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Phytasen
sind Enzyme, die Phytat (myo-Inositolhexakisphosphat) zu myo-Inositol
und anorganischem Phosphat hydrolisieren. Sie sind als wertvolle
Futterzusätze
bekannt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Phytasen, d.h. Phytasen
mit geänderten
Eigenschaften, z. B. geänderten
Aktivitätseigenschaften,
wobei z. B. auf die Phytase(n) Bezug genommen wird, von der sie abgeleitet
worden ist/sind, oder auf bekannte Phytasen. Geänderte Aktivitätseigenschaften
bedeutet, geändert in
mindestens einer Phytaseaktivitäts-bezogenen Hinsicht,
wie (nicht-ausschließliche
Liste): pH-Stabilität, Temperaturstabilität, pH-Profil,
Temperaturprofil, spezifische Aktivität (insbesondere in Bezug auf
pH und Temperatur), Substratspezifität, Substrat-Spaltmuster, Substratbindung,
Positionsspezifität,
die Geschwindigkeit und den Level der Freisetzung von Phosphat von
Getreide, Reaktionsgeschwindigkeit, Geschwindigkeit der Degradierung
von Phytat, erreichter Endlevel an freigesetztem Phosphat.
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Beispiele
von geänderten
Aktivitätseigenschaften
sind eine geänderte
spezifische Aktivität
(z. B. erhöht,
z. B. erhöht
bei einem pH von 3, 4, 5 oder 6); ein geändertes pH- oder Temperaturprofil;
und 1 oder eine geänderte
(z. B. erhöhte)
Thermostabilität,
z. B. eine erhöhte
Schmelztemperatur, wie unter Verwendung von Differentialrasterkalorimetrie
(Differential Scanning Calorimetry, DSC) gemessen.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung
eines modifizierten Proteins, in welchem in einem ersten Schritt
eine Consensussequenz von einer Anzahl von in hohem Grad homologen
Sequenzen bestimmt wird, gemäß den nachfolgenden
Schritten a), b) und c):
- a) mindestens drei,
bevorzugt mindestens 4 Aminosäuresequenzen
werden anhand von einem beliebigen im Stand der Technik bekannten
Standardabgleichprogramm abgeglichen („aligned");
- b) an jeder Position des Aminosäuresequenzabgleichs werden
die Aminosäuren
auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit
hin bewertet und ein Consensusrest wird durch ein beliebiges im
Stand der Technik bekanntes Standardprogramm ausgewählt, wobei
die Mindestanforderungen für
die Berechnung eines Consensusrests derart eingestellt werden, dass
das Programm bereits in der Lage ist, einen Consensusrest zu bestimmen, wenn
ein gegebener Rest in lediglich zwei der abgeglichenen Sequenzen
vorkommt. Wenn dort jedoch eine Untergruppe von Sequenzen zwischen
den verglichenen Aminosäuresequenzen
vorhanden ist, die einen sehr viel höheren Ähnlichkeitsgrad miteinander
zeigen als mit den verbleibenden Sequenzen des Abgleichs, kann die
Untergruppe in der Berechnung lediglich mit ihrer Consensussequenz
dargestellt werden, die auf die gleiche Weise bestimmt wird, wie
in EP 897985 erläutert, oder
es wird alternativ zu jeder Sequenz der Untergruppe ein Vote Weight
(„vote
weight") von 1,
dividiert durch die Anzahl an Sequenzen in der Untergruppe, festgesetzt;
- c) in dem Fall, dass keine Consensusaminosäure an einer definierten Position
von dem Programm identifiziert wird, wird eine beliebige der Aminosäuren, bevorzugt
die an dieser Position am häufigsten
vorkommende Aminosäure,
ausgewählt.
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In
einem zweiten Aspekt wird eine homologe Sequenz mit der Consensussequenz
verglichen und ein oder mehrere Nicht-Consensusreste in dieser homologen
Sequenz werden durch die entsprechenden Consensusreste ersetzt.
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Bevorzugt
werden lediglich solche Aminosäurereste
in der homologen Aminosäuresequenz
ersetzt, wo ein Consensusrest durch das Programm unter moderat stringenten
Bedingungen eindeutig definiert werden kann, während an allen Positionen des
Abgleichs, wo keine bevorzugte Consensusaminosäure unter moderat stringenten
Bedingungen bestimmt werden kann, die Aminosäuren des homologen Proteins
unverändert bleiben.
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In
einem dritten Aspekt wird das aktive Zentrum des interessierenden
Proteins bestimmt, welches alle Aminosäurereste, die in der Bildung
des aktiven Zentrums involviert sind, umfasst, sowohl in der Consensussequenz
als auch in der Sequenz eines homologen Proteins; nachfolgend werden
einige oder alle der abweichenden Aminosäurereste des homologen Proteins
in das Gerüst
(Rückgrad)
der Consensussequenz eingefügt.
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In
einer Ausführungsform
dieses Verfahrens, das für
den Vergleich der Aminosäuren
an einer definierten Position Bezug auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit
verwendet wird, ist das Programm „PRETTY".
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Das
aktive Zentrum des Proteins kann unter Verwenden einer Analyse der
dreidimensionalen Struktur des Proteins bestimmt werden.
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Ein
Beispiel eines homologen Proteins ist eine Enzymfamilie, ein Beispiel
einer definierten Proteinfamilie ist die Familie der Phytasen, z.
B. mit Herkunft von Pilzen.
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Die
Aminosäuresequenz
der Phytase kann beispielsweise durch die Einführung von mindestens einer Mutation
oder Substitution, ausgewählt
von
E58A | F54Y |
D69K | I73V |
D197N | K94A |
T214L | R101A |
E222T | N153K |
E267D | V158I |
R291I | A203G |
R329H | S205G |
S364T | V217A |
A379K | A227V |
G404A | V234L |
| P238A |
| Q277E |
| A287H |
| A292Q |
| V366I |
| A396S |
| E415Q |
| G437A |
| R451E |
verändert
werden.
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Zum
Interpretieren dieser Abkürzungen
ist als ein Beispiel die Mutation E58A wie folgt zu interpretieren:
Wenn 26 von der Zahl abgezogen wird, erhält man die Position oder die
Nummer des Restes in der Consensus-Phytasesequenz oder einer anderen
Phytasesequenz, abgeglichen wie in 1 gezeigt
(entsprechend zu der Addition einer Signalsequenz mit 26 Aminosäuren zu
den in 1 gezeigten Sequenzen). Zum Beispiel
bedeutet die Zahl 58 in E58A die Position Nummer 32 (58 – 26 = 32).
Und der Buchstabe vor der Zahl, d. h. E, stellt die in der Phytase
zu modifizierenden Aminosäure
dar, welche durch die Aminosäure
nach der Zahl ersetzt wird, d. h. A.
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Die
oben erwähnten
Ersetzungen von Aminosäuren,
alleine und/oder in Kombination, weisen eine positive Wirkung auf
die Proteinstabilität
auf.
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Die
folgenden Untergruppen von Mutationen sind ebenfalls interessant
(d. h. Phytasen, welche mindestens eine Mutation umfassen, ausgewählt aus
einer der Gruppen aus):
E58A, D69K, D197N, T214L, E222T, E267D,
R2911, R329H, S364T, A379K, G404A; F54Y, I73V, K94A, R101A, N153K,
V158I, A203G, S205G, V217A, A227V, V234L,
P238A, Q277E, A287H,
A292Q, V366I, A396S, E415Q, G437A, R451E;
E58A, D69K, D197N,
F54Y, I73V, K94A;
T214L, E222T, E267D, R101A, N153K, V158I;
R291I,
R329H, S364T, A203G, S205G, V217A;
A379K, G404A, A227V, V234L,
P238A, Q277E;
A287H, A292Q, V366I, A396S, E415Q, G437A, R451E;
T214L,
E222T, S364T, V158I, A203G, G404A, A227V, P238A, A396S, G437A, R451E.
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Beispiele
von Wirtszellen sind Pflanzenzellen, Tierzellen und mikrobielle
Zellen, zum Beispiel prokaryotische oder eukaryotische Zellen, wie
Bakterien-, Pilz- oder Hefezellen. Ein Beispiel eines Pilzwirtes
ist ein Stamm der Gattung Aspergillus und Beispiele von Hefewirten
sind Stämme
von Saccharomyces und Stämme von
Hansenula.
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Die
Erfindung offenbart ebenfalls ein modifiziertes Protein, das durch
ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist
oder erhalten wird.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls eine Variante oder Mutante einer Phytase,
wie (jedoch nicht hierauf beschränkt)
Consensus-Phytase-1, wobei in der Aminosäuresequenz aus 2 mindestens
eine der folgenden Ersetzungen bewirkt worden ist: Q50L, Q50T, Q50G,
Q50T-Y51N, Q50L-Y51N
oder Q50T-K91A.
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In
dem oben erwähnten
dritten Aspekt wird eine Consensussequenz von homologen Sequenzen,
wie oben beschrieben, bestimmt; in einem zweiten Schritt wird das
aktive Zentrum des Proteins, welches alle Aminosäurereste umfasst, die in die
Bildung des aktiven Zentrums involviert sind, in der Consensussequenz
und in der Sequenz eines einzelnen homologen Proteins bestimmt.
Das einzelne homologe Protein kann bevorzugte Eigenschaften aufweisen,
wie eine hohe spezifische Aktivität oder eine unterschiedliche
pH-Abhängigkeit
der enzymatischen Aktivität.
In einem dritten Schritt werden einige oder alle Aminosäurereste,
die in die Bildung des aktiven Zentrums des homologen Proteins involviert
sind, in das Gerüst
(Rückgrad)
der Consensussequenz eingefügt.
Das Ergebnis hiervon ist ein chimäres Protein, welches das von
einem einzelnen Protein abgeleitete aktive Zentrum, und das Gerüst (Rückgrad)
der Consensussequenz aufweist.
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Das
aktive Zentrum von einem Protein kann z. B. unter Verwenden jeder
beliebigen Analyse der dreidimensionalen Struktur des Proteins bestimmt
werden, z. B. durch Homologie-Modellierung
(„homology
modelling") auf
der Basis einer bekannten 3D-Struktur eines bekannten Proteins.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Consensusproteine bereit,
die durch solche Verfahren erhältlich
sind oder erhalten werden, insbesondere Proteine, die mindestens
eine der in den 2 bis 6, 10 oder 21 gezeigten
Aminosäuresequenzen
umfassen oder Varianten oder Mutanten hiervon. Beispiele von solchen
Varianten sind in den 7 bis 9 gezeigt.
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Solche
Varianten oder Mutanten können
definiert und hergestellt werden auf der Basis der Lehre, die in
der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 0897010 gegeben ist, z. B. Q50L, Q50T, Q50G,
Q50L-Y51N oder Q50T-Y51N. Diese Mutationen sind wie oben oder alternativ
unter Bezugnahme auf 2 definiert.
Wenn auf die 2 Bezug genommen wird,
ist keine Subtraktion des Signalpeptids mit 26 Aminosäuren erforderlich
(z. B. in „Q50L" ist an Position
50 der Aminosäuresequenz
aus 2 die Aminosäure Q durch die Aminosäure L ersetzt
worden).
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Eine
Nahrungsmittel-, Futter- oder pharmazeutische Zusammensetzung, welche
die Phytasen der Erfindung umfasst, ist ein anderer Aspekt der Erfindung.
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In
diesem Zusammenhang bedeutet „mindestens
3, bevorzugt mindestens 4 Aminosäuresequenzen einer
solchen definierten Proteinfamilie", dass drei, vier, fünf sechs bis zwölf zwanzig,
fünfzig
oder sogar mehr Sequenzen für
den Abgleich und den Vergleich verwendet werden können, um
die Aminosäuresequenz
des Consensusproteins zu erzeugen. „Sequenzen einer definierten
Proteinfamilie" bedeutet,
dass solche Sequenzen in eine dreidimensionale Struktur gefaltet
werden, in der bei die alpha-Helices, die beta-Faltblätter und
beta-Drehungen an der gleichen Position vorliegen, so dass solche
Strukturen, wie es von einem Fachmann bezeichnet wird, weitgehend überlagerbar
(„largely
superimposable")
sind. Weiterhin kennzeichnen diese Sequenzen Proteine, welche den
gleichen Typ an biologischer Aktivität zeigen, z. B. einer definierten
Enzymklasse, z. B. den Phytasen. Die dreidimensionale Struktur eines
solchen Proteins ist ausreichend, um das Modellieren der Struktur
der anderen homologen Proteine einer solchen Familie zu ermöglichen.
Ein Beispiel, wie dies erfolgen kann, ist in Beispiel 1 gegeben. „Evolutionäre Ähnlichkeit" in dem Zusammenhang
der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Schema, welches
Aminosäuren
in Bezug auf ihre strukturelle Ähnlichkeit klassifizieren,
was es erlaubt, dass eine Aminosäure
durch eine andere Aminosäure
ersetzt werden kann, mit einem minimalen Einfluss auf die Gesamtstruktur,
wie dies beispielsweise durch im Stand der Technik bekannte Programme,
wie „PRETTY", erfolgt. Der Satz „der Ähnlichkeitsgrad,
der von einem solchen Programm bereitgestellt wird ... ist auf eine
niedrige stringente Nummer eingestellt" bedeutet im Zusammenhang der vorliegenden
Erfindung, dass Werte für
die Parameter, welche den Ähnlichkeitsgrad
in dem Programm bestimmen, das für
das Ausführen
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in einer Weise gewählt werden,
die es dem Programm ermöglicht,
eine Consensusaminosäure
für ein
Maximum an Positionen der gesamten Aminosäuresequenz zu definieren, z.
B. kann im Fall des Programms „PRETTY" ein Wert von 2 oder
3 für die
THRESHOLD und ein Wert von 2 für
die PLURALITY gewählt
werden. Weiterhin bedeutet „ein
Vote Weight von einer geteilt durch die Anzahl solcher Sequenzen" in dem Zusammenhang
der vorliegenden Erfindung, dass die Sequenzen, welche eine Gruppe
von Sequenzen mit einem höheren Ähnlichkeitsgrad
als die anderen Sequenzen, die für
die Bestimmung der Consensussequenz verwendet werden, definieren,
lediglich mit einem Faktor, der gleich ist zu einer, geteilt durch
die Anzahl von allen Sequenzen dieser Gruppe ist, zu einer solchen
Bestimmung beitragen.
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Wie
zuvor erwähnt,
sollte es das Programm nicht erlauben, die Consensusaminosäure auszuwählen, die
häufigste
Aminosäure
wird ausgewählt;
sollte das letztgenannte nicht möglich
sein, wird der Fachmann eine Aminosäure aus all den Sequenzen,
die für
den Vergleich verwendet werden, auswählen, die im Stand der Technik
für ihre
Eigenschaft bekannt ist, die Thermostabilität in Proteinen zu verbessern,
wie beispielsweise diskutiert von Janecek, S. (1993), Process Biochem.
28, 435–445;
Fersht, A. R. & Serrano,
L. (1993), Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75–83; Alber, T. (1989), Annu.
Rev. Biochem. 58, 765–798;
Matthews, B. W. (1987), Biochemistry 26, 6885–6888; oder Matthews, B. W.
(1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17–21.
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Die
Stabilität
eines Enzyms ist für
zahlreiche industrielle Anwendungen relevant. Daher sind eine Vielzahl
von Versuchen, mehr oder weniger erfolgreich, vorgenommen worden,
um die Stabilität,
bevorzugt die Thermostabilität
von Enzymen, durch rationale und zufällige Ansätze zu verbessern.
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Wir
stellen hier einen alternativen Weg dar, um die Thermostabilität eines
Proteins zu verbessern.
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Die
Erfindung offenbart ein Verfahren für die Herstellung eines Consensusproteins,
welches ein Verfahren zum Berechnen eines Aminosäurerestes für nahezu alle Positionen eines
so genannten Consensusproteins und zum Synthetisieren eines vollständigen Gens
von dieser Sequenz, das in einem pro- oder eukaryotischen Expressionssystem
exprimiert werden kann, umfasst.
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DNA-Sequenzen
der vorliegenden Erfindung können
ausgehend von den genomischen oder cDNA-Sequenzen, welche die interessierenden
Proteine, z. B. Phytasen, kodieren, konstruiert werden. Zum Beispiel
können
sie anhand von Verfahren der in vitro Mutagenese konstruiert werden
[siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York]. Eine weit verbreitete und verwendete Strategie
für eine „ortsgerichtete
Mutagenese", wie
ursprünglich
von Hurchinson und Edgell [J. Virol. 8, 181 (1971)] behandelt, involviert
das Annealing (Annähern)
eines synthetischen Oligonukleotids, welches die gewünschte Nukleotidsubstitution
trägt,
zu einer Target-Region (Zielregion) einer einzelsträngigen DNA-Sequenz,
in welche die Mutation eingeführt
werden soll (für
einen Überblick
siehe Smith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985), und für verbesserte
Verfahren siehe Referenzen 2–6
in Stanssen et al., Nucl. Acids Res., 17, 4441–4454 (1989). Eine andere Möglichkeit
zum Mutieren einer gegebenen DNA-Sequenz ist die Mutagenese durch
Verwendung der Polymerasekettenreaktionen (PCR). DNA als Ausgangsmaterial
kann von den jeweiligen Stämmen
durch Verfahren isoliert werden, die im Stand der Technik bekannt
sind und beispielsweise in Sambrook et al. (Molecular Cloning) beschrieben
sind.
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Für Informationen
zu Stämmen,
siehe z. B.
EP 684313 oder
jede beliebige nachfolgend angezeigte Hinterlegungsstelle. Aspergillus
niger [ATCC 9142], Myceliophthora thermophila [ATCC 48102], Talaromyces thermophilus
[ATCC 20186] und Aspergillus fumigatus [ATCC 34625] sind neu hinterlegt
worden gemäß den Bedingungen
des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Cell Collection
unter den folgenden Zugriffsnummern: ATCC 74337, ATCC 74340, ATCC
74338 bzw. ATCC 74339. Es versteht sich jedoch, dass DNA, welche
ein Consensusprotein gemäß der vorliegenden
Erfindung kodiert, ebenfalls auf synthetische Weise hergestellt
werden kann, wie beispielsweise beschrieben in
EP 747483 oder
EP 897985 oder in den Beispielen, durch
im Stand der Technik bekannte Verfahren.
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Für Sequenzinformationen
siehe z. B.
EP 684313 oder
Sequenzdatenbanken, zum Beispiel wie Genbank (Intelligenetics, Californien,
USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge,
GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC,
USA) und Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre,
Madison, Wisconsin, USA).
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Das
Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um die Thermostabilität der Enzymphytase
zu verbessern.
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Sobald
vollständige
DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, können sie
in Vektoren eingeführt
werden, anhand von im Stand der Technik bekannter Verfahren und
wie in Sambrook et al. (s. o.) beschrieben, um das kodierte Polypeptid
in einem geeigneten Wirtssystem zu überexprimieren. Ein Fachmann
weiß jedoch,
dass ebenfalls die DNA-Sequenz selbst verwendet werden kann, um
das geeignete Wirtssystem der Erfindung zu transformieren, um eine Überexpression
des kodierten Polypeptids zu erhalten. Geeignete Wirtssysteme sind
zum Beispiel Pilze, wie Aspergilli, z. B. Aspergillus niger [ATCC
9142] oder Aspergillus ficuum [NRRL 3135] oder wie Trichoderma,
z. B. Trichoderma reesei, oder Hefen, wie Saccharomyces, z. B. Saccharomyces
cerevisiae oder Pichia, wie Pichia pastoris, oder Hansenula polymorpha,
z. B. H. polymorpha (DSM5215); oder Pflanzen, wie beispielsweise
beschrieben von Pen et al., Bio/Technology 11, 811–814 (1994).
Ein Fachmann weiß,
dass solche Mikroorganismen von den Hinterlegungsstellen erhältlich sind,
z. B. der American Type Culture Collection (ATCC), dem Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) oder der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH (DSM) oder jeder beliebigen Hinterlegungsstelle,
wie in der Zeitschrift „Industrial
Property" [(1991)
1, S. 29–40]
aufgelistet. Bakterien, die verwendet werden können, sind z. B. E. coli; Bacilli,
wie z. B. Bacillus subtilis; oder Streptomyces, z. B. Streptomyces
lividans (siehe z. B. Anné und
Mallaert in FEMS Microbiol. Lett. 114, 121 (1993). Bevorzugte Stämme von
E. coli, die verwendet werden können,
sind Stämme
von E. coli K12, z. B. M15 [beschrieben als DZ 291 von Villarejo
et al. in J. Bacteriol. 120, 466–474 (1974)], HB 101 [ATCC
Nr. 33694] oder E. coli SG13009 [Gottesman et al., J. Bacteriol.
148, 265–273
(1981)].
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Vektoren,
die für
die Expression in Pilzen verwendet werden können, sind im Stand der Technik
bekannt und beispielsweise in
EP
420358 oder von Cullen et al., [Bio/Technology 5, 369–376 (1987)],
Ward [Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for
Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York (1991)], Upshall et al.,
[Bio/Technology 5, 1301–1304
(1987)], Gwynne et al., [Bio/Technology 5, 71–79, (1987)], oder Punt et
al., [J. Biotechnol. 17, 19–34
(1991)]; und für
Hefen von Sreekrishna et al., [J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988),
Biochemistry 28, 4117–4125
(1989)], Hitzemann et al. [Nature 293, 717–722 (1981)] oder in
EP 183070 ,
EP 183071 ,
EP 248227 oder
EP 263311 beschrieben. Geeignete Vektoren,
die für die
Expression in E. coli verwendet werden können, sind beispielsweise von
Sambrook et al. [s. o.] Fiers et al. [Procd. 8th Int. Biotechnology
Symposium, Soc. Franc. de Microbiol., Paris (Durand et al., Hrsg.),
S. 680–697 (1988)],
Bujard et al. [Meth. Enzymol. 155, 416–433 (1987)], oder Stüber et al.
[Immunological Methods, Hrsg. Lefkovits und Pernis, Academic Press,
Inc. Band IV, 121–152
(1990)] genannt. Vektoren, die für
die Expression in Bacilli verwendet werden können, sind im Stand der Technik
bekannt und beispielsweise in
EP
207459 ,
EP 405370 ,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984) oder Yansura und Henner,
Meth. Enzymol. 185, 199–228 (1990)
beschrieben. Vektoren, welche für
die Expression in H. polymorpha verwendet werden können, sind
im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in Gellissen et
al., Biotechnology 9, 291–295
(1991) beschrieben.
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Jeder
dieser Vektoren trägt
bereits regulatorische Elemente, z. B. Promotoren, oder die DNA-Sequenzen der vorliegenden
Erfindung können
technisch so erzeugt werden, dass sie solche Elemente erhalten.
Geeignete Promotorelemente, welche verwendet werden können, sind
im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise für Trichoderma
reesei der cgh1- [Haarki et al., Biotechnology 7, 596–600 (1989)]
oder der pki1-Promotor [Schindler et al., Gene 130, 271–275 (1993)];
für Aspergillus
oryzae der amy-Promotor [Christensen et al., Abstr. 19th Lunteren
Lectures on Molecular Genetics F23 (1987), Christensen et al., Biotechnology
6, 1419–1422
(1988), Tada et al., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)]; und für Aspergillus
niger der glaA- [Cullen et al., Bio/Technology 5, 369–376 (1987),
Gwynne et al., Bio/Teehnology 5, 713–719 (1987), Ward in Molecular
Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi,
Marcel Dekker, New York, 83–106
(1991)], alcA- [Gwynne et al., Bio/Technology 5, 718–719 (1987)],
suc1- [Boddy et al., Curr. Genet. 24, 60–66 (1993)], aphA- [MacRae
et al., Gene 71, 339–348.
(1988), MacRae et al., Gene 132, 193–198 (1993)], tpiA- [McKnight
et al., Cell 46, 143–147
(1986), Upshall et al., Bio/Technology 5, 1301–1304 (1987)], gpdA- [Punt
et al., Gene 69, 49–57
(1988), Punt et al., J. Biotechnol. 17, 19–37 (1991)] und der pkiA-Promotor
[de Graaff et al., Curr. Genet. 22, 21–27 (1992)]. Geeignete Promotorelemente,
die für
die Expression in Hefe verwendet werden können, sind im Stand der Technik
bekannt und sind beispielsweise der pho5-Promotor [Vogel et. al.,
Mol. Cell. Biol., 2050–2057
(1989); Rudolf und Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340–1344 (1987)] oder
der gap-Promotor für
eine Expression in Saccharomyces cerevisiae; der aox1-Promotor [Koutz et
al., Yeast 5, 167–177
(1989); Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)]
für Pichia
pastoris; oder der FMD-Promoter [Hollenberg et al., EPA Nr. 0299108]
oder der MOX-Promotor [Ledeboer et al., Nucl. Acids Res. 13, 3063–3082 (1985)]
für H.
polymorpha.
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Demgemäß sind Vektoren,
welche die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen, bevorzugt
für die
Expression der DNA-Sequenzen in Bakterien oder einem Pilz- oder einem Hefewirt,
und solche transformierten Bakterien oder Pilz- oder Hefewirte ebenfalls
ein Teil der Erfindung.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls ein System bereit, welches die hohe Expression
von Proteinen ermöglicht,
insbesondere von den Phytasen der Erfindung, wie rekombinante Stämme von
Hansenula. Um dies zu erreichen, können die Codons der DNA-Sequenz
eines solchen Proteins auf der Basis einer Tabelle für die Codonhäufigkeit
des für
die Expression verwendeten Organismus, z. B. Hefe wie in dem vorliegenden
Fall (siehe z. B. in Beispiel 1) ausgewählt werden. Optional können die
Codons für
die Signalsequenz in einer Weise ausgesucht werden, wie sie für den spezifischen
Fall in Beispiel 1 beschrieben ist; das bedeutet, dass eine Tabelle
für die
Codonhäufigkeit
auf der Basis der Codons, die in den DNA-Sequenzen verwendet werden,
welche die Aminosäuresequenzen
der gegebenen Proteinfamilie kodieren, hergestellt wird. Dann werden
die Codons für
die Gestaltung der DNA-Sequenz der Signalsequenz aus einer Tabelle
für die
Codonhäufigkeit
der für die
Expression verwendeten Wirtszelle ausgewählt, wobei immer Codons von
einer vergleichbaren Häufigkeit in
beiden Tabellen verwendet werden.
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Sobald
solche DNA-Sequenzen in einer geeigneten Wirtszelle in einem geeigneten
Medium exprimiert worden sind, kann das kodierte Protein isoliert
werden, entweder aus dem Medium, in dem Fall, dass das Protein in
das Medium sekretiert wird, oder aus dem Wirtsorganismus, in dem
Fall, dass ein solches Protein intracellulär vorhanden ist, anhand von
im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Proteinaufreinigung
oder, wie in dem Fall einer Phytase, beispielsweise in
EP 420358 beschrieben. Demgemäß ist ein
Verfahren für
die Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, in
welchen, wie oben beschriebene, transformierte Bakterien oder Wirtszellen
unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert werden und das Polypeptid
hieraus gewonnen wird, und ein Polypeptid, wenn es durch ein solches
Verfahren hergestellt wird; oder ein Polypeptid, welches durch eine
DNA-Sequenz der
vorliegenden Erfindung kodiert wird, ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung.
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Sobald
sie erhalten wurden, können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung hinsichtlich ihrer Eigenschaften,
die sie für
die Landwirtschaft wertvoll machen, charakterisiert werden anhand
eines jeden beliebigen im Stand der Technik bekannten Assays.
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Im
Allgemeinen können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne
auf ein spezifisches Anwendungsgebiet beschränkt zu sein, beispielsweise
im Fall von Phytasen für
die Umwandlung von Inositolpolyphosphaten, wie Phytat, zu Inositol
und anorganischem Phosphat.
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Weiterhin
können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren für die Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung oder Nahrungsmittel- oder Futtermischungen
verwendet werden, wobei die Komponenten einer solchen Zusammensetzung
mit mindestens einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung vermischt
werden. Demgemäß sind Nahrungsmittel-
oder Futtermischungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen, welche
mindestens ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfassen, ebenfalls
ein Teil der vorliegenden Erfindung. Ein Fachmann ist mit dem Verfahren
ihrer Herstellung vertraut. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen
oder Nahrungsmittel- oder Futtermischungen können weiterhin Additive oder
Verbindungen, die im Allgemeinen für einen solchen Zweck verwendet
werden und im Stand der Technik bekannt sind, umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Reduzierung
der Level an Phytat in Dung von Tieren, in welchem ein Tier mit
einer solchen Futterzusammensetzung in einer Menge gefüttert wird, die
effektiv zum Umwandeln von Phytat, das in dem Futter enthalten ist,
zu niedrigeren Inositolphosphaten und/oder Inositol und anorganischem
Phosphat ist.
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In
dem vorliegenden Zusammenhang ist eine Phytase ein Enzym oder ein
Polypeptid, das Phytaseaktivität
aufweist. Eine Phytase kann beispielsweise eine myo-Inositolhexakisphosphatphosphorhydrolase,
wie (myo-Inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase, EC 3.1.3.8) und (myo-Inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase,
EC 3.1.3.26) sein.
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In
einer Ausführungsform
wird die Phytase aufgereinigt, d.h. mindestens 85%, bevorzugt mindestens 86,
87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% rein, wie anhand
von SDS-PAGE bewertet.
Die Phytase kann isoliert sein. Die Phytaseaktivität kann anhand
von jedem beliebigen im Stand der Technik bekannten Phytase-Assay
bestimmt werden, z. B. mit dem Assay, das hierin beschrieben wird
(siehe Beispiel 9). Die Assay-Temperatur kann die optimale Temperatur
für die
aktuelle Phytase sein und der Assay-pH kann der optimale pH der
aktuellen Phytase sein.
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Die
Assay-Temperatur kann beispielsweise ausgewählt werden innerhalb des Bereichs
von 20 bis 90°C
oder 30 bis 80°C
oder 35 bis 75°C,
zum Beispiel Temperaturen von 37°C,
50°C, 60°C oder 70°C.
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Der
Assay-pH kann beispielsweise ausgewählt werden innerhalb des Bereichs
von pH 2 bis 9, oder 3 bis 8 oder 3 bis 6, zum Beispiel Assay-pH-Werte
von 3, 4, 5, 6 oder 7 können
ausgewählt
werden.
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Die
Aminosäuresequenzhomologie
(oder Polypeptid- oder Aminosäurehomologie)
wird bestimmt als der Identitätsgrad
zwischen zwei Sequenzen. Dies kann geeigneterweise anhand von im
Stand der Technik bekannten Computerprogrammen bestimmt werden,
wie GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket [Program Manual
for the Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science
Drive, Madison, Wisconsin 53711, USA], siehe ebenfalls Needleman,
S. B. und Wunsch, C. D. (1970), J. Mol. Biol., 48, 443–453]. Bei
Release 9.1 zum Vergleichen von Polypeptidsequenzen ist das Length
Weight („length
weight") auf 0 eingestellt
und das Gap Weight („gap
weight") ist auf
3,0 eingestellt.
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Der
Grad der Identität
oder Homologie zwischen zwei DNA-(Nukleinsäure-)Sequenzen kann anhand von
im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen bestimmt werden,
wie GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket [Program Manual
for the Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive,
Madison, Wisconsin 53711, USA], siehe ebenfalls Needleman, S. B.
und Wunsch, C. D. (1970), J. Mol. Biol., 48, 443–453]. Bei Release 9.1 wird
GAP mit den folgenden Einstellungen für einen DNA-Sequenzvergleich
verwendet: GAP Creation Penalty („GAP creation penalty") von 50 und GAP
Extension Penalty („GAP extension
penalty") von 3.
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Geeignete
experimentelle Bedingungen zum Bestimmen, ob eine gegebene DNA-
oder RNA-Sequenz mit
einer spezifischen Nukleotid- oder Oligonukleotidsonde hybridisiert,
umfasst das Vorweichen des Filters, der die für die Hybridisierung zu überprüfenden DNA-
oder RNA-Fragmente
enthält,
in 5 × SSC
(Natriumchlorid/Natriumcitrat; (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T.
Maniatis 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl,
Cold Spring Harbor, New York) für
10 Min. und Prähybridisierung
des Filters in einer Lösung
aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's-Lösung, 0,5%
SDS und 100 μg/ml
denaturierter beschallter Lachssperma-DNA (Sambrook et al. 1989),
gefolgt von der Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine Konzentration
von 10 ng/ml einer Zufalls-geprimten („random-primed") (Feinberg. A. P.
und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), 32p-dCTP-markierten
(spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) Sonde
für 12
Stunden bei ungefähr
45°C.
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Der
Filter wird dann zweimal für
30 Minuten in 2 × SSC,
0,5% SDS und bei mindestens 55°C
(niedrige Stringenz), bei mindestens 60°C (mittlere Stringenz), bei
mindestens 65°C
(mittlere/hohe Stringenz), bei mindestens 70°C (hohe Stringenz) oder bei
mindestens 75°C
(sehr hohe Stringenz) gewaschen.
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Moleküle, mit
denen die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert,
können
unter Verwendung eines Röntgenfilms
detektiert werden.
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Phytasen
mit geänderter
Thermostabilität
oder thermostabile Phytasen sind ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Eine „thermostabile" Phytase ist eine
Phytase, die einen Tm (Schmelztemperatur) – wie anhand eines aufgereinigten
Phytaseproteins durch Differentialrasterkalorimetrie (DSC) gemessen – von mindestens 65°C aufweist.
Für die
DSC kann eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit verwendet werden,
z. B. von 10°C/Min.
In alternativen Ausführungsformen
beträgt
die Tm mindestens 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 oder 75°C. Oder die
Tm ist gleich oder niedriger als 150°C oder gleich oder niedriger
als 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115 oder 110°C. Demgemäß sind Beispiele für Intervalle
der Tm: 65 bis 150°C,
66 bis 150°C, – (etc.) – 75 bis
150°C; 65
bis 145°C
66 bis 145°C, – (etc.) – 75 bis
145°C, 65
bis 140°C, – (etc.) – 75 bis
140°C; – (etc.) – 65 bis
110°C, 66
bis 110°C, – (etc.) – 75 bis
110°C.
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Besondere
Bereiche für
die Tm sind die folgenden: zwischen 65 und 110°C; zwischen 70 und 110°C, zwischen
70 und 100°C;
zwischen 75 und 95°C
oder zwischen 80 und 90°C.
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In
den nachfolgenden Beispielen 9 und 10 wird die Messung der Tm anhand
von DSC beschrieben und die Tm's
einer Anzahl von Phytasen werden gezeigt.
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Die
optimalen Temperaturen sind ebenfalls angezeigt, da – als ein
alternatives Mittel – eine
thermostabile Phytase als eine Phytase definiert werden kann, die
ein Temperaturoptimum von mindestens 60°C aufweist. Bevorzugt wird die
optimale Temperatur gegenüber
dem Substrat Phytat oder Phytinsäure
bei pH 5,0 oder 5,5 bestimmt. Beispiel 9 beschreibt ein Beispiel
eines Phytase-Assays, einschließlich
einer Definition von Einheiten.
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In
alternativen Ausführungsformen
beträgt
die optimale Temperatur mindestens 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69 oder 70°C.
In einer besonderen Ausführungsform
ist die optimale Temperatur gleich zu oder geringer als 140°C oder gleich
zu oder geringer als 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105 oder 100°C. Demgemäß sind Beispiele
von Intervallen der optimalen Temperatur: 60 bis 140°C, 61 bis
140°C, – (etc.) – 70 bis
140°C; 60
bis 135°C,
61 bis 135°C, – (etc.) – 70 bis
135°C, 60
bis 130°C, – (etc.) – 70 bis
130°C; – (etc.) – 60 bis
100°C, 61 bis
100°C, – (etc.) – 70 bis
100°C.
-
Bevor
die vorliegende Erfindung ausführlicher
beschrieben wird, wird nachfolgend eine kurze Erläuterung
der beigefügten
Figuren gegeben.
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1:
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Gestaltung
der Consensussequenz der Phytase-1. Die Buchstaben stellen Aminosäurereste
in dem Ein-Buchstaben-Code dar. Die folgenden Sequenzen wurden für den Abgleich
verwendet: phyA von Aspergillus terreus 9A-1 [Mitchell, D. B., Vogel,
K., Weimann, B. J., Pasamontes, L. & van Loon, A., P. G. M. (1997), The
phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes
for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora
thermophila, Microbiology 143, 245–252); von Aminosäure (aa)
27; SEQ ID: NR: 1]; phyA von A. terreus cbs116.46 [
EP 897985 ]. A heat resistant phytase
of Aspergillus fumigatus with superior performance in animal experiments.
Phytase optimization and natural variability. In: The Biochemistry
of phytate and phytases (Hrsg. Rasmussen, S. K.; Raboy, V.; Dalbøge, H.
und Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers); von aa (Aminosäure) 27;
SEQ ID NR: 2; phyA von Aspergillus niger var. awamori. (Piddington
et al. (1993) Gene 133, 55–62;
von aa 27; SEQ ID NR: 3); phyA von A. niger T213 (
EP 897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 4);
phyA von A. niger Stamm NRRL3135 [van Hartingsveldt, W., van Zeijl,
C. M. F., Harteveld, G. M., Gouka, R. J., Suykerbuyk, M. E. G., Luiten,
R. G. M., van Paridon, P. A., Selten, G. C. M., Veenstra, A. E.,
van Gorcom, R. F. M., & van
den Hondel, C. A. M. J. J. (1993) Cloning, characterization and
overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus
niger. Gene 127, 87 – 94;
von aa 27; SEQ ID NR: 5]; phyA von Aspergillus fumigatus ATCC 13073
(Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Tessier, M. & van Loon, A.
F. G. M. (1997) Cloning, purification and characterization of a
heat stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus, Appl.
Environ. Microbiol. 63, 1696–1700;
von aa 25; SEQ ID NR: 6]; phyA von A. fumigatus ATCC 32722 (
EP 897985 ); von aa 27; SEQ
ID NR: 7); phyA von A. fumigatus ATCC 58128 (
EP 897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 8);
phyA von A. fumigatus ATCC 26906 (
EP
897985 ); von aa 27; SEQ ID NR: 9); phyA von A. fumigatus
ATCC 32239 (
EP 897985 );
von aa 30; SEQ ID NR: 10; phyA von Emericella nidulans [Pasamontes, L.,
Haiker, M., Henriquez-Huecas, M., Mitchell, D. B. & van Loon, A.
P. G. M. (1997a). Cloning of the phytases from Emericella nidulans
and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus. Biochim. Biophys.
Acta 1353, 217–223;
von aa 25; SEQ ID NR: 11]; phyA von Talaromyces thermophilus (Pasamontes
et al., 1997a) ; von aa 24; SEQ ID NR: 12); und phyA von Myceliophthora
thermophila (Mitchell et al., 1997; von aa 19; SEQ: ID NR: 13).
Der Abgleich wurde unter Verwendung des Programms PILEUP berechnet.
Die Location der Gaps (Lücken)
wurde von Hand verfeinert. Groß geschriebene
Aminosäurereste
in dem Abgleich an einer gegebenen Position gehören zu der Vereinigung von
Aminosäuren,
welche den Consensusrest bildet. In Fettdruck darunter wird die
berechnete Consensussequenz, die Aminosäuresequenz der endgültig erstellten
Consensus-Phytase (Fcp), gezeigt (SEQ ID NR: 14). Die Gaps (Lücken) in
der berechneten Consensussequenz werden von Hand aufgefüllt, gemäß den in
Beispiel 1 festgelegten Prinzipien.
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2:
-
Die
DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 15) des Consensusgens der Phytase-1 (fcp)
und der Primer, die für die
Genkonstruktion verwendet wurden. Die berechnete Aminosäuresequenz
(1, SEQ ID NR: 14) wurde in eine DNA-Sequenz umgewandelt
unter Verwendung des Programms BACKTRANSLATE [Devereux, J., Haeberli,
P. & Smithies,
O. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for
the VAX. Nucl. Acids Res. 12, 387–395], und der Tabelle für die Codonhäufigkeit
von in hohem Maß exprimierten
Hefegenen (GCG Programmpaket, 9.0). Das Signalpeptid der Phytase
von A. terreus cbs 116.46 wurde mit dem N-Terminus fusioniert. Die
in 2 gezeigte Aminosäuresequenz
ist die SEQ ID NR: 16. Die fett gedruckten Basen stellen die Sequenzen
der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das Gen zu erzeugen,
dar. Die Namen der jeweiligen Oligonukleotide sind alternierend
oberhalb oder unterhalb der Sequenz notiert. Die unterstrichenen Basen
stellen das Start- und Stoppcodon des Gens dar. Die kursiv geschriebenen
Basen stellen die zwei eingeführten
EcoRI-Stellen dar.
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3:
-
Abgleich
und Consensussequenz von fünf
Phytasen von Basidiomycete. Die Buchstaben stellen die Aminosäurereste
im Ein-Buchstaben-Code dar. Die Aminosäuresequenzen der Phytasen von
Paxillus involutus, phyA1 (von aa 21; SEQ ID NR: 17; und phyA2 (von
aa 21, WO 98/28409; SEQ ID NR: 18); Trametes pubescens (von aa 24,
WO 98/28409; SEQ ID NO: 19); Agrocybe pediades (von aa 19, WO 98/28409;
SEQ ID NR: 20); und Peniophora lycii (von aa 21, WO 98128409; SEQ
ID NR: 21), beginnend mit den in Klammern angegebenen Aminosäureresten,
wurden für
den Abgleich und die Berechnung der entsprechenden Consensussequenz,
genannt in „Basidio" (Beispiel 2; SEQ
ID NR: 22) verwendet. Der Abgleich wurde mit dem Programm PILEPUP
durchgeführt.
Die Lokation der Gaps wurden von Hand verfeinert. Die Consensussequenz wurde
anhand des Programms PRETTY berechnet. Während ein Vote Weight von 0,5
für die
zwei Phytasen von P. involutus bestimmt wurde, wurden alle anderen
Gene mit einem Vote Weight von 1,0 für die Berechnung der Consensussequenz
verwendet. An Positionen, an denen das Programm nicht in der Lage
war, einen Consensusrest zu bestimmen, enthielt die Basidio-Sequenz
einen Gedankenstrich. Groß geschriebene
Aminosäurereste
in dem Abgleich an einer gegebenen Position stellen die Vereinigung
von Aminosäuren
dar, die den Consensusrest festsetzt.
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4:
-
Gestaltung
der Consensusaminosäuresequenz
der Phytase-10. Durch Addieren der Sequenz der Phytase von Thermomyces
lanuginosus [Berka, R. M., Rey, M. W., Brown, K. M., Byun, T. & Klotz, A. V.
(1998) Molecular characterization and expression of a phytase gene
from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Appl. Environ.
Microbiol. 64, 4423–4427;
SEQ ID NR: 23] und der Consensussequenz der Phytasen von fünf Basidiomyceten
(SEQ ID NR: 22) zu dem Abgleich aus 1, wurde
eine verbesserte Consensussequenz anhand des Programms PRETTY berechnet.
Zusätzlich
wurde die Aminosäuresequenz
von A. niger T213 ausgelassen, und ein Vote Weight von 0,5 wurde
für die
verbleibenden zwei Phytasesequenzen von A. niger festgelegt. Für weitere
Informationen siehe Beispiel 2.
-
5:
-
DNA- und Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-10 (SEQ ID NR: 25 bzw. SEQ ID NR: 26).
-
Die
Aminosäuresequenz
ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes
geschrieben. Die Sequenz der Oligonukleotide, die verwendet wurden,
um das Gen zusammenzubauen, sind in Fettbuchstaben geschrieben.
Die Namen der jeweiligen Oligonukleotide und der Aminosäuren, die
sich in Bezug auf die Consensus-Phytase-1
unterscheiden, sind unterstrichen. Das Gen fcp10 wurde aus den folgenden
Oligonukleotiden zusammengebaut: CP-1, CP-2, CP-3.10, CP-4.10, CP-5.10, CP-6,
CP-7.10, CP-8.10, CP-9.10, CP-10.10, CP-11.10, CP-12.10, CP-13.10,
CP-14.10, CP-15.10, CP-16.10, CP-17.10, CP-18.10, CP-19.10, CP-20.10,
CP-21.10 und CP-22.10. Die neu synthetisierten Oligonukleotide sind
weiterhin durch die Zahl 10 gekennzeichnet. Die Phytase enthält die folgenden
32 Austausche in Bezug auf die Consensus-Phytase-1: Y54F, E58A, D69K, D70G, A94K, N134Q,
I158V, S187A, Q188N, D197N, S204A,
T214L, D220E, L234V, A238P, D246H, T251N, Y259N, E267D, E277Q, A283D, R291I, A320V, R329H, S364T, I366V, A379K, S396A, G404A,
Q415E, A437G, A463E. Die unterstrichenen Mutationen zeigen einen
Stabilisierungseffekt gegenüber
der Consensus-Phytase-1 an, wenn sie als Einzelmutationen in der Consensus-Phytase-1
getestet werden.
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6:
-
Abgleich
für die
Gestaltung der Consensus-Phytase-11 (SEQ ID NR: 27). Im Gegensatz
zu der Gestaltung der Consensus-Phytase-10, wurden für die Gestaltung
der Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-11 alle Phytase von Basidiomycete als unabhängige Sequenzen
unter Verwenden eines festgelegten Vote Weigth von 0,2 für jede Sequenz
von Basidiomycete verwendet. Zusätzlich
wurde die Aminosäuresequenz
von A. niger T213 wieder in diesem Abgleich verwendet.
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7:
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DNA-
und Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A (SEQ ID NR: 28 bzw.
SEQ ID NR: 29). Die Aminosäuresequenz
ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des
Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die ersetzten Aminosäurereste
(in Bezug auf die Consensus-Phytase-1) sind unterstrichen. Das Stoppcodon
des Gens ist durch einen Stern (*) markiert.
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8:
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DNA-
und Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A (SEQ ID NR: 30 bzw.
SEQ ID NR: 31). Die Aminosäuresequenz
ist oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des
Ein-Buchstaben-Codes geschrieben. Die ersetzten Aminosäurereste
(in Bezug auf die Consensus-Phytase-10) sind unterstrichen. Das
Stoppcodon des Gens ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet.
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9:
-
DNA-
und Aminosäuresequenz
der alpha-Mutante Q51T der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 (SEQ
ID NR: 32 bzw. SEQ ID NR: 33). Die Aminosäuresequenz ist oberhalb der
entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes
geschrieben. Die ersetzten Aminosäurereste (bezogen auf die Phytase
von A. fumigatus ATCC 13073) sind unterstrichen. Das Stoppcodon
des Gens ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet.
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10:
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DNA-
und Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-7 (SEQ ID NR: 34 bzw. SEQ ID NR: 35). Die Aminosäuren sind
oberhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes geschrieben.
Die Sequenz der Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das Gen
zusammenzubauen, sind in Fettbuchstaben geschrieben. Oligonukleotide
und Aminosäuren,
die ausgetauscht wurden (unter Bezug auf die Consensus-Phytase-1),
sind unterstrichen, und die entsprechenden Triplets sind in Kleinbuchstaben
geschrieben. Das Gen fcp7 wurde aus den folgenden Oligonukleotiden
zusammengebaut: CP-1, CP-2, CP-3, CP-4.7, CP-5.7, CP-6, CP-7, CP-8.7,
CP-9, CP-10.7, CP-11.7, CP-12.7, CP-13.7, CP-14.7, CP-15.7, CP-16, CP-17.7,
CP-18.7, CP-19.7, CP-20, CP-21 und CP-22. Die neu synthetisierten
Oligonukleotide sind zusätzlich durch
die Zahl 7 gekennzeichnet. Die Consensus-Phytase-7 enthält die folgenden
24 Austausche im Vergleich mit der originalen Consensus-Phytase-1:
S89D, S92G, A94K, D164S, P201S, G203A, G205S, H212P, G224A, D226T,
E255T, D256E, V258T, P265S, Q292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I,
A397S, S398A, G404A und A405S.
-
11:
-
Differentialrasterkalorimetrie
(DSC) von der Consensus-Phytase-1 und der Consensus-Phytase-10. Die Proteinproben
wurden auf ungefähr
50 bis 60 mg/ml konzentriert und extensiv gegen 10 mM Natriumacetat,
pH 5,0, dialysiert. Eine konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von
10°C/Min.
wurde bis zu 95°C
angewendet. DSC von der Consensus-Phytase-10 (obere Kurve) ergab
eine Schmelztemperatur von 85,4°C,
welche 7,3°C
höher ist
als der Schmelzpunkt der Consensus-Phytase-1 (78,1°C, untere
Kurve).
-
12:
-
Differentialrasterkalorimetrie
(DSC) von der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T und der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A.
Die Proteinproben wurden auf ungefähr 50 bis 60 mg/ml konzentriert und
extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante
Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min.
wurde bis zu 95°C
angewendet. DSC von der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T (obere
Kurve) ergab eine Schmelztemperatur von 88,6°C, während die Schmelztemperatur
der Consensus-Phytase-10-thermo-Q50T-K91A
mit 89,3°C
bestimmt wurde.
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13:
-
Vergleich
des Temperaturoptimums zwischen der Consensus-Phytase-1, der Consensus-Phytase-10 und der
Contensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T. Für die Bestimmung des Temperaturoptimums
wurde das Phytase-Standardassay aus Beispiel 9 für eine Reihe von Temperaturen
zwischen 37 und 86°C
durchgeführt. Der
verdünnte Überstand
von transformierten Stämmen
von S. cerevisiae wurde für
die Bestimmung verwendet. Die anderen Komponenten des Überstandes
wiesen keinen Einfluss auf die Bestimmung des Temperaturoptimums
auf: ∧,
Connensus-Phytase-1; ♢, Consensus-Phytase-10;
,
Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T.
-
14:
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ph-abhängiges Aktivitätsprofil
und Substratspezifität
der Consensus-Phytase-10 und ihrer Varianten thermo[3]-Q50T und
thermo[3]-Q50T-K91A. Die Phytaseaktivität wurde unter Verwenden des
Standardassays in geeigneten Puffern (siehe Beispiel 9) bei verschiedenen
pH-Werten bestimmt. Die Kurve a) zeigt das pH-abhängige Aktivitätsprofil
der Consensus- Phytase-10
(☐), Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T (·) und
Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A
(∧). Die
Kurve b) zeigt die entsprechende Substratspezifität, die durch
die Ersetzung von Phytat durch die angezeigten Verbindungen in dem
Standardassay getestet wurde; offene Balken, Consensus-Phytase-10;
graue Balken, Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T; dunkle Balken, Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A.
Die Zahlen entsprechen den folgenden Substraten: 1, Phytat; 2, p-Nitrophenylphosphat;
3, Phenylphosphat; 4, Fructose-1,6-bisphosphat; 5, Fructose-6-phosphat;
6, Glucose-6-phosphat; 7, Ribose-5-phosphat; 8, DL-Glycerol-3-phosphat;
9, Glycerol-2-phosphat; 10, 3-Phosphoglycerat; 11, Phosphoenolpyruvat;
12, AMP; 13, ADP; 14, ATP.
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15:
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ph-abhängiges Aktivitätsprofil
und Substratspezifität
der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T und der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A.
Die Phytaseaktivität
wurde unter Verwenden des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe
Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Die Kurve a) zeigt das
pH-abhängige
Aktivitätsprofil
von der Q50T- (
)
und der Q50T-K91A-Variante (·).
Die Kurve b) zeigt die entsprechenden Substratspezifitäten, die
durch die Ersetzung von Phytat in dem Standardassay durch die angezeigten
Verbindungen getestet wurde (offene Balken, Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T; ausgefüllte Balken
Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A. Die Substrate sind in den
Legenden der
14 aufgeführt.
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16:
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Differentialrasterkalorimetrie
(DSC) von der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T und der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A.
Die Proteinproben wurden auf ungefähr 50 bis 60 mg/ml konzentriert und
extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante
Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min.
wurde bis zu 95°C
angewendet. DSC von der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T (obere
Kurve) zeigte eine Schmelztemperatur von 84,7°C, während der Schmelzpunkt der
Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A bei 85,7°C festgestellt wurde.
-
17:
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Vergleich
des Temperaturoptimums zwischen der Consensus-Phytase-1, der Consensus-Phytase-1 thermo[3]
und der Contensus-Phytase-1 thermo[8]. Für die Bestimmung des Temperaturoptimums
wurde das Phytase-Standardassay bei einer Reihe von Temperaturen
zwischen 37 und 86°C
durchgeführt.
Protein, das aus dem Überstand
von transformierten Stämmen
von S. cerevisiae aufgereinigt wurde, wurde für die Bestimmung verwendet.
O, Cosnensus-Phytase-1; ☐, Consensus-Phytase-1 thermo[3];
,
Consensus-Phytase-1 thermo[8].
-
18:
-
Vergleich
des ph-abhängigen
Aktivitätsprofils
und der Substratspezifität
zwischen der Consensus-Phytase-1, der Consensus-Phytase-7 und der
Phytase von A. niger NRRL 3135. Die Phytaseaktivität wurde
unter Verwenden des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe
Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Der Graph a) zeigt
das pH-abhängige
Aktivitätsprofil
der Consensus-Phytase-1 (
),
der Phytase von A. niger NRRL 3135 (O) und der Consensus-Phytase-7
(
).
Der Graph b) zeigt die entsprechenden Substratspezifitäten, die
durch die Ersetzung von Phytat in dem Standardassay durch die angezeigten
Verbindungen getestet wurde (schwarze Balken, Phytase von A, niger
NRRL 3135; offene Balken, Consensus-Phytase-1; gestrichelte Balken,
Consensus-Phytase-7. Die Substrate sind in der Legende von
14 aufgelistet.
-
19:
-
Differentialrasterkalorimetrie
(DSC) von der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 und ihrer stabilisierten
alpha-Mutante, welche die folgenden Aminosäurenaustausche enthält: F55Y,
V100I, F114Y, A243L, S265P und N294D.
-
Die
Proteinproben wurden auf circa 50 bis 60 mg/ml konzentriert und
extensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante
Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min.
wurde bis zu 95°C
angewendet. DSC von der Phytase von A. fumigatus 13073 (untere Kurve)
zeigte eine Schmelztemperatur von 62,5°C, während der Schmelzpunkt der
alpha-Mutante bei
67,0°C festgestellt
wurde.
-
20:
-
Vergleich
der Temperaturoptima der Wildtyp-Phytase von A. fumigatus 13073,
ihrer alpha-Mutante
und einer weiter stabilisierten alpha-Mutante (E59A-S154N-R329H-S364T-G404A).
Für die
Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Phytase-Standardassay
bei einer Reihe von Temperaturen zwischen 37 und 75°C durchgeführt. Der
verdünnte Überstand
von transformierten Stämmen
von S. cerevisiae wurde für
die Bestimmung verwendet. Die anderen Komponenten in dem Überstand
wiesen keinen Einfluss auf die Bestimmung des Temperaturoptimums
auf. O, Phytase von A. fumigatus ATCC 13073;
,
alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073; ☐, alpha-Mutant-(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)-Q27T
von A. fumigatus ATCC 13073;
, alpha-Mutante-(E59A-S154N-R329H-S364T-G404A)-Q51T-K92A von A.
fumigatus ATCC 13073. Q51T und K92A entsprechen den Substitutionen
Q50T bzw. K91A der Consensus-Phytase-1.
-
21:
-
Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-12 (consphy12; SEQ ID NR: 36), welche eine
Anzahl von Resten aus der aktiven Seite enthält, die von der „Basidio"-Consensussequenz
auf die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A transferiert wurden
(unterstrichen).
-
22:
-
DNA-
und Aminosäuresequenz
von der Consensus-Phytase-3-thermo[11]-Q50T. Die Aminosäuren sind
unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes
geschrieben.
-
23:
-
DNA-
und Aminosäuresequenz
von der Consensus-Phytase-3-thermo[11]-Q50T-K91A. Die Aminosäuren sind
unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes
geschrieben.
-
24:
-
DNA-
und Aminosäuresequenz
von der Consensus-Phytase-10-thermo[5]-Q50T. Die Aminosäuren sind
unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes
geschrieben.
-
25:
-
DNA-
und Aminosäuresequenz
von der Consensus-Phytase-10-thermo[4]-Q50T-K91A. Die Aminosäuren sind
unterhalb der entsprechenden DNA-Sequenz unter Verwenden des Ein-Buchstaben-Codes
geschrieben.
-
Die
hierin erwähnten
Phytase-herstellenden Stämme
von Mikroorganismen d.h. Paxillus involutus CBS 100231; Peniophora
lycii CBS 686.96; Agrocybe pediades CBS 900.96; und Trametes pubescens
CBS 100232; wurden von natürlichen
Proben isoliert, die jeweils von Dänemark; Dänemark; Dänemark; und Schweden (die Uppsala-Sammlung)
stammten. Die Proben wurden im November 1992; Oktober 1993; Juni
1995; bzw. November 1995 gesammelt.
-
Beispiel 1
-
Consensus-Phytase-1
-
Die
Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-1 (fungale Consensus-Phytase, fcp) wurde gestaltet und
berechnet, wie in den Beispielen 1 und 2 von
EP 897985 beschrieben. Die nachfolgende
Tabelle 1 zeigt die Herkunft und das Vote Weight der Aminosäuresequenzen
der Phytasen, die für
die Gestaltung der Consensus-Phytase-1 verwendet wurden. Die Sequenz
der Consensus-Phytase-1 wurde weiterhin in eine DNA-Sequenz umgewandelt,
wie in Beispiel 3 von
EP 897985 beschrieben,
und das Gen der Consensus-Phytase-1 wurde konstruiert und kloniert,
wie in Beispiel 4 von
EP 897985 beschrieben.
-
Tabelle 1
-
Herkunft und
Vote Weight der Aminosäuresequenz
der Phytasen
-
phyA
von Aspergillus terreus 9A-1, aa 27, Vote Weight 0,5 (Mitchell et
al., 1997) phyA von Aspergillus terreus cbs116.46, aa 27, Vote Weight
0,5 (
EP 897985 ) phyA
von Aspergillus niger var. awamori, aa 27, Vote Weight 0,33 [Piddington,
C. S., Houston, C. S., Paloheimo, M., Cantrell, M., Miettinen-Oinonen,
A., Nevalainen, H. & Rambosek,
J. (1993) The cloning and sequencing of the genes encording Phytase
(phy) and ph 2.5-optimum acid phosphatase (aph) from Aspergillus
niger var. awamori. Gene 133, 55–62].
- – phyA von
Aspergillus niger T213 ( EP 897985 ),
aa 27, Vote Weight 0,33
- – phyA
von Aspergillus niger, Stamm NRRL3135, aa 27, Vote Weight 0,33 (van
Hartingsveldt et al., 1993)
- – phyA
von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, aa 26, Vote Weight 0,2 (Pasamontes
et al., 1997)
- – phyA
von Aspergillus fumigatus ATCC 32722, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Aspergillus fumigatus ATCC 58128, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 89 7985 )
- – phyA
von Aspergillus fumigatus ATCC 26906, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Aspergillus fumigatus ATCC 32239, aa 30, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Emericella nidulans, aa 25, Vote Weight 1,0 (Pasamontes et al.,
1997a)
- – phyA
von Talaromyces thermophilus ATCC 20186, aa 24, Vote Weight 1,0
(Pasamontes et al., 1997a)
- – phyA
von Myceliophthora thermophila, aa 19, Vote Weight 1,9 (Mitchell
et al., 1997)
-
Beispiel 2
-
Gestaltung einer verbesserten
Aminosäuresequenz
einer Consensus-Phytase (Consensus-Phytase-10)
-
Die
Abgleiche, die für
die Gestaltung der Consensus-Phytase-10 verwendet wurden, wurden
unter Verwenden des Programms PILEUP aus dem GCG-Sequenzanalysepaket,
Release 9.0 (Devereux et al., 1984), mit den Standardparameter (Gap
Creation Penalty 12, Gap Extension Penalty 4) berechnet. Die Lokalisation
der Gaps wurde unter Verwenden eines Texteditors verfeinert.
-
Die
folgenden Sequenzen wurden für
den Abgleich der Phytasen von Basidiomycete verwendet, beginnend
mit der Aminosäure
(aa), die in Tabelle 2 angegeben ist:
-
Tabelle 2
-
Herkunft und Vote Weight
von fünf
Phytasen von Basidiomycete, die für die Berechnung der entsprechenden Consensusaminosäuresequenz
(Basidio) verwendet wurden
-
- – phyA1
von Paxillus involutus CBS Nr. 100231, aa 21, Vote Weight 0,5 (WO
98/28409)
- – phyA2
von Paxillus involutus CBS Nr. 100231, aa 21, Vote Weight 0,5 (WO
98/28409)
- – phyA
von Trametes pubescens CBS Nr. 100232, aa 24, Vote Weight 1,0 (WO
98/28409)
- – phyA
von Agrocybe pediades CBS Nr. 900.96, aa 19, Vote Weight 1,0 (WO
98/28409)
- – phyA
von Peniophora lycii CBS Nr. 686.96, aa 21, Vote Weight 1,0 (WO
98/28409)
-
Der
Abgleich ist in 3 gezeigt.
-
In
Tabelle 3 sind die Gene aufgelistet, die für den endgültigen Abgleich verwendet wurden.
Die erste Aminosäure
(aa) der Sequenz, die in dem Abgleich verwendet wurde, ist hinter
der Bezeichnung des Organismus angegeben.
-
Tabelle 3
-
Herkunft und Vote Weight
der Phytasesequenzen, die für
die Gestaltung Consensus-Phytase 10 verwendet wurden
-
- – phyA
von Aspergillus terreus 9A-1, aa 27, Vote Weight 0,5 (Mitchell et
al., 1997)
- – phyA
von Aspergillus terreus cbs116.46, aa 27, Vote Weight 0,5 ( EP 897985 )
- – phyA
von Aspergillus niger var awamori, aa 27, Vote Weight 0,5 (Piddington
et al., 1993)
- – phyA
von Aspergillus niger, Stamm NRRL3135, aa 27, Vote Weight 0,5 (van
Hartingsveldt et al., 1993)
- – phyA
von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, aa 26, Vote Weight 0,2 (Pasamontes
et al., 1997)
- – phyA
von Aspergilluns fumigatus ATCC 32722, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Aspergilluns fumigatus ATCC 58128, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Aspergilluns fumigatus ATCC 26906, aa 26, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Aspergilluns fumigatus ATCC 32239, aa 30, Vote Weight 0,2 ( EP 897985 )
- – phyA
von Emericella nidulans, aa 25, Vote Weight 1,0 (Pasamontes et al.,
1997a)
- – phyA
von Talaromyces thermophilus ATCC 20186, aa 24, Vote Weight 1,0
(Pasamontes et al., 1997a)
- – phyA
von Myceliophthora thermophila, aa 19, Vote Weight 1,9 (Mitchell
et al., 1997)
- – phyA
von Thermomyces lanuginosus, aa 36, Vote Weight 1,0 (Berka et al.,
1998)
- – Consensussequenz
von fünf
Phytasen von Basidiomycetes, Vote Weight 1,0 (Basidio, 3)
-
Der
entsprechende Abgleich ist in 4 gezeigt.
-
Berechnung der Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-10
-
Um
den Abgleich zu verbessern, addierten wir die originale Consensussequenz
von fünf
Phytasen von vier verschiedenen Basidiomyceten (Basidio genannt;
welche noch die undefinierten Sequenzpositionen enthielten; siehe 3), nahezu alle Phytasesequenzen, die
für die
Berechnung der originalen Consensussequenzen der Phytasen verwendet
wurden, und eine neue Phytasesequenz von dem Ascomyceten Thermomyces
lanuginosus zu einem größeren Abgleich.
-
Wir
stellten die Plurality („plurality") auf 2,0 und Treshold
(„treshold") auf 3 ein. Die
verwendeten Vote Weights sind in Tabelle 3 aufgelistet. Der Abgleich
und die entsprechende Consensussequenz sind in 4 dargestellt.
Die neue Consensussequenz der Phytase weist 32 verschiedene Aminosäuren auf
im Vergleich zu der originalen Consensus-Phytase-1. Positionen,
für welche
das Programm PRETTY nicht in der Lage war, einen Consensusaminosäurerest
zu berechnen, wurden gemäß den in
Beispiel 1 angegebenen Regeln aufgefüllt. Keiner der von dem Programm
vorgeschlagenen Reste wurde ersetzt.
-
Weiterhin
schlossen wir in einer anderen Berechnung alle Phytasen von Basidiomycete
als einzelne Aminosäuresequenzen
ein, legten jedoch ein Vote Weight von 0,2 für die Berechnung fest. Der
entsprechende Abgleich ist in 6 gezeigt.
Die berechnete Consensusaminosäuresequenz
(Consensus-Phytase-11) weist die folgenden Unterschiede zu der Sequenz
der Consensus-Phytase-10 auf. Buchstabe X bedeutet, dass das Programm
nicht in der Lage war, eine Consensusaminosäure zu berechnen; die Aminosäure in Klammern
entspricht der Aminosäure,
die endgültig
in die Consensus-Phytase-10 eingeschlossen wurde.
-
D35X
(erster Buchstabe für
die Consensus-Phytase-10, letzter Buchstabe für die Consensus-Phytase-11), X(K)69K,
X(E)100E, A101R, Q134N, X(K)153N, X(H)190H, X(A)204S, X(E)220D,
E222T, V227A, X(R)271R, H287A, X(D)288D, X(K)379K, X(I)389I, E390X, X(E)415E,
X(A)416A, X(R)446L, E463A. Die Nummerierung ist die, wie in 5 angegeben.
-
Wir überprüften ebenfalls
Ersetzungen von einzelnen Aminosäuren,
die von den verbesserten Consensussequenzen 10 und 11 vorgeschlagen
wurden, auf ihren Einfluss auf die Stabilität der originalen Consensus-Phytase-1
hin. Der Ansatz ist in Beispiel 3 beschrieben.
-
Umwandlung der Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-10 in eine DNA-Sequenz
-
Die
ersten 26 Aminosäurereste
der Phytase von A. terreus cbs116.46 wurden als Signalpeptid verwendet
und mit dem N-Terminus der Consensus-Phytase-10 fusioniert. Die
verwendete Vorgehensweise ist weiter in Beispiel 1 beschrieben.
-
Die
resultierende Sequenz des Gens fcp10 ist in 5 gezeigt.
-
Konstruktion und Klonieren
des Gens der Consensus-Phytase-10 (fcp10)
-
Die
berechnete DNA-Sequenz von fcp10 wurde in Oligonukleotide von 85
Bp aufgeteilt, wobei abwechselnd die Sequenz des Sense- und des
Antisense-Strangs verwendet wurde. Jedes Oligonukleotid überlappt
mit 20 Bp mit dem vorangehenden und dem folgenden Oligonukleotid
des gegenüberliegenden
Stranges. Die Lokalisation aller Primer, die von Microsynth, Balgach
(Schweiz) bezogen wurden und in einer PAGE-aufgereinigten Form erhalten
wurden, ist in 5 angezeigt.
-
PCR-Reaktionen
-
In
drei PCR-Reaktionen wurden die synthetisierten Oligonukleotide zu
dem vollständigen
Gen zusammengesetzt. Für
die PCR wurde das „High
Fidelity" Kit von
Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)
und der Thermocycler „The ProtokolTM" von
AMS Biotechnology (Europa) Ltd. (Lugano, Schweiz) verwendet. Die
folgenden Oligonukleotide wurden in einer Konzentration von 0,2
pMol/ml verwendet.
Mix 1.10: CP-1, CP-2, CP-3.10, CP-4.10,
CP-5.10, CP-6, CP-7.10, CP-8.10, CP-9.10, CP-10.10
Mix 2.10: CP-9.10, CP-11.10,
CP-12.10, CP-13.10, CP-14.10, CP-15.10, CP-16.10, CP-17.10, CP-18.10, CP-19.10,
CP-20.10, CP-21.10, CP-22.10
-
Die
neu synthetisierten Oligonukleotide sind mit der Nummer 10 markiert.
Die Consensus-Phytase-10 enthält die folgenden
32 Austausche, welche in 5 unterstrichen
sind, im Vergleich zu der originalen Consensus-Phytase-1: Y54F,
E58A, D69K, D70G, A94K, N134Q, I158V, S187A, Q188N, D197N, S204A,
T214L, D220E, L234V, A238P, D246H, T251N, Y259N, E267D, E277Q, A283D,
R291I, A320V, R329H, S364T, I366V, A379K, S396A, G404A, Q415E, A437G,
A463E.
-
Vier
kurze PCR-Primer wurden für
den Zusammenbau der Oligonukleotide verwendet:
PCR-Reaktion
a: | 10 μl Mix 1.10
(2,0 pmol von jedem Oligonukleotid) |
| 2 μl Nukleotide
(10 mM von jedem Nukleotid) |
| 2 μl Primer
CP-a (10 pmol/ml) |
| 2 μl Primer
CP-c.10 (10 pmol/ml) |
| 10,0 μl PCR-Puffer |
| 0,75 μl Polymerase-Mischung
(2,6 U) |
| 73,25 μl H2O |
PCR-Reaktion
b: | 10 μl Mix 2.10
(2,0 pmol von jedem Oligonukleotid) |
| 2 μl Nukleotide
(10 mM von jedem Nukleotid) |
| 2 μl Primer
CP-b (10 pmol/ml) |
| 2 μl Primer
CP-e (10 pmol/ml) |
| 10,0 μl PCR-Puffer |
| 0,75 μl Polymerase-Mischung
(2,6 U) |
| 73,25 μl H2O |
Reaktionsbedingungen
für die
PCR-Reaktionen a und b:
Schritt
1 | 2
Min. – 45°C |
Schritt
2 | 30
Sek. – 72°C |
Schritt
3 | 30
Sek. – 94°C |
Schritt
4 | 30
Sek. – 52°C |
Schritt
5 | 1
Min. – 72°C |
-
Schritte
3 bis 5 wurden 40 mal wiederholt.
-
Die
PCR-Produkte (670 und 905 Bp) wurden durch Agarosegelelektrophorese
(0,9% Agarose) aufgereinigt, gefolgt von einer Gelextraktion (QIAEX
II Gelextraktionskit, Quiagen, Hilden, Deutschland). Die aufgereinigten
DNA-Fragmente wurden für
die PCR-Reaktion c verwendet.
PCR-Reaktion
c: | 6 μl PCR-Produkt
aus Reaktion a (≈ 50
ng) |
| 6 μl PCR-Produkt
aus Reaktion b (≈ 50
ng) |
| 2 μl Primer
CP-a (10 pmol/ml) |
| 2 μl Primer
CP-e (10 pmol/ml) |
| 10,0 μl PCR-Puffer |
| 0,75 μl Polymerase-Mischung
(2,6 U) |
| 73,25 μl H2O |
Reaktionsbedingungen
für die
PCR-Reaktion c:
Schritt
1 | 2
Min. – 94°C |
Schritt
2 | 30
Sek. – 94°C |
Schritt
3 | 30
Sek. – 55°C |
Schritt
4 | 1
Min. – 72°C |
-
Schritte
2 bis 4 wurden 31 mal wiederholt.
-
Die
resultierenden PCR-Produkte (1,4 kB) wurden wie oben angegeben aufgereinigt,
mit EcoRI verdaut und in einen EcoRI-verdauten und dephosphorylisierien
pBsk(–)-Vektor
(Stratagene La Jolla, CA, USA) ligiert. 1 μl der Ligationsmischung wurde
verwendet, um kompetente Zellen von E. coli XL-1 (Stratagene, La Jolla,
CA, USA) zu transformieren. Alle Standardvorgehensweisen wurden
ausgeführt,
wie von Sambrook et al. (1987) beschrieben. Die DNA-Sequenz des
konstruierten Gens (fcp10) wurden durch Sequenzieren, wie im Stand
der Technik bekannt, überprüft.
-
Beispiel 3
-
Erhöhen der Thermostabilität der Consensus-Phytase-1
durch das Einführen
von einzelnen Mutationen, nahegelegt durch die Aminosäuresequenzen
der Consensus-Phytase-10 und der Consensus-Phytase-11
-
Um
die Thermostabilität
von homologen Genen zu erhöhen,
ist es ebenfalls möglich,
den Stabilitätseffekt
von jedem abweichenden Aminosäurerest
zwischen dem interessierenden Protein und der berechneten Consensussequenz
zu überprüfen und
alle stabilisierenden Mutationen in dem interessierenden Protein
zu kombinieren. Wir verwendet die Consensus-Phytase-1 als interessierendes Protein
und überprüften den
Effekt von 34 Aminosäureresten
auf die Proteinstabilität,
die in Bezug auf die Consensus-Phytase-10 und/oder –11 durch
einzelne ortsgerichtete Mutagenese abwichen.
-
Um
Mutanten für
die Expression in A. niger, S. cerevisiae oder H. polymorpha zu
konstruieren, wurde das entsprechende Expressionsplasmid, welches
das Gen der Consensus-Phytase-1
enthielt, als Template für ortsgerichtete
Mutagenese verwendet (siehe Beispiele 6 bis 8). Mutationen wurden
unter Verwenden des „quick
exchangeTM site-directed mutagenesis kit" von Stratagene (La
Jolla, CA, USA) gemäß dem Protokoll
des Herstellers und unter Verwenden der entsprechenden Primer eingeführt. Alle
vorgenommenen Mutationen und die entsprechenden Primer sind in Tabelle
4 zusammengefasst. Plasmide, welche die gewünschte Mutation beherbergten,
wurden durch DNA-Sequenzanalyse, wie im Stand der Technik bekannt,
identifiziert.
-
Tabelle 4
-
Primer, die für die ortsspezifische
Mutagenese der Consensus-Phytase-1 verwendet wurden
-
Ausgetauschte
Basen sind in fett hervorgehoben. Die Einführung einer Restriktionsstelle
ist oberhalb der Sequenz markiert. Wenn eine Restriktionsstelle
in Klammern geschrieben ist, wurde die angegebene Stelle durch Einführen der
Mutation zerstört. Mutation
Primer-Set
und entsprechend
für andere
Mutationen.
-
Das
Temperaturoptimum der aufgereinigten Phytasen, die in Saccharomyces
cerevisiae exprimiert wurden (Beispiel 7), wurde, wie in Beispiel
9 angezeigt, bestimmt. Tabelle 5 zeigt den Effekt von jeder eingeführten Mutation
auf die Stabilität
der Consensus-Phytase-1.
-
Tabelle 5
-
Stabilitätseffekt
der Ersetzungen von einzelnen Aminosäuren in der Consensus-Phytase-1
-
+
oder – bedeutet
ein positiver bzw. ein negativer Effekt auf die Proteinstabilität bis zu
1°C, ++
und –– bedeutet
ein positiver bzw. ein negativer Effekt auf die Proteinstabilität zwischen
1 und 3°C;
die Zahlen 10 oder 11 in Klammern zeigen die Consensus-Phytase-Sequenz
an, durch welche der Austausch der Aminosäure nahegelegt wurde.
-
-
-
Wir
kombinierten acht positive Mutationen (E58A, D197N, E267D, R291I,
R329H, S364T, A379K, G404A) in der Consensus-Phytase-1 thermo[8]
unter Verwenden der oben in diesem Beispiel angegebenen Primer und
Technik. Weiterhin wurden die Mutationen Q50T und/oder K91A eingeführt, welche
hauptsächlich die
katalytischen Eigenschaften einer Phytase beeinflussen (siehe Patentanmeldungen
EP 897010 und
EP 897985 , ebenso wie Beispiel 9).
Die DNA- und Aminosäuresequenz
der resultierenden Phytase (Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A) sind in
7 gezeigt. Auf diesem Weg wurde das Temperaturoptimum und
der Schmelzpunkt für
die Consensus-Phytase um 7°C
erhöht
(
15,
16 und
17).
-
In
einem weiteren Consensusprotein kombinierten wir elf positive Mutationen
(E58A, D69K, D197N, T214L, E222T, E267D, R291I, R329H, S364T, A379K,
G404A) in der Consensus-Phytase-1
thermo[11]. Weiterhin wurden die Mutationen Q50T und/oder K91A eingeführt. Auf
diesem Weg wurde die Schmelztemperatur um weitere 3 bis 4°C erhöht im Vergleich
zu der Consensus-Phytase-1 thermo[8].
-
Unter
Verwenden der Resultate aus Tabelle 5 verbesserten wir die Thermostabilität der Consensus-Phytase-10
weiterhin durch die Rückmutationen
K94A, V158I und A396S, deren Umkehrung (reverse) (A94K, I158V und
S396A) einen starken negativen Einfluss auf die Stabilität der Consensus-Phytase-1
ergaben. Das resultierende Protein wurde Consensus-Phytase-10- thermo[3]
genannt. SEQ ID NR: 26 plus die drei Mutationen K94A, V158I und
A396S. Weiterhin führten
wir die Mutationen Q50T und K91A ein, die hauptsächlich die katalytischen Eigenschaften
einer Consensus-Phytase beeinflussen (siehe Patentanmeldungen
EP 897010 und
EP 897985 , ebenso wie Beispiel 9 und
14 und
15).
Die resultierende DNA- und Aminosäuresequenz ist in
8 gezeigt. Die optimierte Phytase zeigte
ein 4°C
höheres
Temperaturoptimum und einen 4°C
höheren
Schmelzpunkt als die Consensus-Phytase-10
(
12 und
13).
Weiterhin weist die Phytase ebenfalls eine stark erhöhte spezifische
Aktivität
mit Phytat als Substrat von 250 U/mg bei pH 5,5 auf (
14).
-
In
einem noch weiteren Consensusprotein wurden zwei zusätzliche
Mutationen in die Consensus-Phytase-10 thermo[3] eingeführt (E222T,
G437A), was die Consensus-Phytase-10 thermo[5] ergab. Weiterhin
wurden die Mutationen Q50T und/oder K91A eingeführt. Auf diesem Weg wurde die
Schmelztemperatur um weitere 1 bis 2°C erhöht im Vergleich zu der Consensus-Phytase-10
thermo[3].
-
Beispiel
-
Stabilisierung der Phytase
von A. fumigatus ATCC 13073 durch die Ersetzung von Aminosäureresten
durch die entsprechenden Consensus-Phytase-1- und/oder Consensus-Phytase-10-Reste
-
An
sechs Aminosäuresequenzpositionen,
an denen die Phytase von A. fumigatus 13073 die einzige oder nahezu
die einzige Phytase in dem Abgleich von 1 ist,
die nicht den entsprechenden Consensus-Phytase-Aminosäurerest
enthält,
wurde der Nicht-Consensusaminosäurerest
durch den Consensusaminosäurerest
ersetzt. Die folgenden Aminosäuren
wurden in der Phytase von A. fumigatus 13073 ersetzt, welche zusätzlich die
Substitution Q51(24)T (welche die katalytischen Eigenschaften beeinflusst
und der Substitution Q50T in den Consensus-Phytasen entspricht)
und die Signalsequenz der Phytase von A. terreus cbs116.46 enthält (siehe
Europäische
Patentanmeldung Nr. 0897010 und 9):
F55(28)Y, V100(73)I, F114(87)Y, A243(220)L, S265(242)P, N294(282)D.
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Nummerierung aus 1.
-
In
einer zweiten Runde, wenn vier der sieben stabilisierenden Aminosäureaustausche
(E58A, R329H, S364T, G404A), die in der Consensus-Phytase-10 identifiziert
wurden und als Einzelmutationen in der Consensus-Phytase-1 überprüft wurden
(Tabelle 5), wurden zusätzlich
in die alpha-Mutante von A. fumigatus eingeführt. Weiterhin wurde die Aminosäureersetzuung
S154N eingeführt,
von dem gezeigt wurde, dass er die Empfindlichkeit der Phytase gegenüber Proteasen
reduziert.
-
Die
Mutationen wurden wie in Beispiel 3 (siehe Tabelle 6) eingeführt und,
wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben, exprimiert. Die resultierenden
Phytasevarianten von A. fumigatus 13073 wurden alpha-Mutante (d.
h. die Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 mit dem Substitutionen
Q24T, F28Y, V73I, F87Y, A220L, S242P, N282D) und „optimierte" alpha-Mutante (d.
h. die alpha-Mutante von A. fumigatus, welche die zusätzlichen
Substitutionen E59A-S154N-R329H-S364T-G404A aufweist) genannt. K92A
ist eine weitere bevorzugte Mutation.
-
Das
Temperaturoptimum (60°C, 20) und die Schmelztemperatur (67,0°C, 19) der alpha-Mutanten-Phytase von A. fumigatus
13073 wurde um 5 bis 7°C
im Vergleich zu den Werten Wildtyp-Phytase (Temperaturoptimum 55°C, Tm: 60°C) erhöht. Die
fünf zusätzlichen
Ersetzungen von Aminosäuren
erhöhten das
Temperaturoptimum weiterhin um 3°C
(20).
-
Tabelle
6 Mutageneseprimer
für die
Stabilisierung der Phytase von A. fumigatus ATCC 13073 Mutation
Primer
-
Beispiel 5
-
Einführung der Aminosäurereste
der aktiven Seite der Phytase von A. niger NRRL 3135 in die Consensus-Phytase-1
-
Wir
verwendeten die Kristallstruktur der Phytase von Aspergillus niger
NRRL 3135, um alle Aminosäurereste
der aktiven Seite zu definieren (siehe Beispiel 1 und
EP 897010 ). Unter Verwenden des Abgleichs
aus
1 ersetzten wir die folgenden Reste der aktiven
Seite und zusätzlich
die nicht identischen benachbarten Reste der Consensus-Phytase-1
durch solche der Phytase von A. niger:
S89D, S92G, A94K, D164S,
P201S, G203A., G205S, H212P, G224A, D226T, E255T, D256E, V258T,
P265S, Q292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I, A397S, S398A, G404A
und A405S.
-
Die
neue Proteinsequenz Consensus-Phytase-7 wurde in eine DNA-Sequenz
rücktranslatiert (10), wie in Beispiel 1 beschrieben. Das
entsprechende Gen (fcp7) wurde erzeugt, wie in Beispiel 1 beschrieben,
unter Verwenden der folgenden Oligonukleotidmischungen:
Mix
1.7: CP-1, CP-2, CP-3, CP-4.7, CP-5.7, CP-6, CP-7, CP-8.7, CP-9,
CP-10.7
Mix 2.7: CP-9, CP-10.7, CP-11.7, CP-12.7, CP-13.7,
CP-14.7, CP-15.7, CP-16, CP-17.7,
CP-18.7, CP-19.7, CP-20, CP-21, CP-22.
-
Die
DNA-Sequenzen der Oligonukleotide sind in 10 angezeigt.
Die neu synthetisierten Oligonukleotide sind zusätzlich durch die Zahl 7 markiert.
Nach dem Zusammenbauen der Oligonukleotide unter Verwenden der gleichen
PCP-Primer, wie in Beispiel 1 angegeben, wurde das Gen in einem
Expressionsvektor kloniert, wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben.
-
Das
pH-Profil des Enzyms, das nach der Expression in H. polymorpha und
der Aufreinigung bestimmt wurde, war ähnlich zu dem der Phytase von
A. niger (siehe 18).
-
Beispiel 6
-
Expression der Consensus-Phytasegene
in Hansenula polymorpha
-
Die
Phytase-Expressionsvektoren, die verwendet wurden, um H. polymorpha
RB11 zu transformieren [Gellissen, G., Hollenberg, C. P., Janowicz,
Z. A. (1994) Gene expression in methylotrophic yeasts, in Smith, A.
(Hrsg.) S. 395–439],
wurden durch Einführen
des Eco RI-Fragments von pBsk-fcp oder Varianten hiervon in die
Mehrfachklonierungsstelle („multiple
cloning site") des
Expressionsvektors pFPMT121 von H. polymorpha, welcher auf einem
ura3-Selektionsmarker von S. cerevisiae, einem Formatdehydrogenase
(FMD)-Promotorelement
und einem Methanoloxidase (MO)-Terminatorelement von H. polymorpha
basiert, konstruiert. Das 5'-Ende
des Gens fcp wird mit dem FMD-Promotor fusioniert, das 3'-Ende mit dem MOX-Terminator
(Gellissen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46–54, 1996;
EP 299108 ). Die resultierenden
Expressionsvektoren werden mit pFPMTfcp, pFPMTfcp10 und pFPMTfcp7
bezeichnet.
-
Die
konstruierten Plasmide wurden in E. coli vermehrt. Plasmid-DNA wurde
unter Standardverfahren aus dem Stand der Technik aufgereinigt.
Die Expressionsplasmide wurden in den H. polymorpha Stamm RB11 transformiert,
der defizient in der Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase
(ura3) ist, unter Verwenden der Vorgehensweise zur Herstellung von
kompetenten Zellen und zur Transformation von Hefe, wie beschrieben
in Gellissen et al. (1996). Jede Transformationsmischung wurde auf
YNB-Medium (0,14% w/v Difco YNB und 0,5% Amoniumsulfat), enthaltend
2% Glucose und 1,8% Agar, ausplatiert und bei 37°C inkubiert. Nach 4 bis 5 Tagen wurden
einzelne Transformantenkolonien gepickt und in dem oben beschriebenen
Flüssigmedium
für zwei Tage
bei 37°C
wachsen gelassen. Nachfolgend wurde ein Aliquot dieser Kultur verwendet,
um frische Fläschchen
mit YNB-Medium,
die 2% Glucose enthielten, zu inokulieren. Nach sieben weiteren
Passagen in Selektivmedium ist der Expressionsvektor in das Hefegenom
in multimerer Form integriert worden. Nachfolgend wurden mitotisch
stabile Transformanten erhalten, durch zwei zusätzliche Kultivierungsschritte
in 3 ml nicht-selektivem flüssigem
Medium (YPD, 2% Glucose, 10 g/l Hefeextrakt und 20 g/l Pepton).
Um genetisch homogene rekombinante Stämme zu erhalten, wurde ein
Aliqout der letzten Stabilisierungskultur auf Selektivplatten platiert.
Einzelne Kolonien wurden isoliert für die Analyse der Expression
der Phytase in YNB, welches 2% Glycerol anstelle von Glucose enthielt,
um den FMD-Promotor zu derepressieren. Die Aufreinigung der Consensus-Phytasen
erfolgte wie in Beispiel 7 beschrieben.
-
Beispiel 17
-
Expression der Consensus-Phytasegene
in Saccharomyces cerevisiae und Aufreinigung der Phytasen aus dem
Kulturüberstand
-
Die
Consensus-Phytasegene wurden aus dem entsprechenden Bluescript-Plasmid
(pBsk-fcp, pBSK-fcp10, pBsk-fcp7) isoliert und in die Eco RI-Stellen
der Expressionskassette des Expressionsvektors pYES2 von Saccharomyces
cerevisiae ligiert (Invitrogen, San Diego, CA, USA) oder zwischen
den verkürzten GAPFL
(Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase)-Promotor und den pho5-Terminator subkloniert,
wie von Janes et al., Curr. Genet. 18, 97–103, beschrieben. Die korrekte
Orientierung des Gens wurde anhand von PCR überprüft. Die Transformation von
Stämmen
von S. cerevisiae, z. B. INVSc1 (Invitrogen, San Diego, CA, USA)
erfolgte gemäß Hinnen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–1933 (1978). Einzelne Kolonien,
welche das Phytasegen unter der Kontrolle des GAPFL-Promotors beherbergten,
wurden gepickt und in 5 ml Selektionsmedium [SD-uracil; Sherman,
J. P., Finck, G. R. & Hicks,
J. B. (1986) Laboratory course manual for methods in yeast genetics.
Cold Spring Harbor University], bei 30°C unter kräftigem Schütteln (250 upm) für einen
Tag kultiviert. Die Vorkultur wurde dann zu 500 ml YPD-Medium (Sherman
et al., 1986) hinzugefügt
und unter den gleichen Bedingungen wachsen gelassen. Die Induktion
des gal1-Promotors
erfolgte gemäß den Instruktionen
des Herstellers. Nach vier Tagen Inkubation wurde die Zellbrühe zentrifugiert
(7000 upm, GS3-Rotor, 15 Min., 5°C),
um die Zellen zu entfernen, und der Überstand wurde mittels Ultrafiltration
konzentriert in Amicon 8400 Zellen (PM30-Membranen; Grace AG, Wallizeller,
Schweiz) und ultrafreien-15 Zentrifugations-Filtervorrichtungen
(„ultrafree-15
centrifugal filter devices")
(Biomax-30K, Millipore, Bedford, MA, USA). Das Konzentrat (10 ml)
wurde über
eine 40 ml Sephadex G25 Superfine-Säule (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland)
entsalzt, mit 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, das als Elutionspuffer
diente. Die entsalzte Probe wurde auf 2 M (NH4)2SO4 gebracht und
direkt auf eine 1 ml Butyl Sepharose 4 hydrophobe Interaktions-Chromatographiesäule mit
geringem Durchfluss („Butyl
Sepharose 4 Fast Flow hydrophobic interaction chromatography colum)
(Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) geladen, welche mit einem
linearen Gradienten von 2 M bis 0 M (NH4)2SO4 in 10 mM Natriumacetat,
pH 5,0, eluiert wurde. Die Phytase wurde in den Durchschlag („breakthrough") eluiert, konzentriert
und auf eine 120 ml Sephacryl S-300 Gelpermeations-Chromatographiesäule (Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland) geladen. Die Consensus-Phytasen –1, –7 und –10 wurden
als homogener symmetrischer Peak eluiert und wurden mittels SDS-PAGE
als ungefähr
95% rein gezeigt.
-
Beispiel 8
-
Expression der Consensus-Phytasegene
in Aspergillus niger
-
Die
Bluescript-Plasmide pBsk-fcp, pBsk-fcp10, pBsk-fcp7 wurden als Template
für die
Einführung
einer Bsp HI-Stelle stromaufwärts
des Startcodons der Gene und einer Eco RV-Stelle stromabwärts des Stoppcodons verwendet.
Das ExpandTM High Fidelity PCR-Kit (Boehringer
Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde mit den folgenden Primern
verwendet:
-
-
Primer
Asp-2, verwendet zum Klonieren von fcp und fcp7:
-
Primer
Asp-3, verwendet zum Klonieren von fcp10
-
Die
Reaktion wurde, wie von dem Anbieter beschrieben, durchgeführt. Die
PCR-amplifizierten
fcp-Gene wiesen eine neue Bsp HI-Stelle an dem Startcodon auf, die
von dem Primer Asp-1 eingeführt
wurde, was in einer Ersetzung des zweiten Aminosäurerests Glycin durch Serin
resultierte. Nachfolgend wurde das DNA-Fragment mit Bsp HI und Eco
RV verdaut und in die NcoI-Stelle, stromabwärts von dem Glucoamylasepromotor
von Aspergillus niger (glaA), und die Eco RV-Stelle, stromabwärts von
dem Tryptophan C-Terminator von
Aspergillus nidulans (trpC), ligiert (Mullaney et al., 1985). Nach
diesem Klonierungsschritt wurden die Gene sequenziert, um mögliche,
durch die PCR eingeführte,
Fehler zu detektieren. Die resultierenden Expressionsplasmide, welche
grundsätzlich
dem pGLAC-Vektor, wie beschrieben in Beispiel 9 aus
EP 684313 , entsprechen, enthielten
das Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylasegen
(pyr4) von Neurospora crassa als einen Selektionsmarker. Transformation
von Aspergillus niger und die Expression der Consensus-Phytasegene erfolgte,
wie in
EP 684313 beschrieben.
Die Consensus-Phytasen wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, aufgereinigt.
-
Beispiel 9
-
Bestimmung
der Phytaseaktivität
und des pH und der Temperaturoptima
-
Dieses
Beispiel betrifft u. a. die Bestimmung der Phytaseaktivität und des
Temperaturoptimums. Zahlreiche Phytasen sind überprüft worden.
-
Die
Phytase von Aspergillus niger NRRL 3135 wurde, wie in
EP 420358 und von van Hartingsveldt
et al., (Gene 127, 87–94,
1993) beschrieben, hergestellt.
-
Die
Phytasen von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, Aspergillus terreus
9A-1, Aspergillus terreus cbs116.46, Emericella nidulans, Myceliophthora
thermophila und Talaromyces thermophilus wurden, wie in
EP 0897985 und den Referenzen
darin, hergestellt.
-
Die
verbleibenden überprüften Phytasen
wurden, wie hierin beschrieben, hergestellt.
-
Die
Consensus-Phytase-1 thermo[8] bezeichnet eine Variante der Consensus-Phytase-1,
welche weiterhin die acht Mutationen umfasst, welche in der Legende
von 5 unterstrichen sind. Die Consensus-Phytase-1
ist in 1 (SEQ ID NR: 14) ohne Signalpeptid
und in 2 (SEQ ID NR: 16) mit dem Signalpeptid gezeigt.
-
Die
Phytaseaktivität
wurde grundsätzlich,
wie von Mitchell et al. (1997) beschrieben, bestimmt. Die Aktivität wurde
in einer Assay-Mischung, die 0,5% Phytinsäure (≈ 5 mM) in 200 mM Natriumacetat,
pH 5,0, enthielt, gemessen. Nach 15 Min. Inkubation bei 37°C wurde die
Reaktion gestoppt, indem ein gleiches Volumen an 15% Trichloressigsäure zugefügt wurde.
Das freigesetzte anorganische Phosphat wurde quantifiziert, indem
100 μl der
Assay-Mischung mit 900 μl
H2O und 1 ml 0,6 M H2SO4, 2% Ascorbinsäure und 0,5% Ammoniummolybdat
gemischt wurde. Standardlösungen
von Kaliumphosphat wurden als Referenz verwendet. Eine Einheit Enzymaktivität wurde
definiert als die Menge an Enzym, die 1 μmol Phosphat pro Minute bei
37°C freisetzt.
Die Proteinkonzentration wurde unter Verwenden des Enzym-Extinktionskoeffizienten
bei 280 nm bestimmt, berechnet gemäß Pace et al. [Pace N. C.,
Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. (1995) How to measure and
predict the molar absorption coefficient of a protein. Prot. Sci.
4, 2411–2423]:
1 Absorptionseinheit (1 OD) bei 280 nm entspricht 1,101 mg/ml der
Consensus-Phytase-1, 1,068 mg/ml der Consensus-Phytase-7 und 1,039
mg/ml der Consensus-Phytase-10.
-
Für die Kurven
des pH-Optimums wurden die aufgereinigten Enzyme in 10 mM Natriumacetat,
pH 5,0, aufgereinigt. Die Inkubationen wurden durch Mischen von
Aliquots des verdünnten
Proteins mit einem gleichen Volumen an 1% Phytinsäure (≈ 10 mM) in
einer Reihe von verschiedenen Puffern gestartet: 0,4 M Glycin/HCl, pH
2,5; 0,4 M Acetat/NaOH, pH 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5; 0,4 M Imidazol/HCl,
pH 6,0, 6,5; 0,4 M Tris/HCl, pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. Kontrollexperimente
zeigten, dass der pH lediglich leicht durch den Mischungsschritt
beeinflusst wurde. Die Inkubationen wurden für 15 Min. bei 37°C durchgeführt, wie
oben beschrieben.
-
Für die Bestimmung
der Substratspezifitäten
der Phytasen wurde Phytinsäure
in der Assay-Mischung durch
5 mM Konzentrationen der jeweiligen Phosphatverbindungen ersetzt.
Darüber
hinaus wurden die Aktivitätstest,
wie oben beschrieben, durchgeführt.
-
Für die Bestimmung
des Temperaturoptimums wurden Enzym (100 μl) und Substratlösung (100 μl) prä-inkubiert,
für 5 Min.
bei der gegebenen Temperatur. Die Reaktion wurde durch die Zugabe
der Substratlösung
zu dem Enzym gestartet. Nach 15 Min. Inkubation wurde die Reaktion
mit Trichloressigsäure
gestoppt und die Menge an freigesetztem Phosphat wurde bestimmt.
-
Das
pH-Optimum der Consensus-Phytase-1 lag um pH 6,0 bis 6,5 (70 U/mg).
Die Einführung
der Mutation Q50T verschob das pH-Optimum auf pH 6,0 (130 U/mg).
Die Einführung
der Mutation K91A verschob das pH-Optimum weiterhin in den saueren
pH-Bereich. Vergleichbare Wirkungen der Mutationen Q50T und K91A
wurden ebenfalls für
die Consensus-Phytase-10 und für
weiter stabilisierte Consensus-Phytasevarianten beobachtet (14 und 15).
-
Die
Consensus-Phytase-7, welche konstruiert wurde, um die katalytischen
Eigenschaften der Phytase von A. niger NRRL 3135 auf die Consensus-Phytase-1
zu übertragen,
wies ein pH-Profil
auf, das sehr ähnlich zu
dem der Phytase von A. niger in NRRL 3135 war (siehe 18). Die Substratspezifität ähnelte ebenfalls mehr der von
der Phytase von A. niger NRRL 3135 als der der Consensus-Phytase-1.
-
Das
Temperaturoptimum der Consensus-Phytase-1 (71°C) war 16 bis 26°C höher als
die Temperaturoptima der Wildtyp-Phytasen (45 bis 55°C, Tabelle
7), die verwendet wurden, um die Consensussequenz zu berechnen.
Die verbesserte Consensus-Phytase-10 zeigte einen weiteren Anstieg
ihres Temperaturoptimums auf 80°C
(13).
-
Das
Temperaturoptimum der Consensus-Phytase-1 thermo[8] wurde in dem
gleichen Bereich gefunden (78°C),
wenn der Überstand
eines überproduzierenden
Stamms von S. cerevisiae verwendet wurde. Das höchste Temperaturoptimum, das
mit 82°C
erreicht wurde, wurde für
die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A bestimmt.
-
Tabelle 7
-
Temperaturoptima und Tm-Werte
der Consensus-Phytase und der Phytasen von A. fumigatus A. niger,
E. nidulans und M. thermophila
-
Die
Bestimmung des Temperaturoptimums wurde, wie in Beispiel 9 beschrieben,
durchgeführt.
Die Tm-Werte wurden durch Differentialrasterkalorimetrie bestimmt,
wie in Beispiel 10 beschrieben.
-
-
-
Beispiel 10
-
Bestimmung der Schmelztemperatur
durch Differentialrasterkalorimetrie (DSC)
-
Um
die Temperatur zu bestimmen, bei der Phytasen entfaltet sind („unfolding
temperature of the phytases"),
wurde die Differentialrasterkalorimetrie (DSC) angewendet, wie von
Brugger et al., 1997 [Brugger, R., Mascarello, F., Augem, S., van
Loon, A. P. G. M. & Wyss,
M. (1997).
-
Thermal
denaturation of phytases and pH 2.5 acid phosphatase studied by
differential scanning calorimetry. In The Biochemistry of phytate
and phytase (Hrsg. Rasmussen, S. K.; Raboy, V.; Dalbøge, H.
and Loewus, F.; Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande].
Lösungen
von 50 bis 60 mg/ml homogenen Phytasen wurde für die Tests verwendet. Eine
konstante Erhitzungsgeschwindigkeit von 10°C/Min. wurde bis zu 90 bis 95°C angewendet.
-
Die
bestimmten Schmelzpunkte bestätigen
die Ergebnisse, die für
die Temperaturoptima erhalten wurden (Tabelle 7). Die stabilste
Consensus-Phytase, die bislang gestaltet wurde, ist die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A,
welche eine Schmelztemperatur unter den gewählten Bedingungen von 89,3°C zeigt.
Dies ist 26,0 bis 33,6°C
höher als
die Schmelztemperatur der verwendeten Wildtyp-Phytasen.
-
Beispiel 11
-
Transfer der aktiven Seite
der Phytase von Basidiomycete in die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A
-
Wie
vorangehend beschrieben (Beispiel 5), wurden Mutationen, die von
der aktiven Seite der Phytase von Basidiomycete abgeleitet sind,
in die Consensus-Phytase-10 eingeführt. Die folgenden fünf Konstrukte
a) bis e) wurden hergestellt:
- a) Das Konstrukt,
welches Consensus-Phytase-12 genannt wird und eine ausgewählte Anzahl
an Resten der aktiven Seite der Basidio-Consensussequenz umfasst.
Seine Aminosäuresequenz
ist in 21 gezeigt (die ersten 26 Aminosäuren von
dem Signalpeptid; Positionen, die sich von der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A
unterscheiden, sind unterstrichen);
- b) ein Cluster von Mutationen (Cluster II) wurde in die Consensus-Phytase-1-
und -10-Sequenzen
transferiert, d.h.: S80Q, Y86F, S90G, K91A, S92A, K93T, A94R, Y95I;
- c) auf eine ähnliche
Weise wurde ein anderes Cluster an Mutationen (Cluster III) transferiert,
d.h.: T129V, E133A, Q134N, M136S, V137S, N138Q, S139A;
- d) auf eine ähnliche
Weise wurde ein weiteres Cluster an Mutationen (Cluster IV) transferiert,
d.h.: A168D, E171T, K172N, F173W;
- e) und schließlich
wurde ein weiteres Cluster an Mutationen (Cluster V) transferiert,
d.h.: Q297G, S298D, G300D, Y305T.
-
Diese
Konstrukte wurden, wie in den Beispielen 6 bis 8 beschrieben, exprimiert.
-
Beispiel 12:
-
Phytase-Abgleich unter
Verwendung von GAP
-
Die
hierin beschriebenen Phytasen – d.
h. die Aminosäuresequenzen
ebenso wie die entsprechenden DNA-Sequenzen – wurden gegeneinander abgeglichen.
Ebenfalls wurden einige andere Phytasen entsprechend abgeglichen,
d.h. die folgenden:
- – die Consensus-Phytase-1,
beschrieben in EP 897985 ;
- – die
Phytase, die von Aspergillus niger (ficuum) NRRL 3135 (A. niger
NRRL 3135) abgeleitet worden sind, beschrieben in EP 420358 ;
- – die
Phytasen, die von Aspergillus fumigatus ATCC 13073 (A. fumigatus
13073); Aspergillus fumigatus ATCC 32239 (A. fumigatus 32239); Aspergillus
terreus cbs116.46 (A. terreus cbs); Emericella nidulans (E. nidulans);
und Talaromyces thermophilus (T. thermophilus) abgeleitet worden
sind – alle
beschrieben in EP 897010 ;
- – die
Phytasen, die von Myceliophthora thermophila (M. thermophila); und
Aspergillus terreus 9-A1 (A. terreus 9-A1) abgeleitet worden sind – beide
beschrieben in 684313;
- – die
Phytase, die von Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) abgeleitet
worden ist, beschrieben in WO 9735017 (PCT/US97/04559);
- – die
Phytasen, die von Agrocybe pediades (A. pediades), Paxillus involutus
1 und 2 (P. involutus phyA1 und phyA2); und Trametes pubescens (T.
pubescens) abgeleitet worden sind – alle beschrieben in WO 98128409;
and
- – die
Phytase, die von Peniophora lycii (P. lycii) abgeleitet worden ist,
beschrieben in WO 98/28408.
-
Für diese
Abgleich wurde das Programm GAP verwendet, mit den oben beschriebenen
Einstellungen.
-
Für die Polypeptidvergleiche
wurden die Signalpeptide eingeschlossen, mit Ausnahme der Vergleiche mit
der Consensus-Phytase-11.
-
Die
Ergebnisse der Aminosäuresequenzenvergleiche
sind in der nachfolgenden Tabelle 8 aufgezeigt. Die erste Zahl in
jeder Zelle (in jedem Kästchen)
ist die Aminosäureähnlichkeit,
die zweite Zahl ist die Aminosäureidentität.
-
Für DNA-Sequenzvergleiche
wurde die Signalsequenz immer eingeschlossen. Die Resultate sind
in der nachfolgenden Tabelle 9 gezeigt.
-
Diese
Erfindung offenbart beispielsweise die folgenden Ausführungsformen
(A) bis (J), die nachfolgend beschrieben sind.
-
In
diesen Ausführungsformen
wird ihre Aminosäuresequenz,
wenn % Identität
oder % Ähnlichkeit
an dem Aminosäurelevel
für eine
andere Phytase bestimmt wird, mit der Referenzsequenz abgeglichen
(z. B. in der Ausführungsform
(A) der Aminosäuresequenz
der Consensus-Phytase-10) unter Verwenden eines Abgleichprogramms
(„aligment
program"), wie GAP,
auf das oben Bezug genommen wird. Der Prozentsatz an Identität, ebenso
wie der Prozentsatz an Ähnlichkeit,
wird von dem Programm berechnet. Die Aminosäuresequenz der anderen Phytase
kann oder kann nicht das Signalpeptid einschließen.
-
Wenn
% Identität
an dem DNA-Level für
eine andere Phytase-kodierende DNA bestimmt wird, wird diese DNA-Sequenz
mit der Referenzsequenz abgeglichen [z. B. in der Ausführungsform
(A), den Nukleotiden 12 bis 1412 aus SEQ ID NR: 25 (die DNA-Sequenz
der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt)] unter
Verwenden eines Abgleichprogramms wie GAP, auf das oben Bezug genommen
wird. Der Prozentsatz an Identität
wird von dem Programm berechnet. Die DNA-Sequenz, welche die andere
Phytase kodiert, kann eine genomische DNA-Sequenz sein, welche Introns
einschließt,
oder es kann eine cDNA-Sequenz sein. Sie kann oder kann nicht den
Signalpeptid-kodierenden Teil einschließen.
-
Wenn
eine Hybridisierung bestimmt wird, ist die zu verwendende Sonde
die spezifizierte DNA-Sequenz [z. B. in der Ausführungsform (A), die Nukleotide
12 bis 1412 aus SEQ ID NR: 25 (die DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10
(Fcp10), wie in 5 gezeigt)].
-
Die
DNA-Sequenz, welche die andere Phytase kodiert, kann eine genomische
DNA-Probe sein, welche eine Phytase-kodierende DNA-Sequenz enthält; eine
aufgereinigte genomische DNA-Sequenz (aufgereinigt in Bezug auf
die Phytase-kodierende DNA-Sequenz); oder sie kann eine Phytase-kodierende
cDNA-Sequenz sein, bevorzugt aufgereinigt oder amplifiziert, z.
B. PCR-amplifiziert. Die Phytase-kodierende DNA, von welchem Typ
auch immer, kann oder kann nicht den Signalpeptid-kodierenden Teil
einschließen.
Auf geeignete Hybridisierungsbedingungen wird oben Bezug genommen.
-
Der
Begriff „DNA-Sequenz" schließt solche
Fragmente oder Teile der hierin beispielhaft aufgeführten DNA-Sequenzen
ein, solange sie in der Lage sind, ein aktives Enzym (z. B. eine
Phytase) zu kodieren.
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Der
Begriff „Aminosäuresequenz" schließt solche
Fragmente oder Teile von hierin beispielhaft aufgeführten Aminosäuresequenzen
ein, solange sie enzymatisch aktiv sind (z. B. Phytaseaktivität entfalten).
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(A) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-10 (CP10, Fcp10)
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 93,80%; oder mindestens 94, 94,5, 95,
95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der
Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt,
ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 95,09%; oder mindestens 95,5, 96, 96,5,
97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich
zu der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-10 ist.
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Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5%
identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10
(Fcp10), wie in 5 gezeigt, ist.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens
95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5%
identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen,
hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 12
bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10 (Fcp10), wie in 5 gezeigt, hybridisiert. Eine geeignete
Negativkontrolle ist DNA, welche die Consensus-Phytase-1 kodiert.
Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige von CP10,
CP10-thermo[3]-Q50T,
K91A, CP1-thermo[8], CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 93,80%; oder mindestens 94, 94,5, 95,
95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz
der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-10 (Fcp 10), wie in 5 gezeigt,
ist.
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(B) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 93,37%; oder mindestens 93,5 94, 94,5,
95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit
der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, ist.
-
Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 94,66%; oder mindestens 95,0 95,5, 96,
96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu der Sequenz der Aminosäuren 1 bis
467 der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A, wie in 8 gezeigt, ist.
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Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5%
identisch mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A,
wie in 8 gezeigt, ist.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert und welche (i) mindestens
95,88%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5%
identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren
hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden
12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A,
wie in 8 gezeigt, hybridisiert. Eine
geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Consensus-Phytase-1
kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige von
CP10, CP10-thermo[3]-Q50T-K91A, CP1-thermo[8] oder CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 93,37%; oder mindestens 93,5 94, 94,5,
95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der
Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-10-thermo[3]-Q50T-K91A,
wie in 8 gezeigt, ist.
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(C) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-1-thermo[8]
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 98,30%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5%
identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie
in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K
sind hinzuzufügen)
ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 98,51%; oder mindestens 99, 99,5% ähnlich zu
der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8]
(wie in 7 gezeigt, Rückmutationen
T50Q und A91K sind hinzuzufügen)
ist.
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Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
98,73%; oder mindestens 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden
1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie
in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K
sind hinzuzufügen)
ist.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens
98,73%; oder mindestens 99, 99,5% identisch ist; oder (ii) unter
niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen
mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8] (wie
in 7 gezeigt, Rückmutationen T50Q und A91K
sind hinzuzufügen)
hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die
Consensus-Phytase-1 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist
DNA, welche eine beliebige von CP1-thermo[8], CP1-thermo[8]-Q50T-K91A
kodiert.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 98,30%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5%
identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8]
(wie in 7 gezeigt, Rückmutationen
T50Q und A91K sind hinzuzufügen) ist.
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(D) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 97,87%; oder mindestens 98, 98,5, 99,
99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-
thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt,
ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 98,08%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu
der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt, ist.
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Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
98,37%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% identisch mit den Nukleotiden
1 bis 1407 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A,
wie in 7 gezeigt, ist.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens
98,37%; oder mindestens 98,5, 99, 99,5% identisch ist; oder (ii)
unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen oder sehr hohen
Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 1 bis 1407 der DNA-Sequenz
der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A, wie in 7 gezeigt,
hybridisiert. Eine geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die
Consensus- Phytase-1
kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche eine beliebige
von, CP1-thermo[8],
CP1-thermo[8]-Q50T-K91A kodiert.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 97,87%; oder mindestens 98, 98,5, 99,
99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der Consensus-Phytase-1-thermo[8]-Q50T-K91A,
wie in 7 gezeigt, ist.
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(E) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-11
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 90,71%; oder mindestens 91, 91,5, 92,
92,5 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5,
99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 482 der Consensus-Phytase-11,
wie in 6 gezeigt, ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 92,07%; oder mindestens 92,5, 93, 93,5,
94, 94,5 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu
der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 482 der Consensus-Phytase-11, wie in 6 gezeigt,
ist.
-
Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 90,71%; oder mindestens 91, 91,5, 92,
92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99,
99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 482 der Consensus-Phytase-11,
wie in 6 gezeigt, ist.
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(F) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die alpha-Mutante von A. fumigatus
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 97,17%; oder mindestens 97,5, 98, 98,5,
99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der alpha-Mutante
von A. fumigatus (Phytase), wie in 9 gezeigt,
ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 97,82%; oder mindestens 98, 98,5, 99,
99,5% ähnlich
zu der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der alpha-Mutante
von A. fumigatus (Phytase), wie in 9 gezeigt,
ist.
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Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
96,13%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch
mit den Nukleotiden 1 bis 1401 der DNA-Sequenz der alpha-Mutante
von A. fumigatus ATCC 13073 (Phytase), wie in 9 gezeigt,
ist.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 97,17%; oder mindestens 97,5, 98, 98,5,
99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis 467 der alpha-Mutante
von A. fumigatus ATCC 13073 (Phytase), wie in 9 gezeigt,
ist.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens
96,13%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch
ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen
oder sehr hohen Stringenzhedingungen mit den Nukleotiden 1 bis 1407
der DNA-Sequenz der alpha-Mutante von A. fumigatus ATCC 13073 (Phytase),
wie in 9 gezeigt, hybridisiert. Eine
geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Phytase der alpha-Mutante
von A. fumigatus ATCC 13073 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle
ist DNA, welche eine beliebige der Phytase von der alpha-Mutante
von A. fumigatus ATCC 13073 oder der optimierten alpha-Mutante kodiert.
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(G) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die optimierte alpha-Mutante von A. fumigatus
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 96,08%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5,
98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Phytase der optimierten
alpha-Mutante von A. fumigatus ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 96,74%; oder mindestens 97, 97,5, 98,
98,5, 99, 99,5% ähnlich
zu der Sequenz der Phytase der optimierten alpha-Mutante von A.
fumigatus ist.
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Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
95,63%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5%
identisch mit den Nukleotiden 1 bis 1401 der DNA-Sequenz, welche
die Phytase der optimierten alpha-Mutante von A. fumigatus kodiert,
ist.
-
Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 96,08%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5,
98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Phytase der optimierten alpha-Mutante
von A. fumigatus ist.
-
Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens
95,63%; oder mindestens 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5%
identisch ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen,
hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 1
bis 1407 der DNA-Sequenz, welche die Phytase der optimierten alpha-Mutante
von A. fumigatus kodiert, ist.
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Eine
geeignete Negativkontrolle ist DNA, welche die Phytase von A. fumigatus
ATCC 13073 kodiert. Eine geeignete Positivkontrolle ist DNA, welche
eine beliebige der Phytase von der alpha-Mutante von A. fumigatus
ATCC 13073 oder der optimierten alpha-Mutante kodiert.
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(H) Phytasen und entsprechende
DNA-Sequenzen in Bezug auf die Consensus-Phytase-7
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 94,87%; oder mindestens 95, 95,5, 96,
96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der
Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt,
ist.
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 95,30%; oder mindestens 95,5, 96, 96,5,
97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich
zu der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt,
ist.
-
Eine
Phytase, welche durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche mindestens
96,38%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch
mit den Nukleotiden 12 bis 1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-7,
wie in 10 gezeigt, ist.
-
Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, und welche (i) mindestens
96,38%; oder mindestens 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch
ist; oder (ii) unter niedrigen oder mittleren, mittleren/hohen, hohen
oder sehr hohen Stringenzbedingungen mit den Nukleotiden 12 bis
1412 der DNA-Sequenz der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt, hybridisiert.
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Eine
DNA-Sequenz, welche eine Phytase kodiert, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 94,87%; oder mindestens 95, 95,5, 96,
96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der
Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-7, wie in 10 gezeigt,
ist.
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(I) Phytasen in Bezug
auf die Basidio-Consensus-Phytase
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 76,23%; oder mindestens 77, 78, 79, 80,
81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 94,5, 95,
95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der
kombinierten Sequenz aus (i) den Aminosäuren 1 bis 441 der Basidio-Consensus-Phytase,
wie in 3 gezeigt, und (ii) den Aminosäuren 1 bis
26, wie in 5 gezeigt, ist (die Sequenz von
(ii) ist dem N-Terminus der Sequenz aus (i) hinzuzufügen).
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Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 79,50%; oder mindestens 80, 81, 82, 83,
84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5,
97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich zu
der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 441 der Basidio-Consensus-Phytase,
wie in 3 gezeigt, ist.
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(J) Phytasen in Bezug
auf die Consensus-Phytase-12
-
Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,
84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5,
97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% identisch mit der Sequenz der Aminosäuren 1 bis
467 der Consensus-Phytase-12, wie in 21 gezeigt,
ist.
-
Eine
Phytase, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche mindestens 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97,
97,5, 98, 98,5, 99, 99,5% ähnlich
zu der Sequenz der Aminosäuren
1 bis 467 der Consensus-Phytase-12, wie in 21 gezeigt,
ist.
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