DE69826944T2

DE69826944T2 - Konsensus-Phytasen

Info

Publication number: DE69826944T2
Application number: DE69826944T
Authority: DE
Inventors: Martin Lehmann
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2018-07-16
Also published as: TW577921B; NO983364D0; US20030190677A1; JPH11146791A; US6579975B1; CN1526815A; KR100562603B1; EP0897985A2; CA2238613C; BR9802576B1; CN1163596C; USRE39649E1; NZ330940A; US7052869B2; EP1403377A1; DE69826944D1; KR19990014095A; BR9802576A; CN1208768A; DK0897985T3

Description

Phytasen (myo-Inosithexakisphosphatphosphohydrolasen; EC 3.1.3.8) sind Enzyme, die Phytat (myo-Inosithexakisphosphat) zu myo-Inosit und anorganischem Phosphat hydrolysieren und sind als wertvolle Nahrungszusätze bekannt.
Eine Phytase wurde zuerst 1907 in Reisschalen beschrieben [Suzuki et al., Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907)] und Phytasen aus Aspergillusarten wurden 1911 beschrieben [Dox und Golden, J. Biol. Chem. 10, 183–186 (1911)]. Phytasen wurden in auch in Weizenkleie, Pflanzensamen, Tierinnereien und Mikroorganismen gefunden [Howsen und Davis, Enzyme Mibrob. Technol. 5, 377–382 (1983), Lambrechts et al., Biotech. Lett. 14, 61–66 (1992), Shieh und Ware, Appl. Microbiol. 16, 1348–1351 (1968)].
Die Klonierung und Expression der Phytase aus Aspergillus niger (ficuum) wurde von Van Hartingsveldt et al. in Gene, 127, 87–94 (1993) und in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer (EP) 420 358 und von Aspergillus niger var. awamori von Piddington et al. in Gene 133, 55–62 (1993) beschrieben.
Die Klonierung, Expression und Reinigung von Phytasen mit verbesserten Eigenschaften wurde in EP 684 313 offenbart. Da es jedoch einen ständigen Bedarf nach weiter verbesserten Phytasen gibt, insbesondere im Hinblick auf ihre Thermostabilität, ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Consensusphytase mit dem folgenden Verfahren bereitzustellen.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Consensusproteins ist durch die folgenden Stufen gekennzeichnet:

a) mindestens 3, bevorzugt 4 Aminosäuresequenzen einer definierten Proteinfamilie werden mit einem Standard-Alignmentprogramm, das im Stand der Technik bekannt ist, ausgerichtet;
b) Aminosäuren, die nach diesem Alignment an gleicher Position sind, werden im Hinblick auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit mit einem im Stand der Technik bekannten Standardprogramm verglichen, wobei der Grad der Ähnlichkeit, der durch ein solches Programm geliefert wird, der die geringste Ähnlichkeit der Aminosäuren definiert, der für die Bestimmung einer Aminosäure an entsprechenden Positionen verwendet wird, auf eine weniger stringente Zahl gesetzt wird und die Parameter auf solche Weise eingestellt werden, dass es für das Programm möglich ist, aus nur zwei identischen Aminosäuren an entsprechender Position eine Aminosäure für das Consensusprotein zu bestimmen; wenn jedoch zu den verglichenen Aminosäuresequeuzen Sequenzen gehören, die einen viel höheren Ähnlichkeitsgrad miteinander zeigen als die restlichen Sequenzen, werden diese Sequenzen durch ihre Consensussequenz dargestellt, die bestimmt wird wie definiert, auf gleiche Weise wie bei dem vorliegenden Verfahren für die Consensussequenz des Consensusproteins oder es wird ein Gewichtung von 1 dividiert durch die Zahl solcher Sequenzen jeder dieser Sequenzen zugeordnet;
c) wenn keine gemeinsame Aminosäure an einer definierten Position von dem Programm identifiziert werden kann, wird irgendeine der Aminosäuren aller für den Vergleich verwendeter Sequenzen, bevorzugt die häufigste Aminosäure all dieser Sequenzen, ausgewählt oder es wird eine Aminosäure auf Basis der in Beispiel 2 angegebenen Überlegungen ausgewählt;
d) sobald die Consensussequenz definiert ist, wird diese Sequenz in eine DNA-Sequenz rückübersetzt, bevorzugt unter Verwendung einer Codonhäufigkeitstabelle des Organismus, in dem die Expression stattfinden sollte;
e) die DNA-Sequenz wird mit im Stand der Technik bekannten Methoden synthetisiert und entweder in einen geeigneten Expressionsvektor integriert oder selbst verwendet, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren;
f) die transformierte Wirtszelle wird unter geeigneten Kulturbedingungen gezüchtet und das Consensusprotein aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium mit im Stand der Technik bekannten Methoden isoliert.

Verfahrensstufe b) kann auch wie folgt definiert werden:

b) Aminosäuren an gleicher Position gemäß dem Alignment werden verglichen in Bezug auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit mit irgendeinem im Stand der Technik bekannten Standardprogramm, wobei der Ähnlichkeitsgrad, den ein solches Programm liefert, auf den niedrigstmöglichen Wert eingestellt wird und die Aminosäure, die bei mindestens der Hälfte der Sequenzen, die für den Vergleich verwendet werden, am ähnlichsten ist, für die entsprechende Position der Aminosäuresequenz des Consensusproteins ausgewählt wird.

Dieses gesamte Verfahren kann in einem Prozess gezeigt werden, bei dem eine Sequenz aus einer Anzahl von äußerst homologen Sequenzen ausgewählt wird und nur solche Aminosäurereste ersetzt werden, die sich eindeutig von einer Consensussequenz dieser Proteinfamilie unterscheiden, die unter mäßig stringenten Bedingungen berechnet wurde, während an allen Positionen des Alignments, an denen das Verfahren keine Aminosäure unter mäßig stringenten Bedingungen bestimmen kann, die Aminosäuren der bevorzugten Sequenz genommen werden.
Das zum Vergleich von Aminosäuren an einer definierten Position verwendete Programm im Hinblick auf ihre evolutionäre Ähnlichkeit ist das Programm "PRETTY". Die definierte Proteinfamilie ist die Familie der Phytasen, wobei insbesondere die Phytasen aus Pilzen stammen.
Die Wirtszelle ist eukaryotisch, insbesondere eine Pilzzelle, bevorzugt Aspergillus oder Hefe, bevorzugt Saccharomyces oder Hansenula.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Consensusprotein bereitzustellen, das mit solchen Verfahren erhältlich ist und bevorzugt erhalten wurde und spezifisch das Consensusprotein, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat oder eine Variante davon. Eine "Variante" bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein Consensusprotein mit einer Aminosäuresequenz, wie in 2 gezeigt, wobei an einer oder mehreren Positionen Aminosäuren deletiert, zugefügt oder durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt wurden, mit dem Vorbehalt, dass die entstehende Sequenz ein Protein schafft, dessen Grundeigenschatten, wie enzymatische Aktivität (Art der Aktivität und spezifische Aktivität), Thermostabilität, Aktivität in einem bestimmten pH-Bereich (pH-Stabilität) nicht signifikant verändert worden sind. "Signifikant" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass ein Fachmann auf diesem Gebiet angeben würde, dass die Eigenschaften der Variante noch verschieden sind, aber gegenüber denen des Consensusproteins mit der Aminosäuresequenz von 2 selbst nahe liegend wären.
Ein Mutein bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf den Austausch von Aminosäuren in den Aminosäuresequeuzen der Consensusproteine, die in 2 gezeigt sind, das zu Consensusproteinen führt, die weiter verbesserte Eigenschaften, z. B. Aktivität, haben. Solche Muteine können definiert und her gestellt werden auf Basis der in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 97810175.6 angegebenen Lehren, z. B. Q50L, Q50T, Q50G, Q50L-Y51N oder Q50T-Y51N. "Q50L" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass an Position 50 der Aminosäuresequenz die Aminosäure Q durch die Aminosäure L ersetzt wurde.
Außerdem ist ein Lebensmittel, Futtermittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Consensusprotein, wie oben definiert, enthält, auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In diesem Zusammenhang bedeutet "mindestens drei bevorzugt drei Aminosäuresequenzen einer solchen definierten Proteinfamilie", dass 3, 4, 5, 6 bis 12, 20, 50 oder sogar mehr Sequenzen für die Ausrichtung bzw. das Allgemein und den Vergleich verwendet werden können, um die Aminosäuresequenz des Consensusproteins zu erzeugen. "Sequenzen einer definierten Proteinfamilie" bedeutet, dass solche Sequenzen sich in eine dreidimensionale Struktur falten, wobei die α-Helices, die β-Faltblattstrukturen und β-Schleifen an der gleichen Position sind, so dass solche Strukturen überlagert oder "superimposable" sind, wie es der Fachmann auf diesem Gebiet nennt. Weiterhin kennzeichnen diese Sequenzen Proteine, die die gleiche Art von biologischer Aktivität zeigen, z. B. eine definierte Enzymklasse, z. B. die Phytasen. Wie im Stand der Technik bekannt, ist die dreidimensionale Struktur einer solchen Sequenz ausreichend, um die Struktur anderer Sequenzen einer solchen Familie modellieren zu können. Ein Beispiel, wie dies bewirkt werden kann, ist im Referenzbeispiel des vorliegenden Falls angegeben. "Evolutionäre Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Schema, das Aminosäuren im Hinblick auf ihre strukturelle Ähnlichkeit klassifiziert, was es zulässt, eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure zu ersetzen mit minimalem Einfluss auf die Gesamtstruktur, wie dies durch Programme, wie "PRETTY", die im Stand der Technik bekannt sind, erfolgt. Der Ausdruck "der Ähnlichkeitsgrad, der durch ein solches Programm geschaffen wird, wird auf eine weniger stringente Zahl gesetzt" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass Werte für die Parameter, die den Ähnlichkeitsgrad in dem verwendeten Programm bei Durchführung der Erfindung bestimmen, so ausgewählt werden, dass das Programm eine gemeinsame Aminosäure für ein Maximum an Positionen für die gesamte Aminosäuresequenz definieren kann, z. B. kann im Fall des Programms PRETTY ein Wert von 2 oder 3 für THRESHOLD und ein Wert von 2 für PLURALITY ausgewählt werden.
Weiterhin bedeutet "eine Gewichtung von 1 dividiert durch die Anzahl solche Sequenzen" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass die Sequenzen, die eine Gruppe von Sequenzen mit einem höheren Ähnlichkeitsgrad, als andere Sequenzen, die für die Bestimmung der Consensussequenz verwendet werden, definieren, zu einer solchen Bestimmung nur mit einem Faktor beitragen, der gleich 1 ist dividiert durch eine Zahl aller Sequenzen dieser Gruppe.
Wie vorher erwähnt, sollte das Programm nicht zulassen, dass die ähnlichste Aminosäure ausgewählt wird, die häufigste Aminosäure wird ausgewählt, sollte letzteres unmöglich sein, wird der Fachmann auf diesem Gebiet eine Aminosäure aus all den für den Vergleich verwendeten Sequenzen auswählen, die im Stand der Technik für ihre Eigenschaft, die Thermostabilität von Proteinen zu verbessern, bekannt ist, wie z. B. von
S. Janacek (1993), Process Biochem. 28, 435–445 oder
A. R. Fersht & L. Serrano (1993), Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75–83.
T. Alber (1989), Annu. Rev. Biochem. 58, 765–798 oder
B. W. Matthews (1987), Biochemistry 26, 6885-G888.
B. W. Matthews (1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17–21
diskutiert.
Die Stabilität eines Enzyms ist ein kritischer Faktor für viele industrielle Anwendungen. Daher wurden viele Versuche, mehr oder weniger erfolgreich, unternommen, um die Stabilität, bevorzugt die Thermostabilität von Enzymen, durch rationale (van den Burg et al., 1998) oder irrationale Ansätze (Akanuma et al., 1998) zu verbessern. Die Kräfte, die die Thermostabilität eines Proteins beeinflussen, sind die gleichen, die für die richtige Faltung eines Peptidstrangs verantwortlich sind (hydrophobe Wechselwirkungen, van-der-Waals-Wechselwirkungen, H-Bindungen, Salzbrücken, Konformationsspannungen (Matthews, 1993). Wie weiterhin von Matthews et al. (1987) gezeigt wurde, hat die freie Energie des ungefalteten Zustands auch einen Einfluss auf die Stabilität eines Proteins. Eine Verbesserung oder Verstärkung der Proteinstabilität bedeutet, die Anzahl und Stärke vorteilhafter Wechselwirkungen zu erhöhen und die Anzahl und Stärke ungünstiger Wechselwirkungen zu vermindern. Es war möglich, Disulfidbindungen einzuführen (Sauer et al., 1986), Glycin durch Alaninreste zu ersetzen oder den Prolingehalt zu erhöhen, um die freie Energie des ungefalteten Zustands zu vermindern (Margarit et al., 1992; Matthews, 1987a). Andere Gruppen konzentrierten sich auf die Bedeutung zusätzlicher H-Bindungen oder Salzbrücken für die Stabilität eines Proteins (Blaber et al., 1993) oder versuchten, Hohlräume im Proteininneren zu füllen, um die verborgene hydrophobe Oberfläche zu erhöhen und die van-der-Waals-Wechselwirkungen (Karpusas et al., 1989). Weiterhin wurde die Stabilisierung von sekundären Strukturelementen, insbesondere α-Helices, z. B. durch verbessertes Helix-Capping, untersucht (Munos & Serrano, 1995).
Es gibt jedoch keine schnelle und Erfolg versprechende Strategie, um Aminosäureaustausche zu identifizieren, die die Stabilität erhöhen, bevorzugt die thermische Stabilität eines Proteins. Üblicherweise ist die 3D-Struktur eines Proteins notwendig, um Orte in dem Molekül zu finden, wo ein Aminosäureaustausch möglicherweise den gefalteten Zustand des Proteins stabilisiert. Alternative Wege, um dieses Problem zu umgehen, sind entweder die Suche nach einem homologen Protein in einem thermo- oder hyperthermophilen Organismus oder die Stabilität erhöhende Aminosäureaustausche durch einen Ansatz mit Zufallsmutagenese nachzuweisen. Letztere Möglichkeit führt nur zu 10³ bis 10⁴ Mutationen und ist auf Enzyme beschränkt, für die ein Schnellscreeningverfahren verfügbar ist (Arase et al., 1993; Risse et al., 1992). Für all diese Ansätze ist der Erfolg variabel und unvorhersagbar und, falls erfolgreich, war die Verbesserung der Thermostabilität fast immer ziemlich klein.
Hier wird ein alternativer Weg präsentiert, um die Thermostabilität eines Proteins zu verbessern. Imanaka et al. (1986) gehörten zu den ersten, die Vergleiche von homologen Proteinen verwendeten, um die Stabilität eines Proteins zu verbessern. Sie verwendeten einen Vergleich von Proteasen aus thermophilen Organismen mit Homologen aus mesophilen Organismen, um die Stabilität einer mesophilen Protease zu verbessern. Serrano et al. (1993) verwendeten den Vergleich der Aminosäuresequenzen von zwei homologen mesophilen RNasen, um eine thermostabilere RNase zu konstruieren. Sie mutierten individuell alle Reste, die zwischen den beiden unterschiedlich waren und kombinierten die Mutationen, die die Stabilität erhöhten, in einer Mehrfachmutante. Pantoliano et al. (1989) und insbesondere Steipe et al. (1994) schlugen vor, dass die häufigste Aminosäure an jeder Position eines Alignments von homologen Proteinen den größten Beitrag zur Stabilität eines Proteins liefert. Steipe et al. (1994) bewiesen dies für eine variable Domäne eines Immunoglobulins, wohingegen Pantoliano et al. (1989) nach Positionen in der primären Sequenz von Subtilisin suchten, bei denen die Sequenz des Enzyms, das ausgewählt wurde, um im Hinblick auf höhere Stabilität verbessert zu werden, nur im Einzelfall abweichend war. Ihr Ansatz führte zum Ersatz M50F, was die T_m von Subtilisin um 1,8°C erhöhte.
Steipe et al. (1994) bewiesen an einer variablen Domäne von Immunoglobulin, dass es möglich ist, eine stabilisierende Mutation mit einer Erfolgsrate von mehr als 60% vorherzusagen durch Verwendung einer statistischen Methode, bei der der häufigste Aminosäurerest an einer bestimmten Position dieser Domäne bestimmt wird. Es wurde auch vorgeschlagen, dass diese Methode nützliche Ergebnisse nicht nur für die Stabilisierung von variablen Domänen von Antikörpern, sondern auch für Domänen anderer Proteine liefern würde. Es wurde jedoch nie erwähnt, dass diese Methode auf das gesamte Protein ausgedehnt werden könnte. Weiterhin ist nichts über das Programm gesagt, das verwendet wurde, um die Häufigkeit von Aminosäureresten an einer distinkten Position zu berechnen oder ob Bewertungsmatrizes im vorliegenden Fall verwendet wurden.
DNA-Sequenzen können konstruiert werden ausgehend von genomischen oder cDNA-Sequenzen, die Proteine codieren, z. B. Phytasen, die im Stand der Technik bekannt sind [bezüglich Sequenzinformation siehe die oben erwähnten Literaturstellen, z. B. EP 684 313 oder Sequenzdatenbanken, z. B. Genbank (Intelligenetics, Kalifornien, USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) und Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA) oder in den Figuren offenbart mit Methoden der in-vitro-Mutagenese [siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Eine häufig verwendete Strategie für eine solche "ortsgerichtete Mutagenese", wie sie ursprünglich von Hurchinson und Edgell ausgeführt wurde [J. Virol. 8, 181 (1971)] beinhaltet das Annealing eines synthetischen Oligonucleotids, das den gewünschten Nucleotidersatz trägt, mit einer Zielregion einer einzelsträngigen DNA-Sequenz, in die die Mutation eingeführt werden soll [für einen Überblick siehe Smith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985) und bezüglich verbesserter Methoden siehe Literaturstellen 2 bis 6 bei Stanssen et al., Nucl. Acid Res., 17, 4441–4454 (1989)]. Eine weitere Möglichkeit, eine gegebene DNA-Sequenz zu mutieren, die auch zur Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, ist die Mutagenese durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). DNA als Ausgangsmaterial kann mit im Stand der Technik bekannten und z. B. bei Sambrook et al. (Molecular Cloning) beschriebenen Methoden aus den jeweiligen Stämmen isoliert werden. Bezüglich der Stamminformation siehe z. B. EP 684 313 oder jede unten angegebene Hinterlegungsstelle. Aspergillus niger [ATCC 9142], Myceliophthora thermophila [ATCC 48102], Talaromyces thermophilus [ATCC 20186] und Aspergillus fumigatus [ATCC 34625] wurden nach den Bedingungen des Budapester Vertrags erneut bei der American Type Culture Cell Collection hinterlegt unter den folgenden Hinterlegungsnummern: ATCC 74337, ATCC 74340, ATCC 74338 bzw. ATCC 74339. Es versteht sich jedoch, dass DNA, die ein Consensusprotein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, auch synthetisch mit im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden kann, wie z. B. in EP 747 483 oder den Beispielen beschrieben.
Sobald die vollständige DNA-Sequenz erhalten wurde, kann sie mit Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind und z. B. bei Sambrook et al. (s. o.) beschrieben wurden, in Vektoren integriert werden, um das codierte Polypeptid in geeigneten Wirtssystemen zu überexprimieren. Ein Fachmann auf diesem Gebiet weiß jedoch, dass auch die DNA-Sequeuzen selbst verwendet werden können, um die geeigneten Wirtssysteme der Erfindung zu transformieren, um eine Überexpression des codierten Polypeptids zu erzielen. Geeignete Wirtssyste me sind z. B. Pilze, wie Aspergilli, z. B. Aspergillus niger [ATCC 9142] oder Aspergillus ficuum [NRRL 3135], oder wie Trichoderma, z. B. Trichoderma reesei, oder Hefen, wie Saccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae, oder Pichia, wie Pichia pastoris, oder Hansenula polymorpha, z. B. H. polymorpha (DSM5215) oder Pflanzen, wie z. B. bei Pen et al., Bio/Technology 11, 811–814 (1994) beschrieben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet weiß, dass solche Mikroorganismen von Hinterlegungsstellen erhältlich sind, z. B. der American Type Culture Collection (ATTC), dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) oder der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) oder jeder anderen Hinterlegungsstelle, die im Journal "Industrial Property" [(1991) 1, Seiten 29–40] aufgeführt ist. Bakterien, die verwendet können, sind z. B. E. coli, Bacilli, wie z. B. Bacillus subtilis oder Streptomyces, z. B. Streptomyces lividans (siehe z. B. Anne und Mallaert in FEMS Microbiol. Letters 114, 121 (1993). E. coli, die verwendet werden können, sind E.-coli-K12-Stämme, z. B. M15 [beschrieben als DZ 291 von Villarejo et al. in J. Bacteriol. 120, 466–474 (1974)], HB 101 [ATCC Nr. 33694] oder E. coli SG13009 [Gottesman et al., J. Bacteriol. 148, 265–273 (1981)].
Vektoren, die zur Expression in Pilzen verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und werden z. B. EP 420 358 oder von Cullen et al. [Bio/Technology 5, 369–376 (1987)] oder Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems in Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York (1991), Usphall et al. [Bio/Technology 5, 1301–1304 (1987)], Gwynne et al. [Bio/Technology 5, 71–79 (1987)], Punt et al. [J. Biotechnol. 17, 19–34 (1991)] und für Hefen von Sreekrishna et al. [J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988), Biochemistry 28, 4117–4125 (1989)], Hitzemann et al. [Nature 293, 717–722 (1981)] oder in EP 183 070 , EP 183 071 , EP 248 227 , EP 263 311 beschrieben. Geeignete Vektoren, die zur Expression in E. coli verwendet werden können, werden z. B. bei Sambrook et al. [s. o.] oder bei Fiers et al. in Procd., 8^th Int. Biotechnology Symposium" [Soc. Franc. de Microbiol., Paris (Durand et al., Herausgeber), Seiten 680–697 (1988)] oder von Bujard et al. in Methods in Enzymology, Herausgeber Wu und Grossmann, Academic Press, Inc., Bd. 155, 416–433 (1987) und Stüber et al. in Immunological Methods, Herausgeber Lefkovits und Pernis, Academic Press, Inc., Bd. IV, 121–152 (1990) beschrieben. Vektoren, die zur Expression in Bacilli verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und werden z. B. in EP 405 370 , Procd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984) von Yansura und Henner, Meth. Enzymol. 185, 199-228 (1990) oder EP 207 459 beschrieben. Vektoren, die zur Expression in H. Polymorpha verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und werden z. B. bei Gellissen et al., Biotechnology 9, 291–295 (1991) beschrieben.
Alle diese Vektoren tragen bereits regulatorische Elemente, z. B. Promotoren oder die DNA-Sequenzen können gentechnologisch so verändert werden, dass sie solche Elemente enthalten. Geeignete Promotorelemente, die verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und sind z. B. für Trichoderma reesei der cbh1- [Haarki et al., Biotechnology 7, 596–600 (1989)] oder der pki1-Promotor [Schindler et al., Gene 130, 271–275 (1993)], für Aspergillus oryzae der amy-Promotor [Christensen et al., Abstr. 19^th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987), Christensen et al., Biotechnology 6, 1419-1422 (1988), Tada et al., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)], für Aspergillus niger der glaA- [Cullen et al., Bio/Technology 5, 369–376 (1987), Gwynne et al., Bio/Technology 5, 713–719 (1987), Ward in Molecular Industrial Mycology, Systems in Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 83–106 (1991)], alcA- [Gwynne et al., Bio/Technology 5, 718–719 (1987)], suc1- [Boddy et al., Curr. Genet. 24, 60–66 (1993)], aphA- [MacRae et al., Gene 71, 339–348 (1988), MacRae et al., Gene 132, 193–198 (1993)], tpiA- [McKnight et al., Cell 46, 143–147 (1986), Upshall et al., Bio/Technology 5, 1301–1304 (1987)], gpdA- [Punt et al., Gene 69, 49–57 (1988), Punt et al., J. Biotechnol. 17 19–37 (1991)] und der pkiA-Promotor [de Graaff et al., Curr. Genet. 22, 21–27 (1992)]. Geeignete Promotorelemente, die zur Expression in Hefen verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt und sind z. B. der pho5-Promotor [Vogel et al., Mol. Cell. Biol., 2050–2057 (1989); Rudolf und Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340–1344 (1987)] oder der gap-Promotor für die Expression in Saccharomyces cerevisiae und für Pichia pastoris, z. B. der aox1-Promotor [Koutz et al., Yeast 5, 167–177 (1989), Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)] oder der FMD-Promotor [Hollenberg et al., EPA Nr. 0299108] oder der MOX-Promotor [Ledeboer et al., Nucleic Acids Res. 13, 3063–3082 (1985)] für H. polymorpha.
Sobald die Consensus-DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz von 2 codiert, in einer geeigneten Wirtszelle in einem geeigneten Medium exprimiert wurde, kann das codierte Protein entweder aus dem Medium in dem Fall, in dem das Protein in das Medium ausgeschieden wird, oder aus dem Wirtsorganismus, in dem Fall, in dem das Protein intrazellulär vorhanden ist, mit im Stand der Technik zur Proteinreinigung bekannten Methode oder für den Fall einer Phytase beschriebenen Methoden, z. B. in EP 420 358 , isoliert werden.
Sobald das Polypeptid von 2 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, kann es bezüglich seiner Eigenschaften gekennzeichnet werden, die es in der Landwirtschaft nützlich machen, wobei jeder im Stand der Technik bekannte und beschriebene Test verwendet kann, z. B. der von Simons et al. [Br. J. Nutr. 64, 525–540 (1990)], Schöner et al. [J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248–255 (1991)], Vogt [Arch. Geflügelk. 56, 93–98 (1992)], Jongbloed et al. [J. Anim. Sci., 70, 1159–1168 (1992)], Perney et al. [Poultry Sci. 72, 2106–2114 (1993)], Farrell et al. [J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278–283 (1993), Broz et al. [Br. Poultry Sci. 35, 273–280 (1994)] und Düngelhoef et al. [Animal Feed Sci. Technol. 49, 1–10 (1994)].
Im Allgemeinen kann das erfindungsgemäße Polypeptid verwendet werden ohne auf ein bestimmtes Anwendungsgebiet beschränkt zu sein, z. B. im Fall der Phytasen zur Umwandlung von Inositpolyphosphaten, wie Phytat zu Inosit und anorganischem Phosphat.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Polypeptid für ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines zusammengesetzten Lebensmittels oder Futtermittels verwendet werden, wobei die Komponenten einer solchen Zusammensetzung mit einem oder mehreren Polypeptiden der vorliegenden Erfindung gemischt werden. Somit sind zusammengesetzte Lebensmittel oder Futtermittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten, auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein Fachmann auf diesem Gebiet ist mit dem Verfahren zu ihrer Herstellung vertraut. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen oder zusammengesetzten Lebensmittel oder Futtermittel können weiterhin Additive oder Komponenten enthalten, die allgemein für diesen Zweck verwendet werden und im Stand der Technik bekannt sind.
Bevor die vorliegende Erfindung genauer beschrieben wird, ist eine kurze Erläuterung der Tabellen und enthaltenen Figuren unten angegeben.
Tabelle 1: Gewichtung der Aminosäuresequenzen der verwendeten Pilzphytasen. Die Tabelle zeigt die Gewichtungen, die verwendet werden, um die Consensussequenz der Pilzphytasen zu berechnen.
Tabelle 2: Homologie der Pilzphytasen. Die Aminosäuresequenzen der zum Alignment verwendeten Phytasen wurden mit dem Programm GAP (GCG Program Package, 9; Devereux et al., 1984) unter Verwendung von Standardparametern verglichen. Der Vergleich war auf den Teil der Sequenz beschränkt, der auch für das Alignment verwendet wurde (siehe Legende zu 1), dem das Signalpeptid fehlte, das ziemlich divergent war. Die Zahlen über und unter der Diagonale repräsentieren die Aminosäureidentitäten bzw. Ähnlichkeiten.
Tabelle 3: Homologie der Aminosäuresequenz der Pilzconsensusphytase mit Phytasen, die für ihre Berechnung verwendet wurden. Die Aminosäuresequenzen aller Phytasen wurden mit der Pilzconsensusphytasesequenz verglichen unter Verwendung des Programms GAP (GCG Program Package, 9.0). Wiederum war der Vergleich auf den Teil der Sequenz beschränkt, der für das Alignment verwendet wurde.
Tabelle 4: Primer, die zur Einführung von einzelnen Mutationen in Pilzconsensusphytase verwendet wurden. Zur Einführung jeder Mutation waren zwei Primer, die die gewünschte Mutation enthielten, erforderlich (siehe Beispiel 8). Die veränderten Tripletts sind in Fettdruck hervorgehoben.
Tabelle 5: Temperaturoptimum und T_m-Wert für die Pilzconsensusphytase und die Phytasen aus A. fumigatus, A. niger, A. nidulans und M. thermophila. Die Temperaturoptima wurden 3 entnommen. ^aDie Tm-Werte wurden mit Differenzialscanningkalorimetrie bestimmt, wie in Beispiel 10 beschrieben und in 7 gezeigt.
1: Berechnung der Consensusphytasesequenz aus dem Alignment nahezu aller bekannten Pilzphytaseaminosäuresequenzen. Die Buchstaben repräsentieren die Aminosäurereste im Ein-Buchstaben-Code. Die folgenden Sequenzen wurden für das Alignment verwendet: phyA aus Aspergillus terreus 9A-1 (Mitchell et al., 1997; ab Aminosäure (aa) 27), phA aus Aspergillus terreus cbs 116.46 (van Loon et al., 1997; ab aa 27), phyA aus Aspergillus niger var. awamori (Piddington et al., 1993; ab aa 27), phyA aus Aspergillus niger T213; (ab aa 27), phyA aus Aspergillus niger Stanzen NRRL3135 (van Hartingsveldt et al., 1993; ab aa 27), phyA aus Aspergillus fumigatus ATCC 13073 (Pasamontes et al., 1997b; ab aa 25), phyA aus Aspergillus fumigatus ATCC 32722 (van Loon et al., 1997; ab aa 27), phyA aus Aspergillus fumigatus ATCC 58128 (van Loon et al., 1997; ab aa 27), phyA aus Aspergillus fumigatus ATCC 26906 (van Loon et al., 1997; ab aa 27), phyA aus Aspergillus fumigatus ATCC 32239 (van Loon et al., 1997; ab aa 30), phyA aus Aspergillus nidulans (Pasamontes et al., 1997a, ab aa 25), phyA von Talaromyes thermophilus (Pasamontes et al., 1997a; ab aa 24) und phyA aus Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., 1997; ab aa 19). Das Alignment wurde berechnet unter Verwendung des Programms PILEUP. Die Anordnung der Gaps wurde durch Hand verfeinert. Aminosäurereste mit großen Buchstaben in dem Alignment an gegebener Position gehören zu der Aminosäurekoalition, die den Consensusrest etabliert. In Fettdruck ist neben der berechneten Consensussequenz die Aminosäuresequenz der schließlich konstruierten Pilzconsensusphytase (Fcp) gezeigt. Die Zwischenräume (Gaps) in der berechneten Consensussequenz wurden mit Hand aufgefüllt nach den in Beispiel 2 angegebenen Prinzipien.
2: DNA-Sequenz des Pilzconsensusphytasegens (fcp) und die zur Genkonstruktion synthetisierten Primer. Die berechnete Aminosäuresequenz (1) wurde in eine DNA-Sequenz umgewandelt unter Verwendung des Programms BACKTRANSLATE (Devereux et al., 1984) und der Codonhäufigkeitstabelle für stark exprimierte Hefegene (GCG Programmversion 9.0). Das Signalpeptid der Phytase von A. terreus cbs wurde an den N-Terminus fusioniert. Die fettgedruckten Basen zeigen die Sequenzen der zur Erzeugung des Gens verwen deten Oligonucleotide. Die Namen der jeweiligen Oligonucleotide sind über oder unter der Sequenz angegeben. Die unterstrichenen Basen zeigen Start- und Stoppcodon des Gens. Die kursiv geschriebenen Basen zeigen die zwei eingeführen EcoRI-Stellen.
3: Temperaturoptimum der Pilzconsensusphytase und anderer Phytasen, die verwendet wurden, um die Consensussequenz zu berechnen. Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde der Phytasestandardassay bei einer Reihe von Temperaturen zwischen 37 und 85°C durchgeführt. Die verwendeten Phytasen wurden gemäß Beispiel 5 gereinigt. ∇ Pilzconsensusphytase;
A. fumigatus 13073-Phytase; ☐ A. niger NRRL3135-Phytase; O A. nidulans-Phytase; ∎ A. terreus 9A-1-Phytase;
A. terreus-cbs-Phytase.
4: Das pH-abhängige Aktivitätsprofil der Pilzconsensusphytase und der Mutanten Q50L, Q50T und Q50G. Die Phytaseaktivität wurde bestimmt unter Verwendung des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten. Diagramm a) zeigt einen Vergleich der Pilzconsensusphytase (
) mit den Mutanten Q50L (∇), Q50T (
) und Q50G (O) in Prozent Aktivität. Diagramm b) zeigt einen Vergleich der Pilzconsensusphytase (O) mit den Mutanten Q50L (
) und Q50T (∇) unter Verwendung der spezifischen Aktivität der gereinigten Enzyme, die in N. polymorpha exprimiert wurden.
5: Das pH-abhängige Aktivitätsprofil der Mutanten Q50L, Y51N und Q50T; Y51N im Vergleich mit den Mutanteil Q50T und Q50L der Pilzconsensusphytase. Die Phytaseaktivität wurde bestimmt unter Verwendung des Standardassays in geeigneten Puffern (siehe Beispiel 9) bei verschiedenen pH-Werten. Kurve a) zeigt den Einfluss der Mutation Y51N (
) auf die Mutante Q50L (O). Kurve b) zeigt den Einfluss der gleichen Mutation (
) auf die Mutante Q50T (O).
6: Substratspezifität der Pilzconsensusphytase und ihrer Mutanten Q50L, Q50T und Q50G. Die Balken zeigen die relative Aktivität im Vergleich zur Aktivität bei Phytinsäure (100%) mit einer Mehrzahl bekannter natürlicher und synthetischer phosphorylierter Verbindungen.
7: Differenzialscanningkalorimetrie (DSC) der Pilzconsensusphytase und der Mutante Q50T. Die Proteinproben wurden auf ca. 50 bis 60 mg/ml eingeengt und intensiv gegen 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Eine konstante Erwärmungsrate von 10°C/min wurde angewendet bis 90°C. Die DSC der Consensusphytase Q50T (obere Kurve) lieferte eine Schmelztemperatur von 78,9°C, die nahezu identisch ist zum Schmelzpunkt der Pilzconsensusphytase (78,1°C untere Kurve).
Beispiele
Referenzbeispiel
Homologiemodellierung einer A. fumigatus- und A. terreus cbs 116.46-Phytase
Die Aminosäuresequenzen von A. fumigatus und A. terreus cbs116.46-Phytase wurden mit der Sequenz von A. niger NRRL 3135-Phytase verglichen (siehe 1), für die die dreidimensionale Struktur mit Röntgenkristallografie bestimmt worden war.
Ein mehrfaches Aminosäuresequenz-Alignment von A. niger NRRL 3135-Phytase, A. fumigatus-Phytase und A. terreus cbs116.46-Phytase wurde mit dem Programm "PILEUP" (Prog. Menü für Wisconsin Packung, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison Wisconsin, USA 53711) berechnet. Die dreidimensionalen Modelle von A. fumigatus-Phytase und A. terreus cbs116.46-Phytase wurden gebildet unter Verwendung der Struktur von A. niger NRRL 3135-Phytase als Matrize und durch Austausch der Aminosäuren von A. niger NRRL 3135-Phytase gemäß dem Sequenz-Alignment mit den Aminosäuren von A. fumigatus bzw. A. terreus cbs116.46-Phytase. Die Modellkonstruktion und Energieoptimierung wurden durchgeführt unter Verwendung des Programms Moloc (Gerber und Müller, 1995). C-alpha-Positionen wurden fixiert gehalten außer bei neuen Insertionen/Deletionen und in Loop-Bereichen, die von der aktiven Stelle entfernt sind.
Nur geringe Unterschiede zwischen den modellierten Strukturen und der ursprünglichen Kristallstruktur konnten in den äußeren Loops beobachtet werden. Weiterhin wurden die verschiedenen Substratmoleküle, die hauptsächlich auf dem Abbauweg der Phytinsäure (myo-Inositolhexakisphosphat) von Pseudomonas sp. bacterium-Phytase auftreten und, soweit bestimmt, von A. niger NRRL 3135-Phytase (Cosgrove, 1980) konstruiert und nach der Vertiefung der aktiven Stelle jeder Phytasestruktur geformt. Jedes dieser Substrate war in einer hypothetischen Bindungsform, die für Histidinsäurephosphatasen vorgeschlagen wird (Van Etten, 1982) orientiert. Die abspaltbare Phosphatgruppe wurde zu dem katalytisch wesentlichen His 59 orientiert, um das kovalente Phosphoenzymzwischenprodukt zu bilden. Der Sauerstoff der Substratphosphoesterbindung, der durch Asp 339 protoniert wird nach Spaltung wurde hin zum Protonendonator orientiert. Konformationsentspannung des verbleibenden strukturellen Teils der Substrate ebenso wie der die aktive Stellung umgebenden Reste wurde durchgeführt durch Energieoptimierung mit dem Programm Moloc.
Basierend auf den Strukturmodellen wurden die Reste, die in die Vertiefung mit der aktiven Stelle zeigen, identifiziert. Mehr als die Hälfte (60%) dieser Positionen waren identisch zwischen den drei Phytasen, wohingegen nur wenige Positionen nicht konserviert waren (siehe 1). Diese Beobachtuug konnte auf vier weitere Phytasesequenzen ausgedehnt werden (A. nidulans, A. terreus 9A1, Talaromyces thermophilus, Myceliophthora thermophila).
Beispiel 1
Ausrichtung der Aminosäuresequenz der Pilzphytasen
Das Alignment wurde berechnet unter Verwendung des Programms PILEUP von der Sequenzanalysepackung Version 9.0 (Devereux et al., 1984) mit Standardparameter (gap creation penalty 12, gap extension penalty 4). Die Anorduung der Zwischenräume wurde verfeinert unter Verwendung eines Texteditors. Die folgenden Sequenzen (siehe 1) ohne die Signalsequenz wurden für die Durchführung des Alignments verwendet beginnend mit der unten erwähnten Aminosäure (aa):
phyA-Gen von Aspergillus terreus 9A-1, aa 27 (Mitchell et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus terreus cbs116.46, aa 27 (van Loon et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus niger var. awamori, aa 27 (Piddington et al., 1993)
phyA-Gen von Aspergillus niger T213, aa 27
phyA-Gen von Aspergillus niger Stamm NRRL3135, aa 27 (van Hartingsveldt et al., 1993)
phyA-Gen von Aspergillus fumigatus ATCC 13073, aa 26 (Pasamontes et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus fumigatus ATCC 32722, aa 26 (van Loon et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus fumigatus ATCC 58128, aa 26 (van Loon et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus fumigatus ATCC 26906, aa 26 (van Loon et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus fumigatus ATCC 32239, aa 30 (van Loon et al., 1997)
phyA-Gen von Aspergillus nidulans, aa 25 (Roche Nr. R1288, Pasamontes et al., 1997a)
phyA-Gen von Talaromyces thermophilus, ATCC 20186, aa 24 (Pasamontes et al., 1997a)
phyA-Gen von Myceliophthora thermophila, aa 19 (Mitchell et al., 1997).
Tabelle 2 zeigt die Homologie der unten erwähnten Phytasesequenzen.
Beispiel 2
Berechnung der Aminosäuresequenz der Pilzconsensusphytasen
Unter Verwendung des verfeinerten Alignments von Beispiel 1 als Input wurde die Consensussequenz berechnet mit dem Programm PRETTY von Sequence Analysis Package Version 9.0 (Devereux et al., 1984). PRETTY druckt Sequenzen, bei denen die Spalten ausgerichtet sind und kann eine Consensussequenz für die Ausrichtung anzeigen. Eine Gewichtung, die die Ähnlichkeit zwischen Aminosäuresequenzen der ausgerichteten Phytasen beachtet, wurde allen Sequenzen zugeordnet. Die Gewichtung wurde so eingestellt wie der vereinigte Wert für alle Phytasen aus einer Sequenzuntergruppe (gleiche Ursprungsart, aber verschiedene Stämme), z. B. die Aminosäuresequenzen aller Phytasen aus A. fumigatus wurde bei der Auswahl auf 1 gesetzt, das bedeutet, dass jede Sequenz einen Wert von 1 dividiert durch die Anzahl der Stammsequenzen beiträgt (siehe Tabelle 1). Damit war es möglich, zu verhindern, dass sehr ähnliche Aminosäuresequenzen, z. B. die Phytasen aus verschiedenen A. fumigatus-Stämmen die berechnete Consensussequenz dominieren.
Das Programm PRETTY wurde mit den folgenden Parametern gestartet: Die Zahl, die die Anzahl der Angaben definiert, bei denen kein Consensus besteht, wurde auf 2.0 gesetzt. Die Schwelle, die den Bewertungsmatrixwert bestimmt, unter dem ein Aminosäurerest für eine Koalition von Resten nicht gewichtet werden kann, wurde auf 2 gesetzt. PRETTY verwendete die PrettyPep.Cmp.-Consensusbewertungsmatrix für Peptide.
Zehn Positionen für das Alignment (Position 46, 66, 82, 138, 162, 236, 276, 279, 280, 308; 1), für die das Programm keinen Consensusrest bestimmen konnte, wurden mit Hand aufgefüllt gemäß den folgenden Regeln: Wenn ein häufigster Rest existierte, wurde dieser Rest ausgewählt (138, 236, 280); wenn eine vorherrschende Gruppe von chemisch ähnlichen oder äquivalenten Resten auftrat, wurde der häufigste oder, falls nicht verfügbar, ein Rest dieser Gruppe ausgewählt (46, 66, 82, 162, 276, 308). Wenn es entweder einen vorherrschenden Rest noch eine vorherrschende Gruppe gab, wurde einer der auftretenden Reste ausgewählt nach der allgemeinen Annahme ihres Einflusses auf die Proteinstabilität (279). Acht andere Positionen (132, 170, 204, 211, 275, 317, 384, 447; 1) wurden nicht mit dem von dem Programm ausgewählten Aminosäurerest aufgefüllt, sondern normalerweise mit Aminosäuren, die mit der gleichen Häufigkeit auftreten, wie die Reste, die von dem Programm ausgewählt wurden. In den meisten Fällen wurden die geringe Unterbewertung der drei A. niger-Sequenzen (Summe der Gewichtungen: 0,99) ausgeräumt durch diese Korrekturen.
Tabelle 3 zeigt die Homologie der berechneten Pilzconsensusphytaseaminosäuresequenz mit den Phytasesequenzen, die für die Berechnung verwendet wurden.
Beispiel 3
Umwandlung der Pilzconsensusphytaseaminosäuresequenz in eine DNA-Sequenz
Die ersten 26 Aminosäurereste von A. terreus cbs116.46-Phytase wurden als Signalpeptid verwendet und daher an den N-Terminus aller Consensusphytasen fusioniert. Für diesen Stretch wurde eine spezielle Methode verwendet, um die entsprechende DNA-Sequenz zu berechnen. Purvis et al. (1987) schlugen vor, dass der Einbau seltener Codons in ein Gen einen Einfluss auf die Falteffizienz des Proteins hat. Daher wurde zumindest die Verteilung seltener Codons in der Signalsequenz von A. terreus cbs116.46, die für die Pilzconsensusphytase verwendet wurde und die sehr wichtig ist für die Ausscheidung des Proteins, aber umgewandelt in die S. cerevisiae-Codonverwertung, überführt in die neue Signalsequenz, die zur Expression in S. cerevisiae erzeugt wurde. Für die verbleibenden Teile des Proteins wurde die Codonhäufigkeitstabelle von stark exprimierten S. cerevisiae-Genen verwendet, die von dem GCG-Programm erhalten wurden, um die berechnete Aminosäuresequenz in eine DNA-Sequenz zu übersetzen.
Die entstehende Sequenz des fcp-Gens ist in 2 gezeigt.
Beispiel 4
Konstruktion und Klonierung der Pilzconsensusphytasegene
Die berechnete DNA-Seguenz der Pilzconsensusphytase wurde in Oligonucleotide mit 85 bp aufgeteilt, wobei alternierend die Sequenz des Sense- und Antisense-Strangs verwendet wurde. Jedes Oligonucleotid überlappt um 20 bp mit dem vorherigen und dem folgenden Oligonucleotid des entgegengesetzten Strangs. Die Anordnung aller Primer, die von Microsynth, Balgach (Schweiz) erworben wurden und in einer PAGE-gereinigten Form erhalten wurden, ist in 2 gezeigt.
Bei drei PCR-Reaktionen wurden die synthetisierten Oligonucleotide zu dem Gesamtgen zusammengesetzt. Für die PCR wurde der High Fidelity-Kit von Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) und der Thermocycler The Protokol^TM von AMS Biotechnology (Europa) Ltd. (Lugano, Schweiz) verwendet.
Oligonucleotid CP-1 bis CP-10 (Mischung 1, 2) wurden auf eine Konzentration von 0,2 pmol/μl für jedes Oligonucleotid vermischt. Eine zweite Oligonucleotidmischung (Mischung 2) wurde hergestellt mit CP-9 bis CP-22 (0,2 pmol/μl/Oligonucleotid). Zusätzlich wurden vier kurze Primer für die PCR-Reaktionen verwendet:
PCR-Reaktion a

10 μl Mischung 1 (2,0 pmol von jedem Oligonucleotid)
2 μl Nucleotide (jeweils 10 mM Nucleotid)
2 μl Primer CP-a (10 pmol/μl)
2 μl Primer CP-c (10 pmo1/μl)
10,0 μl PCR-Puffer
0,75 μl Polymerasemischung
73,25 μl H₂O

PCR-Reaktion b

10 μl Mischung 2 (2,0 pmol von jedem Oligonucleotid)
2 μl Nucleotide (jeweils 10 mM Nucleotid)
2 μl Primer CP-b (10 pmol/μl)
2 μl Primer CP-e (10 pmol/μl)
10,0 μl PCR-Puffer
0,75 μl Polymerasemischung (2,6 U)
73,25 μl H₂O

Reaktionsbedingungen für die PCR-Reaktion a und b

Stufe 1 2 min – 45°C
Stufe 2 30 s – 72°C
Stufe 3 30 s – 94°C
Stufe 4 30 s – 52°C
Stufe 5 1 min – 72°C
Stufe 3 und 5 wurden 40 Mal wiederholt.

Die PCR-Produkte (670 und 905 bp) wurden mit Agarosegelelektrophorese (0,9% Agarose) und anschließender Gelextraktion (QIAEX II Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden für die PCR-Reaktion c verwendet.
PCR-Reaktion c

6 μl PCR-Produkt von Reaktion a (= 50 ng)
6 μl PCR-Produkt von Reaktion b (= 50 ng)
2 μl Primer CP-a (10 pmol/μl)
2 μl Primer CP-e (10 pmol/μl)
10,0 μl PCR-Puffer
0,75 μl Polymerasemischung (2,6 U)
73,25 μl H₂O

Reaktionsbedingungen für PCR-Reaktion c

Stufe 1 2 min – 94°C
Stufe 2 30 s – 94°C
Stufe 3 30 s – 55°C
Stufe 4 1 min – 72°C
Stufen 2 bis 4 wurden 31 Mal wiederholt.

Das entstehende PCR-Produkt (1,4 kb) wurde wie oben erwähnt gereinigt, mit EcoRI verdaut und in einen mit EcoRI verdauten und dephosphorylierten pBsk(^–)-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ligiert. 1 μl der Ligierungsmischung wurde verwendet, um XL-1-kompetente E. coli-Zellen zu transformieren (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Alle Standardverfahren wurden durchgeführt, wie von Sambrook et al. (1987) beschrieben. Das konstruierte Pilzconsensusphytasegen (fcp) wurde durch Sequenzierung (Plasmid pBsk^–-fcp) verifiziert.
Beispiel 5
Expression des Pilzconsensusphytasegens fcp und seiner Varianten in Saccharomyces cerevisiae und deren Reinigung aus dem Kulturüberstand
Ein Pilzconsensusphytasegen wurde aus dem Plasmid pBsk^–fcp isoliert und in die EcoRI-Stellen der Expressionskassette des Saccharomyces cerevisiae-Expressionsvektors pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ligiert oder zwischen den verkürzten GAPFL-(Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase)-Promotor und den pho5-Terminator, wie von Janes et al. (1990) beschrieben, subkloniert. Die genaue Orientierung des Gens wurde mit PCR geprüft. Die Transformation von S. cerevisiae-Stämmen, z. B. INVSc1 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) erfolgte gemäß Hinnen et al. (1978). Einzelne Kolonien, die das Phytasegen unter der Kontrolle des GAPFL-Promotors beherbergen, wurden herausgepickt und in 5 ml Selektionsmedium (SD-Uracil, Sherman et al., 1986) bei 30°C unter heftigem Schütteln (250 U/min) 1 Tag lang kultiviert. Die Vorkultur wurde dann zu 500 ml YPD-Medium (Sherman er al., 1986) zugegeben und unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Die Induktion des gall-Promotors erfolgte nach den Anleitungen des Herstellers. Nach 4 Tagen Inkubation wurde die Zellbrühe zentrifugiert (7000 U/min, GS3-Rotor, 15 min, 5°C), um die Zellen zu entfernen und der Überstand wurde mit Hilfe von Ultrafiltration in Amicon-8400-Zellen (PM30-Membranen) und ultrafree-15-Zentrifugalfiltervorrichtungen (Biomax-30K, Millipore, Bedford, MA, USA) konzentriert. Das Konzentrat (10 ml) wurde auf einer 40 ml Sephadex G25 Superfine-Säule (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) mit 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, als Elutionspuffer entsalzt. Die entsalzte Probe wurde auf 2 M (NH₄)₂SO₄ gebracht und direkt auf eine 1 ml Butyl Sepharose 4 Fast Flow-Clu-omatographiesäule mit hydrophoben Wechselwirkungen (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 2 M bis 0 M (NH₄)₂SO₄ in 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, eluiert wurde. Die Phytase wurde mit dem Durchbruch eluiert, eingeengt, auf eine 120 ml Sephacryl S-300-Gelpermeationschromatographiesäule geladen (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland). Pilzconsensusphytase und PilzConsensusphytase 7 eluierten als homogener symmetrischer Peak und mit SDS-PAGE wurde gezeigt, dass sie zu etwa 95% rein waren.
Beispiel 6
Expression der Pilzconsensusphytasegene fcp und ihrer Varianten in Hansenula polymorpha
Die Phytaseexpressionsvektoren, die verwendet wurden, um H. polymorpha zu transformieren, wurden konstruiert, indem das EcoRI-Fragment von pBsk^–fcp, das die Consensusphytase oder eine Variante codiert, in die Mehrfachklonierungsstelle des H. polymorpha-Expressionsvektors pFPMT121, der auf einem ura3-Selektionsmarker und dem FMD-Promotor basiert, insertiert wurde. Das 5'-Ende des fcp-Gens wird an den FMD-Promotor, das 3'-Ende an den MOX-Terminator fusioniert (Gellisen et al., 1996; EP 0299108 B ). Der entstehende Expressionsvektor wird mit pFPMTfcp und pBsk^–fcp7 bezeichnet.
Die konstruierten Plasmide wurden in E. coli propagiert. Die Plasmid-DNA wurde gereinigt unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren. Die Expressionsplasmide wurden in den N. polymorpha-Stamm RP11, dem Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (ura3) fehlt, transformiert unter Verwendung des Verfahrens zur Herstellung von kompetenten Zellen und zur Transformation von Hefe, wie bei Gelissen et al. (1996) beschrieben. Jede Transformationsmischung wurde auf YNB (0,14% G/V Difco YNB und 0,5% Ammoniumsulfat), das 2% Glucose und 1,8% Agar enthielt, plattiert und bei 37°C inkubiert. Nach 4 bis 5 Tagen wurden einzelne transformierte Kolonien herausgepickt und in dem oben beschriebenen flüssigen Medium 2 Tage bei 37°C gezüchtet. Anschließend wurde ein Aliquot dieser Kultur verwendet, um frische Gläschen mit YNB-Medium, das 2% Glucose enthielt, zu impfen. Nach sieben weiteren Passagen in selektivem Medium integriert der Expressionsvektor in das Hefegenom in multimerer Form. Anschließend wurden mitotisch stabile Transformanten durch zwei zusätzliche Kultivierungsstufen in 3 ml nicht selektivem flüssigen Medium (YPD, 2% Glucose, 10 g Hefeextrakt und 20 g Pepton) erhalten. Um genetisch homogene rekombinante Stämme zu erhalten, wurde ein Aliquot der letzten Stabilisierungskultur auf einer selektiven Platte plattiert. Einzelne Kolonien wurden isoliert zur Analyse der Phytaseexpression in YNB, das 2% Glycerol statt Glucose enthielt, um den fmd-Promotor zu dereprimieren. Die Reinigung der Pilzconsensusphytasen erfolgte wie in Beispiel 5 beschrieben.
Beispiel 7
Expression der Pilzconsensusgene fcp und ihrer Varianten in Aspergillus niger
Das Plasmid pBsk^–fcp oder das entsprechende Plasmid einer Variante des fcp-Gens wurden als Matrize zur Einführung einer BspHI-Stelle stromaufwärts des Startcodons der Gene und eine EcoRV-Stelle stromabwärts des Stoppcodons verwendet. Der Expand^TM High Fidelity PCR Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde nur den folgenden Primern verwendet:
Die Reaktion wurde durchgeführt, wie vom Hersteller beschrieben. Das durch PCR amplifizierte fcp-Gen hatte eine neue BspHI-Stelle am Startcodon, die mit dem Primer Asp-1 eingeführt wurde, was zu einem Ersatz des zweiten Aminosäurerestes Glycin durch Serin führte. Anschließend wurde das DNA-Fragment mit BspHI und EcoRV verdaut und in die NcoI-Stelle stromabwärts des Glucoamylasepromotors von Aspergillus niger (glaA) und der EcoRV-Stelle stromaufwärts des Aspergillus nidulans Tryptophan C-Terminators (trpC) ligiert (Mullaney et al., 1985). Nach dieser Klonierungsstufe wurden die Gene sequenziert, um mögliche Fehler, die durch die PCR eingeführt wurden, nachzuweisen. Die entstehenden Expressionsplasmide, die im Wesentlichen dem in Beispiel 9 von EP 684 313 beschriebenen 'pGLAC-Vektor entsprachen, enthielten das Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasegen (pyr4) von Neurospora crassa als Selektionsmarker. Die Transformation von Aspergillus niger und die Expression der Consensusphytasegene erfolgte, wie in EP 684 313 beschrieben. Die Pilzconsensusphytasen wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, gereinigt.
Beispiel 8
Konstruktion von Muteinen der Pilzconsensusphytase
Um Muteine zur Expression in A. niger, S. cerevisiae oder H. polymorpha zu konstruieren, wurde das entsprechende Expressionsplasmid, das das Pilzconsensusphytasegen enthielt, als Matrize für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Mutationen wurden eingeführt unter Verwendung des "quick exchange^TM site-directed mutagenesis kit" von Stratagene (La Jolla, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers und unter Verwendung der entsprechenden Primer. Alle Mutationen, die gemacht wurden, und die entsprechenden Primer sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Klone, die die gewünschte Mutation beinhalten, wurden mit DNA-Sequenzanalyse identifiziert, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Die mutierte Phytase wurde verifiziert, indem das vollständige Gen sequenziert wurde.
Beispiel 9
Bestimmung der Phytaseaktivität und des Temperaturoptimums der Consensusphytase und ihrer Varianten
Die Phytaseaktivität wurde hauptsächlich, wie von Mitchell et al. (1997) beschrieben, bestimmt. Die Aktivität wurde in einer Testmischung gemessen, die 0,5% Phytinsäure (~5 mM), 200 mM Natriumacetat, pH 5,0, enthielt. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion gestoppt durch Zugabe eines gleichen Volumens an 15% Trichloressigsäure. Das freigesetzte Phosphat wurde quantitativ ausgewertet durch Vermischen von 100 μl Testmischung mit 900 μl H₂O und 1 ml 0,6 M H₂SO₄, 2% Ascorbinsäure und 0,5% Ammoniummolybdat. Standardlösungen von Kaliumphosphat wurden als Referenz verwendet. Eine Einheit Enzymaktivität wurde definiert als die Menge an Enzym, die 1 μmol Phosphat pro Minute bei 37°C freisetzt. Die Proteinkonzentration wurde bestimmt unter Verwendung des Enzymextinktionskoeffizienten bei 280 nm, der gemäß Pace et al. (1995) berechnet wurde: Pilzconsensusphytase, 1, 101; Pilzconsensusphytase 7, 1,068.
Im Fall der Kurven des pH-Optimums wurden gereinigte Enzyme in 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, verdünnt. Die Inkubationen wurden gestartet, indem Aliquots des verdünnten Proteins mit einem gleichen Volumen 1% Phytinsäure (~10 mM) in einer Reihe verschiedener Puffer gemischt wurden: 0,4 M Glycin/HCl, pH 2,5; 0,4 M Acetat/NaOH, pH 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5; 0,4 M Imidazol/HCl, pH 6,0, 6,5; 0,4 M Tris/HCl, pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. Kontrollversuche zeigten, dass der pH nur gering durch die Mischstufe beeinflusst wurde. Die Inkubationen wurden 15 Minuten lang bei 37°C durchgeführt, wie oben beschrieben.
Zur Bestimmung der Substratspezifitäten der Phytasen wurde Phytinsäure in der Testmischung durch 5 mM Konzentrationen der jeweiligen Phosphatverbindungen ersetzt. Die Aktivitätstests wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurden Enzym (100 μl) und Substratlösung (100 μl) 5 Minuten lang bei der angegebenen Temperatur vorinkubiert. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe der Substratlösung zu dem Enzym. Nach 15 Minuten Inkubation wurde die Reaktion mit Trichloressigsäure gestoppt und die Menge an freigesetztem Phosphat bestimmt.
Das pH-Optimum der ursprünglichen Pilzconsensusphytase war etwa bei pH 6,0 bis 6,5 (70 U/mg). Durch Einführunng der Q50T-Mutation verschob sich das pH-Optimum auf pH 6,0 (130 U/mg), während der Ersatz durch ein Leucin an gleicher Position zu einer maximalen Aktivität bei etwa pH 5,5 führte (212 U/mg). Der Austausch Q50G führte zu einem pH-Optimum der Aktivität oberhalb pH 6,0 (siehe 4). Der Austausch von Tyrosin an Position 51 gegen Asparagin führte zu einem relativen Anstieg der Aktivität unterhalb pH 5,0 (siehe 5). Insbesondere durch die Q50L-Mutation wurde die Spezifität der Pilzconsensusphytase für Phytat drastisch erhöht (siehe 6).
Das Temperaturoptimum der Pilzconsensusphytase (70°C) war 15 bis 25°C höher als das Temperaturoptimum der Wildtypphytasen (45 bis 55°C), die verwendet wurden, um die Consensussequenz zu berechnen (siehe Tabelle 5 und 3).
Beispiel 10
Bestimmung des Schmelzpunkts durch Differenzialscanningkalorimetrie (DSC)
Um die Entfaltungstemperatur der Pilzconsensusphytasen zu bestimmen, wurde Differenzialscanningkalorimetrie angewendet, wie früher von Brugger et al. (1997) veröffentlicht. Lösungen von 50 bis 60 mg/ml homogener Phytase wurden für die Tests verwendet. Eine konstante Erwärmungsrate von 10°C/min wurde bis auf 90°C angewendet.
Die bestimmten Schmelzpunkte zeigen klar die stark verbesserte Thermostabilität der Pilzconsensusphytase im Vergleich zu den Wildtypphytasen (siehe Tabelle 5 und 7). 7 zeigt das Schmelzprofil der Pilzconsensusphytase und ihrer Mutante Q50T. Der gemeinsame Schmelzpunkt wurde bestimmt mit 78 bis 79°C.
Literaturstellen

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Tabelle 1

Aspergillus terreus 9A-1 phytase: 0,50
Aspergillus terreus cbs116.46 phytase: 0,50
Aspergillus niger var. awamori phytase: 0,3333
Aspergillus niger T213 phytase: 0,3333
Aspergillus niger NRRL3135 phytase: 0,3333
Aspergillus fumigatus ATCC 13073 phytase: 0,20
Aspergillus fumigatus ATCC 32722 phytase: 0,20
Aspergillus fumigatus ATCC 58128 phytase: 0,20
Aspergillus fumigatus ATCC 26906 phytase: 0,20
Aspergillus fumigatus ATCC 32239 phytase: 0,20
Aspergillus nidulans phytase: 1,00
Talaromyces thermophilus ATCC 20156 phytase: 1,00
Myceliophora thermophila phytase: 1,00

Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Sequenzprotokoll

Claims

Konsensusprotein, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat, oder Varianten davon, wobei die Grundeigenschaften der Varianten wie enzymatische Aktivität (Art und spezifische Aktivität), Thermostabilität, Aktivität in einem bestimmten pH-Bereich (pH-Stabilität) nicht signifikant verändert worden sind.
Konsensusprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Aminosäuresequenz von 2 die folgenden Austausche durchgeführt worden sind: Q50L, Q50T, Q50G, Q50T-Y51N oder Q50L-Y51N.
Nahrungsmittel, Futtermittel oder Arzneimittel umfassend ein Konsensusprotein nach Anspruch 1 oder 2.