52	24	-	-	-
								40	-	169	165	119	-	-	-
41	-	145	126	72	-	-	-
								42	115	84	35	-	-	-	-
43	145	112	54	-	-	-	-
								44	-	-	-	90	App.70	-	-
45	-	-	-	105	App.80	-	-
								46	-	-	-	96	App.70	-	-
47	-	-	-	104	42	-	-
								48	-	-	-	120	57	-	-
49	-	-	-	147	102	53	-
								50	-	-	-	152	105	51	-
51	-	-	-	184	101	48	-
								52	-	-	-	-	115	88	31
53	-	-	-	-	118	74	25
								54	118	69	-	-	-	-	-

表6-2

肌醇六磷酸酶变体	相对活性68℃/37℃	相对活性70℃/37℃	相对活性72℃/37℃	相对活性74℃/37℃	相对活性75℃/37℃	相对活性76℃/37℃	相对活性78℃/37℃	相对活性80℃/37℃	相对活性81℃/37℃	相对活性82℃/37℃
											55	-	-	-	-	-	-	-	92	66	-
56	-	-	-	-	-	-	-	83	54	-
											57	-	-	-	-	-	-	71	23	-	-
58	172	122	-	-	-	-	-	-	-	-
											59	-	-	-	-	-	90	34	-	-	-
60	-	-	-	-	-	-	-	126	100	51
											61	-	-	-	-	95	51	-	-	-	-
62	-	-	-	-		-	99	49	-	-
											63	-	-	113	101	23	-	-	-	-	-
64	-	-	-	-	-	-	-	110	94	45
											65	-	-	-	-	-	-	-	74	38	-
66	-	-	178	72	36	-	-	-	-	-
											67	-	-	-	-	-	-	36	8	-	-
68	-	-	-	-	-	-	-	61	32	-
											69	-	-	-	-	-	96	40	-	-	-
70	-	-	-	-	-	-	-	69	38	-
											71	-	-	-	-	-	102	52	-	-	-
72	-	-	-	-	-	-	104	50	-	-
											73	-	-	-	-	-	-	-	88	61	-

肌醇六磷酸酶变体	相对活性68℃/37℃	相对活性70℃/37℃	相对活性72℃/37℃	相对活性74℃/37℃	相对活性75℃/37℃	相对活性76℃/37℃	相对活性78℃/37℃	相对活性80℃/37℃	相对活性81℃/37℃	相对活性82℃/37℃
											74	-	-	-	-	-	98	36	-	-	-
75	-	-	-	-	-	71	27	-	-	-
											76	-	-	131	110	60	42/56	16	-	-	-
77	-	-	-	-	-	-	59	17	-	-
											78	-	-	-	-	-	81	28	-	-	-
79	-	-	-	-	-	91	32	-	-	-
											80	-	-	-	-	-	76	24	-	-	-
81	147	102	53	-	-	-	-	-	-	-
											82	-	-	-	-	-	-	-	85	45	-
83	-	-	-	-	-	-	91	31	-	-
											84	-	-	-	-	-	-	-	85	67	-
85	-	-	-	-	-	-	-	60	-	-
											86	-	-	-	-	-	-	-	122	105	58
87	-	-	-	-	-	-	-	102	62	-

表6-3

肌醇六磷酸酶变体	比活性(％)
		N	100
Q	144
		R	122
S	189
		T	200
U	167
		V	167
W	156
		X	167
Y	133
		Z	122

菌株和质粒

将大肠杆菌DH12S(得自Gibco BRL)用于酵母质粒挽救(rescue)。pTMPP2ver2为在TPI启动子控制下的酿酒酵母(S.cerevisiae)和大肠杆菌穿梭(shuttle)载体，从WO 00/10038所述的pJC039构建。将它用于文库构建，酵母表达，筛选和测序。

酿酒酵母YNG318：将MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his 4-539用于构建酵母文库并表达所述肌醇六磷酸酶变体。见J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)所述。

培养基和底物

10×基础溶液

66.8g/l 酵母氮碱基无(w/o)氨基酸(DIFCO)

100g/l 琥珀酸盐

60g/l NaOH

SC-葡萄糖

100ml/l 20％葡萄糖(即2％的终浓度＝2g/100ml)

4ml/l 5％苏氨酸

10ml/l 1％色氨酸

25ml/l 20％水解酪蛋白氨基酸(casamiono acid)

100ml/l 10×基础溶液

用孔径0.20μm的滤膜灭菌上述溶液。琼脂和水(大约761ml)在一起高压灭菌，并且将分开灭菌的SC-葡萄糖溶液加入所述琼脂溶液。

YPD

20g/l Bacto蛋白胨

10g/l 酵母提取物

100ml/l 20％葡萄糖(分开灭菌)

肌醇六磷酸钠平板

100ml/l 1M醋酸钠缓冲液(pH5.5)

5g/l 肌醇六磷酸钠

30g/l 琼脂

PEG/LiAc溶液

50ml 40％PEG4000(通过高压灭菌)

1ml 5M醋酸锂(通过高压灭菌)

痕量金属溶液

FeSO₄×7H₂O 13.90g/l

MnSO₄×5H₂O 13.60g/l

ZnCl₂ 6.80g/l

CuSO₄×5H₂O 2.50g/l

NiCl₂×6H₂O 0.24g/l

柠檬酸×H₂O 3.00g/l

MDU-2Bp

麦芽糖×H₂O 45g/l

酵母提取物 7g/μl

MgSO₄×7H₂O 1g/l

NaCl 1g/l

K₂SO₄ 2g/l

KH₂PO₄ 12g/l

痕量金属溶液 0.5ml/l

方法

肌醇六磷酸酶活性，初次筛选

在SC-葡萄糖平板涂布酵母文库并在30℃温育3天。用硝化滤膜通过使用丝绒布将其复制到新的SC-葡萄糖平板。在30℃温育所述平板1天(或20℃过周末)转移所述滤膜到预热的0.5％肌醇六磷酸钠平板(pH5.5)上。在设定的(prescribed)温度，例如53℃，过夜(O/N)温育所述平板。移去所述滤膜并且倒入0.5M CaCl₂溶液。发现具有清楚区域的所述酵母克隆。从所述主(master)平板分离候选克隆并接种到新的SC-葡萄糖平板和24孔板中1mlYPD培养基。

二次筛选方法

在24孔板在25℃以180rpm培养YPD培养基3天。离心所述平板/或仅使它们静置1小时。将5μl和10μl上清加到肌醇六磷酸钠平板。在37℃和53℃温育所述平板过夜。检测清楚区域的直径。用在下面实施例2描述的(如设定的试验温度)所述肌醇六磷酸酶试验，检测那些在53℃保留活性的克隆的上清的温度曲线。

构建酵母文库的方法

混合0.5μl载体(用EcoRI-NotI消化)和1μl PCR片段。在冰上解冻YNG318感受态细胞。在12ml聚丙烯试管(Falcon 2059)混合100μl所述细胞，所述DNA混合物和10μl载体DNA(Clontech)。加入0.6ml PEG/LiAc溶液并轻柔地混合。在30℃和200rpm温育30分钟。在42℃(热休克(heatshock))温育30分钟。转移到eppendorf管并离心5秒。去除所述上清并在3ml YPD中溶解。在30℃以200rpm温育所述细胞悬液45分钟。将所述悬液倒在SC-葡萄糖平板来得到约300克隆/平板。

文库构建

通过SOE方法构建掺杂文库(通过重叠(Overlap)延伸来剪接，见“PCR：A practical approach”，p.207-209，Oxford University press，eds.McPherson，Quirke，Taylor)，之后是酵母重组。

其他方法

通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser)进行大肠杆菌转化用于构建文库和进行亚克隆。通过碱法(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor)或用所述Qiagen^_质粒试剂盒制备DNA质粒。用Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。通过PTC-200 DNA Engine进行PCR。用ABI PRISM^TM 310遗传分析仪来确定所有DNA序列。用醋酸锂方法进行酵母转化。通过Nucleicacids research vol.20，No.14(1992)3790所述的Robzyk和Kassir′s方法提取酵母总DNA。

扩增和测序的通常引物

用下述引物通过所述SOE方法制备含任何突变片段的DNA片段，或使用下述引物只扩增整个肌醇六磷酸酶基因。

SEQ ID NO：3：

620AM34 GAGTACTATCTTGCATTTGTAC TAGGAGTTTAGTGAACTTGC

SEQ ID NO：4：

680AM35 ATGGTTATGGATTTCGGGGATTC TTCGAGCGTCCCAAAACC

SEQ ID NO：5：

AM34 TAGGAGTTTAGTGAACTTGC

SEQ ID NO：6：

AM35 TTCGAGCGTCCCAAAACC

SEQ ID NO：7：

620 GAGTACTATCTTGCATTTGTAC

SEQ ID NO：8：

680 ATGGTTATGGATTTCGGGGAT

构建掺杂文库的引物实施例

区域229-236

与现有实践一致，在下面详明的核苷酸序列中，使用特定的核苷酸编码。从例如，http://www.cs.pitt.edu/-vanathi/na.html)可清楚得到这些。例如K指G或T；Y指C或T；R指A或G；并且N指A，C，G或T。

T229 VNN 核苷酸

L230 INMKR 氨基酸

S231 TVN 氨基酸

S232 VNN 核苷酸

G233 VNN 核苷酸

N234 VNN 核苷酸

A235 VNN 核苷酸

S236 AMK 氨基酸或只是A(难以得到M和K)

L230INMKR的核苷酸分布：

核苷酸

碱基1

碱基2

碱基3

G	0.0	3.0	46.6
				A	12.5	6.5	7.7
T	0.0	90.4	45.7
				C	87.5	0.0	0.0

在区域T229-S236靶向下述引物：

SEQ ID NO：9：

掺杂1(62mer)：

GAT ATG TGC CCG TTC GAC 12K(11)(12)(13)(14)(15)T 42K 33K115 32K 5CC CCC TTC TGT GAC CTA TTT AC

SEQ ID NO：10：

掺杂1R(18mer)：

GTCGAACGGGCACATATC

1：A91G3T3C3

2：C91 G3 A3 T3

3：G91 C3 A3 T3

4：T91 G3 A3 C3

5：T95 G5

11：C88A12

12：T90 G3 A7

13：G47 A8 T45

14：G9 A91

15：G83 A4 T9 C4

构建掺入的寡聚物改组文库的引物

SEQ ID NO 11：

L102TI(43mer)：

AGTTCGGCGTCGCCGATCTGAYCCCGTTCGGGGCTAACCAATC

SEQ ID NO 12：

VE248+251X(53mer)：

TATTTACCGCGGAGGAGTATVNNTCGTACVNNTACTACTATGACCTCGACAAG

SEQ ID NO 13：V271AI(45mer)：

CCGGGAACGCTCTCGGTCCTRYCCAGGGCGTCGGATACGTCAATG

SEQ ID NO 14：

G286X(42mer)：

ATGAGCTGCTTGCACGCTTGACCVNNCAAGCCGTTCGAGACG

通过掺杂构建肌醇六磷酸酶变体

用下述PCR反应系统和条件，用2个引物对，620AM34及掺杂1R，和掺杂1和上述核苷酸混合物及680AM35进行第一个PCR反应：

PCR反应系统：	条件：
		38.9μl H₂O5μl 10×反应缓冲液1μl Klen Taq LA(CLONTECH)4μl 10mM dNTPs0.3μl×2 100pmol/μl引物0.5μl pTMPP2 ver2	1 98℃ 10sec2 68℃ 90sec1-2 30个循环3 68℃ 10min

用凝胶纯化所得片段并用作第二个PCR反应的模板。用620和680作为引物用下述PCR反应系统和条件进行第二个PCR：

PCR反应系统：	条件：
		38.4μl H₂O5μl 10×反应缓冲液1μl Klen Taq LA (CLONTECH)4μl 10mM dNTPs0.3μl×2 100 pmol/μl引物0.5μl×2 PCR片段	1 98℃ 10sec2 66℃ 90sec1-2 30个循环3 66℃ 10min

掺入的寡聚物改组文库

如下构建掺入文库：用Klen Taq聚合酶及如上述AM34和AM35作为引物进行PCR反应来制备所述变体的基因片段，并凝胶纯化所述片段。将约10μg DNA/250μl与0.8μl DNaseI(Gibco BRL 18068-015)及30μl 10×缓冲液在25℃温育7-10min。加入终浓度10mM的EDTA来终止所述反应。用Whatman玻璃滤膜纯化正确大小的DNA片段(50-150bp)。然后用下述PCR反应系统和条件重新装配所述DNase处理的片段：

PCR反应系统：	条件：
		0.2，0.5和1pmol DNase处理的模板3，6，12×摩尔过量的每种诱变寡核苷酸(oligo)1 Ready-to-go珠0.1μl Pwo聚合酶终体积25μl	1 94℃ 2min2 94℃ 30sec3 45℃ 30sec4 72℃ 1min2-4 30个循环5 72℃ 5min

用上述PCR混合物作为模板，用下述PCR反应系统和条件进行第二个PCR反应：

PCR反应系统：	条件：
		0.2，0.5，1和2μl l^stPCR反应2 Ready-to-go珠0.3μl 100pmol引物1(AM34)0.3μl 100pmol引物2(AM35)0.1μl Pwo聚合酶	1 94℃ 2min2 94℃ 30sec3 55℃ 30sec4 72℃ 90sec2-4 25个循环5 72℃ 10min

实施例2：肌醇六磷酸酶变体的纯化和定性

纯化肌醇六磷酸酶变体

表达选自上表1-5的数个变体的米曲霉(Asperillus oryzae)的发酵培养肉汤(用大写字母A-M命名)，先用一系列Millipore的GF-滤膜然后用0.45μmHA-滤膜(Millipore)过滤。然后将硫酸铵(AMS)以浓度1.35M加入过滤液，并调节pH到pH 6。再次过滤所述样品(如上0.45μm HA-滤膜)并将其上样到70ml(体积取决于上样)在1.35M AMS，20mM琥珀酸盐，pH 6平衡的PhenylSepharose柱(XK26，Pharmacia)。用1.35M AMS，20mM琥珀酸盐，pH 6洗涤所述柱后，以线性梯度1.35-0M AMS在20mM琥珀酸盐，pH6用10个柱体积洗脱所述肌醇六磷酸酶。将流速设定在6ml/min并收集10ml级分(fraction)。汇集含活性并具有足够纯度(通过SDS-PAGE评估)的级分并用50mM醋酸钠，pH 5.5过夜透析。然后向所述含肌醇六磷酸酶的汇集物加入20mM Tris-醋酸(acetic acid)，pH 7.5并在用20mM Tris-醋酸，pH 7.5平衡的8ml MonoQ或较大Q-Sepharose柱(Pharmacia)中进行阴离子交换层析。以线性梯度0-0.5M NaCl在20mM Tris-醋酸，pH 7.5用10个柱体积洗脱所述肌醇六磷酸酶。根据柱子刻度调节流速和级分大小。汇集含肌醇六磷酸酶活性并且具有足够纯度的级分并在用50mM醋酸钠，pH 5.5透析前在Amicon YM10膜上浓缩。

SDS-PAGE

用Novex 4-20 Tris-甘氨酸根据生产商说明进行SDS-PAGE。如从米曲霉纯化的所述肌醇六磷酸酶变体具有分子量，MW，大约65kDa，对应于大约25％碳水化合物(carbohydrate)。

肌醇六磷酸酶活性试验，pH和温度曲线，温度稳定性检测

将10μl稀释的酶样品(在0.1M醋酸钠，0.01％Tween20，pH 5.5稀释)加入0.1M醋酸钠，0.01％Tween20，pH 5.5(在溶解所述肌醇六磷酸钠后调节pH；预热所述底物)中的250μl 5mM肌醇六磷酸钠(Sigma)并在37℃温育30分钟。通过加入250μl 10％TCA来终止所述反应并通过加入500μl 100ml钼酸盐(molybdate)试剂中的7.3g FeSO₄(将8ml H₂SO₄中2.5g(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O稀释到250ml)来测量游离(free)磷酸盐。测量96孔微滴板中200μl样品在750nm的吸光度。包括底物和酶空白。也包括磷酸盐标准曲线(0-2mM磷酸盐)。1FYT等于在给定条件释放1μmol磷酸盐/min的酶量。

通过在50mM数个pH值pH 3(甘氨酸-HCl)，pH 4-5.5(醋酸钠)，pH 6(MES)，pH 7-8(Tris-HCl)的缓冲液进行上述试验来获得所述pH-曲线。

在不同温度(预热所述底物)进行所述试验获得温度曲线。

可通过在测量所述残基活性前，在0.1M磷酸钠，pH 5.5在不同温度预温育肌醇六磷酸酶来研究温度稳定性。

所述纯化的变体与所述P.lycii亲代肌醇六磷酸酶显示类似的pH-曲线(所有均具有大约pH 4-5的最适pH)。

差示扫描量热法(DSC)

在不同pH值用Micro Cal.的VP-DSC进行DSC。从20-90℃以恒定扫描速率1.5℃/min进行扫描。在进行DSC之前，用在适当缓冲液(例如0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.5或3.0；0.1M醋酸钠，pH 5.5；0.1M Tris-HCl，pH 7.0)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)将所述肌醇六磷酸酶脱盐。用MicroCal Origin软件进行数据处理。

所得溶解温度，Tm′s，见下表7所示。所述变体的热稳定性比所述隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶显著提高。所述热稳定性显示为pH依赖性的。

表7

肌醇六磷酸酶变体	Tm(℃)，pH 2.5	Tm(℃)，pH 3.0	Tm(℃)，pH 5.5	Tm(℃)，pH 7.0
					隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶	36.4	50.5	59.6	48.8
A	-	-	62.7	-
					B	-	-	62.4	-
C	-	-	65.0	-
					D	-	52.2	70.5	69.6
E	43.5	58.5	72.6	-
					F	42.2	-	73.5	-
G	44.5	-	73.1	-
					H	48.1	-	78.0	-
I	49.9	-	79.8	-
					J	-	49.0	75.6	-
K	52.1	-	80.6	-
					L	59.6	-	82.0	-
M	53.1	-	80.5	-

实施例3：比活性

用在20mM乙酸钠，pH 5.5透析的高纯度样品测定选自表1-5的变体(在此命名为N，O和P)的比活性。事前在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测所述纯度，显示只存在一种成分。

通过如下氨基酸分析测定所述蛋白质浓度：在110℃在6N HCl，0.1％苯酚中在抽空(evacuated)的玻璃管中水解一等份(aliquot)样品16小时。用Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统根据制造商的说明定量所得氨基酸。从所述氨基酸的量，可计算出水解的等份中的蛋白质总质量，并由此也得到所述蛋白质的浓度。

以单位FYT测定所述肌醇六磷酸酶活性，并用每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白质中以单位FYT测定的肌醇六磷酸酶活性来计算比活性。

所述结果见下表8所示。所述具体比活性数值是相对于设定为100％的所述隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶的比活性。

表8

肌醇六磷酸酶变体	比活性(％)
		隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶	100
N	147
		O	117
P	114

实施例4：包含肌醇六磷酸酶变体的动物饲料和动物饲料添加剂

动物饲料添加剂

将10g 1938号肌醇六磷酸酶变体(以肌醇六磷酸酶酶蛋白质计算)加入下述预混合物(premix)(每千克预混合物)：

5000000 IE 维生素A

1000000 IE 维生素D3

13333mg 维生素E

1000mg 维生素K3

750mg 维生素B1

2500mg 维生素B2

1500mg 维生素B6

7666mcg 维生素B12

12333mg 烟酸(Niacin)

33333mcg 生物素

300mg 叶酸

3000mg Ca-D-Panthothenate(D-泛酸钙)

1666mg 铜

16666mg 铁

16666mg 锌

23333mg 锰

133mg 钴

66mg 碘

66mg 硒

5.8％钙

25％钠

动物饲料

这是动物饲料的实施例，所述动物饲料包含0.03g/kg(30ppm)的肌醇六磷酸酶变体E(以肌醇六磷酸酶酶蛋白质计算)：

74.0％小麦

20.7％烤豆(roasted soy)蛋糕

5.0％豆油

0.3％上述预混合物。

混合所述成分，并且在所需温度，例如65，75，80，或甚至85℃将所述饲料制粒。

本文公开的具体实施方案不会从范围上限制在此描述和权利要求的发明，因为这些实施方案是为了阐述本发明的各个方面。任何等同实施方案都应在本发明范围。事实上，对于本领域技术人员，从前述说明书得到在那些本文所示和描述之外的本发明的多种改进是显而易见的。这些改进也应落入所附的(appended)权利要求的范围。如有冲突，以包括限定的本文公开为准。

本文引用多个文件，全文引入其公开作为参考。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>肌醇六磷酸酶变体

<130>10261

<160>14

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1320

<212>DNA

<213>Peniophora lycii

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(48)

<220>

<221>CDS

<222>(49)..(1320)

<400>1

atggtttctt cggcattcgc accttccatc ctacttagct tgatgtcg agt ctt gct 57

Ser Leu Ala

1

ttg agc acg cag ttc agc ttt gtt gcg gcg cag cta cct atc ccc gca 105

Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro Ile Pro Ala

5 10 15

caa aac aca agt aat tgg ggg cct tac gat ccc ttc ttt ccc gtc gaa 153

Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe Pro Val Glu

20 25 30 35

ccg tat gca gct ccg ccg gaa ggg tgc aca gtg aca cag gtc aac ctg 201

Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln Val Asn Leu

40 45 50

att cag agg cac ggc gcg cgt tgg ccc aca tcc ggc gcg cgg tcg cgg 249

Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala Arg Ser Arg

55 60 65

cag gtc gcc gcc gta gcg aag ata caa atg gcg cga cca ttc acg gat 297

Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro Phe Thr Asp

70 75 80

ccc aag tat gag ttc ctc aac gac ttc gtg tac aag ttc ggc gtc gcc 345

Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe Gly Val Ala

85 90 95

gat ctg cta ccg ttc ggg gct aac caa tcg cac caa acc ggc acc gat 393

Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr Gly Thr Asp

100 105 110 115

atg tat acg cgc tac agt aca cta ttt gag ggc ggg gat gta ccc ttt 441

Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp Val Pro Phe

120 125 130

gtg cgc gcg gct ggt gac caa cgc gtc gtt gac tcc tcg acg aac tgg 489

Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser Thr Asn Trp

135 140 145

acg gca ggc ttt ggc gat gct tct ggc gag act gtt ctc ccg acg ctc 537

Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu Pro Thr Leu

150 155 160

cag gtt gtg ctt caa gaa gag ggg aac tgc acg ctc tgc aat aat atg 585

Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys Asn Asn Met

165 170 175

tgc ccg aat gaa gtg gat ggt gac gaa tcc aca acg tgg ctg ggg gtc 633

Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp Leu Gly Val

180 185 190 195

ttt gcg ccg aac atc acc gcg cga ttg aac gct gct gcg ccg agt gcc 681

Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala Pro Ser Ala

200 205 210

aac ctc tca gac agc gac gcg ctc act ctc atg gat atg tgc ccg ttc 729

Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met Cys Pro Phe

215 220 225

gac act ctc agc tcc ggg aac gcc agc ccc ttc tgt gac cta ttt acc 777

Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr

230 235 240

gcg gag gag tat gtg tcg tac gag tac tac tat gac ctc gac aag tac 825

Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr

245 250 255

tat ggc acg ggc ccc ggg aac gct ctc ggt cct gtc cag ggc gtc gga 873

Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly

260 265 270 275

tac gtc aat gag ctg ctt gca cgc ttg acc ggc caa gcc gtt cga gac 921

Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala Val Arg Asp

280 285 290

gag acg cag acg aac cgc acg ctc gac agc gac cct gca aca ttc ccg 969

Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala Thr Phe Pro

295 300 305

ctg aac cgt acg ttc tac gcc gac ttc tcg cat gat aac acc atg gtg 1017

Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Thr Met Val

310 315 320

ccc atc ttt gcg gcg ctc ggg ctc ttc aac gcc acc gcc ctc gac ccg 1065

Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala Leu Asp Pro

325 330 335

ctg aag ccc gac gag aac agg ttg tgg gtg gac tct aag ctg gta ccg 1113

Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys Leu Val Pro

340 345 350 355

ttc tct gga cat atg acg gtc gag aag ctg gca tgt tct ggg aag gag 1161

Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser Gly Lys Glu

360 365 370

gcg gtc agg gtg ctc gtg aac gac gcg gtg cag ccg ctg gag ttc tgc 1209

Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu Glu Phe Cys

375 380 385

gga ggt gtt gat ggg gtg tgc gag ctt tcg gct ttc gta gag agc cag 1257

Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val Glu Ser Gln

390 395 400

acg tat gcg cgg gag aat ggg caa ggc gac ttc gcc aag tgc ggc ttt 1305

Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys Cys Gly Phe

405 410 415

gtt ccg tcg gaa tag 1320

Val Pro Ser Glu

420

<210>2

<211>423

<212>PRT

<213>Peniophora lycii

<400>2

Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro

1 5 10 15

Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe

20 25 30

Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln

35 40 45

Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala

50 55 60

Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro

65 70 75 80

Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe

85 90 95

Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr

100 105 110

Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp

115 120 125

Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser

130 135 140

Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu

145 150 155 160

Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys

165 170 175

Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp

180 185 190

Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala

195 200 205

Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met

210 215 220

Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp

225 230 235 240

Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu

245 250 255

Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln

260 265 270

Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala

275 280 285

Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala

290 295 300

Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn

305 310 315 320

Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala

325 330 335

Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys

340 345 350

Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser

355 360 365

Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu

370 375 380

Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val

385 390 395 400

Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys

405 410 415

Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu

420

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物620AM34

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gagtactatc ttgcatttgt actaggagtt tagtgaactt gc 42

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物680AM35

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

atggttatgg atttcgggga ttcttcgagc gtcccaaaac 41

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AM34

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

taggagttta gtgaacttgc 20

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AM35

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ttcgagcgtc ccaaaacc 18

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物620

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gagtactatc ttgcatttgt ac 22

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物680

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

atggttatgg atttcgggga t 21

<210>9

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Dope1

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>N在位点19是91％A，3％G，3％T，3％C

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>N在位点20是91％C，3％G，3％A，3％T

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>N在位点21是G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>N在位点is 88％C，12％A

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>N在位点23是90％T，3％G，7％A

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>N在位点24是47％G，8％A，45％T

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(25)

<223>N在位点25是9％G，91％A

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>N在位点26是83％G，4％A，9％T，4％C

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>N在位点27是T

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(28)

<223>N在位点28是91％T，3％G，3％A，3％C

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>N在位点29是91％C，3％G，3％A，3％T

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>N在位点30是G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

<223>N在位点31是91％G，3％C，3％A，3％T

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>N在位点32是91％G，3％C，3％A，3％T-

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>N在位点33是G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(34)..(34)

<223>N在位点34是91％A，3％G，3％T，3％C

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(35)

<223>N在位点35是91％A，3％G，3％T，3％C

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<223>N在位点36是95％T，5％G

<220>

<221>misc_feature

<222>(37)..(37)

<223>N在位点37是91％G，3％C，3％A，3％T

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(38)

<223>N在位点38是91％C，3％G，3％A，3％T

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)..(39)

<223>N在位点39是G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(40)

<223>N在位点40是95％T，5％G

<400>9

gatatgtgcc cgttcgacnn nnnnnntnnn nnnnnnnnnn cccccttctg tgacctattt 60

ac 62

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Dope1R

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

gtcgaacggg cacatatc 18

<210>11

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物L102TI

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>N在位点22是C或T

<400>11

agttcggcgt cgccgatctg ancccgttcg gggctaacca atc 43

<210>12

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物VE248+251X

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>N在位点21是A或C或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>N在位点22是A或C或G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>N在位点23是A或C或G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>N在位点30是A或C或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

<223>N在位点31是A或C或G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>N在位点32是A或C或G或T

<400>12

tatttaccgc ggaggagtat nnntcgtacn nntactacta tgacctcgac aag 53

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物V271AI

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>N在位点21是A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>N在位点22是C或T

<400>13

ccgggaacgc tctcggtcct nnccagggcg tcggatacgt caatg 45

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物G286X

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>N在位点24是A或C或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(26)

<223>N在位点25和26独立地是A或C或G或T

<400>14

atgagctgct tgcacgcttg accnnncaag ccgttcgaga cg 42

Claims

1.亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在位置125D的取代，其中

(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；

(b)每个位置对应于SEQ ID NO：2的位置；和

(c)所述变体是SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由SEQ ID NO：2衍生的多肽，并且该变体与Peniophora lyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶相比具有改进的热稳定性和/或比活性。

2.权利要求1的变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列差十，九，八，七，六，五，四，三，二，或仅一个氨基酸。

3.权利要求1或2的变体，其含有的取代选自下组：

(i)29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V；

(ii)29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S；

(iii)29S+99D+125D+324A+334E+350V；

(vi)29S+125D+218T+324A+344S+350V；

(v)29S+125D+234K+324A+330R；

(vi)29S+125D+234K+324A+330R+395G；

(vii)29S+125D+324A；

(viii)29S+125D+324A+330R+395G；

(ix)29S+125D+324A+350V；

(x)D29S+E125D+P324A+A334E+E344S+P421S；

(xi)D29S+E125D+P324A+D350T；和

(xii)D29S+E125D+P324A+N345H+L347P+D350V。

4.分离的核酸序列，其包含编码权利要求1-3任一变体的核酸序列。

5.核酸构建体，其包含权利要求4的核酸序列，所述核酸序列与一或多个指导所述多肽在适宜表达宿主中产生的调控序列可操纵连接。

6.重组表达载体，其包含权利要求5的核酸构建体。

7.重组宿主细胞，其包含权利要求5的核酸构建体和/或权利要求6的表达载体，其中所述重组宿主细胞是单细胞微生物或者真菌细胞。

8.权利要求7所述的重组宿主细胞，其是酵母细胞。

9.生产权利要求1-3中任一的变体的方法，其包含

(a)培养权利要求7的宿主细胞来生产包含所述变体的上清；和

(b)回收所述变体。

10.组合物，其包含至少一种权利要求1-3中任一的肌醇六磷酸酶变体，和

(a)至少一种脂肪可溶维生素；和/或

(b)至少一种水溶维生素。

11.权利要求10的组合物，其中所述组合物包含选自镁，锌，铁，铜，碘，硒和钴的痕量矿物质。

12.权利要求10或11的组合物，其还包含至少一种选自下述酶的酶：木聚糖酶，葡聚糖内切酶和蛋白酶。

13.权利要求12的组合物，其中所述葡聚糖内切酶是内切-1，3(4)-β葡聚糖酶。

14.权利要求10或11的组合物，其为动物饲料添加剂。

15.动物饲料组合物，其粗制蛋白质含量为50-800g/kg，并包含权利要求1-3任一的变体或权利要求10-14任一的组合物。

16.提高动物饲料营养价值的方法，其中将权利要求1-3任一的变体或权利要求10-14中任一的组合物加到所述饲料。

17.降低动物粪便中肌醇六磷酸/盐水平的方法，包含喂给动物有效量的权利要求15的动物饲料组合物。

18.处理植物蛋白质的方法，包含将权利要求1-3任一的变体或权利要求10、11、12、13或14的组合物加到至少一种植物蛋白质或蛋白质源中的步骤。

19.权利要求1-3任一的变体或权利要求10、11、12、13或14的组合物在如下的用途：降低动物粪便中肌醇六磷酸/盐水平；处理植物蛋白质；或从肌醇六磷酸酶底物释放磷。

20.权利要求1-3任一的变体或权利要求10、11、12、13或14的组合物在动物饲料制备中的用途。

21.权利要求1-3任一的变体或权利要求10、11、12、13或14的组合物在用于提高动物饲料营养价值中的用途。