DE69333766T2

DE69333766T2 - Herstellung von phytat-degradierenden enzymen in trichoderma

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Publication number: DE69333766T2
Application number: DE69333766T
Authority: DE
Inventors: K. Helena NEVALAINEN; T. Marja PALOHEIMO; S. Arja MIETTINEN-OINONEN; K. Tuula TORKKELI; Michael Cantrell; Cristopher Piddington; A. John RAMBOSEK; K. Marja TURUNEN; B. Richard FAGERSTRÖM; Christine Sleiziz Houston
Original assignee: Roal Oy
Current assignee: Roal Oy
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2013-07-31
Also published as: WO1994003612A1; AU4710393A; US5780292A; ES2238673T3; DE69333766D1; EP0659215A1; PT659215E; CA2141437A1; EP0659215B1; ATE290086T1; JPH08501685A; US5830733A

Description

Der mesophile filamentöse Pilz Trichoderma reesei ist beim Sezernieren von Cellulaseenzymen in das Wachstumsmedium sehr effizient. Bei optimierten Kultivierungsbedingungen ist von Mengen von bis zu 40 g/l extrazellulärer Cellulase berichtet worden (Durand et al., Enzyme Microb. Technol. 10: 341–346 (1988); Durand et al. in Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Academic Press, 1988, S. 135–151).
Die Entwicklung von Transformationssystemen für T. reesei (Knowles et al., EP 244 234 ; Penttilä et al., Gene 61: 155–164 (1987); Berka et al., EP 215 594 ) hat die Anwendung gentechnischer Verfahren auf den Pilz möglich gemacht. Durch Gentechnik sind die Produktionsprofile verschiedener Cellulaseenzyme moduliert worden, z.B. um Stämme mit verbesserten Leveln des Endoglucanase I-Enzyms zu ergeben. Der starke cbh1-Promotor ist angewendet worden, um Endoglucanase-Expression zu fördern (Nevalainen et al., "The molecular biology of Trichoderma and its application to the expression of both homologous and heterologous genes", in Molecular Industrial Mycology, Leong und Berka, Hrsg., Marcel Dekker Inc., New York, S. 129–148 (1991); und Harkki, A. et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227–233 (1991)).
Zusätzlich zum Maßschneidern der Produktionsprofile homologer Proteine ist das Produktionspotential von T. reesei nutzbar gemacht worden, um verschiedene heterologe Proteine in dem Pilz zu exprimieren. Bislang sind es wenige Beispiele und diese schließen z.B. Kälberchymosin (Knowles et al., EP 244 234 ; Berka et al., EP 215 594 ; Harkki, A. et al., Bio/Technol. 7: 596–603 (1989); Uusitalo, J. M. et al., J. Biotechnol. 17: 35–50 (1991)), CBH1-Fab-Fusionsantikörper, erzeugt gegen 2-Phenyloxazolon (Nyyssönen et al., WO92/01797), und ein ligninolytisches Pilzenzym (Saloheimo, M. und Niku-Paavola, M.-L., Bio/Technol. 9: 987–990 (1991)) ein. Für verbesserte Expression ist das gewünschte Gen in eine cbh1-Expressionskassette eingefügt worden und in T. reesei durch Protoplastentransformation eingeführt worden (Harkki, A. et al., Bio/Technol. 7: 596–603 (1989); Nyyssönen et al., WO92/01797; Saloheimo, M. und Niku-Paavola, M.-L., Bio/Technol. 9: 987–990 (1991)). Obwohl heterologe Promotoren filamentöser Pilze, wie z.B. Aspergillus amdS, -argB und -Glucoamylase (GA), in T. reesei wenigstens in einem gewissen Ausmaß funktionieren können (Penttilä et al., Gene 61: 155–164 (1987); Knowles et al., EP 244 234 ), erfordert effiziente Expression die Verwendung eines homologen Promotors. Des Weiteren sind in manchen Fällen durch Herstellen des gewünschten Genprodukts als ein Fusionsprotein bessere Ausbeuten erhalten worden (Harkki, A. et al., Bio/Technol. 7: 596–603 (1989); Nyyssönen et al., WO92/01797). Die Ausbeuten heterologer Proteine, erhalten von T. reesei, haben zwischen 10–150 mg/l variiert.
Phytat, eine Speicherform von Phosphor in Pflanzensamen, ist Teil der menschlichen und Tier-Ernährung. Phytat-Phosphor ist monogastrischen Tieren ("monogastrics") schlecht verfügbar, weil es Komplexe mit multivalenten Metallionen ausbildet und an Proteine bindet.
Folglich ist der Abbau von Phytat von Interesse. Die Pflanzenphytin-abbauenden Enzyme Phytase und saure Phosphatase für die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganischen Phosphor werden z.B. von Bakterien (Powar, V. K. und Jagannathan, V. J., J. Bacteriol. 15: 1102–1108 (1982); Cosgrove, D. J., Aust. J. Biol. Sci. 23: 1207–1220 (1970), und Cosgrove, D. J. et al., Aust. J. Biol. Sci. 23: 339–343 (1970); Hefen (Nayini, N. R. und Markakis, P., Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 17: 24–26 (1984)) und filamentösen Pilzen bzw. Fadenpilzen, umfassend verschiedene Aspergillus-Arten, wie z.B. A. terreus (Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 32: 1275–1282 (1968), A, ficuum (Gibson, D. M., Biotechnol. Lett. 9: 305–310 (1987), und A. niger (Shieh, T. R. und Ware, J. H., Appl. Microbiol. 16: 1348–1351 (1968)), hergestellt. Für vollständigen Abbau von Pflanzenphytin sind sowohl Phytase als auch pH 2,5-saure Phosphatase erforderlich.
Industrielle Anwendungen sind mit bemerkenswert höheren Produktionsausbeuten als die von den natürlichen gemeldeten Stämmen hergestellten Mengen verbunden. Das für Phytase codierende Gen ist kürzlich aus A. ficuum isoliert und charakterisiert worden (Van Gorcom et al., EP 420 358 oder WO91/05053), und die Produktion von Phytase ist in A. niger durch Vergrößern der Kopienzahl des Gens in einer Expressionskassette, enthaltend einen starken homologen Aspergillus-Promotor, z.B. GA (Van Gorcom et al., EP 420 358 oder WO91/05053), verbessert worden. Ein für saure Phosphatase codierendes Gen ist aus A. niger isoliert und charakterisiert worden (MacRae et al., Gene 71: 339–348 (1988)).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Bedürfnis nach besseren Produktionsverfahren für Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase und nach Zusammensetzungen, enthaltend dieselben, erkennend, haben die Erfinder hocheffiziente Verfahren für die rekombinante Herstellung davon entwickelt.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Erhalten einer Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Phytat-abbauendes Enzym und wenigstens ein Trichoderma-Enzym, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus einer β-Glucan-abbauenden Aktivität, CBHI, CBHII, EGI und EGII, umfasst, das die Schritte:

a) Herstellen eines rekombinanten Konstrukts, das ein Gen, codierend ein Phytat-abbauendes Enzym, ausgewählt aus Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase, wobei die Phytase die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 8 aufweist, oder wobei die pH 2,5-saure Phosphatase die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, und eine mit dem Gen funktionell verknüpfte Signal-Sequenz enthält;
b) Transformieren eines Trichoderma reesei-Wirts mit dem Konstrukt;
c) Kultivieren des transformierten Trichoderma reesei-Wirts unter für den Trichoderma reesei-Wirt und für Expression des Phytat-abbauenden Enzyms geeigneten Bedingungen;
d) und Entfernen des Mycels aus dem Kulturmedium

Es wird ferner die Verwendung derartiger Zusammensetzungen bei Futter und andere derartige Verfahren, umfassend Nahrungsmittelzusammensetzungen, insbesondere für Tiere, bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Sequenz von Peptid #816 ([SEQ ID NO:57:]), Oligo PHY-31 ([SEQ ID NO:64:]), Peptid #1110 ([SEQ ID NO:62:]), Oligo PHY-34 ([SEQ ID NO:65:]) und Oligo PHY-35 ([SEQ ID NO:52:]). Das pH 2,5-saure Phosphatase-Oligonucleotid PHY-31 ist ein Gemisch von 17meren mit 64facher Degeneriertheit und einem einzelnen Inosin. Peptid #816 stammt aus einem Endoproteinase Lys-C-Verdau von gereinigter, nativer, saurer Phosphatase. PHY-34 ist ein Gemisch von 17meren mit 128facher Degeneriertheit. PHY-35 ist ein Gemisch von 17meren mit 64facher Degeneriertheit. Sowohl PHY-34 als auch PHY-35 sind für vollständige Repräsentation von Peptid #1110 notwendig. Peptid #1110 stammt von einem Trypsin-Verdau von gereinigter, nativer, saurer Phosphatase.
2. Nucleotid-Sequenz aus dem SphI-Fragment mit 2,1 kb, enthaltend das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen [SEQ ID NO:1:] mit abgeleiteter Aminosäuretranslation [SEQ ID NO:2:]. Die Intron-Donor-, Lasso- und Akzeptor-Sequenz, wie durch cDNA-Sequenzieren bestimmt, sind überstrichen. Die Nucleotid-Sequenz, korrespondierend zu Peptiden #816 ([SEQ ID NO:57:]) und #1110 ([SEQ ID NO:62:]), ist unterstrichen. Die genomische Nucleotid-Sequenz wurde durch das M13-Didesoxyverfahren (Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)) unter Verwendung des United States Biochemical Sequencase II-Kit bestimmt.
3. Die Aminosäure-Sequenzen der tryptischen Phytasepeptide #792 [SEQ ID NO:43:] und #420 [SEQ ID NO:23:] und die abgeleiteten Oligonucleotide [SEQ ID NO:3:, :3:, :5: und :6:], verwendet bei der Herstellung der Phytase-Sonde durch verschachtelte ("nested") PCR-Amplifikation.
4. Plasmid pALK169. Die Karte von pALK169, enthaltend das SphI-Insert von 2,4 kb und zeigend die Restriktionskarte des Inserts. Die Lage des Phytase-Gens ist durch einen Pfeil angezeigt. Die Hybridisierungsstelle in der Phytase-Sequenz für das PCR-Fragment von 350 bp ist durch eine verstärkte Linie angezeigt.
5. Die Nucleotid-Sequenz des Phytase-Gens. [SEQ ID NO:7: (DNA) und :8: (Aminosäure)].
6. Die PCR-Primer, verwendet zur Herstellung der cbh1-Phytase-Fusionsfragmente [SEQ ID NO:9: und :10: und :11: und :12:].
7. Konstruktion von pALK171. Das Phytase-Gen mit seiner eigenen Signal-Sequenz wurde an den cbh1-Promotor fusioniert. Nur die relevanten Restriktionsstellen sind gezeigt.
8. Konstruktion von pALK172. Das Phytase-Gen wurde an die cbh1-Signal-Sequenz fusioniert. Nur die relevanten Restriktionsstellen sind gezeigt.
9. Plasmide pALK173A und pALK173B. Die Karten des Plasmids, enthaltend das Phytase-Gen mit seinem eigenen Promotor und den Selektionsmarker, amdS-Gen, sind gezeigt. In dem Plasmid pALK173A ist die transkriptionale Orientierung des Phytase- und amdS-Gens die gleiche; und in dem Plasmid pALK173B ist die transkriptionale Orientierung dieser zwei Gene einander entgegengesetzt.
10. Western-Blots der Proben aus den Kulturüberständen von den Trichoderma-Wirtsstämmen und -Transformanten, die Phytase produzieren. Spur 1: 50 ng gereinigter Aspergillus ALKO 243-Phytase; Spur 2: 15 ng endoF-behandelter Aspergillus ALKO 243-Phytase; Spuren 3 und 10: T. reesei ALKO 233; Spuren 4–5 und 11–12: T. reesei ALKO 233-Transformante 171FR/A4 bzw. A13; Spuren 6 und 13: T. reesei ALKO 2221; Spuren 7–8 und 14–15: T. reesei ALKO 2221-Transformante 171FR/A5 bzw. A9; Spur 9: T. reesei ALKO 2221-Transformante D2; Spur 16: T. reesei ATCC 56765; Spuren 17, 18, 19: T. reesei ATCC 56765-Transformanten 171FR/A21, A11 bzw. A23. In jedem Fall wurden 2 μl einer 1:10-Verdünnung des Kulturüberstands in einem Gel laufen gelassen. 171FR: der Wirt, transformiert mit dem XbaI-Fragment aus dem Plasmid pALK171.
11. Die zum Herstellen des cbh1-pH 2,5-saure Phosphatase-Fusionsfragments [SEQ ID NOS:13: und :14: und :15:] verwendeten PCR-Primer.
12. Konstruktion des Plasmids pALK533. Das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen mit seiner eigenen Signal-Sequenz wurde an den cbh1-Promotor fusioniert.
13. Konstruktion des Plasmids pALK532. Das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen wurde an die/den cbh1-Signal-Sequenz und -Promotor fusioniert.
14. Western-Blot der Trichoderma-Transformanten, die pH 2,5-saure Phosphatase herstellen. Spur 1: 10 ng gereinigter Aspergillus ALKO 243-pH 2,5-saure Phosphatase; Spur 2: 10 ng von endoF-behandelter Aspergillus ALKO 243-pH 2,5-saurer Phosphatase; und Spuren 3–9: 60 ng Protein von jedem der Kulturüberstände von Trichoderma reesei ALKO 2221-Transformanten SC-9, KA-31, KA-17, KB-44, KB-18, SB-4 bzw. KA-28.
I. DEFINITIONEN
In der folgenden Beschreibung wird eine Anzahl von in der rekombinanten DNA (rDNA)-Technologie verwendeten Ausdrücke ausführlich verwendet. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche, einschließlich des Umfangs, der solchen Ausdrücken gegeben werden soll, bereitzustellen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
Gen. Eine DNA-Sequenz, enthaltend eine Matrize für eine RNA-Polymerase. Die von einem Gen transkribierte RNA kann oder kann nicht für ein Protein codieren. RNA, die für ein Protein codiert, wird Messenger-RNA (mRNA) genannt und wird in Eukaryoten von RNA-Polymerase II transkribiert. Ein Gen, enthaltend eine RNA-Polymerase II-Matrize (als ein Er gebnis eines RNA-Polymerase II-Promotors), wobei eine RNA-Sequenz transkribiert wird, die eine Sequenz, komplementär zu der einer speziellen mRNA aufweist, aber normalerweise nicht translatiert wird, kann auch konstruiert werden. So ein Genkonstrukt wird hierin als ein "Antisense-RNA-Gen" bezeichnet, und solch ein RNA-Transkript wird als eine "Antisense-RNA" bezeichnet. Antisense-RNAs sind, aufgrund der Anwesenheit translationaler Stop-Kodons in der Antisense-RNA-Sequenz, normalerweise nicht translatierbar.
Ein "komplementäres DNA"- oder "cDNA"-Gen schließt rekombinante Gene ein, die beispielsweise durch Umkehrtranskription von mRNA synthetisiert werden, und denen folglich dazwischenliegende Sequenzen (Introns) fehlen. Genklone von genomischer DNA können Introns enthalten oder nicht.
Klonierungsvehikel. Eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenzen, die in der Lage ist, genetische Information, speziell DNA, in eine Wirtszelle zu tragen. Ein Klonierungsvehikel wird oft durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstelle(n) charakterisiert, an der/denen derartige DNA-Sequenzen auf vorherbestimmbare Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vehikels geschnitten werden können, und in die eine gewünschte DNA gespleißt werden kann, um deren Klonieren in die Wirtszelle zu bewirken. Das Klonierungsvehikel kann ferner einen Marker enthalten, geeignet für eine Verwendung bei der Identifikation von Zellen, die mit dem Klonierungsvehikel transformiert sind und Replikationsursprünge enthalten, die die Aufrechterhaltung und Replikation des Vehikels in einem oder mehreren prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt(en) ermöglichen. Marker sind beispielsweise Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Das Wort "Vektor" wird manchmal anstelle von "Klonierungsvehikel" verwendet. Ein "Plasmid" ist ein Klonierungsvehikel, im Allgemeinen zirkuläre DNA, die in wenigstens einer Wirtszelle aufrecht erhalten wird und darin autonom repliziert.
Expressionsvehikel. Ein Vehikel oder Vektor, ähnlich zu einem Klonierungsvehikel, das/der aber die Expression eines Gens, das in dieses/diesen hineinkloniert worden ist, nach Transformation in einen Wirt unterstützt. Das klonierte Gen wird gewöhnlich unter die Kontrolle von gewissen Kontroll-Sequenzen (d.h., es wird funktionell mit diesen verknüpft) platziert, wie z.B. Promotor-Sequenzen, die durch das Vehikel oder durch die rekombinante Konstruktion des klonierten Gens bereitgestellt werden können. Expressionskontroll-Sequenzen werden, abhängig davon, ob der Vektor entworfen ist, um das funktionell verknüpfte Gen in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt zu exprimieren, variieren und können zusätzlich Transkriptionselemente, wie z.B. Enhancer-Elemente (stromaufwärts liegende Aktivierungs-Sequenzen, "upstream activation sequences") und Terminations-Sequenzen, und/oder Translations-Start- und -Terminationsstellen enthalten.
Wirt. Ein Wirt ist eine Zelle, prokaryotisch oder eukaryotisch, die als der Empfänger und Träger von rekombinantem Material verwendet wird.
Eukaryotischer Wirt. Ein "eukaryotischer Wirt" kann eine beliebige Zelle von einem eukaryotischen Organismus, einschließlich beispielsweise Tier, Pflanze, Pilz und Hefe, sein.
Erfindungsgemäßer Wirt. Der "erfindungsgemäße Wirt" ist ein Trichoderma reesei-Wirt, der konstruiert worden ist, um rekombinante Phytase und/oder pH 2,5-saure Phosphatase gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu produzieren.
Funktionales Derivat. Ein "funktionales Derivat" eines Proteins oder einer Nucleinsäure ist ein Molekül, das chemisch oder biochemisch abgeleitet ist von (erhalten ist von) so einem Protein oder so einer Nucleinsäure und welches eine biologische Aktivität (entweder funktional oder strukturell) beibehält, die ein Charakteristikum des nativen Proteins oder der nativen Nucleinsäure ist. Eine "Mutante" eines Proteins oder einer Nucleinsäure ist ein biochemisches oder chemisches Derivat von so einem Protein oder so einer Nucleinsäure. Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "funktionales Derivat" "Mutanten", "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemische Derivate" eines Moleküls einschließt, die eine gewünschte Aktivität des nativen Moleküls beibehalten.
Wie hierin verwendet, sagt man, dass ein Molekül ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls ist, wenn es zusätzliche chemische Anteile ("moieties") enthält, die normalerweise kein Teil des Moleküls sind. Solche Anteile können die Löslichkeit, Absorption, Halbwertszeit, etc., des Moleküls verbessern. Die Anteile können die Toxizität des Moleküls verringern oder irgendeinen unerwünschten Nebeneffekt des Moleküls, etc., eliminieren oder abschwächen. Anteile, fähig zum Vermitteln solcher Effekte, sind in Remgington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. Verfahren zum Koppeln solcher Anteile an ein Molekül sind im Fachgebiet gut bekannt.
Fragment. Ein "Fragment" eines Moleküls, wie z.B. eines Proteins oder einer Nucleinsäure, soll sich auf einen Teil der nativen Aminosäure- oder genetischen Nucleotid-Sequenz, und insbesondere auf die funktionalen Derivate der Erfindung beziehen.
Variante oder Analogon. Eine "Variante" oder ein "Analogon" eines Proteins oder einer Nucleinsäure soll sich auf ein Molekül, im Wesentlichen ähnlich in Struktur und biologischer Aktivität zu dem nativen Molekül, wie z.B. das, codiert von einem funktionalen Allel, beziehen.
II. DIE ERFINDUNGSGEMÄßEN WIRTE
T. reesei produziert keine endogene Phytase. Statt dessen werden andere Enzymkomponenten, wie z.B. β-Glucan-abbauende Aktivität, wichtig z.B. bei Futteranwendungen, in hohen Mengen produziert. Folglich resultiert die Verwendung von T. reesei als Produktionswirt für Pilzphytase und pH 2,5-saure Phosphatase in der Sekretion einer völlig unterschiedlichen Enzymzusammensetzung, wenn verglichen mit der, die von Aspergillus sezerniert wird. Zusätzlich werden durch Verwendung von Trichoderma reesei als eine Quelle einer Zusammensetzung, enthaltend Phytat-abbauende Enzyme, einige schwierige Probleme beim nachgeschalteten Prozessieren, die mit ähnlichen Aspergillus-Zusammensetzungen (z.B. bei der Filtration) eintreten, vermieden. Dies ist der Fall, weil die Art der Kultivierung von rekombinantem T. reesei anders als die von Aspergilli ist, wobei das Mycel in den meisten Fällen fluid und leicht trennbar ist. Folglich werden durch Produzieren dieser Enzyme in den erfindungsgemäßen Wirten keine Probleme bei der nachfolgenden Filtration des sezernierten Materials gesehen, wie dies mit dem oft schleimigen und dicken Mycel von Aspergilli der Fall ist.
Verbesserte Mengen an Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase (wenn verglichen zur Synthese in Aspergillus) können durch Einfügen einer DNA-Sequenz, erhalten von A. niger, codierend für Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Aktivität, in eine T. reesei-Expressionskassette, enthaltend den cbh1-Promotor und das Aspergillus-amdS-Gen als einen Transformationsmarker, in dem T. reesei-Expressionssystem produziert werden. Transformation des Konstrukts in T. reesei-Wirte resultiert in stabilen Transformanten, die die Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase in hohen Mengen in einem neuen Hintergrund ("background") begleitender Enzymaktivitäten exprimieren.
Die durch T. reesei produzierte Mischung enthält hohe β-Glucanase-Aktivität und niedrige Glucoamylase-Aktivität. Außerdem ist die Menge an Phytase, hergestellt durch rekombinante T. reesei-Stämme in Schüttelkolbenkultivierungen, vergleichbar zum Level, zu dem die Hauptcellulase, die endogene Cellobiohydrolase I, exprimiert wird, mehr als 1 g/l. Die Menge der pH 2,5-sauren Phosphatase, hergestellt durch die rekombinanten Stämme in Schüttelkolbenkultivierungen, ist weniger als 0,5 g/l.
Aspergillus niger var. awamori ALKO 243 (ATCC 38854) (IFO4033)-Phytase und -saure Phosphatase (optimaler pH 2,5) wurden in Trichoderma reesei unter der Kontrolle des Trichoderma-Cellobiohydrolase I (cbh1)-Promotors überexprimiert. Zusätzlich wurde das Phytase-Gen von seinem eigenen Promotor exprimiert.
Für beide Gene wurden zwei Konstruktionen, die den cbh1-Promotor benutzen, hergestellt: in einer Konstruktion wurde die Signal-Sequenz von Phytase oder saurer Phosphatase verwendet, und in der anderen Konstruktion wurde die cbh1-Signal-Sequenz verwendet. In allen Fällen wurden die Fusionen unter Verwendung von PCR präzise angefertigt, und die Plasmide wurden so konstruiert, dass die Expressionskassette von dem Vektor-Rückgrat ("backbone") vor den Transformationen getrennt werden konnte. Folglich war es möglich, Stämme nur mit den gewünschten Sequenzen (und nicht dem gesamten Vektor, verwendet zum Aufrechterhalten der Sequenzen) zu transformieren, und folglich Stämme zu erhalten, die nicht irgendwelche "fremden" Sequenzen enthielten; solche Stämme waren für industrielle Zwecke geeignet.
Drei Trichoderma reesei-Stämme, ATCC 56765 (RutC-30), ALKO 233 (VTT-D-79125) und ein schwach Aspartylprotease-produzierender Stamm ALKO 2221, wurden als Wirte für Phytase-Expression verwendet. Für saure Phosphatase-Expression wurde nur T. reesei ALKO 2221 transformiert. Wenn Phytase unter dem cbh1-Promotor in Trichoderma exprimiert wurde, führte die beste Transformation ohne E. coli-Sequenzen in Schüttelkolbenkultivierungen zu etwa 3600-fach mehr Phytase als der nicht-transformierte A. niger ALKO 243. Wenn der Phy tase-Promotor verwendet wurde, war die beste in Schüttelkolbenkultivierungen von T. reesei-Transformanten erhaltene Ausbeute etwa 120-fach die der mit A. niger ALKO 243 erhaltene. Die besten erhaltenen saure Phosphatase-Aktivitäten waren etwa 240fach höher, verglichen mit den Leveln, hergestellt durch den A. niger ALKO 243-Stamm.
Die Molekulargewichte (in SDS-PAGE) der Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase, sezerniert von Trichoderma, waren verschieden von jenen, sezerniert von Aspergillus. Der Unterschied schien auf unterschiedlicher Glykosylierung zu beruhen.
Der Produktionslevel von Phytase, erhalten, wenn das Aspergillus-Gen in Trichoderma unter der Kontrolle eines Trichoderma-Promotors exprimiert wurde, war überraschend hoch.
Die Verwendung von T. reesei als ein Produktionswirt für Pilzphytase und Pilz-pH 2,5-saure Phosphatase resultiert in völlig unterschiedlichen Enzympräparationen, wenn verglichen mit denen von Aspergillus. Wenn verglichen mit Aspergillus-Präparationen, enthalten die durch T. reesei hergestellten Mischungen wesentlich höhere β-Glucanase- und verhältnismäßig niedrigere Glucoamylase-Aktivitäten, was deshalb T. reesei-Präparationen bevorzugt z.B. bei Tierfutter zu verwenden sind.
Die erfindungsgemäßen Wirte sollen alle Trichoderma einschließen. Trichoderma werden auf Basis von morphologischem Nachweis von Ähnlichkeit klassifiziert. T. reesei war früher als t. viride Pers. oder T. koningii Oudem bekannt; manchmal wurde T. reesei als eine eigene Art der T. longibrachiatum-Gruppe klassifiziert. Der gesamte Genus Trichoderma ist im Allgemeinen charakterisiert durch schnell wachsende Kolonien, die buschige oder pustelige, wiederholt verzweigte Conidiophoren mit lageniformen Phialiden und Hyalinen oder grünen Konidien, getragen in schleimigen Köpfen (Bissett, J., Can. J. Bot. 62: 924–931 (1984)), tragen.
Der Pilz, genannt T. reesei, ist klar definiert als genetische Familie, stammend aus dem Stamm QM6a, d.h., eine Familie von Stämmen, die einen gemeinsamen genetischen Hintergrund besitzen, der aus einem einzelnen Nucleus des speziellen Isolats XM6a stammt. Nur solche Stämme werden T. reesei genannt.
Die Klassifizierung durch morphologische Mittel ist problematisch, und die ersten kürzlich veröffentlichten molekularen Daten aus DNA-Fingerprint-Analyse und dem Hybridisierungsmuster des Cellobiohydrolase II (cbh2)-Gens in T. reesei und T. longibrachiatum zeigen klar eine Differenzierung dieser Stämme (Meyer, W. et al., Curr. Genet. 21: 27–30 (1992); Morawetz, R., et al., Curr. Genet. 21: 31–36 (1992)).
Jedoch besteht ein Hinweis auf Ähnlichkeit zwischen verschiedenen Trichoderma-Arten auf dem molekularen Level, der in der Konservierung von Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen von makromolekularen Einheiten gefunden wird, die den verschiedenen Trichoderma-Arten gemein sind. Beispielsweise offenbart Chang, C., et al., Nucl. Acids Res. 19: 5559 (1990), die Nucleotid-Sequenz von T. viride cbh1. Das Gen wurde unter Verwendung einer Sonde, basierend auf der T. reesei-Sequenz, isoliert. Die Autoren bemerken, dass eine 95% Homologie zwischen den Aminosäure-Sequenzen des T. viride- und T. reesei-Gens besteht. Goldman, G. H., et al., Nucl. Acids Res. 18: 6717 (1990), offenbart die Nucleotid-Sequenz von Phosphoglyceratkinasen aus T. viride und bemerkt, dass die abgeleitete Aminosäure-Sequenz 81% homolog zu dem Phosphoglyceratkinase-Gen aus T. reesei ist. Folglich müssen die als T. viride klassifizierte Art und T. reesei genetisch sehr nah beieinander liegen.
Des Weiteren besteht eine hohe Ähnlichkeit von Transformationsbedingungen unter den Trichoderma. Obwohl praktisch alle industriell wichtigen Arten von Trichoderma in der zuvor diskutierten Trichoderma-Sektion Longibrachiatum gefunden werden können, gibt es manche anderen Arten von Trichoderma, die dieser Sektion nicht zugeordnet werden. Solch eine Art ist beispielsweise Trichoderma harzianum, die als ein Biokontrollwirkstoff gegen Pflanzenpathogene wirkt. Für diese Trichoderma-Art ist außerdem ein Transformationssystem entwickelt worden (Herrera-Estrella, A., et al., Molec. Microbiol. 4: 839–843 (1990)), das im Wesentlichen dasselbe wie das in der Anmeldung Gelehrte ist. Folglich ist das von Herrera-Estrella bei der Herstellung von Spheroplasten vor der Transformation verwendete Verfahren dasselbe, obwohl Trichoderma harharzianum nicht der Sektion Longibrachiatum zugeordnet wird. Die Lehren von Herrera-Estrella zeigen, dass keine signifikante Verschiedenartigkeit von Trichoderma spp. besteht, so dass von dem erfindungsgemäßen Transformationssystem nicht erwartet werden würde, dass es in allen Trichoderma funktioniert.
Ferner besteht eine gemeinsame Funktionalität von Pilztranskriptions-Kontrollsignalen unter Pilzarten. Es wurde gezeigt, dass wenigstens drei A. nidulans-Promotor-Sequenzen, amdS, argB und gpd, Genexpression in T. reesei herbeiführen. Für amdS und argB sind nur ein oder zwei Kopien des Gens ausreichend, um einen selektierbaren Phänotyp hervorzubringen (Penttilä et al., Gene 61: 155–164 (1987). Gruber, F., et al., Curr. Genetic 18: 71–76 (1990) bemerkt außerdem, dass diese Pilz-Gene oft erfolgreich quer durch verschiedene Arten exprimiert werden können.
Viele Arten von Trichoderma sind von einer breiten Vielfalt von Ressourcen-Zentren, die Pilzkultur-Kollektionen enthalten, verfügbar. Zusätzlich sind Trichoderma-Arten in verschiedenen Datenbanken katalogisiert. Diese Ressourcen und Datenbanken sind von O'Donnell, K., et al. in Biochemistry of Filamentous Fungi: Technology and Products, D. B. Finkelstein et al., Hrsg., Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, USA, 1992, S. 3–39, zusammengefasst.
III. KONSTRUKTION ERFINDUNGSGEMÄSSER WIRTE
Der Prozess des gentechnischen Veränderns der erfindungsgemäßen Wirte wird, gemäß der Erfindung, durch die Isolierung und Teilsequenzierung von reinem Protein, codierend ein interessierendes Enzym, oder durch das Klonieren genetischer Sequenzen, die in der Lage sind, solch ein Protein zu codieren mit Polymerasekettenreaktions-Technologien; und durch die Expression solcher genetischer Sequenzen, ermöglicht. Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "genetische Sequenzen" dafür vorgesehen, sich auf ein Nucleinsäuremolekül (vorzugsweise DNA) zu beziehen. Genetische Sequenzen, die in der Lage sind, ein Protein zu codieren, stammen aus einer Vielfalt von Quellen. Diese Quellen schließen genomische DNA, cDNA, synthe tische DNA und Kombinationen davon ein. Die bevorzugte Quelle genomischer DNA ist eine genomische Pilz-DNA-Bank. Die bevorzugte Quelle der cDNA ist eine cDNA-Bank, hergestellt aus Pilz-mRNA, kultiviert unter Bedingungen, die dafür bekannt sind, die Expression der gewünschten mRNA oder des gewünschten Proteins zu induzieren.
Die genomische DNA kann natürlich vorkommende Introns einschließen oder nicht. Außerdem kann solch genomische DNA in Assoziation mit der 5'-Promotorregion der Gen-Sequenzen und/oder mit der 3'-Transkriptionsterminationsregion erhalten werden. Ferner kann eine solche genomische DNA in Assoziation mit den genetischen Sequenzen, welche die 5'-nicht-translatierte Region der mRNA codieren, und/oder mit den genetischen Sequenzen, welche die 3'-nicht-translatierte Region codieren, erhalten werden. In dem Ausmaß, in dem eine Wirtszelle die transkriptionalen und/oder translationalen regulatorischen Signale, assoziiert mit der Expression der mRNA und des Proteins, erkennen kann, können dann die 5'- und/oder 3'-nicht-transkribierten Regionen des nativen Gens und/oder die 5'- und/oder 3'-nicht-translatierten Regionen der mRNA behalten werden und für transkriptionale und translationale Regulation eingesetzt werden. Genomische DNA kann aus einer beliebigen Wirtszelle, insbesondere einer Pilzwirtszelle, die das gewünschte Protein natürlich exprimiert, durch im Fachgebiet gut bekannte Mittel extrahiert und gereinigt werden.
Zum Klonieren in einen Vektor werden solche geeigneten DNA-Präparationen (entweder genomische DNA oder cDNA) zufällig geschert bzw. enzymatisch gespalten und in geeignete Vektoren ligiert, um eine rekombinante (entweder genomische oder cDNA-) Genbibliothek zu bilden.
Eine ein gewünschtes Protein codierende DNA-Sequenz kann in einen DNA-Vektor gemäß konventioneller Techniken, einschließlich glatt-endender oder versetzt-endender Termini für eine Ligation, Restriktionsenzymverdau, um geeignete Termini bereitzustellen, Auffüllen kohäsiver Enden, wie erforderlich, alkalische Phosphatase-Behandlung, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden, und Ligation mit geeigneten Ligasen, eingefügt werden. Techniken für solche Manipulationen sind von Maniatis, T. (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, zweite Auflage, 1988), offenbart und im Fachgebiet gut bekannt.
Bibliotheken, die für die gewünschten Gene codierende Sequenzen enthalten, können durchmustert werden, und die gewünschte Gen-Sequenz kann durch ein beliebiges Mittel, welches spezifisch auf eine ein solches Gen oder Protein codierende Sequenz selektiert, identifiziert werden, wie z.B. a) durch Hybridisierung mit einer geeigneten Nucleinsäuresonde/geeigneten Nucleinsäuresonden, enthaltend eine für die DNA dieses Proteins spezifische Sequenz, oder b) durch Hybridisierungs-selektierte translationale Analyse, bei der native mRNA, die an den betreffenden Klon hybridisiert, in vitro-translatiert wird und die Translationsprodukte weiter charakterisiert werden, oder, c) falls die klonierten Gen-Sequenzen selbst in der Lage sind, mRNA zu exprimieren, durch Immunopräzipitation eines translatierten Proteinprodukts, hergestellt von dem Wirt, der den Klon enthält.
Für ein gewisses Protein spezifische Oligonucleotid-Sonden, welche verwendet werden können, um Klone zu diesem Protein zu identifizieren, können, ausgehend von der Kenntnis der Aminosäure-Sequenz des Proteins oder von der Kenntnis der Nucleinsäure-Sequenz der DNA, die ein solches oder ein verwandtes Protein codiert, entworfen werden. Alternativ können Antikörper gegen gereinigte Formen des Proteins erzeugt und verwendet werden, um die Anwesenheit einzigartiger Proteindeterminanten in Transformanten, die das gewünschte klonierte Protein exprimieren, zu identifizieren. Die Sequenz von Aminosäureresten in einem Peptid ist hierin entweder durch die Verwendung ihrer allgemein eingesetzten Drei-Buchstaben-Bezeichnungen oder durch ihre Einzel-Buchstaben-Bezeichnungen bezeichnet. Eine Auflistung dieser Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen kann in Lehrbüchern, wie z.B. Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY (1970), gefunden werden. Wenn die Aminosäure-Sequenz horizontal aufgelistet ist, ist beabsichtigt, wenn nichts anderes angegeben ist, dass der Aminoterminus an dem linken Ende ist, und es ist beabsichtigt, dass der Carboxyterminus am rechten Ende ist. Ähnlich ist, wenn nichts anderes angegeben ist oder aus dem Zusammenhang ersichtlich ist, eine Nucleinsäure-Sequenz mit dem 5'-Ende auf der linken Seite angegeben.
Weil der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Kodon verwendet werden, um eine spezielle Aminosäure zu codieren (Watson, J. D., in: Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356–357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um Aminosäure-Sequenzen zu identifizieren, die von Oligonucleotiden codiert sein können, die den niedrigsten Grad an Degeneriertheit aufweisen. Dies wird vorzugsweise durch Identifizieren von Sequenzen, die Aminosäuren enthalten, die nur von einem einzelnen Kodon codiert werden, bewerkstelligt.
Obwohl gelegentlich eine Aminosäure-Sequenz nur von einer einzelnen Oligonucleotid-Sequenz codiert sein kann, kann die Aminosäure-Sequenz häufig von einem beliebigen eines Sets ähnlicher Oligonucleotide codiert sein. Wichtigerweise enthält, während alle Mitglieder dieses Sets Oligonucleotid-Sequenzen enthalten, die fähig sind, das gleiche Peptidfragment zu codieren, und folglich potentiell die gleiche Oligonucleotid-Sequenz enthalten wie das Gen, welches das Peptidfragment codiert, nur ein Mitglied des Sets die Nucleotid-Sequenz, die mit der Exon-codierenden Sequenz des Gens identisch ist. Weil dieses Mitglied innerhalb des Sets vorliegt und in der Lage ist, an DNA selbst in Anwesenheit der anderen Mitglieder des Sets zu hybridisieren, ist es möglich, das unfraktionierte Set an Oligonucleotiden auf dieselbe Weise einzusetzen, auf welche man ein einzelnes Oligonucleotid einsetzen würde, um das das Peptid codierende Gen zu klonieren.
Unter Verwendung des genetischen Codes können ein oder mehrere verschiedene Oligonucleotide, ausgehend von der Aminosäure-Sequenz, identifiziert werden, von denen jedes in der Lage wäre, das gewünschte Protein zu codieren. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein spezielles Oligonucleotid tatsächlich die eigentliche Protein-codierende Sequenz darstellen wird, kann durch Erwägen abnormaler Basenpaarungsbeziehungen und der Häufigkeit, mit welcher ein spezielles Kodon tatsächlich in eukaryotischen Zellen verwendet wird (um eine spezielle Aminosäure zu codieren), abgeschätzt werden. Unter Verwendung von "Kodon-Verwendungsregeln" wird eine einzelne Oligonucleotid-Sequenz oder ein Satz von Oligonucleotid-Sequenzen, die eine theoretische "wahrscheinlichste" Nucleotid-Sequenz beinhalten, fähig des Codierens der Protein-Sequenzen, identifiziert.
Das geeignete Oligonucleotid oder der Satz an Oligonucleotiden, das/der in der Lage ist, ein Fragment eines bestimmten Gens zu codieren (oder welches/welcher komplementär zu solch einem Oligonucleotid oder Satz an Oligonucleotiden ist), kann durch im Fachgebiet gut bekannte Mittel synthetisiert werden (siehe beispielsweise Synthesis and Application of DNA and RNA, S. A. Narang, Hrsg., 1987, Academic Press, San Diego, CA) und als eine Sonde eingesetzt werden, um einen Klon für so ein Gen durch im Fachgebiet bekannte Techniken zu identifizieren und zu isolieren. Techniken der Nucleinsäure-Hybridisierung und Klonidentifizierung sind von Maniatis T., et al. in: Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Habor, NY (1982)), und von Hames, B. D., et al. in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)), offenbart. Jene Mitglieder der oben beschriebenen Genbibliothek, von denen gefunden worden ist, dass sie zu solcher Hybridisierung fähig sind, werden dann analysiert, um das Ausmaß und die Art von codierenden Sequenzen, welche sie enthalten, zu bestimmen.
Um die Detektion einer gewünschten DNA-codierenden Sequenz zu ermöglichen, wird die oben beschriebene DNA-Sonde mit einer detektierbaren Gruppe markiert. So eine detektierbare Gruppe kann irgendein Material sein, das eine detektierbare physikalische oder chemische Eigenschaft aufweist. Solche Materialien sind im Gebiet von Nucleinsäure-Hybridisierung gut entwickelt worden, und im Allgemeinen kann so gut wie jede in solchen Verfahren verwendbare Markierung für die vorliegende Erfindung angewendet werden. Insbesondere nützlich sind radioaktive Markierungen, wie z.B. ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I oder dergleichen. Es kann eine beliebige radioaktive Markierung eingesetzt werden, die für ein angemessenes Signal sorgt und eine ausreichende Halbwertszeit aufweist. Wenn es einzelsträngig ist, kann das Oligonucleotid unter Verwendung von Kinasereaktionen radioaktiv markiert werden. Alternativ sind Polynucleotide als Nucleinsäure-Hybridisierungs-Sonden verwendbar, wenn sie mit einem nicht-radioaktiven Marker, wie z.B. Biotin, einem Enzym oder einer fluoreszierenden Gruppe, markiert sind.
Zusammengefasst erlaubt folglich die Aufklärung einer Protein-Teilsequenz die Identifikation einer theoretischen "wahrscheinlichsten" DNA-Sequenz oder eines Satzes solcher Sequenzen, fähig zum Codieren eines solchen Peptids. Durch Konstruieren eines Oligonucleotids, komplementär zu dieser theoretischen Sequenz (oder durch Konstruieren eines Satzes von Oli gonucleotiden, komplementär zu diesem Satz an "wahrscheinlichsten" Oligonucleotiden) erhält man ein DNA-Molekül (oder einen Satz von DNA-Molekülen), fähig zum Funktionieren als eine Sonde/Sonden für die Identifizierung und Isolierung von Klonen, die ein Gen enthalten.
In einem alternativen Weg, ein Gen zu klonieren, wird eine Bibliothek unter Verwendung eines Expressionsvektors, durch Klonieren von DNA oder bevorzugter cDNA, hergestellt aus einer Zelle, die in der Lage ist, das Protein zu exprimieren, in einen Expressionsvektor, hergestellt. Die Bibliothek wird dann auf Mitglieder, welche das gewünschte Protein exprimieren, beispielsweise durch Durchmustern der Bibliothek mit Antikörpern gegen das Protein, durchgemustert.
Die oben diskutierten Verfahren sind folglich dazu in der Lage, genetische Sequenzen, die fähig sind, ein Protein oder biologisch aktive oder antigene Fragmente dieses Proteins zu codieren, zu identifizieren. Um solche genetischen Sequenzen weiter zu charakterisieren und um das rekombinante Protein herzustellen, ist es wünschenswert, die Proteine, welche diese Sequenzen codieren, zu exprimieren. Eine solche Expression identifiziert jene Klone, welche Proteine exprimieren, die Charakteristika des gewünschten Proteins besitzen. Solche Charakteristika können die Fähigkeit, Antikörper spezifisch zu binden, die Fähigkeit, die Produktion von Antikörpern auszulösen, welche in der Lage sind, das native nicht-rekombinante Protein zu binden, die Fähigkeit einer Zelle, eine enzymatische Aktivität bereitzustellen, die eine Eigenschaft des Proteins ist, und die Fähigkeit einer Empfängerzelle, eine nicht-enzymatische (aber spezifische) Funktion bereitzustellen, unter anderen, einschließen.
Eine DNA-Sequenz kann durch im Fachgebiet bekannte Mittel verkürzt werden, um ein gewünschtes Gen aus einer chromosomalen Region zu isolieren, die mehr Information als für die Verwendung dieses Gens in den erfindungsgemäßen Wirten notwendig enthält. Beispielsweise kann Restriktionsverdau eingesetzt werden, um die Volllängen-Sequenz an einer gewünschten Stelle zu spalten. Alternativ oder zusätzlich können Nucleasen, die vom 3'-Ende eines DNA-Moleküls spalten, verwendet werden, um eine bestimmte Sequenz zu einer verkürzten Form zu verdauen, wobei die gewünschte Länge dann durch Gelelektrophorese und DNA-Sequenzieren identifiziert und gereinigt wird. Solche Nucleasen schließen beispielsweise Exonuclease III und Bal31 ein. Andere Nucleasen sind im Fachgebiet gut bekannt.
Wenn die codierende Sequenz und ein funktionell verknüpfter Promotor in eine eukaryotische Empfängerzelle als eine nicht-replizierende DNA (oder RNA), ein nicht-integrierendes Molekül eingeführt werden, kann die Expression des codierten Proteins durch die transiente (nicht-stabile) Expression der eingeführten Sequenz stattfinden.
Vorzugsweise wird die codierende Sequenz an einem DNA (oder RNA)-Molekül, wie z.B. einem kovalent geschlossenen, ringförmigen Molekül, das nicht zur autonomen Replikation fähig ist, oder vorzugsweise einem linearen Molekül, das in das Wirtschromosom integriert, eingeführt. Genetisch stabile Transformanten können mit Vektorsystemen oder Transformationssystemen konstruiert werden, wobei eine gewünschte DNA in das Wirtschromosom integ riert wird. So eine Integration kann innerhalb einer Zelle de novo geschehen oder durch Transformation mit einem Vektor unterstützt werden, der sich selbst funktionell in das Wirtschromosom einfügt, beispielsweise Transposone oder andere DNA-Elemente, die die Integration von DNA-Sequenzen in Chromosomen fördern. Es wird ein Vektor eingesetzt, der fähig ist, die gewünschten Gen-Sequenzen in ein Pilz-Wirtszellchromosom zu integrieren.
Die für Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase, die die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:2 aufweisen, codierende Gene unter der Kontrolle geeigneter Promotoren können in eine Plasmidkonstruktion kombiniert werden und in die Wirtszellen durch Transformation eingeführt werden. Die Art des Plasmidvektors wird von dem Wirtsorganismus abhängen. Bei der praktischen Realisierung der Erfindung ist der filamentöse Pilz Trichoderma reesei als ein Modell verwendet worden. Folglich sind für T. reesei Vektoren, die DNA inkorporieren, die für die Integration der Sequenzen, codierend die Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Gene, in das Wirtschromosom sorgt, bevorzugt. Solch ein Targeting zu beispielsweise dem cbh1-Locus, kann durch Bereitstellen cbh1-codierender oder -flankierender Sequenzen auf dem rekombinanten Konstrukt in einer Menge, die ausreichend ist, um die Integration an diesen Locus in einer relevanten Häufigkeit zu leiten, erreicht werden.
Zellen, die die eingefügte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, werden selektiert, indem außerdem ein oder mehrere Marker eingeführt werden, die die Selektion von Wirtszellen, welche den Expressionsvektor in dem Chromosom enthalten, erlauben, beispielsweise kann der Marker Biozid-Resistenz, z.B. Resistenz gegen Antibiotika oder Schwermetalle, wie z.B. Kupfer oder dergleichen, bereitstellen. Das selektierbare Marker-Gen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gen-Sequenzen verknüpft sein oder in dieselbe Zelle durch Co-Transfektion eingeführt werden. Ein genetischer Marker, speziell für die Transformation der erfindungsgemäßen Wirte, ist amdS, der Acetamidase codiert und folglich Trichoderma ermöglicht, auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle zu wachsen.
Um ein gewünschtes Protein zu exprimieren, sind transkriptionale und translationale Signale, die von einem geeigneten Wirt erkennbar sind, notwendig. Die klonierten codierenden Sequenzen, erhalten durch die oben beschriebenen Verfahren, und vorzugsweise in einer Doppelstrangform, können funktionell mit Sequenzen verknüpft werden, die transkriptionale Expression in einem Expressionsvektor kontrollieren, und in eine Wirtszelle eingeführt werden, um rekombinantes Protein herzustellen. Abhängig davon, welcher Strang der codierenden Sequenz funktionell mit den Sequenzen verknüpft ist, die transkriptionale Expression kontrollieren, ist es außerdem möglich, Antisense-RNA zu exprimieren.
Die Expression des Proteins in unterschiedlichen Wirten kann in unterschiedlichen posttranslationalen Modifikationen resultieren, die die Eigenschaften des Proteins verändern können.
Man sagt, ein Nucleinsäuremolekül, wie z.B. DNA, ist "fähig zum Exprimieren" eines Polypeptids bzw. "dazu in der Lage", falls es Expressionskontroll-Sequenzen enthält, die Transkriptionsregulationsinformation enthalten, und solche Sequenzen "funktionell verknüpft" mit der das Polypeptid codierenden Nucleotid-Sequenz sind.
Eine funktionelle Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der eine Sequenz mit einer regulatorischen Sequenz (oder Sequenzen) so verbunden ist/sind, dass Expression der Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der regulatorischen Sequenz gestellt wird. Man sagt, dass zwei DNA-Sequenzen (wie z.B. eine codierende Sequenz und eine Promotorregion-Sequenz, verknüpft mit dem 5'-Ende der codierenden Sequenz) funktionell verknüpft sind, wenn die Induktion von Promotorfunktion in der Transkription von mRNA, codierend das gewünschte Protein, resultiert, und wenn die Art der Verknüpfung zwischen den beiden DNA-Sequenzen nicht (1) in der Einführung einer Rasterverschiebungsmutation resultiert, (2) nicht mit dem Vermögen der Expressions-regulatorischen Sequenzen interferiert, die Expression des Proteins zu leiten, Antisense-RNA, oder (3) mit der Fähigkeit der DNA-Matrize, transkribiert zu werden, interferiert. Folglich wäre eine Promotorregion funktionell mit einer DNA-Sequenz verknüpft, wenn der Promotor in der Lage wäre, Transkription dieser DNA-Sequenz zu bewirken.
Die genaue Natur der für Genexpression benötigten regulatorischen Regionen kann zwischen Arten oder Zelltypen variieren, soll im Allgemeinen aber, wie notwendig, 5'-nicht-transkribierende und 5'-nicht-translatierende (nicht-codierende) Sequenzen, verbunden mit Initiation der Transkription bzw. Translation, wie z.B. der TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und dergleichen, einschließen. Insbesondere werden solche 5'-nicht-transkribierenden Kontroll-Sequenzen eine Region einschließen, die einen Promotor zur transkriptionalen Kontrolle des funktionell verknüpften Gens enthält. Solche transkriptionalen Kontrollsequenzen können außerdem Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts liegende Aktivator-Sequenzen ("upstream activator sequences"), wie gewünscht, einschließen.
Expression eines Proteins in eukaryotischen Wirten, wie z.B. einem Pilz, erfordert die Verwendung regulatorischer Regionen, die in solchen Wirten funktional sind, und vorzugsweise regulatorische Systeme aus Pilzen. Eine breite Vielfalt transkriptionaler und translationaler regulatorischer Sequenzen kann, abhängig von der Art des Wirts, eingesetzt werden. Vorzugsweise sind diese regulatorischen Signale in ihrem nativen Zustand mit einem bestimmten Gen assoziiert, das zu einem hohen Level an Expression in der Wirtszelle in der Lage ist.
In Eukaryoten, wo die Transkription nicht in direktem Zusammenhang mit der Translation steht, können solche Kontrollregionen ein Methionin (AUG)-Startkodon bereitstellen oder nicht, abhängig davon, ob die klonierte Sequenz so ein Methionin enthält. Solche Regionen werden im Allgemeinen eine Promotorregion, ausreichend, um die Initiation der RNA-Synthese in der Wirtszelle zu leiten, einschließen. Promotoren von Genen filamentöser Pilze, welche ein mRNA-Produkt, das zur Translation fähig ist, codieren, sind bevorzugt, und insbesondere können starke Promotoren eingesetzt werden, vorausgesetzt sie funktionieren in der Wirtszelle auch als Promotoren. Bevorzugte starke eukaryotische Promotoren zur Verwendung in Trichoderma schließen den T. reesei-cbh1-Gen-Promotor ein, oder ein Promotor eines anderen Cellulase- Gens, wie z.B. der für das cbh2-, egl1- oder egl2-Gen, kann verwendet werden. Zusätzlich zur Verwendung regulatorischer Trichoderma-Elemente kann die Expression von Proteinen unter die Kontrolle regulatorischer Elemente von Aspergillus nidulans (beispielsweise den argB-Gen-Promotor und den amdS-Gen-Promotor), Aspergillus niger (beispielsweise den Phytase-Promotor oder den Glykoamylase-Gen-Promotor) gestellt werden. Jedoch kann die Expression unter regulatorischen Nicht-Trichoderma-Elementen wie diesen sehr niedrig sein, wenn verglichen zur Verwendung von Trichoderma-Elementen, und insbesondere Genen von T. reesei.
Wie weitgehend bekannt ist, wird die Translation eukaryotischer mRNA an dem Kodon initiiert, welches das erste Methionin codiert. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, die für das gewünschte Protein codiert, nicht irgendwelche intervenierenden Kodons enthält, die in der Lage sind, ein Methionin zu codieren. Das Vorhandensein solcher Kodons resultiert entweder in einer Bildung eines Fusionsproteins (falls das AUG-Kodon im selben Leserahmen wie die Protein-codierende DNA-Sequenz ist) oder einer Rasterverschiebungsmutation (wenn das AUG-Kodon nicht im selben Leserahmen wie die Protein-codierende Sequenz ist).
Es kann erwünscht sein, ein Fusionsprodukt zu konstruieren, das eine partielle codierende Sequenz (gewöhnlich am Amino-terminalen Ende) eines Proteins und eine zweite codierende Sequenz (partiell oder komplett) eines Phytase-abbauenden Enzyms der Erfindung enthält. Die Sequenz, die das Phytase-abbauende Enzym nicht codiert, kann als Signal-Sequenz zur Sekretion des Proteins aus der Wirtszelle wirken oder nicht. Beispielsweise kann die für das gewünschte Protein codierende Sequenz mit einer Signal-Sequenz verknüpft sein, die die Sekretion des Proteins aus, oder die Compartimentalisierung des Proteins in einem einen speziellen Wirt erlauben wird. Solche Fusionsprotein-Sequenzen können mit oder ohne spezifische Proteasestellen entworfen werden, so dass eine gewünschte Peptid-Sequenz nachfolgendem Entfernen zugänglich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die native Signal-Sequenz eines Pilzproteins, oder ein funktionales Derivat dieser Sequenz, das die Fähigkeit behält, die Sekretion des Peptids, das funktionell damit verknüpft ist, zu leiten, verwendet. Aspergillus-Leader/Sekretionssignal-Elemente funktionieren auch in Trichoderma.
Es können regulatorische Transkriptionsinitiationssignale ausgewählt werden, die Repression oder Aktivierung erlauben, so dass die Expression der funktionell verknüpften Gene moduliert werden kann. Beispielsweise können regulatorische Signale temperatursensitiv sein, so dass durch Variieren der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder chemischer Regulation unterliegen, z.B. Metabolit. Translationssignale sind nicht notwendig, wenn es gewünscht ist, Antisense-RNA-Sequenzen zu exprimieren.
Wenn erwünscht, können die nicht-transkribierten und/oder nicht-translatierten Regionen 3' von der Sequenz, codierend ein gewünschtes Protein, durch die oben beschriebenen Klonierungsverfahren erhalten werden. Die 3'-nicht-transkribierte Region kann für ihre regulatorischen Transkriptionsterminations-Sequenzelemente, oder für jene Elemente, welche Polyadeny lierung in eukaryotischen Zellen leiten, beibehalten werden. Wo die nativen Expressionskontroll-Sequenzsignale nicht zufriedenstellend in einer Wirtszelle funktionieren, können dann in der Wirtszelle funktionale Sequenzen substituiert werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können ferner andere funktionell verknüpfte regulatorische Elemente umfassen, wie z.B. DNA-Elemente, welche Antibiotika-Resistenz verleihen, oder Replikationsursprünge zum Aufrechterhalten des Vektors in einer oder mehreren Wirtszelle(n).
In einer anderen Ausführungsform, insbesondere zum Aufrechterhalten der erfindungsgemäßen Vektoren in prokaryotischen Zellen oder in Zellen der Hefe S. cerevisiae, wird die eingeführte Sequenz in ein Plasmid oder in einen viralen Vektor inkorporiert, der zur autonomen Replikation in dem Empfängerwirt fähig ist. Ein beliebiger einer großen Vielfalt von Vektoren kann für diesen Zweck eingesetzt werden. In Bacillus-Wirten kann die Integration der gewünschten DNA notwendig sein.
Beim Auswählen eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors schließen wichtige Faktoren ein: die Leichtigkeit, mit welcher Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von jenen Empfängerzellen selektiert werden können, welche den Vektor nicht enthalten; die Anzahl von Kopien des Vektors, welche in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es wünschenswert ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten hin- und herzubewegen ("to shuttle").
Bevorzugte S. cerevisiae-Hefeplasmide schließen jene, enthaltend den "2-Micron circle", etc., oder deren Derivate, ein. Solche Plasmide sind im Fachgebiet gut bekannt (Botstein, D., et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274 (1982); Broach, J. R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, S. 445–470 (1981); Broach, J. R., Cell 28: 203–204 (1982); Bollon, D. P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48 (1980); Maniatis, T., in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3, Gene Expression, Academic Press, NY, S. 563–608 (1980)) und sind kommerziell erhältlich.
Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, enthaltend das Konstrukt/die Konstrukte, für die Expression vorbereitet ist, wird/werden das DNA-Konstrukt/die DNA-Konstrukte in eine geeignete Wirtszelle durch ein beliebiges einer Vielfalt geeigneter Mittel, einschließlich Transformation, eingeführt. Nach dem Einführen des Vektors werden Empfängerzellen in einem selektiven Medium kultiviert, welches auf das Wachstum Vektor-enthaltender Zellen selektiert. Expression der klonierten Gen-Sequenzen) resultiert in der Produktion des gewünschten Proteins oder in der Produktion eines Fragments dieses Proteins. Diese Expression kann auf kontinuierliche Weise in den transformierten Zellen stattfinden oder auf eine kontrollierte Weise, beispielsweise durch Induktion der Expression.
Pilztransformation wird auch gemäß der im Fachgebiet bekannten Techniken durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung z.B. von homologer Rekombination, um ein Gen stabil in den Pilzwirt einzufügen und/oder das Vermögen der Wirtszelle zu zerstören, ein bestimmtes Protein zu exprimieren.
IV. HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN
In der folgenden Beschreibung wird auf verschiedene Methodologien verwiesen werden, die dem Fachmann im Gebiet der Immunologie gut bekannt sind. Standard-Referenzarbeiten, die die allgemeinen Prinzipien der Immunologie darlegen, schließen die Arbeit von Catty, D. (Antibodies, A Practical Approach, Bd. 1, IRL Press, Washington, DC (1988)); Klein, J. (Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1992)); Kennett, R., et al., in Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980)); Campbell, A. ("Monoclonal Antibody Technology", in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 13 (Burdon, R., et al., Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1984)); und Eisen, H. N., in Microbiology, 3. Aufl. (Davis, B. D., et al., Harper & Row, Philadelphia (1980)) ein.
Man sagt, dass ein Antikörper "fähig zum Binden" eines Moleküls ist, wenn er fähig ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Ausdruck "Epitop" soll sich auf diesen Anteil eines Haptens beziehen, welcher von einem Antikörper erkannt und gebunden werden kann. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Ein "Antigen" ist fähig, ein Tier zu veranlassen, Antikörper, fähig zum Binden an ein Epitop dieses Antigens, herzustellen. Die spezifische Reaktion, auf die oben verwiesen wurde, soll anzeigen, dass das Antigen in einer hochselektiven Weise mit seinem korrespondierenden Antikörper reagieren wird und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die von anderen Antigenen hervorgerufen werden können.
Der Ausdruck "Antikörper" (Ab, "antibody") oder "monoklonaler Antikörper" (Mab, "monoclonal antibody"), wie hierin verwendet, soll intakte Moleküle sowie Fragmente davon (wie z.B. Fab- und F(ab')₂-Fragmente), die für die Bindung an Antigen verwendet werden können, bezeichnen. Fab und F(ab')₂-Fragmente haben kein FC-Fragment von intaktem Antikörper, verschwinden rascher aus dem Blutkreislauf und können weniger nicht-spezifische Gewebebindung von einem intakten Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325 (1983)).
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden durch ein beliebiges einer Vielfalt von Verfahren hergestellt. Vorzugsweise wird gereinigtes Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein oder ein Fragment davon (mit endoF oder dessen Äquivalent, um Zuckeranteile zu entfernen, behandelt oder nicht) einem Tier verabreicht, um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyklonale Antikörper enthalten, die fähig sind, solche Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase zu binden.
Zellen, die Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein oder ein Fragment davon exprimieren, oder eine Mischung von Proteinen, enthaltend Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase oder solche Fragmente, können einem Tier auch verabreicht werden, um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyklonale Antikörper enthalten, von denen einige fähig sein werden, Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein zu binden. Wenn gewünscht, kann ein solcher Phytase- oder pH 2,5-saurer Phosphatase-Antikörper von den anderen polyklonalen Antikörpern durch Standard-Proteinreinigungstechniken, und insbesondere durch Affinitätschromatographie mit gereinigter Phytase oder pH 2,5-saurer Phosphatase oder Fragmenten davon, gereinigt werden.
Ein Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Proteinfragment kann auch chemisch synthetisiert werden und durch HPLC gereinigt werden, um es im Wesentlichen frei von Kontaminanten zu machen. So eine Präparation wird dann in ein Tier eingeführt, um polyklonale Antiseren hoher spezifischer Aktivität zu produzieren.
Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridoma-Technologie hergestellt werden (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., S. 563–681 (1981)). Im Allgemeinen schließen solche Prozeduren das Immunisieren eines Tiers mit Phytase- oder pH 2,5-saurer Phosphatase-Protein-Antigen ein. Die Splenocyten solcher Tiere werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomzelllinie fusioniert. Eine beliebige geeignete Myelomzelllinie kann gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden; jedoch ist es bevorzugt, die Eltern-Myelomzelllinie (SP₂O), erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, einzusetzen. Nach der Fusion werden die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium aufrecht erhalten und dann durch limitierende Verdünnung ("limiting dilution"), wie von Wands, J. R., et al., Gastroenterology 80: 225–232 (1981), beschrieben, kloniert.
Die durch eine Selektion erhaltenen Hybridomzelllinien werden dann analysiert, um Klone zu identifizieren, welche Antikörper sezernieren, die fähig sind, das Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein-Antigen zu binden.
Durch Anwendung der oben beschriebenen Verfahren können zusätzliche Zelllinien, fähig zum Produzieren von Antikörpern, welche Epitope des Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Proteins erkennen, erhalten werden.
Antikörper gegen sowohl hochkonservierte als auch schlecht konservierte Regionen des Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Proteins sind für Studien der Kontrolle der Biosynthese und des Katabolismus von Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein und für Studien, wobei es notwendig ist, die Anwesenheit und/oder des Protein-Antigens in einer Zusammensetzung zu identifizieren oder quantifizieren, verwendbar.
V. HERSTELLUNG VON PHYTASE UND SAURER PHOSPHATASE
Die besten Phytase-Produktionslevel werden erhalten, wenn Trichoderma mit linearer DNA unter Verwendung des cbh1-Promotors transformiert werden (etwa 3800 PNU/ml, siehe Tabelle 8). Etwa 3500 und 3600 PNU/ml Kulturmedium wurden mit den besten T. reesei ALKO 2221- und ALKO 233-Transformanten erhalten, die keine E. coli-Sequenzen enthielten. Sowohl die Phytase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz schienen gleich gut zu funktionieren, und dieselben Level an Phytase-Produktion konnten erreicht werden, wenn T. reesei ALKO 2221 oder ATCC 56765 als ein Wirtsstamm verwendet wurden. In T. reesei ALKO 233 war der Level von produzierter Phytase-Aktivität höher, wenn die Phytase-Signal-Sequenz verwendet wurde.
Phytase wird von den erfindungsgemäßen Trichoderma reesei-Wirten in den Überstand des Kulturmediums exprimiert. Die Menge von Phytase im Kulturmedium ist im Allgemeinen höher als irgendeine bisher beschriebene Menge eines heterologen Proteins, das in Trichoderma exprimiert wurde.
Das Spektrum von Enzymen, die Phytase in den erfindungsgemäßen Trichoderma reesei-Stämmen begleiten, ist höchst unterschiedlich und vorteilhaft gegenüber dem von ähnlichen Präparationen von Aspergillus-Kulturüberständen. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trichoderma reesei-Wirte sind sowohl Endoglucanase- als auch Cellobiohydrolase-Aktivitäten im Allgemeinen wesentlich höher. Das Glykosylierungsmuster der Phytase ist außerdem unterschiedlich, wenn sie von Trichoderma reesei exprimiert wird, was in einem Phytaseprotein resultiert, das bei Western-Analyse als multiple Banden migriert.
Die beste Produktion von pH 2,5-saurer Phosphatase von den erfindungsgemäßen Trichoderma reesei-Transformanten resultiert in 240 APNU/ml-Kulturmedium, in Schüttelkolbenkultivierung und in Lactose-basierendem Medium. Wie mit der Phytase, funktionierten sowohl die saure Phosphatase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz gleichermaßen gut.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die Phytase enthalten, können direkt für das Entfernen von Phytinsäure oder Inosithexaphosphorsäure, aus Rohmaterial, insbesondere Phytin-enthaltendem Rohmaterial, und insbesondere Pflanzenmaterial, verwendet werden. Phytase entfernt die Phosphatgruppen von Phytinsäure und zerstört deren Fähigkeit, mit Mineralabsorption zu interferieren. Wenn als ein Tierfutteradditiv verwendet, setzen die erfindungsgemäßen Phytasezusammensetzungen an Phytin in Korn-gebundenes Phosphat frei und reduzieren folglich das Bedürfnis nach Dosen zusätzlichen Phosphats in Futterformulierungen dramatisch und vermindern Umweltbelastungen.
Die gemäß der Erfindung hergestellte Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase können durch im Fachgebiet bekannte Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden.
Nachdem die Erfindung nun im Allgemeinen beschrieben wurde, wird dieselbe durch Bezugnahme auf gewisse spezifische Beispiele besser verstanden werden, die hierin für Illustrationszwecke eingeschlossen sind.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Assay-Verfahren zur Bestimmung von Phytase-Aktivität
Prinzip Phytase wirkt auf Phytat (Inositolhexaphosphat), um anorganisches Phosphat freizusetzen. Die Bestimmung von freigesetztem anorganischen Phosphat basiert auf der Farbe, die durch die Reduktion eines Phosphormolybdat-Komplexes gebildet wird.
Aktivitätseinheit Eine Phytase-Einheit (PU, "phytase unit") ist die Menge an Enzym, die unter Standardbedingungen 1 nmol von anorganischem Phosphat in einer Minute aus Natriumphytat freisetzt. Assay-Bedingungen

Substrat Natriumphytat

pH 5,0

Inkubationstemperatur 37°C ± 0,5°C

Inkubationszeit 15 Minuten

Ausrüstung

Wasserbad 37°C

Wasserbad 50°C

Spektralphotometer

Teströhrchenmischer (Vortex)

Phosphat-freies Glasgeschirr
Reagentien Alle Lösungen werden in entionisiertem Wasser, Milli-Q oder einem Äquivalent hergestellt.

1. Citratpuffer (0,2 M, pH 5,0). 0,2 M Lösungen von sowohl Natriumcitrat (C₆H₈O₇Na·2H₂O, 58,8 g/l, Merck 6448) und Zitronensäure (C₆H₈O₇·H₂O, 42,0 g/l, Merck 244) werden in Wasser erstellt. Der pH der Citratlösung (1 Liter) wird mit 0,2 M Citronensäure (der Verbrauch an Citronensäure sollte etwa 385 ml sein) auf 5,0 eingestellt.
2. Substrat. 1,00 g Natriumphytat (Sigma P-3168) wird in etwa 70 ml Citratpuffer gelöst. Der pH wird mit 0,2 M Citronensäure auf 5,0 eingestellt, und das Volumen wird mit Citratpuffer auf 100 ml eingestellt. Täglich muss frische Substratlösung hergestellt werden.
3. 15% (Gew./Vol.) TCA-Lösung. Herstellung aus Trichloressigsäure (Merck 807).
4. 10% (Gew./Vol.) Ascorbinsäurelösung. Herstellung aus Ascorbinsäure (Merck 127). Lagerung unter Kühlung. Die Lösung ist sieben Tage lang stabil.
5. 2,5% (Gew./Vol.) Ammoniummolybdatlösung. 2,5 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, Merck 1182) werden in Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.
6. 1 M Schwefelsäure. 55,6 ml konzentrierte H₂SO₄ (Merck 731) werden zu etwa 800 ml Wasser, unter Rühren, gegeben. Es wird abkühlen gelassen, und es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
7. Reagens C. 3 Volumen 1 M Schwefelsäure werden mit 1 Volumen 2,5% Ammoniummolybdat vermischt, dann wird 1 Volumen 10% Ascorbinsäure zugegeben, und es wird gut gemischt. Täglich muss frisches Reagens C hergestellt werden.

Probenverdünnung Proben werden in Citratpuffer verdünnt. Von jeder Probe werden zweifache Verdünnungen angefertigt. Im Fall von Enzympulver werden etwa 250 mg Probe akkurat gewogen, in dem Puffer gelöst und in einem Messkolben auf 25 ml aufgefüllt. Wenn notwendig, wird weiter verdünnt.
Assay
Hydrolyse 1,0 ml Probenverdünnung, enthaltend 20–190 PU, werden in zwei Teströhrchen pipettiert. 2,0 ml 15%ige TCA werden zu einem der Röhrchen (Blindprobe, "blank") zugegeben und gemischt. Die Röhrchen ohne TCA werden in ein Wasserbad bei 37°C gesetzt und 5 Minuten äquilibrieren gelassen. Unter Verwendung einer Stoppuhr wird die Hydrolyse durch sequentielles Zugeben in geeigneten Intervallen von 1,0 ml Substrat (etwa 10 Minuten lang bei 37°C äquilibriert) zu jedem Röhrchen und Mischen gestartet. Nach exakt 15-minütiger Inkubation wird die Reaktion durch Zugeben von 2,0 ml TCA zu jedem Röhrchen gestoppt. Es wird gemischt und auf Raumtemperatur abgekühlt. 1,0 ml Substrat werden auch zu den Blindprobenröhrchen (bei Raumtemperatur gehalten) gegeben, und es wird gemischt. Falls ein Präzipitat auftritt, muss es durch 10-minütige Zentrifugation bei 2000 g abgetrennt werden.
Freigesetztes Orthophosphat 0,4 ml jeder Probe nach Hydrolyse werden in Teströhrchen pipettiert. 3,6 ml Wasser werden zu jedem Röhrchen gegeben. 4,0 ml Reagens C werden zugegeben, und es wird gemischt. Es wird 20 Minuten lang bei 50°C inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Extinktion gegenüber der Reagens-Blindprobe (siehe unten) wird bei 820 nm gemessen.
Standard Eine 9,0 mM Phosphat-Stammlösung wird hergestellt. 612,4 mg KH₂PO₄ (Merck 4873, getrocknet im Exsikkator mit Siliciumdioxid) werden gelöst und mit Wasser in einem volumenfrischen Kolben auf 500 ml verdünnt. Die folgenden Verdünnungen der Stammlösung in Wasser werden hergestellt, und diese werden als Standards verwendet.
4,0 ml jeder Verdünnung werden in zwei Teströhrchen pipettiert. Außerdem werden 4,0 ml Wasser in ein Teströhrchen pipettiert (Reagens-Blindprobe). 4,0 ml Reagens C werden zugegeben, und es wird gemischt. Es wird 20 Minuten lang bei 50°C inkubiert, und es wird auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Absorptionswerte werden bei 820 nm gegen die von der Reagens-Blindprobe gemessen. Eine Standardkurve wird durch Blotting der Absorptionswerte gegen Phytase-Aktivität (PU/ml) erstellt. Eine neue Standardlinie muss bei jeder Serie von Assays konstruiert werden.
Berechnung Der Blindproben-Absorptionswert wird vom Probenabsorptionswert subtrahiert (der Unterschied sollte 0,100–1,000 sein). Die Phytase-Aktivität (PU/ml) wird von der Standardlinie abgelesen und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Um die Aktivität (PU/g) von Enzympulvern zu berechnen, wird das Ergebnis (PU/ml) ferner mit 25 (ml) multipliziert und durch das exakte Gewicht der Probe (g) geteilt.
Vorbereitung von Futter und anderen unlöslichen Proben für Phytase-Analyse
Etwa 2,5 g gemahlene Probe werden akurat in zwei 50 ml-Bechergläser gewogen. 20,0 ml Citratpuffer werden zugegeben. Es wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Magnetrührers gemischt. Etwa 10 ml von jedem werden in Zentrifugenröhrchen transferiert, und das feste Material wird durch 10-minütige Zentrifugation bei 2004 g abgetrennt. 2,5 ml Überstand werden auf PD 10-Gelfiltrationssäulen (Sephadex G-25M, Pharmacia 17-0851-01) aufgebracht, die mit 25 ml Citratpuffer äquilibriert sind. Das Eluat wird verworfen. Dann werden 3,5 ml Citratpuffer auf die Säule aufgebracht und das Eluat in einem Messzylinder gesammelt. Das Volumen wird mit Citratpuffer auf 5,0 ml aufgefüllt (Verdünnungsfaktor 2), und es wird auf Phytase-Aktivität untersucht. Die Aktivität PU/g wird durch Multiplizieren der gemessenen Aktivität (PU/ml) mit 40 (Verdünnungsfaktor·Volumen Extraktionspuffer) und Teilen durch das exakte Gewicht der Probe (g) erhalten. Referenz: Chen et al., Anal. Chem. 28: 1756–1758 (1956).
BEISPIEL 2
Bestimmung von saurer Phosphatase-Aktivität
Prinzip. Saure Phosphatase wirkt auf p-Nitrophenylphosphat, um anorganisches Phosphat freizusetzen. Die Bestimmung von freigesetztem anorganischen Phosphat basiert auf der durch die Reduktion von Phosphormolybdat-Komplex gebildeten Farbe.
Einheit der Aktivität. Eine saure Phosphatase-Einheit (HFU) ist die Menge an Enzym, die unter Standardbedingungen 1 nmol anorganisches Phosphat aus p-Nitrophenylphosphat in einer Minute freisetzt. Assay-Bedingungen

Substrat p-Nitrophenylphosphat

pH 2,5

Temperatur 37°C ± 0,5°C

Inkubationszeit 15 min

Ausrüstung

Wasserbad 37°C

Wasserbad 50°C

Spektralphotometer

Teströhrchenmischer (Vortex)

Zentrifuge (Hereaus Biofuge 17S, 3090 oder äquivalentes Gerät)

Phosphat-freies Glasgeschirr
Reagentien Alle Lösungen werden in entionisiertem Wasser, Milli-Q oder einem Äquivalent hergestellt.

1. Glycinpuffer (0,2 M, pH 2,5) 15,014 g Glycin (Merck 4201) werden in etwa 800 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit 1 M Salzsäure (Verbrauch sollte etwa 80 ml sein) auf 2,5 eingestellt, und es wird mit Wasser auf 1000 ml verdünnt.
2. Substrat (30 mM) 1,114 g p-Nitrophenylphosphat (Boehringer, 738 352) werden in Glycinpuffer gelöst und das Volumen mit dem Puffer auf 100 ml eingestellt. Täglich muss frische Substratlösung hergestellt werden.
3. 15% (Gew./Vol.) TCA-Lösung Herstellung aus Trichloressigsäure (Merck 807).
4. 10% (Gew./Vol.) Ascorbinsäurelösung. Herstellung aus Ascorbinsäure (Merck 127). Lagerung unter Kühlung. Die Lösung ist 7 Tage lang stabil.
5. 2,5% (Gew./Vol.) Ammoniummolybdatlösung. 2,5 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, Merck 1182) werden in Wasser gelöst, und es wird auf 100 ml aufgefüllt.
6. 1 M Schwefelsäure. 55,6 ml konzentrierte H₂SO₄ (Merck 731) werden zu etwa 800 ml Wasser unter Rühren gegeben. Abkühlen wird ermöglicht, und es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
7. Reagens C 3 Volumen 1 M Schwefelsäure werden mit 1 Volumen 2,5%igem Ammoniummolybdat vermischt, dann wird 1 Volumen 10%ige Ascorbinsäure zugegeben, und es wird gut gemischt. Täglich muss frisches Reagens C hergestellt werden.

Probenverdünnung. Proben werden in Glycinpuffer verdünnt. Von jeder Probe werden Verdünnungen im Duplikat angefertigt. Im Fall von Enzympulver werden etwa 250 mg der Probe akurat gewogen, in dem Puffer gelöst und auf 25 ml in einem Messkolben aufgefüllt, und es wird, falls notwendig, weiter verdünnt.
Verdünnungstabelle:
Assay.
Hydrolyse: 1,9 ml an Substrat werden in zwei Teströhrchen pipettiert. 2,0 ml 15%ige TCA werden zu einem der Röhrchen (Blindprobe) zugegeben, und es wird gemischt. Die Röhrchen ohne TCA werden in ein Wasserbad bei 37°C gestellt und 5 min lang äquilibrieren gelassen. Unter Verwendung einer Stoppuhr wird die Hydrolyse durch sequentielles Zugeben in geeigneten Zeitabständen von 0,1 ml der Enzymverdünnung zu jedem Röhrchen gestartet, und es wird gemischt. Nach genau 15-minütiger Inkubation wird die Reaktion durch Zugeben von 2,0 ml TCA zu jedem Röhrchen gestoppt. Es wird gemischt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Außerdem werden 0,1 ml Probe zu den Blindprobenröhrchen (bei Raumtemperatur gehalten) gegeben, und es wird gemischt. Falls ein Präzipitat auftaucht, muss es durch 10-minütige Zentrifugation bei 2000 g abgetrennt werden.
Freigesetztes Orthophosphat: 0,4 ml jeder Probe werden nach der Hydrolyse in Teströhrchen pipettiert. Zu jedem Röhrchen werden 3,6 ml Wasser zugegeben. 4,0 ml Reagens C werden zugegeben, und es wird gemischt. Es wird 20 min bei 50°C inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Extinktion gegen die der Reagens-Blindprobe (siehe unten) wird bei 820 nm gemessen.
Standard. Eine 9,0 mM Phosphat-Stammlösung wird hergestellt. 612,4 mg KH₂PO₄ (Merck 4873, im Exsikkator mit Siliciumdioxid getrocknet) werden gelöst und auf 500 ml mit Wasser in einem Messkolben verdünnt. Die folgenden Verdünnungen werden in Wasser aus den Stammlösungen hergestellt, und diese werden als Standards verwendet.

* Die entsprechende saure Phosphatase-Aktivität (HFU/ml) wird erhalten durch Teilen der Phosphorkonzentration (nmol/ml) durch die Hydrolysezeit (15 min) und Multiplizieren mit 40 (Gesamtvolumen nach Hydrolysereaktion/Probenvolumen) und mit 10 (Verdünnung vor Analyse von anorganischem Phosphor).

4,0 ml jeder Verdünnung werden in zwei Teströhrchen pipettiert. Außerdem werden 4,0 ml Wasser in ein Röhrchen pipettiert (Reagens-Blindprobe). 4,0 ml Reagens C werden zugegeben, und es wird gemischt. Es wird 20 min lang bei 50°C inkubiert, und es wird auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Extinktionen bzw. Absorptionswerte werden bei 820 nm gegen die der Reagens-Blindprobe gemessen. Eine Standardkurve wird durch Auftragen der Absorptionswerte gegen saure Phosphatase-Aktivität (HFU/ml) erstellt. Mit jeder Serie an Assays muss eine neue Standardlinie konstruiert werden.
Berechnung. Die Blindproben-Extinktion wird von der Proben-Extinktion subtrahiert (die Differenz sollte 0,100 bis 1,000 sein). Die saure Phosphatase-Aktivität (HFU/ml) wird von der Standardlinie abgelesen und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Um die Aktivität (HFU/g) von Enzympulvern zu berechnen, wird das Ergebnis (HFU/ml) ferner mit 25 (ml) multipliziert und durch das exakte Gewicht der Probe (g) geteilt.
Vorbereitung von Futter und anderen unlöslichen Proben für saure Phosphatase- Analyse. Etwa 2,5 g gemahlene Probe werden in zwei 50 ml-Becher akkurat gewogen. 20,0 ml Glycinpuffer werden zugegeben. Unter Verwendung eines Magnetrührers wird etwa 30 min lang bei Raumtemperatur gemischt. Jeweils 10 ml werden in Zentrifugenröhrchen überführt, und das feste Material wird durch 10-minütige Zentrifugation bei 2004 g abgetrennt. 2,5 ml des Überstands werden auf PD-10-Gelfiltrationssäulen (Sephadex G-25M, Pharmacia 17-0851-01) aufgetragen, die mit 25 ml Glycinpuffer äquilibriert sind. Das Eluat wird verworfen. Dann werden 3,5 ml Glycinpuffer auf die Säule aufgetragen und das Eluat in einem Messzylinder gesammelt. Das Volumen wird mit Glycinpuffer auf 5,0 ml aufgefüllt (Verdünnungsfaktor 2) und auf saure Phosphatase-Aktivität untersucht. Die Aktivität HFU/g wird erhalten durch Multiplizieren der gemessenen Aktivität (HFU/ml) mit 40 (Verdünnungsfaktor Volumen Extraktionspuffer) und durch das exakte Gewicht der Probe (g) geteilt. Referenz: Chen, P. S., et al., Anal. Chem. 28: 1756–1758 (1956).
BEISPIEL 3
Reinigung von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase
Das Folgende wird zur Bezugnahme darauf, wie der geschulte Fachmann Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase reinigen würde, bereitgestellt.
I. PHYTASE
Enzymreinigung. Die Schritte wurden bei 4 bis 8°C durchgeführt, wenn es nicht anders angegeben ist. Das Ausgangsmaterial war das von Aspergillus niger var. awamori ALKO 243 produzierte, zellfreie Kulturmediumkonzentrat.
Ammoniumsulfatfällung. Das Kulturfiltratkonzentrat (990 ml) wurde auf einem Eisbad gehalten, und 0,436 g Ammoniumsulfat wurden pro ml zugegeben (70% Sättigung). Nach 30 min wurde das Präzipitat durch 15-minütige Zentrifugation bei 10004 g abgetrennt und verworfen.
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Der Überstand (1070 ml) wurde auf eine Octyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia)-Säule (5 cm × 17 cm), äquilibriert mit einer Lösung, enthaltend 0,436 g (NH₄)₂SO₄ pro ml 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), aufgetragen. Die Säule wurde mit 500 ml der Äquilibrierungslösung gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 500 ml, enthaltend 70→0% Ammoniumsulfat in 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2) entwickelt. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt und auf Phytase- und saure Phosphatase-Aktivität analysiert. Das meiste der Phytase-Aktivität eluierte zum Beginn des Gradienten. Die Fraktionen wurden für den nächsten Schritt zusammengefasst ("pooled"). Die nach der Phytase-Aktivität eluierenden Fraktionen, die das meiste der saure Phosphatase-Aktivität enthielten, wurden für die saure Phosphatase-Reinigung (siehe unten) zusammengefasst.
Anionenaustauschchromatographie. Die zusammengefassten Phytase-Fraktionen (129 ml) wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon PM 10-Membran konzentriert. Das übrige Ammoniumsulfat wurde durch PD 10 (Pharmacia)-Gelfiltrationssäulen, äquilibriert mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), entfernt. Die Probe, in 24,5 ml, wurde auf eine DEAE-Sepharose (Pharmacia)-Säule (5 cm × 7 cm), äquilibriert mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), aufgetragen. Die Säule wurde mit dem Gleichgewichtspuffer (100 ml) gewaschen und durch einen linearen Gradienten von 200 ml, enthaltend 0→0,5 M NaCl in Gleichgewichtspuffer, entwickelt.
Gelfiltration. Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung eines Centricon-30-Mikrokonzentrators auf ein Gesamtvolumen von 600 μl konzentriert. 100 μl-Anteile wurden bei etwa 23°C und 0,3 ml/min durch eine Superose 12 HR 10/30-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), laufen gelassen.
Kationenaustausch. Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung eines Centricon-30-Mikrokonzentrators in 50 mM Natriumformiat (pH 3,8) überführt. Die Probe wurde in zwei Portionen von 2 ml auf eine Mono S HR 5/5-FPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 50 mM Natriumformiat (pH 3,8), bei etwa 23°C aufgetragen. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer (10 ml) gewaschen, und das gebundene Protein wurde bei 60 ml/h mit einem linearen Gradienten von 20 ml, enthaltend 0→430 mM NaCl in Äquilibrierungspuffer, eluiert.
II. SAURE PHOSPHATASE
Gelfiltration. Die zusammengefassten Fraktionen, die das meiste der saure Phosphatase-Aktivität aus dem hydrophobe Wechselwirkungschromatographie-Schritt enthielten, wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon PM 10-Membran konzentriert. Die konzentrierte Probe (25 ml) wurde durch eine Sephacryl S-200 (Pharmacia)-Säule (2,6 cm × 94 cm), äquilibriert mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2) bei 20 ml/h, laufen gelassen.
Anionenaustauschchromatographie. Die zusammengefassten Fraktionen (48 ml) wurden auf eine DEAE-Sepharose (Pharmacia)-Säule (5 cm × 7 cm), äquilibriert mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), aufgetragen. Die Säule wurde mit 100 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 200 ml, enthaltend 0→0,5 M NaCl in Äquilibrierungspuffer, entwickelt.
Anionenaustauschchromatographie. Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden konzentriert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon PM 10-Membran in 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,0) überführt. Die Probe wurde in vier Portionen von 3,5 ml auf einer Mono Q HR 5/5-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,0), bei etwa 23°C und 60 ml/h laufen gelassen. Die Säule wurde mit 10 ml des Gleichgewichtspuffers gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 20 ml, enthaltend 0→350 mM NaCl in Gleichgewichtspuffer, eluiert.
Gelfiltration. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefasst, konzentriert und mit einem Centricon-30-Mikrokonzentrator in 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), enthaltend 150 mM NaCl, zu einem Gesamtvolumen von 400 μl überführt. 100 μl-Portionen wurden bei etwa 23°C und 18 ml/h durch eine Superose 12 HR 10/30-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit dem Probenpuffer, laufen gelassen.
Anionenaustauschchromatographie. Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden mit einer PD 10-Gelfiltrationssäule in 20 mM Histidin/HCl (pH 5,8) überführt. Die Probe wurde in vier Portionen von 1 ml auf einer Mono Q HR 5/5-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit dem Probenpuffer, bei etwa 23°C und 60 ml/h laufen gelassen. Die Säule wurde mit 5 ml Probenpuffer gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 20 ml, enthaltend 0→350 mM NaCl in Gleichgewichtspuffer, eluiert.

nd: = nicht bestimmt ("not determined")

BEISPIEL 4
Charakterisierung des Peptidverdau gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase
Native gereinigte Phytase (70 μg) in 50 mM Tris-HCl pH 7,9 wurde mit 2% (G/G) Trypsin (TPCK-behandelt, Sigma) 2 Stunden lang bei 37°C verdaut und dann mit weiteren 2% (Gew./Gew.) Trypsin 21 Stunden lang verdaut. Eine Charge nativer gereinigter Phosphatase in 100 mM Tris-HCl pH 8,0 wurde mit 2% (Gew./Gew.) Trypsin 20 Stunden lang bei 37°C verdaut und dann mit weiteren 2% (Gew./Gew.) Trypsin 6 Stunden verdaut. Die Peptide wurden wie unten beschrieben gereinigt.
Eine andere Charge gereinigter nativer Phosphatase wurde unter Verwendung von 4-Vinylpyridin wie folgt alkyliert: Lyophilisierte Phosphatase (75 μg) wurde mit 40 μl 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, enthaltend 6 M Guanidiumhydrochlorid, 2 mM EDTA und 34 mM DTT, versetzt. Nach Zugabe von 1 μl 4-Vinylpyridin (Sigma) wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (22°C) 1 Stunde lang aufbewahrt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl 1,4 M DTT gestoppt. Alkylierte Phosphatase wurde dann durch HPLC mit einer C-1-Umkehrphasensäule (TSK TMS 250; 0,46 × 4 cm) unter Verwendung eines 20% bis 70%-ACN/0,06% TFA-Gradienten (80% bis 30% 0,1% TFA) innerhalb von 30 Minuten gereinigt. Die bei 218 nm absorbierenden Fraktionen wurden zusammengefasst und in einer Speed-Vac-Vakuumzentrifuge eingedampft. Die getrocknete Probe wurde in 60 μl 70 mM Tris-HCl pH 9,1 resuspendiert und mit 2% (Gew./Gew.) Lysylendopeptidase C (Wako Chemicals) 2 Stunden lang bei 37°C verdaut. Nach Zugabe weiterer 2% (Gew./Gew.) Lysylendopeptidase C wurde die Inkubation bei 37°C auf 26 Stunden verlängert. Die Peptide wurden wie unten beschrieben gereinigt.
Peptidreinigung und Amino-terminale Sequenzierung
Die durch Verdaue erhaltenen Peptide wurden durch HPLC an einer C-18-Umkehrphasensäule (Vydac 218 TP B5; 0,46 × 25 cm) mit einem 90 Minuten-Gradienten von 0 bis 60% ACN/0,06% TFA (100 bis 40% von 0,1% TFA) getrennt. Die Extinktion bei 218 nm wurde zur Detektion von Peptiden verwendet.
Amino-terminales Sequenzieren des gereinigten Peptids sowie des nativen Proteins wurde durchgeführt, indem sie in einem Gas-gepulsten Flüssigphasensequenzierer ("gaspulsed-liquid-phase-sequencer") (Kalkkinen und Tilgmann, Journal of Protein Chemistry 7: 242–243 (1988)) verdaut wurden. Die freigesetzten PTH-Aminosäuren wurden on-line unter Verwendung von Kapillar-Umkehrphasen-HPLC analysiert.
Carboxy-terminales Sequenzieren von Phytase
Eine Charge gereinigter Phytase (53 μg) wurde mit Carboxypeptidase Y (Sigma, 0,6 U) in 50 mM Natriumacetat pH 5,6, enthaltend 10% Harnstoff und 0,05% SDS, bei Raumtemperatur (22°C) verdaut. Proben des Verdaus wurden zu verschiedenen Zeitpunkten genommen. Diese wurden in einer Speed-Vac-Vakuumzentrifuge getrocknet und gemäß dem Aminosäure-Analysierungs-Kit Pico-Tag (Waters Association) mit Phenylisothiocyanat (PITC) derivatisiert. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde durch Umkehrphasen-HPLC mit der Pico-Tag C-18-Säule durchgeführt, und durch identisch derivatisierte Aminosäure-Standards quantifiziert.
Ergebnisse und Diskussion
Sequenzen konnten aus den Peptiden extrahiert werden, die "doppelte Sequenzen" (für sowohl Phytase und Phosphatase, Tabellen 3 und 4) zeigten, da sie quantitativ unterschiedlich waren und/oder die andere Sequenz schon von sequenzierten Peptiden bekannt war. Native Phosphatase schien gegen über Lysylendopeptidase C-Verdau einigermaßen resistent zu sein. Nach Alkylierung wurden Phosphatasepeptide jedoch gut mit Lysylendopeptidase C erhalten.
Die von Phytase erhaltene Amino-terminale Sequenz (Nphy, #1081; [SEQ ID NO:50:]) war ähnlich, aber nicht identisch mit der Amino-terminalen Sequenz von A. ficuum-Phytase (LAVPASRNQSSGDT) [SEQ ID NO:17:], angezeigt von Ullah, A. H. J., Prep. Biochem. 18: 459–471 (1988). Aus Trypsin-Verdau resultierende Peptide sind in Tabelle 3 gezeigt. Ein Peptid (10 phy) [SEQ ID NO:23:] hatte mit dem internen Peptid von A. ficuum-Phytase (MMQCQAEQEPLVRVLVNDR); Ullah, A. H. J., Prep. Biochem. 18: 459–471 (1988), identische Sequenzen. Carboxy-terminales Sequenzieren von Phytase ergab die Sequenz XSA-OH.
Von dem Amino-terminalen Sequenzieren nativer und alkylierter Phosphatase (Tabelle 4) wurden keine Ergebnisse erhalten. Ein Peptid (7Lpho, #817 [SEQ ID NO:53]) war jedoch mit der Amino-terminalen Sequenz von A. ficuum-saurer Phosphatase (pH-Optimum 2,5: FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDG), veröffentlicht von Ullah, A. H. J. und Cummings, B. J., Prep. Biochem. 17: 397–422 (1987), und ein anderes (10Lpho. #941 [SEQ ID NO:54:]) scheint eine Fortsetzung von diesem zu sein. Peptid 3Tpho (Peptid #1106 in Tabelle 4: SEQ ID NO:61:]) könnte auch eine Fortsetzung von Peptid 11Lpho (Peptid #943-2 in Tabelle 4; SEQ ID NO:60:) sein, weil es vier überlappende Aminosäuren: FSSG, aufweist.
Peptid 1Lpho (Peptid #816 in Tabelle 4; SEQ ID NO:57) enthält die aktives Zentrum-Konsensus-Sequenz RHGXRXP [SEQ ID NO:18:] von Phytasen und Phosphatasen, vorgeschlagen von Ullah, A. H. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 178: 45–53 (1991). Das Peptid war hochhomolog, aber nicht identisch. Ein Phytasepeptid (#675 [SEQ ID NO:37:], LKDPR) enthielt wiederum einen Teil der KDPRA [SEQ ID NO:19:]-Homologie-Sequenz zwischen A. ficuum-Phytase und verschiedenen Phosphatasen, angezeigt von Ullah, A. H. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 178: 45–53 (1991).
Die Ergebnisse zeigen an, dass A. niger-Phytase homolog zu A. ficuum-Phytase ist, aber nicht damit identisch ist. Im Fall von saurer Phosphatase (pH-Optimum 2,5) gelangt man zu der gleichen Schlussfolgerung.
BEISPIEL 5
Das Klonieren und Sequenzieren des Gens für saure Phosphatase mit pH 2,5-Optimum aus Aspergillus niger
I. ZUSAMMENFASSUNG
Das Gen für saure Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,5 ist aus Aspergillus niger kloniert worden und sequenziert worden. Die translatierte Nucleotid-Sequenz ergab für die pH 2,5-saure Phosphatase ein Polypeptid von 479 Aminosäuren. Das Gen für dieses Protein wurde unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden, basierend auf der Peptid-Sequenz des gereinigten Proteins, isoliert.
II. EXPERIMENTELLES UND DISKUSSION
A. Entwerfen von Oligonucleotid-Sonden.
Die Isolierung des Gens, codierend pH 2,5-saure Phosphatase (AP), wurde durch Hybridisierung von degenerierten Oligonucleotiden, entworfen von Peptid-Sequenzen, durchgeführt. Mehrere interne Peptidfragmente waren aus gereinigter pH 2,5-AP aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO 243 (ATCC 38854), wie zuvor in diesem Patent beschrieben, vorher isoliert und sequenziert worden.
Ein degeneriertes 17mer-Oligonucleotid, PHY-31, wurde aus dem saure Phosphatase-Peptid #816 (1Lpho in Tabelle 4 [SEQ ID NO:57:]) entworfen. Durch den Einbau eines neutralen Inosins ist in PHY-31 eine perfekte Übereinstimmung von 64 möglichen Kombinationen vorhanden. Die Nucleotid-Sequenz von Oligonucleotid PHY-31 und die korrespondierende Peptid-Sequenz ist in 1 gezeigt.
B. Hybridisierungsspezifität der Oligonucleotid-Sonden
Um die Spezifität der degenerierten Oligonucleotide zu bewerten, wurden sie mit [γ³²P]-ATP zu einer hohen spezifischen Aktivität unter Verwendung von E. coli-T4-Polynucleotidkinase (BRL) endmarkiert und verwendet, um die gesamte genomische DNA von ALKO 243 zu sondieren. Genomische DNA wurde durch ein neutrales Lyseverfahren isoliert. Kurz gesagt, wurden fein gemahlene, gefriergetrocknete Mycelien mit einem 4%igen SDS-TE-Puffer lysiert. Zelltrümmer wurden entfernt, und der Überstand wurde entfernt und zweimal mit einem gleichen Volumen Tris-gesättigtem Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert. Genomische DNA wurde mit NH₄OAC und EtOH präzipitiert. Pelletierte DNA wurde durch Ultrazentrifugation über CsCl gereinigt und wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)) beschrieben zurückgewonnen. Hybridisierung an genomische DNA mit [γ³²P]-ATP-markierten, degenerierten Oligonucleotiden, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982), wurde bei 42°C über Nacht auf Filtern in Oligonucleotid-Hybridisierungslösung (6 × SSPE, 0,5% SDS, 3 × Denhardts, 100 μg/ml tRNA) durchgeführt. Nicht-spezifisches Binden wurde beseitigt, indem die Filter zweimal 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1% SDS, und einmal 5 Minuten lang bei 42°C in fri scher Lösung gewaschen wurden. Eine Belichtung über Nacht auf Kodak X-Omat AR-Film mit intensivierenden Filtern deckte positiv hybridisierende Banden auf.
A. niger ALKO 243-genomische DNA wurde mit pH 2,5 Oligonucleotid PHY-31 sondiert. Hybridisierung wurde wie bei genomischer Hybridisierung durchgeführt. Unter den Oligonucleotiden für pH 2,5-AP ergab nur PHY-31 relativ spezifische Hybridisierung an genomische DNA. Hybridisierung an eine vorherrschende und an eine geringfügige Bande zeigte ausreichende Spezifität zur Verwendung zum Durchmustern der Bibliotheken an.
C. Isolierung und Charakterisierung des pH 2,5-saure Phosphatase-Gens
Genomische DNA wurde mit Sau3A teilverdaut, um Fragmente von 10–23 kb Länge zu produzieren. Verdaute DNA wurde an BamHI-geschnittene, dephosphorylierte Lambda Dash II-Vektorarme (Stratagene) ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro unter Verwendung von Gigapack Gold-Verpackungsextrakten (Stratagene) verpackt. Ein verpackter Phage ("packaged phage") wurde verwendet, um E. coli-Stamm P2392 zu infizieren. Die Lambda-Bibliothek wurde mit dem Oligonucleotid PHY-31 auf das pH 2,5-AP-Gen unter den mit genomischen Hybridisierungen in Abschnitt (B) etablierten Bedingungen durchgemustert. Zwölf hybridisierende Plaques wurden für weitere Charakterisierung herausgenommen. Von jedem der Kandidaten isolierte Bakteriophagen-DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen verdaut und entweder mit PHY-31 oder einem Gemisch von PHY-34 und PHY-35, die von einem unabhängigen pH 2,5-AP-Peptid abgeleitet waren (1), sondiert. Einer der Klone, AP99, enthielt ein zuvor in genomischer Southern-Analyse identifiziertes SphI-Fragment von 2,1 kb, das stark an beide Sonden hybridisierte. Eine starke Hybridisierung an zwei von verschiedenen Peptid-Sequenzen abgeleitete Oligonucleotide legte nahe, dass AP99 pH 2,5-AP-codierende Sequenzen enthielt. Dieses SphI-Fragment von 2,1 kb wurde deshalb in M13mp18 und M13mp19 zum Sequenzieren subkloniert. Translation der Nucleotid-Sequenz dieses Subklons deckte die Peptid-Sequenzen, einschließlich dem N-terminalen Peptid (Tabelle 4), auf. Unmittelbar stromaufwärts von dem N-terminalen Peptid ist eine typische Pilzsekretions-Signal-Sequenz, beginnend mit einem Methionin-Startkodon an Position 136. Alle Peptid-Sequenzen, bis auf #1108 (Peptid 9Tpho in Tabelle 4 [SEQ ID NO:63:]), welches an Nucleotid-Position 1384 beginnt, waren in einem einzelnen ORF vorhanden. Terminationskodons wurden zwischen Nucleotiden 1151 und 1384 in allen drei Leserahmen identifiziert. Dieses Ergebnisse machten den Einfluss eines Introns/von Introns in dem 3'-Anteil des Gens nötig.
Die Identifizierung von Introngrenzen wurde durch die Isolierung und das Sequenzieren von pH 2,5-AP-cDNA durchgeführt. Die 3'-Region des pH 2,5-AP-Gens wurde aus der korrespondierenden cDNA durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung von pH 2,5-AP-spezifischen Primern isoliert. A. niger var. awamori ALKO 243 wurde in RNA-Nährlösungsmedium, pro Liter bestehend aus 2,0% Maisstärke (Sigma), 1,0% Proteasepepton (Difco), 30,0 g Glucose, 5,0 g NH₄NO₃, 0,5 g MgSO₄·7H₂O, 0,5 g KCl, 0,183 g FeSO₄·7H₂O, kultiviert. Gesamt-RNA wurde im Wesentlichen durch das LiCl-Präzipitationsverfahren von McAda und Douglas (McAda, P. C., et al., Meth. Enrymol. 97: 337–344 (1983)) isoliert. Polyadenylierte Messenger-RNA wurde aus Gesamt-RNA durch die Verwendung von Oligonucleotid(dT)-Cellulose-Säulen (Pharmacia), wie vom Hersteller angegeben, affinitätsgereinigt. Die Oligonucleotid-PCR-Primer UPPHOS (5'GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3') [SEQ ID NO:66:] und DOWNPHOS (5'-GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT-3') [SEQ ID NO:16:] wurden gemäß der Genom-Sequenzen mit flankierenden EcoRI-Restriktionsstellen synthetisiert. UPPHOS und DOWNPHOS sind invers orientiert und in dem genomischen Klon durch 978 Basen getrennt. Erststrangsynthese wurde mit dem BMB-cDNA-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit 1,0 μg mRNA und DOWNPHOS durchgeführt. PCR-Amplifikation des cDNA·mRNA-Komplexes mit Oligonucleotid-Primern UPPHOS und DOWNPHOS ergab ein spezifisches Produkt von etwa 850 Basenpaaren ("bps"). PCR-Amplifizierung von pAP-1-Plasmid-DNA mit denselben Primern ergab das erwartete Produkt von 1006 bps. Gelgereinigtes cDNA-PCR-Produkt wurde mit EcoRI geschnitten und in pUC18 zum Doppelstrangsequenzieren unter Verwendung des United States Biochemical Sequencase II-Kits subkloniert. Die Primer amplifizierten ein Fragment von 850 bp aus der cDNA und das erwartete Fragment von 1006 bp aus klonierter genomischer DNA. Sequenzieren des amplifizierten cDNA-Fragments deckte das Vorhandensein von drei kurzen Introns auf, wobei jedes Donor-, Lasso- und Aktzeptor-Konsensus-Pilz-Sequenzen aufwies. Die codierende Sequenz wird durch Spleißen der Nucleotide 136–916, 971–1088, 1141–1245 und 1305–1740 erlangt. Die resultierende translatierte Sequenz codiert für ein Protein von 479 Aminosäuren, wie in 2 gezeigt.
Das pH 2,5-AP-Polypeptid, vorhergesagt aus der Nucleotid-Sequenz, hat ein berechnetes M_r von 52678. Das SphI-Fragment von 2,1 kb in pUC18 (pAP-1) enthielt 135 bp der stromaufwärtigen pH 2,5-AP-Sequenz.
BEISPIEL 6
Aspergillus niger-Phytase-Produktion in Trichoderma reesei
II. EXPERIMENTELLE PROTOKOLLE
1. Bakterielle Stämme, Phage und Plasmide
Zum Subklonieren und Sequenzieren wurden die E. coli-Stämme DH5α (Hanahan, D., "Techniques for transformation of E. coli", in DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 109–135 (1985); Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) und XL-1-Blue (Bullock, W. O., et al., BioTechniques 5: 376–378 (1987); Stratagene, La Jolla, CA, USA) verwendet. E. coli Y1090 (r^–) wurde (Huynh, D. S., et al., "Constructing and screening cDNA libraries in λgt1 and λgt11", DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 49–57 (1985); Promega Biotec Protoclone GT System, Madison, WI, USA) als ein Wirt beim Kultivieren von λgt11-Phage verwendet.
Aspergillus niger var. awamori ALKO 243 (ATCC 38854) wurde als ein Donor des Phytase-Gens verwendet. T. reesei-Stämme ATCC 56765 (RutC-30), ALKO 233 (VTT-D- 791256, Bailey und Nevalainen, Enzyme Microb. Technol. 3: 153–157 (1981)) und ALKO 2221 wurden als Empfänger für das Phytase-Gen verwendet. ALKO 2221 ist eine schwache Aspartylproteasemutante, abgeleitet von dem Stamm ALKO 233 durch UV-Mutagenese.
Der Phage λgt11 (Promega) wurde zum Erstellen der Genbibliothek verwendet. Die Phagen wurden durch von Silhavy et al. beschriebene Standardverfahren kultiviert (Silhavy, T. J., et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1984)).
Als Vektoren zum Subklonieren wurden pUC9 (Boehringer Mannheim, BRD) und pALK307, ein Derivat von pIBI76 (IBI, New Haven, Conn., USA), verwendet. Um pALK307 zu erhalten, wurde ein NaeI-PvuI-Fragment von ungefähr 940 bp (tatsächlich 941 bp) aus pIBI76 deletiert. Dies ist der einzige Austausch in pIBI76. Das Plasmid pAMH110 (Nevalainen, H., et al., "The molecular biology of Trichoderma and its application to the expression of both homologous and heterologous genes", in Molecular Industrial Mycology, Leong und Berka, Hrsg., Marcel Dekker Inc., New York, S. 129–148 (1991)), enthält die Trichoderma reesei-cbh1-Promotor- und -Terminator-Bereiche. Das Plasmid p3SR2 (Kelly und Hynes, EMBO J. 4: 475–479 (1985)) enthält das Aspergillus nidulans-Acetamidase-Gen. p3SR2 ist freundlicherweise von Dr. M. Hynes (University of Melbourne, Australien) gespendet worden.
2. Kultivierungsmedien und Kulturbedingungen
E. coli-Kultivierungen wurden bei 37°C über Nacht durchgeführt, und Kultivierungen von filamentösen Pilzen bei 30°C für 5 bis 7 Tage zur Enzymproduktion und für 2 Tage, wenn Mycelien für DNA-Isolierung kultiviert wurden.
E. coli wurden in L-Nährlösung (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)), ergänzt mit Ampicillin (50–100 μg/ml), wenn benötigt, kultiviert. PD-Agar-Schrägen ("slants") (Kartoffel-Dextrose-Brühe von Difco, Detroit, MI, USA) wurden zum Kultivieren der Aspergillus- und der Trichoderma-Stämme verwendet. Aspergillus niger ALKO 243-Mycel zur DNA-Extraktion wurde in vollständigem Aspergillus-Medium, enthaltend 2% (Gew./Vol.) Malzextrakt (Difco), 0,1% (Gew./Vol.) Bacto-Pepton (Difco) und 2% (Gew./Vol.) Glucose, kultiviert. Die Platten und Medien für T. reesei-Transformationen waren wie in Penttilä et al. (Penttilä, M., et al., Gene 61: 155–164 (1987)). Die Transformanten wurden auf selektivem Acetamid-CsCl-Medium gereinigt (Penttilä, M., et al., Gene 61: 155–164 (1987)), bevor auf PD-Schrägen überführt wurde.
Zum Plattendurchmustern von hohen Phytase-Produzenten wurden T. reesei-Klone, transformiert mit der cbh1-Promotor/Phytase-Fusion, 3 bis 5 Tage lang auf Trichoderma-Minimal-Mediumplatten ohne Glucose und ergänzt mit 1% Natriumphytat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1% Solka Floc und 1% "proteose peptone" (Difco) kultiviert. Wenn das Konstrukt, enthaltend den Phytase-Promotor, für die Transformation verwendet wurde, wurde das Durch mustern nach hohen Phytase-Produzenten auf Platten durchgeführt, die 1% Natriumphytat und 1% "proteose peptone", aber kein Natriumphosphat enthielten.
Für die Phytase-Produktion wurde A. niger ALKO 243 5 Tage lang in einem Sojamehlmedium, enthaltend Glucose und Mineralsalze (alle von Merck, Darmstadt, BRD), kultiviert; der pH wurde auf 5,0 eingestellt. Für Phytase-Expression von dem cbh1-Promotor wurden T. reesei-Transformanten 7 Tage lang (250 UpM) in einem Lactose-basierten Kultivierungsmedium kultiviert. Zum Kultivieren des mit dem Fragment, enthaltend den Phytase-Promotor, transformierten T. reesei, wurde Trichoderma-Minimalmedium mit 50 g/l Sojamehl ergänzt, und es wurde kein Natriumphosphat zugegeben.
Die Bestandteile des Sojablütenmediums sind wie folgt (pro Liter): 50 g Sojablüten, 30 g Glucose, 5,0 g NH₄NO₃, 0,5 g MgSO₄·7H₂O, 0,5 g KCl, 0,183 g FeSO₄·7H₂O bei pH 5,0. Das auf Lactose basierende Kultivierungsmedium enthält: 4% Molke, 1,5% Komplexstickstoffquelle, 1,5% KH₂PO₄, 0,5% (NH₄)₂SO₄, bei pH 5,5.
3. DNA-Präparationen
Plasmid-DNA wurde aus E. coli (großer Maßstab) unter Verwendung von Qiagen-Säulen (Diagen GmbH, Düsseldorf, BRD) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Für rasches Durchmustern wurde das Verfahren von Holmes und Quigley (Anal. Biochem. 114: 193–197 (1981)) verwendet. Chromosomale DNA von Aspergillus wurde von lyophilisierten Mycelien, wie in Clements und Roberts (Curr. Genet. 9: 293–298 (1986)) und in Raeder und Broda (Lett. Appl. Microbiol. 1: 17–20 (1985)) beschrieben, isoliert.
4. Klonierungsprozeduren
Vorwiegend wurden die Standard-DNA-Verfahren, beschrieben von Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr. Harbor, NY, USA (1982), verwendet. Die/das bei den DNA-Manipulationen verwendete(n) Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Polynucleotidkinase und EcoRI-Methylase waren von Boehringer (Mannheim, BRD) und New England Biolabs (Beverley, MA, USA). Mungbohnennuclease war von BRL (Gaithersburg, MD, USA) und ExoIII von Pharmacia (Uppsala, Schweden). Jedes Enzym wurde gemäß den Instruktionen des Anbieters verwendet.
Zum Herstellen der Genbank wurde die chromosomale DNA mit HaeIII teilverdaut. EcoRI-Methylase-Behandlung, Größenfraktionierung und Verpacken wurden wie in Paloheimo et al. (Paloheimo, M., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 584–591 (1992)) durchgeführt. Fragmente mit einer Größe von 2–8 kb wurden für die Konstruktion der Genbank verwendet.
Subklonieren in den Plasmidvektor wurde durch Verwenden von Standard-DNA- Verfahren (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)) durchgeführt. DNA-Fragmente zum Klonieren oder für Transformationen wurden aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) durch das Gefrier-Tau-Phenol-Verfahren (Benson, S. A., Bio/Techniques 2: 66–68 (1984)) oder durch Verwenden der GeneClean^®- oder Mermaid^TM-Kits (BIO 101 Inc., La Jolla, CA, USA) gemäß der Instruktionen des Anbieters isoliert.
Das Sequenzieren wurde direkt von den Plasmiden durch das Sanger-Verfahren (Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)) mittels SP6-, T7-, pUC/M13-Primern und Verlängerungsprimern und des "Promega Sequenase"-Sequenzier-Kits (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH, USA) durchgeführt. Fusionen zwischen dem cbh1-Promotor und dem Phytase-Gen wurden durch eine automatisierte Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems 373A, Foster City, CA, USA) unter Verwendung des "Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing-Kit (Applied Biosystems) sequenziert. Die verwendeten Oligonucleotide wurden durch einen "Applied Biosystems 381A Synthesizer" synthetisiert, ausgenommen der pUC-Primer, die von der United States Biochemical Corporation erworben wurden.
DNA-Sonden wurden unter Verwendung des nicht-radioaktiven DIG-DNA Labelling and Detection-Kit von Boehringer gemäß den Instruktionen des Anbieters markiert.
Hybridisierungen wurden bei 68°C wie in den Instruktionen des Anbieters (Boehringer) durchgeführt. Hybond N-Nylonfilter von Amersham wurden bei den Plaquedurchmusterungen und bei den Southern-Blot-Hybridisierungen verwendet.
Wenn die Plaques mit einem Antiserum durchgemustert wurden, wurde ein Phytasespezifisches polyklonales Antiserum KH1236 verwendet. KH1236 wurde gegen eine gereinigte und deglykosylierte Phytase-Präparation (M. Turunen, Alko Ltd.) im National Public Health Institute (Helsinki, Finnland) hergestellt. Anti-Kaninchen-IgG-alkalisches Phosphat-Konjugat und Farbentwicklungssubstrate von ProtoBlot^TM Immunoblotting-System (Promega) wurden verwendet, um die Immunkomplexe zu detektieren.
5. Transformationen
E. coli-Stämme wurden gemäß dem Verfahren von Hanahan ("Techniques for transformation of E. coli", in DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 109–135 (1985), transformiert, und T. reesei-Stämme wie in Penttilä et al. (Gene 61: 155–164 (1987)). Wenn die ligierten Fragmente transformiert wurden (die D-Transformante in Tabelle 7), wurde das Ligationsgemisch nicht weiter gereinigt, sondern wurde als solches in den Transformationen verwendet. Vor dem Sporulieren auf Kartoffeldextroseagar (PD)-Schrägen ("slants") wurden T. reesei-Transformanten auf das selektive Medium transferiert und durch Konidien gereinigt.
6. Enzym- und Proteinmessungen
Für die Enzym-Assays wurde T. reesei-Mycel von dem Kulturmedium durch 15- bis 30-minütige Zentrifugation bei 5000 bis 10000 UpM (Sorvall SS-34, Dupont Company, Wilmington, Delaware, USA) abgetrennt. A. niger-Kulturen wurden 40 min lang bei 10000 UpM (Sorvall SS-34) zentrifugiert. Die Phytase-Aktivität wurde von dem Kulturüberstand als die Menge von anorganischem Phosphat gemessen, die durch enzymatische Hydrolyse von Natriumphytat substrat bei 37°C, wie früher beschrieben, freigesetzt wurde. Eine normalisierte Phytase-Einheit (PNU, "phytase normalized unit") ist als die Menge von Phytase-Aktivität definiert, die von dem A. niger ALKO 243-Stamm unter den verwendeten Kultivierungsbedingungen produziert wird.
Die Phytase-Produktion auf den Natriumphytat-Assayplatten wurde durch Gießen des Reagens C (3:1:1-Verhältnis von 1 M H₂SO₄, 2,5%iges Ammoniummolybdat, 10%ige Ascorbinsäure) auf die Platten und 15-minütiges Inkubieren der Platten bei 50°C visualisiert. Die Reduktion des Phosphormolybdat-Komplexes führt zu bläulicher Farbe.
Amyloglucosidase-Aktivität (AGU) wurde durch Verwendung von 1%iger Zulkowsky-Stärke (Merck) als ein Substrat und Messen der Menge der freigesetzten Glucose-Einheiten durch Kochen mit DNS-Reagens (siehe unten) nach 10-minütiger Reaktion bei 60°C bei pH 4,8 gemessen. Proteasen (HUT) wurden wie in Food Chemicals Codex (1981) bei pH 4,7 unter Verwendung von 2%igem Hämoglobin (Sigma) als ein Substrat gemessen. Endoglucanase (ECU)- und Cellobiohydrolase (FPU)-Aktivitäten wurden wie in IUPAC's "Measurement of Cellulase Activities (IUPAC Commission on Biotechnology, Measurement of Cellulase Activities, Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, Delhi, Indien, S. 5–7 und 10–11 (1981)) gemessen. 1%ige Hydroxyethylcellulose (Fluka AG) in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 4,8) und Whatman Nr. 1-Papier wurden jeweils als Substrate verwendet. Verwendete DNS unterschied sich von der im Protokoll der IUPAC Beschriebenen und wurde hergestellt, indem zuerst 50,0 g 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure (Merck) in 41 deionisiertem Wasser verdünnt wurden. Dann wurden 80,0 g NaOH langsam unter Verwendung des Magnetrührers zugegeben, und 1500 g Natrium-Kaliumtartrat (Merck) wurden zugegeben und durch Erwärmen der Lösung (Maximaltemperatur 45°C) verdünnt. Das Gesamtvolumen wurde auf 51 eingestellt, die Lösung wurde durch Whatman Nr. 1 filtriert und vor Licht geschützt.
CBHI-Protein wurde von dem Kulturüberstand gemessen, indem ein SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen wurde und die CBHI-Proteinbande detektiert wurde (T. reesei ALKO 233- und ALKO 2221-Stämme) oder durch Dot-Blotting von Proben unter Verwendung der Schleicher & Schuell's (Dassel, BRD) "Minifold^TM Micro-Sample Filtration Manifold" (T. reesei ATCC 56765). CBHI-Protein wurde unter Verwendung von CBHI-spezifischem monoklonalen Antikörper CI-89 (Aho, S., et al., Eur. J. Biochem. 200: 643–649 (1991)) und Anti-Maus-IgG-alkalisches Phosphat-Konjugat (Promega) detektiert. Die Visualisierung der Immunkomplexe wurde wie beim Plaquedurchmustern durchgeführt.
7. SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot-Analyse wurden wie in Laemmli (Laemmli, U. K., Nature 227: 680–685 (1970)) und wie in Towbin et al. (Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–4354 (1979)) durchgeführt. Visualisierung des Phytaseproteins in Western-Blots wurde unter Verwendung des po lyklonalen Kaninchen-Antiserums KH1236 durchgeführt. Die Visualisierung der Immunkomplexe wurde wie beim Plaquedurchmustern durchgeführt.
8. Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR-Reaktionen wurden durch den Techne Thermal Cycler PHC-2 (Techne Ltd., Cambridge, UK) in 100 μl Volumina bewerkstelligt. Die Reaktionsgemische enthielten 0,2 mM von jedem dNTP (3'-Desoxynucleosid-5'-Triphosphat, Pharmacia) in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5–2,0 mM MgCl₂ und 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine. Das verwendete Protokoll war das Folgende: 95°C (Plasmid) oder 100°C (chromosomale DNA)/5 min vor Zugabe der Taq-DNA-Polymerase (1–2 Einheiten, Cetus Corp., Emeryville, CA, USA) und 100 μl Überschichtung von Paraffinöl, Denaturierung 95°C/1 min, Anlagerung ("annealing") 60°C/1 min (bei der inversen PCR 52°C), Erweiterung ("extension") 72°C/2 min (bei der inversen PCR 2,5 min), 30 Zyklen lang. Die abschließende Erweiterungszeit war 9 min, um die Vervollständigung der Strangsynthese zu gewährleisten. Wenn ein Plasmid oder DNA-Fragment als eine Matrize verwendet wurde, war die Menge der verwendeten Matrize 5–10 ng, und es wurden 20–50 pmol von jedem Primer zugegeben. Wenn chromosomale DNA als eine Matrize verwendet wurde, waren die entsprechenden verwendeten Mengen 100 ng und 50–100 pmol. Die ringförmige Matrize für die inverse PCR wurde aus der verdauten chromosomalen DNA wie in Innis et al. (Ochman, H., et al., "Amplification of flanking sequences by inverse PCR", in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis, M. A., et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, S. 219–227 (1990)), angefertigt. PCR-Fragmente wurden mittels des GeneClean^®- oder Mermaid^TM-Kit (falls erforderlich von einem Agarosegel) oder durch Qiagen-Spitzen ("tips") gereinigt. Die Enden der Fragmente wurden unter Verwendung des DNA-Polymerase I-Klenow-Fragments aufgefüllt.
2. ERGEBNISSE
A. Molekulares Klonieren der Aspergillus niger-Phytase
1. Produktion der Phytase-Sonde durch ineinandergeschachtelte PCR-Amplifikation
Die Oligonucleotid-Primer, verwendet in den PCR-Reaktionen, und die korrespondierenden Aminosäure-Sequenzen der Phytase ALKO 243-Peptide #792 (15 phy) und #420 (10 phy) (Tabelle 3, wie früher beschrieben) sind in 3 gezeigt (Nucleotide 1409–1480 und 1727–1762 in der Phytase-Sequenz, siehe 5). Zwei primäre PCR-Reaktionen wurden durchgeführt. In Reaktion A wurden Sinn-Oligonucleotid 1 (#792) und Gegensinn-Oligonucleotid 4 (#420) verwendet; in Reaktion B wurden Sinn-Oligonucleotid 3 (#420) und Gegensinn-Oligonucleotid 2 (#792) verwendet. Die primäre PCR-Reaktion A ergab eine einzelne Bande von etwa 400 bps, während die PCR-Amplifikation von der Reaktion B kein Produkt ergab. Folglich wurde schlussgefolgert, dass die Region, codierend für das Peptid #792 auf der 5'-Seite in der Phytase-Sequenz lokalisiert war, verglichen mit der, codierend für das Peptid #420. Das primäre PCR-Fragment (A) wurde als eine Matrize für die zweite PCR mit internen Primern von den Peptid-Sequenzen: Sinn-Oligonucleotid 2 und Gegensinn-Oligonucleotid 3, verwendet. PCR-Amplifikation von der zweiten PCR-Reaktion ergab ein spezifisches Produkt von etwa 350 bps. Das PCR-Fragment wurde in SmaI-verdautes pUC9 kloniert und sequenziert. Die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäure-Sequenz enthielt auch die bekannten Aminosäuren von dem Peptid #792 und #420, die von den Primer-Sequenzen nicht codiert waren. Das PCR-Fragment von ungefähr 350 bp wurde verwendet, um die DNA-Bank zu sondieren.
2. Durchmustern der DNA-Bank
Die Genbank enthielt ungefähr 1,9 × 10⁶ pfu (Plaque-bildende Einheiten, "plaque forming units")/ml, von denen ungefähr 99,5% ein Insert aufwiesen. Von etwa 80000 Plaques, die durchmustert wurden, wurden 2 positive Klone Hae2-6 und Hae1-5 gefunden. Die Klone wurden isoliert, gereinigt, und die Inserts (5,6 und 5,2 kb) wurden in EcoRI-geschnittenes pALK307 subkloniert. Die Klone reagierten auch mit dem Phytase-Antiserum KH1236. Die Inserts wurden restriktionskartiert, und es wurde gefunden, dass das PCR-Fragment an das BamHI-SphI-Restriktionsfragment von etwa 1 kb der Klone hybridisiert (siehe 4 für das Hybridisierungsgebiet in der Phytase-Sequenz). Die Sequenz des Klons Hae2-6, die mehr der 5'-Sequenz enthielt, codierte für 15 interne tryptische Peptid-Sequenzen, aber die N-terminale Aminosäure-Sequenz wurde nicht gefunden. Die N-terminale- und die Promotor-Gegendenthaltenden Phagenklone wurden unter Verwendung einer 5'-Sonde, hergestellt durch inverse PCR, aus der Genbank herausgemustert (Ochman, H., et al., "Amplification of flanking sequences by inverse PCR", in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis, M. A., et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, S. 219–227 (1990)).
3. Amplifikation des 5'-Endes und der Promotor-Sequenz des Phytase-Gens durch inverse PCR
Restriktionsenzym-Verdaue der genomischen DNA und Southern-Hybridisierungen mit der PCR-Sonde von 350 bp zeigten, dass Verdaue der genomischen DNA mit SalI Fragmente geeigneter Größe (1–3 kb) zur Zirkularisierung und Amplifikation mit PCR erzeugten. Die für die inverse PCR verwendeten Primer waren von Basen 1243–1257 (Gegensinn-Primer)- und 1204–1321 (Sinn-Primer)- Gegenden der Phytase-Sequenz (siehe 5). Inverse PCR mit SalI-verdauter ALKO 243-DNA erzeugte eine PCR-Bande von etwa 1,2 kb. Das PCR-Fragment von 350 bp hybridisierte an das Fragment der inversen PCR, und durch Sequenzieren des subklonierten Fragments wurde bestätigt, dass es die stromaufwärts liegenden Teile des Phytase-Gens enthielt. Außerdem war die N-terminale Peptid-Sequenz eingeschlossen.
4. Isolierung des kompletten Phytase-Gens
Das von der inversen PCR erhaltene PCR-Fragment von 1,2 kb wurde als eine Sonde verwendet, um 80000 Plaques zu durchmustern, von welchen sieben positive Plaques identifiziert werden konnten. Das komplette Phytase-Gen wurde auf einem Insert von etwa 6 kb eines Phagenklons isoliert.
Das SphI-Fragment von etwa 2,4 kb, enthaltend das Phytase-Gen und die Promotorgegend, wurde in pALK307 (geschnitten mit SphI) subkloniert, um pALK169 zu ergeben ( 4). Die Restriktionskarte des Phytase-enthaltenden SphI-Fragments und die Lage des Phytase-Gens in dem Fragment sind in der Plasmidkarte gezeigt.
Die Phytase-Sequenz ist in 5 gezeigt. Die Sequenz, codierend für das Phytaseprotein, entspricht der Phytase-Sequenz von Aspergillus ficuum, veröffentlicht in der "Gist brocades" (Delft, Niederlande) PCT-Patentanmeldung ( EP 420 358 oder WO91/05053) mit 12 Unterschieden bei den abgeleiteten Aminosäuren. Jeder Unterschied bei der abgeleiteten Aminosäure war auf die Änderung eines Nucleotids zurückzuführen und könnte auf Unterschiede zwischen den Stämmen zurückzuführen sein. Außerdem wurden in der Sequenz, codierend das Struktur-Gen, 33 Nucleotidunterschiede gefunden, die nicht zu Unterschieden bei der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz führten. In der Signal-Sequenz bestanden Unterschiede in zwei Nucleotiden (der andere führte zu einem Unterschied bei der abgeleiteten Aminosäure), und bei der vorgeschlagenen Intron-Gegend konnten acht Unterschiede gefunden werden. Die Gesamt-Übereinstimmung pro Länge (Nucleotid-Sequenzen von dem ersten ATG zu dem Stop-Kodon TAG zwischen den zwei Sequenzen war 96,3%. Die zwischen den beiden Phytase-Sequenzen gefundenen Unterschiede, von "Gist brocades" und "ALKO" sind in der Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5. Nucleotid- und Aminosäureunterschiede zwischen Gist's- und ALKO's-Phytase-Sequenzen. Die Nucleotid-Nummern werden von dem ersten Met (ATG) in der Signal-Sequenz und Aminosäure-Nummern von dem N-terminalen Leu gezählt (siehe Fig. 5). Die Aminosäuren, falls zwischen den beiden Sequenzen unterschiedlich, sind in Fettbuchstaben geschrieben.
B. Konstruktion der Plasmide für Überexpression von Phytase in Trichoderma reesei
1. Die PCR-Fragmente für die präzisen cbh1-Phytase-Fusionen
Die Fusionen zwischen dem cbh1-Promotor und der Phytase-Signal-Sequenz und zwischen der cbh1-Signal-Sequenz und dem Phytase-Gen wurden durch PCR durchgeführt. Die Phytase-Signal-Sequenz oder die N-terminale Sequenz des Phytaseproteins beginnen präzise, wo die korrespondierenden cbh1-Sequenzen beginnen würden (für die cbh1-Sequenz siehe Shoemaker, S., et al., Bio/Technology 1: 691–696 (1983)). Die für die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind in 6 gezeigt. Um pALK171 (Phytase-Signal-Sequenz) zu konstruieren, machten wir von der SacII-Stelle in dem cbh1-Promotorbereich in dem 5'-PCR-Primer Gebrauch. Die XhoI-Stelle (14 Nucleotide vom N-Terminus des Phytase-Gens) wurde bei dem 3'-Primer verwendet. Der 5'-Primer war ein 39-mer, das einen "tail" bzw. "Schwanz" von 19 Nucleotiden der cbh1-Promotor-Sequenz (die der Signal-Sequenz vorangeht) und 20 Nucleotiden von der Phytase-Signal-Sequenz enthielt. Der 3'-Primer war ein 22-mer. Bei der Konstruktion von pALK172 (cbh1-Signal-Sequenz) machten wir von der SfiI-Stelle in der cbh1-Signal-Sequenz bei dem 5'-Primer und von der SalI-Stelle der Phytase (762 Nucleotide vom N-Terminus) im 3'-Primer Gebrauch. In diesem Fall war der 5'-Primer ein 46-mer, enthaltend einen "tail" von 28 Nucleotiden und 18 Nucleotiden der N-terminalen Phytase-Sequenz; der 3'-Primer war ein 24-mer. Bei all diesen Primern wurden drei bis fünf zusätzliche Nucleotide an die Enden der PCR-Fragmente hinter den Restriktionsstellen-Sequenzen angefügt, um einen korrekten Schnitt zu gewährleisten. pALK169 wurde bei den PCR-Reaktionen als eine Matrize verwendet.
Von den PCR-Reaktionen wurden Fragmente der erwarteten Längen erhalten: das Fragment, enthaltend die gewollte Fusion, war für pALK171 202 bps lang und für pALK172 800 bps lang.
2. Konstruktion von Plasmiden mit dem cbh1-Promotor: pALK171 (Phytase-Signal-Sequenz) und pALK172 (cbh1-Signal-Sequenz)
Plasmid pALK170L wurde durch Schneiden des Phytase-Gens aus pALK169 als ein SphI-XhoI-Fragment und Ligieren desselben an SphI XhoI-geschnittenes pALK307 angefertigt. Das PCR-Fragment von 200 bp, enthaltend die cbh1-Promotor- und Phytase-Signal-Sequenz, wurde mit XhoI geschnitten und an pALK170L ligiert, das mit XbaI geschnitten, mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment behandelt und mit XhoI geschnitten worden war (pALK170X, 7). Der Fusionsbereich und der PCR-Fragment-Bereich wurden sequenziert, um zu gewährleisten, dass bei der PCR-Amplifikation keine Fehler aufgetaucht waren. Phytase-Fragment, enthaltend die Fusion, wurde als ein SphI (behandelt mit der T4-DNA-Polymerase)-SacII-Fragment isoliert und wurde zwischen den cbh1-Promotor- und Terminatorbereichen des Plasmids pAMH110, zuvor verdaut mit NdeI (aufgefüllt mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment) und SacII, eingefügt. Das erhaltene Plasmid (pALK171X, 7) enthält das Phy tase-Gen präzise an den cbh1-Promotor fusioniert. Um pALK171 zu konstruieren, wurde das amdS-Gen (selektierbarer Marker) aus p3SR2 als ein SphI-KpnI-Fragment isoliert, die Enden wurden mit der T4-DNA-Polymerase behandelt, und amdS wurde dann an die SphI-Stelle von pALK171X (behandelt mit der T4-DNA-Polymerase) ligiert. Das lineare Fragment von ungefähr 7,5 kb, das keine bakteriellen Sequenzen enthielt, wurde aus pALK171 durch Schneiden mit XbaI isoliert und wurde für die Transformationen verwendet.
pALK172 wurde im Wesentlichen auf dieselbe Art wie pALK171 konstruiert (siehe 8). Das PCR-Fragment von 800 bp wurde mit SalI geschnitten und an XbaI (aufgefüllt mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment), SalI-geschnittenes pALK170L, ligiert. Auch in diesem Fall wurden die Fusionen und die Sequenz des PCR-Fragments durch Sequenzieren überprüft. Die Phytase-PCR-Fragment-Fusion wurde aus pALK170S als ein SphI (behandelt mit der T4-DNA-Polymerase)-SfiI-Fragment isoliert und an pAMH110 ligiert, das mit NdeI (aufgefüllt mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment)-SfiI geschnitten worden war. Um pALK172 zu konstruieren, wurde das das amdS-Gen enthaltende Fragment an pALK172S auf dieselbe Weise ligiert wie beim Konstruieren von pALK171. XbaI wurde auch in diesem Fall verwendet, um aus dem Vektorrückgrat das in den Transformationen verwendete lineare Fragment auszuschneiden.
3. Konstruktion der Plasmide mit dem Phytase-Promotor: pALK173A und pALK173B
Das Phytase-Gen wurde mit seinem eigenen Promotor als ein SphI-Fragment aus pALK169 isoliert und in die KpnI-Stelle von p3SR2 ligiert (in beiden Fällen wurden die Enden der Fragmente durch die T4-Polymerase aufgefüllt), was in Plasmiden von etwa 11,2 kb pALK173A und pALK173B resultierte (siehe 4 für pALK169 und 7 und 8 für die p3SR2-Karte). In pALK173A sind die beiden Gene Phytase und amdS in einer parallelen Orientierung, in pALK173B sind sie in entgegengesetzten Orientierungen (9). EcoRI wurde verwendet, um pALK173A und pALK173B zu linearisieren, wenn linearisierte Plasmide für Transformationen verwendet wurden.
C. Transformation von Trichoderma reesei und Durchmustern der Transformanten
Die T. reesei-Stämme ATCC 56765, ALKO 233 und ALKO 2221 wurden mit ringförmigen Plasmiden und mit den XbaI-Fragmenten von den Plasmiden pALK171 und pALK172 (cbh1-Promotor) transformiert. T. reesei-Stämme ALKO 233 und 2221 wurden auch mit den linearisierten pALK171- und pALK172-Plasmiden sowie mit ringförmigen und linearen pALK173A- und pALK173B (Phytase-Promotor)-Plasmiden transformiert. Transformationshäufigkeiten (Transformanten/μg DNA) variierten von 3 bis 60, wenn die aus pALK171 oder pALK172 isolierten Fragmente verwendet wurden. Wenn ringförmige Plasmide pALK171 oder pALK172 bei den Transformationen verwendet wurden, waren die Häufigkeiten etwa 50/μg für T. reesei ALKO 233 und ALKO 2221 und etwa 100/μg für T. reesei ATCC 56765. Transformationshäufigkeiten, erhalten, wenn linearisierte Plasmide verwendet wurden, waren etwa 100/μg. Wenn pALK173A oder pALK173B bei Transformationen verwendet wurden, waren die Häufigkeiten von 6 bis 26 für das lineare Plasmid und von 6 bis 20 für das ringförmige Plasmid.
Die Regenerationshäufigkeit der Sphaeroplasten variierte von 4,5% bis 13,2% für T. reesei-Stämme ALKO 233 und ALKO 2221 und war 1–2% für den T. reesei-Stamm ATCC 56765.
Die Mengen der Transformanten, die auf die Phytase-Produktion auf Platten hin durchgemustert wurden, sind in Tabelle 6 gezeigt. Jene Klone, die klar einen blaugefärbten Hof bzw. Halo um die Kolonie herum produzierten, wurden als positive Klone gezählt.
Tabelle 6. Platten-Assay-positive Transformanten und Gesamtzahl getesteter Klone. Die Anzahl der im Platten-Assay positiven Transformanten und die Gesamtzahl von im Phytase-Platten-Assay getesteten Transformanten sind gezeigt. Nur jene Transformantenstämme, die sowohl auf der Selektionsschräge als auch auf dem Platten-Assay gut wuchsen, sind eingeschlossen. Als positive Phytase-Produzenten sind jene Stämme gezählt, die auf dem Platten-Assay klare Phytase-Aktivität zeigten.
Die Transformanten, die auf dem Platten-Assay die besten Produzenten zu sein schienen, wurden in Schüttelkolben kultiviert. Inocula wurden entweder direkt von Acetamid-Schrägen oder von PD-Schrägen nach Reinigung durch Konidien genommen. Von den T. reesei ATCC 56765, ALKO 233 und ALKO 2221, transformiert mit den Fragmenten von pALK171 und von pALK172, wurden von jedem Satz an Transformanten 7 bis 16 Klone gereinigt, und die Phytase-Produktion wurde in Schüttelkolbenkultivierungen getestet. Wenn ringförmige Plasmide pALK171 oder pALK172 bei den Transformationen verwendet worden waren, wurden 13 und 12 gereinigte T. reesei ATCC 56765, bzw. vier bis sieben Transformanten-T. reesei-Stämme ALKO 233 und ALKO 2221, kultiviert. Wenn linearisierte Plasmide pALK171 oder pALK172 verwendet wurden, wurden von jedem etwa 20 Transformanten-Stämme in Schüttelkolben kultiviert. Von den Klonen von T. reesei ALKO 233, transformiert mit den linearen pALK173A/B-Plasmiden, wurden sieben pALK173A- und zwei pALK173B- (und mit den ringförmigen Plasmiden vier pALK173A- und drei pALK173B-) Transformanten, die auf Platten Phytase-Aktivität anzeigten, gereinigt und in Schüttelkolbenkultivierungen getestet. Für die T. reesei ALKO 2221-Transformanten waren die entsprechenden in Schüttelkolbenkultivierungen getesteten Mengen wie folgt: für die linearen Plasmide drei pALK173A- und fünf pALK173B- und für die ringförmigen Plasmide sechs pALK173A- und sechs pALK173B-Transformanten.
D. Phytase-Produktion durch die Trichoderma-Transformanten
Die besten Phytase-Produktionslevel von Transformanten von T. reesei ATCC 56765, ALKO 233 und ALKO 2221, ohne E. coli-Sequenzen, wenn der cbh1-Promotor (pALK171- und pALK172-Fragmente) verwendet wurde, sind in Tabelle 7 gezeigt.
Etwa 3600 PNU/ml wurde mit der besten Transformante erhalten. Etwa der gleiche Produktionslevel konnte durch Verwendung sowohl der Stämme T. reesei ALKO 233 als auch ALKO 2221 erreicht werden. Die beste Phytase-produzierende T. reesei ATCC 56765-Transformante produzierte etwa 1800 PNU/ml. Sowohl die Phytase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz schienen gleichermaßen gut zu funktionieren, und es konnten die gleichen Level bei der Phytase-Produktion erreicht werden, wenn T. reesei ALKO 2221 oder ATCC 56765 als ein Wirtsstamm verwendet wurden. Bei T. reesei ALKO 233 war der Level produzierter Phytase-Aktivität höher, wenn die Phytase-Signal-Sequenz verwendet wurde.
Einige der Transformanten produzierten kein nachweisbares CBHI-Protein, was höchst wahrscheinlich die Integration der transformierenden DNA in den cbh1-Locus anzeigt. Die Abwesenheit des CBHI-Proteins beeinflusste die Produktionslevel in den durchmusterten Transformanten nicht, d.h., man fand gute Produzenten, sowohl unter den Transformanten, die normale Mengen von CBHI produzierten, als auch unter CBHI-negativen Stämmen (ALKO 233, ALKO 2221).
Die besten, durch die Verwendung von ringförmigen und linearen Plasmid pALK171 und pALK172 erhaltenen Produktionslevel sind in der Tabelle 8 gezeigt. Die besten Produktionsausbeuten wurden mit dem T. reesei ALKO 2221 erhalten, der mit dem linearen Plasmid pALK171 (Phytase-Signal-Sequenz) transformiert worden war.
Tabelle 8. Phytase-Produktion durch die ringförmigen oder linearen Plasmide pALK171 und pALK172 transformierten T. reesei-Stämme. Es sind die Phytase-Aktivitäten als PNU/ml in den Kulturüberständen der drei besten Phytase-produzierenden Transformanten von jedem Typ gezeigt. T. reesei ATCC 56765-Transformanten wurden vor den Kultivierungen durch Konidien gereinigt, und die Ergebnisse sind Durchschnitte von zwei Schüttelkolbenkultivierungen. Inocula für Kultivierungen der T. reesei- und ALKO 2221-Transformanten wurden aus den Acetamid-Schrägen genommen, und die gezeigten Ergebnisse sind von einer Schüttelkolbenkultivierung.
Auch der A. niger-Phytase-Promotor kann die Expression des Gens in Trichoderma fördern. Jedoch sind die erhaltenen Enzymausbeuten viel geringer als mit dem zu T. reesei homologen cbh1-Promotor: die von den Kulturüberständen von Transformanten, enthaltend den eigenen Promotor der Phytase, erhaltenen Aktivitäten waren etwa 1 bis etwa 14 PNU/ml für die T. reesei ALKO 233-Transformanten und etwa 6 bis etwa 120 PNU/ml für die T. reesei ALKO 2221-Transformanten (Tabelle 9).
Tabelle 9. Phytase-Produktion durch mit ringförmigem oder linearem Plasmid pALK173A oder pALK173B (Phytase-Promotor) transformierten T. reesei-Transformanten. Phytase-Aktivitäten als PNU/ml in den Kulturüberständen der Transformanten sind gezeigt. Transformanten sind vor Kultivierung durch Konidien gereinigt worden. Die gezeigten Ergebnisse sind von einer Schüttelkolbenkultivierung. Ein "kleiner als"-Zeichen (<) bedeutet, dass der Wert unterhalb des Detektionslevels war.
E. Der Enzymhintergrund in den Phytase-Präparationen, produziert durch T. reesei
Phytase wird in hohen Mengen in den T. reesei-Stämmen exprimiert, und der Hintergrund anderer Enzymaktivitäten in den Überständen von T. reesei-Transformanten ist unterschiedlich zu jenen im Aspergillus-Überstand (Tabelle 7). Sowohl Endoglucanase- als auch Cellobiohydrolase-Aktivitäten sind wesentlich höher, wenn T. reesei als ein Produktionswirt verwendet wird, verglichen mit A. niger. Die verwendeten T. reesei-Stämme produzierten außerdem verhältnismäßig weniger Glucoamylase-Aktivität als der A. niger ALKO 243-Stamm.
F. Phytaseprotein, produziert durch die Trichoderma-Transformanten
Proben aus den Wachstumsmedien der Transformanten (pALK171-Fragment) und der nicht-transformierten T. reesei-Stämme ATCC 56765, ALKO 233 und ALKO 2221 wurden in Western-Blots analysiert (10). Kurz beschrieben, wurden die folgenden Proben analysiert: Spur 1: 50 ng von gereinigter Aspergillus ALKO 243-Phytase; Spur 2: 15 ng von endoF-behandelter Aspergillus ALKO 243-Phytase; Spuren 3 und 10: T. reesei ALKO 233; Spuren 4–5 und 11–12: T. reesei ALKO 233-Transformante 171FR/A4 bzw. A13; Spuren 6 und 13: T. reesei ALKO 2221; Spuren 7–8 und 14–15: T. reesei ALKO 2221-Transformante 171FR/A5 bzw. A9; Spur 9: T. reesei ALKO 2221-Transformante D2; Spur 16: T. reesei ATCC 56765; Spuren 17, 18, 19: T. reesei ATCC 56765-Transformanten 171FR/A21, A11 bzw. A23. In jedem Fall wurden 2 μl von einer 1:10-Verdünnung des Kulturüberstands auf einem Gel laufen gelassen. 171 FR ist der mit dem XbaI-Fragment von dem Plasmid pALK171 transformierte Wirt.
Das Molekulargewicht der Phytase, produziert durch Trichoderma, unterschied sich von dem, produziert durch Aspergillus, und der Unterschied schien auf Unterschieden im Glykosylierungslevel zu beruhen. Die von T. reesei ALKO 233 sezernierte Phytase war in den Western-Blots als drei, und diejenige, sezerniert durch T. reesei ALKO 2221 als 6 bis 9 Hauptproteinbanden mit Größen von etwa 45–65 kDa sichtbar, von denen die niedrigsten in der Größe der deglykosylierten Aspergillus-Phytase (45–48 kDa in SDS-PAGE) entsprachen. Die von T. reesei ATCC 56765 sezernierte Phytase war von einer Größe von 65–80 kDa und bestand aus drei bis fünf Proteinbanden. Das Molekulargewicht der nativen Aspergillus-Phytase, laufen gelassen in SDS-PAGE, ist etwa 80–85 kDa. Das Phytaseprotein, produziert durch die Transformanten, die mit pALK172-Fragment oder pALK173A/B transformiert worden waren, zeigten dieselbe Art von Bandenmuster.
III. Schlussfolgerungen
Der Produktionslevel von Aspergillus-Phytase, erhalten, wenn T. reesei als ein Produktionswirt verwendet wurde, war überraschend hoch. Durch Verwenden von T. reesei wird die Phytase in einem neuen Hintergrund produziert, der sich von dem von Aspergillus unterscheidet und Enzyme, wichtig z.B. bei Futteranwendungen, enthält. Das Molekulargewicht des in Trichoderma produzierten Aspergillus-Phytaseproteins ist unterschiedlich zu dem aus Aspergillus. Dieser Größenunterschied, der auf unterschiedlicher Glykosylierung zu beruhen schien, beeinträchtigte die Enzymaktivität jedoch nicht.
BEISPIEL 7
Produktion von Aspergillus niger pH 2,5-saurer Phosphatase in Trichoderma reesei
I. EXPERIMENTELLE PROTOKOLLE
1. Stämme und Plasmide
E. coli-Stämme XL1-Blue (Bullock, W. O., et al., Biotechniques 5: 376–379 (1987); Stratagene, La Jolla, CA, USA) und Sure^TM (Greener, A., Strategies 3: 5–6 (1990); Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurden als Wirte für von den Plasmiden pALK601 (12 und 13) und pAP-1 (12 und 13) angefertigte Konstruktionen verwendet. Das Plasmid pALK601 enthält die T. reesei-cbh1-Promotor- und -Terminator-Sequenzen und das Aspergillus nidulans-Acetamidase-Gen. Das Plasmid pAP-1 enthält das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen aus Aspergillus niger var. awamori ALKO 243 (ATCC 38854).
Trichoderma reesei-Stamm ALKO 2221, eine Niedrig-Aspartylprotease-Mutante, abgeleitet von dem T. reesei-Stamm ALKO 233 (VTT-D-79125) durch UV-Mutagenese, wurde als ein Empfänger für das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen verwendet.
2. Wachstumsmedien und Kulturbedingungen
E. coli-Stämme wurden in L-Nährlösung (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)), ergänzt mit Ampicillin (50 μg/ml), wenn erforderlich, kultiviert. E. coli-Kultivierungen wurden bei 37°C über Nacht durchgeführt.
PD-Agar-Schrägen ("Kartoffel-Dextrose"-Brühe von Difco, Detroit, Michigan, USA) wurden zum Lagern der Trichoderma-Stämme verwendet. Die Platten und Medien für T. reesei-Transformationen waren im Wesentlichen wie in Penttilä et al. (Penttilä, M., et al., Gene 61: 155–164 (1987)). Die Transformanten wurden auf selektivem Acetamid-CsCl-Medium (Penttilä, M., et al., Gene 61: 155–164 (1987)) gereinigt, bevor sie auf PD-Schrägen transferiert wurden. T. reesei-Transformanten wurden in auf Lactose-basierendem Medium (siehe Beispiel 6, Unterparagraph 2) bei 30°C (250 Upm) 7 Tage lang zur Expression von pH 2,5-saurer Phosphatase unter der Kontrolle des cbh1-Promotors kultiviert.
3. Manipulation von DNA
Manipulationen von DNA wurden wie oben für Phytase beschrieben, hauptsächlich durch Standardverfahren (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)), durchgeführt. Plasmid-DNA aus E. coli wurde durch Verwendung von Qiagen-Säulen (Diagen GmbH, Düsseldorf, BRD) gemäß den Instruktionen des Anbieters isoliert. Durch schnelles Screening der Plasmid-DNA aus E. coli wurde das Verfahren von Holmes und Quigley (Holmes und Quigley, Anal. Biochem. 114: 193–197 (1981)) verwendet. Die/das bei den DNA-Manipulationen verwendete(n) Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und T4-DNA-Polymerase, waren von Boehringer (Mannheim, BRD) und New England Biolabs (Beverly, MA, USA). Jedes Enzym wurde gemäß der Empfehlung des Anbieters verwendet. DNA-Fragmente für das Klonieren oder für Transformationen wurden aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) durch das Gefrier-Tau-Phenol-Verfahren (Benson, S. A., Bio/Techniques 2: 66–68 (1984)) oder unter Verwendung des Mermaid^TM-Kits (BIO 101 Inc., La Jolla, CA, USA) gemäß der Instruktionen des Anbieters durchgeführt.
Das Sequenzieren der Fusionen zwischen dem cbh1-Promotor und dem pH 2,5-saure Phosphatase-Gen wurde mit pUC/M13-Primern und Verlängerungsprimern unter Verwendung des des Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing-Kit (Applied Biosystems) und des automatisierten Sequenzanalysators (Applied Biosystems 373A, Foster City, CA, USA) durchgeführt.
Die verwendeten Oligonucleotide wurden von einem Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)-381A-Synthesizer, mit Ausnahme der M13-Primer, die von Applied Biosystems erworben wurden, synthetisiert.
4. Transformationen
Transformationen wurden auch wie oben für Phytase beschrieben durchgeführt. Transformation von E. coli-Stämmen XL1-Blue oder Sure wurde durch das Verfahren des Anbieters (Stratagene La Jolla, CA, USA) durchgeführt, T. reesei-Stämme wurden im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Penttilä et al. (Penttilä, M., et al., Gene 61: 155–164 (1987)) transformiert. Das bei der Pilzprotoplasten-Präparation für Transformationen verwendete Novozym 234 war von Novo Industri AS (Kopenhagen, Dänemark). Vor dem Sporulieren auf PD-Schrägen wurden T. reesei-Transformanten auf dem selektiven Acetamid-Medium durch Konidien gereinigt.
5. Enzymaktivitäts-Assays
Für die Enzym-Assays wurde das Mycel von dem Kulturmedium durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 3000 UpM (Sorvall SS-34, Dupont Company, Wilmington, Delaware, USA) abgetrennt. Die Enzymaktivität von pH 2,5-saurer Phosphatase wurde von dem Kulturüberstand unter Verwendung von para-Nitrophenylphosphat (Sigma, St. Louis, USA) als ein Substrat, wie früher beschrieben, gemessen. Eine Aktivitätseinheit von pH 2,5-saurer Phosphatase setzt 1 nmol anorganisches Phosphat pro Minute bei dem Substrat p-Nitrophenylphosphat in pH 2,5 bei 37°C frei. Eine normalisierte saure Phosphatase-Einheit (APNU, "acid phosphatase normalized unit") ist als die Menge von saurer Phosphatase-Aktivität definiert, die von dem A. niger ALKO 243-Stamm unter den verwendeten Kultivierungsbedingungen produziert wird (siehe Beispiel 6, Unterparagraph 2).
Amyloglucosidase-Aktivität (AGU) wurde durch Verwendung von 1% Zulkowsky-Stärke (Merck) als ein Substrat und Messen der Menge der freigesetzten Glucose-Einheiten durch Kochen mit DNS-Reagens (siehe unten) nach 10-minütiger Reaktion bei 60°C bei pH 4,8 gemessen. Proteasen (HUT) wurden wie in Food Chemicals Codex (Food Chemicals Codex, National Academy Press, Washington, DC, USA, S. 496–497 (1981)) bei pH 4,7 unter Verwendung von 2% Hämoglobin (Sigma) als ein Substrat gemessen. Endoglucanase (ECU)- und Cellobiohydrolase (FPU)-Aktivitäten wurden wie in IUPAC's "Measurement of Cellulase Activities (IUPAC Commission on Biotechnology, Measurement of Cellulase Activities, Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, Delhi, Indien, S. 5–7 und 10–11 (1981)) gemessen. 1% Hydroxyethylcellulose (Fluka AG) in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 4,8) und Whatman Nr. 1-Papier wurden jeweils als Substrate verwendet. Verwendete DNS unterschied sich von der bei IUPAC's Measurement of cellulase activities (IUPAC Commission on Biotechnology, Measurement of Cellulase Activities, Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, Delhi, India, Indien, S. 5–7 und 10–11 (1984) Beschriebenen und wurde hergestellt, indem zuerst 50,0 g 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure (Merck) in 41 deionisiertem Wasser verdünnt wurden. Dann wurden 80,0 g NaOH langsam unter Verwendung des Magnetrührers zugegeben, und 1500 g K-Na-Tartrat (Merck) wurden zugegeben und durch Erwärmen der Lösung (Maximaltemperatur 45°C) verdünnt. Das Gesamtvolumen wurde auf 5 1 eingestellt, die Lösung wurde durch Whatman Nr. 1 filtriert und gegen Licht geschützt.
6. SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot-Analyse wurden nach den Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K., Nature 227: 680–685 (1970)) und Towbin et al. (Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–4354 (1979)) durchgeführt. Die Visualisierung des pH 2,5-saure Phosphatase-Proteins in Western-Blots wurde unter Verwendung des polyklonalen Kaninchen-Antiserums KH1269 durchgeführt. KH1269 wurde gegen gereinigtes, deglykosyliertes pH 2,5-saure Phosphatase-Protein angefertigt (M. Turunen, Alko Ltd.) und wurde von dem National Public Health Institute (Helsinki, Finnland) geliefert. Visualisierung des CBHI-Proteins aus den pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten in Western-Blots wurde durch Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers CI-261 (Aho, S., et al., Eur. J. Biochem 200: 643–649 (1991)) durchgeführt. Anti-Kaninchen-IgG- und Anti-Maus-IgG-alkalisches Phosphat-Konjugat und Farbentwicklungssubstrate von ProtoBlot^TM Immunoblotting-System (Promega, Madison, USA) wurden verwendet, um die Immunkomplexe zu detektieren.
7. PCR
Die PCR-Reaktionen wurden von einem Techne-PHC-2-Thermo-Cycler (Techne Ltd., Cambridge, UK) in 100 μl Volumina bewerkstelligt. Das Reaktionsgemisch enthielt 0,2 mM von jedem dNTP (Pharmacia, pH 8,3), 20–50 pmol von jedem Primer und 10 mg Plasmidmatrize in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 100 μg/ml Gelatine. Das verwendete Protokoll war das Folgende: 96°C/10 min vor Zugeben der Taq-DNA-Polymerase (2 Units, Boehringer Mannheim, BRD) und 100 μl Paraffinöl, Denaturierung 95°C/1 min, Anlagerung ("annealing") 60°C/1 min, Erweiterung ("extension") 72°C/1 min, 30 Zyklen lang. Die letzte Erweiterungszeit war 9 min, um die Vervollständigung der Strangsynthese zu gewährleisten. Die PCR-Fragmente wurden durch den Mermaid^TM-Kit gereinigt. Die Enden der Fragmente wurden unter Verwendung des DNA-Polymerase I-Klenow-Fragments aufgefüllt.
II. ERGEBNISSE
A. Vektorkonstruktionen zur Überexpression des pH 2,5-saure Phosphatase-Gens in Trichoderma reesei ALKO 2221
1. Konstruktion von Plasmid pALK533
Das Plasmid pALK533 besteht aus dem Aspergillus niger var. awamori ALKO 243-pH 2,5-saure Phosphatase-Gen mit seiner eigenen Signal-Sequenz, eingefügt in die Trichoderma reesei-Expressionskassette, enthaltend die cbh1-Promotor- und -Terminator-Sequenzen. pALK533 enthält außerdem das Aspergillus nidulans amdSK-Gen als einen Selektionsmarker für Transformanten.
Die präzise Fusion zwischen dem cbh1-Promotor und der pH 2,5-saure Phosphatase-Signal-Sequenz wurde mit PCR durchgeführt. Die für die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind in 11 gezeigt. Die SacII-Stelle in dem cbh1-Promotor-Bereich wurde bei dem 5'-Primer verwendet, und die MluI-Stelle des saure Phosphatase-Gens (374 Nucleotide abwärts von dem N-Terminalen des saure Phosphatase-Gens) wurde bei dem 3'-Primer verwendet. Der 5'-Primer war ein 39-mer, enthaltend einen "tail" von 19 Nucleotiden der cbh1-Promotor-Sequenz, die der Signal-Sequenz vorangeht, der exakt an die ersten 20 Nucleotide der saure Phosphatase-Signal-Sequenz angrenzt. Der 3'-Primer war ein 30-mer des pH 2,5-saure Phosphatase-Gens. pAP-1 (12) wurde bei den PCR-Reaktionen als eine Matrize verwendet. Ein Fragment der erwarteten Länge von 466 bps wurde von der PCR-Reaktion erhalten.
Das PCR-Fragment von 466 bp, enthaltend die pH 2,5-saure Phosphatase-Signal-Sequenz, wurde mit MluI verdaut und an pAP-1 ligiert, das mit HindIII verdaut, mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment behandelt und mit MluI verdaut worden war, um Plasmid p102 zu erhalten (15). Die Fusion und das PCR-Fragment wurden sequenziert, um zu gewährleisten, dass bei der PCR-Amplifikation keine Fehler aufgetaucht waren.
Um Plasmid pALK533 (12) zu konstruieren, wurde ein pH 2,5-saure Phosphatase-Gen, enthaltend die Fusion aus dem Plasmid p102, als ein SphI (aufgefüllt mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment)-SacII-Fragment isoliert, und zwischen dem cbh1-Promotor und -Terminator des Plasmids pALK601(ΔNdeI) eingefügt, welches mit NdeI (aufgefüllt mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment) und SacII verdaut worden war. In pALK601(ΔNdeI) wird die NdeI-Stelle in dem Intron-Bereich des amdS-Gens in pALK601 unter Verwendung des DNA-Polymerase I-Klenow-Fragments inaktiviert. Das für Transformationen verwendete lineare Fragment wurde aus dem Vektorrückgrat mit XbaI heraus verdaut.
2. Konstruktion des Plasmids pALK532
Das Plasmid pALK532 besteht aus dem Aspergillus niger var. awamori ALKO 243-2,5-saure Phosphatase-Gen, eingefügt in die Trichoderma reesei-CBHI-Expressionskassette, enthaltend die cbh1-Promotor- und -Signal-Sequenz und -Terminator-Sequenzen. pALK532 enthält außerdem das Aspergillus nidulans amdS-Gen als einen Selektionsmarker für Transformanten.
Die präzise Fusion zwischen der cbh1-Signal-Sequenz und dem pH 2,5-saure Phosphatase-Gen wurde mit PCR durchgeführt. Die für die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind in 11 gezeigt. Die SfiI-Stelle in der cbh1-Signal-Sequenz wurde bei dem 5'-Primer verwendet. Der 5'-Primer war ein 46-mer, enthaltend einen "tail" von 28 Nucleotiden, die exakt an die ersten 18 Nucleotide der N-terminalen Sequenz von saurer Phosphatase angrenzen. Der 3'-Primer war dasselbe 30-mer, das bei der Konstruktion von pALK533 verwendet wurde. pAP-1 wurde bei der PCR-Reaktion als eine Matrize verwendet. Von der PCR-Reaktion wurde ein Fragment der erwarteten Länge von 418 bps erhalten.
Das PCR-Fragment von 418 bp, enthaltend die cbh1-Signal-Sequenz, wurde mit MluI verdaut und an pAP-1 ligiert, das mit HindIII verdaut, mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment behandelt und mit MluI verdaut worden war, um Plasmid p51 zu erhalten (13). Die Fusion und das PCR-Fragment wurden sequenziert, um zu gewährleisten, dass bei der PCR-Amplifikation keine Fehler erfolgt waren. Um das Plasmid pALK532 (13) zu konstruieren, wurde ein pH 2,5-saure Phosphatase-Fragment, enthaltend die Fusion aus dem Plasmid p51 als ein SphI (aufgefüllt mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment)-SfiI-Fragment, isoliert und wurde zwischen den cbh1-Promotor- und -Terminator-Bereichen des Plasmids pALK601(ΔNdeI) eingefügt. pALK601(ΔNdeI) war mit NdeI verdaut worden und mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment aufgefüllt und mit SfiI verdaut worden. Das lineare Fragment von ungefähr 7,8 kb, das keine bakteriellen Sequenzen enthielt, wurde aus pALK532 durch Restriktions-Verdau mit XbaI isoliert und wurde für Transformationen verwendet.
B. Transformation von Trichoderma reesei und Durchmustern der Transformanten
Trichoderma reesei ALKO 2221 wurde separat mit den linearen XbaI-Fragmenten von dem Plasmid pALK532 und pALK533 transformiert. Transformationshäufigkeiten (Transformanten/μg DNA) variierten von 2 bis 30.
Vierundvierzig T. reesei ALKO 2221/pALK532-Transformanten und 103 pALK533-Transformanten wurden durch Konidien gereinigt und wurden in Schüttelkolben kultiviert.
C. pH 2,5-saure Phosphatase-Produktion durch die Trichoderma-Transformanten
Die besten Transformanten, basierend auf der pH 2,5-saure Phosphatase-Produktion, sind in der Tabelle 10 gezeigt. Der beste Enzymaktivitätslevel war 240 APNU in Schüttelkolbenkultivierung in auf Lactose-basierendem Medium.
Sowohl die saure Phosphatase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz funktionierten gleich gut, und es konnten etwa dieselben Level an pH 2,5-saurer Phosphatase-Aktivität erreicht werden. Der beste pH 2,5-saure Phosphatase-Aktivitätslevel wurde von Trichoderma-Transformante SC-9 produziert und war etwa 250-fach größer als die Level, produziert durch den nativen Aspergillus niger var. awamori ALKO 243-Stamm in entsprechenden Bedingungen.
Zwei von den neuen besten Produzierern reagierten nicht mit dem monoklonalen CBHI-Antikörper bei der Western-Blot-Analyse, was nahe legt, dass sich die Expressionskassette bei jenen zwei Transformanten in den cbh1-Locus integriert hatte (Tabelle 10).
D. Der Enzymhintergrund in den pH 2,5-saure Phosphatase-Präparationen, hergestellt von T. reesei
Die pH 2,5-saure Phosphatase wird in den T. reesei-Transformanten in hohen Mengen exprimiert, und der Hintergrund einiger anderer Enzymaktivitäten in den Überständen von T. reesei-Transformanten ist unterschiedlich von jenen im Aspergillus-Überstand (Tabelle 10). Sowohl Endoglucanase- als auch Cellobiohydrolase-Aktivitäten sind signifikant höher, wenn T. reesei als ein Produktionswirt verwendet wird. Die T. reesei-Transformanten produzierten außerdem verhältnismäßig weniger Glucoamylase-Aktivität als der A. niger ALKO 243-Stamm.
E. Identifikation der pH 2,5-saure Phosphatase, hergestellt durch die Trichoderma-Transformanten
Proben von den Wachstumsmedien der Transformanten und dem T. reesei ALKO 2221-Stamm wurden im Western-Blot analysiert (14). Die folgenden Proben wurden analysiert: 10 ng von gereinigter Aspergillus ALKO 243-pH 2,5-saurer Phosphatase; 10 ng von endoF-behandelter Aspergillus ALKO 243-pH 2,5-saurer Phosphatase; und 60 ng Protein von jedem der Kulturüberstände von Trichoderma reesei ALKO 2221-Transformanten SC-9, KA-31, KB-44, KB-18, SB-4 und KA-28 (14).
Die von T. reesei-Transformanten sezernierte pH 2,5-saure Phosphatase wurde als vier Proteinbanden der Größen von etwa 50–66 kD gesehen. Dies beruht wahrscheinlich auf dem unterschiedlichen Level an Glykosylierung des Proteinanteils der sezernierten pH 2,5-saure Phosphatase. Verglichen mit der Größe der pH 2,5-saure Phosphatase, hergestellt durch den Aspergillus niger var. awamori ALKO 243-Stamm (66 kD), ist die Mehrheit der pH 2,5-saure Phosphatase-Proteine, hergestellt von T. reesei, kleiner als die von Aspergillus Hergestellten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Erhalten einer Zusammensetzung, die ein Phytat-abbauendes Enzym und wenigstens ein Trichoderma-Enzym, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus einer β-Glucan-abbauenden Aktivität, CBHI, CBHII, EGI und EGII, umfasst, das die Schritte (a) Herstellen eines rekombinanten Konstrukts, das ein Gen kodierend ein Phytat-abbauendes Enzym, ausgewählt aus Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase, wobei die Phytase die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8 aufweist, oder wobei die pH 2,5-saure Phosphatase die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, und eine mit dem Gen funktionell verknüpfte Signalsequenz enthält; (b) Transformieren eines Trichoderma reesei-Wirts mit dem Konstrukt; (c) Kultivieren des transformierten Trichoderma reesei-Wirts unter für den Trichoderma reesei-Wirt und für Expression des Phytat-abbauenden Enzyms geeigneten Bedingungen; (d) und Entfernen des Myzels aus dem Kulturmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Konstrukt dem Wirt in einer linearen Form zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Konstrukt dem Wirt in einer ringförmigen Plasmidform zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der linearen Form bakterielle Sequenzen fehlen.