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Der
mesophile filamentöse
Pilz Trichoderma reesei ist beim Sezernieren von Cellulaseenzymen
in das Wachstumsmedium sehr effizient. Bei optimierten Kultivierungsbedingungen
ist von Mengen von bis zu 40 g/l extrazellulärer Cellulase berichtet worden
(Durand et al., Enzyme Microb. Technol. 10: 341–346 (1988); Durand et al.
in Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Academic
Press, 1988, S. 135–151).
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Die
Entwicklung von Transformationssystemen für T. reesei (Knowles et al.,
EP 244 234 ; Penttilä et al.,
Gene 61: 155–164
(1987); Berka et al.,
EP 215 594 )
hat die Anwendung gentechnischer Verfahren auf den Pilz möglich gemacht.
Durch Gentechnik sind die Produktionsprofile verschiedener Cellulaseenzyme
moduliert worden, z.B. um Stämme
mit verbesserten Leveln des Endoglucanase I-Enzyms zu ergeben. Der
starke cbh1-Promotor ist angewendet worden, um Endoglucanase-Expression
zu fördern
(Nevalainen et al., "The
molecular biology of Trichoderma and its application to the expression
of both homologous and heterologous genes", in Molecular Industrial Mycology,
Leong und Berka, Hrsg., Marcel Dekker Inc., New York, S. 129–148 (1991);
und Harkki, A. et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227–233 (1991)).
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Zusätzlich zum
Maßschneidern
der Produktionsprofile homologer Proteine ist das Produktionspotential
von T. reesei nutzbar gemacht worden, um verschiedene heterologe
Proteine in dem Pilz zu exprimieren. Bislang sind es wenige Beispiele
und diese schließen
z.B. Kälberchymosin
(Knowles et al.,
EP 244 234 ;
Berka et al.,
EP 215 594 ;
Harkki, A. et al., Bio/Technol. 7: 596–603 (1989); Uusitalo, J. M.
et al., J. Biotechnol. 17: 35–50
(1991)), CBH1-Fab-Fusionsantikörper,
erzeugt gegen 2-Phenyloxazolon (Nyyssönen et al., WO92/01797), und
ein ligninolytisches Pilzenzym (Saloheimo, M. und Niku-Paavola,
M.-L., Bio/Technol. 9: 987–990
(1991)) ein. Für
verbesserte Expression ist das gewünschte Gen in eine cbh1-Expressionskassette eingefügt worden
und in T. reesei durch Protoplastentransformation eingeführt worden
(Harkki, A. et al., Bio/Technol. 7: 596–603 (1989); Nyyssönen et al.,
WO92/01797; Saloheimo, M. und Niku-Paavola, M.-L., Bio/Technol. 9: 987–990 (1991)).
Obwohl heterologe Promotoren filamentöser Pilze, wie z.B. Aspergillus amdS,
-argB und -Glucoamylase (GA), in T. reesei wenigstens in einem gewissen
Ausmaß funktionieren
können
(Penttilä et
al., Gene 61: 155–164
(1987); Knowles et al.,
EP 244
234 ), erfordert effiziente Expression die Verwendung eines
homologen Promotors. Des Weiteren sind in manchen Fällen durch
Herstellen des gewünschten
Genprodukts als ein Fusionsprotein bessere Ausbeuten erhalten worden
(Harkki, A. et al., Bio/Technol. 7: 596–603 (1989); Nyyssönen et al.,
WO92/01797). Die Ausbeuten heterologer Proteine, erhalten von T.
reesei, haben zwischen 10–150
mg/l variiert.
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Phytat,
eine Speicherform von Phosphor in Pflanzensamen, ist Teil der menschlichen
und Tier-Ernährung.
Phytat-Phosphor ist monogastrischen Tieren ("monogastrics") schlecht verfügbar, weil es Komplexe mit multivalenten
Metallionen ausbildet und an Proteine bindet.
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Folglich
ist der Abbau von Phytat von Interesse. Die Pflanzenphytin-abbauenden
Enzyme Phytase und saure Phosphatase für die Umwandlung von Phytat
in Inositol und anorganischen Phosphor werden z.B. von Bakterien
(Powar, V. K. und Jagannathan, V. J., J. Bacteriol. 15: 1102–1108 (1982);
Cosgrove, D. J., Aust. J. Biol. Sci. 23: 1207–1220 (1970), und Cosgrove,
D. J. et al., Aust. J. Biol. Sci. 23: 339–343 (1970); Hefen (Nayini,
N. R. und Markakis, P., Lebensmittel Wissenschaft und Technologie,
17: 24–26
(1984)) und filamentösen Pilzen
bzw. Fadenpilzen, umfassend verschiedene Aspergillus-Arten, wie
z.B. A. terreus (Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 32: 1275–1282 (1968),
A, ficuum (Gibson, D. M., Biotechnol. Lett. 9: 305–310 (1987),
und A. niger (Shieh, T. R. und Ware, J. H., Appl. Microbiol. 16:
1348–1351
(1968)), hergestellt. Für
vollständigen
Abbau von Pflanzenphytin sind sowohl Phytase als auch pH 2,5-saure Phosphatase
erforderlich.
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Industrielle
Anwendungen sind mit bemerkenswert höheren Produktionsausbeuten
als die von den natürlichen
gemeldeten Stämmen
hergestellten Mengen verbunden. Das für Phytase codierende Gen ist
kürzlich aus
A. ficuum isoliert und charakterisiert worden (Van Gorcom et al.,
EP 420 358 oder WO91/05053),
und die Produktion von Phytase ist in A. niger durch Vergrößern der
Kopienzahl des Gens in einer Expressionskassette, enthaltend einen
starken homologen Aspergillus-Promotor, z.B. GA (Van Gorcom et al.,
EP 420 358 oder WO91/05053),
verbessert worden. Ein für
saure Phosphatase codierendes Gen ist aus A. niger isoliert und charakterisiert
worden (MacRae et al., Gene 71: 339–348 (1988)).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Das
Bedürfnis
nach besseren Produktionsverfahren für Phytase und pH 2,5-saure
Phosphatase und nach Zusammensetzungen, enthaltend dieselben, erkennend,
haben die Erfinder hocheffiziente Verfahren für die rekombinante Herstellung
davon entwickelt.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zum Erhalten einer Zusammensetzung bereitgestellt, die
ein Phytat-abbauendes Enzym und wenigstens ein Trichoderma-Enzym,
ausgewählt
aus einer Gruppe, bestehend aus einer β-Glucan-abbauenden Aktivität, CBHI,
CBHII, EGI und EGII, umfasst, das die Schritte:
- a)
Herstellen eines rekombinanten Konstrukts, das ein Gen, codierend
ein Phytat-abbauendes Enzym, ausgewählt aus Phytase und pH 2,5-saurer
Phosphatase, wobei die Phytase die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:
8 aufweist, oder wobei die pH 2,5-saure Phosphatase die Aminosäure-Sequenz
von SEQ ID NO: 2 aufweist, und eine mit dem Gen funktionell verknüpfte Signal-Sequenz
enthält;
- b) Transformieren eines Trichoderma reesei-Wirts mit dem Konstrukt;
- c) Kultivieren des transformierten Trichoderma reesei-Wirts
unter für
den Trichoderma reesei-Wirt und für Expression des Phytat-abbauenden
Enzyms geeigneten Bedingungen;
- d) und Entfernen des Mycels aus dem Kulturmedium
umfasst.
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Es
wird ferner die Verwendung derartiger Zusammensetzungen bei Futter
und andere derartige Verfahren, umfassend Nahrungsmittelzusammensetzungen,
insbesondere für
Tiere, bereitgestellt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1.
Sequenz von Peptid #816 ([SEQ ID NO:57:]), Oligo PHY-31 ([SEQ ID
NO:64:]), Peptid #1110 ([SEQ ID NO:62:]), Oligo PHY-34 ([SEQ ID
NO:65:]) und Oligo PHY-35 ([SEQ ID NO:52:]). Das pH 2,5-saure Phosphatase-Oligonucleotid
PHY-31 ist ein Gemisch von 17meren mit 64facher Degeneriertheit
und einem einzelnen Inosin. Peptid #816 stammt aus einem Endoproteinase
Lys-C-Verdau von gereinigter, nativer, saurer Phosphatase. PHY-34
ist ein Gemisch von 17meren mit 128facher Degeneriertheit. PHY-35
ist ein Gemisch von 17meren mit 64facher Degeneriertheit. Sowohl
PHY-34 als auch PHY-35 sind für
vollständige
Repräsentation
von Peptid #1110 notwendig. Peptid #1110 stammt von einem Trypsin-Verdau von gereinigter,
nativer, saurer Phosphatase.
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2. Nucleotid-Sequenz aus dem SphI-Fragment
mit 2,1 kb, enthaltend das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen [SEQ ID
NO:1:] mit abgeleiteter Aminosäuretranslation
[SEQ ID NO:2:]. Die Intron-Donor-, Lasso- und Akzeptor-Sequenz,
wie durch cDNA-Sequenzieren bestimmt, sind überstrichen. Die Nucleotid-Sequenz, korrespondierend
zu Peptiden #816 ([SEQ ID NO:57:]) und #1110 ([SEQ ID NO:62:]),
ist unterstrichen. Die genomische Nucleotid-Sequenz wurde durch das M13-Didesoxyverfahren
(Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977))
unter Verwendung des United States Biochemical Sequencase II-Kit bestimmt.
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3.
Die Aminosäure-Sequenzen
der tryptischen Phytasepeptide #792 [SEQ ID NO:43:] und #420 [SEQ
ID NO:23:] und die abgeleiteten Oligonucleotide [SEQ ID NO:3:, :3:,
:5: und :6:], verwendet bei der Herstellung der Phytase-Sonde durch
verschachtelte ("nested") PCR-Amplifikation.
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4.
Plasmid pALK169. Die Karte von pALK169, enthaltend das SphI-Insert
von 2,4 kb und zeigend die Restriktionskarte des Inserts. Die Lage
des Phytase-Gens ist durch einen Pfeil angezeigt. Die Hybridisierungsstelle
in der Phytase-Sequenz für
das PCR-Fragment von 350 bp ist durch eine verstärkte Linie angezeigt.
-
5.
Die Nucleotid-Sequenz des Phytase-Gens. [SEQ ID NO:7: (DNA) und
:8: (Aminosäure)].
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6.
Die PCR-Primer, verwendet zur Herstellung der cbh1-Phytase-Fusionsfragmente
[SEQ ID NO:9: und :10: und :11: und :12:].
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7.
Konstruktion von pALK171. Das Phytase-Gen mit seiner eigenen Signal-Sequenz wurde an den
cbh1-Promotor fusioniert. Nur die relevanten Restriktionsstellen
sind gezeigt.
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8.
Konstruktion von pALK172. Das Phytase-Gen wurde an die cbh1-Signal-Sequenz fusioniert. Nur
die relevanten Restriktionsstellen sind gezeigt.
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9.
Plasmide pALK173A und pALK173B. Die Karten des Plasmids, enthaltend
das Phytase-Gen mit seinem eigenen Promotor und den Selektionsmarker,
amdS-Gen, sind gezeigt. In dem Plasmid pALK173A ist die transkriptionale
Orientierung des Phytase- und amdS-Gens die gleiche; und in dem
Plasmid pALK173B ist die transkriptionale Orientierung dieser zwei
Gene einander entgegengesetzt.
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10. Western-Blots der Proben aus den Kulturüberständen von
den Trichoderma-Wirtsstämmen und
-Transformanten, die Phytase produzieren. Spur 1: 50 ng gereinigter
Aspergillus ALKO 243-Phytase; Spur 2: 15 ng endoF-behandelter Aspergillus
ALKO 243-Phytase;
Spuren 3 und 10: T. reesei ALKO 233; Spuren 4–5 und 11–12: T. reesei ALKO 233-Transformante 171FR/A4
bzw. A13; Spuren 6 und 13: T. reesei ALKO 2221; Spuren 7–8 und 14–15: T.
reesei ALKO 2221-Transformante 171FR/A5 bzw. A9; Spur 9: T. reesei
ALKO 2221-Transformante D2; Spur 16: T. reesei ATCC 56765; Spuren
17, 18, 19: T. reesei ATCC 56765-Transformanten 171FR/A21, A11 bzw.
A23. In jedem Fall wurden 2 μl
einer 1:10-Verdünnung des
Kulturüberstands
in einem Gel laufen gelassen. 171FR: der Wirt, transformiert mit
dem XbaI-Fragment aus dem Plasmid pALK171.
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11. Die zum Herstellen des cbh1-pH 2,5-saure Phosphatase-Fusionsfragments
[SEQ ID NOS:13: und :14: und :15:] verwendeten PCR-Primer.
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12. Konstruktion des Plasmids pALK533. Das pH
2,5-saure Phosphatase-Gen
mit seiner eigenen Signal-Sequenz wurde an den cbh1-Promotor fusioniert.
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13. Konstruktion des Plasmids pALK532. Das pH
2,5-saure Phosphatase-Gen
wurde an die/den cbh1-Signal-Sequenz und -Promotor fusioniert.
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14. Western-Blot der Trichoderma-Transformanten,
die pH 2,5-saure Phosphatase herstellen. Spur 1: 10 ng gereinigter
Aspergillus ALKO 243-pH 2,5-saure Phosphatase; Spur 2: 10 ng von
endoF-behandelter Aspergillus ALKO 243-pH 2,5-saurer Phosphatase;
und Spuren 3–9:
60 ng Protein von jedem der Kulturüberstände von Trichoderma reesei
ALKO 2221-Transformanten SC-9, KA-31, KA-17, KB-44, KB-18, SB-4 bzw.
KA-28.
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I. DEFINITIONEN
-
In
der folgenden Beschreibung wird eine Anzahl von in der rekombinanten
DNA (rDNA)-Technologie verwendeten Ausdrücke ausführlich verwendet. Um ein klares
und konsistentes Verständnis
der Beschreibung und Ansprüche,
einschließlich
des Umfangs, der solchen Ausdrücken
gegeben werden soll, bereitzustellen, werden die folgenden Definitionen
bereitgestellt.
-
Gen.
Eine DNA-Sequenz, enthaltend eine Matrize für eine RNA-Polymerase. Die
von einem Gen transkribierte RNA kann oder kann nicht für ein Protein
codieren. RNA, die für
ein Protein codiert, wird Messenger-RNA (mRNA) genannt und wird
in Eukaryoten von RNA-Polymerase
II transkribiert. Ein Gen, enthaltend eine RNA-Polymerase II-Matrize
(als ein Er gebnis eines RNA-Polymerase II-Promotors), wobei eine
RNA-Sequenz transkribiert wird, die eine Sequenz, komplementär zu der
einer speziellen mRNA aufweist, aber normalerweise nicht translatiert
wird, kann auch konstruiert werden. So ein Genkonstrukt wird hierin
als ein "Antisense-RNA-Gen" bezeichnet, und
solch ein RNA-Transkript wird als eine "Antisense-RNA" bezeichnet. Antisense-RNAs sind, aufgrund
der Anwesenheit translationaler Stop-Kodons in der Antisense-RNA-Sequenz, normalerweise
nicht translatierbar.
-
Ein "komplementäres DNA"- oder "cDNA"-Gen schließt rekombinante
Gene ein, die beispielsweise durch Umkehrtranskription von mRNA
synthetisiert werden, und denen folglich dazwischenliegende Sequenzen
(Introns) fehlen. Genklone von genomischer DNA können Introns enthalten oder
nicht.
-
Klonierungsvehikel.
Eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenzen, die in
der Lage ist, genetische Information, speziell DNA, in eine Wirtszelle
zu tragen. Ein Klonierungsvehikel wird oft durch eine oder eine
kleine Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstelle(n)
charakterisiert, an der/denen derartige DNA-Sequenzen auf vorherbestimmbare
Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des
Vehikels geschnitten werden können,
und in die eine gewünschte
DNA gespleißt
werden kann, um deren Klonieren in die Wirtszelle zu bewirken. Das
Klonierungsvehikel kann ferner einen Marker enthalten, geeignet
für eine Verwendung
bei der Identifikation von Zellen, die mit dem Klonierungsvehikel
transformiert sind und Replikationsursprünge enthalten, die die Aufrechterhaltung
und Replikation des Vehikels in einem oder mehreren prokaryotischen
oder eukaryotischen Wirt(en) ermöglichen.
Marker sind beispielsweise Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Das Wort "Vektor" wird manchmal anstelle
von "Klonierungsvehikel" verwendet. Ein "Plasmid" ist ein Klonierungsvehikel,
im Allgemeinen zirkuläre
DNA, die in wenigstens einer Wirtszelle aufrecht erhalten wird und
darin autonom repliziert.
-
Expressionsvehikel.
Ein Vehikel oder Vektor, ähnlich
zu einem Klonierungsvehikel, das/der aber die Expression eines Gens,
das in dieses/diesen hineinkloniert worden ist, nach Transformation
in einen Wirt unterstützt.
Das klonierte Gen wird gewöhnlich
unter die Kontrolle von gewissen Kontroll-Sequenzen (d.h., es wird
funktionell mit diesen verknüpft)
platziert, wie z.B. Promotor-Sequenzen, die durch das Vehikel oder
durch die rekombinante Konstruktion des klonierten Gens bereitgestellt
werden können.
Expressionskontroll-Sequenzen werden, abhängig davon, ob der Vektor entworfen
ist, um das funktionell verknüpfte
Gen in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt zu exprimieren,
variieren und können
zusätzlich
Transkriptionselemente, wie z.B. Enhancer-Elemente (stromaufwärts liegende
Aktivierungs-Sequenzen, "upstream activation sequences") und Terminations-Sequenzen,
und/oder Translations-Start- und -Terminationsstellen enthalten.
-
Wirt.
Ein Wirt ist eine Zelle, prokaryotisch oder eukaryotisch, die als
der Empfänger
und Träger
von rekombinantem Material verwendet wird.
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Eukaryotischer
Wirt. Ein "eukaryotischer
Wirt" kann eine
beliebige Zelle von einem eukaryotischen Organismus, einschließlich beispielsweise
Tier, Pflanze, Pilz und Hefe, sein.
-
Erfindungsgemäßer Wirt.
Der "erfindungsgemäße Wirt" ist ein Trichoderma
reesei-Wirt, der
konstruiert worden ist, um rekombinante Phytase und/oder pH 2,5-saure
Phosphatase gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
zu produzieren.
-
Funktionales
Derivat. Ein "funktionales
Derivat" eines Proteins
oder einer Nucleinsäure
ist ein Molekül, das
chemisch oder biochemisch abgeleitet ist von (erhalten ist von)
so einem Protein oder so einer Nucleinsäure und welches eine biologische
Aktivität
(entweder funktional oder strukturell) beibehält, die ein Charakteristikum
des nativen Proteins oder der nativen Nucleinsäure ist. Eine "Mutante" eines Proteins oder
einer Nucleinsäure
ist ein biochemisches oder chemisches Derivat von so einem Protein
oder so einer Nucleinsäure. Es
ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "funktionales Derivat" "Mutanten", "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemische Derivate" eines Moleküls einschließt, die
eine gewünschte
Aktivität
des nativen Moleküls
beibehalten.
-
Wie
hierin verwendet, sagt man, dass ein Molekül ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls ist, wenn es zusätzliche
chemische Anteile ("moieties") enthält, die
normalerweise kein Teil des Moleküls sind. Solche Anteile können die
Löslichkeit,
Absorption, Halbwertszeit, etc., des Moleküls verbessern. Die Anteile können die
Toxizität
des Moleküls
verringern oder irgendeinen unerwünschten Nebeneffekt des Moleküls, etc., eliminieren
oder abschwächen.
Anteile, fähig
zum Vermitteln solcher Effekte, sind in Remgington's Pharmaceutical
Sciences (1980) offenbart. Verfahren zum Koppeln solcher Anteile
an ein Molekül
sind im Fachgebiet gut bekannt.
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Fragment.
Ein "Fragment" eines Moleküls, wie
z.B. eines Proteins oder einer Nucleinsäure, soll sich auf einen Teil
der nativen Aminosäure-
oder genetischen Nucleotid-Sequenz,
und insbesondere auf die funktionalen Derivate der Erfindung beziehen.
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Variante
oder Analogon. Eine "Variante" oder ein "Analogon" eines Proteins oder
einer Nucleinsäure soll
sich auf ein Molekül,
im Wesentlichen ähnlich
in Struktur und biologischer Aktivität zu dem nativen Molekül, wie z.B.
das, codiert von einem funktionalen Allel, beziehen.
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II. DIE ERFINDUNGSGEMÄßEN WIRTE
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T.
reesei produziert keine endogene Phytase. Statt dessen werden andere
Enzymkomponenten, wie z.B. β-Glucan-abbauende
Aktivität,
wichtig z.B. bei Futteranwendungen, in hohen Mengen produziert.
Folglich resultiert die Verwendung von T. reesei als Produktionswirt
für Pilzphytase
und pH 2,5-saure Phosphatase in der Sekretion einer völlig unterschiedlichen
Enzymzusammensetzung, wenn verglichen mit der, die von Aspergillus
sezerniert wird. Zusätzlich
werden durch Verwendung von Trichoderma reesei als eine Quelle einer
Zusammensetzung, enthaltend Phytat-abbauende Enzyme, einige schwierige
Probleme beim nachgeschalteten Prozessieren, die mit ähnlichen
Aspergillus-Zusammensetzungen (z.B. bei der Filtration) eintreten, vermieden. Dies
ist der Fall, weil die Art der Kultivierung von rekombinantem T.
reesei anders als die von Aspergilli ist, wobei das Mycel in den
meisten Fällen
fluid und leicht trennbar ist. Folglich werden durch Produzieren
dieser Enzyme in den erfindungsgemäßen Wirten keine Probleme bei
der nachfolgenden Filtration des sezernierten Materials gesehen,
wie dies mit dem oft schleimigen und dicken Mycel von Aspergilli
der Fall ist.
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Verbesserte
Mengen an Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase (wenn verglichen
zur Synthese in Aspergillus) können
durch Einfügen
einer DNA-Sequenz, erhalten von A. niger, codierend für Phytase-
oder pH 2,5-saure Phosphatase-Aktivität, in eine T. reesei-Expressionskassette,
enthaltend den cbh1-Promotor und das Aspergillus-amdS-Gen als einen
Transformationsmarker, in dem T. reesei-Expressionssystem produziert werden.
Transformation des Konstrukts in T. reesei-Wirte resultiert in stabilen
Transformanten, die die Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase in
hohen Mengen in einem neuen Hintergrund ("background") begleitender Enzymaktivitäten exprimieren.
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Die
durch T. reesei produzierte Mischung enthält hohe β-Glucanase-Aktivität und niedrige
Glucoamylase-Aktivität.
Außerdem
ist die Menge an Phytase, hergestellt durch rekombinante T. reesei-Stämme in Schüttelkolbenkultivierungen,
vergleichbar zum Level, zu dem die Hauptcellulase, die endogene
Cellobiohydrolase I, exprimiert wird, mehr als 1 g/l. Die Menge
der pH 2,5-sauren Phosphatase, hergestellt durch die rekombinanten
Stämme
in Schüttelkolbenkultivierungen,
ist weniger als 0,5 g/l.
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Aspergillus
niger var. awamori ALKO 243 (ATCC 38854) (IFO4033)-Phytase und -saure
Phosphatase (optimaler pH 2,5) wurden in Trichoderma reesei unter
der Kontrolle des Trichoderma-Cellobiohydrolase I (cbh1)-Promotors überexprimiert.
Zusätzlich
wurde das Phytase-Gen von seinem eigenen Promotor exprimiert.
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Für beide
Gene wurden zwei Konstruktionen, die den cbh1-Promotor benutzen,
hergestellt: in einer Konstruktion wurde die Signal-Sequenz von
Phytase oder saurer Phosphatase verwendet, und in der anderen Konstruktion
wurde die cbh1-Signal-Sequenz verwendet. In allen Fällen wurden
die Fusionen unter Verwendung von PCR präzise angefertigt, und die Plasmide
wurden so konstruiert, dass die Expressionskassette von dem Vektor-Rückgrat ("backbone") vor den Transformationen
getrennt werden konnte. Folglich war es möglich, Stämme nur mit den gewünschten
Sequenzen (und nicht dem gesamten Vektor, verwendet zum Aufrechterhalten
der Sequenzen) zu transformieren, und folglich Stämme zu erhalten,
die nicht irgendwelche "fremden" Sequenzen enthielten;
solche Stämme
waren für
industrielle Zwecke geeignet.
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Drei
Trichoderma reesei-Stämme,
ATCC 56765 (RutC-30), ALKO 233 (VTT-D-79125) und ein schwach Aspartylprotease-produzierender
Stamm ALKO 2221, wurden als Wirte für Phytase-Expression verwendet.
Für saure
Phosphatase-Expression wurde nur T. reesei ALKO 2221 transformiert.
Wenn Phytase unter dem cbh1-Promotor in Trichoderma exprimiert wurde,
führte
die beste Transformation ohne E. coli-Sequenzen in Schüttelkolbenkultivierungen
zu etwa 3600-fach mehr Phytase als der nicht-transformierte A. niger ALKO
243. Wenn der Phy tase-Promotor verwendet wurde, war die beste in
Schüttelkolbenkultivierungen
von T. reesei-Transformanten
erhaltene Ausbeute etwa 120-fach die der mit A. niger ALKO 243 erhaltene.
Die besten erhaltenen saure Phosphatase-Aktivitäten waren etwa 240fach höher, verglichen
mit den Leveln, hergestellt durch den A. niger ALKO 243-Stamm.
-
Die
Molekulargewichte (in SDS-PAGE) der Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase,
sezerniert von Trichoderma, waren verschieden von jenen, sezerniert
von Aspergillus. Der Unterschied schien auf unterschiedlicher Glykosylierung
zu beruhen.
-
Der
Produktionslevel von Phytase, erhalten, wenn das Aspergillus-Gen
in Trichoderma unter der Kontrolle eines Trichoderma-Promotors exprimiert
wurde, war überraschend
hoch.
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Die
Verwendung von T. reesei als ein Produktionswirt für Pilzphytase
und Pilz-pH 2,5-saure
Phosphatase resultiert in völlig
unterschiedlichen Enzympräparationen,
wenn verglichen mit denen von Aspergillus. Wenn verglichen mit Aspergillus-Präparationen,
enthalten die durch T. reesei hergestellten Mischungen wesentlich
höhere β-Glucanase-
und verhältnismäßig niedrigere
Glucoamylase-Aktivitäten,
was deshalb T. reesei-Präparationen
bevorzugt z.B. bei Tierfutter zu verwenden sind.
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Die
erfindungsgemäßen Wirte
sollen alle Trichoderma einschließen. Trichoderma werden auf
Basis von morphologischem Nachweis von Ähnlichkeit klassifiziert. T.
reesei war früher
als t. viride Pers. oder T. koningii Oudem bekannt; manchmal wurde
T. reesei als eine eigene Art der T. longibrachiatum-Gruppe klassifiziert.
Der gesamte Genus Trichoderma ist im Allgemeinen charakterisiert
durch schnell wachsende Kolonien, die buschige oder pustelige, wiederholt
verzweigte Conidiophoren mit lageniformen Phialiden und Hyalinen oder
grünen
Konidien, getragen in schleimigen Köpfen (Bissett, J., Can. J.
Bot. 62: 924–931
(1984)), tragen.
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Der
Pilz, genannt T. reesei, ist klar definiert als genetische Familie,
stammend aus dem Stamm QM6a, d.h., eine Familie von Stämmen, die
einen gemeinsamen genetischen Hintergrund besitzen, der aus einem einzelnen
Nucleus des speziellen Isolats XM6a stammt. Nur solche Stämme werden
T. reesei genannt.
-
Die
Klassifizierung durch morphologische Mittel ist problematisch, und
die ersten kürzlich
veröffentlichten
molekularen Daten aus DNA-Fingerprint-Analyse und dem Hybridisierungsmuster
des Cellobiohydrolase II (cbh2)-Gens in T. reesei und T. longibrachiatum
zeigen klar eine Differenzierung dieser Stämme (Meyer, W. et al., Curr.
Genet. 21: 27–30
(1992); Morawetz, R., et al., Curr. Genet. 21: 31–36 (1992)).
-
Jedoch
besteht ein Hinweis auf Ähnlichkeit
zwischen verschiedenen Trichoderma-Arten auf dem molekularen Level,
der in der Konservierung von Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen von makromolekularen
Einheiten gefunden wird, die den verschiedenen Trichoderma-Arten
gemein sind. Beispielsweise offenbart Chang, C., et al., Nucl. Acids
Res. 19: 5559 (1990), die Nucleotid-Sequenz von T. viride cbh1.
Das Gen wurde unter Verwendung einer Sonde, basierend auf der T.
reesei-Sequenz, isoliert. Die Autoren bemerken, dass eine 95% Homologie
zwischen den Aminosäure-Sequenzen
des T. viride- und T. reesei-Gens besteht. Goldman, G. H., et al.,
Nucl. Acids Res. 18: 6717 (1990), offenbart die Nucleotid-Sequenz
von Phosphoglyceratkinasen aus T. viride und bemerkt, dass die abgeleitete
Aminosäure-Sequenz
81% homolog zu dem Phosphoglyceratkinase-Gen aus T. reesei ist.
Folglich müssen
die als T. viride klassifizierte Art und T. reesei genetisch sehr
nah beieinander liegen.
-
Des
Weiteren besteht eine hohe Ähnlichkeit
von Transformationsbedingungen unter den Trichoderma. Obwohl praktisch
alle industriell wichtigen Arten von Trichoderma in der zuvor diskutierten
Trichoderma-Sektion Longibrachiatum gefunden werden können, gibt
es manche anderen Arten von Trichoderma, die dieser Sektion nicht
zugeordnet werden. Solch eine Art ist beispielsweise Trichoderma
harzianum, die als ein Biokontrollwirkstoff gegen Pflanzenpathogene
wirkt. Für
diese Trichoderma-Art ist außerdem
ein Transformationssystem entwickelt worden (Herrera-Estrella, A.,
et al., Molec. Microbiol. 4: 839–843 (1990)), das im Wesentlichen dasselbe
wie das in der Anmeldung Gelehrte ist. Folglich ist das von Herrera-Estrella
bei der Herstellung von Spheroplasten vor der Transformation verwendete
Verfahren dasselbe, obwohl Trichoderma harharzianum nicht der Sektion
Longibrachiatum zugeordnet wird. Die Lehren von Herrera-Estrella
zeigen, dass keine signifikante Verschiedenartigkeit von Trichoderma
spp. besteht, so dass von dem erfindungsgemäßen Transformationssystem nicht
erwartet werden würde,
dass es in allen Trichoderma funktioniert.
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Ferner
besteht eine gemeinsame Funktionalität von Pilztranskriptions-Kontrollsignalen
unter Pilzarten. Es wurde gezeigt, dass wenigstens drei A. nidulans-Promotor-Sequenzen,
amdS, argB und gpd, Genexpression in T. reesei herbeiführen. Für amdS und
argB sind nur ein oder zwei Kopien des Gens ausreichend, um einen
selektierbaren Phänotyp
hervorzubringen (Penttilä et
al., Gene 61: 155–164
(1987). Gruber, F., et al., Curr. Genetic 18: 71–76 (1990) bemerkt außerdem,
dass diese Pilz-Gene oft erfolgreich quer durch verschiedene Arten
exprimiert werden können.
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Viele
Arten von Trichoderma sind von einer breiten Vielfalt von Ressourcen-Zentren,
die Pilzkultur-Kollektionen enthalten, verfügbar. Zusätzlich sind Trichoderma-Arten
in verschiedenen Datenbanken katalogisiert. Diese Ressourcen und
Datenbanken sind von O'Donnell,
K., et al. in Biochemistry of Filamentous Fungi: Technology and
Products, D. B. Finkelstein et al., Hrsg., Butterworth-Heinemann,
Stoneham, MA, USA, 1992, S. 3–39,
zusammengefasst.
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III. KONSTRUKTION ERFINDUNGSGEMÄSSER WIRTE
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Der
Prozess des gentechnischen Veränderns
der erfindungsgemäßen Wirte
wird, gemäß der Erfindung,
durch die Isolierung und Teilsequenzierung von reinem Protein, codierend
ein interessierendes Enzym, oder durch das Klonieren genetischer
Sequenzen, die in der Lage sind, solch ein Protein zu codieren mit
Polymerasekettenreaktions-Technologien; und durch die Expression
solcher genetischer Sequenzen, ermöglicht. Wie hierin verwendet,
ist der Ausdruck "genetische
Sequenzen" dafür vorgesehen,
sich auf ein Nucleinsäuremolekül (vorzugsweise
DNA) zu beziehen. Genetische Sequenzen, die in der Lage sind, ein
Protein zu codieren, stammen aus einer Vielfalt von Quellen. Diese
Quellen schließen
genomische DNA, cDNA, synthe tische DNA und Kombinationen davon ein.
Die bevorzugte Quelle genomischer DNA ist eine genomische Pilz-DNA-Bank.
Die bevorzugte Quelle der cDNA ist eine cDNA-Bank, hergestellt aus
Pilz-mRNA, kultiviert unter Bedingungen, die dafür bekannt sind, die Expression
der gewünschten
mRNA oder des gewünschten
Proteins zu induzieren.
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Die
genomische DNA kann natürlich
vorkommende Introns einschließen
oder nicht. Außerdem
kann solch genomische DNA in Assoziation mit der 5'-Promotorregion der
Gen-Sequenzen und/oder
mit der 3'-Transkriptionsterminationsregion
erhalten werden. Ferner kann eine solche genomische DNA in Assoziation
mit den genetischen Sequenzen, welche die 5'-nicht-translatierte
Region der mRNA codieren, und/oder mit den genetischen Sequenzen,
welche die 3'-nicht-translatierte
Region codieren, erhalten werden. In dem Ausmaß, in dem eine Wirtszelle die
transkriptionalen und/oder translationalen regulatorischen Signale,
assoziiert mit der Expression der mRNA und des Proteins, erkennen
kann, können
dann die 5'- und/oder
3'-nicht-transkribierten Regionen
des nativen Gens und/oder die 5'-
und/oder 3'-nicht-translatierten
Regionen der mRNA behalten werden und für transkriptionale und translationale
Regulation eingesetzt werden. Genomische DNA kann aus einer beliebigen
Wirtszelle, insbesondere einer Pilzwirtszelle, die das gewünschte Protein
natürlich
exprimiert, durch im Fachgebiet gut bekannte Mittel extrahiert und
gereinigt werden.
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Zum
Klonieren in einen Vektor werden solche geeigneten DNA-Präparationen
(entweder genomische DNA oder cDNA) zufällig geschert bzw. enzymatisch
gespalten und in geeignete Vektoren ligiert, um eine rekombinante
(entweder genomische oder cDNA-) Genbibliothek zu bilden.
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Eine
ein gewünschtes
Protein codierende DNA-Sequenz kann in einen DNA-Vektor gemäß konventioneller
Techniken, einschließlich
glatt-endender oder versetzt-endender Termini für eine Ligation, Restriktionsenzymverdau,
um geeignete Termini bereitzustellen, Auffüllen kohäsiver Enden, wie erforderlich,
alkalische Phosphatase-Behandlung, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden,
und Ligation mit geeigneten Ligasen, eingefügt werden. Techniken für solche
Manipulationen sind von Maniatis, T. (Maniatis, T., et al., Molecular
Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, zweite
Auflage, 1988), offenbart und im Fachgebiet gut bekannt.
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Bibliotheken,
die für
die gewünschten
Gene codierende Sequenzen enthalten, können durchmustert werden, und
die gewünschte
Gen-Sequenz kann durch ein beliebiges Mittel, welches spezifisch
auf eine ein solches Gen oder Protein codierende Sequenz selektiert,
identifiziert werden, wie z.B. a) durch Hybridisierung mit einer
geeigneten Nucleinsäuresonde/geeigneten
Nucleinsäuresonden,
enthaltend eine für
die DNA dieses Proteins spezifische Sequenz, oder b) durch Hybridisierungs-selektierte
translationale Analyse, bei der native mRNA, die an den betreffenden
Klon hybridisiert, in vitro-translatiert wird und die Translationsprodukte
weiter charakterisiert werden, oder, c) falls die klonierten Gen-Sequenzen
selbst in der Lage sind, mRNA zu exprimieren, durch Immunopräzipitation
eines translatierten Proteinprodukts, hergestellt von dem Wirt,
der den Klon enthält.
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Für ein gewisses
Protein spezifische Oligonucleotid-Sonden, welche verwendet werden
können,
um Klone zu diesem Protein zu identifizieren, können, ausgehend von der Kenntnis
der Aminosäure-Sequenz
des Proteins oder von der Kenntnis der Nucleinsäure-Sequenz der DNA, die ein
solches oder ein verwandtes Protein codiert, entworfen werden. Alternativ
können
Antikörper
gegen gereinigte Formen des Proteins erzeugt und verwendet werden,
um die Anwesenheit einzigartiger Proteindeterminanten in Transformanten,
die das gewünschte
klonierte Protein exprimieren, zu identifizieren. Die Sequenz von
Aminosäureresten
in einem Peptid ist hierin entweder durch die Verwendung ihrer allgemein
eingesetzten Drei-Buchstaben-Bezeichnungen oder durch ihre Einzel-Buchstaben-Bezeichnungen
bezeichnet. Eine Auflistung dieser Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen
kann in Lehrbüchern,
wie z.B. Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York,
NY (1970), gefunden werden. Wenn die Aminosäure-Sequenz horizontal aufgelistet
ist, ist beabsichtigt, wenn nichts anderes angegeben ist, dass der
Aminoterminus an dem linken Ende ist, und es ist beabsichtigt, dass
der Carboxyterminus am rechten Ende ist. Ähnlich ist, wenn nichts anderes
angegeben ist oder aus dem Zusammenhang ersichtlich ist, eine Nucleinsäure-Sequenz
mit dem 5'-Ende
auf der linken Seite angegeben.
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Weil
der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Kodon verwendet
werden, um eine spezielle Aminosäure
zu codieren (Watson, J. D., in: Molecular Biology of the Gene, 3.
Aufl., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356–357). Die
Peptidfragmente werden analysiert, um Aminosäure-Sequenzen zu identifizieren,
die von Oligonucleotiden codiert sein können, die den niedrigsten Grad
an Degeneriertheit aufweisen. Dies wird vorzugsweise durch Identifizieren
von Sequenzen, die Aminosäuren
enthalten, die nur von einem einzelnen Kodon codiert werden, bewerkstelligt.
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Obwohl
gelegentlich eine Aminosäure-Sequenz
nur von einer einzelnen Oligonucleotid-Sequenz codiert sein kann, kann die
Aminosäure-Sequenz
häufig
von einem beliebigen eines Sets ähnlicher
Oligonucleotide codiert sein. Wichtigerweise enthält, während alle
Mitglieder dieses Sets Oligonucleotid-Sequenzen enthalten, die fähig sind,
das gleiche Peptidfragment zu codieren, und folglich potentiell
die gleiche Oligonucleotid-Sequenz enthalten wie das Gen, welches
das Peptidfragment codiert, nur ein Mitglied des Sets die Nucleotid-Sequenz,
die mit der Exon-codierenden Sequenz des Gens identisch ist. Weil
dieses Mitglied innerhalb des Sets vorliegt und in der Lage ist,
an DNA selbst in Anwesenheit der anderen Mitglieder des Sets zu
hybridisieren, ist es möglich,
das unfraktionierte Set an Oligonucleotiden auf dieselbe Weise einzusetzen,
auf welche man ein einzelnes Oligonucleotid einsetzen würde, um
das das Peptid codierende Gen zu klonieren.
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Unter
Verwendung des genetischen Codes können ein oder mehrere verschiedene
Oligonucleotide, ausgehend von der Aminosäure-Sequenz, identifiziert
werden, von denen jedes in der Lage wäre, das gewünschte Protein zu codieren.
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein spezielles Oligonucleotid tatsächlich die
eigentliche Protein-codierende Sequenz darstellen wird, kann durch
Erwägen
abnormaler Basenpaarungsbeziehungen und der Häufigkeit, mit welcher ein spezielles
Kodon tatsächlich
in eukaryotischen Zellen verwendet wird (um eine spezielle Aminosäure zu codieren),
abgeschätzt
werden. Unter Verwendung von "Kodon-Verwendungsregeln" wird eine einzelne
Oligonucleotid-Sequenz oder ein Satz von Oligonucleotid-Sequenzen, die eine
theoretische "wahrscheinlichste" Nucleotid-Sequenz
beinhalten, fähig
des Codierens der Protein-Sequenzen, identifiziert.
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Das
geeignete Oligonucleotid oder der Satz an Oligonucleotiden, das/der
in der Lage ist, ein Fragment eines bestimmten Gens zu codieren
(oder welches/welcher komplementär
zu solch einem Oligonucleotid oder Satz an Oligonucleotiden ist),
kann durch im Fachgebiet gut bekannte Mittel synthetisiert werden
(siehe beispielsweise Synthesis and Application of DNA and RNA,
S. A. Narang, Hrsg., 1987, Academic Press, San Diego, CA) und als
eine Sonde eingesetzt werden, um einen Klon für so ein Gen durch im Fachgebiet
bekannte Techniken zu identifizieren und zu isolieren. Techniken
der Nucleinsäure-Hybridisierung
und Klonidentifizierung sind von Maniatis T., et al. in: Molecular
cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold
Spring Habor, NY (1982)), und von Hames, B. D., et al. in: Nucleic
Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington,
DC (1985)), offenbart. Jene Mitglieder der oben beschriebenen Genbibliothek, von
denen gefunden worden ist, dass sie zu solcher Hybridisierung fähig sind,
werden dann analysiert, um das Ausmaß und die Art von codierenden
Sequenzen, welche sie enthalten, zu bestimmen.
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Um
die Detektion einer gewünschten
DNA-codierenden Sequenz zu ermöglichen,
wird die oben beschriebene DNA-Sonde mit einer detektierbaren Gruppe
markiert. So eine detektierbare Gruppe kann irgendein Material sein,
das eine detektierbare physikalische oder chemische Eigenschaft
aufweist. Solche Materialien sind im Gebiet von Nucleinsäure-Hybridisierung
gut entwickelt worden, und im Allgemeinen kann so gut wie jede in
solchen Verfahren verwendbare Markierung für die vorliegende Erfindung
angewendet werden. Insbesondere nützlich sind radioaktive Markierungen,
wie z.B. 32P, 3H, 14C, 35S, 125I oder dergleichen. Es kann eine beliebige
radioaktive Markierung eingesetzt werden, die für ein angemessenes Signal sorgt
und eine ausreichende Halbwertszeit aufweist. Wenn es einzelsträngig ist,
kann das Oligonucleotid unter Verwendung von Kinasereaktionen radioaktiv
markiert werden. Alternativ sind Polynucleotide als Nucleinsäure-Hybridisierungs-Sonden
verwendbar, wenn sie mit einem nicht-radioaktiven Marker, wie z.B. Biotin,
einem Enzym oder einer fluoreszierenden Gruppe, markiert sind.
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Zusammengefasst
erlaubt folglich die Aufklärung
einer Protein-Teilsequenz die Identifikation einer theoretischen "wahrscheinlichsten" DNA-Sequenz oder
eines Satzes solcher Sequenzen, fähig zum Codieren eines solchen
Peptids. Durch Konstruieren eines Oligonucleotids, komplementär zu dieser
theoretischen Sequenz (oder durch Konstruieren eines Satzes von
Oli gonucleotiden, komplementär
zu diesem Satz an "wahrscheinlichsten" Oligonucleotiden)
erhält
man ein DNA-Molekül
(oder einen Satz von DNA-Molekülen),
fähig zum
Funktionieren als eine Sonde/Sonden für die Identifizierung und Isolierung
von Klonen, die ein Gen enthalten.
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In
einem alternativen Weg, ein Gen zu klonieren, wird eine Bibliothek
unter Verwendung eines Expressionsvektors, durch Klonieren von DNA
oder bevorzugter cDNA, hergestellt aus einer Zelle, die in der Lage
ist, das Protein zu exprimieren, in einen Expressionsvektor, hergestellt.
Die Bibliothek wird dann auf Mitglieder, welche das gewünschte Protein
exprimieren, beispielsweise durch Durchmustern der Bibliothek mit
Antikörpern
gegen das Protein, durchgemustert.
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Die
oben diskutierten Verfahren sind folglich dazu in der Lage, genetische
Sequenzen, die fähig
sind, ein Protein oder biologisch aktive oder antigene Fragmente
dieses Proteins zu codieren, zu identifizieren. Um solche genetischen
Sequenzen weiter zu charakterisieren und um das rekombinante Protein
herzustellen, ist es wünschenswert,
die Proteine, welche diese Sequenzen codieren, zu exprimieren. Eine
solche Expression identifiziert jene Klone, welche Proteine exprimieren,
die Charakteristika des gewünschten
Proteins besitzen. Solche Charakteristika können die Fähigkeit, Antikörper spezifisch
zu binden, die Fähigkeit,
die Produktion von Antikörpern
auszulösen,
welche in der Lage sind, das native nicht-rekombinante Protein zu
binden, die Fähigkeit
einer Zelle, eine enzymatische Aktivität bereitzustellen, die eine
Eigenschaft des Proteins ist, und die Fähigkeit einer Empfängerzelle,
eine nicht-enzymatische (aber spezifische) Funktion bereitzustellen,
unter anderen, einschließen.
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Eine
DNA-Sequenz kann durch im Fachgebiet bekannte Mittel verkürzt werden,
um ein gewünschtes Gen
aus einer chromosomalen Region zu isolieren, die mehr Information
als für
die Verwendung dieses Gens in den erfindungsgemäßen Wirten notwendig enthält. Beispielsweise
kann Restriktionsverdau eingesetzt werden, um die Volllängen-Sequenz
an einer gewünschten
Stelle zu spalten. Alternativ oder zusätzlich können Nucleasen, die vom 3'-Ende eines DNA-Moleküls spalten,
verwendet werden, um eine bestimmte Sequenz zu einer verkürzten Form
zu verdauen, wobei die gewünschte
Länge dann
durch Gelelektrophorese und DNA-Sequenzieren
identifiziert und gereinigt wird. Solche Nucleasen schließen beispielsweise
Exonuclease III und Bal31 ein. Andere Nucleasen sind im Fachgebiet
gut bekannt.
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Wenn
die codierende Sequenz und ein funktionell verknüpfter Promotor in eine eukaryotische
Empfängerzelle
als eine nicht-replizierende DNA (oder RNA), ein nicht-integrierendes
Molekül
eingeführt
werden, kann die Expression des codierten Proteins durch die transiente
(nicht-stabile) Expression der eingeführten Sequenz stattfinden.
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Vorzugsweise
wird die codierende Sequenz an einem DNA (oder RNA)-Molekül, wie z.B.
einem kovalent geschlossenen, ringförmigen Molekül, das nicht
zur autonomen Replikation fähig
ist, oder vorzugsweise einem linearen Molekül, das in das Wirtschromosom
integriert, eingeführt.
Genetisch stabile Transformanten können mit Vektorsystemen oder
Transformationssystemen konstruiert werden, wobei eine gewünschte DNA in
das Wirtschromosom integ riert wird. So eine Integration kann innerhalb
einer Zelle de novo geschehen oder durch Transformation mit einem
Vektor unterstützt
werden, der sich selbst funktionell in das Wirtschromosom einfügt, beispielsweise
Transposone oder andere DNA-Elemente, die die Integration von DNA-Sequenzen
in Chromosomen fördern.
Es wird ein Vektor eingesetzt, der fähig ist, die gewünschten
Gen-Sequenzen in ein Pilz-Wirtszellchromosom zu integrieren.
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Die
für Phytase
oder pH 2,5-saure Phosphatase, die die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:2
aufweisen, codierende Gene unter der Kontrolle geeigneter Promotoren
können
in eine Plasmidkonstruktion kombiniert werden und in die Wirtszellen
durch Transformation eingeführt
werden. Die Art des Plasmidvektors wird von dem Wirtsorganismus
abhängen.
Bei der praktischen Realisierung der Erfindung ist der filamentöse Pilz Trichoderma
reesei als ein Modell verwendet worden. Folglich sind für T. reesei
Vektoren, die DNA inkorporieren, die für die Integration der Sequenzen,
codierend die Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Gene, in das
Wirtschromosom sorgt, bevorzugt. Solch ein Targeting zu beispielsweise
dem cbh1-Locus, kann durch Bereitstellen cbh1-codierender oder -flankierender
Sequenzen auf dem rekombinanten Konstrukt in einer Menge, die ausreichend
ist, um die Integration an diesen Locus in einer relevanten Häufigkeit
zu leiten, erreicht werden.
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Zellen,
die die eingefügte
DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, werden selektiert,
indem außerdem
ein oder mehrere Marker eingeführt
werden, die die Selektion von Wirtszellen, welche den Expressionsvektor
in dem Chromosom enthalten, erlauben, beispielsweise kann der Marker
Biozid-Resistenz, z.B. Resistenz gegen Antibiotika oder Schwermetalle,
wie z.B. Kupfer oder dergleichen, bereitstellen. Das selektierbare
Marker-Gen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gen-Sequenzen
verknüpft
sein oder in dieselbe Zelle durch Co-Transfektion eingeführt werden.
Ein genetischer Marker, speziell für die Transformation der erfindungsgemäßen Wirte,
ist amdS, der Acetamidase codiert und folglich Trichoderma ermöglicht,
auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle zu wachsen.
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Um
ein gewünschtes
Protein zu exprimieren, sind transkriptionale und translationale
Signale, die von einem geeigneten Wirt erkennbar sind, notwendig.
Die klonierten codierenden Sequenzen, erhalten durch die oben beschriebenen
Verfahren, und vorzugsweise in einer Doppelstrangform, können funktionell
mit Sequenzen verknüpft
werden, die transkriptionale Expression in einem Expressionsvektor
kontrollieren, und in eine Wirtszelle eingeführt werden, um rekombinantes
Protein herzustellen. Abhängig
davon, welcher Strang der codierenden Sequenz funktionell mit den
Sequenzen verknüpft
ist, die transkriptionale Expression kontrollieren, ist es außerdem möglich, Antisense-RNA
zu exprimieren.
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Die
Expression des Proteins in unterschiedlichen Wirten kann in unterschiedlichen
posttranslationalen Modifikationen resultieren, die die Eigenschaften
des Proteins verändern
können.
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Man
sagt, ein Nucleinsäuremolekül, wie z.B.
DNA, ist "fähig zum
Exprimieren" eines
Polypeptids bzw. "dazu
in der Lage", falls
es Expressionskontroll-Sequenzen enthält, die Transkriptionsregulationsinformation enthalten,
und solche Sequenzen "funktionell
verknüpft" mit der das Polypeptid
codierenden Nucleotid-Sequenz sind.
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Eine
funktionelle Verknüpfung
ist eine Verknüpfung,
bei der eine Sequenz mit einer regulatorischen Sequenz (oder Sequenzen)
so verbunden ist/sind, dass Expression der Sequenz unter den Einfluss
oder die Kontrolle der regulatorischen Sequenz gestellt wird. Man
sagt, dass zwei DNA-Sequenzen (wie z.B. eine codierende Sequenz
und eine Promotorregion-Sequenz, verknüpft mit dem 5'-Ende der codierenden
Sequenz) funktionell verknüpft
sind, wenn die Induktion von Promotorfunktion in der Transkription
von mRNA, codierend das gewünschte
Protein, resultiert, und wenn die Art der Verknüpfung zwischen den beiden DNA-Sequenzen nicht
(1) in der Einführung
einer Rasterverschiebungsmutation resultiert, (2) nicht mit dem
Vermögen
der Expressions-regulatorischen Sequenzen interferiert, die Expression
des Proteins zu leiten, Antisense-RNA, oder (3) mit der Fähigkeit
der DNA-Matrize, transkribiert zu werden, interferiert. Folglich
wäre eine
Promotorregion funktionell mit einer DNA-Sequenz verknüpft, wenn
der Promotor in der Lage wäre,
Transkription dieser DNA-Sequenz zu bewirken.
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Die
genaue Natur der für
Genexpression benötigten
regulatorischen Regionen kann zwischen Arten oder Zelltypen variieren,
soll im Allgemeinen aber, wie notwendig, 5'-nicht-transkribierende und 5'-nicht-translatierende
(nicht-codierende) Sequenzen, verbunden mit Initiation der Transkription
bzw. Translation, wie z.B. der TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und dergleichen,
einschließen.
Insbesondere werden solche 5'-nicht-transkribierenden
Kontroll-Sequenzen eine Region einschließen, die einen Promotor zur
transkriptionalen Kontrolle des funktionell verknüpften Gens
enthält.
Solche transkriptionalen Kontrollsequenzen können außerdem Enhancer-Sequenzen oder
stromaufwärts
liegende Aktivator-Sequenzen ("upstream
activator sequences"),
wie gewünscht,
einschließen.
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Expression
eines Proteins in eukaryotischen Wirten, wie z.B. einem Pilz, erfordert
die Verwendung regulatorischer Regionen, die in solchen Wirten funktional
sind, und vorzugsweise regulatorische Systeme aus Pilzen. Eine breite
Vielfalt transkriptionaler und translationaler regulatorischer Sequenzen
kann, abhängig
von der Art des Wirts, eingesetzt werden. Vorzugsweise sind diese
regulatorischen Signale in ihrem nativen Zustand mit einem bestimmten
Gen assoziiert, das zu einem hohen Level an Expression in der Wirtszelle
in der Lage ist.
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In
Eukaryoten, wo die Transkription nicht in direktem Zusammenhang
mit der Translation steht, können solche
Kontrollregionen ein Methionin (AUG)-Startkodon bereitstellen oder
nicht, abhängig
davon, ob die klonierte Sequenz so ein Methionin enthält. Solche
Regionen werden im Allgemeinen eine Promotorregion, ausreichend,
um die Initiation der RNA-Synthese in der Wirtszelle zu leiten,
einschließen.
Promotoren von Genen filamentöser
Pilze, welche ein mRNA-Produkt, das zur Translation fähig ist,
codieren, sind bevorzugt, und insbesondere können starke Promotoren eingesetzt
werden, vorausgesetzt sie funktionieren in der Wirtszelle auch als
Promotoren. Bevorzugte starke eukaryotische Promotoren zur Verwendung
in Trichoderma schließen den
T. reesei-cbh1-Gen-Promotor ein, oder ein Promotor eines anderen
Cellulase- Gens,
wie z.B. der für
das cbh2-, egl1- oder egl2-Gen, kann verwendet werden. Zusätzlich zur
Verwendung regulatorischer Trichoderma-Elemente kann die Expression
von Proteinen unter die Kontrolle regulatorischer Elemente von Aspergillus nidulans
(beispielsweise den argB-Gen-Promotor
und den amdS-Gen-Promotor), Aspergillus niger (beispielsweise den
Phytase-Promotor
oder den Glykoamylase-Gen-Promotor) gestellt werden. Jedoch kann
die Expression unter regulatorischen Nicht-Trichoderma-Elementen
wie diesen sehr niedrig sein, wenn verglichen zur Verwendung von
Trichoderma-Elementen, und insbesondere Genen von T. reesei.
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Wie
weitgehend bekannt ist, wird die Translation eukaryotischer mRNA
an dem Kodon initiiert, welches das erste Methionin codiert. Aus
diesem Grund ist es bevorzugt, sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen
einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, die für das gewünschte Protein
codiert, nicht irgendwelche intervenierenden Kodons enthält, die
in der Lage sind, ein Methionin zu codieren. Das Vorhandensein solcher
Kodons resultiert entweder in einer Bildung eines Fusionsproteins
(falls das AUG-Kodon im selben Leserahmen wie die Protein-codierende
DNA-Sequenz ist) oder einer Rasterverschiebungsmutation (wenn das
AUG-Kodon nicht im selben Leserahmen wie die Protein-codierende
Sequenz ist).
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Es
kann erwünscht
sein, ein Fusionsprodukt zu konstruieren, das eine partielle codierende
Sequenz (gewöhnlich
am Amino-terminalen Ende) eines Proteins und eine zweite codierende
Sequenz (partiell oder komplett) eines Phytase-abbauenden Enzyms
der Erfindung enthält.
Die Sequenz, die das Phytase-abbauende Enzym nicht codiert, kann
als Signal-Sequenz zur Sekretion des Proteins aus der Wirtszelle
wirken oder nicht. Beispielsweise kann die für das gewünschte Protein codierende Sequenz
mit einer Signal-Sequenz verknüpft
sein, die die Sekretion des Proteins aus, oder die Compartimentalisierung
des Proteins in einem einen speziellen Wirt erlauben wird. Solche
Fusionsprotein-Sequenzen können
mit oder ohne spezifische Proteasestellen entworfen werden, so dass
eine gewünschte
Peptid-Sequenz nachfolgendem Entfernen zugänglich ist. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird die native Signal-Sequenz eines Pilzproteins, oder ein funktionales Derivat
dieser Sequenz, das die Fähigkeit
behält,
die Sekretion des Peptids, das funktionell damit verknüpft ist,
zu leiten, verwendet. Aspergillus-Leader/Sekretionssignal-Elemente funktionieren
auch in Trichoderma.
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Es
können
regulatorische Transkriptionsinitiationssignale ausgewählt werden,
die Repression oder Aktivierung erlauben, so dass die Expression
der funktionell verknüpften
Gene moduliert werden kann. Beispielsweise können regulatorische Signale
temperatursensitiv sein, so dass durch Variieren der Temperatur die
Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder chemischer
Regulation unterliegen, z.B. Metabolit. Translationssignale sind
nicht notwendig, wenn es gewünscht
ist, Antisense-RNA-Sequenzen zu exprimieren.
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Wenn
erwünscht,
können
die nicht-transkribierten und/oder nicht-translatierten Regionen
3' von der Sequenz,
codierend ein gewünschtes
Protein, durch die oben beschriebenen Klonierungsverfahren erhalten werden.
Die 3'-nicht-transkribierte
Region kann für
ihre regulatorischen Transkriptionsterminations-Sequenzelemente,
oder für
jene Elemente, welche Polyadeny lierung in eukaryotischen Zellen
leiten, beibehalten werden. Wo die nativen Expressionskontroll-Sequenzsignale
nicht zufriedenstellend in einer Wirtszelle funktionieren, können dann
in der Wirtszelle funktionale Sequenzen substituiert werden.
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Die
erfindungsgemäßen Vektoren
können
ferner andere funktionell verknüpfte
regulatorische Elemente umfassen, wie z.B. DNA-Elemente, welche
Antibiotika-Resistenz verleihen, oder Replikationsursprünge zum
Aufrechterhalten des Vektors in einer oder mehreren Wirtszelle(n).
-
In
einer anderen Ausführungsform,
insbesondere zum Aufrechterhalten der erfindungsgemäßen Vektoren
in prokaryotischen Zellen oder in Zellen der Hefe S. cerevisiae,
wird die eingeführte
Sequenz in ein Plasmid oder in einen viralen Vektor inkorporiert,
der zur autonomen Replikation in dem Empfängerwirt fähig ist. Ein beliebiger einer
großen
Vielfalt von Vektoren kann für
diesen Zweck eingesetzt werden. In Bacillus-Wirten kann die Integration
der gewünschten
DNA notwendig sein.
-
Beim
Auswählen
eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors schließen wichtige
Faktoren ein: die Leichtigkeit, mit welcher Empfängerzellen, die den Vektor
enthalten, erkannt und von jenen Empfängerzellen selektiert werden
können,
welche den Vektor nicht enthalten; die Anzahl von Kopien des Vektors,
welche in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es wünschenswert
ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener
Arten hin- und herzubewegen ("to
shuttle").
-
Bevorzugte
S. cerevisiae-Hefeplasmide schließen jene, enthaltend den "2-Micron circle", etc., oder deren
Derivate, ein. Solche Plasmide sind im Fachgebiet gut bekannt (Botstein,
D., et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274 (1982); Broach, J. R.,
in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle
and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor,
NY, S. 445–470
(1981); Broach, J. R., Cell 28: 203–204 (1982); Bollon, D. P.,
et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48 (1980); Maniatis, T., in:
Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3, Gene Expression,
Academic Press, NY, S. 563–608
(1980)) und sind kommerziell erhältlich.
-
Sobald
der Vektor oder die DNA-Sequenz, enthaltend das Konstrukt/die Konstrukte,
für die
Expression vorbereitet ist, wird/werden das DNA-Konstrukt/die DNA-Konstrukte
in eine geeignete Wirtszelle durch ein beliebiges einer Vielfalt
geeigneter Mittel, einschließlich
Transformation, eingeführt.
Nach dem Einführen
des Vektors werden Empfängerzellen
in einem selektiven Medium kultiviert, welches auf das Wachstum
Vektor-enthaltender Zellen selektiert. Expression der klonierten
Gen-Sequenzen) resultiert in der Produktion des gewünschten
Proteins oder in der Produktion eines Fragments dieses Proteins.
Diese Expression kann auf kontinuierliche Weise in den transformierten
Zellen stattfinden oder auf eine kontrollierte Weise, beispielsweise durch
Induktion der Expression.
-
Pilztransformation
wird auch gemäß der im
Fachgebiet bekannten Techniken durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung
z.B. von homologer Rekombination, um ein Gen stabil in den Pilzwirt
einzufügen und/oder
das Vermögen
der Wirtszelle zu zerstören,
ein bestimmtes Protein zu exprimieren.
-
IV. HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN
-
In
der folgenden Beschreibung wird auf verschiedene Methodologien verwiesen
werden, die dem Fachmann im Gebiet der Immunologie gut bekannt sind.
Standard-Referenzarbeiten, die die allgemeinen Prinzipien der Immunologie
darlegen, schließen
die Arbeit von Catty, D. (Antibodies, A Practical Approach, Bd.
1, IRL Press, Washington, DC (1988)); Klein, J. (Immunology: The
Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, New York
(1992)); Kennett, R., et al., in Monoclonal Antibodies, Hybridoma:
A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980));
Campbell, A. ("Monoclonal
Antibody Technology",
in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
Bd. 13 (Burdon, R., et al., Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1984));
und Eisen, H. N., in Microbiology, 3. Aufl. (Davis, B. D., et al.,
Harper & Row,
Philadelphia (1980)) ein.
-
Man
sagt, dass ein Antikörper "fähig zum Binden" eines Moleküls ist,
wenn er fähig
ist, spezifisch mit dem Molekül
zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu
binden. Der Ausdruck "Epitop" soll sich auf diesen
Anteil eines Haptens beziehen, welcher von einem Antikörper erkannt
und gebunden werden kann. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein
Epitop haben. Ein "Antigen" ist fähig, ein
Tier zu veranlassen, Antikörper,
fähig zum
Binden an ein Epitop dieses Antigens, herzustellen. Die spezifische
Reaktion, auf die oben verwiesen wurde, soll anzeigen, dass das
Antigen in einer hochselektiven Weise mit seinem korrespondierenden
Antikörper
reagieren wird und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die
von anderen Antigenen hervorgerufen werden können.
-
Der
Ausdruck "Antikörper" (Ab, "antibody") oder "monoklonaler Antikörper" (Mab, "monoclonal antibody"), wie hierin verwendet,
soll intakte Moleküle
sowie Fragmente davon (wie z.B. Fab- und F(ab')2-Fragmente),
die für
die Bindung an Antigen verwendet werden können, bezeichnen. Fab und F(ab')2-Fragmente
haben kein FC-Fragment von intaktem Antikörper, verschwinden rascher
aus dem Blutkreislauf und können
weniger nicht-spezifische Gewebebindung von einem intakten Antikörper aufweisen
(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325 (1983)).
-
Die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung werden durch ein beliebiges einer Vielfalt
von Verfahren hergestellt. Vorzugsweise wird gereinigtes Phytase-
oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein oder ein Fragment davon (mit
endoF oder dessen Äquivalent,
um Zuckeranteile zu entfernen, behandelt oder nicht) einem Tier
verabreicht, um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyklonale
Antikörper
enthalten, die fähig sind,
solche Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase zu binden.
-
Zellen,
die Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein oder ein Fragment
davon exprimieren, oder eine Mischung von Proteinen, enthaltend
Phytase oder pH 2,5-saure Phosphatase oder solche Fragmente, können einem
Tier auch verabreicht werden, um die Produktion von Seren zu induzieren,
die polyklonale Antikörper
enthalten, von denen einige fähig sein
werden, Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein zu binden.
Wenn gewünscht,
kann ein solcher Phytase- oder pH 2,5-saurer Phosphatase-Antikörper von
den anderen polyklonalen Antikörpern
durch Standard-Proteinreinigungstechniken, und insbesondere durch
Affinitätschromatographie
mit gereinigter Phytase oder pH 2,5-saurer Phosphatase oder Fragmenten
davon, gereinigt werden.
-
Ein
Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Proteinfragment kann auch
chemisch synthetisiert werden und durch HPLC gereinigt werden, um
es im Wesentlichen frei von Kontaminanten zu machen. So eine Präparation
wird dann in ein Tier eingeführt,
um polyklonale Antiseren hoher spezifischer Aktivität zu produzieren.
-
Monoklonale
Antikörper
können
unter Verwendung von Hybridoma-Technologie hergestellt werden (Kohler
et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol.
6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling
et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier,
N. Y., S. 563–681
(1981)). Im Allgemeinen schließen
solche Prozeduren das Immunisieren eines Tiers mit Phytase- oder
pH 2,5-saurer Phosphatase-Protein-Antigen
ein. Die Splenocyten solcher Tiere werden extrahiert und mit einer
geeigneten Myelomzelllinie fusioniert. Eine beliebige geeignete
Myelomzelllinie kann gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden; jedoch ist es bevorzugt, die Eltern-Myelomzelllinie
(SP2O), erhältlich von der American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland, einzusetzen. Nach der Fusion
werden die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium
aufrecht erhalten und dann durch limitierende Verdünnung ("limiting dilution"), wie von Wands,
J. R., et al., Gastroenterology 80: 225–232 (1981), beschrieben, kloniert.
-
Die
durch eine Selektion erhaltenen Hybridomzelllinien werden dann analysiert,
um Klone zu identifizieren, welche Antikörper sezernieren, die fähig sind,
das Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein-Antigen zu binden.
-
Durch
Anwendung der oben beschriebenen Verfahren können zusätzliche Zelllinien, fähig zum
Produzieren von Antikörpern,
welche Epitope des Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Proteins
erkennen, erhalten werden.
-
Antikörper gegen
sowohl hochkonservierte als auch schlecht konservierte Regionen
des Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Proteins sind für Studien
der Kontrolle der Biosynthese und des Katabolismus von Phytase-
oder pH 2,5-saure Phosphatase-Protein und für Studien, wobei es notwendig
ist, die Anwesenheit und/oder des Protein-Antigens in einer Zusammensetzung
zu identifizieren oder quantifizieren, verwendbar.
-
V. HERSTELLUNG VON PHYTASE
UND SAURER PHOSPHATASE
-
Die
besten Phytase-Produktionslevel werden erhalten, wenn Trichoderma
mit linearer DNA unter Verwendung des cbh1-Promotors transformiert
werden (etwa 3800 PNU/ml, siehe Tabelle 8). Etwa 3500 und 3600 PNU/ml
Kulturmedium wurden mit den besten T. reesei ALKO 2221- und ALKO
233-Transformanten erhalten, die keine E. coli-Sequenzen enthielten.
Sowohl die Phytase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz schienen gleich
gut zu funktionieren, und dieselben Level an Phytase-Produktion
konnten erreicht werden, wenn T. reesei ALKO 2221 oder ATCC 56765
als ein Wirtsstamm verwendet wurden. In T. reesei ALKO 233 war der Level
von produzierter Phytase-Aktivität
höher,
wenn die Phytase-Signal-Sequenz verwendet wurde.
-
Phytase
wird von den erfindungsgemäßen Trichoderma
reesei-Wirten in den Überstand
des Kulturmediums exprimiert. Die Menge von Phytase im Kulturmedium
ist im Allgemeinen höher
als irgendeine bisher beschriebene Menge eines heterologen Proteins,
das in Trichoderma exprimiert wurde.
-
Das
Spektrum von Enzymen, die Phytase in den erfindungsgemäßen Trichoderma
reesei-Stämmen begleiten,
ist höchst
unterschiedlich und vorteilhaft gegenüber dem von ähnlichen
Präparationen
von Aspergillus-Kulturüberständen. Unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Trichoderma
reesei-Wirte sind sowohl Endoglucanase- als auch Cellobiohydrolase-Aktivitäten im Allgemeinen
wesentlich höher.
Das Glykosylierungsmuster der Phytase ist außerdem unterschiedlich, wenn
sie von Trichoderma reesei exprimiert wird, was in einem Phytaseprotein
resultiert, das bei Western-Analyse als multiple Banden migriert.
-
Die
beste Produktion von pH 2,5-saurer Phosphatase von den erfindungsgemäßen Trichoderma reesei-Transformanten
resultiert in 240 APNU/ml-Kulturmedium, in Schüttelkolbenkultivierung und
in Lactose-basierendem Medium. Wie mit der Phytase, funktionierten
sowohl die saure Phosphatase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz gleichermaßen gut.
-
Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
die Phytase enthalten, können
direkt für
das Entfernen von Phytinsäure
oder Inosithexaphosphorsäure,
aus Rohmaterial, insbesondere Phytin-enthaltendem Rohmaterial, und
insbesondere Pflanzenmaterial, verwendet werden. Phytase entfernt
die Phosphatgruppen von Phytinsäure
und zerstört
deren Fähigkeit,
mit Mineralabsorption zu interferieren. Wenn als ein Tierfutteradditiv
verwendet, setzen die erfindungsgemäßen Phytasezusammensetzungen
an Phytin in Korn-gebundenes Phosphat frei und reduzieren folglich
das Bedürfnis
nach Dosen zusätzlichen
Phosphats in Futterformulierungen dramatisch und vermindern Umweltbelastungen.
-
Die
gemäß der Erfindung
hergestellte Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase können durch
im Fachgebiet bekannte Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden.
-
Nachdem
die Erfindung nun im Allgemeinen beschrieben wurde, wird dieselbe
durch Bezugnahme auf gewisse spezifische Beispiele besser verstanden
werden, die hierin für
Illustrationszwecke eingeschlossen sind.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Assay-Verfahren
zur Bestimmung von Phytase-Aktivität
-
Prinzip
Phytase wirkt auf Phytat (Inositolhexaphosphat), um anorganisches
Phosphat freizusetzen. Die Bestimmung von freigesetztem anorganischen
Phosphat basiert auf der Farbe, die durch die Reduktion eines Phosphormolybdat-Komplexes
gebildet wird.
-
Aktivitätseinheit
Eine Phytase-Einheit (PU, "phytase
unit") ist die Menge
an Enzym, die unter Standardbedingungen 1 nmol von anorganischem
Phosphat in einer Minute aus Natriumphytat freisetzt. Assay-Bedingungen
Substrat | Natriumphytat |
pH | 5,0 |
Inkubationstemperatur | 37°C ± 0,5°C |
Inkubationszeit | 15
Minuten |
Ausrüstung
Wasserbad | 37°C |
Wasserbad | 50°C |
Spektralphotometer | |
Teströhrchenmischer
(Vortex) | |
Phosphat-freies
Glasgeschirr | |
-
Reagentien
Alle Lösungen
werden in entionisiertem Wasser, Milli-Q oder einem Äquivalent
hergestellt.
- 1. Citratpuffer (0,2 M, pH 5,0).
0,2 M Lösungen
von sowohl Natriumcitrat (C6H8O7Na·2H2O, 58,8 g/l, Merck 6448) und Zitronensäure (C6H8O7·H2O, 42,0 g/l, Merck 244) werden in Wasser
erstellt. Der pH der Citratlösung
(1 Liter) wird mit 0,2 M Citronensäure (der Verbrauch an Citronensäure sollte
etwa 385 ml sein) auf 5,0 eingestellt.
- 2. Substrat. 1,00 g Natriumphytat (Sigma P-3168) wird in etwa
70 ml Citratpuffer gelöst.
Der pH wird mit 0,2 M Citronensäure
auf 5,0 eingestellt, und das Volumen wird mit Citratpuffer auf 100
ml eingestellt. Täglich muss
frische Substratlösung
hergestellt werden.
- 3. 15% (Gew./Vol.) TCA-Lösung.
Herstellung aus Trichloressigsäure
(Merck 807).
- 4. 10% (Gew./Vol.) Ascorbinsäurelösung. Herstellung
aus Ascorbinsäure
(Merck 127). Lagerung unter Kühlung.
Die Lösung
ist sieben Tage lang stabil.
- 5. 2,5% (Gew./Vol.) Ammoniummolybdatlösung. 2,5 g (NH4)6Mo7O24·4H2O, Merck 1182) werden in Wasser gelöst und auf
100 ml aufgefüllt.
- 6. 1 M Schwefelsäure.
55,6 ml konzentrierte H2SO4 (Merck
731) werden zu etwa 800 ml Wasser, unter Rühren, gegeben. Es wird abkühlen gelassen,
und es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
- 7. Reagens C. 3 Volumen 1 M Schwefelsäure werden mit 1 Volumen 2,5%
Ammoniummolybdat vermischt, dann wird 1 Volumen 10% Ascorbinsäure zugegeben,
und es wird gut gemischt. Täglich
muss frisches Reagens C hergestellt werden.
-
Probenverdünnung Proben
werden in Citratpuffer verdünnt.
Von jeder Probe werden zweifache Verdünnungen angefertigt. Im Fall
von Enzympulver werden etwa 250 mg Probe akkurat gewogen, in dem
Puffer gelöst
und in einem Messkolben auf 25 ml aufgefüllt. Wenn notwendig, wird weiter
verdünnt.
-
-
Assay
-
Hydrolyse
1,0 ml Probenverdünnung,
enthaltend 20–190
PU, werden in zwei Teströhrchen
pipettiert. 2,0 ml 15%ige TCA werden zu einem der Röhrchen (Blindprobe, "blank") zugegeben und gemischt.
Die Röhrchen
ohne TCA werden in ein Wasserbad bei 37°C gesetzt und 5 Minuten äquilibrieren
gelassen. Unter Verwendung einer Stoppuhr wird die Hydrolyse durch
sequentielles Zugeben in geeigneten Intervallen von 1,0 ml Substrat
(etwa 10 Minuten lang bei 37°C äquilibriert)
zu jedem Röhrchen
und Mischen gestartet. Nach exakt 15-minütiger Inkubation wird die Reaktion
durch Zugeben von 2,0 ml TCA zu jedem Röhrchen gestoppt. Es wird gemischt
und auf Raumtemperatur abgekühlt.
1,0 ml Substrat werden auch zu den Blindprobenröhrchen (bei Raumtemperatur
gehalten) gegeben, und es wird gemischt. Falls ein Präzipitat
auftritt, muss es durch 10-minütige
Zentrifugation bei 2000 g abgetrennt werden.
-
Freigesetztes
Orthophosphat 0,4 ml jeder Probe nach Hydrolyse werden in Teströhrchen pipettiert.
3,6 ml Wasser werden zu jedem Röhrchen
gegeben. 4,0 ml Reagens C werden zugegeben, und es wird gemischt. Es
wird 20 Minuten lang bei 50°C
inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Extinktion gegenüber der Reagens-Blindprobe
(siehe unten) wird bei 820 nm gemessen.
-
Standard
Eine 9,0 mM Phosphat-Stammlösung
wird hergestellt. 612,4 mg KH2PO4 (Merck 4873, getrocknet im Exsikkator mit
Siliciumdioxid) werden gelöst
und mit Wasser in einem volumenfrischen Kolben auf 500 ml verdünnt. Die
folgenden Verdünnungen
der Stammlösung
in Wasser werden hergestellt, und diese werden als Standards verwendet.
-
-
4,0
ml jeder Verdünnung
werden in zwei Teströhrchen
pipettiert. Außerdem
werden 4,0 ml Wasser in ein Teströhrchen pipettiert (Reagens-Blindprobe).
4,0 ml Reagens C werden zugegeben, und es wird gemischt. Es wird
20 Minuten lang bei 50°C
inkubiert, und es wird auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Absorptionswerte werden
bei 820 nm gegen die von der Reagens-Blindprobe gemessen. Eine Standardkurve
wird durch Blotting der Absorptionswerte gegen Phytase-Aktivität (PU/ml)
erstellt. Eine neue Standardlinie muss bei jeder Serie von Assays
konstruiert werden.
-
Berechnung
Der Blindproben-Absorptionswert wird vom Probenabsorptionswert subtrahiert
(der Unterschied sollte 0,100–1,000
sein). Die Phytase-Aktivität
(PU/ml) wird von der Standardlinie abgelesen und mit dem Verdünnungsfaktor
multipliziert. Um die Aktivität
(PU/g) von Enzympulvern zu berechnen, wird das Ergebnis (PU/ml)
ferner mit 25 (ml) multipliziert und durch das exakte Gewicht der
Probe (g) geteilt.
-
Vorbereitung von Futter
und anderen unlöslichen
Proben für
Phytase-Analyse
-
Etwa
2,5 g gemahlene Probe werden akurat in zwei 50 ml-Bechergläser gewogen.
20,0 ml Citratpuffer werden zugegeben. Es wird 30 Minuten lang bei
Raumtemperatur unter Verwendung eines Magnetrührers gemischt. Etwa 10 ml
von jedem werden in Zentrifugenröhrchen
transferiert, und das feste Material wird durch 10-minütige Zentrifugation
bei 2004 g abgetrennt. 2,5 ml Überstand
werden auf PD 10-Gelfiltrationssäulen
(Sephadex G-25M, Pharmacia 17-0851-01) aufgebracht, die mit 25 ml
Citratpuffer äquilibriert
sind. Das Eluat wird verworfen. Dann werden 3,5 ml Citratpuffer
auf die Säule
aufgebracht und das Eluat in einem Messzylinder gesammelt. Das Volumen
wird mit Citratpuffer auf 5,0 ml aufgefüllt (Verdünnungsfaktor 2), und es wird
auf Phytase-Aktivität
untersucht. Die Aktivität
PU/g wird durch Multiplizieren der gemessenen Aktivität (PU/ml)
mit 40 (Verdünnungsfaktor·Volumen
Extraktionspuffer) und Teilen durch das exakte Gewicht der Probe
(g) erhalten. Referenz: Chen et al., Anal. Chem. 28: 1756–1758 (1956).
-
BEISPIEL 2
-
Bestimmung
von saurer Phosphatase-Aktivität
-
Prinzip.
Saure Phosphatase wirkt auf p-Nitrophenylphosphat, um anorganisches
Phosphat freizusetzen. Die Bestimmung von freigesetztem anorganischen
Phosphat basiert auf der durch die Reduktion von Phosphormolybdat-Komplex
gebildeten Farbe.
-
Einheit
der Aktivität.
Eine saure Phosphatase-Einheit (HFU) ist die Menge an Enzym, die
unter Standardbedingungen 1 nmol anorganisches Phosphat aus p-Nitrophenylphosphat
in einer Minute freisetzt. Assay-Bedingungen
Substrat | p-Nitrophenylphosphat |
pH | 2,5 |
Temperatur | 37°C ± 0,5°C |
Inkubationszeit | 15
min |
Ausrüstung
Wasserbad | 37°C |
Wasserbad | 50°C |
Spektralphotometer | |
Teströhrchenmischer
(Vortex) | |
Zentrifuge
(Hereaus Biofuge 17S, 3090 oder äquivalentes
Gerät) | |
Phosphat-freies
Glasgeschirr | |
-
Reagentien
Alle Lösungen
werden in entionisiertem Wasser, Milli-Q oder einem Äquivalent
hergestellt.
- 1. Glycinpuffer (0,2 M, pH 2,5)
15,014
g Glycin (Merck 4201) werden in etwa 800 ml Wasser gelöst. Der
pH-Wert wird mit 1 M Salzsäure (Verbrauch
sollte etwa 80 ml sein) auf 2,5 eingestellt, und es wird mit Wasser
auf 1000 ml verdünnt.
- 2. Substrat (30 mM)
1,114 g p-Nitrophenylphosphat (Boehringer,
738 352) werden in Glycinpuffer gelöst und das Volumen mit dem
Puffer auf 100 ml eingestellt. Täglich
muss frische Substratlösung
hergestellt werden.
- 3. 15% (Gew./Vol.) TCA-Lösung
Herstellung
aus Trichloressigsäure
(Merck 807).
- 4. 10% (Gew./Vol.) Ascorbinsäurelösung.
Herstellung
aus Ascorbinsäure
(Merck 127). Lagerung unter Kühlung.
Die Lösung
ist 7 Tage lang stabil.
- 5. 2,5% (Gew./Vol.) Ammoniummolybdatlösung.
2,5 g (NH4)6Mo7O24·4H2O, Merck 1182) werden in Wasser gelöst, und
es wird auf 100 ml aufgefüllt.
- 6. 1 M Schwefelsäure.
55,6
ml konzentrierte H2SO4 (Merck
731) werden zu etwa 800 ml Wasser unter Rühren gegeben. Abkühlen wird
ermöglicht,
und es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
- 7. Reagens C
3 Volumen 1 M Schwefelsäure werden mit 1 Volumen 2,5%igem
Ammoniummolybdat vermischt, dann wird 1 Volumen 10%ige Ascorbinsäure zugegeben,
und es wird gut gemischt. Täglich
muss frisches Reagens C hergestellt werden.
-
Probenverdünnung. Proben
werden in Glycinpuffer verdünnt.
Von jeder Probe werden Verdünnungen im
Duplikat angefertigt. Im Fall von Enzympulver werden etwa 250 mg
der Probe akurat gewogen, in dem Puffer gelöst und auf 25 ml in einem Messkolben
aufgefüllt,
und es wird, falls notwendig, weiter verdünnt.
-
-
Assay.
-
Hydrolyse:
1,9 ml an Substrat werden in zwei Teströhrchen pipettiert. 2,0 ml 15%ige
TCA werden zu einem der Röhrchen
(Blindprobe) zugegeben, und es wird gemischt. Die Röhrchen ohne
TCA werden in ein Wasserbad bei 37°C gestellt und 5 min lang äquilibrieren
gelassen. Unter Verwendung einer Stoppuhr wird die Hydrolyse durch
sequentielles Zugeben in geeigneten Zeitabständen von 0,1 ml der Enzymverdünnung zu
jedem Röhrchen
gestartet, und es wird gemischt. Nach genau 15-minütiger Inkubation
wird die Reaktion durch Zugeben von 2,0 ml TCA zu jedem Röhrchen gestoppt.
Es wird gemischt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Außerdem werden 0,1 ml Probe
zu den Blindprobenröhrchen
(bei Raumtemperatur gehalten) gegeben, und es wird gemischt. Falls
ein Präzipitat
auftaucht, muss es durch 10-minütige
Zentrifugation bei 2000 g abgetrennt werden.
-
Freigesetztes
Orthophosphat: 0,4 ml jeder Probe werden nach der Hydrolyse in Teströhrchen pipettiert.
Zu jedem Röhrchen
werden 3,6 ml Wasser zugegeben. 4,0 ml Reagens C werden zugegeben,
und es wird gemischt. Es wird 20 min bei 50°C inkubiert und auf Raumtemperatur
abgekühlt.
Die Extinktion gegen die der Reagens-Blindprobe (siehe unten) wird
bei 820 nm gemessen.
-
Standard.
Eine 9,0 mM Phosphat-Stammlösung
wird hergestellt. 612,4 mg KH
2PO
4 (Merck 4873, im Exsikkator mit Siliciumdioxid
getrocknet) werden gelöst
und auf 500 ml mit Wasser in einem Messkolben verdünnt. Die
folgenden Verdünnungen
werden in Wasser aus den Stammlösungen
hergestellt, und diese werden als Standards verwendet.
- *
Die entsprechende saure Phosphatase-Aktivität (HFU/ml) wird erhalten durch
Teilen der Phosphorkonzentration (nmol/ml) durch die Hydrolysezeit
(15 min) und Multiplizieren mit 40 (Gesamtvolumen nach Hydrolysereaktion/Probenvolumen)
und mit 10 (Verdünnung
vor Analyse von anorganischem Phosphor).
-
4,0
ml jeder Verdünnung
werden in zwei Teströhrchen
pipettiert. Außerdem
werden 4,0 ml Wasser in ein Röhrchen
pipettiert (Reagens-Blindprobe). 4,0 ml Reagens C werden zugegeben,
und es wird gemischt. Es wird 20 min lang bei 50°C inkubiert, und es wird auf
Raumtemperatur abgekühlt.
Die Extinktionen bzw. Absorptionswerte werden bei 820 nm gegen die
der Reagens-Blindprobe gemessen. Eine Standardkurve wird durch Auftragen
der Absorptionswerte gegen saure Phosphatase-Aktivität (HFU/ml)
erstellt. Mit jeder Serie an Assays muss eine neue Standardlinie
konstruiert werden.
-
Berechnung.
Die Blindproben-Extinktion wird von der Proben-Extinktion subtrahiert
(die Differenz sollte 0,100 bis 1,000 sein). Die saure Phosphatase-Aktivität (HFU/ml)
wird von der Standardlinie abgelesen und mit dem Verdünnungsfaktor
multipliziert. Um die Aktivität
(HFU/g) von Enzympulvern zu berechnen, wird das Ergebnis (HFU/ml)
ferner mit 25 (ml) multipliziert und durch das exakte Gewicht der
Probe (g) geteilt.
-
Vorbereitung
von Futter und anderen unlöslichen
Proben für
saure Phosphatase- Analyse.
Etwa 2,5 g gemahlene Probe werden in zwei 50 ml-Becher akkurat gewogen.
20,0 ml Glycinpuffer werden zugegeben. Unter Verwendung eines Magnetrührers wird
etwa 30 min lang bei Raumtemperatur gemischt. Jeweils 10 ml werden
in Zentrifugenröhrchen überführt, und
das feste Material wird durch 10-minütige Zentrifugation bei 2004
g abgetrennt. 2,5 ml des Überstands
werden auf PD-10-Gelfiltrationssäulen
(Sephadex G-25M, Pharmacia 17-0851-01)
aufgetragen, die mit 25 ml Glycinpuffer äquilibriert sind. Das Eluat
wird verworfen. Dann werden 3,5 ml Glycinpuffer auf die Säule aufgetragen
und das Eluat in einem Messzylinder gesammelt. Das Volumen wird
mit Glycinpuffer auf 5,0 ml aufgefüllt (Verdünnungsfaktor 2) und auf saure
Phosphatase-Aktivität untersucht.
Die Aktivität
HFU/g wird erhalten durch Multiplizieren der gemessenen Aktivität (HFU/ml)
mit 40 (Verdünnungsfaktor
Volumen Extraktionspuffer) und durch das exakte Gewicht der Probe
(g) geteilt. Referenz: Chen, P. S., et al., Anal. Chem. 28: 1756–1758 (1956).
-
BEISPIEL 3
-
Reinigung von Phytase
und pH 2,5-saurer Phosphatase
-
Das
Folgende wird zur Bezugnahme darauf, wie der geschulte Fachmann
Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase reinigen würde, bereitgestellt.
-
I. PHYTASE
-
Enzymreinigung.
Die Schritte wurden bei 4 bis 8°C
durchgeführt,
wenn es nicht anders angegeben ist. Das Ausgangsmaterial war das
von Aspergillus niger var. awamori ALKO 243 produzierte, zellfreie
Kulturmediumkonzentrat.
-
Ammoniumsulfatfällung. Das
Kulturfiltratkonzentrat (990 ml) wurde auf einem Eisbad gehalten,
und 0,436 g Ammoniumsulfat wurden pro ml zugegeben (70% Sättigung).
Nach 30 min wurde das Präzipitat
durch 15-minütige
Zentrifugation bei 10004 g abgetrennt und verworfen.
-
Hydrophobe
Wechselwirkungschromatographie. Der Überstand (1070 ml) wurde auf
eine Octyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia)-Säule (5 cm × 17 cm), äquilibriert mit einer Lösung, enthaltend
0,436 g (NH4)2SO4 pro ml 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), aufgetragen.
Die Säule
wurde mit 500 ml der Äquilibrierungslösung gewaschen
und dann mit einem linearen Gradienten von 500 ml, enthaltend 70→0% Ammoniumsulfat
in 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2) entwickelt. Fraktionen von 10 ml
wurden gesammelt und auf Phytase- und saure Phosphatase-Aktivität analysiert.
Das meiste der Phytase-Aktivität
eluierte zum Beginn des Gradienten. Die Fraktionen wurden für den nächsten Schritt
zusammengefasst ("pooled"). Die nach der Phytase-Aktivität eluierenden
Fraktionen, die das meiste der saure Phosphatase-Aktivität enthielten,
wurden für
die saure Phosphatase-Reinigung (siehe unten) zusammengefasst.
-
Anionenaustauschchromatographie.
Die zusammengefassten Phytase-Fraktionen (129 ml) wurden durch Ultrafiltration
unter Verwendung einer Amicon PM 10-Membran konzentriert. Das übrige Ammoniumsulfat
wurde durch PD 10 (Pharmacia)-Gelfiltrationssäulen, äquilibriert mit 50 mM Bis-Tris/HCl
(pH 6,2), entfernt. Die Probe, in 24,5 ml, wurde auf eine DEAE-Sepharose
(Pharmacia)-Säule
(5 cm × 7
cm), äquilibriert
mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), aufgetragen. Die Säule wurde
mit dem Gleichgewichtspuffer (100 ml) gewaschen und durch einen
linearen Gradienten von 200 ml, enthaltend 0→0,5 M NaCl in Gleichgewichtspuffer,
entwickelt.
-
Gelfiltration.
Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung
eines Centricon-30-Mikrokonzentrators auf ein Gesamtvolumen von
600 μl konzentriert.
100 μl-Anteile
wurden bei etwa 23°C
und 0,3 ml/min durch eine Superose 12 HR 10/30-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert
mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2), laufen gelassen.
-
Kationenaustausch.
Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung
eines Centricon-30-Mikrokonzentrators in 50 mM Natriumformiat (pH
3,8) überführt. Die
Probe wurde in zwei Portionen von 2 ml auf eine Mono S HR 5/5-FPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert
mit 50 mM Natriumformiat (pH 3,8), bei etwa 23°C aufgetragen. Die Säule wurde
mit dem Äquilibrierungspuffer
(10 ml) gewaschen, und das gebundene Protein wurde bei 60 ml/h mit
einem linearen Gradienten von 20 ml, enthaltend 0→430 mM NaCl in Äquilibrierungspuffer,
eluiert.
-
II. SAURE PHOSPHATASE
-
Gelfiltration.
Die zusammengefassten Fraktionen, die das meiste der saure Phosphatase-Aktivität aus dem
hydrophobe Wechselwirkungschromatographie-Schritt enthielten, wurden
durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon PM 10-Membran
konzentriert. Die konzentrierte Probe (25 ml) wurde durch eine Sephacryl
S-200 (Pharmacia)-Säule
(2,6 cm × 94
cm), äquilibriert
mit 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2) bei 20 ml/h, laufen gelassen.
-
Anionenaustauschchromatographie.
Die zusammengefassten Fraktionen (48 ml) wurden auf eine DEAE-Sepharose
(Pharmacia)-Säule
(5 cm × 7
cm), äquilibriert
mit 50 mM Bis-Tris/HCl
(pH 6,2), aufgetragen. Die Säule
wurde mit 100 ml Äquilibrierungspuffer
gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 200 ml, enthaltend
0→0,5 M
NaCl in Äquilibrierungspuffer,
entwickelt.
-
Anionenaustauschchromatographie.
Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden konzentriert und
durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon PM 10-Membran
in 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,0) überführt. Die
Probe wurde in vier Portionen von 3,5 ml auf einer Mono Q HR 5/5-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert
mit 20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,0), bei etwa 23°C und 60 ml/h laufen gelassen.
Die Säule
wurde mit 10 ml des Gleichgewichtspuffers gewaschen, und das gebundene
Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 20 ml, enthaltend
0→350 mM
NaCl in Gleichgewichtspuffer, eluiert.
-
Gelfiltration.
Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefasst, konzentriert und
mit einem Centricon-30-Mikrokonzentrator in 20 mM Bis-Tris/HCl (pH
6,2), enthaltend 150 mM NaCl, zu einem Gesamtvolumen von 400 μl überführt. 100 μl-Portionen
wurden bei etwa 23°C
und 18 ml/h durch eine Superose 12 HR 10/30-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert
mit dem Probenpuffer, laufen gelassen.
-
Anionenaustauschchromatographie.
Die zusammengefassten aktiven Fraktionen wurden mit einer PD 10-Gelfiltrationssäule in 20
mM Histidin/HCl (pH 5,8) überführt. Die
Probe wurde in vier Portionen von 1 ml auf einer Mono Q HR 5/5-HPLC-Säule (Pharmacia), äquilibriert
mit dem Probenpuffer, bei etwa 23°C
und 60 ml/h laufen gelassen. Die Säule wurde mit 5 ml Probenpuffer
gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit einem linearen Gradienten
von 20 ml, enthaltend 0→350
mM NaCl in Gleichgewichtspuffer, eluiert.
- nd
- = nicht bestimmt ("not determined")
-
BEISPIEL 4
-
Charakterisierung des
Peptidverdau gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase
-
Native
gereinigte Phytase (70 μg)
in 50 mM Tris-HCl pH 7,9 wurde mit 2% (G/G) Trypsin (TPCK-behandelt,
Sigma) 2 Stunden lang bei 37°C
verdaut und dann mit weiteren 2% (Gew./Gew.) Trypsin 21 Stunden lang
verdaut. Eine Charge nativer gereinigter Phosphatase in 100 mM Tris-HCl
pH 8,0 wurde mit 2% (Gew./Gew.) Trypsin 20 Stunden lang bei 37°C verdaut
und dann mit weiteren 2% (Gew./Gew.) Trypsin 6 Stunden verdaut.
Die Peptide wurden wie unten beschrieben gereinigt.
-
Eine
andere Charge gereinigter nativer Phosphatase wurde unter Verwendung
von 4-Vinylpyridin
wie folgt alkyliert: Lyophilisierte Phosphatase (75 μg) wurde
mit 40 μl
0,5 M Tris-HCl pH 7,5, enthaltend 6 M Guanidiumhydrochlorid, 2 mM
EDTA und 34 mM DTT, versetzt. Nach Zugabe von 1 μl 4-Vinylpyridin (Sigma) wurde das
Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (22°C) 1 Stunde lang aufbewahrt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl 1,4 M DTT gestoppt. Alkylierte
Phosphatase wurde dann durch HPLC mit einer C-1-Umkehrphasensäule (TSK TMS 250; 0,46 × 4 cm)
unter Verwendung eines 20% bis 70%-ACN/0,06% TFA-Gradienten (80% bis 30%
0,1% TFA) innerhalb von 30 Minuten gereinigt. Die bei 218 nm absorbierenden
Fraktionen wurden zusammengefasst und in einer Speed-Vac-Vakuumzentrifuge
eingedampft. Die getrocknete Probe wurde in 60 μl 70 mM Tris-HCl pH 9,1 resuspendiert
und mit 2% (Gew./Gew.) Lysylendopeptidase C (Wako Chemicals) 2 Stunden
lang bei 37°C
verdaut. Nach Zugabe weiterer 2% (Gew./Gew.) Lysylendopeptidase
C wurde die Inkubation bei 37°C
auf 26 Stunden verlängert.
Die Peptide wurden wie unten beschrieben gereinigt.
-
Peptidreinigung
und Amino-terminale Sequenzierung
-
Die
durch Verdaue erhaltenen Peptide wurden durch HPLC an einer C-18-Umkehrphasensäule (Vydac
218 TP B5; 0,46 × 25
cm) mit einem 90 Minuten-Gradienten von 0 bis 60% ACN/0,06% TFA
(100 bis 40% von 0,1% TFA) getrennt. Die Extinktion bei 218 nm wurde
zur Detektion von Peptiden verwendet.
-
Amino-terminales
Sequenzieren des gereinigten Peptids sowie des nativen Proteins
wurde durchgeführt,
indem sie in einem Gas-gepulsten Flüssigphasensequenzierer ("gaspulsed-liquid-phase-sequencer") (Kalkkinen und
Tilgmann, Journal of Protein Chemistry 7: 242–243 (1988)) verdaut wurden.
Die freigesetzten PTH-Aminosäuren
wurden on-line unter Verwendung von Kapillar-Umkehrphasen-HPLC analysiert.
-
Carboxy-terminales
Sequenzieren von Phytase
-
Eine
Charge gereinigter Phytase (53 μg)
wurde mit Carboxypeptidase Y (Sigma, 0,6 U) in 50 mM Natriumacetat
pH 5,6, enthaltend 10% Harnstoff und 0,05% SDS, bei Raumtemperatur
(22°C) verdaut.
Proben des Verdaus wurden zu verschiedenen Zeitpunkten genommen.
Diese wurden in einer Speed-Vac-Vakuumzentrifuge getrocknet und
gemäß dem Aminosäure-Analysierungs-Kit
Pico-Tag (Waters Association) mit Phenylisothiocyanat (PITC) derivatisiert.
Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde durch Umkehrphasen-HPLC
mit der Pico-Tag
C-18-Säule
durchgeführt,
und durch identisch derivatisierte Aminosäure-Standards quantifiziert.
-
Ergebnisse
und Diskussion
-
Sequenzen
konnten aus den Peptiden extrahiert werden, die "doppelte Sequenzen" (für
sowohl Phytase und Phosphatase, Tabellen 3 und 4) zeigten, da sie
quantitativ unterschiedlich waren und/oder die andere Sequenz schon
von sequenzierten Peptiden bekannt war. Native Phosphatase schien
gegen über
Lysylendopeptidase C-Verdau einigermaßen resistent zu sein. Nach
Alkylierung wurden Phosphatasepeptide jedoch gut mit Lysylendopeptidase
C erhalten.
-
Die
von Phytase erhaltene Amino-terminale Sequenz (Nphy, #1081; [SEQ
ID NO:50:]) war ähnlich, aber
nicht identisch mit der Amino-terminalen Sequenz von A. ficuum-Phytase
(LAVPASRNQSSGDT) [SEQ ID NO:17:], angezeigt von Ullah, A. H. J.,
Prep. Biochem. 18: 459–471
(1988). Aus Trypsin-Verdau resultierende Peptide sind in Tabelle
3 gezeigt. Ein Peptid (10 phy) [SEQ ID NO:23:] hatte mit dem internen
Peptid von A. ficuum-Phytase (MMQCQAEQEPLVRVLVNDR); Ullah, A. H.
J., Prep. Biochem. 18: 459–471
(1988), identische Sequenzen. Carboxy-terminales Sequenzieren von
Phytase ergab die Sequenz XSA-OH.
-
Von
dem Amino-terminalen Sequenzieren nativer und alkylierter Phosphatase
(Tabelle 4) wurden keine Ergebnisse erhalten. Ein Peptid (7Lpho,
#817 [SEQ ID NO:53]) war jedoch mit der Amino-terminalen Sequenz
von A. ficuum-saurer Phosphatase (pH-Optimum 2,5: FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDG),
veröffentlicht
von Ullah, A. H. J. und Cummings, B. J., Prep. Biochem. 17: 397–422 (1987),
und ein anderes (10Lpho. #941 [SEQ ID NO:54:]) scheint eine Fortsetzung
von diesem zu sein. Peptid 3Tpho (Peptid #1106 in Tabelle 4: SEQ
ID NO:61:]) könnte
auch eine Fortsetzung von Peptid 11Lpho (Peptid #943-2 in Tabelle
4; SEQ ID NO:60:) sein, weil es vier überlappende Aminosäuren: FSSG,
aufweist.
-
Peptid
1Lpho (Peptid #816 in Tabelle 4; SEQ ID NO:57) enthält die aktives
Zentrum-Konsensus-Sequenz
RHGXRXP [SEQ ID NO:18:] von Phytasen und Phosphatasen, vorgeschlagen
von Ullah, A. H. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 178: 45–53 (1991).
Das Peptid war hochhomolog, aber nicht identisch. Ein Phytasepeptid
(#675 [SEQ ID NO:37:], LKDPR) enthielt wiederum einen Teil der KDPRA
[SEQ ID NO:19:]-Homologie-Sequenz zwischen A. ficuum-Phytase und
verschiedenen Phosphatasen, angezeigt von Ullah, A. H. J. et al.,
Biochem. Biophys. Res. Comun. 178: 45–53 (1991).
-
Die
Ergebnisse zeigen an, dass A. niger-Phytase homolog zu A. ficuum-Phytase
ist, aber nicht damit identisch ist. Im Fall von saurer Phosphatase
(pH-Optimum 2,5) gelangt man zu der gleichen Schlussfolgerung.
-
-
-
-
-
-
BEISPIEL 5
-
Das Klonieren und Sequenzieren
des Gens für
saure Phosphatase mit pH 2,5-Optimum aus Aspergillus niger
-
I. ZUSAMMENFASSUNG
-
Das
Gen für
saure Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,5 ist aus Aspergillus
niger kloniert worden und sequenziert worden. Die translatierte
Nucleotid-Sequenz ergab für
die pH 2,5-saure Phosphatase ein Polypeptid von 479 Aminosäuren. Das
Gen für
dieses Protein wurde unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden,
basierend auf der Peptid-Sequenz des gereinigten Proteins, isoliert.
-
II. EXPERIMENTELLES UND
DISKUSSION
-
A. Entwerfen von Oligonucleotid-Sonden.
-
Die
Isolierung des Gens, codierend pH 2,5-saure Phosphatase (AP), wurde
durch Hybridisierung von degenerierten Oligonucleotiden, entworfen
von Peptid-Sequenzen, durchgeführt.
Mehrere interne Peptidfragmente waren aus gereinigter pH 2,5-AP
aus A. niger var. awamori-Stamm
ALKO 243 (ATCC 38854), wie zuvor in diesem Patent beschrieben, vorher
isoliert und sequenziert worden.
-
Ein
degeneriertes 17mer-Oligonucleotid, PHY-31, wurde aus dem saure
Phosphatase-Peptid
#816 (1Lpho in Tabelle 4 [SEQ ID NO:57:]) entworfen. Durch den Einbau
eines neutralen Inosins ist in PHY-31 eine perfekte Übereinstimmung
von 64 möglichen
Kombinationen vorhanden. Die Nucleotid-Sequenz von Oligonucleotid
PHY-31 und die korrespondierende Peptid-Sequenz ist in 1 gezeigt.
-
B. Hybridisierungsspezifität der Oligonucleotid-Sonden
-
Um
die Spezifität
der degenerierten Oligonucleotide zu bewerten, wurden sie mit [γ32P]-ATP zu einer hohen
spezifischen Aktivität
unter Verwendung von E. coli-T4-Polynucleotidkinase (BRL) endmarkiert
und verwendet, um die gesamte genomische DNA von ALKO 243 zu sondieren.
Genomische DNA wurde durch ein neutrales Lyseverfahren isoliert.
Kurz gesagt, wurden fein gemahlene, gefriergetrocknete Mycelien
mit einem 4%igen SDS-TE-Puffer lysiert. Zelltrümmer wurden entfernt, und der Überstand
wurde entfernt und zweimal mit einem gleichen Volumen Tris-gesättigtem
Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert. Genomische DNA wurde mit NH4OAC und EtOH präzipitiert. Pelletierte DNA
wurde durch Ultrazentrifugation über
CsCl gereinigt und wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY, USA (1982)) beschrieben zurückgewonnen.
Hybridisierung an genomische DNA mit [γ32P]-ATP-markierten,
degenerierten Oligonucleotiden, Maniatis et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY, USA (1982), wurde bei 42°C über Nacht
auf Filtern in Oligonucleotid-Hybridisierungslösung (6 × SSPE, 0,5% SDS, 3 × Denhardts,
100 μg/ml
tRNA) durchgeführt.
Nicht-spezifisches Binden wurde beseitigt, indem die Filter zweimal
30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1% SDS, und einmal
5 Minuten lang bei 42°C
in fri scher Lösung
gewaschen wurden. Eine Belichtung über Nacht auf Kodak X-Omat
AR-Film mit intensivierenden Filtern deckte positiv hybridisierende
Banden auf.
-
A.
niger ALKO 243-genomische DNA wurde mit pH 2,5 Oligonucleotid PHY-31
sondiert. Hybridisierung wurde wie bei genomischer Hybridisierung
durchgeführt.
Unter den Oligonucleotiden für
pH 2,5-AP ergab nur PHY-31 relativ spezifische Hybridisierung an
genomische DNA. Hybridisierung an eine vorherrschende und an eine
geringfügige
Bande zeigte ausreichende Spezifität zur Verwendung zum Durchmustern
der Bibliotheken an.
-
C. Isolierung und Charakterisierung
des pH 2,5-saure Phosphatase-Gens
-
Genomische
DNA wurde mit Sau3A teilverdaut, um Fragmente von 10–23 kb Länge zu produzieren. Verdaute
DNA wurde an BamHI-geschnittene, dephosphorylierte Lambda Dash II-Vektorarme
(Stratagene) ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro unter Verwendung
von Gigapack Gold-Verpackungsextrakten (Stratagene) verpackt. Ein
verpackter Phage ("packaged
phage") wurde verwendet,
um E. coli-Stamm P2392 zu infizieren. Die Lambda-Bibliothek wurde
mit dem Oligonucleotid PHY-31 auf das pH 2,5-AP-Gen unter den mit
genomischen Hybridisierungen in Abschnitt (B) etablierten Bedingungen
durchgemustert. Zwölf
hybridisierende Plaques wurden für
weitere Charakterisierung herausgenommen. Von jedem der Kandidaten
isolierte Bakteriophagen-DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen
verdaut und entweder mit PHY-31 oder einem Gemisch von PHY-34 und
PHY-35, die von einem unabhängigen
pH 2,5-AP-Peptid abgeleitet waren (1), sondiert. Einer
der Klone, AP99, enthielt ein zuvor in genomischer Southern-Analyse
identifiziertes SphI-Fragment von 2,1 kb, das stark an beide Sonden
hybridisierte. Eine starke Hybridisierung an zwei von verschiedenen
Peptid-Sequenzen
abgeleitete Oligonucleotide legte nahe, dass AP99 pH 2,5-AP-codierende
Sequenzen enthielt. Dieses SphI-Fragment von 2,1 kb wurde deshalb
in M13mp18 und M13mp19 zum Sequenzieren subkloniert. Translation
der Nucleotid-Sequenz dieses Subklons deckte die Peptid-Sequenzen,
einschließlich
dem N-terminalen Peptid (Tabelle 4), auf. Unmittelbar stromaufwärts von
dem N-terminalen Peptid ist eine typische Pilzsekretions-Signal-Sequenz,
beginnend mit einem Methionin-Startkodon an Position 136. Alle Peptid-Sequenzen,
bis auf #1108 (Peptid 9Tpho in Tabelle 4 [SEQ ID NO:63:]), welches
an Nucleotid-Position 1384 beginnt, waren in einem einzelnen ORF
vorhanden. Terminationskodons wurden zwischen Nucleotiden 1151 und
1384 in allen drei Leserahmen identifiziert. Dieses Ergebnisse machten
den Einfluss eines Introns/von Introns in dem 3'-Anteil des Gens nötig.
-
Die
Identifizierung von Introngrenzen wurde durch die Isolierung und
das Sequenzieren von pH 2,5-AP-cDNA durchgeführt. Die 3'-Region des pH 2,5-AP-Gens wurde aus
der korrespondierenden cDNA durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung
von pH 2,5-AP-spezifischen
Primern isoliert. A. niger var. awamori ALKO 243 wurde in RNA-Nährlösungsmedium,
pro Liter bestehend aus 2,0% Maisstärke (Sigma), 1,0% Proteasepepton
(Difco), 30,0 g Glucose, 5,0 g NH4NO3, 0,5 g MgSO4·7H2O, 0,5 g KCl, 0,183 g FeSO4·7H2O, kultiviert. Gesamt-RNA wurde im Wesentlichen
durch das LiCl-Präzipitationsverfahren
von McAda und Douglas (McAda, P. C., et al., Meth. Enrymol. 97:
337–344
(1983)) isoliert. Polyadenylierte Messenger-RNA wurde aus Gesamt-RNA
durch die Verwendung von Oligonucleotid(dT)-Cellulose-Säulen (Pharmacia), wie vom Hersteller
angegeben, affinitätsgereinigt.
Die Oligonucleotid-PCR-Primer UPPHOS (5'GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3') [SEQ ID NO:66:]
und DOWNPHOS (5'-GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT-3') [SEQ ID NO:16:]
wurden gemäß der Genom-Sequenzen
mit flankierenden EcoRI-Restriktionsstellen synthetisiert. UPPHOS
und DOWNPHOS sind invers orientiert und in dem genomischen Klon
durch 978 Basen getrennt. Erststrangsynthese wurde mit dem BMB-cDNA-Kit
gemäß den Empfehlungen
des Herstellers mit 1,0 μg
mRNA und DOWNPHOS durchgeführt.
PCR-Amplifikation
des cDNA·mRNA-Komplexes
mit Oligonucleotid-Primern UPPHOS und DOWNPHOS ergab ein spezifisches
Produkt von etwa 850 Basenpaaren ("bps"). PCR-Amplifizierung von
pAP-1-Plasmid-DNA mit denselben Primern ergab das erwartete Produkt
von 1006 bps. Gelgereinigtes cDNA-PCR-Produkt wurde mit EcoRI geschnitten
und in pUC18 zum Doppelstrangsequenzieren unter Verwendung des United
States Biochemical Sequencase II-Kits subkloniert. Die Primer amplifizierten
ein Fragment von 850 bp aus der cDNA und das erwartete Fragment
von 1006 bp aus klonierter genomischer DNA. Sequenzieren des amplifizierten
cDNA-Fragments deckte das Vorhandensein von drei kurzen Introns
auf, wobei jedes Donor-, Lasso- und Aktzeptor-Konsensus-Pilz-Sequenzen
aufwies. Die codierende Sequenz wird durch Spleißen der Nucleotide 136–916, 971–1088, 1141–1245 und
1305–1740
erlangt. Die resultierende translatierte Sequenz codiert für ein Protein
von 479 Aminosäuren,
wie in 2 gezeigt.
-
Das
pH 2,5-AP-Polypeptid, vorhergesagt aus der Nucleotid-Sequenz, hat
ein berechnetes Mr von 52678. Das SphI-Fragment
von 2,1 kb in pUC18 (pAP-1) enthielt 135 bp der stromaufwärtigen pH
2,5-AP-Sequenz.
-
BEISPIEL 6
-
Aspergillus niger-Phytase-Produktion
in Trichoderma reesei
-
II. EXPERIMENTELLE PROTOKOLLE
-
1. Bakterielle Stämme, Phage
und Plasmide
-
Zum
Subklonieren und Sequenzieren wurden die E. coli-Stämme DH5α (Hanahan,
D., "Techniques
for transformation of E. coli",
in DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford,
S. 109–135
(1985); Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) und
XL-1-Blue (Bullock, W. O., et al., BioTechniques 5: 376–378 (1987);
Stratagene, La Jolla, CA, USA) verwendet. E. coli Y1090 (r–)
wurde (Huynh, D. S., et al., "Constructing
and screening cDNA libraries in λgt1
and λgt11", DNA Cloning, Bd.
1, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford, S. 49–57 (1985);
Promega Biotec Protoclone GT System, Madison, WI, USA) als ein Wirt beim
Kultivieren von λgt11-Phage
verwendet.
-
Aspergillus
niger var. awamori ALKO 243 (ATCC 38854) wurde als ein Donor des
Phytase-Gens verwendet. T. reesei-Stämme ATCC 56765 (RutC-30), ALKO
233 (VTT-D- 791256,
Bailey und Nevalainen, Enzyme Microb. Technol. 3: 153–157 (1981))
und ALKO 2221 wurden als Empfänger
für das
Phytase-Gen verwendet. ALKO 2221 ist eine schwache Aspartylproteasemutante,
abgeleitet von dem Stamm ALKO 233 durch UV-Mutagenese.
-
Der
Phage λgt11
(Promega) wurde zum Erstellen der Genbibliothek verwendet. Die Phagen
wurden durch von Silhavy et al. beschriebene Standardverfahren kultiviert
(Silhavy, T. J., et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1984)).
-
Als
Vektoren zum Subklonieren wurden pUC9 (Boehringer Mannheim, BRD)
und pALK307, ein Derivat von pIBI76 (IBI, New Haven, Conn., USA),
verwendet. Um pALK307 zu erhalten, wurde ein NaeI-PvuI-Fragment
von ungefähr
940 bp (tatsächlich
941 bp) aus pIBI76 deletiert. Dies ist der einzige Austausch in
pIBI76. Das Plasmid pAMH110 (Nevalainen, H., et al., "The molecular biology
of Trichoderma and its application to the expression of both homologous
and heterologous genes",
in Molecular Industrial Mycology, Leong und Berka, Hrsg., Marcel
Dekker Inc., New York, S. 129–148
(1991)), enthält
die Trichoderma reesei-cbh1-Promotor-
und -Terminator-Bereiche. Das Plasmid p3SR2 (Kelly und Hynes, EMBO
J. 4: 475–479
(1985)) enthält
das Aspergillus nidulans-Acetamidase-Gen. p3SR2 ist freundlicherweise
von Dr. M. Hynes (University of Melbourne, Australien) gespendet
worden.
-
2. Kultivierungsmedien
und Kulturbedingungen
-
E.
coli-Kultivierungen wurden bei 37°C über Nacht
durchgeführt,
und Kultivierungen von filamentösen Pilzen
bei 30°C
für 5 bis
7 Tage zur Enzymproduktion und für
2 Tage, wenn Mycelien für
DNA-Isolierung kultiviert wurden.
-
E.
coli wurden in L-Nährlösung (Maniatis,
T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)), ergänzt mit
Ampicillin (50–100 μg/ml), wenn benötigt, kultiviert.
PD-Agar-Schrägen
("slants") (Kartoffel-Dextrose-Brühe von Difco,
Detroit, MI, USA) wurden zum Kultivieren der Aspergillus- und der
Trichoderma-Stämme
verwendet. Aspergillus niger ALKO 243-Mycel zur DNA-Extraktion wurde
in vollständigem
Aspergillus-Medium, enthaltend 2% (Gew./Vol.) Malzextrakt (Difco),
0,1% (Gew./Vol.) Bacto-Pepton (Difco) und 2% (Gew./Vol.) Glucose,
kultiviert. Die Platten und Medien für T. reesei-Transformationen
waren wie in Penttilä et
al. (Penttilä,
M., et al., Gene 61: 155–164
(1987)). Die Transformanten wurden auf selektivem Acetamid-CsCl-Medium
gereinigt (Penttilä,
M., et al., Gene 61: 155–164
(1987)), bevor auf PD-Schrägen überführt wurde.
-
Zum
Plattendurchmustern von hohen Phytase-Produzenten wurden T. reesei-Klone,
transformiert mit der cbh1-Promotor/Phytase-Fusion, 3 bis 5 Tage
lang auf Trichoderma-Minimal-Mediumplatten
ohne Glucose und ergänzt
mit 1% Natriumphytat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1% Solka Floc
und 1% "proteose
peptone" (Difco)
kultiviert. Wenn das Konstrukt, enthaltend den Phytase-Promotor,
für die
Transformation verwendet wurde, wurde das Durch mustern nach hohen
Phytase-Produzenten auf Platten durchgeführt, die 1% Natriumphytat und
1% "proteose peptone", aber kein Natriumphosphat
enthielten.
-
Für die Phytase-Produktion
wurde A. niger ALKO 243 5 Tage lang in einem Sojamehlmedium, enthaltend
Glucose und Mineralsalze (alle von Merck, Darmstadt, BRD), kultiviert;
der pH wurde auf 5,0 eingestellt. Für Phytase-Expression von dem
cbh1-Promotor wurden T. reesei-Transformanten 7 Tage lang (250 UpM)
in einem Lactose-basierten Kultivierungsmedium kultiviert. Zum Kultivieren
des mit dem Fragment, enthaltend den Phytase-Promotor, transformierten
T. reesei, wurde Trichoderma-Minimalmedium mit 50 g/l Sojamehl ergänzt, und
es wurde kein Natriumphosphat zugegeben.
-
Die
Bestandteile des Sojablütenmediums
sind wie folgt (pro Liter): 50 g Sojablüten, 30 g Glucose, 5,0 g NH4NO3, 0,5 g MgSO4·7H2O, 0,5 g KCl, 0,183 g FeSO4·7H2O bei pH 5,0. Das auf Lactose basierende
Kultivierungsmedium enthält:
4% Molke, 1,5% Komplexstickstoffquelle, 1,5% KH2PO4, 0,5% (NH4)2SO4, bei pH 5,5.
-
3. DNA-Präparationen
-
Plasmid-DNA
wurde aus E. coli (großer
Maßstab)
unter Verwendung von Qiagen-Säulen (Diagen GmbH,
Düsseldorf,
BRD) gemäß dem Protokoll
des Herstellers isoliert. Für
rasches Durchmustern wurde das Verfahren von Holmes und Quigley
(Anal. Biochem. 114: 193–197
(1981)) verwendet. Chromosomale DNA von Aspergillus wurde von lyophilisierten
Mycelien, wie in Clements und Roberts (Curr. Genet. 9: 293–298 (1986)) und
in Raeder und Broda (Lett. Appl. Microbiol. 1: 17–20 (1985))
beschrieben, isoliert.
-
4. Klonierungsprozeduren
-
Vorwiegend
wurden die Standard-DNA-Verfahren, beschrieben von Maniatis et al.
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spr. Harbor, NY, USA (1982), verwendet. Die/das bei den DNA-Manipulationen
verwendete(n) Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, Klenow-Fragment
von DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Polynucleotidkinase und
EcoRI-Methylase waren von Boehringer (Mannheim, BRD) und New England
Biolabs (Beverley, MA, USA). Mungbohnennuclease war von BRL (Gaithersburg,
MD, USA) und ExoIII von Pharmacia (Uppsala, Schweden). Jedes Enzym
wurde gemäß den Instruktionen
des Anbieters verwendet.
-
Zum
Herstellen der Genbank wurde die chromosomale DNA mit HaeIII teilverdaut.
EcoRI-Methylase-Behandlung, Größenfraktionierung
und Verpacken wurden wie in Paloheimo et al. (Paloheimo, M., et
al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 584–591 (1992)) durchgeführt. Fragmente
mit einer Größe von 2–8 kb wurden für die Konstruktion
der Genbank verwendet.
-
Subklonieren
in den Plasmidvektor wurde durch Verwenden von Standard-DNA- Verfahren (Maniatis, T.,
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)) durchgeführt. DNA-Fragmente
zum Klonieren oder für
Transformationen wurden aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt
(FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) durch das Gefrier-Tau-Phenol-Verfahren
(Benson, S. A., Bio/Techniques 2: 66–68 (1984)) oder durch Verwenden
der GeneClean®-
oder MermaidTM-Kits (BIO 101 Inc., La Jolla,
CA, USA) gemäß der Instruktionen
des Anbieters isoliert.
-
Das
Sequenzieren wurde direkt von den Plasmiden durch das Sanger-Verfahren
(Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977))
mittels SP6-, T7-, pUC/M13-Primern
und Verlängerungsprimern
und des "Promega
Sequenase"-Sequenzier-Kits
(United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH, USA) durchgeführt. Fusionen
zwischen dem cbh1-Promotor und dem Phytase-Gen wurden durch eine
automatisierte Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems 373A, Foster
City, CA, USA) unter Verwendung des "Taq DyeDeoxyTM Terminator
Cycle Sequencing-Kit (Applied Biosystems) sequenziert. Die verwendeten
Oligonucleotide wurden durch einen "Applied Biosystems 381A Synthesizer" synthetisiert, ausgenommen
der pUC-Primer, die von der United States Biochemical Corporation
erworben wurden.
-
DNA-Sonden
wurden unter Verwendung des nicht-radioaktiven DIG-DNA Labelling
and Detection-Kit von Boehringer gemäß den Instruktionen des Anbieters
markiert.
-
Hybridisierungen
wurden bei 68°C
wie in den Instruktionen des Anbieters (Boehringer) durchgeführt. Hybond
N-Nylonfilter von Amersham wurden bei den Plaquedurchmusterungen
und bei den Southern-Blot-Hybridisierungen verwendet.
-
Wenn
die Plaques mit einem Antiserum durchgemustert wurden, wurde ein
Phytasespezifisches polyklonales Antiserum KH1236 verwendet. KH1236
wurde gegen eine gereinigte und deglykosylierte Phytase-Präparation
(M. Turunen, Alko Ltd.) im National Public Health Institute (Helsinki,
Finnland) hergestellt. Anti-Kaninchen-IgG-alkalisches Phosphat-Konjugat
und Farbentwicklungssubstrate von ProtoBlotTM Immunoblotting-System
(Promega) wurden verwendet, um die Immunkomplexe zu detektieren.
-
5. Transformationen
-
E.
coli-Stämme
wurden gemäß dem Verfahren
von Hanahan ("Techniques
for transformation of E. coli",
in DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford,
S. 109–135
(1985), transformiert, und T. reesei-Stämme wie in Penttilä et al.
(Gene 61: 155–164
(1987)). Wenn die ligierten Fragmente transformiert wurden (die
D-Transformante in Tabelle 7), wurde das Ligationsgemisch nicht
weiter gereinigt, sondern wurde als solches in den Transformationen
verwendet. Vor dem Sporulieren auf Kartoffeldextroseagar (PD)-Schrägen ("slants") wurden T. reesei-Transformanten
auf das selektive Medium transferiert und durch Konidien gereinigt.
-
6. Enzym-
und Proteinmessungen
-
Für die Enzym-Assays
wurde T. reesei-Mycel von dem Kulturmedium durch 15- bis 30-minütige Zentrifugation
bei 5000 bis 10000 UpM (Sorvall SS-34, Dupont Company, Wilmington,
Delaware, USA) abgetrennt. A. niger-Kulturen wurden 40 min lang
bei 10000 UpM (Sorvall SS-34) zentrifugiert. Die Phytase-Aktivität wurde von
dem Kulturüberstand
als die Menge von anorganischem Phosphat gemessen, die durch enzymatische
Hydrolyse von Natriumphytat substrat bei 37°C, wie früher beschrieben, freigesetzt
wurde. Eine normalisierte Phytase-Einheit (PNU, "phytase normalized unit") ist als die Menge
von Phytase-Aktivität
definiert, die von dem A. niger ALKO 243-Stamm unter den verwendeten
Kultivierungsbedingungen produziert wird.
-
Die
Phytase-Produktion auf den Natriumphytat-Assayplatten wurde durch
Gießen
des Reagens C (3:1:1-Verhältnis
von 1 M H2SO4, 2,5%iges
Ammoniummolybdat, 10%ige Ascorbinsäure) auf die Platten und 15-minütiges Inkubieren
der Platten bei 50°C
visualisiert. Die Reduktion des Phosphormolybdat-Komplexes führt zu bläulicher
Farbe.
-
Amyloglucosidase-Aktivität (AGU)
wurde durch Verwendung von 1%iger Zulkowsky-Stärke
(Merck) als ein Substrat und Messen der Menge der freigesetzten
Glucose-Einheiten durch Kochen mit DNS-Reagens (siehe unten) nach
10-minütiger
Reaktion bei 60°C
bei pH 4,8 gemessen. Proteasen (HUT) wurden wie in Food Chemicals
Codex (1981) bei pH 4,7 unter Verwendung von 2%igem Hämoglobin
(Sigma) als ein Substrat gemessen. Endoglucanase (ECU)- und Cellobiohydrolase
(FPU)-Aktivitäten
wurden wie in IUPAC's "Measurement of Cellulase
Activities (IUPAC Commission on Biotechnology, Measurement of Cellulase
Activities, Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute
of Technology, Delhi, Indien, S. 5–7 und 10–11 (1981)) gemessen. 1%ige
Hydroxyethylcellulose (Fluka AG) in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH
4,8) und Whatman Nr. 1-Papier wurden jeweils als Substrate verwendet.
Verwendete DNS unterschied sich von der im Protokoll der IUPAC Beschriebenen
und wurde hergestellt, indem zuerst 50,0 g 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure (Merck) in
41 deionisiertem Wasser verdünnt
wurden. Dann wurden 80,0 g NaOH langsam unter Verwendung des Magnetrührers zugegeben,
und 1500 g Natrium-Kaliumtartrat (Merck) wurden zugegeben und durch
Erwärmen der
Lösung
(Maximaltemperatur 45°C)
verdünnt.
Das Gesamtvolumen wurde auf 51 eingestellt, die Lösung wurde
durch Whatman Nr. 1 filtriert und vor Licht geschützt.
-
CBHI-Protein
wurde von dem Kulturüberstand
gemessen, indem ein SDS-Polyacrylamidgel
laufen gelassen wurde und die CBHI-Proteinbande detektiert wurde
(T. reesei ALKO 233- und ALKO 2221-Stämme) oder durch Dot-Blotting
von Proben unter Verwendung der Schleicher & Schuell's (Dassel, BRD) "MinifoldTM Micro-Sample
Filtration Manifold" (T.
reesei ATCC 56765). CBHI-Protein wurde unter Verwendung von CBHI-spezifischem
monoklonalen Antikörper
CI-89 (Aho, S., et al., Eur. J. Biochem. 200: 643–649 (1991))
und Anti-Maus-IgG-alkalisches
Phosphat-Konjugat (Promega) detektiert. Die Visualisierung der Immunkomplexe wurde
wie beim Plaquedurchmustern durchgeführt.
-
7. SDS-PAGE
und Western-Blot-Analyse
-
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese
(SDS-PAGE) und Western-Blot-Analyse
wurden wie in Laemmli (Laemmli, U. K., Nature 227: 680–685 (1970))
und wie in Towbin et al. (Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 76: 4350–4354
(1979)) durchgeführt.
Visualisierung des Phytaseproteins in Western-Blots wurde unter
Verwendung des po lyklonalen Kaninchen-Antiserums KH1236 durchgeführt. Die
Visualisierung der Immunkomplexe wurde wie beim Plaquedurchmustern
durchgeführt.
-
8. Polymerasekettenreaktion
(PCR)
-
Die
PCR-Reaktionen wurden durch den Techne Thermal Cycler PHC-2 (Techne
Ltd., Cambridge, UK) in 100 μl
Volumina bewerkstelligt. Die Reaktionsgemische enthielten 0,2 mM
von jedem dNTP (3'-Desoxynucleosid-5'-Triphosphat, Pharmacia)
in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5–2,0 mM MgCl2 und
0,01% (Gew./Vol.) Gelatine. Das verwendete Protokoll war das Folgende:
95°C (Plasmid)
oder 100°C
(chromosomale DNA)/5 min vor Zugabe der Taq-DNA-Polymerase (1–2 Einheiten,
Cetus Corp., Emeryville, CA, USA) und 100 μl Überschichtung von Paraffinöl, Denaturierung
95°C/1 min,
Anlagerung ("annealing") 60°C/1 min (bei
der inversen PCR 52°C),
Erweiterung ("extension") 72°C/2 min (bei
der inversen PCR 2,5 min), 30 Zyklen lang. Die abschließende Erweiterungszeit
war 9 min, um die Vervollständigung
der Strangsynthese zu gewährleisten. Wenn
ein Plasmid oder DNA-Fragment als eine Matrize verwendet wurde,
war die Menge der verwendeten Matrize 5–10 ng, und es wurden 20–50 pmol
von jedem Primer zugegeben. Wenn chromosomale DNA als eine Matrize
verwendet wurde, waren die entsprechenden verwendeten Mengen 100
ng und 50–100
pmol. Die ringförmige
Matrize für
die inverse PCR wurde aus der verdauten chromosomalen DNA wie in
Innis et al. (Ochman, H., et al., "Amplification of flanking sequences
by inverse PCR",
in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis, M.
A., et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, S. 219–227 (1990)),
angefertigt. PCR-Fragmente wurden mittels des GeneClean®- oder
MermaidTM-Kit (falls erforderlich von einem
Agarosegel) oder durch Qiagen-Spitzen ("tips")
gereinigt. Die Enden der Fragmente wurden unter Verwendung des DNA-Polymerase
I-Klenow-Fragments
aufgefüllt.
-
2. ERGEBNISSE
-
A. Molekulares Klonieren
der Aspergillus niger-Phytase
-
1. Produktion
der Phytase-Sonde durch ineinandergeschachtelte PCR-Amplifikation
-
Die
Oligonucleotid-Primer, verwendet in den PCR-Reaktionen, und die
korrespondierenden Aminosäure-Sequenzen
der Phytase ALKO 243-Peptide #792 (15 phy) und #420 (10 phy) (Tabelle
3, wie früher
beschrieben) sind in 3 gezeigt (Nucleotide 1409–1480 und
1727–1762
in der Phytase-Sequenz, siehe 5). Zwei
primäre
PCR-Reaktionen wurden durchgeführt.
In Reaktion A wurden Sinn-Oligonucleotid 1 (#792) und Gegensinn-Oligonucleotid
4 (#420) verwendet; in Reaktion B wurden Sinn-Oligonucleotid 3 (#420) und
Gegensinn-Oligonucleotid 2 (#792) verwendet. Die primäre PCR-Reaktion
A ergab eine einzelne Bande von etwa 400 bps, während die PCR-Amplifikation
von der Reaktion B kein Produkt ergab. Folglich wurde schlussgefolgert,
dass die Region, codierend für
das Peptid #792 auf der 5'-Seite
in der Phytase-Sequenz lokalisiert war, verglichen mit der, codierend
für das
Peptid #420. Das primäre
PCR-Fragment (A) wurde als eine Matrize für die zweite PCR mit internen Primern
von den Peptid-Sequenzen: Sinn-Oligonucleotid 2 und Gegensinn-Oligonucleotid
3, verwendet. PCR-Amplifikation von der zweiten PCR-Reaktion ergab
ein spezifisches Produkt von etwa 350 bps. Das PCR-Fragment wurde
in SmaI-verdautes pUC9 kloniert und sequenziert. Die von der DNA-Sequenz
abgeleitete Aminosäure-Sequenz
enthielt auch die bekannten Aminosäuren von dem Peptid #792 und
#420, die von den Primer-Sequenzen nicht codiert waren. Das PCR-Fragment
von ungefähr
350 bp wurde verwendet, um die DNA-Bank zu sondieren.
-
2. Durchmustern
der DNA-Bank
-
Die
Genbank enthielt ungefähr
1,9 × 106 pfu (Plaque-bildende Einheiten, "plaque forming units")/ml, von denen ungefähr 99,5%
ein Insert aufwiesen. Von etwa 80000 Plaques, die durchmustert wurden,
wurden 2 positive Klone Hae2-6 und Hae1-5 gefunden. Die Klone wurden
isoliert, gereinigt, und die Inserts (5,6 und 5,2 kb) wurden in
EcoRI-geschnittenes pALK307 subkloniert. Die Klone reagierten auch
mit dem Phytase-Antiserum KH1236. Die Inserts wurden restriktionskartiert,
und es wurde gefunden, dass das PCR-Fragment an das BamHI-SphI-Restriktionsfragment
von etwa 1 kb der Klone hybridisiert (siehe 4 für das Hybridisierungsgebiet
in der Phytase-Sequenz). Die Sequenz des Klons Hae2-6, die mehr
der 5'-Sequenz enthielt,
codierte für
15 interne tryptische Peptid-Sequenzen, aber die N-terminale Aminosäure-Sequenz
wurde nicht gefunden. Die N-terminale- und die Promotor-Gegendenthaltenden
Phagenklone wurden unter Verwendung einer 5'-Sonde, hergestellt durch inverse PCR,
aus der Genbank herausgemustert (Ochman, H., et al., "Amplification of
flanking sequences by inverse PCR", in PCR Protocols, A Guide to Methods
and Applications, Innis, M. A., et al., Hrsg., Academic Press, San
Diego, S. 219–227
(1990)).
-
3. Amplifikation des 5'-Endes und der Promotor-Sequenz
des Phytase-Gens durch inverse PCR
-
Restriktionsenzym-Verdaue
der genomischen DNA und Southern-Hybridisierungen mit der PCR-Sonde
von 350 bp zeigten, dass Verdaue der genomischen DNA mit SalI Fragmente
geeigneter Größe (1–3 kb) zur
Zirkularisierung und Amplifikation mit PCR erzeugten. Die für die inverse
PCR verwendeten Primer waren von Basen 1243–1257 (Gegensinn-Primer)- und
1204–1321
(Sinn-Primer)- Gegenden der Phytase-Sequenz (siehe 5).
Inverse PCR mit SalI-verdauter ALKO 243-DNA erzeugte eine PCR-Bande
von etwa 1,2 kb. Das PCR-Fragment
von 350 bp hybridisierte an das Fragment der inversen PCR, und durch
Sequenzieren des subklonierten Fragments wurde bestätigt, dass
es die stromaufwärts
liegenden Teile des Phytase-Gens enthielt. Außerdem war die N-terminale
Peptid-Sequenz eingeschlossen.
-
4. Isolierung
des kompletten Phytase-Gens
-
Das
von der inversen PCR erhaltene PCR-Fragment von 1,2 kb wurde als
eine Sonde verwendet, um 80000 Plaques zu durchmustern, von welchen
sieben positive Plaques identifiziert werden konnten. Das komplette
Phytase-Gen wurde auf einem Insert von etwa 6 kb eines Phagenklons
isoliert.
-
Das
SphI-Fragment von etwa 2,4 kb, enthaltend das Phytase-Gen und die
Promotorgegend, wurde in pALK307 (geschnitten mit SphI) subkloniert,
um pALK169 zu ergeben ( 4). Die Restriktionskarte des
Phytase-enthaltenden SphI-Fragments und die Lage des Phytase-Gens in dem Fragment
sind in der Plasmidkarte gezeigt.
-
Die
Phytase-Sequenz ist in
5 gezeigt. Die Sequenz, codierend
für das
Phytaseprotein, entspricht der Phytase-Sequenz von Aspergillus ficuum,
veröffentlicht
in der "Gist brocades" (Delft, Niederlande) PCT-Patentanmeldung
(
EP 420 358 oder WO91/05053)
mit 12 Unterschieden bei den abgeleiteten Aminosäuren. Jeder Unterschied bei
der abgeleiteten Aminosäure
war auf die Änderung
eines Nucleotids zurückzuführen und
könnte
auf Unterschiede zwischen den Stämmen
zurückzuführen sein.
Außerdem
wurden in der Sequenz, codierend das Struktur-Gen, 33 Nucleotidunterschiede gefunden,
die nicht zu Unterschieden bei der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz
führten.
In der Signal-Sequenz bestanden Unterschiede in zwei Nucleotiden
(der andere führte
zu einem Unterschied bei der abgeleiteten Aminosäure), und bei der vorgeschlagenen Intron-Gegend
konnten acht Unterschiede gefunden werden. Die Gesamt-Übereinstimmung pro Länge (Nucleotid-Sequenzen
von dem ersten ATG zu dem Stop-Kodon TAG zwischen den zwei Sequenzen
war 96,3%. Die zwischen den beiden Phytase-Sequenzen gefundenen
Unterschiede, von "Gist
brocades" und "ALKO" sind in der Tabelle
5 gezeigt.
-
-
Tabelle
5. Nucleotid- und Aminosäureunterschiede
zwischen Gist's-
und ALKO's-Phytase-Sequenzen. Die Nucleotid-Nummern
werden von dem ersten Met (ATG) in der Signal-Sequenz und Aminosäure-Nummern von dem N-terminalen
Leu gezählt
(siehe Fig. 5). Die Aminosäuren,
falls zwischen den beiden Sequenzen unterschiedlich, sind in Fettbuchstaben
geschrieben.
-
B. Konstruktion der Plasmide
für Überexpression
von Phytase in Trichoderma reesei
-
1. Die PCR-Fragmente
für die
präzisen
cbh1-Phytase-Fusionen
-
Die
Fusionen zwischen dem cbh1-Promotor und der Phytase-Signal-Sequenz
und zwischen der cbh1-Signal-Sequenz und dem Phytase-Gen wurden
durch PCR durchgeführt.
Die Phytase-Signal-Sequenz oder die N-terminale Sequenz des Phytaseproteins
beginnen präzise,
wo die korrespondierenden cbh1-Sequenzen beginnen würden (für die cbh1-Sequenz
siehe Shoemaker, S., et al., Bio/Technology 1: 691–696 (1983)).
Die für
die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind in 6 gezeigt.
Um pALK171 (Phytase-Signal-Sequenz) zu konstruieren, machten wir
von der SacII-Stelle in dem cbh1-Promotorbereich in dem 5'-PCR-Primer Gebrauch.
Die XhoI-Stelle (14 Nucleotide vom N-Terminus des Phytase-Gens)
wurde bei dem 3'-Primer
verwendet. Der 5'-Primer
war ein 39-mer, das einen "tail" bzw. "Schwanz" von 19 Nucleotiden
der cbh1-Promotor-Sequenz (die der Signal-Sequenz vorangeht) und
20 Nucleotiden von der Phytase-Signal-Sequenz enthielt. Der 3'-Primer war ein 22-mer.
Bei der Konstruktion von pALK172 (cbh1-Signal-Sequenz) machten wir
von der SfiI-Stelle in der cbh1-Signal-Sequenz bei dem 5'-Primer und von der SalI-Stelle der
Phytase (762 Nucleotide vom N-Terminus)
im 3'-Primer Gebrauch.
In diesem Fall war der 5'-Primer
ein 46-mer, enthaltend einen "tail" von 28 Nucleotiden
und 18 Nucleotiden der N-terminalen Phytase-Sequenz; der 3'-Primer war ein 24-mer. Bei all diesen
Primern wurden drei bis fünf
zusätzliche
Nucleotide an die Enden der PCR-Fragmente hinter den Restriktionsstellen-Sequenzen
angefügt,
um einen korrekten Schnitt zu gewährleisten. pALK169 wurde bei
den PCR-Reaktionen als eine Matrize verwendet.
-
Von
den PCR-Reaktionen wurden Fragmente der erwarteten Längen erhalten:
das Fragment, enthaltend die gewollte Fusion, war für pALK171
202 bps lang und für
pALK172 800 bps lang.
-
2. Konstruktion von Plasmiden
mit dem cbh1-Promotor: pALK171 (Phytase-Signal-Sequenz) und pALK172 (cbh1-Signal-Sequenz)
-
Plasmid
pALK170L wurde durch Schneiden des Phytase-Gens aus pALK169 als
ein SphI-XhoI-Fragment und Ligieren desselben an SphI XhoI-geschnittenes
pALK307 angefertigt. Das PCR-Fragment von 200 bp, enthaltend die
cbh1-Promotor- und Phytase-Signal-Sequenz, wurde mit XhoI geschnitten
und an pALK170L ligiert, das mit XbaI geschnitten, mit dem DNA-Polymerase
I-Klenow-Fragment behandelt und mit XhoI geschnitten worden war
(pALK170X, 7). Der Fusionsbereich und
der PCR-Fragment-Bereich wurden sequenziert, um zu gewährleisten,
dass bei der PCR-Amplifikation keine Fehler aufgetaucht waren. Phytase-Fragment, enthaltend
die Fusion, wurde als ein SphI (behandelt mit der T4-DNA-Polymerase)-SacII-Fragment isoliert
und wurde zwischen den cbh1-Promotor- und Terminatorbereichen des
Plasmids pAMH110, zuvor verdaut mit NdeI (aufgefüllt mit dem DNA-Polymerase
I-Klenow-Fragment)
und SacII, eingefügt.
Das erhaltene Plasmid (pALK171X, 7) enthält das Phy tase-Gen
präzise
an den cbh1-Promotor fusioniert. Um pALK171 zu konstruieren, wurde
das amdS-Gen (selektierbarer Marker) aus p3SR2 als ein SphI-KpnI-Fragment
isoliert, die Enden wurden mit der T4-DNA-Polymerase behandelt,
und amdS wurde dann an die SphI-Stelle von pALK171X (behandelt mit
der T4-DNA-Polymerase) ligiert. Das lineare Fragment von ungefähr 7,5 kb,
das keine bakteriellen Sequenzen enthielt, wurde aus pALK171 durch
Schneiden mit XbaI isoliert und wurde für die Transformationen verwendet.
-
pALK172
wurde im Wesentlichen auf dieselbe Art wie pALK171 konstruiert (siehe 8).
Das PCR-Fragment von 800 bp wurde mit SalI geschnitten und an XbaI
(aufgefüllt
mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment), SalI-geschnittenes pALK170L,
ligiert. Auch in diesem Fall wurden die Fusionen und die Sequenz
des PCR-Fragments durch Sequenzieren überprüft. Die Phytase-PCR-Fragment-Fusion
wurde aus pALK170S als ein SphI (behandelt mit der T4-DNA-Polymerase)-SfiI-Fragment
isoliert und an pAMH110 ligiert, das mit NdeI (aufgefüllt mit
dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment)-SfiI geschnitten worden war.
Um pALK172 zu konstruieren, wurde das das amdS-Gen enthaltende Fragment
an pALK172S auf dieselbe Weise ligiert wie beim Konstruieren von
pALK171. XbaI wurde auch in diesem Fall verwendet, um aus dem Vektorrückgrat das
in den Transformationen verwendete lineare Fragment auszuschneiden.
-
3. Konstruktion der Plasmide
mit dem Phytase-Promotor: pALK173A und pALK173B
-
Das
Phytase-Gen wurde mit seinem eigenen Promotor als ein SphI-Fragment
aus pALK169 isoliert und in die KpnI-Stelle von p3SR2 ligiert (in
beiden Fällen
wurden die Enden der Fragmente durch die T4-Polymerase aufgefüllt), was
in Plasmiden von etwa 11,2 kb pALK173A und pALK173B resultierte
(siehe 4 für pALK169 und 7 und 8 für die p3SR2-Karte).
In pALK173A sind die beiden Gene Phytase und amdS in einer parallelen
Orientierung, in pALK173B sind sie in entgegengesetzten Orientierungen
(9). EcoRI wurde verwendet, um pALK173A und pALK173B
zu linearisieren, wenn linearisierte Plasmide für Transformationen verwendet
wurden.
-
C. Transformation von
Trichoderma reesei und Durchmustern der Transformanten
-
Die
T. reesei-Stämme
ATCC 56765, ALKO 233 und ALKO 2221 wurden mit ringförmigen Plasmiden und
mit den XbaI-Fragmenten von den Plasmiden pALK171 und pALK172 (cbh1-Promotor)
transformiert. T. reesei-Stämme
ALKO 233 und 2221 wurden auch mit den linearisierten pALK171- und
pALK172-Plasmiden sowie mit ringförmigen und linearen pALK173A-
und pALK173B (Phytase-Promotor)-Plasmiden transformiert. Transformationshäufigkeiten
(Transformanten/μg
DNA) variierten von 3 bis 60, wenn die aus pALK171 oder pALK172
isolierten Fragmente verwendet wurden. Wenn ringförmige Plasmide
pALK171 oder pALK172 bei den Transformationen verwendet wurden,
waren die Häufigkeiten
etwa 50/μg
für T.
reesei ALKO 233 und ALKO 2221 und etwa 100/μg für T. reesei ATCC 56765. Transformationshäufigkeiten,
erhalten, wenn linearisierte Plasmide verwendet wurden, waren etwa 100/μg. Wenn pALK173A
oder pALK173B bei Transformationen verwendet wurden, waren die Häufigkeiten
von 6 bis 26 für
das lineare Plasmid und von 6 bis 20 für das ringförmige Plasmid.
-
Die
Regenerationshäufigkeit
der Sphaeroplasten variierte von 4,5% bis 13,2% für T. reesei-Stämme ALKO
233 und ALKO 2221 und war 1–2%
für den
T. reesei-Stamm ATCC 56765.
-
Die
Mengen der Transformanten, die auf die Phytase-Produktion auf Platten
hin durchgemustert wurden, sind in Tabelle 6 gezeigt. Jene Klone,
die klar einen blaugefärbten
Hof bzw. Halo um die Kolonie herum produzierten, wurden als positive
Klone gezählt.
-
Tabelle
6. Platten-Assay-positive Transformanten und Gesamtzahl getesteter
Klone. Die Anzahl der im Platten-Assay positiven Transformanten
und die Gesamtzahl von im Phytase-Platten-Assay getesteten Transformanten
sind gezeigt. Nur jene Transformantenstämme, die sowohl auf der Selektionsschräge als auch
auf dem Platten-Assay gut wuchsen, sind eingeschlossen. Als positive
Phytase-Produzenten sind jene Stämme
gezählt,
die auf dem Platten-Assay klare Phytase-Aktivität zeigten.
-
Die
Transformanten, die auf dem Platten-Assay die besten Produzenten
zu sein schienen, wurden in Schüttelkolben
kultiviert. Inocula wurden entweder direkt von Acetamid-Schrägen oder
von PD-Schrägen
nach Reinigung durch Konidien genommen. Von den T. reesei ATCC 56765,
ALKO 233 und ALKO 2221, transformiert mit den Fragmenten von pALK171
und von pALK172, wurden von jedem Satz an Transformanten 7 bis 16
Klone gereinigt, und die Phytase-Produktion wurde in Schüttelkolbenkultivierungen
getestet. Wenn ringförmige
Plasmide pALK171 oder pALK172 bei den Transformationen verwendet
worden waren, wurden 13 und 12 gereinigte T. reesei ATCC 56765,
bzw. vier bis sieben Transformanten-T. reesei-Stämme
ALKO 233 und ALKO 2221, kultiviert. Wenn linearisierte Plasmide
pALK171 oder pALK172 verwendet wurden, wurden von jedem etwa 20
Transformanten-Stämme
in Schüttelkolben
kultiviert. Von den Klonen von T. reesei ALKO 233, transformiert
mit den linearen pALK173A/B-Plasmiden, wurden sieben pALK173A- und
zwei pALK173B- (und mit den ringförmigen Plasmiden vier pALK173A-
und drei pALK173B-) Transformanten, die auf Platten Phytase-Aktivität anzeigten,
gereinigt und in Schüttelkolbenkultivierungen
getestet. Für
die T. reesei ALKO 2221-Transformanten waren die entsprechenden
in Schüttelkolbenkultivierungen
getesteten Mengen wie folgt: für
die linearen Plasmide drei pALK173A- und fünf pALK173B- und für die ringförmigen Plasmide
sechs pALK173A- und sechs pALK173B-Transformanten.
-
D. Phytase-Produktion
durch die Trichoderma-Transformanten
-
Die
besten Phytase-Produktionslevel von Transformanten von T. reesei
ATCC 56765, ALKO 233 und ALKO 2221, ohne E. coli-Sequenzen, wenn
der cbh1-Promotor (pALK171- und
pALK172-Fragmente) verwendet wurde, sind in Tabelle 7 gezeigt.
-
-
Etwa
3600 PNU/ml wurde mit der besten Transformante erhalten. Etwa der
gleiche Produktionslevel konnte durch Verwendung sowohl der Stämme T. reesei
ALKO 233 als auch ALKO 2221 erreicht werden. Die beste Phytase-produzierende
T. reesei ATCC 56765-Transformante
produzierte etwa 1800 PNU/ml. Sowohl die Phytase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz schienen
gleichermaßen
gut zu funktionieren, und es konnten die gleichen Level bei der
Phytase-Produktion erreicht werden, wenn T. reesei ALKO 2221 oder
ATCC 56765 als ein Wirtsstamm verwendet wurden. Bei T. reesei ALKO
233 war der Level produzierter Phytase-Aktivität höher, wenn die Phytase-Signal-Sequenz
verwendet wurde.
-
Einige
der Transformanten produzierten kein nachweisbares CBHI-Protein,
was höchst
wahrscheinlich die Integration der transformierenden DNA in den
cbh1-Locus anzeigt. Die Abwesenheit des CBHI-Proteins beeinflusste
die Produktionslevel in den durchmusterten Transformanten nicht,
d.h., man fand gute Produzenten, sowohl unter den Transformanten,
die normale Mengen von CBHI produzierten, als auch unter CBHI-negativen
Stämmen
(ALKO 233, ALKO 2221).
-
Die
besten, durch die Verwendung von ringförmigen und linearen Plasmid
pALK171 und pALK172 erhaltenen Produktionslevel sind in der Tabelle
8 gezeigt. Die besten Produktionsausbeuten wurden mit dem T. reesei
ALKO 2221 erhalten, der mit dem linearen Plasmid pALK171 (Phytase-Signal-Sequenz)
transformiert worden war.
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Tabelle
8. Phytase-Produktion durch die ringförmigen oder linearen Plasmide
pALK171 und pALK172 transformierten T. reesei-Stämme. Es sind die Phytase-Aktivitäten als
PNU/ml in den Kulturüberständen der
drei besten Phytase-produzierenden Transformanten von jedem Typ
gezeigt. T. reesei ATCC 56765-Transformanten wurden
vor den Kultivierungen durch Konidien gereinigt, und die Ergebnisse
sind Durchschnitte von zwei Schüttelkolbenkultivierungen.
Inocula für
Kultivierungen der T. reesei- und ALKO 2221-Transformanten wurden aus den Acetamid-Schrägen genommen,
und die gezeigten Ergebnisse sind von einer Schüttelkolbenkultivierung.
-
Auch
der A. niger-Phytase-Promotor kann die Expression des Gens in Trichoderma
fördern.
Jedoch sind die erhaltenen Enzymausbeuten viel geringer als mit
dem zu T. reesei homologen cbh1-Promotor: die von den Kulturüberständen von
Transformanten, enthaltend den eigenen Promotor der Phytase, erhaltenen
Aktivitäten
waren etwa 1 bis etwa 14 PNU/ml für die T. reesei ALKO 233-Transformanten
und etwa 6 bis etwa 120 PNU/ml für
die T. reesei ALKO 2221-Transformanten (Tabelle 9).
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Tabelle
9. Phytase-Produktion durch mit ringförmigem oder linearem Plasmid
pALK173A oder pALK173B (Phytase-Promotor) transformierten T. reesei-Transformanten.
Phytase-Aktivitäten
als PNU/ml in den Kulturüberständen der
Transformanten sind gezeigt. Transformanten sind vor Kultivierung
durch Konidien gereinigt worden. Die gezeigten Ergebnisse sind von
einer Schüttelkolbenkultivierung.
Ein "kleiner als"-Zeichen (<) bedeutet, dass
der Wert unterhalb des Detektionslevels war.
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E. Der Enzymhintergrund
in den Phytase-Präparationen,
produziert durch T. reesei
-
Phytase
wird in hohen Mengen in den T. reesei-Stämmen exprimiert, und der Hintergrund
anderer Enzymaktivitäten
in den Überständen von
T. reesei-Transformanten ist unterschiedlich zu jenen im Aspergillus-Überstand
(Tabelle 7). Sowohl Endoglucanase- als auch Cellobiohydrolase-Aktivitäten sind
wesentlich höher,
wenn T. reesei als ein Produktionswirt verwendet wird, verglichen
mit A. niger. Die verwendeten T. reesei-Stämme produzierten außerdem verhältnismäßig weniger
Glucoamylase-Aktivität
als der A. niger ALKO 243-Stamm.
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F. Phytaseprotein, produziert
durch die Trichoderma-Transformanten
-
Proben
aus den Wachstumsmedien der Transformanten (pALK171-Fragment) und
der nicht-transformierten T. reesei-Stämme ATCC 56765, ALKO 233 und
ALKO 2221 wurden in Western-Blots analysiert (10). Kurz beschrieben, wurden die folgenden Proben
analysiert: Spur 1: 50 ng von gereinigter Aspergillus ALKO 243-Phytase;
Spur 2: 15 ng von endoF-behandelter
Aspergillus ALKO 243-Phytase; Spuren 3 und 10: T. reesei ALKO 233;
Spuren 4–5
und 11–12:
T. reesei ALKO 233-Transformante 171FR/A4 bzw. A13; Spuren 6 und
13: T. reesei ALKO 2221; Spuren 7–8 und 14–15: T. reesei ALKO 2221-Transformante
171FR/A5 bzw. A9; Spur 9: T. reesei ALKO 2221-Transformante D2;
Spur 16: T. reesei ATCC 56765; Spuren 17, 18, 19: T. reesei ATCC
56765-Transformanten 171FR/A21, A11 bzw. A23. In jedem Fall wurden
2 μl von
einer 1:10-Verdünnung
des Kulturüberstands
auf einem Gel laufen gelassen. 171 FR ist der mit dem XbaI-Fragment
von dem Plasmid pALK171 transformierte Wirt.
-
Das
Molekulargewicht der Phytase, produziert durch Trichoderma, unterschied
sich von dem, produziert durch Aspergillus, und der Unterschied
schien auf Unterschieden im Glykosylierungslevel zu beruhen. Die von
T. reesei ALKO 233 sezernierte Phytase war in den Western-Blots als drei, und
diejenige, sezerniert durch T. reesei ALKO 2221 als 6 bis 9 Hauptproteinbanden
mit Größen von
etwa 45–65
kDa sichtbar, von denen die niedrigsten in der Größe der deglykosylierten
Aspergillus-Phytase (45–48
kDa in SDS-PAGE) entsprachen. Die von T. reesei ATCC 56765 sezernierte
Phytase war von einer Größe von 65–80 kDa
und bestand aus drei bis fünf
Proteinbanden. Das Molekulargewicht der nativen Aspergillus-Phytase,
laufen gelassen in SDS-PAGE, ist etwa 80–85 kDa. Das Phytaseprotein,
produziert durch die Transformanten, die mit pALK172-Fragment oder
pALK173A/B transformiert worden waren, zeigten dieselbe Art von
Bandenmuster.
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III. Schlussfolgerungen
-
Der
Produktionslevel von Aspergillus-Phytase, erhalten, wenn T. reesei
als ein Produktionswirt verwendet wurde, war überraschend hoch. Durch Verwenden
von T. reesei wird die Phytase in einem neuen Hintergrund produziert,
der sich von dem von Aspergillus unterscheidet und Enzyme, wichtig
z.B. bei Futteranwendungen, enthält.
Das Molekulargewicht des in Trichoderma produzierten Aspergillus-Phytaseproteins
ist unterschiedlich zu dem aus Aspergillus. Dieser Größenunterschied,
der auf unterschiedlicher Glykosylierung zu beruhen schien, beeinträchtigte
die Enzymaktivität
jedoch nicht.
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BEISPIEL 7
-
Produktion von Aspergillus
niger pH 2,5-saurer Phosphatase in Trichoderma reesei
-
I. EXPERIMENTELLE PROTOKOLLE
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1. Stämme und Plasmide
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E.
coli-Stämme
XL1-Blue (Bullock, W. O., et al., Biotechniques 5: 376–379 (1987);
Stratagene, La Jolla, CA, USA) und SureTM (Greener,
A., Strategies 3: 5–6
(1990); Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurden als Wirte für von den
Plasmiden pALK601 (12 und 13)
und pAP-1 (12 und 13)
angefertigte Konstruktionen verwendet. Das Plasmid pALK601 enthält die T.
reesei-cbh1-Promotor- und -Terminator-Sequenzen und das Aspergillus
nidulans-Acetamidase-Gen.
Das Plasmid pAP-1 enthält
das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen aus Aspergillus niger var. awamori
ALKO 243 (ATCC 38854).
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Trichoderma
reesei-Stamm ALKO 2221, eine Niedrig-Aspartylprotease-Mutante, abgeleitet
von dem T. reesei-Stamm ALKO 233 (VTT-D-79125) durch UV-Mutagenese,
wurde als ein Empfänger
für das
pH 2,5-saure Phosphatase-Gen verwendet.
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2. Wachstumsmedien und
Kulturbedingungen
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E.
coli-Stämme
wurden in L-Nährlösung (Maniatis,
T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1982)), ergänzt mit
Ampicillin (50 μg/ml),
wenn erforderlich, kultiviert. E. coli-Kultivierungen wurden bei
37°C über Nacht
durchgeführt.
-
PD-Agar-Schrägen ("Kartoffel-Dextrose"-Brühe von Difco,
Detroit, Michigan, USA) wurden zum Lagern der Trichoderma-Stämme verwendet.
Die Platten und Medien für
T. reesei-Transformationen waren im Wesentlichen wie in Penttilä et al.
(Penttilä,
M., et al., Gene 61: 155–164
(1987)). Die Transformanten wurden auf selektivem Acetamid-CsCl-Medium
(Penttilä,
M., et al., Gene 61: 155–164
(1987)) gereinigt, bevor sie auf PD-Schrägen transferiert wurden. T.
reesei-Transformanten wurden in auf Lactose-basierendem Medium (siehe
Beispiel 6, Unterparagraph 2) bei 30°C (250 Upm) 7 Tage lang zur
Expression von pH 2,5-saurer Phosphatase unter der Kontrolle des
cbh1-Promotors kultiviert.
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3. Manipulation
von DNA
-
Manipulationen
von DNA wurden wie oben für
Phytase beschrieben, hauptsächlich
durch Standardverfahren (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, USA (1982)), durchgeführt. Plasmid-DNA aus E. coli
wurde durch Verwendung von Qiagen-Säulen (Diagen GmbH, Düsseldorf,
BRD) gemäß den Instruktionen
des Anbieters isoliert. Durch schnelles Screening der Plasmid-DNA
aus E. coli wurde das Verfahren von Holmes und Quigley (Holmes und
Quigley, Anal. Biochem. 114: 193–197 (1981)) verwendet. Die/das
bei den DNA-Manipulationen verwendete(n) Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase,
Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und T4-DNA-Polymerase, waren von Boehringer
(Mannheim, BRD) und New England Biolabs (Beverly, MA, USA). Jedes
Enzym wurde gemäß der Empfehlung
des Anbieters verwendet. DNA-Fragmente
für das
Klonieren oder für
Transformationen wurden aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt
(FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) durch das Gefrier-Tau-Phenol-Verfahren (Benson,
S. A., Bio/Techniques 2: 66–68
(1984)) oder unter Verwendung des MermaidTM-Kits
(BIO 101 Inc., La Jolla, CA, USA) gemäß der Instruktionen des Anbieters
durchgeführt.
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Das
Sequenzieren der Fusionen zwischen dem cbh1-Promotor und dem pH
2,5-saure Phosphatase-Gen wurde mit pUC/M13-Primern und Verlängerungsprimern
unter Verwendung des des Taq DyeDeoxyTM Terminator
Cycle Sequencing-Kit (Applied Biosystems) und des automatisierten
Sequenzanalysators (Applied Biosystems 373A, Foster City, CA, USA)
durchgeführt.
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Die
verwendeten Oligonucleotide wurden von einem Applied Biosystems
(Foster City, CA, USA)-381A-Synthesizer, mit Ausnahme der M13-Primer,
die von Applied Biosystems erworben wurden, synthetisiert.
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4. Transformationen
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Transformationen
wurden auch wie oben für
Phytase beschrieben durchgeführt.
Transformation von E. coli-Stämmen
XL1-Blue oder Sure wurde durch das Verfahren des Anbieters (Stratagene
La Jolla, CA, USA) durchgeführt,
T. reesei-Stämme
wurden im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
von Penttilä et
al. (Penttilä, M.,
et al., Gene 61: 155–164
(1987)) transformiert. Das bei der Pilzprotoplasten-Präparation
für Transformationen
verwendete Novozym 234 war von Novo Industri AS (Kopenhagen, Dänemark).
Vor dem Sporulieren auf PD-Schrägen
wurden T. reesei-Transformanten auf dem selektiven Acetamid-Medium
durch Konidien gereinigt.
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5. Enzymaktivitäts-Assays
-
Für die Enzym-Assays
wurde das Mycel von dem Kulturmedium durch 15-minütiges Zentrifugieren
bei 3000 UpM (Sorvall SS-34, Dupont Company, Wilmington, Delaware,
USA) abgetrennt. Die Enzymaktivität von pH 2,5-saurer Phosphatase
wurde von dem Kulturüberstand
unter Verwendung von para-Nitrophenylphosphat (Sigma, St. Louis,
USA) als ein Substrat, wie früher
beschrieben, gemessen. Eine Aktivitätseinheit von pH 2,5-saurer
Phosphatase setzt 1 nmol anorganisches Phosphat pro Minute bei dem
Substrat p-Nitrophenylphosphat in pH 2,5 bei 37°C frei. Eine normalisierte saure
Phosphatase-Einheit (APNU, "acid
phosphatase normalized unit")
ist als die Menge von saurer Phosphatase-Aktivität definiert, die von dem A.
niger ALKO 243-Stamm unter den verwendeten Kultivierungsbedingungen
produziert wird (siehe Beispiel 6, Unterparagraph 2).
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Amyloglucosidase-Aktivität (AGU)
wurde durch Verwendung von 1% Zulkowsky-Stärke
(Merck) als ein Substrat und Messen der Menge der freigesetzten
Glucose-Einheiten durch Kochen mit DNS-Reagens (siehe unten) nach
10-minütiger
Reaktion bei 60°C
bei pH 4,8 gemessen. Proteasen (HUT) wurden wie in Food Chemicals
Codex (Food Chemicals Codex, National Academy Press, Washington,
DC, USA, S. 496–497
(1981)) bei pH 4,7 unter Verwendung von 2% Hämoglobin (Sigma) als ein Substrat
gemessen. Endoglucanase (ECU)- und Cellobiohydrolase (FPU)-Aktivitäten wurden
wie in IUPAC's "Measurement of Cellulase
Activities (IUPAC Commission on Biotechnology, Measurement of Cellulase
Activities, Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute
of Technology, Delhi, Indien, S. 5–7 und 10–11 (1981)) gemessen. 1% Hydroxyethylcellulose
(Fluka AG) in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 4,8) und Whatman Nr.
1-Papier wurden jeweils als Substrate verwendet. Verwendete DNS
unterschied sich von der bei IUPAC's Measurement of cellulase activities
(IUPAC Commission on Biotechnology, Measurement of Cellulase Activities,
Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology,
Delhi, India, Indien, S. 5–7
und 10–11
(1984) Beschriebenen und wurde hergestellt, indem zuerst 50,0 g
2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure
(Merck) in 41 deionisiertem Wasser verdünnt wurden. Dann wurden 80,0
g NaOH langsam unter Verwendung des Magnetrührers zugegeben, und 1500 g K-Na-Tartrat
(Merck) wurden zugegeben und durch Erwärmen der Lösung (Maximaltemperatur 45°C) verdünnt. Das
Gesamtvolumen wurde auf 5 1 eingestellt, die Lösung wurde durch Whatman Nr.
1 filtriert und gegen Licht geschützt.
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6. SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
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Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamid-Gelektrophorese
(SDS-PAGE) und Western-Blot-Analyse
wurden nach den Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K., Nature 227:
680–685
(1970)) und Towbin et al. (Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 76: 4350–4354
(1979)) durchgeführt.
Die Visualisierung des pH 2,5-saure Phosphatase-Proteins in Western-Blots
wurde unter Verwendung des polyklonalen Kaninchen-Antiserums KH1269
durchgeführt.
KH1269 wurde gegen gereinigtes, deglykosyliertes pH 2,5-saure Phosphatase-Protein angefertigt
(M. Turunen, Alko Ltd.) und wurde von dem National Public Health
Institute (Helsinki, Finnland) geliefert. Visualisierung des CBHI-Proteins
aus den pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten in Western-Blots wurde
durch Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers CI-261 (Aho, S., et al.,
Eur. J. Biochem 200: 643–649
(1991)) durchgeführt.
Anti-Kaninchen-IgG- und Anti-Maus-IgG-alkalisches
Phosphat-Konjugat und Farbentwicklungssubstrate von ProtoBlotTM Immunoblotting-System (Promega, Madison,
USA) wurden verwendet, um die Immunkomplexe zu detektieren.
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7. PCR
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Die
PCR-Reaktionen wurden von einem Techne-PHC-2-Thermo-Cycler (Techne
Ltd., Cambridge, UK) in 100 μl
Volumina bewerkstelligt. Das Reaktionsgemisch enthielt 0,2 mM von
jedem dNTP (Pharmacia, pH 8,3), 20–50 pmol von jedem Primer und
10 mg Plasmidmatrize in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM
MgCl2 und 100 μg/ml Gelatine. Das verwendete
Protokoll war das Folgende: 96°C/10
min vor Zugeben der Taq-DNA-Polymerase (2 Units, Boehringer Mannheim,
BRD) und 100 μl
Paraffinöl,
Denaturierung 95°C/1 min,
Anlagerung ("annealing") 60°C/1 min,
Erweiterung ("extension") 72°C/1 min,
30 Zyklen lang. Die letzte Erweiterungszeit war 9 min, um die Vervollständigung
der Strangsynthese zu gewährleisten.
Die PCR-Fragmente wurden durch den MermaidTM-Kit
gereinigt. Die Enden der Fragmente wurden unter Verwendung des DNA-Polymerase
I-Klenow-Fragments aufgefüllt.
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II. ERGEBNISSE
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A. Vektorkonstruktionen
zur Überexpression
des pH 2,5-saure Phosphatase-Gens in Trichoderma reesei ALKO 2221
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1. Konstruktion von Plasmid
pALK533
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Das
Plasmid pALK533 besteht aus dem Aspergillus niger var. awamori ALKO
243-pH 2,5-saure Phosphatase-Gen mit seiner eigenen Signal-Sequenz,
eingefügt
in die Trichoderma reesei-Expressionskassette, enthaltend die cbh1-Promotor-
und -Terminator-Sequenzen. pALK533 enthält außerdem das Aspergillus nidulans
amdSK-Gen als einen Selektionsmarker für Transformanten.
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Die
präzise
Fusion zwischen dem cbh1-Promotor und der pH 2,5-saure Phosphatase-Signal-Sequenz wurde
mit PCR durchgeführt.
Die für
die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind in 11 gezeigt.
Die SacII-Stelle in dem cbh1-Promotor-Bereich wurde bei dem 5'-Primer verwendet, und die MluI-Stelle
des saure Phosphatase-Gens (374 Nucleotide abwärts von dem N-Terminalen des
saure Phosphatase-Gens) wurde bei dem 3'-Primer verwendet. Der 5'-Primer war ein 39-mer,
enthaltend einen "tail" von 19 Nucleotiden
der cbh1-Promotor-Sequenz,
die der Signal-Sequenz vorangeht, der exakt an die ersten 20 Nucleotide
der saure Phosphatase-Signal-Sequenz angrenzt. Der 3'-Primer war ein 30-mer
des pH 2,5-saure Phosphatase-Gens. pAP-1 (12)
wurde bei den PCR-Reaktionen als eine Matrize verwendet. Ein Fragment
der erwarteten Länge
von 466 bps wurde von der PCR-Reaktion erhalten.
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Das
PCR-Fragment von 466 bp, enthaltend die pH 2,5-saure Phosphatase-Signal-Sequenz, wurde mit MluI
verdaut und an pAP-1 ligiert, das mit HindIII verdaut, mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment
behandelt und mit MluI verdaut worden war, um Plasmid p102 zu erhalten
(15). Die Fusion und das PCR-Fragment wurden
sequenziert, um zu gewährleisten,
dass bei der PCR-Amplifikation keine Fehler aufgetaucht waren.
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Um
Plasmid pALK533 (12) zu konstruieren, wurde
ein pH 2,5-saure Phosphatase-Gen,
enthaltend die Fusion aus dem Plasmid p102, als ein SphI (aufgefüllt mit
DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment)-SacII-Fragment
isoliert, und zwischen dem cbh1-Promotor und -Terminator des Plasmids
pALK601(ΔNdeI)
eingefügt,
welches mit NdeI (aufgefüllt
mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment) und SacII verdaut worden war. In
pALK601(ΔNdeI)
wird die NdeI-Stelle in dem Intron-Bereich des amdS-Gens in pALK601
unter Verwendung des DNA-Polymerase I-Klenow-Fragments inaktiviert.
Das für
Transformationen verwendete lineare Fragment wurde aus dem Vektorrückgrat mit
XbaI heraus verdaut.
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2. Konstruktion des Plasmids
pALK532
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Das
Plasmid pALK532 besteht aus dem Aspergillus niger var. awamori ALKO
243-2,5-saure Phosphatase-Gen,
eingefügt
in die Trichoderma reesei-CBHI-Expressionskassette, enthaltend die
cbh1-Promotor- und -Signal-Sequenz und -Terminator-Sequenzen. pALK532
enthält
außerdem
das Aspergillus nidulans amdS-Gen als einen Selektionsmarker für Transformanten.
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Die
präzise
Fusion zwischen der cbh1-Signal-Sequenz und dem pH 2,5-saure Phosphatase-Gen
wurde mit PCR durchgeführt.
Die für
die PCR-Fragmente verwendeten Primer sind in 11 gezeigt.
Die SfiI-Stelle in der cbh1-Signal-Sequenz wurde bei dem 5'-Primer verwendet.
Der 5'-Primer war
ein 46-mer, enthaltend einen "tail" von 28 Nucleotiden,
die exakt an die ersten 18 Nucleotide der N-terminalen Sequenz von
saurer Phosphatase angrenzen. Der 3'-Primer
war dasselbe 30-mer, das bei der Konstruktion von pALK533 verwendet
wurde. pAP-1 wurde bei der PCR-Reaktion als eine Matrize verwendet.
Von der PCR-Reaktion wurde ein Fragment der erwarteten Länge von
418 bps erhalten.
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Das
PCR-Fragment von 418 bp, enthaltend die cbh1-Signal-Sequenz, wurde
mit MluI verdaut und an pAP-1 ligiert, das mit HindIII verdaut,
mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment
behandelt und mit MluI verdaut worden war, um Plasmid p51 zu erhalten
(13). Die Fusion und das PCR-Fragment wurden sequenziert, um
zu gewährleisten,
dass bei der PCR-Amplifikation keine Fehler erfolgt waren. Um das
Plasmid pALK532 (13) zu konstruieren, wurde
ein pH 2,5-saure Phosphatase-Fragment, enthaltend die Fusion aus
dem Plasmid p51 als ein SphI (aufgefüllt mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment)-SfiI-Fragment,
isoliert und wurde zwischen den cbh1-Promotor- und -Terminator-Bereichen
des Plasmids pALK601(ΔNdeI)
eingefügt. pALK601(ΔNdeI) war
mit NdeI verdaut worden und mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment
aufgefüllt und
mit SfiI verdaut worden. Das lineare Fragment von ungefähr 7,8 kb,
das keine bakteriellen Sequenzen enthielt, wurde aus pALK532 durch
Restriktions-Verdau mit XbaI isoliert und wurde für Transformationen
verwendet.
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B. Transformation von
Trichoderma reesei und Durchmustern der Transformanten
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Trichoderma
reesei ALKO 2221 wurde separat mit den linearen XbaI-Fragmenten
von dem Plasmid pALK532 und pALK533 transformiert. Transformationshäufigkeiten
(Transformanten/μg
DNA) variierten von 2 bis 30.
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Vierundvierzig
T. reesei ALKO 2221/pALK532-Transformanten und 103 pALK533-Transformanten wurden
durch Konidien gereinigt und wurden in Schüttelkolben kultiviert.
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C. pH 2,5-saure Phosphatase-Produktion
durch die Trichoderma-Transformanten
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Die
besten Transformanten, basierend auf der pH 2,5-saure Phosphatase-Produktion,
sind in der Tabelle 10 gezeigt. Der beste Enzymaktivitätslevel
war 240 APNU in Schüttelkolbenkultivierung
in auf Lactose-basierendem Medium.
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Sowohl
die saure Phosphatase- als auch die cbh1-Signal-Sequenz funktionierten
gleich gut, und es konnten etwa dieselben Level an pH 2,5-saurer
Phosphatase-Aktivität
erreicht werden. Der beste pH 2,5-saure Phosphatase-Aktivitätslevel
wurde von Trichoderma-Transformante SC-9 produziert und war etwa
250-fach größer als
die Level, produziert durch den nativen Aspergillus niger var. awamori
ALKO 243-Stamm in entsprechenden Bedingungen.
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Zwei
von den neuen besten Produzierern reagierten nicht mit dem monoklonalen
CBHI-Antikörper bei der
Western-Blot-Analyse, was nahe legt, dass sich die Expressionskassette
bei jenen zwei Transformanten in den cbh1-Locus integriert hatte
(Tabelle 10).
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D. Der Enzymhintergrund
in den pH 2,5-saure Phosphatase-Präparationen, hergestellt von
T. reesei
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Die
pH 2,5-saure Phosphatase wird in den T. reesei-Transformanten in
hohen Mengen exprimiert, und der Hintergrund einiger anderer Enzymaktivitäten in den Überständen von
T. reesei-Transformanten ist unterschiedlich von jenen im Aspergillus-Überstand
(Tabelle 10). Sowohl Endoglucanase- als auch Cellobiohydrolase-Aktivitäten sind
signifikant höher,
wenn T. reesei als ein Produktionswirt verwendet wird. Die T. reesei-Transformanten
produzierten außerdem
verhältnismäßig weniger
Glucoamylase-Aktivität
als der A. niger ALKO 243-Stamm.
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E. Identifikation der
pH 2,5-saure Phosphatase, hergestellt durch die Trichoderma-Transformanten
-
Proben
von den Wachstumsmedien der Transformanten und dem T. reesei ALKO
2221-Stamm wurden
im Western-Blot analysiert (14).
Die folgenden Proben wurden analysiert: 10 ng von gereinigter Aspergillus
ALKO 243-pH 2,5-saurer Phosphatase; 10 ng von endoF-behandelter Aspergillus
ALKO 243-pH 2,5-saurer Phosphatase; und 60 ng Protein von jedem
der Kulturüberstände von
Trichoderma reesei ALKO 2221-Transformanten SC-9, KA-31, KB-44, KB-18, SB-4 und
KA-28 (14).
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Die
von T. reesei-Transformanten sezernierte pH 2,5-saure Phosphatase
wurde als vier Proteinbanden der Größen von etwa 50–66 kD gesehen.
Dies beruht wahrscheinlich auf dem unterschiedlichen Level an Glykosylierung
des Proteinanteils der sezernierten pH 2,5-saure Phosphatase. Verglichen
mit der Größe der pH
2,5-saure Phosphatase, hergestellt durch den Aspergillus niger var.
awamori ALKO 243-Stamm (66 kD), ist die Mehrheit der pH 2,5-saure
Phosphatase-Proteine, hergestellt von T. reesei, kleiner als die
von Aspergillus Hergestellten.
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