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Hintergrund
der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein künstlich
hergestelltes autofluoreszentes Protein, sowie ein Verfahren zu
seiner Herstellung.
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Stand der Technik
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Fluoreszierende Proteine sind hervorragende
Marken für
die Genexpression und die Proteinlokalisation in verschiedenen biologischen
Systemen (Kendall et al. (1998), Trends Biotechnol. 16, 216–224). Seit
der Veröffentlichung
des grünfluoreszierenden
Proteins (GFP = green fluorescent protein) aus der biolumineszenten
Qualle Aequorea victoria (Prasher et al. (1992) Gene 111, 229–233) wurden
zahlreiche Versuche unternommen, dieses Protein vorteilhaft zu verändern. So
konnte beispielsweise die Löslichkeit
des Proteins und seine Darstellbarkeit bei der Fluoreszenz-aktivierten
Zellsortierung (FACS = fluorescence activated Gell sorting) verbessert
werden (Cormack et al. (1996), Gene 173, 33–38). Es wurden ferner verschiedene
Farbmutanten des GFP erzeugt oder isoliert, die beispielsweise gelb,
blau oder rot fluoreszieren (z.B. Sawano et al. (2000) NAR
28 (16),
E 78; Yang et al. (1998), J. Biol. Chem. 273 (14), 8212; Heim et
al. (1996), Curr. Biol. 6 (2), 178–182; Lewis et al. (1999) Anal.
Chem. 71 (19), 4321 ; Patterson et al. (2001), J. Cell. Sci. 114,
837–838; Matz
et al. (1999), Nature Biotechnol. 17, 969–973). Darüber hinaus wurden zahlreiche
Versuche unternommen, bei dem GFP aus Aequorea durch Mutation eine
hellere Fluoreszenz zu erzeugen (Sacchetti (2001) FEBS
492 (1–2), 151;
Battistutta (2000), Proteins
41 (4), 429; Ito (1999) Biochem.
Biophys. Res. Com. 264 (2), 556; Kim et al. (1998) Brain Res. Bull.
47 (1), 35;
US 5,491,084 bzw.
Nature Biotechnol. (1996) 14, 315–319). Diese zahlreichen Anstrengungen
zur Veränderung
und Verbesserung der bekannten fluoreszierenden Proteine zeigen,
dass ein großer
Bedarf an solchen autofluoreszenten Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften
besteht. Einen Überblick über die
vielfältigen
Anwendungsmöglichkeiten
fluoreszierender Proteine gibt der Artikel von van Roessel et al.
(Nature Cell Biology (2002) Vol. 4, E 15 – E 20).
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Darüber hinaus wurden verstärkt neue
fluoreszierende Proteine aus natürlichen
Quellen, wie beispielsweise Anthozoen (Korallen), isoliert und charakterisiert
(z.B. Matz et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17, 969–973; Fradkov
et al. (2000), FEBS Letters 479, 127–130). Eine solche Isolierung
von neuen Proteinen aus natürlichen
Quellen und deren anschließende
Klonierung ist aber sehr aufwendig und kostenintensiv.
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Die WO 99/49019 A2 offenbart beispielsweise
grün-fluoreszierende
Proteine aus Anthozoen der Gattungen Renilla und Ptilosarcus, sowie
die isolierten Nukleinsäuren,
die für
diese Proteine kodieren.
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Die WO 00/46233 A1 offenbart ferner
ein fluoreszierendes Protein aus Korallen, sowie die hierfür kodierenden
Gene und mögliche
Anwendungen für
die Proteine.
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Die WO 01/32688 A1 offenbart die
Aminosäuresequenzen
von grünfluoreszierenden
Proteinen aus Renilla reniformis (Anthozoa, Coelenterata), sowie
die hieraus abgeleiteten Nukleotid-Sequenzen der Nukleinsäuren und
eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten.
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Die WO 01/34824 A2 zeigt einen Sequenzvergleich
(„alignment")
verschiedener fluoreszierender Proteine aus Aequorea victoria, Ptilosarcus
gurneyi und Renilla mulleri. Dieser Sequenzvergleich dient der Feststellung
von Homologien der Proteine, d.h. der Ermittlung der relativen Ähnlichkeiten
zwischen diesen Proteinen, und führt
nicht zur Herstellung neuer fluoreszierender Proteine.
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Die Bestrebungen ständig neue
autofluoreszente Proteine aus immer neuen Quellen zu isolieren zeigen,
dass ein sehr großer
Bedarf an neuen fluoreszierenden Proteinen mit vorteilhaften Eigenschaften
besteht.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung,
neue fluoreszierende Proteine bereitzustellen.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
ein fluoreszierendes Protein gelöst,
das eine Aminosäuresequenz
aufweist, welche mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID
Nrn. 1, 15, 17, 19 und 21 zumindest, 80 % Homologie aufweist. Es
werden also neue autofluoreszente Proteine bereitgestellt, die aufgrund ihrer
Fluoreszenz in Zellen nachweisbar sind und daher als Marken für die Genexpression
und die Proteinlokalisation beispielsweise in der Zell-, Entwicklungs-
und Molekularbiologie verwendet werden können. Dabei weisen die erfindungsgemäßen Proteine
auch teilweise neue Eigenschaften auf, wie beispielsweise die Regenerierbarkeit
der Fluoreszenz nach deren Ausbleichen mittels Bestrahlung mit Licht
bestimmter Wellenlänge.
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Als fluoreszierende Proteine im Sinne
der Erfindung sind dabei auch Fusionsproteine und Multimere zu verstehen,
die zumindest ein erfindungsgemäßes fluoreszierendes
Protein enthalten. Dies gilt besonders für Fusionsproteine, da die erfindungsgemäßen Proteine
unter anderem als Expressionsmarker verwendet werden können und
sich somit eine Fusion mit weiteren Proteinen anbietet.
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Im Sinne der Erfindung ist unter
dem Begriff Homologie der Grad der Übereinstimmung von zwei Proteinsequenzen,
d.h. die Anzahl der in den Proteinen übereinstimmenden Aminosäure-Positionen
in Prozent, zu verstehen. Dabei können in eine oder beide Proteinsequenzen
eine oder mehrere Lücken
eingefügt
werden, damit die höchstmögliche Anzahl
identischer Aminosäuren
in Bezug auf ihre jeweilige Position einander zugeordnet sind. Zur
Bestimmung der Homologie kann aber beispielsweise auch ein herkömmliches
Datenverarbeitungsprogramm verwendet werden.
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In besonders vorteilhafter Ausgestaltung
der Erfindung weist das erfindungsgemäße fluoreszierende Protein
mit einer der Aminosäuresequenzen
gemäß Seq ID
Nrn. 1, 15, 17, 19 und 21 zumindest 90 % Homologie auf.
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Durch gezielte oder ungerichtete
Mutation lassen sich die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Proteins
vorteilhaft beeinflussen. Dabei hat sich als besonders, vorteilhaft
erwiesen, dass bezogen auf die Aminosäuresequenz gemäß Seq ID
Nr. 1 die Aminosäure
an Position 2 Valin oder Glutaminsäure ist, die Aminosäure an Position 3 Alanin
oder Leucin, die Aminosäure
an Position 4 Lysin oder Cystein, die Aminosäure an Position 6 Lysin
oder Valin oder Glutaminsäure,
die Aminosäure
an Position 7 Asparagin oder Alanin, die Aminosäure an Position 10 Lysin
oder Threonin, die Aminosäure
an Position 44 Threonin oder Alanin, die Aminosäure an Position 98 Isoleucin
oder Phenylalanin, die Aminosäure
an Position 108 Isoleucin oder Alanin, die Aminosäure an Position 125 Leucin
oder Phenylalanin, die Aminosäure
an Position 128 Valin oder Alanin, die Aminosäure an Position 150 Lysin
oder Glutaminsäure,
die Aminosäure
an Position 174 Tyrosin oder Histidin, die Aminosäure an Position 183 Lysin
oder Glutaminsäure,
die Aminosäure
an Position 213 Valin oder Alanin, die Aminosäure an Position 223 Glycin
oder Lysin, die Aminosäure
an Position 224 Valin oder Isoleucin oder Serin, die Aminosäure an Position 225 Alanin
oder Arginin oder Tryptophan, die Aminosäure an Position 226 Leucin oder
Glycin oder Serin, die Aminosäure
an Position 227 Prolin oder Threonin und/oder die Aminosäure an Position 228 Lysin
oder Serin ist. Das Vorliegen dieser Aminosäuren an den jeweiligen Positionen
wirkt sich beispielsweise vorteilhaft auf die Expression, Stabilität, Löslichkeit
und Fluoreszenzintensität
der erfindungsgemäßen Proteine
aus.
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Einige der erfindungsgemäßen fluoreszierenden
Proteine weisen die vorteilhafte und überraschende Eigenschaft auf,
dass die Fluoreszenz bei der Bestrahlung mit Licht für die Fluoreszenz
geeigneter Wellenlänge
nach kurzer Zeit abklingt und durch eine folgende Bestrahlung mit
Licht anderer Wellenlänge
wieder regenerierbar ist. Dabei kann die Bestrahlung zur Anregung
der Fluoreszenz mit Licht einer Wellenlänge zwischen 375 und 580 nm
und die Bestrahlung zur Regeneration der Fluoreszenz mit Licht kürzerer Wellenlänge, insbesondere
einer Wellenlänge
zwischen 320 und 400 nm, erfolgen. Erfindungsgemäß kann dieses fluoreszierende
Protein in vorteilhafter Weise beispielsweise zum Nachweis von zeitabhängigen zellulären Prozessen, wie
Proteindiffusion oder -transport, oder zur optischen Informationsspeicherung
verwendet werden.
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Die Erfindung betrifft ferner ein
Nukleinsäuremolekül mit einer
Nukleotidsequenz, die für
ein fluoreszierendes Protein kodiert, wobei die Nukleotidsequenz
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) einer isolierten
oder künstlichen
Nukleotidsequenz, welche für
das erfindungsgemäße fluoreszierende Protein
kodiert,
- b) einer Nukleotidsequenz gemäß Seq ID Nrn. 2, 16, 18, 20
oder 22, oder
- c) einer Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen
gemäß a) oder
b) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes
Codon unterscheidet, d.h bei der zumindest eine stille Mutation
vorliegt.
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Die Erfindung betrifft ferner einen
Vektor zur Expression eines fluoreszierenden Proteins in einer geeigneten
Zelle, wobei dieser das zuvor beschriebene Nukleinsäuremolekül in exprimierbarer
Form enthält.
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Die Erfindung betrifft auch Zellen,
welche das erfindungsgemäße Protein,
das genannte Nukleinsäuremolekül und/oder
den genannten Vektor enthalten, sowie einen Kit, der das erfindungsgemäße Protein,
das beschriebene Nukleinsäuremolekül, den beschriebenen
Vektor und/oder zumindest eine der genannten Zellen enthalten.
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Es ist ferner eine pharmazeutische
Zusammensetzung vorgesehen, welche das erfindungsgemäße Protein,
das genannte Nukleinsäuremolekül und/oder
den genannten Vektor, sowie vorzugsweise übliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe,
enthält.
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Die Erfindung betrifft ferner ein
Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteins.
Bei diesem Verfahren werden die Aminosäuresequenzen von zumindest
drei bekannten autofluoreszenten Proteinen dadurch verglichen, dass
diese zunächst
auf eine Weise nebeneinander angeordnet werden, dass sich gegebenenfalls
unter Einführung
von Lücken
eine Übereinstimmung
der Positionen von Invarianten Aminosäuren oder ähnlichen Bereichen für alle Proteine
ergibt. Dabei können
die Aminosäuresequenzen
beispielsweise derart zueinander ausgerichtet werden, dass die höchstmögliche Anzahl
identischer Aminosäuren in
Bezug auf ihre jeweilige Position einander zugeordnet sind, wobei
dies vorzugsweise unter Beibehaltung der jeweiligen Reihenfolge
der Aminosäuren
erfolgt. Ähnliche
Bereiche sind hierbei alle Sequenzabschnitte, vorzugsweise ein Abschnitt
von zumindest drei aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die eine im wesentlichen identische
Primärstruktur
aufweisen oder im gefalteten Protein eine Domäne bilden, deren Funktion bereits
bekannt ist. Die ähnlichen
Bereiche können
bei unterschiedlichen Proteinen auch an unterschiedlichen Positionen
liegen. In diesem Fall kann der Abgleich der ähnlichen Bereiche beispielsweise
durch Einfügen
von Lücken
oder das Verschieben dieser Bereiche in der Sequenz erfolgen.
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Mit Hilfe dieses Abgleichs der jeweiligen
Positionen der ausgewählten
Aminosäuresequenzen
wird eine Durchschnitts-Sequenz über
zumindest einen wesentlichen Teil der gesamten Länge der Aminosäuresequenz
ermittelt. Dabei wird für
jede gegebene Position diejenige Aminosäure ausgewählt, die in den zugrundeliegenden
Aminosäuresequenzen
an dieser Position am häufigsten
auftritt, wobei eine Lücke
wie eine Aminosäure
behandelt wird. Hieraus ergibt sich eine Folge von Aminosäuren und
Lücken
mit dazwischen liegenden Positionen, an denen keine Aminosäure am häufigsten
auftritt bzw. an denen zwei oder mehr Aminosäuren mit der gleichen Häufigkeit
auftreten. An diesen Stellen muss nun eine Aminosäure nach
zuvor festgelegten, sinnvollen, reproduzierbaren und allgemein gültigen Kriterien
ausgewählt
werden. Hierzu stellt das erfindungsgemäße Verfahren mehrere Möglichkeiten
zur Verfügung.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird eine Aminosäure
an einer solchen Position dadurch ermittelt, dass zunächst vor
dem Vergleich der Aminosäuresequenzen
eine Rangfolge der zugrundeliegenden Proteine festgelegt wird, d.h.
den einzelnen Proteinen werden Rangnummern von 1 bis n zugeordnet.
Ist an einer Position die häufigste
Aminosäure
nicht eindeutig feststellbar, so wird diejenige Aminosäure eingesetzt,
die unter den häufigsten
Aminosäuren
zu der Proteinsequenz gehört,
die die niedrigste Rangnummer besitzt.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung wird eine Aminosäure
an einer solchen Position dadurch ermittelt, dass die Aminosäuren aufgrund
funktioneller und/oder struktureller Kriterien in Gruppen eingeteilt
werden und bei mehreren Aminosäuren
mit gleicher Häufigkeit
eine Aminosäure
aus der Gruppe ausgewählt
wird, die an der jeweiligen Position am häufigsten auftritt.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung wird eine Aminosäure
an einer solchen Position dadurch ermittelt, dass bei mehreren Aminosäuren mit
gleicher Häufigkeit
die Aminosäure aufgrund
funktioneller und/oder struktureller Kriterien unter Berücksichtigung
der Eigenschaften der bekannten Proteine ausgewählt wird.
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Dabei kann beim Erstellen der Durchschnitts-Sequenz
die Auswahl einer Aminosäure
bei mehreren Aminosäuren
mit gleicher Häufigkeit
innerhalb einer Aminosäuresequenz
auch aufgrund unterschiedlicher Kriterien erfolgen, d.h. die zuvor
genannten Ausführungsformen
können
in vorteilhafter Weise miteinander kombiniert werden. Ferner können funktionelle
und strukturelle Kriterien oder sonstige Kenntnisse über die
bekannten Proteine auch die genannte Festlegung der Rangfolge der
Aminosäure-Sequenzen
vor deren Vergleich bedingen oder zumindest beeinflussen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht überraschender
Weise die Herstellung neuer fluoreszierender Proteine, die sich
in einem geigneten System exprimieren lassen. Die zuvor beschriebenen
Verfahrensschritte führen
zu einer vollständigen,
künstlichen
Aminosäuresequenz,
die ein Protein repräsentiert,
welches Autofluoreszenz zeigt und in einem geeigneten System exprimierbar
ist.
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Zur Expression des Proteins und zum
Nachweis der Fluoreszenz wird zunächst eine künstliche Nukleinsäure-Sequenz,
die für
die ermittelte Durchschnitts-Sequenz
kodiert, erstellt und zumindest ein entsprechendes Nukleinsäure-Molekül synthetisiert.
Dieses Nukleinsäure-Molekül wird mit
einem geeigneten Promotor verbunden und das Protein dann in einem
geeigneten System exprimiert. Das erfindungsgemäße Verfahren führt also
zu einem neuen, vollständig
funktionsfähigen
fluoreszierenden Protein. Das Verfahren kann dabei einfach und ohne
grossen apparativen Aufwand durchgeführt werden. Ferner wird bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
nicht lediglich ein bekanntes Protein verändert, sondern dieses geht
vielmehr von mehreren bekannten Proteinen aus, so dass die positiven
Eigenschaften der verschiedenen Proteine in dem neuen Protein vereint
werden können.
Auf diese Weise können
neue fluoreszierende Proteine hergestellt werden, ohne dass bisher
unbekannte natürliche
Proteine mit viel Aufwand isoliert und kloniert werden müssen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird dabei die Durchschnitts-Sequenz vor dem Erstellen der künstlichen
Nukleinsäure-Sequenz
am N-Terminus und/oder C-Terminus
durch Austausch zumindest einer Aminosäure modifiziert. Zum Erreichen
einer optimalen Kozak-Region im Bereich des Start-Codons kann beispielsweise
nach der Startaminosäure
Methionin die zusätzliche
Aminosäure
Valin eingeführt
werden. Am C-Terminus kann ferner beispielsweise die zusätzliche
hydrophile Aminosäure
Serin angefügt
werden, um die Löslichkeit
des Proteins zu verbessern.
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In besonders vorteilhafter Ausgestaltung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist vorgesehen, dass anschließend,
d.h. nach Erstellung und Expression der Durchschnitts-Sequenz, in
dem künstlichen
Nukleinsäure-Molekül zumindest
ein Codon ausgetauscht und/oder durch Mutagenese verändert wird
und hierdurch zumindest eine Aminosäure der Durchschnitts-Sequenz
ausgetauscht wird. Durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren können bestimmte
Eigenschaften des künstlichen
Proteins, wie beispielsweise Stabilität, Löslichkeit, Kompatibilität oder Funktionalität, in vorteilhafter
Weise verändert
werden. Dabei kann insbesondere die Fluoreszenz, d.h. die gemeinsame
Funktion der ursprünglichen
bekannten Proteine, gezielt beeinflusst bzw. verbessert werden.
Erfindungsgemäß konnten
andere Mutanten des fluoreszierenden Durchschnitts-Proteins (Durchschnitts – FP) generiert
werden, die in Bezug auf die Löslichkeit
in der Zelle und die Helligkeit der Fluoreszenz deutlich verbessert
sind. Dabei betragen die Abweichungen der Mutantenklone vom Durchschnitts – FP in
Bezug auf die Aminosäure-Sequenz
maximal 10%, d.h. die Homologie der erfindungsgemäßen Proteine
untereinander beträgt
mindestens 90%.
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In weiterer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist vorgesehen, dass das Protein nach der Expression isoliert und/oder
aufgereinigt wird, damit es der weiteren Verwendung in geeigneter
Form zugeführt
werden kann.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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Die Erfindung wird im weiteren anhand
der Figuren beispielhaft näher
erläutert.
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1 zeigt
einen Vergleich der Aminosäuresequenzen
von 9 fluoreszierenden Proteinen (FPs), bei dem die Sequenzen derart
untereinander angeordnet sind, dass sich unter Einführung von
Lücken
eine optimale Übereinstimmung
von Invarianten Aminosäuren
oder ähnlichen
Bereichen für
alle Proteine ergibt. Dabei wurden den einzelnen FPs jeweils Rangnummern
zugeordnet:
Rangnummer 1: Aequorea victoria GFP (Gene
(1992) 111, 229)
Rangnummer 2: Zoanthus sp. zFP506
(Nature Biotechnol. (1999) 17, 969)
Rangnummer 3:
Zoanthus sp. zFP538 (Nature Biotechnol. (1999) 17, 969)
Rangnummer 4:
Discosoma striata dsFP483 (Nature Biotechnol. (1999) 17, 969)
Rangnummer 5:
Discosoma sp. "red" dsFP583 (Nature Biotechnol. (1999) 17,969)
Rangnummer 6:
Anemonia majano amFP486 (Nature Biotechnol. (1999) 17, 969)
Rangnummer 7:
Clavularia sp. cFP484 (Nature Biotechnol. (1999) 17, 969)
Rangnummer 8:
Renilla mulleri GFP (WO 99/49019)
Rangnummer 9: Ptilosarcus
gurneyi GFP (W0 99/49019)
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Hieraus wurde die Durchschnitts-Sequenz
bzw. durch das Einfügen
zusätzlicher
Modifikationen das Durchschnitts-FP gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
ermittelt.
- a) Aminosäure-Positionen 1 bis 53
- b) Aminosäure-Positionen 54 bis 109
- c) Aminosäure-Positionen 110 bis 164
- d) Aminosäure-Positionen 165 bis 222
- e) Aminosäure-Positionen 223 bis 234
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Die Nummerierung der Positionen bezieht
sich hier auf die ermittelte Durchschnitts-Sequenz. An den Stellen,
an denen in der Durchschnitts-Sequenz eine Lücke vorliegt, werden die Positionen
nicht fortlaufend nummeriert, sondern mit den Zusätzen „b" bzw. „c" versehen.
Ausnahmen hiervon bilden lediglich die Positionen 1b und 226b,
an denen im Durchschnitts-FP gegenüber der ermittelten Durchschnitts-Sequenz
zusätzliche
Aminosäuren
eingefügt
sind.
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2 zeigt
eine schematische Darstellung des Aufbaus der Plasmide, die zur
Durchführung
des beschriebenen Verfahrens und zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden
Proteine in Escherichia coli und Säugetierzellen verwendet werden.
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3 zeigt
fluoreszenzmikroskopische Bilder von NIH3T3-Zellen, die mit Expressionsplasmiden
für verschiedene
Mutageneseprodukte der erfindungsgemäßen Proteine transfiziert wurden.
A: 9 Stunden nach Transfektion, B: 24 Stunden nach Transfektion.
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4 zeigt
fluoreszenzmikroskopische Bilder von NIH3T3-Zellen (Fluoreszein-Filtersatz) nach
Transfektion mit einem Expressionsplasmid für ein Mutageneseprodukt eines
erfindungsgemäß hergestellten
Proteins (p2A9-c15m3). A: Aufnahme 6 Stunden nach Transfektion
bei Bestrahlung mit Fluoreszein-Anregungsfilter, B:
Aufnahme nach 10 Sekunden. Bestrahlung mit Fluoreszein-Anregungsfilter,
C: Aufnahme nach 2 Sekunden Bestrahlung mit DAPI-Anregungsfilter zur Regeneration und
anschließender
Bestrahlung mit Fluoreszein-Anregungsfilter.
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5 zeigt
fluoreszenzmikroskopische Bilder von Escherichia coli-Zellen (DH5),
die mit je 7,1 μg
eines Plasmids ohne fluoreszierendes Protein (pMCS5, Negativkontrolle;
A) und eines Expressionplasmids (pExpAcFP; B), welches das Gen für das Durchschnitts-FP
enthält,
transformiert wurden. Von einer ÜN-Kultur
der transformierten Zellen wurden jeweils 2 ml pelletiert, der Überstand
dekantiert, das Pellet mit dem letzten Tropfen resuspendiert und
von dieser Suspension jeweils 10 μl
auf einen Objektträger
mit Deckgläschen
gegeben.
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Beschreibung
der Erfindung
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Das nachfolgende Beispiel dient der
näheren
Erläuterung
der Erfindung, ohne diese jedoch auf die beispielhaft offenbarten
Stoffe und Verfahren zu beschränken.
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Beispiel: Herstellung des
künstlichen
autofluoreszenten Proteins
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Für
die Herstellung des künstlichen
autofluoreszenten Proteins nach dem oben beschriebenen Verfahren
wurden die Aminosäuresequenzen
der folgenden natürlich
vorkommenden Proteine, die als gemeinsame Funktion Autofluoreszenz
aufweisen, unter Festlegung einer Rangfolge zugrundegelegt:
Rangnummer 1:
Aequorea victoria GFP
Rangnummer 2: Zoanthus sp. zFP506
Rangnummer 3:
Zoanthus sp. zFP538
Rangnummer 4: Discosoma striata
dsFP483
Rangnummer 5: Discosoma sp. "red" dsFP583
Rangnummer 6:
Anemonia majano amFP486
Rangnummer 7: Clavularia sp.
cFP484
Rangnummer 8: Renilla mulleri GFP
Rangnummer 9:
Ptilosarcus gurneyi GFP
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Die Anordnung der Aminosäuresequenzen
erfolgte zunächst
in Form eines „alignments",
bei dem unter Einführung
von Lücken
eine Übereinstimmung
der Positionen von Invarianten Aminosäuren für alle Proteine erzielt wurde,
wobei die Aminosäuresequenzen
derart zueinander ausgerichtet wurden, dass unter Beibehaltung der
jeweiligen Reihenfolge der Aminosäuren die höchstmögliche Anzahl identischer Aminosäuren in Bezug
auf ihre jeweilige Position einander zugeordnet sind (vgl. Matz
et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17, 969–973). Die Aminosäuresequenzen
von Renilla mulleri GFP und Ptilosarcus gurneyi GFP wurden dann
hierzu ergänzend
unter Berücksichtigung
offensichtlich invarianter Aminosäuren angefügt (siehe 1a–e). Die sich aus dieser Anordnung
ergebende Folge der jeweils eindeutig häufigsten Aminosäuren wurde
an den übrigen
Positionen durch diejeinige der häufigsten Aminosäuren ergänzt, die
an dieser Position die höchste Rangnummer
besitzt. Die daraus resultierende Durchschnitts-Sequenz wurde daraufhin
sowohl am N-Terminus als auch am C- Terminus modifiziert. Zum Erreichen
einer optimalen Kozak-Region im Bereich des Start-Codons wurde nach
der Startaminosäure
Methionin die zusätzliche
Aminosäure
Valin eingeführt.
Am C-Terminus wurde die zusätzliche
hydrophile Aminosäure
Serin angefügt,
um die Löslichkeit
des Proteins nicht durch einen hydrophoben C-Terminus zu erschweren.
Für diese
Proteinsequenz (Seq ID No. 1) wurde nun eine kodierende DNA-Sequenz
(Seq ID No. 2) unter Berücksichtigung
der Codons entworfen, die in Säugetierzellen besonders
häufig
auftreten. Für
die Klonierung des gewünschten
FP-Gens (FP = Fluoreszierendes Protein) in das Expressionsplasmid
pExpA wurden 12 teilkomplementäre
DNA-Oligonukleotide (Seq ID Nos. 3–14) verwendet, aus denen in
zwei aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen
das gesamte FP-Gen amplifiziert wurde. Durch anschließenden Restriktionsverdau
mit den Restriktionsenzymen Xba I und Not I wurde ein DNA-Fragment erhalten,
das nach Ligation mit dem Xba I/Not I Fragment von pExpA das Expressionplasmid
pExpA-cFP ergab (siehe 2A). Dieses
führt nach
Transformation von Escherichia coli-Zellen (DH5) zu Ampicillin-resistenten
Bakterienkolonien, die im Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung
von Fluoreszenzfiltern, die Fluoreszenzmoleküle mit Licht im blauen Wellenlängenbereich
von 460 nm bis 505 nm anregen und emittiertes Licht im grünen Wellenlängenbereich
von 510 nm bis 560 nm passieren lassen (Filtersatz für Fluoreszein),
eine grüne
Fluoreszenz zeigen (siehe 5B), während bei
der entsprechenden Negativkontrolle keine Fluoreszenz detektiert
werden konnte (siehe 5A). Bereits
für das
unmittelbar aus dem Verfahren hervorgegangene Durchschnitts-FP (Seq
ID Nr. 1) konnte also Autofluoreszenz nachgewiesen werden, ohne
das hierzu eine anschließende
Mutagenese notwendig gewesen wäre.
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Zur Funktionsoptimierung durch Mutagenese
des so erhaltenen autofluoreszenten Gens wurden mehrere Strategien
angewendet. Zunächst
wurden ausgehend von pExpA-cFP mittels PCR Mutationen in das FP-Gen
eingeführt.
Dies geschah unter Verwendung von Primern, die so gewählt waren,
dass sie mit pExPA-cFP in Bereichen außerhalb der kodierenden Sequenz
hybridisierten, jedoch so, dass die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme
Xba I und Not I noch enthalten waren. Dies ermöglichte eine Zufallsmutagenese über den
gesamten kodierenden Bereich. Die PCR wurde in Gegenwart von Mn2+-Ionen durchgeführt, was zu einer erwünschten
Erhöhung
der Fehlerrate der verwendeten Taq-DNA Polymerase führt. Die
so erhaltenen PCR-Produkte wurden mit Xba I und Not I verdaut und
anschließend
mit dem passenden Fragment von pExpA ligiert und in Escherichia
coli Zellen (DH5) transformiert. Von den Ampicillin-resistenten
Kolonien wurden die bei Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop deutlich
helleren ausgewählt.
Die Erhöhung
der Fluoreszenzintensität
wurde durch nochmalige Transformation in Escherichia coli-Zellen
verifiziert, die Plasmid-DNA präpariert
und die Sequenz des FP-Gens ermittelt.
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In einer weiteren Mutagenese wurden
die verbesserten pExpA-cFP Plasmide kombiniert und abermals in Gegenwart
von Mn2+-Ionen amplifiziert. Diesmal wurden
die restriktionsverdauten PCR-Produkte jedoch mit dem Xba I und
Not I geschnittenen p2A9-Fragment ligiert, um Plasmide zu erhalten,
die sich für
die Expression sowohl in Escherichia coli Zellen, als auch in Säugetierzellen
eignen.
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Alternativ wurden PCR-Reaktionen
durchgeführt,
um speziell die N- und C-terminalen
Bereiche zu verändern.
Der 5'-Primen hybridisierte mit dem FP-Gen und enthielt anstelle
der ersten 6 Codons an 18 Positionen eine Mischung aller 4 Basen,
ebenso der 3'-Primen anstelle der letzten 6 Codons, sodass im translatierten
Protein am N- und C-Terminus eine Zufallsfolge von 6 beliebigen
Aminosäuren
entstand. Diese PCR-Produkte wurden ebenfalls mit Xba I und Not
I verdaut und mit dem entsprechenden Fragment von p2A9 ligiert.
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In einem dritten Ansatz wurden ausgewählte Codons
durch PCR mit teilhomologen Primern gezielt mutiert, um einzelne
Aminosäurecodons
auszutauschen. Auch hier wurden die erhaltenen PCR-Produkte mit Xba
I und Not I verdaut und mit dem entsprechenden p2A9-Fragment ligiert.
Aus allen drei Ansätzen
wurden nach der Ligation und anschließender Transformation von Escherichia
coli Zellen (DH5) 48 Kolonien ausgewählt, die eine hohe Helligkeit
in der Fluoreszenz aufwiesen, und die Plasmid-DNA präpariert.
Diese wurde daraufhin in einem Folgexperiment in NIH3T3-Zellen transformiert,
um diejenigen Klone für
eine Sequenzierung auszuwählen,
die bei Transfektion dieser Zellen zu einer höheren Fluoreszenz führen.
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Klonierung der Expressionsplasmide
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Für
die Expression der oben genannten Proteine in geeigneten Escherichia
coli-Zellen wurden
Plasmide konstruiert, die eine kodierende Sequenz für FP (FP
= Fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle des Iac-Promoters
enthalten (pExpAcFP, siehe 2A). Die
Plasmide wurden durch Modifikation von pMCS5 (MoBiTec, Göttingen,
Deutschland) hergestellt. pMCS5 ist ähnlich aufgebaut wie pBluescript
SK(–)(Stratagene) und
unterscheidet sich von diesem nur im 5'-Bereich der kodierenden Sequenz für das IacZα-Fragment. pMCS5
besitzt daher den Iac-Promoter und nachgeschaltet den Iac-Operator,
wodurch die Expression einer eingefügten kodierenden Sequenz von
der Abwesenheit von aktivem Iac-Repressor
abhängt.
Um in jedem Fall in Escherichia coli-Zellen eine konstitutive Expression
zu erreichen, wurde pMCS5 so modifiziert, dass der Iac-Operator
nicht mehr enthalten ist. An dessen Stelle wurde das frühe mRNA
Polyadenylierungssignal aus SV40 eingesetzt, um ein Umkonstruieren
dieses Expressionsplasmides für
Escherichia coIi in ein Expressionsplasmid für Säugetierzellen vorzubereiten
(p2A9-cFP, siehe 2B). Dieses geschah
durch zusätzliches
Einfügen
von regulatorischen Promotersequenzen, die eine Expression des nachgeschalteten
Gens in Säugetierzellen
hervorrufen. Als besonders wirksam erwies sich eine Kombination
aus dem vollständigen „unmittelbar-frühen" Promoter
des Cytomegalovirus (CMV), gefolgt von einem 100 Basenpaaren langen
Fragment des Iac-Promoters aus Escherichia coli sowie dem 180 Basenpaar
langen 3'-Ende des „unmittelbar-frühen" CMV-Promoters.
Diese Fragmente wurden jeweils per PCR mit Primern hergestellt,
die zusätzlich
zu den homologen Bereichen Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme enthielten.
Für das
Einfügen
der künstlichen
FP Gene wurden zwischen dem kombinierten Promoter und der Polyadenylierungssequenz
Erkennungsstellen für
die Restriktionsenzyme Xba I und Not I eingefügt.
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Versuchsbeschreibung: Die
Expression von FP in Säugetierzellen
führt zu
Autofluoreszenz der Zellen:
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NIH3T3-Zellen (adhärent, 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung in 12-Loch Schale,
bis zur 70–80
%igen Konfluenz kultiviert) wurden mit 1 μg Vektor-DNA mit Exgene (MBI
Fermentas) transfiziert. Die Plasmide p2A9-c15m2 (Seq ID No. 15),
p2A9-c15m3 (Seq
ID No. 17), p2A9-c15m12 (Seq ID No. 19) und p2A9-c15m48 (Seq ID
No. 21) enthielten verschieden mutierte Gene, c15m2 (Seq ID No.
16), c15m3 (Seq ID No. 18), c15m12 (Seq ID No. 20) und c15m48 (Seq
ID No. 22), für
das FP (FP = Fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle eines
kombinierten Promoters, der zur konstitutiven Expression des nachgeschalteten
Gens in Escherichia coli Zellen und Säugetierzellen führt. Nach
9 (siehe 3A) bzw. 24 Stunden (siehe 3B) wurden die Zellen im Fluoreszenzmikroskop
analysiert. Unter Verwendung von Fluoreszenzfiltern, die Fluoreszenzmoleküle mit Licht
im blauen Wellenlängenbereich
von 460 nm bis 505 nm anregen und emittiertes Licht im grünen Wellenlängenbereich
von 510 nm bis 560 nm passieren lassen (Filtersatz für Fluoreszein),
konnten bei allen Zellen, die mit FP oder mutierten FP enthaltenden
Plasmiden transfiziert waren, eine grüne Fluoreszenz beobachtet werden.
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Versuchsbeschreibung: Die
Autofluoreszenz von FP bleicht aus und läßt sich durch Bestrahlung mit
ultraviolettem Licht regenerieren:
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NIH3T3-Zellen (adhärent, 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung in 12-Loch Schale,
bis zur 70–80
%igen Konfluenz kultiviert) wurden mit 1 μg Vektor-DNA mit Exgene (MBI
Fermentas) transfiziert. Das Plasmid p2A9-c15m3 enthielt ein mutiertes
Gen c15m3 für
FP (FP = Fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle eines kombinierten
Promoters, der zur konstitutiven Expression des nachgeschalteten Gens
in Escherichia coli-Zellen und Säugetierzellen
führt.
Nach 6 Stunden wurden die Zellen im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Unter
Verwendung von Fluoreszenz-Anregungsfiltern, die Fluoreszenzmoleküle mit Licht
im blauen Wellenlängenbereich
von 460 nm bis 505 nm anregen und emittiertes Licht im grünen Wellenlängenbereich
von 510 nm bis 560 nm passieren lassen (Filtersatz für Fluoreszein),
konnten bei Zellen, die mit diesem mutierten FP enthaltenden Plasmid
transfiziert waren, eine grüne
Fluoreszenz beobachtet werden (siehe 4A).
Diese Fluoreszenz schwächte
sich während
der Betrachtung innerhalb weniger Sekunden bis zum fast völligen Verschwinden
ab (siehe 4B). Nach Bestrahlung des
Sichtfeldes mit kurzwelligem Licht im sichtbaren blauen bis ultravioletten
Bereich (320 nm bis 400 nm, DAPI-Anregungsfilter) läßt sich
die Fluoreszenz mit dem Fluoreszein-Filtersatz wieder beobachten
(siehe 4C), d.h sie konnte mit dem
kürzerwelligen
Licht regeneriert werden. Dieses mutierte FP kann also beispielsweise
zum Nachweis von zeitabhängigen
zellulären
Prozessen, wie Proteindiffusion oder -transport, oder zur optischen
Informationsspeicherung verwendet werden.
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Vergleich der Aminosäureseguenzen
des Durchschnitts-FP und dessen Mutanten mit den bekannten fluoreszierenden
Proteinen:
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Tabelle 1 zeigt die Unterschiede
in der Aminosäure-Sequenz
zwischen den einzelnen modifizierten Proteinen cFP2, cFP3, cFP12
und cFP48, die durch die mutierten Gene c15m2 (Seq ID No. 16), c15m3
(Seq ID No. 18), c15m12 (Seq ID No. 20) und c15m48 (Seq ID No. 22)
kodiert werden, im Vergleich mit dem Durchschnitts-FP (D-FP). Die
Nummerierung der Aminosäure-Positionen
ist dabei derjenigen der Durchschnitts-Sequenz gemäß 1 entnommen. Hieraus ergeben sich Abweichungen
der einzelnen Proteine in Bezug auf das Durchschnitts-FP zwischen
6 % und 8 %, d.h. relative Ähnlichkeiten
zwischen 92 % und 94 % (Tabelle 2). Dagegen zeigt Tabelle 2, dass
die Unterschiede der neuen erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine
zu den bekannten Proteinen, die Ausgangspunkt für die Ermittlung der Durchschnitts-Sequenz
waren, relativ hoch sind. Es ergeben sich hier lediglich Sequenz-Homologien zwischen
32 % und 69 %. Es konnte also eine völlig neue Gruppe von Aminosäure-Sequenzen
bzw. Proteinen bereitgestellt werden, die deutliche Autofluoreszenz
zeigen und vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten bieten. Darüber hinaus
konnte eine zusätzliche Funktion
bzw. vorteilhafte Eigenschaft in den erfindungsgemäßen Proteinen
erzeugt werden.
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Liste der verwendeten Abkürzungen:
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Außer den im Duden gebräuchlichen,
wurden folgende Abkürzungen
verwendet:
CMV Cytomegalovirus
C-Terminus C-terminales
Ende einer Aminosäuresequenz
DNA
Desoxyribonukleinsäure
FACS
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
(fluorescence activated
cell sorting)
FP fluoreszierendes Protein
GFP grün-fluoreszierendes
Protein (green fluorescent protein)
nm Nanometer (Einheit der
Wellenlänge)
N-Terminus
N-terminales Ende einer Aminosäuresequenz
PCR
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
Seq ID
Nr. Sequenz-Identifikationsnummer (gemäß Sequenzprotokoll)
SV40
Simian Virus 40
μg
Mikrogramm
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-
Tabelle
2: Relative Ähnlichkeiten
der fluoreszierenden Proteine in Prozent bezogen auf die jeweiligen
Aminosäuresequenzen.
(D-FP (Seq ID Nr. 1) = Durchschnitts-FP; cFP2 (Seq ID Nr. 15), cFP3
(Seq ID Nr. 17), cFP12 (Seq ID Nr. 19) und cFP48 (Seq ID Nr. 21)
= Mutierte D-FP-Klone)
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