DE3786947T2

DE3786947T2 - Mikrobiologisches Verfahren zur Gewinnung eines Proteins durch Züchtung eines mutanten Bakterienstammes.

Info

Publication number: DE3786947T2
Application number: DE87400813T
Authority: DE
Inventors: Richard Legoux; Pascal Leplatois; Joseph Evelyne Liauzun; Brigitte Niaudet; Willem Roskam
Original assignee: Elf Sanofi SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1986-04-10
Filing date: 1987-04-10
Publication date: 1994-02-24
Anticipated expiration: 2007-04-11
Also published as: JPH09224685A; DE3786947D1; EP0245138A1; FR2597114B1; JP2528872B2; CA1304021C; US4945047A; JP2708403B2; JPH08228789A; FR2597114A1; ES2059401T3; JP2661894B2; JPS637793A; EP0245138B1; JPH09224684A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung eines Proteins durch Kultivierung von gramnegativen Bakterien, die eine Mutation spezieller Art aufweisen und in die eine für den Präkursor dieses Proteins kodierende DNS-Sequenz eingeführt wurde.
Die Erfindung findet Anwendung auf zahlreichen technischen Gebieten und insbesondere bei der Herstellung von Medikamenten, deren Wirkstoff ein Protein ist.
Es ist bekannt, daß zahlreiche Proteine ihre biologische Aktivität erst erlangen, nachdem sie einer posttranslationellen Reifung unterzogen worden sind. Da es sich um im Zellplasma in Form eines Präkursors biosynthetisierte und dann außerhalb des Zellplasmas gebrachte Proteine handelt, ist die erste Stufe dieser Reifung häufig die Entfernung einer N-terminalen Sequenz, genannt Signal-Peptid, dieses Präkursors auf enzymatischem Weg. Solche in Form eines Präkursors biosynthetisierte Proteine sind sowohl bei prokaryotischen Organismen als auch bei eukaryotischen Organismen bekannt. Als Beispiele für solche Proteine kann man insbesondere die beta- Lactamase TEM-1, die alkalische Phosphatase, das eine oder andere Produkt aus z. B. der Art Eschericia coli, das von der Art Staphylococcus aureus erzeugte Protein A, die z. B. durch die Art Bacillus amyloliquefaciens produzierte alpha-Amylase, Proteine prokaryotischen Ursprungs sowie das menschliche Wachstumshormon, menschliches Insulin, den Gewebeaktivator von Plasminogen und den epidermalen Wachstumsfaktor sowie durch eukaryotische Zellen produzierte Proteine nennen.
Es ist auch bekannt, daß man gramnegative Bakterien, die zuvor mit einem Plasmid, welches eine für den natürlichen Präkursor eines Proteins codierende DNS-Sequenz aufweist, transformiert worden sind, zur Gewinnung dieses Proteins verwenden kann (Gray G.L. et al., Biotechnology 2 (1984) 161- 165; Gray G.L. et al., Gene 39 (1985) 247-254). Desgleichen garantiert das zytoplasmatische Kompartiment die Transkription der DNS-Sequenz und dann die Translation des entsprechenden RNS-Messenger; der so biosynthetisierte Präkursor erfährt danach während oder nach Durchbrechen der zytoplasmatischen Membran eine enzymatische Spaltung oder einen enzymatischen Abbau unter Entfernung seines Signal-Peptids; das Protein, das so dem von seinem Signal-Peptid befreiten Präkursor entspricht, sammelt sich im periplasmatischen Raum des Bakteriums, aus dem es gewonnen werden kann.
Analoge Resultate wurden auch erzielt, wenn die DNS- Sequenz für einen anderen als den natürlichen Präkursor codiert (d. h. so, daß er in den Zellen synthetisiert wird, die üblicherweise seine Produktion gewährleisten), was das Signal- Peptid betrifft; beispielsweise wurde ein einem Protein eucaryotischen Ursprungs entsprechender Präkursor, kombiniert mit dem Peptidsignal eines Proteins bakteriellen Ursprungs, synthetisiert (Talmadge K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980) 3988-3992; Gray G.L. et al., Gene 39 (1985) 247-254).
Es ist auch bekannt, daß Bakterien Mutationen aufweisen können, die die Expression von Operons begrenzen bzw. unterdrücken, indem die Transkription erst nach einer Fixierung des aus der Kombination von cyclischer 3',5'-Adenosinphosphorsäure (oder cAMP) mit dem Protein CRP (für Cyclic AMP Receptor Protein), auch CAP-Protein (für Catabolite Activator Protein) genannt, resultierenden AMPc-CRP-Komplexes im Bereich der Regulationselemente dieser Operons initiiert werden kann. Eine Funktionsbeschreibung solcher Operons ist im Kapitel "The Lac Promoter - Reznikoff W.S. und Abelson J.N. des Werks "The Operon - Miller J.H. und Reznikoff W.S., Cold Spring Harbor Laboratory - 1980" enthalten.
Es ist klar, daß solche Bakterien, deren Biosynthesevermögen reduziert ist (denn die hier inhibierten Operons steuern die Synthese von zahlreichen Enzymen), nicht von vornherein Wirte nach Wahl für die industrielle Produktion eines Proteins darstellen können.
Die von Gray G.L. et al. 1984 und 1985 veröffentlichten Arbeiten (siehe oben) zeigen, daß die bis heute unternommenen Forschungsarbeiten zur Gewinnung eines Proteins durch Kultivierung von Bakterien, in die eine für einen Präkursor dieses Proteins codierende DNS-Sequenz eingeführt worden ist, auf die Konstruktion von Plasmiden, die durch eine spezielle Auswahl von Regulationselementen (insbesondere Promotoren) wirksamer gemacht wurden, hinausliefen.
Die Anmelderin wählte genau einen anderen Forschungsweg und lenkte ihr Hauptaugenmerk auf das Bakterium als Wirt. Und so hat sie auf überraschende Weise gefunden, daß gramnegative Bakterien, deren Chromosom mindestens eine Mutation aufweist, die die Expression von Operons, deren Transkription von der Fixierung des Komplexes cAMP-CRP abhängt, beschränken bzw. unterdrücken, Wirtsorganismen der Wahl für die industrielle Produkten von biosynthetisierten Proteinen in Form eines Präkursors darstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit gemäß einem ersten Aspekt ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung eines Proteins durch Kultivierung von gramnegativen Bakterien, in die eine für einen Präkursor dieses Proteins codierende DNS- Sequenz eingeführt wurde, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Bakterienstamm eingesetzt wird, dessen Chromosom mindestens eine Mutation aufweist, die die Expression der Operons, bei denen die Transkription von der Fixierung des cAMP-CRP-Komplexes abhängt, begrenzt bzw. unterdrückt.
Die betreffenden Mutationen sind jene, die dazu neigen, die intrazelluläre Konzentration von cAMP zu verringern, jene, die die Synthese des Proteins CRP in funktioneller Form begrenzen oder unterdrücken, jene, die zur Synthese des Proteins CRP in mutierter Form führen und durch die es zur Bildung von solchen cAMP-CRP-Komplexen kommt, daß ihre Fixierung an der DNS verhindert oder kaum wirksam gemacht wird, sowie jene, die die Fixierungsstelle des cAMP-CRP-Komplexes an der DNS derart modifizieren, daß die Fixierung des Komplexes verhindert oder kaum wirksam gemacht wird. Es kann sich um konditionelle Mutationen handeln, deren Expression von einem Parameter, wie z. B. der Temperatur, abhängt.
Von diesen Mutationen sind jene, die das chromosomale Gen cya selbst oder eine seine Expression regulierende DNS derart beeinträchtigen, daß die Adenylatcyclase, für die dieses Gen codiert, nicht synthetisiert oder in einer Form synthetisiert wird, daß es unfähig ist, seine spezifische Aktivität - nämlich die Transformation von Adenosintriphosphat (oder ATP) in cAMP - auszuüben, gut charakterisiert. Dasselbe gilt für die Mutationen, die das chromosomale Gen crp selbst oder eine seine Expression regulierende DNS-Sequenz derart beeinflussen, daß das Protein CRP, für das dieses Gen codiert, nicht synthetisiert oder in einer mutierten vorm synthetisiert wird, so daß es keine Bildung von ausreichend stabilen cAMP-CRP- Komplexen geben kann, um ihre wirksame Fixierung an der DNS zu ermöglichen. Diese Mutationen sind der Einfachheit halber nachstehend als -Mutation und crp-Mutation bezeichnet.
Die cya- und crp-Mutationen können beliebig sein: es kann sich insbesondere um eine Mutation durch Substitution, eine Mutation durch Insertion, eine Mutation durch Inversion oder auch z. B. eine Mutation durch Deletion handeln. Die Mutation kann nur ein einziges Paar von Nucleotiden betreffen, da aber eine solche Punktmutation reversibel ist, wird eine Mutation, die, da sie gleichzeitig mehrere Paare von Nucleotiden betrifft, irreversibel ist, bevorzugt. Es kann sich auch noch um multiple Punktmutationen handeln. Im Fall einer cya-Mutation wird cAMP nicht synthetisiert, und es kann keine Bildung des cAMP-CRP-Komplexes geben; durch die Zugabe von exogenem cAMP läßt sich dieser Synthesefehler abschwächen und werden die gestörten Zellfunktionen wiederhergestellt. Im Fall einer crp- Mutation wird das CRP-Protein nicht mehr in funktioneller Form synthetisiert, und es kann daher wieder keine Bildung des cAMP- CRP-Komplexes stattfinden; die Zugabe von exogenem cAMP ist hier nicht imstande, die gestörten Zellfunktionen wiederherzustellen.
Die Erfindung betrifft vorteilhafterweise das oben definierte mikrobiologische Verfahren, bei dem ein Bakterienstamm eingesetzt wird, dessen Chromosom mindestens eine Mutation aufweist, die die durch das Gen cya und die dessen Expression regulierenden DSN-Sequenzen gebildete Einheit, die durch das Gen crp und die dessen Expression regulierenden DNS- Sequenzen gebildete Einheit oder auch noch die eine oder andere dieser Einheiten beeinträchtigt.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Bakterienstämme können jeder gramnegativen Art angehören, bei der an das Protein CRP gekoppeltes cAMP eine Kontrolle der Expression verschiedener Operons ausübt. Die Zuhilfenahme solcher Bakterienstämme für die industrielle Produktion ist umso interessanter, als sie eine bemerkenswerte Resistenz gegen die Wirkung zahlreicher Bakteriophagen aufweisen (Sushil Kumar, J. Bact., 125 (1976) 545-555). Die Art Escherichia coli ist eine Art der Wahl.
Die Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt das mikrobiologische Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der eingesetzte mutante Bakterienstamm ein Stamm der Art Escherichia coli ist.
Die Anmelderin hat insbesondere zwei mutante Stämme von Escherichia coli selektioniert, die am 17. Februar 1986 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Paris, Frankreich) hinterlegt wurden. Einer dieser Stämme weist eine crp-Punktmutation auf (Depot Nr. I-528); der andere Stamm weist keine Punktmutation, sondern eine cya-Mutation durch Deletion (Depot Nr. I-529) auf.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise das mikrobiologische Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der mutante Stamm die Merkmale des einen oder des anderen der bei der CNCM unter den Nummern I-528 und I-529 hinterlegten Stämme aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Schaffung von zahlreichen Proteinen. Es ist zu verstehen, daß es von geringer Bedeutung ist, ob das Protein, das man herzustellen wünscht, in Form eines Präkursors auf natürliche Weise biosynthetisiert wird oder nicht. Das Verfahren kann auch zur Schaffung eines nicht natürlichen Proteins geeignet sein; es kann sich beispielsweise um ein Hybridprotein handeln, dessen Primärstruktur aus zwei oder mehreren bekannten Proteinen gewählt wurde. Es genügt in sämtlichen Fällen, eine für dieses Protein codierende DNS-Sequenz herzustellen, welches im Bereich seines N-terminalen Endes mit einem die Rolle eines Signal- Peptids spielenden Peptid gekoppelt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Gewinnung des menschlichen Wachstumshormons (im folgenden Text mit dem Symbol hGH bezeichnet) von Vorteil.
Fig. 1 stellt die Sequenz der für einen der natürlichen Präkursoren des hGH, wie er aus den Hypophysezellen, wo er synthetisiert wird, isoliert wird, codierenden DNS sowie die Sequenz der Aminosäuren dieses Präkursors dar: die ersten 26 Aminosäuren (gezählt in der Figur ab der Aminosäure in der 26- Position) bilden das Signal-Peptid, und die anderen 191 Aminosäuren (hier mit 1 bis 191 numeriert) sind die des eigentlichen hGH (im folgenden Text und in den Beispielen als "reifes hGH" bezeichnet).
Die nachstehende Tabelle 1 ist zum besseren Verständnis der Fig. 1 angeführt, in welcher jede Aminosäure mit einem einzigen Buchstaben bezeichnet ist.

Tabelle 1

Aminosäuren Buchstabe
Alanin A
Arginin R
Asparagin N
Asparaginsäure D
Cystein C
Glutamin Q
Glutaminsäure E
Glycin G
Histidin H
Isoleucin I
Leucin L
Lysin K
Methionin M
Phenylalanin F
Prolin P
Serin S
Threonin T
Tryptophan W
Tyrosin Y
Valin V
In den Codons der in Fig. 1 angeführten DNS-Sequenz haben die Buchstaben A, C, T und G die übliche Bedeutung und bezeichnen die Basen Adenin, Cytosin, Thymin bzw. Guanin.
Zur Durchführung der Erfindung ist es erforderlich, daß die mutanten Bakterien eine für den Präkursor des betreffenden Proteins codierende DNS-Sequenz aufweisen. Unter Präkursor wird hier der natürliche Präkursor des Proteins verstanden, wenn es ihn gibt, jedes durch Modifikation an seinem Signal-Peptid erhaltene Derivat desselben sowie jeder Präkursor, der an dieses Protein ein Peptid bindet, welches die Aufgabe eines Signal-Peptids übernehmen kann und insbesondere aus den bekannten Procaryoten- und Eucaryoten-Signal-Peptiden oder aus Derivaten derselben ausgewählt sein kann.
Die für den Präkursor des Proteins codierende DNS-Sequenz kann in das Bakterium eingeführt werden, das von einem replizierbaren Expressionsvektor, wie einem Plasmid, getragen wird. Es ist klar, daß die zur Expression der Sequenz notwendigen Regulationselemente (insbesondere Promotoren) in deren Nähe angeordnet werden müssen, so daß sie ihre Rolle übernehmen können.
Die verwendbaren Plasmide sind beispielsweise die zum Stand der Technik beschriebenen (Gray G.L. et al, Gene 39 (1985) 247-254), mit der Maßgabe, daß sie in dem zum Einsatz gelangenden Bakterienstamm replizierbar sind. Es wurde bestätigt, daß es bei der Auswahl dieser Plasmide nicht notwendig ist, daß in dem verwendeten Konstrukt die für den Präkursor des Proteins von Interesse codierende DNS-Sequenz induzierbar ist. Es ist auch wichtig, daß die Sequenz in mehreren Exemplaren vorhanden ist.
Die Anmelderin hat mehrere Plasmide konstruiert und selektioniert, die nach der Replikation in den Bakterienzellen in einer Menge von 50 bis 300 Kopien pro Zelle vorhanden sein können, wobei jede Kopie ein Exemplar der für den Präkursor des Proteins codierenden DNS-Sequenz aufweist; am 17. Februar 1986 hat sie den mit einem dieser Plasmide transformierten Stamm E. coli MC 1061 bei der CNCM hinterlegt; dieser Stamm hat die Depot-Nummer I-530. Der Einfachheit halber wird in der folgenden Beschreibung auf das bei der CNCM unter der Nummer I- 530 hinterlegte Plasmid verwiesen. Dieses Plasmid, das nachstehend auch mit seiner internen Referenz p163,1 bezeichnet ist, weist eine für einen natürlichen Präkursor des hGH codierende DNS-Sequenz auf. Diese Sequenz, die in Fig. 1 dargestellt ist, ist identisch mit jener, die aus einem der in den Zellen der menschlichen Hypophyse synthetisierten Präkursoren bestimmt wird; sie wurde unter die Kontrolle eines Promotor-Operator-Hybrids gebracht, das 1) ein Fragment des aus seinem 5'-Ende kommenden und seine RNS-Polymerase- Erkennungsstelle (welche Stelle um sein in der 35-Position befindliches Nukleotid zentriert ist, wie von Takanami M. et al. - Nature, 260 (1976) 297-302 definiert) enthaltenden Tryptophanpromotors und 2) den Lactose UV5-Promotor-Operator, dessen zwischen seinem 5'-Ende und der die Erkennungsstelle (welche Stelle um sein in der 35-Position befindliches Nukleotid zentriert ist) und seine Bindungsstelle (welche Stelle um sein in der 10-Position befindliches Nukleotid zentriert ist, wie von Pribnow D. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 784-789 definiert) von der RNS-Polymerase trennenden Zone befindlicher Teil entfernt worden ist, koppelt.
Fig. 2 zeigt für das Plasmid eine Funktionskarte, die den Standort und die Ausrichtung der DNS-Hauptsequenzen zeigt, welche wie folgt symbolisch vermerkt sind:
Replikationsursprung (ORI)
Vom Plasmid pBR322 stammendes DNS- Segment
DNS-Segment, enthaltend die für den natürlichen Präkursor von hGH codierende Sequenz
DNS-Segment das fd-Phagen, enthaltend einen Transkriptionsterminator
DNS-Segment, enthaltend das Promotor-Operator-Hybrid Tryptophan-Lactose UV5
Für β-Lactamase codierendes DNS- Segment (ApR: Ampicillin- Resistenz).
Aus dieser Karte sind auch die Schnittstellen bestimmter Restriktionsenzyme, nämlich der Enzyme SalI, BamHI, Hind III, PstI, EcoRI, XhoI und PvuI, ersichtlich.
Die Anwesenheit der Mutation UV5 (beschrieben im Kapitel "The Lac Promoter, Reznikoff W.S. und Abelson J.N." des Werks "The Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980") im Plasmid p163,1 macht die Expression der für den Präkursor des hGH codierenden DNS-Sequenz unempfindlich gegenüber der kombinierten Wirkung von cAMP und dem Protein CRP. Es ist klar, daß, ausgehend von diesem Plasmid, weitere Plasmide konstruiert werden können, die dessen allgemeine Merkmale übernehmen, u.zw. durch Substitution der für einen der natürlichen Präkursoren des hGH codierenden DNS-Sequenz durch eine für einen anderen Präkursor, insbesondere einen Präkursor eines anderen Proteins, codierende Sequenz.
Die Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt das mikrobiologische Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für den Präkursor des betreffenden Proteins codierende DNS-Sequenz, zusammen mit seine Expression gestattenden Regulationselementen, in einem Plasmid enthalten ist; sie betrifft insbesondere das mikrobiologische Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die DNS-Sequenz in einem Plasmid enthalten ist, das die allgemeinen Charakteristika des unter der Nr. I-530 bei der CNCM hinterlegten Plasmids aufweist.
Die Erfindung betrifft gemäß einem weiteren Aspekt das mikrobiologische Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Bakterienstamm eine für den Präkursor des hGH codierende DNS-Sequenz enthält.
Die Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt die unter den Nummern I-528 und I-529 bei der CNCM hinterlegten Bakterienstämme.
Die Erfindung betrifft gemäß einem noch anderen Aspekt das unter der Nummer I-530 bei der CNCM hinterlegte Plasmid.
Die Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen veranschaulicht. Sie ist selbstverständlich nicht auf die hier im besonderen angeführten Beispiele beschränkt, sondern umfaßt vielmehr sämtliche Varianten im Rahmen der Patentansprüche.

Beispiele

I. Verwendete Bakterien und Plasmide

Es wurden vier Bakterienstämme und vier Plasmide verwendet. Neben den unter den Nummern I-528 und I-529 bei der CNCM hinterlegten Stämmen sind zwei weitere Escherichia coli-Stämme in den Beispielen genannt. - Ein Stamm, der gleichzeitig eine (nicht punktförmige) cya-Mutation durch Deletion und eine (nicht punktförmige) crp- Mutation durch Deletion aufweist und nachstehend mit der internen Referenz A bezeichnet ist; der Stamm CNCM I-529 ist von diesem Stamm abgeleitet. - Ein Stamm, der keine Mutation aufweist, die die Expression von Operons, deren Transkription erst nach der Kopplung des Komplexes cAMP-CRP eingeleitet werden kann, begrenzen oder unterdrücken kann, bekannt unter der Bezeichnung MC 1061 (E. coli Genetic Stock Center - New Haven - Connecticut, USA); dieser Stamm ist nachstehend mit der internen Referenz T bezeichnet. Der Stamm CNCM I-528 ist von diesem Stamm abgeleitet.
Neben dem bei CNCM unter der Nr. I-530 hinterlegten Plasmid sind drei weitere Plasmide in den Beispielen zitiert: es handelt sich um die mit den internen Referenzen p164,1, p200,3 und p212,6 bezeichneten Plasmide.
Das Plasmid p164,1 ist nahe verwandt mit dem Plasmid p163,1; es unterscheidet sich von diesem im wesentlichen durch das Fehlen der Mutation UV5.
Das Plasmid p212,6 kommt dem Plasmid p163,1 nahe. Fig. 3 zeigt von diesem eine Funktionskarte, die die Lokalisierung und Orientierung der DNS-Hauptsequenzen wiedergibt, welche wie folgt symbolisch dargestellt sind:
Replikationsursprung (ORI)
Vom Plasmid pBR327 stammendes DNS- Segment
DNS-Segment, enthaltend die für den natürlichen Präkursor des hGH codierende Sequenz
DNS-Segment des fd-Phagen, enthaltend einen Transkriptionsterminator
DNS-Segment, enthaltend das Gen Lac i und seinen Promotor
DNS-Segment, enthaltend das Promotor-Operator-Hybrid Tryptophan- Lactose UV5
Für β-Lactamase codierendes DNS- Segment (ApR = Ampicillin- Resistenz).
Wie für das in Fig. 2 dargestellte Plasmid p163,1 sind die Schnittstellen bestimmter Restriktionsenzyme in Fig. 3 aufgezeigt.
Das Plasmid p200,3 ist ein dem Plasmid p212,6 äquivalentes Plasmid, wobei das Plasmid p212,6 wegen seines nicht reprimierbaren Charakters für die Expression der für den Präkursor von hGH codierenden DNS-Sequenz ausgewählt wurde.
Die für einen der natürlichen Präkursoren des hGH codierende DNS-Sequenz, die in den Plasmiden p212,6 und p200,3 enthalten ist, unterscheidet sich von der in Fig. 1 dargestellten Sequenz durch zwei Substitutionen: das Codon ACC kam anstelle des Codons ACA, codierend für die Aminosäure in der Position 24 und desgleichen wurde das Codon TCT substituiert durch das Codon TCC, codierend für die Aminosäure in der Position 22.

II. Allgemeine Methodik

Die durchgeführten Versuche bestanden darin, die betreffenden Wirt-Vektor-Paare zu kultivieren, die zuvor unter derartigen Bedingungen hergestellt worden waren (siehe 2.1), daß der Wirt in der Lage war, die für den Präkursor des hGH codierende DNS-Sequenz zu exprimieren (s. 2.2), wobei die Expression notwendigenfalls induziert wurde (s. 2.3), die im periplasmatischen Raum enthaltenen Proteine zu sammeln und das periplasmatische hGH mengenmäßig zu bestimmen (s. 2.5).

2.1. Herstellung der Wirt-Vektor-Paare

Die Wirt-Vektor-Paare wurden hergestellt nach den dem Fachmann bekannten Bakterientransformationsmethoden, die insbesondere in den nachstehenden Werken beschrieben sind: - Molecular Cloning - A Laboratory Manual - T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook - Cold Spring Harbor Laboratory 1982. - Experiments in Molecular Genetics - J.H. Miller - Cold Spring Harbor Laboratory - 1972.

2.2. Kultivierung

a) Beimpfung

Eine auf festem Medium (LB-Medium + Agar-Agar) erhaltene isolierte Kolonie wird in 5 ml Medium (LB-Medium) mit den nachstehenden Charakteristika, versetzt mit Ampicillin in einer Menge von 100 ug/ml in Suspension gebracht: - Basisbestandteile, eingebracht vor Autoklavieren Kasein- Pankreashydrolysat (Bactotrypton von DIFCO) 10 g
Hefeextrakt 5g
Natriumchlorid 5g
Destilliertes Wasser qsp 1 l - pH eingestellt auf 7,3 vor Autoklavieren

b) Primärinkubation

18 h bei 37ºC, bis die Kultur die stationäre Wachstumsphase erreicht.

c) Verdünnung

Die Bakteriensuspension wird in LB-Medium derart verdünnt, daß man einen Wert von etwa 0,05 für die optische Dichte erhält, abgelesen bei 600 nm - OD 600 nm - (Spektrofotometer Spectronic 20 - Bausch-Lomb).

d) Sekundärinkubation

50 ml der nach 2.2.c erhaltenen Bakteriensuspension werden bei 37ºC inkubiert, bis ein OD 600 nm von etwa 0,2 erreicht wird.

2.3. Induktion

Zu der nach 2.2.d erhaltenen Bakteriensuspension gibt man Isopropyl-β-D-thiogalactose (oder IPTG) in einer Menge, daß die Endkonzentration 1 mM beträgt; IPTG wird hier verwendet, um die Auslösung und Aufrechthaltung der Synthese des Präkursors von hGH unter Neutralisierung der Wirkung des sich normalerweise an den Lactoseoperator bindenden Repressors zu bewirken.

2.4. Osmoseschock

(Es wird auf das von N.G. Nossal und L.A. Heppel in "The Journal of Biological Chemistry" 241 (1966) 3055-3062 beschriebene Protokoll verwiesen).

a) Herstellung der Bakteriensuspension

Eine Probe der Suspension, wie sie in 2.2.d erhalten wurde (Fall, in dem eine Induktion nicht erforderlich ist) oder wie sie nach einer bestimmten Induktionszeit erhalten wurde, wird genommen und so behandelt (5 min Zentrifugieren mit 6000 g, Entfernen des Überstandes und Wiedereinbringen der Bakterien in Suspension in LB-Medium), daß sie eine OD bei 600 nm von etwa 10 aufweist.

b) Waschen

Die in 2.4.a erhaltene Suspension wird 5 min mit 6000 g zentrifugiert.
Das Bakterienpellet wird mit konstantem Volumen in einer Lösung A folgender Zusammensetzung aufgenommen:
Puffer pH 7, hergestellt durch Zugabe zu destilliertem Wasser von - Tri(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl oder Tris-HCl, derart versetzt, daß man eine Endkonzentration von 30 mM hat; - Ethylendiamintetraessigsäure oder EDTA, derart versetzt, daß man eine Endkonzentration von 1 mM hat.

c) Wirkung von Saccharose

Die in 2.4.b erhaltene Suspension wird 5 min mit 6000 g zentrifugiert.
Das Bakterienpellet wird mit konstantem Volumen vorsichtig in einer Lösung B aufgenommen, die der Lösung A, versetzt mit Saccharose in einer Menge von 15 g pro 100 ml, entspricht und extemporär hergestellt wird.
Die Suspension wird 10 min bei 20ºC stehengelassen. Dann wird sie 5 min mit 6000 g zentrifugiert. Die Zentrifugationsrohre werden in schmelzendes Eis gegeben. Man entfernt sorgfältig den Überstand und ersetzt ihn (mit konstantem Volumen) durch entionisiertes Wasser, das auf der Temperatur des schmelzenden Eises gehalten wird.
Die so hergestellte Suspension (deren OD bei 600 nm bei 10 liegt) wird 5 min bei 0ºC stehengelassen.

d) Sammeln der Proteine im Periplasmabereich

Die in 2.4.c erhaltene Suspension wird 10 min mit 18000 g zentrifugiert.
Der Überstand wird gesammelt, er enthält die Proteine im Periplasmabereich.

2.5. Bestimmung des periplasmatischen hGH

a) Methodik

Der in 2.4.d erhaltene Überstand wird einer radioimmunologischen Bestimmung des menschlichen Wachstumshormons unterzogen (Kit ¹²&sup5;I-hGH Coatria® - Biomerieux, Frankreich).
Diese Bestimmung besteht in der aufeinanderfolgenden Durchführung: - einer kompetitiven Reaktion zwischen dem mit Jod 125 markierten und in vorbestimmter Menge eingebrachten hGH und dem in der zu bestimmenden analysierten Probe enthaltenen hGH gegenüber einem ersten anti-hGH-Antikörper in vorbestimmter Menge; - einer Kopplungsreaktion des ersten Antikörpers mit einem zweiten, gegen den ersten Antikörper gerichteten und an einem festen Träger fixierten Antikörper.
Nach der Inkubation ist das Verhältnis des mit Jod 125 markierten hGH umgekehrt proportional zur Menge an hGH in der zu bestimmenden Probe.

2.6. Nachweis der Beschaffenheit des periplasmatischen hGH

1) Methodik

Es wurde die Beschaffenheit des hGH, wie es sich in dem in 2.4.d erhaltenen Überstand sammelte, nachgewiesen.
Dazu wurden die folgenden Schritte nacheinander ausgeführt: - Elektrophoretische Auftrennung der verschiedenen im Überstand enthaltenen Proteine auf Polyacrylamidgel (nach dem von Laemmli - U.K. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685 beschriebenen Protokoll).
Auf diese Weise wandern das hGH in reifer Form und der Präkursor des hGH an zwei unterschiedliche Punkte als Funktion ihrer jeweiligen scheinbaren Molmasse. - Verlagerung der im Gel enthaltenen Proteine auf einen Nitrocellulosefilter (nach der Methode von H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350-4354).
- Immundetektion, durchgeführt nach der Methode von Burnette (W.W. Burnette, Anal. Biochem. 112 (1981), 195-203), sie beinhaltet nacheinander: - Spülen des Nitrocellulosefilters 10 min lang mit einem A- Puffer (Tris - HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KI 1 mM). - Kontaktieren des Nitrocellulosefilters 30 min lang bei 37ºC mit einem Puffer B (Puffer A, versetzt mit Rinderserumalbumin in einer Menge von 3 g pro 100 ml). - Kontaktieren des Nitrocellulosefilters 18 h lang bei 20ºC mit einem Immunserum (einem das reife hGH und seinen Präkursor erkennenden polyklonalen Antikörper). - Spülen des Nitrocellulosefilters mit B-Puffer. - Kontaktieren des Nitrocellulosefilters 6 h lang bei 20ºC mit einer Proteinlösung A, die mit Jod 125 mit 0,1 Mikrocurie pro ml markiert ist. - Spülen des Filters mit A-Puffer, - Trocknen des Filters zwischen zwei absorbierenden Blättern, - Kontaktieren mit einem Röntgenfilm, - Entwickeln des Films.

2) Resultate

Es wurde bemerkt, daß unter den aufrechterhaltenen Arbeitsbedingungen das periplasmatische hGH zu etwa 98% der Moleküle in reifer Form vorhanden war, unabhängig vom verwendeten Bakterienstamm und vom verwendeten Plasmid.

III. Resultate

3.1. Beispiel A:

Vergleich der Gehalte an mit den Wirt-Vektor-Paaren E. coli Stamm T/p212,6 bzw. E.coli CNCM I-528/p212,6 hergestelltem periplasmatischem hGH.
Bei einer Induktionszeit von 3 h 30 min wurden die folgenden Resultate erzielt:
Periplasma-hGH, gemessen in ug pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und au eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 nm = 1
Stamm T/p212,6 0,86
Stamm CNCM I-528/p212,6 2,00
Diese Resultate zeigen, daß der mutante Stamm (Stamm CNCM I-528) periplasmatisches hGH mit einer größeren Leistungsfähigkeit als der nicht mutante Stamm (Stamm T) produzieren kann, wobei die Produktion mehr als das Doppelte ausmacht.

3.2. Beispiel B:

Vergleich der Gehalte an mit den Wirt-Vektor-Paaren E. coli Stamm T/p163,1, E. coli Stamm CNCM I-528/p163,1, E. coli Stamm T/p164,1 bzw. E.coli Stamm CNCM I-528/p164,1 hergestelltem periplasmatischem hGH.
Bei einer Induktionszeit von 3 h wurden die folgenden Resultate erzielt:
Periplasma-hGH, gemessen in ng pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und auf eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 nm = 1 Stamm T Stamm CNCM I-528
Es scheint, daß der mutante Stamm (Stamm CNCM I-528) zu einer Produktion von periplasmatischem hGH in einer deutlich höheren Menge (Erhöhung von etwa 30% in einem Fall und Erhöhung von etwa 70% im anderen Fall) fähig ist, und das unabhängig davon, ob die für den Präkursor von hGH codierende DNS-Sequenz bei ihrer Expression unter der Steuerung von Signalen, die auf die kombinierte Wirkung von cAMP und dem Protein CRP empfindlich sein sollen, steht oder nicht.

3.3. Beispiel C:

Vergleich des Gehalts an mit den Wirt-Vektor-Paaren E. coli Stamm T/p200,3 und E.coli CNCM I-528/p200,3 hergestelltem periplasmatischem hGH.
Dieser Versuch wurde ohne Induktion durchgeführt.
Es wurden die folgenden Resultate erzielt:
Periplasma-hGH, gemessen in Nanogramm pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und auf eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 um = 1
Stamm T/p200-3 200
Stamm CNCM I-528/p200-3 512
Es scheint, daß der mutante Stamm (Stamm CNCM I-528) in der Lage ist, periplasmatisches hGH mit größerer Leistungsfähigkeit zu produzierten als der nicht mutante Stamm (Stamm T), wobei die Produktion mehr als doppelt so groß ist.
Dieser Versuch zeigt, daß man eine Wirkung derselben Größenordnung erzielt, egal ob die Synthese des Präkursors induzierbar ist oder nicht.

3.4. Beispiel D:

Vergleich des Gehalts an-mit dem Wirt-Vektor-Paar E. coli Stamm CNCM I-529/p212,6 in Gegenwart bzw. in Abwesenheit von cAMP hergestelltem periplasmatischem hGH.
Bei einer Induktionszeit, die zwischen 30 und 120 min variierte, wurden die folgenden Resultate erhalten:
Reifes hGH in ug pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und auf eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 nm = 1 In Abwesenheit von cAMP Phänotyp Nach 30 min 60 min 120 min In Gegenwart von
* In Gegenwart von cAMP kommen die Effekte der cya-Mutation nicht zur Expression, und der Stamm weist einen wilden Phänotyp auf [cya&spplus;): er hat die Merkmale eines nicht mutierten Stamms bezüglich des cya-Charakters.
Es scheint, daß der mutante Stamm CNCM I-529 in der Lage ist, periplasmatisches hGH mit größerer Leistungsfähigkeit zu produzierten als ein Mutterstamm, von dem er sich unter den gewählten Arbeitsbedingungen nur durch die Expression einer cya-Mutation unterscheidet.

3.5. Beispiel E:

Vergleichsmessungen des Gehalts an periplasmatischem hGH und des Gehalts an von einem gegebenen Wirt-Vektor-Paar produzierten periplasmatischen Gesamtproteinen.
Dieser Versuch wurde bei einer Induktionszeit von 3 h durchgeführt.
Es wurden die folgenden Resultate erzielt: Versuchsbedingungen mit Zugabe (+) oder ohne (-) von cAMP und Phenotyp (1) Periplasmatisches hGH Mikrogramm/ml (2) Periplasmatische Gesamtproteine (mg/ml)
Die periplasmatischen hGH-Werte sind ausgedrückt in ug pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und auf eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 nm = 1.
Die periplasmatischen Gesamtproteine werden mit dem Verfahren von Bradford (Bradford M.M., Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-264) gemessen und sind ausgedrückt in mg pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und auf eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 nm = 1.
Dieser Versuch zeigt, daß die Produktion von periplasmatischen Bakterienenzymen in ihrer reifen Form, von der die Messung des Gehalts an im Periplasma vorhandenen Proteinen zeugt, gegenüber den in Gegenwart eines Wild-Typs erhaltenen Werten in Gegenwart eines Stamms, dessen Chromosom eine cya-Mutation (Stamm CNCM I-529 ohne exogene Zugabe von cAMP) oder eine d-Mutation (Stamm A mit exogener Zugabe von cAMP) aufweist, bedeutend geringer ist. Gleichzeitig erhöht sich die Produktion von periplasmatischem hGH stark, wenn sich die eine oder andere Mutation exprimiert.

3.6. Beispiel F:

Vergleich des Gehalts an mit den Wirt-Vektor-Paaren A/p 212,6 und I-529/p212,6 in Abwesenheit von cAMP hergestelltem periplasmatischem hGH.
Bei einer Inkubationszeit von 2 h wurden die folgenden Resultate erzielt:
Reifes hGH in ug pro ml Überstand, der nach dem osmotischen Schock gesammelt und auf eine Trübung gebracht wurde, so daß OD 600 nm = 1
Stamm A/p 212,6 2,08
Stamm CNCM I-529/p212,6 2,07
Es scheint, daß der Stamm A, dessen Chromosom eine cya- Mutation durch Deletion und eine crp-Mutation durch Deletion aufweist, und der Stamm I-529, dessen Chromosom dieselbe cya- Mutation durch Deletion aufweist, identische Leistungen erbringen können.
Diese Beispiele veranschaulichen den offensichtlichen Vorteil, der beim Einsatz von Stämmen erzielt wird, welche eine Mutation aufweisen, die die Expression von Operonsn, deren Transkription erst nach Fixierung des cAMP-CRP-Komplexes initiiert werden kann, begrenzt bzw. unterdrückt: diese Stämme ermöglichen nämlich eine bedeutende Steigerung der Produktion des beabsichtigten Periplasmaproteins (welches in den vorliegenden Beispielen zu 98% in seiner reifen Form hergestellt wurde). Beispiel E zeigt den Vorteil ersten Ranges, der durch den Einsatz gleichartiger Bakterien erbracht wird, noch viel deutlicher auf: die festgestellte Steigerung ist nicht nur absolut, sondern auch relativ, wobei die mutanten Stämme die Produktion ihrer eigenen Proteine auf den normalerweise periplasmatischen Raum beschränken, was die Reinigung des bezweckten Proteins aus dem Periplasmagehalt noch erleichtert.

Claims

1. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung eines Proteins durch Kultivierung gramnegativer Bakterien, in die eine DNS-Sequenz eingeführt wurde, die für einen Präkursor dieses Proteins codiert' dadurch gekennzeichnet, daß ein Bakterienstamm eingesetzt wird, dessen Chromosom mindestens eine Mutation aufweist, die' dazu führt, die Fixierung des cAMP-CRP-Komplexes (d. h. des Komplexes von cyclischem Adenosinmonophosphat, cAMP, mit dem Rezeptorprotein für cyclisches AMP, CRP) zu verhindern oder wenig wirksam zu machen, so daß die Expression der Operons, bei denen die Transkription durch die Fixierung des cAMP-CRP-Komplexes kontrolliert wird, unterdrückt oder begrenzt wird.

2. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromosom der betreffenden Bakterien mindestens eine Mutation aufweist, welche die durch das Gen cya und die seine Expression regulierenden DNS-Sequenzen gebildete Einheit beeinträchtigt.

3. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromosom der betreffenden Bakterien mindestens eine Mutation aufweist, welche die durch das Gen crp und die seine Expression regulierenden DNS-Sequenzen gebildete Einheit beeinträchtigt.

4. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromosom dieser Bakterien mindestens eine Mutation, weiche die durch das Gen cya und die seine Expression regulierenden DNS-Sequenzen gebildete Einheit beeinträchtigt, sowie mindestens eine Mutation aufweist, welche die durch das Gen crp und die seine Expression regulierenden DNS-Sequenzen gebildete Einheit beeinträchtigt.

5. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der Ansprüche i bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte mutante Bakterienstamm ein Stamm der Art Escherichia coli ist.

6. Mikrobiologisches Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß der mutante Bakterienstamm die Eigenschaften des unter der Nr. 1-529 bei der Hinterlegungsstelle CNCM hinterlegten Stamms aufweist.

7. Mikrobiologisches Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß der mutante Bakterien- Stamm die Eigenschaften des unter der Nr. I-528 bei der Hinterlegungsstelle CNCM hinterlegten Stamms aufweist.

8. Mikrobiologisches Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß der mutante Bakterienstamm ein Stamm von Escherichia coli ist, dessen Chromosom zwei Deletionen aufweist, von denen die eine die durch das Gen cya und die seine Expression regulierenden DNS-Sequenzen gebildete Einheit und die andere die durch das Gen crp und die seine Expression regulierenden DNS-Sequenzen gebildete Einheit beeinträchtigt.

9. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für den Präkursor des Proteins- von Interesse codierende DNS-Sequenz, zusammen mit Regulierungselementen, die seine Expression erlauben, in einem Plasmid enthalten ist.

10. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm eine DNS-Sequenz enthält, die für einen Präkursor des menschlichen Wachstumshormons codiert.

11. Mikrobiologisches Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die betreffende DNS-Sequenz in einem Plasmid enthalten ist, das die allgemeinen Charakteristika des unter der Nr. I-530 bei der Hinterlegungsstelle CNCM hinterlegten Plasmids aufweist.

12. Bakterienstamm, der unter der Nr. I-528 bei der Hinterlegungsstelle CNCM hinterlegt ist.

13. Bakterienstamm, der unter der Nr. I-529 bei der Hinterlegungsstelle CNCM hinterlegt ist.