ES2230639T3 - Fitasas por consenso. - Google Patents
Fitasas por consenso.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE DIRIGE A UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE UNA PROTEINA POR CONSENSO, ESPECIFICAMENTE UNA PROTEINA POR CONSENSO A BASE DE FITASA, LA PROTEINA POR CONSENSO QUE PUEDE OBTENERSE POR MEDIO DE DICHO PROCESO, Y LOS MUTANTES ESPECIFICOS DE LA PROTEINA POR CONSENSO.
Description
Fitasas de consenso.
Las fitasas (myo-inositol hexakisfosfato
fosfohidrola-sas; EC 3.1.3.8) son enzimas que
hidrolizan el fitato (myo-inositol hexakisfosfato) a
myo-inositol y fosfato inorgánico y son conocidas por ser
valiosos aditivos de los alimentos.
Se describió una fitasa por primera vez en el
salvado del arroz, en 1907 [Suzuki y col., Bull. Coll. Agr. Tokio
Imp. Univ. 7, 495 (1907)] y fitasas a partir del
Aspergillus species en 1911 [Dox y Golden, J. Biol.. Chem.
10, 183-186 (1911)]. Fitasas han sido también
encontradas en el salvado de trigo, semillas vegetales, intestinos
de animales y en microorganismos [Howsen y Davis, Enzyme Microb.
Technol. 5, 377-382 (1983), Lambrechts y
col., Biotech. Lett. 14, 61-66 (1992), Shieh
y Ware, Appl. Microbiol. 16, 1348-1351
(1968)].
La clonación y expresión de la fitasa a partir
del Aspergillus niger (ficuum) han sido descritas por Van
Hartingsveldt y col., en Gene, 127, 87,94 (1993) y en la
solicitud de patente europea, publicación nº (EP) 420 358 y a partir
del Aspergillus niger var. awamori, por Piddington y col., en
Gene 133, 55-62 (1993).
La clonación, expresión y purificación de las
fitasas con mejores propiedades, han sido descritas en la patente
EP 684 313. Sin embargo, dado que existe todavía una contínua
necesidad de fitasas mejoradas especialmente con respecto a su
termoestabilidad, es un objeto de la presente invención el
proporcionar una fitasa de consenso mediante el siguiente
procedimiento.
Un procedimiento para la preparación de una
proteína de consenso, el cual procedimiento se caracteriza por los
siguientes pasos:
a) por lo menos tres secuencias de aminoácidos,
de preferencia cuatro, de una determinada familia de proteínas, se
alinean mediante un programa estándar de alineamiento ya conocido
en la especialidad;
b) se comparan los aminoácidos que están en la
misma posición de acuerdo con dicho alineamiento, teniendo en
cuenta su similitud evolutiva, mediante cualquier programa de los
ya conocidos en la especialidad, mientras que el grado de similitud
suministrado por este programa, el cual define la similitud más
baja de los aminoácidos que se emplean para la determinación de un
aminoácido de las correspondientes posiciones se ajusta a un número
menos limitativo, y los parámetros se ajustan de tal forma que es
posible para el programa el determinar a partir de solamente 2
aminoácidos idénticos en una posición correspondiente un aminoácido
para la proteína de consenso; sin embargo, si entre las secuencias
comparadas de aminoácidos hay secuencias que muestran un más alto
grado de similitud entre sí que con las secuencias restantes, estas
secuencias están representadas por su secuencia de consenso
determinada como se ha definido de la misma manera que en el
presente procedimiento para la secuencia de consenso de la proteína
de consenso, o se asigna un peso de voto de 1 dividido por el número
de dichas secuencias, a cada una de aquellas secuencias.
c) en el caso de que no pueda identificarse
mediante el programa ningún aminoácido corriente, cualquiera de los
aminmoácidos de todas las secuencias empleados para la comparación,
se selecciona de preferencia el aminoácido más frecuente de todas
dichas secuencias, o se selecciona un aminoácido sobre la base de
la consideración dada en el ejemplo 2.
d) una vez se ha definido la secuencia de
consenso, dicha secuencia se retrotraduce en una secuencia de ADN,
de preferencia empleando una tabla de frecuencia de codones del
organismo en el cual ha de tener lugar la expresión;
e) la secuencia de ADN se sintetiza mediante
métodos ya conocidos en la especialidad y se emplea, o bien
integrada en un vector de expresión adecuado o bien por si misma,
para transformar una célula anfitriona apropiada;
f) la célula anfitriona transformada se hace
crecer en condiciones de cultivo adecuadas, y la proteína de
consenso se aisla de la célula anfitriona o de su medio de cultivo
por métodos ya conocidos en la especialidad.
El procedimiento del paso b) puede definirse
también como sigue:
b) se comparan los aminoácidos que están en la
misma posición de acuerdo con dicha alineación teniendo en cuenta
su similitud evolutiva mediante cualquier programa estándar
conocido en la especialidad, mientras que el grado de similitud
proporcionado por dicho programa se ajusta al valor más bajo
posible y el aminoácido que es el más similar para por lo menos la
mitad de las secuencias empleadas para la comparación se selecciona
para la correspondiente posición en la secuencia de aminoácidos de
la proteína de consenso.
Este procedimiento completo puede ser visto en un
procedimiento en el cual se escoge una secuencia de un número de
secuencias altamente homólogas y solamente se reemplazan los
radicales de aminoácido que difieren claramente de una secuencia de
consenso de esta familia de proteínas calculada en condiciones
moderadamente restrictivas, mientras en todas las posiciones del
alineamiento donde el método no es capaz de determinar un
aminoácido en condiciones moderadamente restrictivas se toman los
aminoácidos de la secuencia preferida.
El programa empleado para la comparación de
aminoácidos en una posición determinada, en vistas a su similitud
evolutiva es el programa "PRETTY". La familia de proteínas
definida es la familia de las fitasas, especialmente cuando las
fitasas son de origen fúngico.
La célula anfitriona es de origen eucariótico,
especialmente fúngico, de preferencia un Aspergillus o
levaduras, de preferencia Saccharomyces o
Hansenula.
Es un objeto de la presente invención el
proporcionar una proteína de consenso obtenible, obtenida mediante
dicho procedimiento y específicamente la proteína de consenso que
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 ó una
variante de la misma. La expresión una "variante" se refiere,
en el contexto de la presente invención, a una proteína de consenso
con una secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 en donde
en una o más posiciones los aminoácidos han sido eliminados,
añadidos o reemplazados por uno o más aminoácidos diferentes con la
condición de que la secuencia resultante proporcione una proteína
cuyas propiedades básicas como la actividad enzimática (tipo y
actividad específicos), termoestabilidad, actividad en un cierto
margen de pH (estabilidad del pH) no han sido significativamente
cambiadas. "Significativamente" significa en este contexto que
un experto en la especialidad diría que las propiedades de la
variante pueden todavía ser diferentes pero esto no sería no
evidente en cuanto a las propiedades de la proteína de consenso con
la secuencia de aminoácidos de la propia figura 2.
Una muteína se refiere en el contexto de la
presente invención, a substituciones de aminoácidos en las
secuencias de aminoácidos de las proteínas de consenso mostradas en
la figura 2, lo cual conduce a proteínas de consenso con mejores
propiedades, p. ej., la actividad. Estas muteínas pueden definirse y
prepararse a base de las especificaciones dadas en la solicitud de
la patente europea número 97810175.6, p. ej., Q50L, Q50T, Q50G,
Q50L-Y51N ó Q50T-Y51N. "Q50L"
significa en este contexto que en la posición 50 de la secuencia de
aminoácidos, el aminoácido Q ha sido reemplazado por el aminoácido
L.
Asimismo, un alimento, pienso o composición
farmacéutica que comprende una proteína de consenso como se ha
definido más arriba es también un objeto de la presente
invención.
En este contexto, "por lo menos tres, de
preferencia tres secuencias de aminoácidos de dicha determinada
familia de proteínas" significa que tres, cuatro, cinco, seis
hasta 12, 20, 50 ó incluso más secuencias pueden emplearse para el
alineamiento y la comparación para crear la secuencia de aminoácidos
de la proteína de consenso. "Secuencias de una determinada
familia de proteínas" significa que dichas secuencias se pliegan
en una estructura de tres dimensiones en donde las hélices \alpha,
las hojas \beta y los giros están en la misma posición, de forma
que dichas estructuras son como se las llama por los expertos en la
especialidad, superponibles. Además, estas secuencias caracterizan
las proteínas que muestran el mismo tipo de actividad biológica, p.
ej., una determinada clase de enzimas p. ej., las fitasas. Como ya
es sabido en la especialidad, la estructura de tres dimensiones de
una de dichas secuencias es suficiente para permitir la modelación
de la estructura de otras secuencias de dicha familia. Un ejemplo,
de cómo esto se puede efectuar, viene dado en el ejemplo de
referencia del presente caso. "Similitud evolutiva" en el
contexto de la presente invención se refiere a un esquema que
clasifica los aminoácidos en cuanto a su similitud estructural que
permite que un aminoácido pueda ser reemplazado por otro aminoácido
con una mínima influencia sobre el conjunto de la estructura, como
hacen p. ej., los programas, como el "PRETTY" ya conocido en la
especialidad. La frase "el grado de similitud proporcionado por
dicho programa ... se ajusta a un número menos limitativo"
significa en el contexto de la presente invención, que los valores
de los parámetros que determinan el grado de similitud en el
programa empleado en la práctica de la presente invención, se
escogen de manera que permitan que el programa defina un aminoácido
común para un máximo de posiciones de toda la secuencia de
aminoácidos, p. ej., en caso del programa PRETTY puede escogerse un
valor de 2 ó 3 para el UMBRAL y un valor de 2 para la
PLURALIDAD.
Además, "un peso de voto de uno dividido por el
número de dichas secuencias", significa en el contexto de la
presente invención, que las secuencias que definen un grupo de
secuencias con un grado de similitud mayor que las otras secuencias
empleadas para la determinación de la secuencia de consenso sólo
contribuyen a dicha determinación con un factor que es igual a uno
dividido por el número de todas las secuencias de este grupo.
Como se ha mencionado anteriormente, en caso de
que el programa no permita seleccionar el aminoácido más similar,
se selecciona el aminoácido más frecuente, y si esto último fuera
imposible, el experto en la especialidad seleccionará un aminoácido
entre todas las secuencias empleadas para la comparación, que sea
conocido en la especialidad por su propiedad de mejorar la
termoestabilidad de las proteínas como describen p. ej.,
- Janecek, S. (1993), Process Biochem. 28, 435-445 ó
- Fersht, A. R. & Serrano, L. (1993), Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75-83.
- Alber, T. (1989), Annu. Rev. Biochem. 58, 765-798 ó
- Matthews, B. W. (1987), Biochemistry 26, 6885-6888.
- Matthews, B. W. (1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17-21.
La estabilidad de una enzima es un factor crítico
para muchas aplicaciones industriales. Por lo tanto se han hecho
una gran cantidad de intentos, con mayor o menor éxito, para
aumentar la estabilidad, de preferencia la termoestabilidad de las
enzimas mediante métodos racionales (van den Burg y col., 1998) o
métodos irracionales (Akanuma y col., 1998). Las fuerzas que
influencian la termoestabilidad de una proteína son las mismas que
aquellas que son responsables de un plegado correcto de la cadena
de un péptido (interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der
Waals, uniones H, puentes de sales, cepa conformacional (Matthews,
1993)). Además, como describe Matthews y col., (1987), la energía
libre del estado sin plegar tiene también una influencia en la
estabilidad de una proteína. La potenciación de la estabilidad de
una proteína significa aumentar el número y fuerza de las
interacciones favorables, y disminuir el número y fuerza de las
interacciones desfavorables. Ha sido posible introducir enlaces
disulfuro (Sauer y col., 1986) para reemplazar la glicina con
radicales de alanina o para aumentar el contenido de prolina con el
fin de reducir la energía libre del estado sin plegar (Margarit
y col., 1992; Matthews, 1987a). Otros grupos se
concentraron en la importancia de las uniones H adicionales o de
los puentes de sales en la estabilidad de una proteína (Blaber y
col., 1993), o intentaron llenar las cavidades interiores de la
proteína para aumentar el área de la superficie hidrofóbica oculta y
con ello las interacciones de van der Waals (Karpusas y
col., 1989). Además, se investigó también la estabilización
de los elementos de la estructura secundaria, especialmente las
hélices \alpha, por ejemplo, aumentando el recubrimiento de la
hélice (Muñoz & Serrano, 1995).
Sin embargo, no existe ninguna estrategia rápida
y prometedora para identificar las substituciones que aumentarán la
estabilidad, de preferencia la estabilidad térmica de una proteína.
Habitualmente, la estructura 3D de una proteína es necesaria para
encontrar lugares de la molécula en donde la substitución de un
aminoácido estabilizará posiblemente el estado plegado de la
proteína. Vías alternativas para soslayar este problema son, o bien
buscar una proteína homóloga en un organismo termo o
hipertermófilo, o bien detectar substituciones de aminoácidos que
aumentan la estabilidad mediante un método de mutagénesis
aleatoria. Esta última posibilidad sucede solamente en 10^{3} a
10^{4} mutaciones y está restringida a las enzimas para las cuales
es asequible un procedimiento de rápido rastreo (Arase y col-.
1993; Risse y col., 1992). Para todos estos métodos el éxito fue
variable e impredecible y, en caso de tener éxito, los aumentos de
termoestabilidad fueron casi siempre más bien pequeños.
Presentamos aquí un camino alternativo para
aumentar la termoestabilidad de una proteína. Imanaka y col.,
(1986) fue de los primeros en emplear comparaciones de proteínas
homólogas para aumentar la estabilidad de una proteína. Emplearon
la comparación entre proteasas, desde las proteasas termofílicas
con las proteasas homólogas de organismos mesofílicos, para
potenciar la estabilidad de una proteasa mesofílica. Serrano y
col., (1993) emplearon la comparación entre las secuencias de
aminoácidos de dos RNasas mesofílicas homólogas para construir una
RNasa más termoestable. Mutaron individualmente todos los residuos
que diferían entre las dos y combinaron las mutaciones que
aumentaban la estabilidad de un mutante múltiple. Pantoliano y
col., (1989) y en particular, Steipe y col., (1994)
sugirieron que el aminoácido más frecuente en cada posición de una
alineación de proteínas homólogas contribuía en gran proporción a
la estabilidad de una proteína. Steipe y col., (1994)
demostró esto para un dominio variable de una inmunoglobulina,
mientras que Pantaliano y col., (1989) buscaba posiciones en
la secuencia primaria de la subtilisina en la cual la secuencia de
la enzima escogida para aumentar su estabilidad, fue singularmente
divergente. Su método dio como resultado la substitución del M50F
lo cual aumentó el T_{m} de la subtilisina en 1,8ºC.
Steipe y col., (1994) demostraron en un
dominio variable de la inmunoglobulina que es posible predecir una
mutación estabilizante con más de una proporción del 60% de éxito,
empleando justamente un método estadístico que determina el residuo
aminoácido más frecuente en una cierta posición de este dominio. Se
pensó también que este método proporcionaría resultados útiles no
solamente para la estabilización de dominios variables de
anticuerpos sino también para dominios de otras proteínas. Sin
embargo no se mencionó nunca que este método podía ser extendido a
la proteína completa. Además, nada se dice sobre el programa que
fue utilizado para calcular la frecuencia de los residuos de
aminoácido en una distinta posición o si se emplearon matrices
estriadas como en el caso presente.
Pueden construirse secuencias de ADN a partir de
secuencias genómicas o secuencias o de ADNc que codifican
proteínas, p. ej., fitasas, conocidas en la especialidad [para
información de estas secuencias ver las referencias mencionadas más
arriba, p. ej., la patente EP 684 313 ó las bases de datos de
secuencias, por ejemplo como el Genbank (Intelligenetics,
California, USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall,
Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre,
Washington DC, USA) y Vecbase (University of Wisconsin,
Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA), o descritas en las
figuras mediante métodos de mutagénesis in vitro [ver p.
ej., Sambroook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York]. Una estrategia ampliamente empleada
para dicha "mutagénesis inducida en un sitio", como se
proyectó originalmente por Hurchinson y Edgell [J. Virol. 8,
181 (1971)], implica la asociación de un oligonucleótido sintético
que lleva la deseada substitución de nucleótidos, a una región diana
de una secuencia de ADN monocatenaria, en donde la mutación debe
ser introducida [para una revisión, ver Smith, Annu. Rev. Genet.
19, 423 (1985) y para métodos perfeccionados ver las
referencias 2-6 en Stanssen y col., Nucl.
Acid. Res., 17, 4441-4454 (1989)]. Otra
posibilidad de mutación de una secuencia dada de ADN que también se
prefiere para la práctica de la presente invención es la
mutagénesis empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El ADN como material de partida puede aislarse por métodos ya
conocidos en la especialidad y descritos p. ej., en Sambrook y
col, (Molecular Cloning) ("Clonación molecular") a partir
de las cepas correspondientes. Para información de las cepas ver p.
ej., la patente EP 684 313 ó cualquier autoridad depositaria
indicada más adelante. El Aspergillus niger [ATCC 9142],
Myceliophthora thermophila [ATCC 48 102], Talaromyces
thermophilus [ATCC 20186] y Aspergillus fumigatus [ATCC
34625] han sido redepositados de acuerdo con las condiciones del
Budapest Treaty ("Tratado de Budapest") en la American Type
Culture Cell Collection ("Colección americana de cultivos
celulares tipo"), con los siguientes números de registro: ATCC
74337, ATCC 74340, ATCC 74338 y ATCC 74339 respectivamente. Se
comprende, sin embargo, que el ADN que codifica una proteína de
consenso de acuerdo con la presente invención puede también
prepararse de manera sintética como se describe p. ej., en la
patente EP 747 483 ó los ejemplos por métodos ya conocidos en la
especialidad.
Una vez se han obtenido las secuencias completas
de ADN, pueden integrarse en vectores por métodos ya conocidos en
la especialidad y descritos p. ej., en Sambrook y col., (ver
más arriba) para superexpresar el polipéptido codificado, en
sistemas anfitriones apropiados. Sin embargo, el experto en la
especialidad sabe que también las mismas secuencias de ADN pueden
emplearse para transformar los sistemas anfitriones adecuados de la
invención para lograr una superexpresión del polipéptido
codificado. Sistemas anfitriones adecuados son por ejemplo los
hongos como los Aspergilli, p. ej., Aspergillus niger
[ATCC 9142] ó Aspergillus ficuum [NRRL 3135] o como el
Trichoderma, p. ej., el Trichoderma reesei o levaduras
como los Saccharomyces, p. ej., el Saccharomyces
cerevisiae o Pichia, como la Pichia pastoris, o
Hansenula polimorpha, p. ej., H. polymorpha
(DSM5215), o vegetales, como describe p. ej., Pen y col.,
Bio/Technology 11, 811-814 (1994). El experto en la
especialidad sabe que dichos microorganismos están disponibles en
las autoridades depositarias, p. ej., la American Type Culture
Collection (ATCC), el Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS) o la
Deutsche Saammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) o
cualquier otra autoridad depositaria como figuran relacionadas en
la revista "Industrial Property" [(1991) 1, páginas
29-40]. Las bacterias que pueden emplearse son p.
ej., E. coli, Bacilli como p. ej., Bacillus subtilis o
Streptomyces p. ej., Streptomyces lividans (ver p.
ej., Anné y Mallaert en FEMS Microbiol. Letters 114, 121
(1993). El E. coli que podría emplearse son las cepas E.
coli K12, p. ej., M15 [descrita como DZ 291 por Villarejo y
col., en J. Bacteriol. 120, 466-474 (1974)],
HB 101 [ATCC nº 33694] ó E. coli SG 13009 [Gottesman y col.,
J. Bacte-riol. 148, 265-273
(1981)].
Vectores que pueden emplearse para la expresión
en hongos son ya conocidos en la especialidad y están descritos p.
ej., en la patente EP 420 338, ó por Cullen y col., [Bio/Technology
5, 369-376 (1987)] ó Ward en Molecular
Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi
("Micología molecular industrial, sistemas y aplicaciones de los
hongos filamentosos"), Marcel Dekker, Nueva York (1991), Upshall
y col., [Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)]
Gwynne y col., [BioTechnology 5, 71-79
(1987)], Punt y col., [J. Bio/Technol. 17,
19-34 (1991)] y para levaduras por Sreekrishna y
col., [J. Basic Microbiol. 28, 265-278
(1988), Biochemistry 28, 4117-4125 (1989)],
Hitzemann y col. [Nature 293, 717-722 (1981)]
ó en EP 183 070, EP 183 071, EP 248 227, EP 263 311. Vectores
adecuados que pueden emplearse para la expresión en E. coli
se mencionan p. ej., en Sambrook y col. [ver más arriba] ó en Fiers
y col. en Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium ("8º Simposio
Internacional de Biotecnología"),[Soc. Franc. de
Micro-biol., Paris (Durand y col., eds.), pp.
680-697 (1988)] ó en Bujard y col., Methods in
Enzymology ("Métodos en Enzimología"), eds. Wu y Grossmann,
Academic Press, Inc. Vol. 155, 416-433 (1987)
y Stüber y col., en Immunological Methods, eds. Lefkovits y Pernis,
Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152 (1990).
Vectores que podrían emplearse para la expresión en Bacilli son ya
conocidos en la especialidad y están descritos p. ej., en EP 405
370, Procd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984) en Yansura y
Henner, Meth. Enzymol. 185, 199-228 (1990) ó
EP 207 459. Vectores que pueden emplearse para la expresión en
H. Polymorpha son ya conocidos en la especialidad y están
descritos p. ej., en Gellissen y col., Biotechnology
("Biotecnología"), 9, 291-295
(1991).
Tanto dichos vectores que ya llevan elementos
reguladores p. ej., promotores, o secuencias de ADN, pueden
modificarse para contener estos elementos. Elementos adecuados para
promotor que pueden emplearse son ya conocidos en la especialidad y
son p. ej., para el Trichoderma reesei el cbhl-[Haarki y col.,
Biotechnology 7, 596-600 (1989)] ó el
promotor pki1 (Schindler y col., Gene 130,
271-275 (1993)], para el Aspergillus oryzae el
promotor amy
[(Christensen y col., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics ("19ª conferencia de Lunteren sobre Gené-tica Molecular") F23 (1987), Christensen y col., Biotechnology 6, 1419-1422 (1988), Tada y col., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)], para el Aspergillus niger el glaA- (Cullen y col., Bio/Technology 5, 369-376 (1987), Gwynne y col., Bio/Technology 5, 713-719 (1987), Ward en Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi ("Micología Molecular Industrial, Sistemas y aplicaciones para hongos filamentosos"), Marcel Dekker, Nueva York, 83-106 (1991)], alcA- [Gwynne y col., Bio/Technology 5, 718-719 (1987)], sucl- [Boddy y col., Curr. Genet. 24, 60-66 (1993)], aphA- [MacRae y col., Gene 71, 339-348 (1988), MacRae y col., Gene 132, 193-198 (1993)], tpiA- [McKnight y col., Cell 46, 143-147 (1986), Upshall y col., Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)], gpdA- [Punt y col., Gene 69, 49-57 (1988), Punt y col., J. Biotechnol. 17, 19-37 (1991)] y el promotor pkiA [Graaff y col., Curr. Genet. 22, 21-27 (1992)]. Elementos promotores adecuados que podrían emplearse para la expresión en levaduras son ya conocidos en la especialidad y son, p. ej., el promotor pho5 (Vogel y col., Mol. Cell. Biol., 2050-2057 (1989); Rudolf y Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340-1344 (1987)] ó el promotor gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae y para Pichia pastoris, p. ej., el promotor aox1 (Koutz y col., Yeast ("Levadura") 5, 167-177 (1989);
Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)], ó el promotor FMD [Hollenberg y col., EPA nº 0299108] ó el promotor MOX [Ledeboer y col., Nucleic Acids Res. 13. 3063-3082 (1985] para H. polymorpha.
[(Christensen y col., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics ("19ª conferencia de Lunteren sobre Gené-tica Molecular") F23 (1987), Christensen y col., Biotechnology 6, 1419-1422 (1988), Tada y col., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)], para el Aspergillus niger el glaA- (Cullen y col., Bio/Technology 5, 369-376 (1987), Gwynne y col., Bio/Technology 5, 713-719 (1987), Ward en Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi ("Micología Molecular Industrial, Sistemas y aplicaciones para hongos filamentosos"), Marcel Dekker, Nueva York, 83-106 (1991)], alcA- [Gwynne y col., Bio/Technology 5, 718-719 (1987)], sucl- [Boddy y col., Curr. Genet. 24, 60-66 (1993)], aphA- [MacRae y col., Gene 71, 339-348 (1988), MacRae y col., Gene 132, 193-198 (1993)], tpiA- [McKnight y col., Cell 46, 143-147 (1986), Upshall y col., Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)], gpdA- [Punt y col., Gene 69, 49-57 (1988), Punt y col., J. Biotechnol. 17, 19-37 (1991)] y el promotor pkiA [Graaff y col., Curr. Genet. 22, 21-27 (1992)]. Elementos promotores adecuados que podrían emplearse para la expresión en levaduras son ya conocidos en la especialidad y son, p. ej., el promotor pho5 (Vogel y col., Mol. Cell. Biol., 2050-2057 (1989); Rudolf y Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340-1344 (1987)] ó el promotor gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae y para Pichia pastoris, p. ej., el promotor aox1 (Koutz y col., Yeast ("Levadura") 5, 167-177 (1989);
Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)], ó el promotor FMD [Hollenberg y col., EPA nº 0299108] ó el promotor MOX [Ledeboer y col., Nucleic Acids Res. 13. 3063-3082 (1985] para H. polymorpha.
Una vez la secuencia de ADN de consenso que
codifica la secuencia de aminoácidos de la figura 2 ha sido
expresada en una célula anfitriona adecuada en un medio adecuado,
puede aislarse la proteína codificada bien sea del medio, en el
caso de que la proteína se segregue en el medio, o bien a partir del
organismo anfitrión en el caso de que dicha proteína esté presente
intracelularmente por métodos ya conocidos en la especialidad de
purificación de proteínas o descrita en el caso de una fitasa, p.
ej., en la patente EP 420 358.
Una vez obtenido el polipéptido de la figura 2 de
la presente invención, puede caracterizarse por sus propiedades que
lo hacen útil en agricultura, y puede emplearse cualquier ensayo
conocido en la especialidad y descrito p. ej., por Simons y col.,
[Br. J. Nutr. 64. 525-540 (1990)], Schöner y
col., [J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66,
248-255 (1991)], Vogt [Arch. Geflügelk. 56,
93-98 (1992)], Jongbloed y col., (J. Anim. Sci.,
70, 1159-1168 (1992)], Perney y col.,
[Poultry Sci. 72, 2106-2114 (1993)], Farrell
y col., [J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69,
278-283 (1993), Broz y col., [Br. Poultry Sci.
35, 273-280 (1994)] y Düngelhoef y col.,
[Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10
(1994)].
En general, el polipéptido de la presente
invención puede emplearse sin que sea limitado a un campo
específico de aplicación, p. ej., en el caso de las fitasas para la
conversión de polifosfatos de inositol, como el fitato a inositol y
fosfato inorgánico.
Además, el polipéptido de la presente invención
puede emplearse en un procedimiento para la preparación de una
composición farmacéutica o alimentos o piensos compuestos, en donde
los componentes de dicha composición se mezclan con uno o más
polipéptidos de la presente invención. En consecuencia el alimento o
piensos compuestos o las composiciones farmacéuticas que contienen
uno o más polipéptidos de la presente invención son también un
objeto de la presente invención. Un experto en la especialidad está
familiarizado con su procedimiento de preparación. Estas
composiciones farmacéuticas o alimentos o piensos compuestos pueden
contener además aditivos o componentes generalmente empleados para
dicho propósito y conocidos en el estado actual de la
especialidad.
Antes de describir la presente invención con más
detalle se da a continuación una corta explicación de las tablas y
figuras anexas.
Tabla
1
Pesos de voto empleados de las secuencias de
aminoácidos de las fitasas fúngicas. La tabla muestra los pesos de
voto empleados para calcular la secuencia de consenso de las
fitasas fúngicas.
Tabla
2
Homología de las fitasas fúngicas. Las secuencias
de aminoácidos de las fitasas empleadas en el alineamiento, se
compararon mediante el programa GAP (paquete de programa GCG, 9;
Devereux y col., 1984) empleando parámetros estándar. La
comparación se restringió a la parte de la secuencia que se empleó
también para el alineamiento (ver leyenda de la figura 1)
desprovista del péptido señal que era más bien divergente. Los
números encima y debajo de la diagonal representan las identidades
y las similitudes respectivamente de los aminoácidos.
Tabla
3
Homología de la secuencia de aminoácidos de la
fitasa de consenso fúngica con las fitasas empleadas para su
cálculo. Las secuencias de aminoácidos de todas las fitasas se
compararon con la secuencia de la fitasa de consenso fúngica,
empleando el programa GAP (paquete del programa GCG, 9.0). De nuevo,
la comparación se restringió a la parte de la secuencia que se
empleó en el alineamiento.
Tabla
4
Cebadores empleados para la introducción de
mutaciones individuales en la fitasa de consenso fúngica. Para la
introducción de cada mutación, se necesitaron dos cebadores
conteniendo la mutación deseada (ver ejemplo 8). Los tripletes
cambiados están resaltados en negritas.
Tabla
5
Temperatura óptima y valor T_{m} de la fitasa
de consenso fúngica y de las fitasas de A. fumigatus, A.
niger, A. nidulans y M. thermophila. Las temperaturas
óptimas se tomaron de la figura 3. Los valores T_{m} se
determinaron mediante calorimetría de scanning diferencial como se
describe en el ejemplo 10 y se muestra en la figura 7.
Figura 1: Cálculo de la secuencia de la fitasa de
consenso a partir del alineamiento de casi todas las secuencias de
aminoácidos de las fitasas fúngicas conocidas. Las letras
representan los residuos de aminoácidos en el código de una letra.
Las secuencias siguientes se emplearon para el alineamiento:
phyA del Aspergillus terreus 9A-1
(Mitchell y col., 1997; del aminoácido (aa) 27), phyA de
Aspergillus terreus cbs 116.46 (van Loon y col., 1997;
de aa 27), phyA de Aspergillus niger var. awamori
(Piddington y col., 1993; de aa 27), phyA de
Aspergillus niger T213; de aa 27, phyA de
Aspergillus niger cepa NRRL 3135 (van Hartingsveldt y
col., 1993; de aa 27), phyA de Aspergillus fumigatus
ATCC 13073 (Pasamontes y col., 1997b; de aa 25), phyA
de Aspergillus fumigatus ATCC 32722 (van Loon y col., 1997;
de aa 27), phyA de Aspergillus fumigatus ATCC 58128
(van Loon y col., 1997; de aa 27), phyA de
Aspergillus fumigatus ATCC 26906 (van Loon y col.,
1997; de aa 27), phyA de Aspergillus fumigatus ATCC
32239 (van Loon y col., 1997; de aa 30), phyA de
Aspergillus nidulans (Pasamontes y col., 1997a;
de aa 25), phyA de Talaromyces thermophilus
(Pasamontes y col., 1997a; de aa 24), y phyA de
Myce-liophtora thermophila (Mitchell y
col., 1997; de aa 19). El alineamiento se calculó empleando el
programa PILEUP. La localización de los huecos se ajustó a mano.
Los residuos de aminoácido escritos en mayúscula en el alineamiento
en una posición dada pertenecen al conjunto de aminoácidos que
establecen el residuo de consenso. En negritas, debajo de la
secuencia de consenso calculada, se muestra la secuencia de
aminoácidos de la fitasa de consenso fúngica finalmente construída
(Fcp). Los huecos en la secuencia de consenso calculada se llenaron
a mano de acuerdo con los principios establecidos en el ejemplo
2.
Figura 2: Secuencia de ADN del gen de la fitasa
de consenso fúngica (fcp) y de los cebadores sintetizados
para la construcción del gen. La secuencia de aminoácidos calculada
(figura 1) se convirtió en una secuencia de ADN empleando el
programa BACKTRANSLATE (Devereux y col., 1984) y la tabla de
frecuencias de codones de los genes de levadura altamente expresadas
(paquete de programa GCG, 9.0). El péptido de señal de la fitasa de
A. terreus cbs se fusionó con el terminal N. Las bases en
negritas representan las secuencias de oligonucleótidos empleados
para generar el gen. Los nombres de los respectivos
oligonucleótidos están indicados encima o debajo de la secuencia.
Las bases subrayadas representan el codon de principio y final del
gen. Las bases escritas en cursiva muestran los dos sitios
Eco RI introducidos.
Figura 3: Temperatura óptima de la fitasa de
consenso fúngica y otras fitasas empleadas para calcular la
secuencia de consenso. Para la determinación de la temperatura
óptima, se efectuó el ensayo estándar de la fitasa en una serie de
temperaturas entre 37 y 85ºC. Las fitasas empleadas se purificaron
de acuerdo con el ejemplo 5. \nabla, fitasa de consenso fúngica;
\blacktriangledown, fitasa de A. fumigatus 13073; \Box,
fitasa de A. niger NRRL3135; \medcirc, fitasa de A.
nidulans; \blacksquare, fitasa de A. terreus
9A-1; \medbullet, fitasa de A. terreus
cbs.
Figura 4: Perfil de la actividad en función del
pH de la fitasa de consenso fúngica y del mutante Q50L, Q50T y
Q50G. La actividad de la fitasa se determinó empleando el ensayo
estándar en tampones apropiados (ver ejemplo 9) a diferentes
valores del pH. La gráfica a) muestra una comparación de la fitasa
de consenso fúngica (\medbullet) con los mutantes Q50L (\nabla),
Q50T (\blacktriangledown), y Q50G (\medcirc) en tanto por
ciento de actividad. La gráfica b) muestra una comparación de la
fitasa de consenso fúngica (\medcirc) con el mutante Q50L
(\medbullet) y Q50T (\nabla) empleando la actividad específica
de las enzimas purificadas expresadas en H. polymorpha.
Figura 5: el perfil de actividad en función del
pH de los mutantes Q50L, Y51N y Q50T; Y51N en comparación con los
mutantes Q50T y Q50L de la fitasa de consenso fúngica. La actividad
de la fitasa se determinó empleando el ensayo estándar en tampones
apropiados (ver ejemplo 9) a diferentes valores del pH. La gráfica
a) muestra la influencia de la mutación Y51N (\medbullet) sobre el
mutante Q50L (\medcirc). La gráfica b) muestra la influencia de
la misma mutación (\medbullet) sobre el mutante Q50T
(\medcirc).
Figura 6: Especificidad del substrato de la
fitasa de consenso fúngica y sus mutantes Q50L, Q50T y Q50G. Las
barras representan la actividad relativa en comparación con la
actividad con ácido fítico (100%) con una variedad de compuestos
fosforilados naturales y sintéticos ya conocidos.
Figura 7: Calorimetría de scanning diferencial
(DSC) de la fitasa de consenso fúngico y su mutante Q50T. Las
muestras de proteína se concentraron aproximadamente a
50-60 mg/ml y se dializaron extensivamente contra 10
mM de acetato de sodio, pH 5,0. Se aplicó una velocidad constante
de calentamiento de 10ºC/minuto hasta los 90ºC. La DSC de la fitasa
de consenso Q50T (gráfica superior) dio una temperatura de fusión
de 78,9ºC, la cual es casi idéntica al punto de fusión de la fitasa
de consenso fúngico (78,1ºC, gráfica inferior).
Las secuencias de aminoácidos de la fitasa de
A. fumigatus y A. terreus cbs 116.46, se compararon
con la secuencia de la fitasa de A. niger NRRL 3135 (ver
figura 1) para lo cual se había determinado la estructura
tridimensional mediante cristalografía con rayos X.
Se calculó un alineamiento múltiple de secuencias
de aminoácidos de la fitasa de A.niger NRRL 3135. Se calculó
una fitasa de A. fumigatus y una fitasa de A. terreus
cbs 116.46, con el programa "PILEUP" (Progr. Menu for the
Wisconsin Package, versión 8, Septiembre 1994, Genetics Computer
Group ("Grupo Informático de Genética", 575 Science Drive,
Madison Wisconsin, USA 53711). Los modelos tridimensionales de la
fitasa de A. fumigatus y la fitasa de A. terreus cbs
116.46 se construyeron empleando la estructura de la fitasa de
A. niger NRRL 3135 como un molde e intercambiando los
aminoácidos de la fitasa de A. niger NRRL 3135, de acuerdo
con el alineamiento de la secuencia a los aminoácidos de las
fitasas de A. fumigatus y A. terreus cbs 116.46,
respectivamente. La construcción del modelo y la optimización de la
energía se efectuaron empleando el programa Moloc (Gerber y Müller,
1995). Las posiciones C-alfa se mantuvieron fijas
excepto para nuevas inserciones/deleciones y en regiones bucle
distantes del sitio activo.
Solamente pudieron observarse pequeñas
diferencias de las estructuras modeladas con la estructura
cristalina original, en los bucles externos. Además, las moléculas
de substratos diferentes que se encuentran principalmente en el
camino de degradación del ácido fítico
(myo-inositol-hexakisfosfato) por la fitasa
del Pseudomonas sp. bacterium y en el grado determinado por
la fitasa de A. niger NRRL 3135 (Cosgrove, 1980), se
construyeron y estructuraron en la cavidad del sitio activo de cada
estructura de fitasa. Cada uno de estos substratos se orientó en un
modo de unión hipotético propuesto para las fosfatasas ácidas de
histidina (Van Etten, 1982). El grupo fosfato escindible, se
orientó hacia la His 59 catalíticamente esencial, para formar la
fosfoenzima covalente intermedia. El oxígeno de la unión fosfoéster
del substrato que se protonizará mediante el Asp 339 después de la
escisión, se orientó hacia el dador de protones. Se efectuó una
relajación conformacional de la parte estructural restante de los
substratos así como de los residuos de los sitios activos
circundantes, mediante la optimización de la energía con el programa
Moloc.
En base a los modelos estructurales, se
identificaron los residuos apuntando hacia la cavidad del sitio
activo. Más de la mitad (60%) de estas posiciones fueron idénticas
entre estas tres fitasas, mientras que solamente pocas posiciones
no se conservaron (ver figura 1). Esta observación podría extenderse
a cuatro secuencias de fitasas adicionales (A. nidulans, A.
terreus 9A1, Talaromyces thermophilus y Myceliophthora
thermophila).
El alineamiento se calculó empleando el programa
PILEUP de la Sequense Análisis Package Release 9.0 ("edición 9.0
del paquete de análisis de secuencias") (Devereux y col.,
1984) con el parámetro estándar (penalización 12 por creación del
hueco, penalización 4 por extensión del hueco). La localización de
los huecos se perfeccionó empleando un editor de texto. Se
emplearon las siguientes secuencias (ver figura 1) sin la secuencia
señal para efectuar el alineamiento partiendo con el aminoácido
(aa) mencionado a continuación:
gen phyA de Aspergillus terreus
9A-1, aa 21 (Mitchell y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus terreus cbs
l16.46, aa 27 (van Loon y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus niger var.
awamori, aa 27 (Paddington y col., 1993)
gen phyA de Aspergillus niger T213, aa
27
gen phyA de Aspergillus niger cepa
NRRL3135, aa 27 (van Hartingsveldt y col., 1993)
gen phyA de Aspergillus fumigatus
ATCC 13073, aa 26 (Pasamontes y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus fumigatus
ATCC 32722, aa 26 (van Loon y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus fumigatus
ATCC 58128, aa 26 (van Loon y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus fumigatus
ATCC 26906, aa 26 (van Loon y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus fumigatus
ATCC 32239, aa 30 (van Loon y col., 1997)
gen phyA de Aspergillus nidulans,
aa 25 (Roche nº R1288, Pasamontes y col., 1997a)
gen phyA de Talaromyces
thermophilus ATCC 20186, aa 24 (Pasamontes y col.,
1997a)
gen phyA de Myceliophthora
thermophila, aa 19 (Mitchell y col., 1997)
La tabla 2 muestra la homología de las secuencias
de fitasa mencionadas más arriba.
Empleando el alineamiento ajustado del ejemplo 1
como entrada, se calculó la secuencia de consenso mediante el
programa PRETTY de la Sequence Análisis Package Release 9.0
("edición 9.0 del paquete para análisis de secuencias")
(Devereux y col., 1984). PRETTY imprime las secuencias con
sus columnas alineadas y puede exponer una secuencia de consenso
para el alineamiento. Un peso de voto que tiene en cuenta la
similitud entre las secuencias de aminoácidos de las fitasas
alineadas, fueron asignados a todas las secuencias. El peso de voto
se ajustó de forma que el impacto combinado de todas las fitasas de
un subgrupo de secuencias (las mismas especies en cuanto al origen
pero de cepas distintas), p. ej., secuencias de aminoácidos de
todas las fitasas de A. fumigatus, por elección se ajustó
una, que significa que cada secuencia contribuye con un valor de 1
dividido por el número de secuencias de cepas (ver tabla 1). De
esta manera, fue posible evitar que secuencias de aminoácidos muy
similares, p. ej., de las fitasas de diferentes cepas de A.
fumigatus dominasen la secuencia de consenso calculada.
El programa PRETTY se arrancó con los siguientes
parámetros: La pluralidad que define el número de votos por debajo
del cual no existe consenso, se ajustó en 2,0. El umbral, que
determina el valor de la matriz de puntos por debajo del cual un
residuo de aminoácidos puede no votar una coalición de residuos, se
ajustó en 2. PRETTY empleó la matriz de puntos de consenso Pretty
Pep.Cmp para péptidos.
Diez posiciones de alineamiento (posición 46, 66,
82, 138, 162, 236, 276, 279, 280, 308; figura 1), para el cual el
programa no fue capaz de determinar un residuo de consenso, se
llenaron a mano de acuerdo con las siguientes reglas: si existía un
residuo muy frecuente, este residuo era escogido (138, 236, 280); si
había un grupo prevalente de residuos químicamente similares o
equivalentes, se seleccionaba el residuo más frecuente o, si no lo
había, se seleccionaba un residuo de este grupo (46, 66, 82, 162,
276, 308). Si no había ni un residuo prevalente ni un grupo
prevalente, se escogía uno de los residuos existentes de acuerdo
con la asunción común de su influencia sobre la estabilidad de la
proteína (279). Otras ocho posiciones (132, 170, 204, 211, 275, 317,
384, 447; figura 1) no se llenaron con el residuo de aminoácidos
seleccionado por el programa pero normalmente con aminoácidos que
estaban con la misma frecuencia que los residuos que fueron
escogidos por el programa. En la mayoría de los casos, la secuencia
ligeramente por debajo de las tres secuencias de A. niger
(suma de los pesos de voto 0,99) fue eliminada mediante estas
correcciones.
La tabla 3 muestra la homología de la secuencia
de aminoácidos de la fitasa de consenso, fúngica, calculada, con
las secuencias de las fitasas empleadas para el cálculo.
Los primeros 26 residuos aminoácidos de la fitasa
de A. terreus cbs 116.46 se emplearon como péptido señal y
por lo tanto, fusionados al terminal N de todas las fitasas de
consenso. Para este tramo, hemos utilizado un método especial para
calcular la correspondiente secuencia de ADN. Purvis y col.,
(1987) propusieron que la incorporación de codones raros en un gen
tiene una influencia sobre la eficiencia del plegado de la proteína.
Por lo tanto, por lo menos la distribución de codones raros en la
secuencia señal de A. terreus cbs 116.46 el cual se empleó
para la fitasa de consenso fúngico, y la cual es muy importante
para la secreción de la proteína pero convertido en el uso del
codón de S. cerevisiae, se transfirió en la nueva secuencia
señal generada para la expresión en S. cerevisiae. Para las
partes restantes de la proteína, hemos empleado la tabla de
frecuencia de codones de genes de S. cerevisiae altamente
expresados, obtenidos a partir del paquete de programa GCG, para
traducir la secuencia calculada de aminoácidos en una secuencia de
ADN.
La secuencia resultante del gen fcp está mostrada
en la figura 2.
La secuencia de ADN calculada de la fitasa de
consenso fúngica, se dividió en oligonucleótidos de 85 pares de
bases, empleando alternativamente la secuencia de la cadena del
sentido y la del antisentido. Cada oligonucleótido sobrepasa en 20
pares de bases al oligonucleótido anterior y al siguiente
oligonucleótido de la cadena opuesta. La posición de todos los
cebadores, adquiridos en Microsynth, Balgach (Suiza) y obtenidos en
forma de un PAGE purificado, está indicada en la figura 2.
Los oligonucleótidos sintetizados se compusieron
en tres reacciones PCR, en el gen completo. Para la PCR, se
emplearon el kit "High Fidelity Kit" de la firma Boehringer
Mannheim (Boehreinger Mannheim, Mannheim, Alemania), y el
termociclador "The Protocol^{TM}" de AMS Biotechnology
(Europe) Ltd. (Lugano, Suiza).
Los oligonucleótidos CP-1 a
CP-10 (mezcla 1, figura 2) se mezclaron a una
concentración de 0,2 pmoles/\mul por cada oligonucleótido. Una
segunda mezcla de oligonucleótidos (mezcla 2) se preparó con
CP-9 a CP-22 (0,2 pmoles/\mul por
cada oligonucleótido). Adicionalmente se emplearon cuatro cebadores
cortos en las reacciones PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- 10 \mul de mezcla 1 (2,0 pmoles de cada oligonucleótido)
- 2 \mul de nucleótidos (10 mM de cada nucleótido)
- 2 \mul del cebador CP-a (10 pmoles/\mul)
- 2 \mul del cebador CP-c (10 pmoles/\mul)
- 10,0 \mul de tampón de PCR
- 0,75 \mul de mezcla de polimerasa
- 73,25 \mul de H_{2}O
- 10 \mul de mezcla 2 (2,0 pmoles de cada oligonucleótido)
- 2 \mul de nucleótidos (10 mM de cada nucleótido)
- 2 \mul del cebador CP-b (10 pmoles/\mul)
- 2 \mul del cebador CP-e (10 pmoles/\mul)
- 10,0 \mul de tampón de PCR
- 0,75 \mul de mezcla de polimerasa (2,6 U)
- 73,25 \mul de H_{2}O
| paso 1, | 2 min - 45ºC | |
| step 2, | 30 seg - 72ºC | |
| step 3, | 30 seg - 94ºC | |
| step 4, | 30 sec - 52ºC | |
| step 5, | 1 min - 72ºC |
Los pasos 3 a 5 se repitieron 40 veces.
Los productos de la PCR (670 y 905 pares de
bases) se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa
(agarosa al 0,9%) y una subsiguiente extracción del gel (QIAEX II
Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Alemania). Los fragmentos
purificados de ADN se emplearon para la reacción PCR c.
- 6 \mul del producto de la PCR de la reacción a (=50 ng)
- 6 \mul del producto de la PCR de la reacción b (=50 ng)
- 2 \mul del cebador CP-a (10 pmoles/\mul)
- 2 \mul del cebador CP-e (10 pmoles/\mul)
- 10,0 \mul de tampón de PCR
- 0,75 \mul de mezcla de polimerasa (2,6 U)
- 73,25 \mul de H_{2}O
| paso 1, | 2 min - 94ºC | |
| step 2, | 30 seg - 94ºC | |
| step 3, | 30 seg - 55ºC | |
| step 4, | 1 min - 72ºC |
Los pasos 2 a 4 se repitieron 31 veces.
El producto resultante de la PCR (1,4 kb) se
purificó como se ha mencionado más arriba, se digirió con Eco RI, y
se ligó a un vector pBsk(-) digerido con Eco RI y
desfos-forilado (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Se
empleó 1 \mul de la mezcla de ligación para transformar las
células compe-tentes E. coli
XL-1 (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Todos los
procedimientos estándar se efectuaron como describe Sambrook y
col., (1987). El gen de la fitasa de consenso fúngico
construído (fcp) se verificó mediante secuenciado (plásmido
pBsk-fcp).
Se aisló un gen de la fitasa de consenso fúngica
del plásmido pBsk-fcp ligado en sitios de
Eco RI del casette de expresión del vector de expresión
pYES2 del Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen, San Diego,
CA, USA) o subclonado entre el promotor GAPFL acortado
(gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa) y el pho5 terminador como describe Janes y
col., (1990). La orientación correcta del gen fue comprobada
mediante PCR. La transformación de las cepas de S.
cerevisiae, p. ej., INVSc1 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) se
hizo de acuerdo con Hinnen y col., (1978). Se picaron
colonias individuales que contenían el gen de la fitasa bajo el
control del promotor GAPFL y se cultivaron en 5 ml de medio de
selección (SD-uracilo, Sherman y col., 1986)
a 30ºC, agitando vigorosamente (250 rpm) durante un día. El
precultivo se añadió a continuación a 500 ml de medio YPD (Sherman
y col., 1986) y se hizo crecer en las mismas condiciones. La
inducción del promotor gal 1 se hizo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Después de cuatro días de incubación,
el caldo de células se centrifugó (7000 rpm, rotor GS3, 15 minutos,
5ºC) para eliminar las células y el sobrenadante se concentró
mediante ultra-filtración en Amicon 8400 células
(membranas PM30) y dispositivos de filtración centrífuga
Ultrafree-15 (Biomax-30K, Millipore,
Bedford, MA, USA). El concentrado (10 ml) se desaló sobre una
columna de 40 ml Sephadex G25 Superfine (Pharmacia Biotech,
Friburgo, Alemania), con 10 mM de acetato de sodio, pH 5,0,
actuando como tampón de elución. La muestra desalada se trató con
2M de (NH_{4})_{2}SO_{4} y se cargó directamente sobre
una columna cromatográfica de interacción hidrofóbica de 1 ml de
Butil Sefarosa 4 Fast Flow (Pharmacia Biotech, Frifurgo, Alemania)
el cual se eluyó con un gradiente lineal de 2 M a 0 M de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en 10 mM de acetato de sodio, pH
5,0. La fitasa se eluyó por la zona de ruptura, se concentró y se
cargó sobre una columna de cromatografía de permeación en gel de 120
ml Sephacryl S-300 (Pharmacia Biotech, Friburgo,
Alemania). La fitasa de consenso fúngica y la fitasa de consenso
fúngico 7, eluyeron como un pico homogéneo simétrico y se comprobó
mediante SDS-PAGE que era aproximadamente del 95%
de pureza.
Los vectores de expresión de la fitasa empleados
para la transformación de la H. polimorfa, se construyeron
por inserción en el fragmento Eco RI del
pBsk^{-}fcp que codifica la fitasa de consenso o una
variante, en el sitio de clonado múltiple del vector de expresión
de la H. polimorfa, pFPMT121, el cual está basado en un
marcador de selección ura3 y el promotor FMD. El extremo 5'
del gen fcp se fusiona con el FMD, y el extremo 3'
con el terminador MOX (Gellissen y col., 1996: EP 0299 108
B). El vector de expresión resultante recibe el nombre de
pFPMTfcp y pBsk^{-}fcp 7.
Los plásmidos construídos se propagaron en el
E. coli. El ADN del plásmido se purificó empleando el estado
actual de los métodos de la especialidad. Los plásmidos de
expresión se transformaron dentro de la H. polimorfa cepa
RP11 deficiente en
orotidina-5'-fosfato descarboxilasa
(ura3) empleando el procedimiento para la preparación de
células competentes y para la transformación de levadura como ha
descrito Gelissen y col., (1996). Cada mezcla de
transformación se plaqueó sobre YNB (0,14'' p/v de Difco YNB y 0,5%
de sulfato de amonio) conteniendo 2% de glucosa y 1,8% de agar y se
incubó a 37ºC. Después de 4 ó 5 días, las colonias transformantes
individuales se picaron e hicieron crecer en el medio líquido
descrito más arriba durante 2 días a 37ºC. A continuación, se
empleó un alícuota de este cultivo para inocular viales recién
preparados con medio YNB conteniendo un 2% de glucosa. Después de
siete pasos más en medio selectivo, el vector de expresión está
integrado en el genoma de la levadura en forma multimérica. A
continuación se obtuvieron transformantes mitóticamente estables
mediante dos pasos adicionales de cultivo en 3 ml de medio líquido
no selectivo (YPD, 2% de glucosa, 10 g de extracto de levadura, y
20 g de peptona). Con el fin de obtener genéticamente cepas
recombinantes genéticamente homogéneas, se plaqueó un alícuota del
último cultivo de estabilización sobre una placa selectiva. Se
aislaron colonias individuales para el análisis de la expresión de
la fitasa en YNB conteniendo un 2% de glicerina en lugar de glucosa
para desreprimir el promotor fmd. La purificación de las
fitasas de consenso fúngicas se hizo como se ha descrito en el
ejemplo 5.
Se empleó el plásmido pBsk^{-}fcp ó el
correspondiente plásmido de una variante del gen fcp, como
molde para la introducción de un sitio Bsp HI en dirección
hacia arriba del codon de comienzo de los genes y un sitio Eco RV
en dirección hacia abajo del codon de finalización. Se empleó el
kit Expand^{TM} High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemania, con los siguientes cebadores:
La reacción se efectuó como se ha descrito por el
proveedor. El gen fcp amplificado por la PCR tenía un nuevo
sitio Bsp HI en el codon de comienzo, introducido por el
cebador Asp-1, lo cual dió como resultado la
substitución del segundo residuo aminoácido glicina por serina. A
continuación, el fragmento de ADN se digirió con Bsp HI y
Eco RV y se ligó en el sitio Nco I en dirección hacia
abajo del promotor glucoamilasa de Aspergillus niger (glaA)
y el sitio Eco RV en dirección hacia arriba del
Aspergillus nidulans del terminador triptófano C
(trpC) (Mullaney y col., 1985). Después de este paso de
clonado los genes fueron secuenciados para detectar posibles
defectos introducidos mediante la PCR. Los plásmidos de expresión
resultantes que básicamente corresponden al vector pGLAC como se
describe en el ejemplo 9 de la patente EP 684 313, contenían el gen
de la orotidina-5'-fosfato
descarboxilasa (pyr 4) de la Neurospora crassa como un
marcador de selección. La transformación del Aspergillus
niger y la expresión de los genes de la fitasa de consenso se
hizo como se describe en la patente EP 684 313, Las fitasas de
consenso fúngicas se purificaron como se describe en el ejemplo
5.
Para construir muteínas para la expresión en
A. niger, S. cerevisiae, ó H. polimorfa, se empleó el
correspondiente plásmido de expresión conteniendo el gen de la
fitasa de consenso fúngica, como molde para la mutagénesis inducida
al sitio. Las mutaciones se introdujeron empleando el "kit de
mutagénesis inducida al sitio quick exchange^{TM}" ("sitio de
intercambio rápido") de Stratagene (La Jolla, CA, USA) siguiendo
el protocolo del fabricante y empleando los correspondientes
cebadores. Todas las mutaciones efectuadas y los correspondientes
cebadores están resumidos en la tabla 4. Los clones conteniendo la
mutación deseada se identificaron mediante análisis de la secuencia
de ADN como ya es conocido en la especialidad. La fitasa mutada se
comprobó por secuenciado del gen completo.
La actividad fitasa se determinó básicamente como
se describe en Mitchell y col., (1997). La actividad se
midió en una mezcla de ensayo que contenía 0,5% de ácido fítico (=
5 mM), 200 mM de acetato de sodio, pH 5,0. Después de 15 minutos de
incubación a 37ºC, la reacción se interrumpió por adición de un
volumen igual de ácido tricloracético al 15%. El fosfato liberado se
cuantificó mezclando 100 \mul de la mezcla de ensayo con 900
\mul de H_{2}O y 1 ml de H_{2}SO_{4} 0,6 M, 2% de ácido
ascórbico y 0,5% de molibdato de amonio. Se emplearon soluciones
estándar de fosfato de potasio como referencia. Una unidad de
actividad de enzima se definió como la cantidad de enzima que libera
1 \mumol de fosfato por minuto a 37ºC. La concentración de
proteína se determinó empleando el coeficiente de extinción de
enzima a 280 nm calculado de acuerdo con Pace y col.,
(1995): fitasa de consenso fúngica, 1,101; fitasa de consenso
fúngica 7, 1,068.
En caso de curvas de pH óptimo, las enzimas
purificadas se diluyeron en 10 mM de acetato de sodio, pH 5,0. Las
incubaciones empezaron mezclando alícuotas de la proteína diluída
con un volumen igual de ácido fítico 1% (= 10 mM) en una serie de
diferentes tampones: 0,4 M de glicina/HCl, pH 2,5; 0,4 M de
acetato/NaOH, pH 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5; 0,4M de imidazol/HCl,
pH 6,0, 6,5; 0,4 M de Tris/HCl pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 9,0.
Experimentos de control mostraron que el pH fue solamente
ligeramente afectado por el paso de mezclado. Las incubaciones se
efectuaron durante 15 minutos a 37ºC como se ha descrito más
arriba.
Para la determinación de las especificidades del
substrato de las fitasas, se reemplazó el ácido fítico de la mezcla
de ensayo, por los respectivos compuestos de fosfato a la
concentración de 5 mM. Los ensayos de actividad se efectuaron como
se ha descrito más arriba.
Para la determinación de la temperatura óptima,
la enzima (100 \mul) y la solución del substrato (100 \mul) se
preincubaron durante 5 minutos a la temperatura dada. La reacción
empezó por adición de la solución del substrato a la enzima.
Después de 15 minutos de incubación, la reacción se interrumpió con
ácido tricloracético y se determinó la cantidad de fosfato
liberado.
El pH óptimo de la fitasa de consenso fúngica
original fue aproximadamente un pH 6,0-6,5 (70
U/mg). Mediante la introducción de la mutación Q50T, el pH óptimo
cambió a pH 6,0 (130 U/mg), mientras que la substitución mediante
una leucina en la misma posición dió como resultado un máximo de
actividad aproximadamente a pH 5,5 (212 U/mg). El intercambio Q50G
dio como resultado un pH óptimo de la actividad por encima de pH
6,0 (ver figura 4). El cambio de tirosina en la posición 51 con
asparagina dio como resultado un aumento relativo de la actividad
por debajo de pH 5,0 (ver figura 5). Especialmente mediante la
mutación Q50L, la especificidad para el fitato de la fitasa de
consenso fúngica aumentó drásticamente (ver figura 6).
La temperatura óptima de la fitasa de consenso
fúngica (70ºC) fue 15-25ºC mas alta que la
temperatura óptima de las fitasas tipo salvaje
(45-55ºC) lo cual se empleó para calcular la
secuencia de consenso (ver tabla 5 y figura 3).
Con el fin de determinar la temperatura de
desarrollo de las fitasas de consenso fúngicas, se efectuó una
calorimetría de scanning diferencial, como se había descrito
anteriormente por Brugger y col., (1997). Se emplearon
soluciones de 50-60 mg/ml de fitasa homogénea para
los ensayos. Se aplicó una velocidad constante de calentamiento de
10ºC/minuto hasta alcanzar los 90ºC.
Los puntos de fusión determinados muestran
claramente la termoestabilidad fuertemente aumentada de la fitasa
de consenso fúngica en comparación con las fitasas de tipo salvaje
(ver tabla 5 y figura 7). La figura 7 muestra el perfil de fusión de
la fitasa de consenso fúngica y su mutante Q50T. Su punto de fusión
habitual se determinó entre 78 y 79ºC.
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| Aspergillus terreus 9A-1 fitasa | 0.50 | |
| Aspergillus terreus cbs116.46 fitasa | 0.50 | |
| Aspergillus niger var. awamori fitasa | 0.3333 | |
| Aspergillus niger T213 fitasa | 0.3333 | |
| Aspergillus niger NRRL3135 fitasa | 0.3333 | |
| Aspergillus fumigatus ATCC 13073 fitasa | 0.20 | |
| Aspergillus fumigatus ATCC 32722 fitasa | 0.20 | |
| Aspergillus fumigatus ATCC 58128 fitasa | 0.20 |
| Aspergillus fumigatus ATCC 26906 fitasa | 0.20 | |
| Aspergillus fumigatus ATCC 32239 fitasa | 0.20 | |
| Aspergillus nidulans fitasa | 1.00 | |
| Talaromyces thermophilus ATCC 20186 fitasa | 1.00 | |
| Myceliphthora thermophila fitasa | 1.00 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Fitasa | Identidad [%] | Similitud [%] |
| A. niger T213 | 76.6 | 79.6 |
| A. niger var. awamori | 76.6 | 79.6 |
| A. niger NRRL3135 | 76.6 | 79.4 |
| A. nidulans | 77.4 | 81.5 |
| A. terreus 9A-1 | 70.7 | 74.8 |
| A. terreus cbs116.46 | 72.1 | 75.9 |
| A. fumigatus 13073 | 80.0 | 83.9 |
| A. fumigatus 32239 | 78.2 | 82.3 |
| T. thermophilus | 72.7 | 76.8 |
| M. thermophila | 58.3 | 64.5 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> fitasas de consenso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Case 13239
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 98113176.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1998-07-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 97112688.3
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<151>
1997-07-24
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<160> 19
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<170> módulo secuencial PADAT, versión 1.0-
modificada
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<210> 1
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<211> 441
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fitasa de consenso fig. 1
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 467
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fitasa de consenso fig. 2
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1426
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Gen de la fitasa de consenso fig.
2
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador CP-a
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatatgaatt catgggcgtg ttcgtc
\hfill26
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<210> 5
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CP-b
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaaagttc attgaaggtt tc
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CP-C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcgaaag cagtacaagt ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CP-e
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatatgaatt cttaagcgaa ac
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Asp-1
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatatcatga gcgtgttcgt cgtgctactg ttc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Asp-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccgactta caaagcgaat tctatagata tat
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadar para la mutación Q50L
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggg gtttgtacag tccatacttc tc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutación Q50L
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaagtatg gactgtacaa accccacaag tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutacion Q50T
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggg gtacctactc tccatacttc tc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuecnia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutación Q50T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaagtatg gagagtaggt accccacaag tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para la mutación Q50G
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggg gtggttactc tccatacttc tc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutación Q50G
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgagaagtatg gagagtaacc accccacaag tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutación
Q50T-Y51N
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggg gtaccaactc tccatacttc tc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutación
Q50T-Y51N
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<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaagtatg gagagttggt accccacaag tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la mutación
Q50L-Y51N
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggg gtctcaactc tccatacttc tc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador para la mutación
Q50L-Y51N
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgagaagtatg gagagttgag accccacaag tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (3)
1. Una proteína de consenso que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 ó cualquier
variante de la misma, en donde las variantes de las propiedades
básicas tales como la actividad enzimática (tipo de y actividad
específica), termoestabilidad, actividad en un cierto margen de pH
(estabilidad al pH), no han sido significativamente cambiadas.
2. La proteína de consenso de la reivindicación
1, caracterizada en que en la secuencia de aminoácidos de la
figura 2, se han efectuado los siguientes reemplazamientos, Q50L,
Q50T, Q50G, Q50T-Y51N, ó
Q50L-Y51N.
3. Un producto alimenticio, un pienso o una
composición farmacéutica que contiene una proteína de consenso como
se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 ó 2.
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