DE69617641T3

DE69617641T3 - Xylanase beinhaltende futterzusätze für tiere

Info

Publication number: DE69617641T3
Application number: DE69617641T
Authority: DE
Inventors: Peter Kamp Hansen; Peter Wagner; Anette MÜLLERTZ; Inge Helmer Knap
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2009-10-22
Anticipated expiration: 2016-01-27
Also published as: ES2169219T5; AU4431696A; ATE210180T1; AU710547B2; ES2169219T3; US5817500A; JP3307947B2; DE69617641T2; EP0805856A1; US20020160080A1; US7217433B2; EP0805856B2; CA2209617A1; EP0805856B1; CA2209617C; WO1996023062A1; CN1169752A; JPH10510997A; BR9606935A; CN1165614C

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft Tierfutterzusätze, welche Zusätze eine Xylanase, wie in Anspruch 1 beansprucht, umfassen.
ZUGRUNDELIEGENDER STAND DER TECHNIK
Die Arten und die Menge von Pflanzenrohmaterialien, die als Bestandteile in Tierfutter verwendet werden können, werden oftmals durch die Fähigkeit der Tiere, diese zu verdauen, eingeschränkt. Futter verbessernde Enzyme sind Enzyme, üblicherweise von mikrobiellem Ursprung, die durch Verbessern der Verdaubarkeit des Futters in der Lage sind, die Effizienz von dessen Nutzung zu erhöhen.
Xylanolytische Enzyme (EC 3.2.1.8) sind als Futter verbessernde („feed enhancing”) Enzyme wohl bekannt. Es ist über Xylanasen, die aus Stämmen von Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Acremonium gewonnen worden sind, berichtet worden. Darüber hinaus ist ein Enzympräparat, das durch Submersfermentation von Humicola insolens gewonnen worden ist, auf den Markt gebracht worden (Bio-Feed^TM Plus, erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark).
Es sind Xylanase-Präparate, die aus Stämmen des Pilzes Thermomyces lanuginosus (Syn. Humicola lanuginosa) erhalten worden sind, beschrieben worden [siehe Lischnig, T., Purkarthofer, H., und Steiner, W.; Biotechnology Letters 1993 15(4) 411–414; Gomes, J., Purkarthofer, H., Hayn, M., Kapplmüller, J., Sinner, M., und Steiner, W.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993 39 700–707]. Jedoch ist die Verwendung einer Thermomyces lanugi nosus-Xylanase als Futter verbesserndes Enzym niemals offenbart worden.
Darüber hinaus betreffen die im Stand der Technik beschriebenen Xylanase-Präparate allesamt komplexe Enzympräparate, die eine Mehrzahl von Enzymkomponenten umfassen. Ein-Komponenten-Xylanase-Präparate, die von Thermomyces durch Anwendung der Technik der in vitro-DNA-Rekombination abgeleitet worden sind, sind niemals offenbart worden.
Für viele Anwendungen wird die Verwendung von komplexen Enzympräparaten aufgrund eines synergistischen Effekts, der aus der kooperativen Wirkung einer Mehrzahl von Komponenten entsteht, als günstig angesehen. Es besteht die Meinung, dass für einige Anwendungen, z. B. die Umwandlung von Lignocellulose in flüssige Futtermittel oder Kraftstoff, die Verarbeitung von Lebensmitteln und insbesondere zum Erhöhen der Verdaubarkeit von Tierfutter, eine Mischung von xylanolytischen und cellulytischen Enzymen optimale Leistungseigenschaften aufweist [Alam, M., Gomes, I., Mohiuddin, G., & Hoq, M. M.; Enzyme Microb. Technol. 1994 16 298–302].
ZUSAMNENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt zur Verfügung: einen Tierfutterzusatz; eine Vormischung („Pre-mix”) für Tierfutter; ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter; und Verwendungen einer Xylanase wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
Gemäß der Erfindung ist jetzt festgestellt worden, dass im Vergleich zu herkömmlichen Futter verbessernden Enzymen, die von Thermomyces lanuginosus abgeleitete Xylanase ein hervorragendes Futter verbesserndes Enzym ist, das eine signifikante Verbesserung der Futterausnutzung, wenn es Tierfutter zuge setzt wird, zeigt. Darüber hinaus ist das von Thermomyces lanuginosus abgeleitete Xylanase-Präparat aufgrund einer hervorragenden Wärmestabilität besonders gut geeignet, unter Bedingungen, die mikrobielle Infektionen, insbesondere eine Infektion durch Salmonella, verhindern, zu Futterzusätzen verarbeitet zu werden. Es ist ebenfalls festgestellt worden, dass die von Thermomyces lanuginosus abgeleitete Xylanase eine signifikante Verringerung der Speisebreiviskosität bewirkt, was eine signifikante Verbesserung in der Hühnerfutterumwandlungseffizienz anzeigt.
Schließlich ist überraschenderweise festgestellt worden, dass die rekombinant produzierte Thermomyces-Xylanase signifikant wärmestabiler ist als die native Xylanase, was die rekombinant produzierte Xylanase besonders gut geeignet macht, um unter Bedingungen, die mikrobielle Infektionen, insbesondere eine Infektion durch Salmonella, verhindern, zu Futterzusätzen verarbeitet zu werden.
Der vorliegende Anmeldungstext beschreibt ein Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat, welche Xylanase-Komponente durch in vitro-DNA-Rekombinationstechniken aus einem Stamm von Thermomyces oder einer verwandten Gattung erhalten wird.
Dementsprechend beschreibt der Anmeldungstext unter seinem ersten Aspekt einen Tierfutterzusatz, welcher Zusatz eine Ein-Komponenten-Xylanase, die von einem Stamm von Humicola abgeleitet ist, umfasst.
Unter einem anderen Aspekt beschreibt der Anmeldungstext ein Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat, in welchem Präparat die Xylanasekomponente von einem Humicola-Stamm abgeleitet ist.
Unter einem weiteren Aspekt beschreibt der Anmeldungstext ein DNA-Konstrukt, das eine eine Xylanase-Komponente codierende DNA-Sequenz umfasst, welche DNA-Sequenz umfasst:

a) den Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist; oder
b) eine DNA-Sequenz, die zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, analog ist, welche analoge DNA-Sequenz entweder
i) zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, zu mindestens 80% homolog ist; oder
ii) ein Polypeptid codiert, das zu mindestens 80% homolog ist zu dem Polypeptid, das von der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, codiert wird.

Unter noch weiteren Aspekten beschreibt der Anmeldungstext einen Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt der Erfindung beherbergt, eine Wirtszelle, die das DNA-Konstrukt oder den Expressionsvektor umfasst, und ein Verfahren zum Herstellen eines Ein-Komponenten-Xylanase-Präparats der Erfindung, welches Verfahren umfasst, die Wirtszelle unter Bedingungen, die die Produktion des Enzyms erlauben, zu kultivieren und das Enzym aus der Kultur zu gewinnen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, in denen:
1 die relative xylanolytische Aktivität (%) einer Ein-Komponenten-Xylanase, bestimmt bei 30°C im Bereich von pH 2,5 bis 9, zeigt. Es erweist sich, dass das Enzym ein pH-Optimum im Bereich von 4,5 bis 7,5, spezieller im Bereich von 5,0 bis 6,5, um pH 6 herum, hat;
2 die relative xylanolytische Aktivität (%) einer Ein-Komponenten-Xylanase, bestimmt bei pH 5,5 im Bereich von 30 bis 80°C, zeigt. Es erweist sich, dass das Enzym ein Temperaturoptimum im Bereich von 50–70°C, um 60°C herum hat;
3 die relative restliche Aktivität (%) des Ein-Komponenten-Xylanase-Präparats (I) verglichen mit jener des nativen Thermomyces lanuginoxus-Xylanase-Präparats (II) zeigt. Die restliche Aktivität wurde bei pH 6,0 nach Inkubation für 60 min bei 60, 65, 70 bzw. 75°C bestimmt;
4 die Ergebnisse eines Vergleichs der Effizienz der Verringerung der Viskosität von Weizen zwischen einer nativen Thermomyces lanuginosus-Xylanase
und eines Mehr-Komponenten-Enzympräparats, erhalten durch Kultivierung von Humicola insolens (x), zeigt (Dosierung (FXU/g Weizen) in der Probe);
5 die Ergebnisse eines Vergleichs der Effizienz der Verringerung der Viskosität von Weizen zwischen einer rekombinant produzierten Ein-Komponenten-Thermomyces lanuginosus-Xylanase (I) und einer nativen Thermomyces lanuginosus-Xylanase (II) zeigt, werden gezeigt (Dosierung (FXU/g Weizen) in der Probe);
6 den AMEn-Wert von Weizen (MJ/kg) als Funktion der Xylanase-Zugabe (FXU/kg Futter) zeigt; (A) Thermomyces lanuginosus-Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat; (B) native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat; (C) Referenz (Bio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark; ein Mehr-Komponenten-Enzympräparat, erhalten durch Kultivierung von Humicola insolens); und
7 die Fettverdauung (%) in der experimentellen Diät als Funktion der Xylanasezugabe (FXU/kg Futter) zeigt; (A) Thermomyces lanuginosus-Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat; (B) native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat; (C) Referenz (Rio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark; ein Mehr-Komponenten-Enzympräparat, erhalten durch Kultivierung von Humicola insolens).
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Tierfutterzusätze
Bei einer Zugabe zu Tierfutter verbessern Futter verbessernde Enzyme den in vivo-Abbau von Pflanzenzellwandmaterial zum Teil aufgrund einer Verringerung der Darmviskosität (Redford et al., Proceedings of the 1^st Symposium an Enzymes in Animal Nutrition, 1993, S. 73–77), wodurch eine bessere Ausnutzung der Pflanzennährstoffe durch das Tier erreicht wird. Dadurch werden die Wachstumsgeschwindigkeit und/oder das Futterumwandlungsverhältnis (d. h. das Gewicht von aufgenommenem Futter bezogen auf die Gewichtszunahme) des Tiers verbessert.
In dem Kontext dieser Erfindung ist ein Tierfutterzusatz ein Enzympräparat, das ein oder mehrere Futter verbessernde(s) Enzym(e) und geeignete Träger und/oder Excipientien umfasst und welches Enzympräparat in einer Form, die für eine Zugabe zu Tierfutter geeignet ist, bereitgestellt wird. Der Tierfutterzusatz der Erfindung kann gemäß Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden und kann in Form eines trockenen oder flüssigen Präparats vorliegen. Das in das Präparat aufzunehmende Enzym kann gegebenenfalls gemäß Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, stabilisiert werden.
In dem Kontext dieser Erfindung ist ein eine Ein-Komponenten-Xylanase umfassender Tierfutterzusatz ein Enzympräparat, das in einer Form bereitgestellt wird, die für eine Zugabe zu Tierfutter geeignet ist, in welchem Präparat im wesentlichen die gesamte xylanolytische Aktivität (d. h. die nachweisbare xylanolytische Aktivität) einer einzelnen Xylanasekomponente zugeschrieben werden kann.
Der Tierfutterzusatz der Erfindung kann ein granuliertes Enzymerzeugnis sein, das leicht mit Futterbestandteilen gemischt werden kann oder, mehr bevorzugt, eine Komponente einer Vormischung („Pre-mix”) bilden kann. Das granulierte Enzymerzeugnis kann beschichtet oder nicht beschichtet sein. Die Teilchengröße des Enzymgranulats ist vorzugsweise mit jener der Futter- oder Vormischungskomponenten verträglich. Dies stellt ein sicheres und bequemes Mittel zum Einarbeiten von Enzymen in Futter bereit.
Der Tierfutterzusatz der Erfindung kann auch eine stabilisierte flüssige Zusammensetzung sein, die eine wässrige oder auf Öl basierende Aufschlämmung sein kann.
Der Tierfutterzusatz der Erfindung kann seine Wirkung entweder in vitro (durch Modifizieren von Bestandteilen des Futter) oder in vivo ausüben. Der Futterzusatz der Erfindung ist besonders geeignet für eine Zugabe zu Tierfutterzusammensetzungen, die hohe Mengen an Arabinoxylanen und Glucuronoxylanen enthalten, z. B. Futter, das Getreide, wie Gerste, Weizen, Roggen oder Hafer, oder Mais, enthält.
Ein-Komponenten-Xylanase-Präparate
Die Erfindung stellt einen Tierfutterzusatz, wie in Anspruch 1 beschrieben, bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Tierfutterzusatz der Erfindung eine Ein-Komponenten-Xylanase, die von einem Termomyces-Stamm, insbesondere von einem Thermomyces lanuginosus-Stamm, am meisten bevorzugt von dem Stamm Thermomy ces lanuginosus DSM 4109 oder einer Mutante oder Variante davon, abgeleitet ist.
Vorzugsweise ist die Ein-Komponenten-Xylanase von einer Wirtszelle abgeleitet, die ein Gen trägt, das die Xylanasekomponente codiert. Insbesondere kann die Ein-Komponenten-Xylanase

a) von der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder von der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, codiert werden; oder
b) codiert werden von einer DNA-Sequenz, die zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, analog ist, welche analoge DNA-Sequenz entweder
i) zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, zu mindestens 80% homolog ist; oder
ii) ein Polypeptid codiert, das zu mindestens 80% homolog ist zu dem Polypeptid, das von der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz codiert wird, oder zu (von) der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, oder.

In noch bevorzugteren Ausführungsformen kann die Ein-Komponenten-Xylanase weiter dadurch gekennzeichnet sein:

a) dass sie eine Enzymrestaktivität von mehr als 96% nach Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 60°C aufweist;
b) dass sie eine Enzymrestaktivität von mehr als 83% nach Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 65°C aufweist;
c) dass sie eine Enzymrestaktivität von mehr als 20% nach Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 70°C aufweist; und/oder
d) dass sie eine Enzymrestaktivität von mehr als 10% nach Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 75°C aufweist.

Analoge DNA-Sequenzen
Wie hier definiert, soll eine zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz analoge DNA-Sequenz eine jegliche DNA-Sequenz bezeichnen, die ein xylanolytisches Enzym codiert, welches Enzym eine oder mehrere der oben unter (i) bis (iv) zitierten Eigenschaften aufweist.
Die analoge DNA-Sequenz kann vorzugsweise aus einem anderen oder verwandten (z. B. dem gleichen) Organismus, der die Xylanasekomponente produziert, auf der Grundlage des Xylanase codierenden Teils der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer geeigneten Untersequenz (wie beispielsweise 20–500 bp) von dieser, z. B. unter Einsatz der hier beschriebenen Vorgehensweisen, isoliert werden und kann folglich beispielsweise eine allelische Variante oder Speziesvariante der DNA-Sequenz, die die hier präsentierte DNA-Sequenz umfasst, sein.
Alternativ kann die analoge Sequenz auf der Grundlage des Xylanase codierenden Teils der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder einer jeglichen Untersequenz davon konstruiert werden, z. B. durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, die zu keiner anderen Aminosäuresequenz des durch die DNA-Sequenz codierten xylanolytischen Enzyms führen, die aber der Codonverwendung des Wirtsorganismus, der für die Produktion des Enzyms vorgesehen ist, entsprechen, oder durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz führen können.
Beim Ausführen von Nukleotidsubstitutionen sind Aminosäureveränderungen vorzugsweise von einer geringfügigeren Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinträchtigen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren, kleine amino- oder carboxylterminale Verlängerungen, wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid von bis zu ungefähr 20–25 Resten oder eine kleine Verlängerung, die die Reinigung vereinfacht, wie ein Poly-Histidinstrang, ein Antigenepitop oder eine Bindungsdomäne. Beispiele von konservativen Substitutionen erfolgen innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine Beschreibung von Nukleotidsubstitutionen, siehe z. B. Ford et al., Protein Expression and Purification, 2, 1991 95–107.
Für Fachleute auf diesem Gebiet wird offensichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb der für die Funktion des Moleküls kritischen Regionen vorgenommen werden können und nach wie vor zu einem aktiven xylanolytischen Enzym führen werden. Aminosäuren, die für die Aktivität der von dem DNA-Konstrukt der Erfindung codierten Xylanase essentiell sind und dementsprechend vorzugsweise keiner Substitution unterzogen werden, können gemäß Vorgehensweisen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe z. B. Cunningham und Wells, Science 1989 244 1081–1085), identifiziert werden. Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf biologische (d. h. proteolytische) Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Orte einer Substrat-Enzym-Wechselwirkung können eben falls durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, die durch solche Techniken, wie kernmagnetische Resonanzanalyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z. B. de Vos et al., Science 1992 255 306–312; Smith et al., J. Mol. Biol. 1992 224 899–904; Wlodaver et al., FEBS Lett. 1992 309 59–64) bestimmt wird.
Es versteht sich, dass der Xylanase codierende Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder eine jegliche Untersequenz davon als Sonden zum Isolieren der vollständigen DNA-Sequenz, die das xylanolytische Enzym kodiert, z. B. der DNA-Sequenz, die als SEQ ID NO:1 angegeben ist, verwendet werden können.
Die Homologie, auf die oben in i) Bezug genommen worden ist, wird als das Ausmaß der Identität zwischen den zwei Sequenzen bestimmt, was eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten angibt. Die Homologie kann geeigneterweise mittels Computerprogrammen bestimmt werden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, wie GAP, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt wird (Needleman, S. B., & Wunsch, C. D.; J. Mol. Biol., 1970 48 443–453). Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für einen DNA-Sequenzvergleich: GAP-„creation penalty” von 5,0 und GAP-„extension penalty” von 0,3, weist die codierende Region der DNA-Sequenz ein Identitätsausmaß von vorzugsweise mindestens 70%, insbesondere mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% zu der codierenden Region des Xylanase codierenden Teils der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder zu der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhalten werden kann, auf.
Die Hybridisierung, auf die oben in (ii) Bezug genommen worden ist, soll angeben, dass die analoge DNA-Sequenz unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, die detailliert in dem nach folgenden Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben werden, an die gleiche Oligonukleotidsonde wie die DNA-Sequenz, die die Xylanasekomponente codiert, hybridisiert. Die zu verwendende Sonde kann bequemerweise auf der Basis des Xylanase codierenden Teils der DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer Untersequenz davon, die mindestens 6–7 Aminosäuren des Enzyms codiert, oder auf der Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO 2 gezeigt ist, konstruiert werden. In dem letzeren Fall wird die Sonde ausgehend von einer Aminosäureuntersequenz, die einer hohen Anzahl von gering degenerierten Codons entspricht, hergestellt.
Normalerweise ist die analoge DNA-Sequenz hochgradig homolog zu der DNA-Sequenz, wie z. B. zu mindestens 70% homolog zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz, die eine Xylanasekomponente der Erfindung codiert, vorzugsweise zu mindestens 80%, insbesondere mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% homolog zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz.
Das Ausmaß der Homologie, auf das oben in (iii) Bezug genommen worden ist, wird als das Ausmaß an Identität zwischen den zwei Sequenzen bestimmt, was eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten angibt. Die Homologie kann geeigneterweise mittels Computerprogrammen bestimmt werden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, wie GAP, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt wird (Needleman, S. B., & Wunsch, C. D.; J. Mol. Biol., 1970 48 443–453). Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für einen Polypeptid-Sequenzvergleich: GAP-„creation penalty” von 3,0 und GAP-„extension penalty” von 0,1, weist das von einer analogen DNA-Sequenz codierte Polypeptid ein Identitätsausmaß von vorzugsweise mindestens 70%, insbesondere mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% zu dem Enzym, das von einem DNA-Konstrukt, das den Xylanase codierenden Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst, oder von der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhalten werden kann, codiert wird, auf.
Gemäß dem im Obigen beschriebenen Verfahren wurde die DNA-Homologie der Xylanase der Erfindung zu den meisten Xylanasen des Standes der Technik unter Verwendung des Computerprogramms GAP bestimmt. Die Xylanase der Erfindung zeigte nur 63% DNA-Homologie zu der Xylanase I aus Trichoderma reesei (Torronen, A., et al., Biotechnology 1992 10 11 1461–1465) und 63% DNA-Homologie zu Xylanase I aus Cochliobolus carbonum (Apel, P. C., et al.; Mol. Plant Microb. Interact. 1993 6 467–473).
Der Begriff „abgeleitet von” in Verbindung mit Eigenschaft (i) oben soll nicht nur eine Xylanasekomponente bezeichnen, die von dem Stamm Thermomyces lanuginosus DSM 4109 produziert wird, sondern auch eine Xylanasekomponente, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, die aus diesem Stamm isoliert worden ist, und die in einer mit der DNA-Sequenz transformierten Wirtszelle produziert wird. Die immunologische Reaktivität kann durch das in dem nachfolgenden Abschnitt Materialien und Methoden beschriebene Verfahren bestimmt werden.
Futter verbessernde Enzyme
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Futterzusatz der Erfindung zusätzliche Futter verbessernde Enzyme enthalten.
Im Kontext dieser Erfindung umfassen Futter verbessernde Enzyme α-Galactosidasen, β-Galactosidasen, insbesondere Lactasen, Phytasen, β-Glucanasen, insbesondere endo-β-1,4-Glucanasen und endo-β-1,3(4)-Glucanasen, Xylanasen, Xylosidasen, Galactanasen, insbesondere Arabinogalactan-endo-1,4-β-galactosidasen und Arabinogalactan-endo-1,3-β-galactosidasen, Endoglucanasen, insbesondere endo-1,2-β-Glucanase, endo-1,3-α-Glucanase und endo-1,3-β-Glucanase, Pektin-abbauende Enzyme, insbesondere Pec tinasen, Pectinesterasen, Pectinlyasen, Polygalacturonasen, Arabinanasen, Rhamnogalacturonasen, Rhamnogalacturonanacetylesterasen, Rhamnogalacturonan-α-rharnnosidase, Pectatlyasen, und α-Galacturonisidasen, Mannanasen, β-Mannosidasen, Mannanacetylesterasen, Xylanacetylesterasen, Proteasen und lipolytische Enzyme, wie Lipasen und Cutinasen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Mikrobielle Quellen
Die Erfindung betrifft einen Tierfutterzusatz, welcher Zusatz eine von einem Stamm, der zu der Gruppe von thermophilen Pilzen gehört, z. B. Thermomyces, abgeleitete Xylanase umfasst.
Die Gattung Thermomyces, die mehrere Spezies umfasst [Appinis & Eggins, 1966], genauer die Spezies Thermomyces lanuginosus (Syn. Humicola lanuginosa), ist klassischerweise der Gruppe von thermophilen Pilzen zugeordnet worden [Cooney & Emerson; 1964]. Mehrere der zu dieser Gruppe gehörenden Gattungen, z. B. Spezies von Humicola, Thermoascus, Chaetomium, Mucor, Talaromyces, Malbranchea, Myceliophthora, Thielavia [Cooney & Emerson, 1964] haben sich als sehr starke Enzymproduzenten erwiesen. Auch Byssochlamus und Paecilomyces sind dieser Gruppe zugeordnet worden.
Die taxonomische Zuordnung von Thermomyces ist allgemein als unsicher anerkannt worden. Jedoch klassifiziert die Datenbank Entrez des National Institute of Health (Stand Januar 1996) Thermomyces als eine mitosporische Pyrenomycete (d. h. eine Pyrenomycete, die nur unvollständig charakterisiert ist, wodurch keine ausreichenden Informationen zur Verfügung stehen, so dass diese weder einer speziellen Ordnung noch etwa einer speziellen Familie zugeordnet werden kann).
Die neuesten molekularen Studien haben eine Ermittlung der 18S-RNA-Sequenz von Thermomyces versucht, um diese Information zu verwenden, um die phylogenetische Verwandtschaft dieser Gattung weiter zu klären. Eine vorläufige Interpretation der verfügbaren Daten legt nahe, dass Thermomyces näher mit den unter Plectomycetes, insbesondere unter Erotiales, gruppierten Pilzen verwandt ist. Nach einer Homologierecherche in Datenbanken ist die Sequenz der 18S-RNA von Byssochlamus die Sequenz, die am engsten mit der beschriebenen Sequenz von Thermomyces lanuginosus (Novo Nordisk 1996, unveröffentlichte Daten) verwandt ist. Wenn Untersuchungen von mehr Isolaten, die zu der Gattung Thermomyces gehören, diese vorläufigen Ergebnisse stützen, könnte dies einen Transfer der Gattung Thermomyces zu der Ordnung der Plectomycetes unterstützen. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch Xylanase-Präparate, die von Plectomycetes, insbesondere Erotiales, abgeleitet sind.
Es wurde eine Homologierecherche mit der Xylanase der Erfindung in Nukleotid- und Proteindatenbanken ausgeführt. Die Homologierecherche zeigte, dass die am nächsten verwandten Xylanasen die Xylanase I aus Trichoderma reesei und die Xylanase I aus Cochliobolus carbonum waren. Beide Xylanase gehören zur Familie 11 von Glycosylhydrolasen (Henrissat, B.; Biochem. J. 1991 280 309–316), was anzeigt, dass die Xylanase der Erfindung ebenfalls zu dieser Familie gehört.
Mehrere Proben von Thermomyces lanuginosus sind hinterlegt worden und sind von internationalen Hinterlegungsstellen, die unter dem Budapester Vertrag anerkannt sind, z. B. der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, öffentlich erhältlich. Ein Stamm von Thermomyces lanuginosus ist gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 1b, DE-3300 Braunschweig, Deutschland, am 04. Mai 1987 hinterlegt worden und hat die Aufnahmenummer DSM 4109 erhalten.
Ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae DSM 10133, der Plasmid-DNA enthält, die die als SEQ ID NO: 1 angegebene Volllängen-DNA-Sequenz, die die Endoglucanase der Erfindung codiert, in dem Hefevektor pYES 2.0 umfasst, wurde gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 1b, DE-3300 Braunschweig, Deutschland, am 19. Juli 1995 hinterlegt und hat die Aufnahmenummer DSM 10133 erhalten.
DNA-Konstrukte
Unter noch einem anderen Aspekt beschreibt der Anmeldungstext ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Xylanasekomponente codiert, welche DNA-Sequenz umfasst:

(a) den Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist; oder
(b) eine DNA-Sequenz, die zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, analog ist, welche analoge DNA-Sequenz entweder
i) zu dem Xylanase codierenden Teil der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, zu mindestens 80% homolog ist; oder
ii) ein Polypeptid codiert, das zu mindestens 80% homolog ist zu dem Polypeptid, das von der als SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz codiert wird, oder zu der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist.

Wie hier definiert, soll der Begriff „DNA-Konstrukt” ein jegliches Nukleinsäuremolekül von cDNA-, genomischer DNA-, synthetischer DNA- oder RNA-Ursprung bezeichnen. Der Begriff „Konstrukt” soll ein Nukleinsäuresegment bezeichnen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und das auf einer vollständigen oder teilweisen Nukleotidsequenz, die die Xylanase von Interesse codiert, basieren kann. Das Konstrukt kann gegebenenfalls andere Nukleinsäuresegmente enthalten.
Das das xylanolytische Enzym codierende DNA-Konstrukt kann geeigneterweise von genomischem oder cDNA-Ursprung sein, beispielsweise erhalten durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenen auf DNA-Sequenzen, die die Gesamtheit oder einen Teil des xylanolytischen Enzyms codieren, durch Hybridisierung unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Das das xylanolytische codierende Nukleinsäurekonstrukt kann auch durch etablierte Standardmethoden synthetisch hergestellt werden, z. B. durch die Phosphoamiditmethode, die von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 1981 22 1859–1869 beschrieben worden ist, oder die Methode, die von Matthes et al., EMBO Journal 1984 3 801–805, beschrieben worden ist. Gemäß der Phosphoamiditmethode werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einer automatischen DNA-Synthetisiervorrichtung, gereinigt, durch Hybridisierung in Doppelstränge überführt, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Darüber hinaus kann das Nukleinsäurekonstrukt von gemischtem synthetischen und genomischen, gemischtem synthetischen und cDNA- oder gemischtem genomischen und cDNA-Ursprung sein, hergestellt gemäß Standardtechniken durch Ligieren von Fragmenten von synthetischem, genomischen oder cDNA-Ursprung (wie jeweils geeignet), wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten Nukleinsäurekonstrukts entsprechen.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann auch durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern, beispielsweise wie in US 4,683,202 oder von Saiki et al., Science 1988 239 487–491 beschrieben, hergestellt werden.
Die eine Xylanasekomponente codierende DNA-Sequenz kann von einem Humicola-Stamm, einem Thermoascus-Stamm, einem Chaetomium-Stamm, einem Mucor-Stamm, einem Talaromyces-Stamm, einem Malbranchea-Stamm, einem Myceliophthora-Stamm, einem Thielavia-Stamm, einem Byssochlamus-Stamm oder einem Paecilomyces-Stamm abgeleitet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die die Xylanasekomponente codierende DNA-Sequenz von einem Thermomyces-Stamm, insbesondere einem Stamm von Thermomyces lanuginosus abgeleitet. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz von einer DNA-Bibliothek von Thermomyces lanuginosus DSM 4109 oder einer Mutante oder Variante davon abgeleitet oder wird auf der Grundlage von dieser produziert.
Die das xylanolytische Enzym codierende DNA-Sequenz kann durch herkömmliche Methoden isoliert werden, welche Methoden typischerweise umfassen können:

– Klonieren einer cDNA-Bibliothek, z. B. aus dem Stamm Thermomyces lanuginosus DSM 4109 oder aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133, in einen geeigneten Vektor;
– Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit diesem Vektor;
– Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die geeignet sind, um das gewünschte xylanolytische Enzym, das von einem oder mehreren Klonen in der cDNA-Bibliothek codiert wird, zu exprimieren;
– Screenen auf positive Klone durch Bestimmen einer jeglichen xylanolytischen Aktivität des Enzyms, das durch solche Klone produziert wird, und
– Isolieren der DNA, die das gewünschten xylanolytische Enzym codiert, aus solchen Klonen.

Ein allgemeines Verfahren ist in WO 93/11249 , dessen Inhalt hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird, offenbart worden. Eine detailliertere Beschreibung des Screeningverfahrens wird in Beispiel 1 unten gegeben.
Die eine Xylanasekomponente codierende DNA-Sequenz kann beispielsweise isoliert werden durch Screenen einer cDNA-Bibliothek eines Stamms von Thermomyces lanuginosus und Selektieren auf Klone, die das xylanolytische Enzym exprimieren (z. B. wie durch die Fähigkeit des Enzyms, 1,4-β-xylosidische Bindungen in 1,4-β-Xylanen zu hydrolysieren, definiert). Die geeignete DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon durch Standardmethoden, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert werden.
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäurekonstrukt den Xylanase codierenden Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer jeglichen Untersequenz davon, die sich, aber von der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet. Die Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuresequenzen, die mit einem Nukleinsäuremolekül (entweder genomisch, synthetisch oder cDNA oder RNA), das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine jegliche Untersequenz davon codiert, unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen hybridisieren.
Rekombinante Expressionsvektoren
Unter einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der das DNA-Konstrukt der Erfindung umfasst.
Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung kann ein jeglicher Vektor sein, der in bequemer Weise in vitro-DNA-Rekombinationsprozeduren unterworfen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oftmals von der Wirtszelle, in die er eingeschleust werden soll, abhängen. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid sein. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeschleust wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit dem oder den Chromosom(en), in das bzw. die er integriert worden ist, repliziert wird.
In dem Expressionsvektor der Erfindung ist die das xylanolytische Enzym codierende DNA-Sequenz funktionell mit zusätzlichen Segmenten verknüpft, die für die Transkription der DNA benötigt werden. Allgemein ist der Expressionsvektor von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff „funktionell verknüpft” gibt an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie für ihre beabsichtigten Zwecke zusammen wirken, z. B. beginnt die Transkription in einem Promotor und schreitet durch die DNA-Sequenz, die das xylanolytische Enzym codiert, hindurch fort.
So sollte in dem Expressionsvektor der Erfindung die DNA-Sequenz, die das xylanolytische Enzym codiert, funktionell mit einer geeigneten Promotor- und Terminatorsequenz verbunden sein.
Der Promotor kann eine jegliche DNA-Sequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl transkriptionelle Aktivität zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die zu der Wirtszelle entweder homologe oder heterologe Proteine codieren.
Beispiele von geeigneten Promotoren, um die Transkription der das xylanolytische Enzym der Erfindung codierenden DNA in bakteriellen Wirtszellen zu steuern, umfassen den Promotor des Gens der maltogenen Amylase von Bacillus stearothermophilus, des alpha-Amylase-Gens von Bacillus licheniformis, des BAN-Amylase-Gens von Bacillus amyloliquefaciens, des Gens der alkalischen Protease von Bacillus subtilis oder des Xylanaseoder Xylosidase-Gens von Bacillus pumilus, oder durch die PR- oder P_L-Promotoren des Phagen lambda oder die lac-, trp- oder tac-Promotoren von E. coli.
Beispiele von geeigneten Promotoren für eine Verwendung in Hefe-Wirtszellen umfassen Promotoren von glycolytischen Hefegenen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073–12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419–434) oder Alkoholdehydrogenasegenen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982) oder die TPI1-( US 4,599,311 ) oder ADH2-4c-(Russell et al., Nature 304 (1983), 652–654)-Promotoren.
Beispiele von geeigneten Promotoren für eine Verwendung in Wirtszellen in Form von filamentösen Pilzen sind beispielsweise der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093–2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele von anderen nützlichen Promotoren sind jene, die von dem die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Asparginsäureproteinase von Rhizomucor miehei, die neutrale α-Amylase von Aspergillus niger, die säurestabile α-Amylase von Aspergillus niger, die Glucoamylase (GluA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von Aspergillus oryzae, die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae oder die Acetamidase von Aspergillus nidulans codierenden Gen abgeleitet sind. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase- und gluA-Promotoren.
Der Expressionsvektor kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, sich in der jeweiligen Wirtszelle zu replizieren. Der Expressionsvektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, wie das Dihydrofolatreductase (DHFR) codierende Gen oder das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (beschrieben von Russell, P. R., Gene 1985 40 125–130), oder eines, das Resistenz gegen ein Arzneimittel, z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chlorampheni-col, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat, verleiht. Für filamentöse Pilze umfassen selektierbare Marker amdS, pyrG, argB, niaD und sC.
Um das xylanolytische Enzym in den Sekretionsweg der Wirtszellen zu dirigieren, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leadersequenz, Präpro-Sequenz oder Prä-Sequenz bekannt) in dem Expressionsvektor vorgesehen werden. Die sekretorische Signalsequenz ist im korrekten Leseraster mit der das xylanolytische Enzym codierenden DNA-Sequenz verknüpft. Sekretorische Signalsequenzen befinden sich üblicherweise 5' zu der das xylanolytische Enzym codierenden DNA-Sequenz. Die sekretorische Signalsequenz kann jene sein, die normalerweise mit dem xylanolytischen Enzym assoziiert ist, oder kann von einem Gen, das ein anderes sezerniertes Protein codiert, stammen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Expressionsvektor eine sekretorische Signalsequenz umfassen, die im wesentlichen identisch ist mit der die sekretorische Signalsequenz codierenden Sequenz des Bacillus licheniformis-α-Amylasegens, wie z. B. in WO 86/05812 beschrieben.
Auch können Maßnahmen für die Amplifizierung der Expression ergriffen werden, z. B. durch Tandem-Amplifizierungstechniken, die ein einfaches oder doppeltes „Crossing-over” umfassen, oder durch „Multicopy”-Techniken, z. B. wie sie in US 4,959,316 oder WO 91/09129 beschrieben werden. Alternativ kann der Expressionsvektor einen temperaturempfindlichen Replikationsstartpunkt, z. B. wie in EP 283,075 beschrieben, umfassen.
Verfahren zum Ligieren von DNA-Sequenzen, die jeweils das xylanolytische Enzym, den Promotor und gegebenenfalls die Terminator- und/oder sekretorische Signalsequenz codieren, und um diese in geeignete Vektoren, die die für die Replikation erforderliche Information enthalten, zu insertieren, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Wirtszellen
Unter noch einem anderen Aspekt beschreibt der Anmeldungstext eine Wirtszelle, die das DNA-Konstrukt und/oder den rekombinanten Expressionsvektor umfasst.
Das DNA-Konstrukt kann zu der jeweiligen Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sein. Wenn es zu der Wirtszelle homolog ist, d. h. in der Natur von der Wirtszelle produziert wird, wird es typischerweise mit einer anderen Promotorsequenz oder, sofern anwendbar, mit einer anderen sekretorischen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz als in seiner natürlichen Umgebung funktionell verknüpft sein. In diesem Kontext soll der Begriff „homolog” eine cDNA-Sequenz umfassen, die ein xylanolytisches Enzym, das zu dem jeweiligen Wirtsorganismus nativ ist, codiert. Der Begriff „heterolog” soll eine DNA-Sequenz umfasen, die von der Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Folglich kann die DNA-Sequenz von einem anderen Organismus stammen oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
Die Wirtszelle, in die das DNA-Konstrukt oder der rekombinante Expressionsvektor eingeschleust werden soll, kann eine jegliche Zelle sein, die in der Lage ist, das xylanolytische Enzym zu produzieren, und umfasst Bakterien-, Hefe-, Pilz- und höhere eukaryotische Zellen.
Beispiele von bakteriellen Wirtszellen, die bei Kultivierung in der Lage sind, das xylanolytische Enzym der Erfindung zu produzieren, sind grampositive Bakterien, wie Stämme von Bacillus, insbesondere ein Stamm von Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megatherium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis oder Bacillus agaradherens, oder Stämme von Streptomyces, insbesondere ein Stamm von Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien, wie Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung von kompetenten Zellen in einer an sich bekannten Weise erfolgen (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor, NY, 1989).
Bei einer Expression des xylanolytischen Enzyms in Bakterien, wie Escherichia coli, kann die Xylanase im Cytoplasma, typischerweise als unlösliche Granula (bekannt als Einschlusskörperchen) zurückgehalten werden oder kann durch eine bakterielle Sekretionssequenz in den periplasmatischen Raum dirigiert werden. In dem erstgenannten Fall werden die Zellen lysiert und die Granula gewonnen und denaturiert, wonach das xylanolytische Enzym durch Verdünnen des Denaturierungsmittels rückgefaltet wird. In dem letztgenannten Fall kann das xylanolytische Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Aufbrechen der Zellen, z. B. durch Beschallen oder osmotischen Schock, so dass der Inhalt des periplasmatischen Raums freigesetzt wird, und Gewinnen des xylanolytischen Enzyms gewonnen werden.
Beispiele von geeigneten Hefezellen umfassen Zellen von Saccharomyces-Sp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri und Saccharomyces uvarum, Zellen von Schizosaccharomyces-Sp., wie Schizosaccharomyces pombe, Zellen von Kluyveromyces, wie Kluyveromyces lactis, Zellen von Hansenula, z. B. Hansenula polymorpha, Zellen von Pichia, z. B. Pichia pastoris (siehe Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, S. 3459–3465; US 4,882,279 ) und Zellen von Yarrowia-Sp., wie Yarrowia lipolytica. Verfahren zum Transformieren von Hefezellen mit heterologer DNA und zum Produzieren von heterologen Polypeptiden daraus werden z. B. in US 4,599,311 , US 4,931,373 , US 4,870,008 , 5,037,743 und US 4,845,075 , die allesamt hiermit unter Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben. Transformierte Zellen werden anhand eines Phänotyps, der durch einen selektierbaren Marker bestimmt wird, üblicherweise Arzneimittelresistenz oder die Fähigkeit, sich in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs, z. B. Leucin, zu vermehren, selektiert. Ein bevorzugter Vektor für eine Verwendung in Hefe ist der POT1-Vektor, der in US 4,931,373 offenbart ist. Der das xylanolytische Enzym der Erfindung codierenden DNA-Sequenz kann eine Signalsequenz und gegebenenfalls eine Leadersequenz, z. B. wie oben beschrieben, vorangehen.
Beispiele von anderen Pilzzellen sind Zellen von filamentösen Pilzen, z. B. Aspergillus-Sp., insbesondere Stämme von Aspergillus Japonicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans o der Aspergillus niger, Neurospora-Sp., Fusarium-Sp., insbesondere Stämme von Fusarium oxysporum oder Fusarium graminearum, oder Trichoderma-Sp. Pilzzellen können durch ein Verfahren, das Protoplastenbildung und Transformation der Protoplasten, gefolgt von einer Regeneration der Zellwand, in einer an sich bekannten Weise umfasst, transformiert werden. Die Verwendung von Aspergillus-Sp. für die Expression von Proteinen ist beispielsweise in EP 272,277 und EP 230,023 beschrieben worden. Die Transformation von F. oxysporum kann beispielsweise ausgeführt werden, wie von Malardier et al., Gene 1989 78 147–156, beschrieben. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsmikroorganismus ist z. B. in EP 238 023 , dessen Inhalt hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Stamm von Aspergillus oryzae.
Verfahren zum Herstellen eines Ein-Komponenten-Präparats
Unter einem noch weiteren Aspekt beschreibt der Anmeldungstext ein Verfahren zum Herstellen des xylanolytischen Enzyms der Erfindung, worin eine geeignete Wirtszelle, die mit einer das xylanolytische Enzym codierenden DNA-Sequenz transformiert worden ist, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Produktion des Enzyms erlauben, und das resultierende Enyzm aus der Kultur gewonnen wird.
Unter einem weiteren Aspekt beschreibt der Anmeldungstext ein Verfahren zum Herstellen eines Ein-Komponenten-Xylanase-Präparats, worin eine geeignete Wirtszelle, die mit einer das Enzym codierenden DNA-Sequenz transformiert worden ist, unter Bedingungen, die die Produktion der Xylanase-Komponente erlauben, kultiviert wird, gefolgt von der Gewinnung der Xylanase-Komponente aus der Kultur.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die das Enzym codierende DNA-Sequenz ein DNA-Konstrukt, das wie oben beschrieben erhalten worden ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das DNA-Konstrukt mit einer geeigneten Expressionssignalsequenz in einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben, kombiniert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine, die oben beschrieben worden ist.
Das zum Kultivieren der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann ein jegliches herkömmliches Medium sein, das zum Vermehren der jeweiligen Wirtszellen geeignet ist. Das exprimierte xylanolytische Enzym kann passenderweise in das Kulturmedium sezerniert werden und kann daraus durch Reinigungsprozeduren gewonnen werden. Wohlbekannte Reinigungsprozeduren umfassen das Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren von proteinartigen Komponenten des Mediums mittels eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, und chromatographische Methoden, wie z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie.
BEISPIELE
Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise den Umfang der Erfindung, wie er beansprucht wird, beschränken sollen.
MATERIALIEN UND METHODEN
Spenderorganismus
mRNA wurde aus Thermomyces lanuginosus DSM 4109 isoliert, das in einem Xylan enthaltenden Fermentationsmedium unter Bewegung, um ausreichende Belüftung sicherzustellen, kultiviert wurde. Myzele wurden nach 3–5 Tagen Kultivierung geerntet, unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Hefestämme
Der unten verwendete Saccharomyces cerevisiae-Stamm ist JG169 (MATα; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-113; prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).
Plasmide
Für die Expression wurde das kommerziell erhältliche Hefeplasmid pYES 2.0 (Invitrogen) verwendet.
Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775, das in EP 238 023 beschrieben worden war. Die Konstruktion von pHD414 wird detaillierter in WO 93/11249 beschrieben.
Extraktion von Gesamt-RNA
Die Extraktion von Gesamt-RNA wurde mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von einer Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen und Isolierung von poly(A)⁺-RNA durch oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschromatographie unter Verwendung der in WO 93/11249 beschriebenen Verfahren ausgeführt.
cDNA-Synthese und -Modifizierung
Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 μg poly(A)⁺-RNA durch die RNase H-Methode (Gabler, U., Hoffman, B. J., Gene 1983 25 263–269; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 1989) unter Verwendung der „hair-pin” (Haarnadelschleifen)-Modifizierung synthetisiert. Das Verfahren wird detaillierter in WO 93/11249 beschrieben.
Nach einer Behandlung mit Mungobohnen-Nuklease wurde die ds-cDNA mit T4-DNA-Polymerase (Invitrogen) mit stumpfen Enden versehen und die cDNA wurde an nicht-palindromische BstX I-Adaptoren (1 μg/μl, Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers ligiert.
Konstruktion von cDNA-Bibliotheken
Die mit Adaptoren versehene ds-cDNA wurde durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen und in 25 ml H₂O resuspendiert. Vor der Bibliotheks-Ligation im großen Maßstab wurden vier Test-Ligationen in 10 μl Ligationspuffer (der gleiche wie oben) ausgeführt, wobei jede 1 μl ds-cDNA (Reaktionsröhrchen #1– #3), 2 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) und 50 ng (Röhrchen #1), 100 ng (Röhrchen #2) und 200 ng (Röhrchen #3 und #4) mittels Bst XI gespaltetenen Hefe-Expressionsvektor (entweder der Vektor pYES 2.0, Invitrogen, oder yHD13) enthielt.
Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine Ligation in großem Maßstab in 40 μl Ligationspuffer vorgenommen. Elektrokompetente E. coli 1061-Zellen wurden mit 1 μl-Aliquots transformiert und die transformierten Zellen wurden titriert und die Bibliothek auf LB + Ampicillin-Platten mit 5000–7000 c. f. u. (koloniebildende Einheiten)/Platte ausplattiert. Jeder Platte wurden 3 ml Medium zugesetzt. Die Bakterien wurden abgekratzt, es wurde 1 ml Glycerol zugesetzt und bei –80°C als Pools gelagert. Die restlichen 2 ml wurden für die DNA-Isolierung verwendet. Für weitere Einzelheiten bezüglich dieser Methode wird auf WO 94/14952 verwiesen.
Konstruktion von Hefe-Bibliotheken
Um sicherzustellen, dass alle Bakterienklone in Hefe getestet wurden, wurde eine Anzahl von Hefetransformanten, die 5-mal höher war als die Anzahl der Bakterienklone in den ursprünglichen Pools, als Limit gesetzt.
Ein μl-Aliquots von gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) aus individuellen Pools wurden mittels Elektroporation (200 Ω, 1,5 kV, 25 μF) in 40 μl kompetente Saccharomyces cerevisiae JG169-Zellen (OD₆₀₀ = 1,5 in 500 ml YPD eingeschleust, zweimal in kaltem DIW, einmal in kaltem 1 M Sorbitol gewaschen, in 0,5 ml 1 M Sorbitol resuspendiert (Becker, D. M., Guarante, L., Methods Enzymol. 1991 194 182–187). Nach Zugabe von 1 ml 1 M kaltem Sorbitol wurden 80 μl-Aliquots auf SC + Glucose – Uracil ausplattiert, so dass 250–400 c. f. u. (koloniebildende Einheiten)/Platte erhalten wurden, und bei 30°C 3 bis 5 Tage inkubiert.
Identifizierung von positiven Klonen
Nach 3 bis 5 Tagen Kultivierung wurden die Agarplatten auf SC-Uracil-Platten, die 0,2% Azurin-vernetztes Birken-Xylan (AZCL^TM birch xylan, Megazyme^TM, Australien) und 2% Galactose enthielten, replikaplattiert, gefolgt von einer Inkubation für 2–4 Tage bei 30°C für die Detektion von xylanolytischer Aktivität. Nach der Inkubation wurden xylanolytisches Enzym-positive Kolonien als Kolonien, die ringsherum einen blauen Hof aufwiesen, identifiziert.
Zellen von Enzym-positiven Kolonien wurden für die Isolierung von einzelnen Kolonien auf Agar verteilt und eine Enzym produzierende Einzelkolonie wurde für jede der xylanolytisches Enzym produzierenden Kolonien identifiziert.
Charakterisierung von positiven Klonen
Die positiven Klone wurden als einzelne Kolonien erhalten. Plasmid-DNA wurde aus einer Zellkultur, die aus den zwei positiven Hefekolonien hergestellt worden war, isoliert. Plasmid-DNA wurde in E. coli eingeschleust (durch Transformation), isoliert und individuell charakterisiert, indem das 5'-Ende jedes cDNA-Klons unter Verwendung der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977 74 5463–5467) und des Sequenase^TM-Systems (United States Biochemical) sequenziert wurde.
Isolierung eines cDNA-Gens für die Expression in Aspergillus
20 ml YNB-1-Brühe in einem 50 ml Glasteströhrchen wurden mit einer oder mehreren xylanolytisches Enzym produzierenden Hefekolonien inokuliert. Das Röhrchen wurde 2 Tage bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 3000 Upm geerntet.
DNA, die gemäß WO 94/14952 isoliert worden war, wurde in 50 μl Wasser gelöst. E. coli wurden mit Aliquots der DNA transformiert, wie in WO 94/14952 beschrieben. Aus E. coli wurde Plasmid-DNA unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das cDNA-Insert wurde unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen ausgeschnitten und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger Allgemeine Vorgehensweise
100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) werden mit Sporen von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger inokuliert und unter Schütteln bei 37°C ungefähr 2 Tage inkubiert. Das Myzel wird durch Filtration geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Das Myzel wird in 15 ml 1,2 M MgSO₄ und 10 mM NaH₂PO₄, pH 5,8, suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt und es wird 1 ml Puffer, der 120 mg Novozym^TM 234, Charge 1687, enthält, zugesetzt. Nach 5 min wird 1 ml 12 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin; Sigma, Typ H25) zugesetzt und die Inkubation unter sanfter Bewegung für 1,5 bis 2,5 h bei 37°C fortgesetzt, bis eine große Anzahl von Protoplasten in einer unter dem Mikroskop untersuchten Probe sichtbar ist.
Die Suspension wird durch Miracloth filtriert, das Filtrat in ein steriles Röhrchen transferiert und mit 5 ml 0,6 M Sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0, überschichtet. Es wird eine Zentrifugation für 15 min bei 100 g ausgeführt und die Protoplasten werden von der Oberseite des MgSO₄-Kissens gewonnen. 2 Volumen STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂) werden der Protoplastensuspension zugesetzt und die Mischung wird 5 min bei 1000 g zentrifugiert. Das Protoplastenpellet wird in 3 ml STC resuspendiert und erneut pelletiert. Dies wird wiederholt. Schließlich werden die Protoplasten in 0,2–1 ml STC resuspendiert.
100 μl Protoplastensuspension werden mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (einem das Aspergillus nidulans-amdS-Gen tragenden Plasmid) gemischt. Man lässt die Mischung bei Raumtemperatur 25 min stehen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, werden zugesetzt und es wird (zweimal) vorsichtig gemischt und schließlich werden 0,85 ml der gleichen Lösung zugesetzt und es wird vorsichtig gemischt. Man lässt die Mischung bei Raumtemperatur 25 min stehen, zentrifugiert sie bei 2500 g für 15 min und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf den geeigneten Platten verteilt. Protoplasten werden auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 1966 113 51–56), die 1,0 M Sucrose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zur Inhibition des Hintergrundwachstums enthalten, verteilt. Nach einer Inkubation für 4–7 Tage bei 37°C werden Sporen gepickt und zur Gewinnung von Einzelkolonien verteilt. Diese Vorgehensweise wird wiederholt und Sporen einer einzelnen Kolonie werden nach der zweiten erneuten Isolierung als definierte Transformante gelagert.
Test von Aspergillus oryzae-Transformanten
10 ml YPM (siehe unten) wurden mit jeder der Transformanten inokuliert und diese wurden vermehrt. Nach 2–5 Tagen Inkubation bei 30°C wurde der Überstand entfernt. Die xylanolytische Aktivität wurde durch Auftragen von 10 μl Überstand auf Löcher von 4 mm Durchmesser, die aus 0,2% AZCL^TM Birken-Xylan (Megazyme^TM, Australien) enthaltenden Agarplatten ausgestochen worden waren, identifiziert. Xylanolytische Aktivität wird dann als blauer Hof identifiziert.
Hybridisierungsbedingungen
Geeignete Hybridisierungsbedingungen, um die Hybridisierung zwischen einer Oligonukleotidsonde und einer „analogen” DNA-Sequenz der Erfindung zu bestimmen, können, wie nachfolgend beschrieben, definiert werden. Eine geeignete Oligonukleotidsonde zur Verwendung bei der Hybridisierung kann auf der Grundlage des Xylanase codierenden Teils der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer jeglichen Untersequenz davon oder auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 2 gezeigten abgeleiteten Aminosäuresequenz hergestellt werden. Ein Beispiel einer geeigneten Sonde ist die DNA-Sequenz, die dem Xylanase codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 entspricht, d. h. die Nukleotide an den Positionen 31–705 in SEQ ID NO: 1.
Ein Filter, der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente enthält, wird einem Vorquellen in 5 × SSC unterworfen und 1 h bei ungefähr 50°C in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardts Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg von denaturierter beschallter Kalbsthymus-DNA vorhybridisiert. Nach einer Hybridisierung für 18 h bei ungefähr 45°C in der gleichen Lösung, der 50 μCi ³²P-dCTP-markierte Sonde zugesetzt worden waren, wird das Produkt dreimal in 2 × SSC, 0,2% SDS 30 min bei einer Temperatur von vorzugsweise mindestens 55°C, insbesondere mindestens 60°C, mindestens 65°C, mindestens 70°C, mindestens 75°C, vorzugsweise mindestens 80°C gewaschen.
Moleküle, an die unter diesen Bedingungen die Oligonukleotidsonde hybridisiert, können unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen werden.
Medien

YPM-Medium: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 810 ml. 90 ml 20% Maltodextrin, autoklaviert und sterilfiltriert, werden zugesetzt.
YPD-Medium: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 810 ml. 90 ml 20% Glucose, autoklaviert und sterilfiltriert, werden zugesetzt.
10 × Basal-Salzmedium: 66,8 g Hefe-Stickstoffbase, 100 g Bernsteinsäure, 60 g NaOH, H₂O auf 1000 ml, sterilfiltriert.
SC-URA: 90 ml 10 × Basal-Salz, 22,5 ml 20% Casaminosäuren, 9 ml 1% Tryptophan, H₂O auf 806 ml, autoklaviert, Zugabe von 3,6 ml 5% Threonin und 90 ml 20% Glucose oder 20% Galactose.
SC-H-Brühe: 7,5 g/l Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan. 20 min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 10 ml einer 30%-igen Galactoselösung, 5 ml einer 30%-igen Glucoselösung und 0,4 ml einer 5%-igen Threoninlösung pro 100 ml Medium zugesetzt.
SC-H-Agar: 7,5 g/l Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan und 20 g/l Agar (Bacto^TM). 20 min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 55 ml einer 22%-igen Galactoselösung und 1,8 ml einer 5%-igen Threoninlösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
YNB-1-Agar: 3,3 g/l KH₂PO₄, 16,7 g/l Agar, pH auf 7 eingestellt. 20 min bei 121°C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 25 ml einer 13,6%-igen Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 25 ml einer 40%-igen Glucoselösung, 1,5 ml einer 1%-igen L-Leucinlösung und 1,5 ml einer 1%-igen Histidinlösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
YNB-1-Brühe: Zusammensetzung wie YNB-1-Agar, aber ohne Agar.

Xylanolytische Aktivität
Die xylanolytische Aktivität kann in FXU-Einheiten, die bei pH 6,0 mit Remazol-Xylan (4-0-Methyl-D-glucurono-D-xylan, gefärbt mit Remazol Brilliant Blue R, Fluka) als Substrat bestimmt werden, ausgedrückt werden.
Eine Xylanaseprobe wird mit dem Remazol-Xylan-Substrat inkubiert. Der Hintergrund von nicht-abgebautem gefärbtem Substrat wird durch Ethanol präzipitiert. Die restliche blaue Farbe im Überstand (wie spektrophotometrisch bei 585 nm bestimmt) ist proportional zur Xylanaseaktivität und die Xylanaseeinheiten werden dann bezogen auf einen Enzymstandard bei Standardreaktionsbedingungen, d. h. bei 50,0°C, pH 6,0 und 30 min Reaktionszeit, bestimmt.
Ein Informationsblatt AF 293.6/1, das diese Analysenmethode detaillierter beschreibt, ist auf Anfrage von Novo Nordisk A/S, Dänemark, welcher Folder hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird, erhältlich.
BEISPIEL 1
Isolierung des Gens
Es wurde eine Bibliothek von Thermomyces lanuginosus, bestehend aus ungefähr 1,5 × 10° individuellen Klonen in 150 Pools, konstruiert. Aus 20 einzelnen Klonen aus der Bibliothek wurde DNA isoliert und einer Analyse hinsichtlich einer cDNA-Insertion unterworfen. Die Insertionsfrequenz wurde zu > 90% ermittelt und die durchschnittliche Insertgröße betrug ungefähr 1400 bp.
Hefe wurde mit der DNA aus einigen der Pools transformiert und es wurden 50–100 Platten, die 200–500 Hefekolonien enthielten, von jedem Pool erhalten. Nach 3–5 Tagen Kultivierung wurden die Agarplatten auf mehrere Sätze von Agarplatten replikaplattiert. Ein Satz von Platten, der 0,1% AZCL^TM Xylan (Megazyme^TM, Australien) enthält, wurde dann 3–5 Tage bei 30°C inkubiert, um Xylanaseaktivität zu detektieren. Positive Kolonien wurden als Kolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren, identifiziert. Alternativ wurde ein Satz von Platten dann 3–5 Tage bei 30°C inkubiert, bevor er mit einem Xylan-Überschichtungsgel, das 0,1% AZCL^TM-Xylan und 1% Agarose in einem Puffer mit einem geeigneten pH enthielt, überschichtet wurde. Nach der Inkubation für 1–2 Tage bei 30°C wurden positive Kolonien als Kolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren, identifiziert.
Zellen aus Enzym-positiven Kolonien wurde für die Isolierung von Einzelkolonien auf Agar verteilt, und es wurde für jede der identifizierten Xylanase produzierenden Kolonien eine Enzym produzierende Einzelkolonie selektiert.
Charakterisierung von positiven Klonen
Die positiven Klone wurden als Einzelkolonien erhalten. cDNA-Inserts wurden direkt ausgehend von der Hefe-Kolonie unter Verwendung von biotinylierten Polylinker-Primern amplifiziert, mittels des magnetische Körnchen (Dynabead^TM M-280, Dynal)-Systems gereinigt und einzeln durch Sequenzieren des 5'-Endes jedes cDNA-Klons unter Verwendung der Kettenabbruchmethode (Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R.; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977 74 5463–5467) und des Sequenase^TM-Systems (United States Biochemical) charakterisiert.
Die DNA-Sequenz ist als SEQ ID NO: 1 gezeigt, die der als SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht.
Isolierung von Hefe-DNA
Um PCR-Fehler in dem zu klonierenden Gen zu vermeiden, wurde die cDNA aus den Hefe-Plasmiden durch Standardverfahren isoliert, z. B. wie in Beispiel 1 von WO 93/11249 beschrieben, welche Veröffentlichung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird. Die Hefe-DNA wurde in 50 μl Wasser zu einer Endkonzentration von ungefähr 100 μl/ml gelöst.
Escherichia coli wurde durch Standardverfahen mit der DNA transformiert. Zwei E. coli-Kolonien wurden aus jeder der Transformationen isoliert und mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI, die das DNA-Insert herausschnitten, analysiert. Der Hefestamm JG169 wurde mit der DNA von einem dieser Klone erneut transformiert.
Die DNA-Sequenzen von mehreren der positiven Klone wurden teilweise bestimmt. Die DNA-Sequenzen der Xylanase der Erfindung ist als SEQ ID NO: 1, die der Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 2 angegeben ist, entspricht, gezeigt.
BEISPIEL 2
Expression in Aspergillus
Um das Gen in Aspergillus zu exprimieren, wird cDNA aus einem der obigen Klone durch Verdau mit HindIII/XbaI oder anderen geeigneten Restriktionsenzymen, Größenfraktionierung auf einem Gel und Reinigung isoliert und nachfolgend an pHD414 ligiert, was zu dem Plasmid pA2XITI führt. Nach der Amplifizierung in E. coli wird ein Stamm von Aspergillus oryzae mit dem Plasmid gemäß der allgemeinen Vorgehensweise, die oben in dem Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben worden ist, transformiert.
Test von Aspergillus oryzae-Transformanten
10 ml YPM-Medium wurden mit jeder der Transformanten inokuliert. Nach 3–5 Tagen Inkubation bei 30°C und 250 Upm wurde der Überstand entfernt. Die xylanolytische Aktivität wurde bestimmt, indem 10 μl Überstand in 4 mm (Durchmesser)-Löcher, die in einer Agarplatte, die 0,2% AZCL^TM-Xylan (Megazyme^TM, Australien) in einem Puffer mit geeignetem pH enthielt, ausgestochen worden waren, gegeben wurden und über Nacht bei 40°c inkubiert wurde. Die Xylanaseaktivität wurde, wie oben beschrieben, identifiziert. Einige der Transformanten hatten Höfe, die signifikant größer waren als der Aspergillus oryzae-Hintergrund. Dies zeigt eine effiziente Expression von Xylanase in Aspergillus oryzae. Die 8 Transformanten mit der höchsten Xylanase-Aktivität wurden selektiert und damit YPG-Agar inokuliert und die Transformanten darin gehalten.
Aus YPG-Agar-Schrägröhrchen wurden 500 ml-Schüttelkolben mit FG-4- und MDU-2-Medien mit jeder der 8 ausgewählten Transformanten inokuliert. Nach 3–5 Tagen Fermentation mit ausreichender Bewegung, um gute Belüftung sicherzustellen, wurden die Kulturbrühen 10 min bei 2000 g zentrifugiert und die Überstände wurden analysiert.
Ein Volumen von 15 μl von jedem Überstand wurde auf Löcher von 4 mm Durchmesser aufgetragen, die aus einem 0,1% AZCL^TM-Xylan-Überschichtungsgel (25 ml in einer Petrischale von 13 cm Durchmesser) ausgestochen worden waren. Die Xylanaseaktivität wurde durch die Bildung eines blauen Hofs bei der Inkubation identifiziert.
Nachfolgend wurde die Xylanase in einem Medium, das Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt enthielt, fermentiert. Die Fermentation wurde ausgeführt, indem ein Medium, das 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle umfasste, mit einer Schüttelkolbenkultur der Aspergillus oryzae-Wirtszellen inokuliert wurde. Nach 24 h Kultivierung bei pH 5,0 und 34°C wurde die kontinuierliche Zufuhr von zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen begonnen. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor gehalten und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff im Überschuss vorhanden war. Die Kultivierung wurde 4 Tage fortgesetzt, wonach die Enzyme durch Zentrifugation, Ultrafiltration, Klarfiltration und Keimfiltration gewonnen werden konnten.
BEISPIEL 3
Reinigungsbeispiel
Der Kulturübestand aus der in Beispiel 2 beschriebenen Fermentation von Aspergillus oryzae, die das rekombinante Enzym exprimieren, wird zentrifugiert und durch einen 0,2 μm-Filter filtriert, um die Myzele zu entfernen.
100 ml des filtrierten Überstands werden in einer Filtron^TM-Ultracette-Vorrichtung oder Amicon^TM-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer 3 kDa-Membran ultrafiltriert, um eine 10-fache Konzentrierung zu erreichen. Dieses Konzentrat wird in zwei aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationsrunden in der gleichen Vorrichtung in 20 mM TRIS, pH 8,0, 100-fach verdünnt. Diese Ultrafiltrationsprobe wird mit einer Rate von 2 ml/min auf einen Pharmacia XK 26/20 Fast Flow Q-Sepharose^TM-Anionenaustauscher, der mit 20 mM TRIS, pH 8,0, äquilibriert worden ist, aufgeladen.
Nachdem die Probe aufgetragen worden ist, wird die Säule mit zwei Säulenvolumen 25 mM TRIS, pH 8,0, gewaschen und gebundene Proteine werden mit einem linearen ansteigenden NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in 25 mM TRIS, pH 8,0, eluiert. Die Fraktionen werden gesammelt und die Xylanaseaktivität in den Fraktionen, wie oben beschrieben, gemessen.
Xylanase enthaltende Fraktionen werden gepoolt und in 10 mM Natriumcitrat, pH 4,0, UF-konzentriert. Dieses Material wird auf eine XK 16/20 Fast Flow S-Sepharose^TM-Säule mit einer Rate von 1,5 ml/min aufgeladen. Das Enzym wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl eluiert und Xylanase enthaltende Fraktionen werden gepoolt, konzentriert und für eine Charakterisierung und weitere Experimente, wie nachfolgend beschrieben, verwendet.
BEISPIEL 4
Enzymcharakterisierung
Die gemäß Beispiel 3 erhaltene Xylanase wurde der folgenden Enzymcharakterisierung unterworfen.
SDS-PAGE-Elektrophorese
SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamidgelelektrophorese) wurde in einer Mini-Leck 4-Elektrophoreseeinheit (Kem-En-Tec, Kopenhagen) als eine modifizierte Version des Laemmli-Verfahrens (Laemmli, U. K.; Nature 1970 227 680–685; Christgau et al., 1991, J. Biol. Chem. 1991 266 S. 21157–212664] ausgeführt.
Es wurde eine relative Molekülmasse (MW) von ungefähr 26 kDa bestimmt.
Isoelektrische Fokussierung
Eine isoelektrische Fokussierung wurde auf Ampholine^TM-PAG-Platten, pH 3,5–9,5, (Pharmacia, Schweden) auf einer Mul tiphor^TM-Elektrophoreseeinheit gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie gemäß Standardprotokollen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, angefärbt.
Es wurde ein isoelektrischer Punkt (pI) von ungefähr 4,5 bestimmt.
pH- und Temperaturoptima
Enzymaktivitäten werden durch die Freisetzung einer blauen Farbe aus AZCL^TM-Birken-Xylan (Megazyme, Australien) gemessen.
0,5 ml 0,4% AZCL^TM-Substratsuspension wird mit 0,5 ml 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer bei optimalem pH gemischt und es werden 10 μl einer geeignet verdünnten Enzymlösung zugesetzt. Inkubationen werden in Eppendorf-Thermomixern 15 min bei 30°C ausgeführt, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung für 20 min bei 95°C. Enzyminkubationen werden an Dreifachproben ausgeführt. Es wird eine Leerprobe erzeugt, in der Enzym zugesetzt, aber unverzüglich inaktiviert wird. Nach der Zentrifugation wird die Absorption des Überstands in Mikrotiterplatten bei 620 nm gemessen und der Leerwert abgezogen.
0,1 M Citrat/Phosphatpuffer von verschiedenen pH-Werten wurden für die Bestimmung des pH-Optimums verwendet. Es wurde ein 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer, pH 5,5, für die Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen für 15 min verwendet, um das Temperaturoptimum zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in den 1–2 gezeigt.
1 zeigt die relative xylanolytische Aktivität (%), bestimmt bei 30°C im Bereich von pH 2,5 bis 9. Es zeigt sich, dass das Enzym ein pH-Optimum im Bereich von 4,5–7,5, spezieller im Bereich von 5,0–6,5, um pH 6 herum aufweist.
2 zeigt die relative xylanolytische Aktivität (%), bestimmt bei pH 5,5 im Bereich von 30 bis 80°C. Es zeigt sich, dass das Enzym ein Temperaturoptimum im Bereich von 50–70°C, um 60°C herum hat.
BEISPIEL 5
Wärmestabilitätsvergleiche
In diesem Beispiel wurde die Wärmestabilität eines Ein-Komponenten-Xylanase-Präparats, das gemäß den Beispielen 1 bis 3 erhalten worden ist, mit jener des native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparats verglichen.
Die native Thermomyces lanuginosus-Xylanase wurde, wie unten beschrieben, hergestellt.
200 Liter YPG-Medium der folgenden Zusammensetzung (g/l) wurden 24 h mit dem Stamm Thermomyces lanuginosus DSM 4109 inokuliert:

Hefeextrat, 50% 10

Glucose 5

KH₂PO₄ 3

Na₂HPO₄, 2H₂O 2

FeSO₄ 0,25

MgSO₄, 7H₂O 2

Pluronic 0,7

pH eingestellt auf 6,0.
Nach der Inokulation wurde das Inokulum 2000 Liter des folgenden Mediums (g/l) zugesetzt und weitere 3 Tage fermentiert:

Natriumcaseinat 10

Sojamehl 20

Na₂HPO₄, 2H₂O 2

Xylan 3

Xylose 500

pH eingestellt auf 7,5.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt, der Überstand durch Ultrafiltration (unter Verwendung einer Membran mit einem Molekülmassenausschluss von 10000) konzentriert und das UF-Konzentrat durch Gefriertrocknen in ein rohes Pulver umgewandelt.
Die Präparate wurden mit 100 mM Citrat-Phosphatpuffer, pH 6,0, verdünnt, um die Enzymaktivität in einen linearen Analysenbereich zu bringen, wenn die Präparate dem nachfolgend beschriebenen Assay auf Enzymaktivität unterzogen wurden. Die verdünnten Proben wurden in Aliquots von 2 ml bei Temperaturen von 60, 65, 70 und 75°C in ein Wasserbad gesetzt. Eine Kontrolle wurde in Eiswasser gehalten. Inkubierte Proben wurden nach 60 entfernt und in Eiswasser gesetzt.
Als Substrat wurde Remazol-Xylan aus Buchenholz verwendet (4-O-Methyl-D-glucurono-D-xylan, gefärbt mit Remazol Brilliant Blue R, Fluka). Das Substrat wurde mit 100 mM Citrat-Phosphatpuffer, pH 6,0, gelöst, um eine 0,5%-ige (Gew./Vol.) Lösung herzustellen.
Um die restlichen Enzymaktivitäten zu bestimmen, wurde 0,9 ml Substrat zu vier Röhrchen (zwei Hauptwerten und zwei Leerwerten) zugesetzt und in einem Wasserbad bei 50°C 5 min vorgewärmt. Bei t = 0 wurde 0,1 ml Enzymprobe allen Röhrchen, die die Hauptwerte bildeten, zugesetzt und gemischt. Nach 60 min wurde die Inkubation beendet durch die Zugabe von 5 ml Ethanolreagenz (eine Mischung von 150 ml 99,9%-igem Ethanol und 1 ml 2 N HCl), gefolgt von 10 Sekunden Schütteln auf einem Whirlimixer. Allen Röhrchen, die die Leerwerte bildeten, wurde zuerst 5 ml Ethanolreagenz zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 0,1 ml Enzymprobe und Schütteln für 10 Sekunden auf einem Whirlimixer. Man ließ alle Röhrchen ungefähr 15 min bei Umgebungstemperatur stehen, bevor sie einer Zentrifugation bei 4000 Upm für 10 min unterworfen wurden. Schließlich wurde die optische Dichte bei 585 nm gemessen und ein Mittelwert der Doppelbestimmungen gebildet und die Leerwerte abgezogen.
Die relative restliche Enzymaktivität, die als Funktion der Inkubationstemperatur und der Zeit bestimmt wurde, wurde als Prozentsatz des Kontrollwerts (Kontrollwert definiert als „100%”) berechnet. Die Ergebnisse sind in 3 angegeben.
In der Figur ist die restliche Aktivität des Ein-Komponenten-Xylanasepräparats der Erfindung (weiße Balken) im Vergleich zu jener des native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparats (schräggestreifte Balken) dargestellt. Es ist die restliche Aktivität gezeigt, die bei pH 6,0 und nach einer Inkubation bei 60, 65, 70 und 75°C für 30 bzw. 60 min bestimmt wurde.
Aus der Figur ergibt sich, dass die Xylanasekomponente der Erfindung nach Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 60°C eine restliche Enzymaktivität von mehr als 96%, spezieller von mehr als 97%, im wesentlichen 100% aufweist.
Nach einer Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 65°C hat die Xylanasekomponente der Erfindung eine restliche Enzymaktivität von mehr als 83%, insbesondere mehr als 85%, insbesondere mehr als 90%, im wesentlichen 100%.
Nach einer Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 70°C hat die Xylanasekomponente der Erfindung eine restliche Enzymaktivität von mehr als 20%, insbesondere mehr als 30%, spezieller mehr als 40%, noch spezieller mehr als 50%, um 63% herum.
Nach einer Inkubation für 60 min bei pH 6,0 und 75°C hat die Xylanasekomponente der Erfindung eine restliche Enzymaktivität von mehr als 9%, insbesondere mehr als 10%, speziell mehr als 20%, noch spezieller mehr als 30%, um 48% herum.
Aus der Figur ergibt sich auch, dass das Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat der Erfindung eine signifikant verbesserte Wärmestabilität im Vergleich zu jener des native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparats zeigt. Neben der Tatsache, das es ein hervorragendes Futter verbesserndes Enzym ist, macht diese unerwartete Verbesserung der Wärmestabilität das Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat der Erfindung besonders gut für ein Einbringen in Tierfutterzusätze geeignet. Während des Einarbeitens in Tierfutterzusätze spielt die Wärmestabilität des Enzyms eine wichtige Rolle, um eine mikrobielle Infektion des Futters zu verhindern.
BEISPIEL 6
Verringerung der in vitro-Viskosität
Die Vorderdarm-Speisebreiviskosität ist als Haupternährungseinschränkung, die die Verdaubarkeit von auf Weizen und Gerste basierenden Broiler-Hähnchendiäten beeinflusst, identifiziert worden. Es ist eine enge Korrelation zwischen der Verringerung der Speisebreiviskositätsergebnisse und Verbesserungen bei der Hühnerfutterumwandlungseffizienz festgestellt worden [siehe z. B. Graham, H., Redford, M. und Choct, M.; Feedstuffs 1993 65 (5) 14–15].
In diesem Experiment wird die Weizenviskositätsverringerung, die durch Verwendung von (i) einem gemäß den Beispielen 1–3 erhaltenen rekombinant produzierten Ein-Komponenten-Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat, (ii) einem native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat, das durch Kultivierung, wie in Beispiel 5 beschrieben, erhalten worden ist, bzw. (iii) einem kommerziell erhältlichen Mehrkomponenten-Enzympräparat, das durch Kultivierung von Humicola insolens erhalten worden ist, (Bio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark) erhalten wird, untersucht.
Bei t = 0 wurden 12 g gemahlener trockener Weizen („Statens Husdyrbrugsforsøg”, Foulum, Dänemark), 1 mm Siebmaschenweite („mesh”), mit 38 ml Extraktionspuffer, 0,5 M HCl–KCl, pH 1,5, gemischt und darin unter konstantem Rühren bei 40°C gehalten. Während der Inkubation waren die Proben mit Zinnfolie abgedeckt. Bei t = 89 min wurde der pH mit 1 M NaOH auf 6,0 (± 0,15) eingestellt. Bei t = 90 min wurde Enzymlösung bis zu insgesamt 40 ml zugesetzt.
Die obigen Enzympräparate (i)–(iii) wurden verdünnt, um eine Enzymendkonzentration im Bereich von 0,16 bis 5,19 FXU/g Weizen zu erhalten. Alle Experimente wurden doppelt vorgenommen und Proben, d. h. Lösungen ohne jegliches zugesetztes Enzym, wurden stets als Doppelproben mit aufgenommen.
Nach 30 min Inkubation wurden die Proben für die Viskositätsbestimmung entfernt. Es wurde ein Brookfield LVDV-III-Viskosimeter mit einem kleinen Probenadaptor und der Spindel Nr. SC4-31 bei 250 Upm, was einer Scherrate von 85 s^–1 entsprach, verwendet. Für jede Bestimmung wurden ungefähr 13 ml Suspension schnell in den kleinen Probenadaptor gegossen, der in den Wassermantel mit konstanter Wasserheizung auf 40°C gesetzt wurde. Es wurden drei separate cP-Ablesungen, jede für 15 Sekunden, vorgenommen und es wurde der Durchschnittswert verwendet.
In allen Fällen wurden die mit zugesetztem Enzym erhaltenen resultierenden Daten als relative Viskosität, d. h. bezogen auf die Viskosität, die in den Kontrollproben gemessen wurde, die als „1” definiert wurde, ausgedrückt.
In 4 sind die Ergebnisse eines Vergleichs der Weizenviskositätsverringerungseffizienz zwischen (ii) der nativen Thermomyces lanuginosus-Xylanase in einer Dosis von 0,16, 0,32, 0,65, 1,29 und 2,58 FXU/g Weizen
und (iii) einem Mehrkomponenten-Enzym-Präparat, das durch Kultivierung von Humicola insolens erhalten worden ist, in einer Dosis von 0,32, 0,65, 1,29, 2,58 und 5,19 FXU/g Weizen (x) gezeigt. Aus der Figur ergibt sich, dass im Vergleich zu (iii), einem durch Kultivierung von Humicola insolens erhaltenen Mehrkomponenten-Enzym-Präparat, die native Thermomyces lanuginosus-Xylanase (ii) die Viskosität einer Weizensuspension bei Berechnung auf einer FXU-Basis signifikant verringert.
Zusätzlich sind in 5 die Ergebnisse eines Vergleichs der Weizenviskositätsverringerungseffizienz zwischen (i) der rekombinant produzierten Ein-Komponenten-Thermomyces lanuginosus-Xylanase (I) und (ii) der nativen Thermomyces lanuginosus-Xylanase (II) gezeigt. Die Ergebnisse basieren auf zwei ähnlichen Dosierungen von 0,65 und 2,58 FXU/g Weizen. Aus der Figur wird ersichtlich, dass die Wirkung auf die Viskosität in Weizensuspensionen recht ähnlich ist.
Zusammenfassend zeigt dieses Beispiel klar, dass bei Vergleich mit einem Futterzusatz des Standes der Technik die von Thermomyces lanuginosus abgeleiteten Xylanasen überlegen darin sind, die Viskosität einer Weizensuspension zu verringern, und dementsprechen ein großes Potential für eine Verwendung als Futter verbessernde Enzyme besitzen.
BEISPIEL 7
Thermomyces lanuginosus-Xylanase als Futter verbesserndes Enzym
In diesem Beispiel wird ein Thermomyces lanuginosus-Ein-Kompoenten-Xylanase-Präparat Tierfutter zugesetzt und mit einem herkömmlichen die Verdaubarkeit verbessernden Enzympräparat verglichen.
Das Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat war gemäß den Beispielen 1 bis 3 erhalten worden. Das Referenzpräparat ist ein Futterzusatz des Standes der Technik, ein Mehrkomponenten-Enzympräparat, das durch Kultivierung von Humicola insolens erhalten worden ist (Bio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark).
Broiler-Hähnchen wurden drei Wochen mit einer experimentellen Diät mit und ohne Enzyme gefüttert. Die Zusammensetzung der Diät ist in Tabelle 1 unten gezeigt.
Die Tiere wurden in fünf Hauptgruppen eingeteilt und fünf unterschiedlichen Behandlungen unterzogen. Jede Hauptgruppe wurde in acht Untergruppen (Käfige), bestehend aus 30 Broiler-Hähnchen (15 von jedem Geschlecht), unterteilt. Jede Untergruppe (Käfig) wurde separat gewogen.

Die fünf unterschiedlichen Behandlungen umfassten eine Kontrollbehandlung ohne Enzyme und die folgenden Behandlungen mit Enzymzusatz: 400 und 800 FXU/kg Futter des Referenzpräparats (Ref.) und 200 und 400 FXU/kg Futter des Ein-Komponenten-Xylanase-Präparats der Erfindung (Erf.). Tabelle 1 Futterzusammensetzung

Bestandteile	%
Weizen, entspelzt, geröstet	73,10
Fischmehl, aschearm	12,50
Fleisch-und-Knochen-Mehl, aschearm	4,00
Tierisches Fett	4,00
Methionin (40%)	4,00
Kalkstein	0,45
Dicalciumphosphat	0,60
Vitamine/Mikromineralien-Vormischung („pre-mix”)	0,75
Cholinchlorid	0,26
	0,04
Gesamt	100
ME pro kg Futter, MJ	12,85
Protein,	19,77
Pro 10 MJME, g
Protein	154
Lysin	7,26
Threonin	5,17
Methionin + Cystein	6,31
Arginin	8,77
Calcium	7,27
Phosphor, verfügbar	3,48
Natrium	1,53
Chlorid	2,21

Die Behandlung wurde bei ein Tag alten Hühnchen begonnen. Nach drei Wochen Behandlung wurden Gewichtszunahme und Futterverbrauch gemessen und ein Futterumwandlungsverhältnis (FUV) berechnet, siehe Tabelle 2 unten (in der das Hühnchengewicht und die Futteraufnahme im Alter von drei Wochen angegeben sind).
Aus Tabelle 2 ergibt sich, dass das FUV in den Gruppen, die 200 FXU/kg Futter des Enzympräparats der Erfindung (Erf.) erhalten hatten, geringer war im Vergleich zu der Kontrollgruppe und der Gruppe, die 400 FXU des Referenzpräparats (Ref.) erhalten hatten. Jedoch befindet sich das FUV, das nach Verwendung von 200 FXU des Enzympräparats der Erfindung berechnet worden ist, auf dem gleichen Niveau wie nach einer Verwendung von 800 FXU des Referenzpräparats, was anzeigt, dass im Vergleich zu dem Referenzpräparat das Enzympräparat der Erfindung bei ¼ der FXU-Dosismenge die gleiche Wirkung hat.

Folglich wird das Enzym der Erfindung als besser als das Referenzpräparat darin angesehen, die Verdaubarkeit von Futtermaterialien zu verbessern. Obwohl es ein Ein-Komponenten-Präparat ist, ist das Präparat der Erfindung im Vergleich zu einem Futterzusatz des Standes der Technik, der die Wirkung einer Mehrzahl von Enzymkomponenten bietet, überlegen darin, die Verdaubarkeit zu verbessern. Tabelle 2 Produktionsparameter von 0 bis 3 Wochen

			Gewicht/Hühnchen (g)	Futteraufnahme/Hühnchen (g)	Futterumwandlungsverhältnis (g/g)
Kontrolle			612	870	1,42	100
Ref.	400	587	839	1,42	100
Ref.	800	634	878	1,38	97
Erf.	200	623	861	1,38	97
Erf.	400	597	820	1,37	96

BEISPIEL 8
Verbesserung der metabolisierbaren Energie von Weizen in Broiler-Hähnchendiäten
Dieses Beispiel zeigt einen Vergleich von zwei Tierfutterzusätzen der Erfindung mit einem Futterzusatz des Standes der Technik hinsichtlich des Einflusses auf den Wert der apparenten metabolisierbaren Energie (AME) von Weizen.
Die zwei Tierfutterzusätze der Erfindung sind (A) ein Thermomyces lanuginosus-Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat, das durch in vitro-DNA-Rekombinationstechniken gemäß den Beispielen 1 bis 3 erhalten worden ist, und (B) ein native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat, das durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren erhalten worden ist. Der Futterzusatz des Standes der Technik ist ein Mehrkomponenten-Enzympräparat (C), das durch Kultivierung von Humicola insolens erhalten worden ist (Bio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark).
Es wurden ein Tag alte männliche Ross-Broiler-Hühnchen verwendet, die von einer kommerziellen Brutstätte geliefert worden sind. Von Tag 1 bis 16 wurden sie mit einer kommerziellen Starter-Diät gefüttert. Am Tag 16 wurden sie einzeln gewogen. Vögel mit zu hohem oder zu geringem Körpergewicht wurden ausgesondert und der Rest wurde Batteriekäfigen zugewiesen. Von Tag 16 bis Tag 23 wurden sie an die Käfige gewöhnt.
Von Tag 24 bis 28 wurde ein Bilanztest gemäß der Europäischen Referenzmethode für die in vivo-Bestimmung der metabolisierbaren Energie AME [Bourdillon et al.; Br. Pouly. Sci. 1990 31 557–565] ausgeführt. Der Versuch umfasste 9 Behandlungen mit 5 Wiederholungen von 4 Broiler-Hühnchen pro Wiederholung.
Die Grunddiät enthält 56% Sorghum, 32,5% Soyabohnenmehl, 6% tierisches Fett, 1% Sojabohnenöl und 5% Mineralien, Vitamine, Spurenelemente und Aminosäuren. In der experimentellen Diät wurde die Hälfte der Grunddiät durch Weizen ersetzt. Die Hühnchen wurden mit den Diäten als Schlempe mit einer Konzentration von 90% für eine Aufnahme ad libitum gefüttert.
Die Exkremente wurden täglich quantitativ gesammelt. Proben von Futter und gefriergetrockneten Exkrementen wurden auf Fett, Bruttoenergie (BE) und Stickstoff analysiert. Der AME-Gehalt der Diäten wurde aus ihrem jeweiligen Exkremente/Futter-Verhältnis wie auch deren entsprechendem BE-Gehalt berechnet. Eine Korrektur für eine N-Retention zu Null (AMEn) wurde unter Verwendung eines Energieäquivalents von 34,36 kJ/g zurückgehaltenes N ausgeführt. Die Fettverdaubarkeit wurde durch Fettextraktion der Diäten und der gefriergetrockneten Exkremente unter Berücksichtigung des Exkremente/Futter-Verhältnisses bestimmt.
Die Ergebnisse wurden durch eine Ein-Faktor-Varianzanalyse analysiert, wobei signifikante Unterschiede durch einen LSD-Mehrfachbereichstest unter Verwendung von Statgraphics Version 5 identifiziert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten und den 6–7 gezeigt.
6 zeigt den AMEn-Wert von Weizen (MJ/kg) als Funktion der Xylanasezugabe (FXU/kg Futter); (A) Thermomyces lanuginosus-Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat; (B) native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat; (C) Referenz (Bio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark; ein Mehrkomponenten-Enzympräparat, das durch Kultivierung von Humicola insolens erhalten worden ist).
7 zeigt die Fettverdauung (%) in der experimentellen Diät als Funktion der Xylanasezugabe (FXU/kg Futter); (A) Thermomy ces lanuginosus-Ein-Komponenten-Xylanase-Präparat; (B) native Thermomyces lanuginosus-Xylanase-Präparat; (C) Referenz (Bio-Feed Plus CT, ein Produkt von Novo Nordisk A/S, Dänemark; ein Mehrkomponenten-Enzympräparat, das durch Kultivierung von Humicola insolens erhalten worden ist).
Eine Ergänzung der Grunddiät mit 200 FXU/kg Futter von entweder (A) oder (B) führte zu einem relativ geringen und nichtsignifikanten Anstieg des AMEn-Durchschnittswerts wie auch von dem der Fettverdauung (siehe Tabelle 3). Folglich werden keine Korrekturen hinsichtlich der Aktivität der Xylanasen gegenüber den Grundkomponenten vorgenommen, wenn die AMEn-Werte von Weizen berechnet werden.
In der experimentellen Diät waren sowohl (A) als auch (B) in Dosen von 100 und 200 FXU/kg Futter enthalten, wohingegen (C) in einer Dosis von 400 FXU/kg Futter enthalten war.
Wie aus Tabelle 3 ersehen werden kann, führten beide Dosen der Tierfutterzusätze der Erfindung zu einem signifikanten besseren AMEn-Wert als die experimentelle Diät allein. Der AMEn-Wert von Weizen zeigt Verbesserungen von 4,9–8,6% nach Zugabe der Enzyme. Der Referenzzusatz (C) zeigt eine Verbesserung hinsichtlich des AMEn-Werts von Weizen von 4,9%.
Bei einem Vergleich der Tierfutterzusätze der Erfindung mit einem Zusatz des Standes der Technik ist klar, dass die Tierfutterzusätze der Erfindung viel besser wirken als der Referenzzusatz, wenn sie auf einer FXU-Basis dosiert werden. 200 FXU/kg von (B) sind signifikant besser als 400 FXU//kg von (C).
Die Fettverdauung der experimentellen Diät folgt dem gleichen Muster wie die AMEn-Wert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Tierfutterzusatz, der eine Xylanase enthält, wobei die Xylanase aufweist i) eine Ainosäuresequenz von mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO: 2; oder wobei die Xylanase von einem DNA-Konstrukt codiert wird, das umfasst ii) die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder iii) einen Xylanase codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 oder iv) die Nukleotide Nr. 31–705 von SEQ ID NO: 1 oder v) einen Xylanase codierenden Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, oder vi) eine DNA-Sequenz, die sich von den Sequenzen von ii) bis v) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, oder vii) eine DNA-Sequenz, die mindestens zu 80% homolog zu einer der sequenzen von ii) bis vi) ist; und dadurch gekennzeichnet ist, dass der Tierfutterzusatz als Granulat mit oder ohne Beschichtung erhältlich ist.
Tierfutterzusatz nach Anspruch 1, wobei die in Absatz i) von Anspruch 1 erwähnte Homologie mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% beträgt oder wobei die in Absatz vii) von Anspruch 1 erwähnte Homologie mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% beträgt.
Vormischung (”Pre-mix”) für Tierfutter, die einen Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.
Tierfutter, das Tierfutterbestandteile gemischt mit einer Xylanase enthält, wobei die Xylanase aufweist i) eine Ainosäuresequenz von mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO: 2; oder wobei die Xylanase von einem DNA-Konstrukt codiert wird, das umfasst ii) die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder iii) einen Xylanase codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 oder iv) die Nukleotide Nr. 31–705 von SEQ ID NO: 1 oder v) einen Xylanase codierenden Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, oder vi) eine DNA-Sequenz, die sich von den Sequenzen von ii) bis v) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, oder vii) eine DNA-Sequenz, die mindestens zu 80% homolog zu einer der sequenzen von ii) bis vi) ist.
Verfahren zum Herstellen von Tierfutter, wobei Futterbestandteile mit dem Tierfutterzusatz, der eine Xylanase enthält, gemischt wird, wobei die Xylanase aufweist i) eine Ainosäuresequenz von mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO: 2; oder wobei die Xylanase von einem DNA-Konstrukt codiert wird, das umfasst ii) die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder iii) einen Xylanase codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 oder iv) die Nukleotide Nr. 31–705 von SEQ ID NO: 1 oder v) einen Xylanase codierenden Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, oder vi) eine DNA-Sequenz, die sich von den Sequenzen von ii) bis v) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, oder vii) eine DNA-Sequenz, die mindestens zu 80% homolog zu einer der sequenzen von ii) bis vi) ist; oder die Vormischung nach Anspruch 3.
Verwendung einer Xylanase, wobei die Xylanase aufweist i) eine Ainosäuresequenz von mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO: 2; oder wobei die Xylanase von einem DNA-Konstrukt codiert wird, das umfasst ii) die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder iii) einen Xylanase codierenden Teil von SEQ ID NO: 1 oder iv) die Nukleotide Nr. 31–705 von SEQ ID NO: 1 oder v) einen Xylanase codierenden Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 10133 erhältlich ist, oder vi) eine DNA-Sequenz, die sich von den Sequenzen von ii) bis v) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, oder vii) eine DNA-Sequenz, die mindestens zu 80% homolog zu einer der sequenzen von ii) bis vi) ist; in Tierfutter, Tierfutterzusätzen oder Vormischungen; oder für die in vitro erfolgende Modifizierung von Tierfutterbestandteilen.