JPH08228789A - 細菌株及びプラスミド - Google Patents
細菌株及びプラスミドInfo
- Publication number
- JPH08228789A JPH08228789A JP8021278A JP2127896A JPH08228789A JP H08228789 A JPH08228789 A JP H08228789A JP 8021278 A JP8021278 A JP 8021278A JP 2127896 A JP2127896 A JP 2127896A JP H08228789 A JPH08228789 A JP H08228789A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- strain
- hgh
- crp
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 34
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 48
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 42
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 28
- 101710154303 Cyclic AMP receptor protein Proteins 0.000 abstract description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 abstract description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 abstract description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 abstract 2
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 abstract 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 abstract 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 13
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 3
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYZDOKBFNBVDPA-UHFFFAOYSA-N 2-(aminomethyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC(CO)(CO)CO HYZDOKBFNBVDPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001262777 Lentibacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002833 beta-lactamase TEM-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 108091006374 cAMP receptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150084863 cya gene Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- -1 that is Chemical compound 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
たんぱく質である医薬の製造に適用できる細菌株の提
供。 【解決手段】 C.N.C.M.に寄託番号I−528
及びI−529としてそれぞれ寄託した菌株の一般的特
性を有する細菌株、及びC.N.C.M.に寄託番号I
−530として寄託したプラスミドの一般的特性を有す
るプラスミド。
Description
前駆体をコードするDNA配列体を当該細菌に導入し
て、特定の型の突然変異を担う(Carry)グラム陰
性菌を培養することによって、たんぱく質を得ることを
可能にする微生物学的方法に用いる細菌株及びプラスミ
ドに関する。
に有効成分がたんぱく質である医薬の製造に適用でき
る。
けた後にのみ、生物学的活性を獲得することが知られて
いる。細胞質中で前駆体の形で生合成され、それから細
胞質から運び出されるたんぱく質の場合には、この成熟
の第1段階は、シグナルペプチドと称されるN未端をこ
の前駆体から酵素的に除去することであることが多い。
前駆体の形で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核
生物と真核生物の両方について知られている。このよう
なたんぱく質として特に言及できるものには、例えば、
大腸菌(Escherichia coli)の種など
により産生されるβ−ラクタマーゼ TEM−1とアル
カリ性 ホスファターゼ、黄色ブドウ球菌(Staph
ylococcus aureus)の種により産生さ
れるプロティンA、デンプン液化バチルス(Bacil
lus amyloliquefaciens)の種な
どにより産生されるα−アミラーゼ(これらは原核生物
由来のたんぱく質である)、また、ヒト成長ホルモン、
ヒトインシュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、
上皮成長因子(これらは真核細胞により産生されるたん
ぱく質である)などがある。
天然のたんぱく質前駆体をコードするDNA配列体を担
うプラスミドを用いて形質転換したグラム陰性菌を、使
用できることが知られている(G.L.Gray et
al.,Biotechnology 2(198
4)161−165;G.L.Gray et a
l.,Gene 39(1985)247−254)。
この場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行わ
れる。細胞質区画で、DNA配列体が転写され、それか
ら対応するメッセンジャーRNAが翻訳される。このよ
うにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移
動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナ
ルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前
駆体に対応するたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができ
る。
に関して、天然の前駆体(つまり、通常の産生を行う細
胞で合成される形)と異なる前駆体をコードする場合に
も、類似する結果が得られている。例えば、真核生物由
来のたんぱく質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペ
プチドが結合した前駆体が合成された(K.Talma
dge et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,77(1980)3988−39
92;G.L.Gray et al.,Gene 3
9(1985)247−254)。
または、抑制さえも行う突然変異を起こせることが知ら
れている。このオペロンの転写は、アデノシン3′,
5′−環状リン酸(cAMP)がCRP(環状AMPレ
セプタたんぱく質)(これはCAP(カタボライト活性
化たんぱく質)とも称される)と会合して生じるcAM
P−CRP複合体が、このオペロンの調節要素へ固定さ
れた後にのみ開始されるような転写である。これらのオ
ペロンの機能に関しては、「オペロン」(TheOpe
ron,J.H.Miller and W.S.Re
znikoff,Cold Spring Harbo
r Laboratory,1980)中の「Lacプ
ロモータ」(W.S.Reznikoff and
J.N.Abelson)の章に説明されている。
減少した細菌(阻害されたオペロンは、多くの酵素の合
成を支配するので)が、始めから、たんぱく質工業生産
用の好ましい宿主を形成できないことは明らかであっ
た。
報告(上記)には、当該たんぱく質の前駆体をコードす
るDNA配列体を導入した細菌を培養することによっ
て、たんぱく質を製造するこれまでの研究が、調節要素
(特にプロモータ)を特に選択することによりプラスミ
ド構造の効率を高めることに向けられていたことが示さ
れている。
心を払い、別の方向の研究を行った。驚くべきことに、
転写がcAMP−CRP複合体の固定に依存するオペロ
ンの発現を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1
つの突然変異を担うクロモソームを有するグラム陰性菌
が、前駆体の形で生合成されるたんぱく質の工業生産の
ための好ましい宿主を構成することが見出された。
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を導入したグ
ラム陰性菌を培養することによって、たんぱく質を生産
する微生物学的方法に関する。この方法は、転写がcA
MP−CRP複合体の固定に依存するオペロンの発現を
制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1つの突然変
異を担うクロモソームを有する細菌種の使用を包含す
る。
減少する傾向があるもの;機能形のCRP合成を制限ま
たは抑制するもの;突然変異形のCRPの合成を導き、
DNAへの固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ち
るようなcAMP−CRP複合体の形成を起こすもの;
および、当該複合体の固定が妨げられるまたは比較的に
効率が落ちるような仕方に、DNAに対するcAMP−
CRP複合体の固定の部位を修飾するものである。これ
らは、発現が温度などのパラメータに依存する条件突然
変異であってよい。
伝子cya自身またはその発現を調節するDNA配列体
に、この遺伝子がコードするアドニル酸シクラーゼが合
成されないか、またはその特異的な活性、すなわちアデ
ノシン、三リン酸(ATP)のcAMPへの変換を行う
ことができない形で合成するように影響を及ぼす突然変
異が、特に特徴づけられる。クロモソーム遺伝子crp
自身またはその発現を調節するDNA配列体に、この遺
伝子がコードするCRPが合成されないか、またはDN
Aへの効率的な固定を可能にする十分に安定なcAMP
−CRP複合体が形成されないような突然変異形で合成
するように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜
上、これらの突然変異をここではcya突然変異および
crp突然変異と称する。
のものでよいが、特に可能なものは、置換による突然変
異、挿入による突然変異、変換による突然変異、または
例えば欠失による突然変異である。突然変異は、一対の
ヌクレオチドのみに影響を与えるものであってよいが、
この型の点突然変異は可逆的なので、幾対かのヌクレオ
チドに同時に影響を与える不可逆的突然変異が好まし
い。多重点突然変異が更に可能性がある。cya突然変
異の場合には、cAMPは合成されず、cAMP−CR
P複合体の形成は起き得ない。外来性cAMPの添加に
よって、この合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を
回復することが可能となる。crp突然変異の場合に
は、CRPはもはや機能形では合成されず、同様に、c
AMP−CRP複合体の形成は起き得ない。ここでは、
外来性cAMPの添加は、乱された細胞機能の回復には
無力である。
調節するDNA配列体により形成される系、またはcr
p遺伝子およびその発現を調節するDNA配列体により
形成される系、またはその両方の系に影響を及ぼす少な
くとも1つの突然変異を担うクロモソームを有する細菌
株を使用する上に定めた微生物学的方法に、有利に関連
している。
の発現の制御を行うCRPとカップリングしている任意
のグラム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この
型の細菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対し
て驚く程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利と
なる(Sushil Kumar,J.Bact.12
5(1976)545−555)。好ましい細菌の種は
大腸菌である。
然変異細菌株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学
的方法に関する。
国立微生物寄託機関(Collection Nati
onale de Cultures de Micr
oorganismes(C.N.C.M.),Par
is, France)に寄託した大腸菌の2つの突然
変異菌株を選択した。菌株の1つは点crp突然変異を
担い(寄託番号I−528)、他の菌株は欠失による非
点cya突然変異を担う(寄託番号I−529)。
寄託番号I−528およびI−529としてC.N.
C.M.に寄託された菌株の一方または他方の特性を有
する上記の微生物学的方法に関する。
を得ることが可能となる。製造を望むたんぱく質が、前
駆体の形で天然に生合成されるか否かはほとんど重要で
ないことを理解する必要がある。また、この方法は非天
然のたんぱく質の製造にも適している。例えば、1次構
造を2つまたはそれ以上の既知のたんぱく質から選択し
たハイブリッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、
この方法は、N未端にシグナルペプチドとして挙動する
ペプチドが結合した上記のたんぱく質をコードするDN
A配列体の製造を満足する。
(以後、hGHと称する)の製造に対して特に有利であ
る。
ら単離された天然hGH前駆体の1つをコードするDN
A配列体、および、この前駆体のアミノ酸配列体を示し
ている。最初の26のアミノ酸(図中の−26位のアミ
ノ酸から数える)がシグナルペプチドを構成し、他の1
91のアミノ酸(ここでは1から191までの番号を付
ける)は実際のhGH(以後、「成熟hGH」と称す
る)のアミノ酸である。
語を説明する。
A,C,T,Gを使用している。これらはそれぞれ、ア
デニン、シトシン、チミン、グアニンの塩基を示す。
が、所望のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列
体を含むことが必要である。「前駆体」の語は、それが
存在する場合は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグ
ナルペプチドを修飾して得られた上記の天然前駆体の任
意の誘導体を、更に、シグナルペプチドとして挙動でき
るペプチドが上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体
を意味するものとして理解される。前駆体は特に、既知
の原核および真核生物のシグナルペプチドまたはその誘
導体を包含する群から選択できる。
A配列体を、プラスミドなどの複製可能な発現ベクター
により細菌に導入できる。上記配列体の発現に必要な調
節要素(特に、プロモータ)が、その機能を行うために
その配列体の付近に位置することが必要であることは明
白である。
とを条件として、従来技術(G.L.Gray et
al.,Gene 39(1985)247−254)
に説明されているプラスミドを使用できる。これらのプ
ラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所望
のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が誘導
可能である必要はないことが示された。上記の配列体が
幾つかの複写として存在することも重要である。
の後、細胞当り50ないし300の比率で複写が存在
し、それぞれの複写が所望のたんぱく質の前駆体をコー
ドするDNA配列体の複写を担うことができる幾つかの
プラスミドを構築し、選択した。これらのプラスミドの
1つによって形質転換された大腸菌MC1061株を、
1986年2月17日にC.N.C.M.に寄託した。
この菌株は寄託番号I−530である。便宜上、以後の
説明では、寄託番号I−530としてC.N.C.M.
に寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミ
ド(以後、内部参照によりp163,1とも称する)
は、hGHの天然の前駆体の1つをコードするDNA配
列体を担う。図1に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞
で合成された前駆体の1つから決定された配列体と同一
である。これを、1)5′未端から始まり、RNAポリ
メラーゼ認識部位(−35位に位置するそのヌクレオチ
ドの中央の部位、文献(M.Takanami et
al.,Nature 260(1976)297−3
02)に定められている)を含むトリプトファン プロ
モーターの断片、および、2)RNAポリメラーゼ認識
部位(−35位に位置するそのヌクレオチドの中央の部
位)と、固定部位(−10位に位置するそのヌクレオチ
ドの中央の部位、文献(D.Pribnow,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA72(197
5)784−789)に定められている)とを分離して
いる領域と5′未端との間の部分を除いたプロモーター
オペレータ(promoter−operator)ラ
クトース UV5が結合したハイブリッド プロモータ
ーオペレータの制御下に置いた。
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
り、SalI、BamHI、HindIII 、PstI、
EcoRI、XhoI、およびPvuIの酵素の作用部
位を示している。
5(「オペロン」中の「Lacプロモータ」の章(前記
参照)に説明されている)が存在するために、hGH前
駆体をコードするDNA配列体の発現が、cAMPおよ
ひCRPの併合作用に不感受性となる。このプラスミド
は、その一般的特性を仮定して、天然のhGH前駆体の
1つをコードするDNA配列体を、他の前駆体特に他の
たんぱく質の前駆体をコードする配列体に置換すること
によって、他のプラスミドを構築するために使用でき
る。
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が、その発現
を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担われる上
記の微生物学的方法に関する。特に、上記のDNA配列
体が、C.N.C.M.に寄託された寄託番号I−53
0のプラスミドの一般的特性を有するプラスミドによっ
て担われる上記の微生物学的方法に関する。
が、hGH前駆体をコードするDNA配列体を含有する
上記の微生物学的方法に関する。
−528およびI−529としてC.N.C.M.に寄
託された細菌株に関する。
号I−530としてC.N.C.M.に寄託されたプラ
スミドに関する。
当然、本発明は、これらの例で説明されている本発明の
方法の適用には制限されない。本発明には、特許請求の
範囲によって定められる範囲の変法の全てが含まれる。
した寄託番号I−528およびI−529の菌株とは別
に、他に次の2つの大腸菌の菌株に言及する。
失による非点crp突然変異の両方を担う菌株。以後、
内部参照によりAと称する。C.N.C.M.I−52
9株はこの菌株から誘導される。
転写が開始されるオペロンの発現を、制限または抑制で
きる突然変異を担わない菌株。MC1061(大腸菌、
Genetic Sock Center,New−H
aven,Connecticut,USA)として知
られている。以後、内部参照によりTと称する。C.
N.C.M.I−528株はこの菌株から誘導される。
した寄託番号I−530のプラスミドとは別に、他に3
つのプラスミドに言及する。これらは内部参照により、
p164,1、p200,3、p212,6と称する。
63,1と非常に類似しており、本質的な相違は突然変
異UV5が存在しないことである。
63,1と類似している。図3に、これについて、主要
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
様に、一定の制限酵素の作用部位を図3に示す。
12,6と等価であり、hGH前駆体をコードするDN
A配列体の発現に関する非抑制特性のために選択した。
ラスミドp212,6およびp200,3により担われ
るDNA配列体は、図1に示す配列体と、2つの置換に
おいて異なっている。つまり、コドンACCは、−24
位に位置するアミノ酸をコードするコドンACAに置換
され、同様に、コドンTCTは、−22位に位置するア
ミノ酸をコードするコドンTCCに置換された。
§2.1参照)、宿主がhGH前駆体をコードするDN
A配列体を発現できるような条件下に培養し(§2.2
参照)、必要ならば発現を誘導(§2.3参照)するこ
とと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を採取すること
と(§2.4参照)、ペリプラズムhGHを同定するこ
と(§2.5参照)とからなる。
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。
ル)」(Molecular cloning−A L
aboratory Manual,T.Maniat
is,E.F.Fritsch and J.Samb
rook,Cold Spring Harbor L
aboratory,1982) ・「分子遺伝学の実験」(Experiments i
n molecular genetics,J.H.
Miller,Cold Spring Harbor
Laboratory,1972) 2.2.培養 a)接種 固体培地(LB培地+寒天)で得られた分離コロニー
を、以下の特性を有し、かつ100μg/mlのアンピ
シリンを添加した5mlの培地(LB培地)中に懸濁さ
せる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物(DIFCOからのバクトトリプトン) 10g 酵母抽出物 5g 塩化ナトリウム 5g 蒸溜水添加 1l であり、 ・加圧滅菌前にpHを7.3に調節した。
Lomb spectronic 20)での光学密
度、即ちOD600nmが約0.05になるように、細
菌懸濁液をLB培地中で希釈する。
D600nmが約0.2になるまで37℃でインキュベ
ーションした。
ピル−β−D−チオガラクトース(IPTG)をその最
終濃度が1mMになる量だけ添加する。ここで、IPT
Gはリプレッサー(通常はラクトース オペレータに結
合する)の作用を中和することによって、hGH前駆体
の合成を開始し、かつ維持するために用いる。
ical Chemistry 241(1966)3
055−3062)において、N.G.Nossalお
よびL.A.Heppelが発表したプロトコールを参
照してもよい。) a)細菌懸濁液の調製 2.2.d(誘導が必要とされない場合)のようにして
得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸
濁液の試料を採取し、OD600nmが約10になるよ
うにこれを処理(6000gで5分間遠心分離、上澄み
を除去、細菌をLB培地中に再度懸濁)する。
分離する。
A中に採取する。即ち、溶液Aは蒸溜水に下記のものを
添加することによって調製されたpH=7の緩衝液であ
る。
−HCl、即ち、Tris−HCl 最終濃度が30mMのように添加する。
A 最終濃度が1mMになるように添加する。
分離する。
g/100mlのスクロースを添加した溶液B中に、残
渣の一定量を注意深く採取し、直ちに用いる。
る。
れた脱イオン水中に再度静置する(一定容量で)。
nmは約10)を0℃で5分間放置する。
集 2.4.cで得られた懸濁液を、18,000gで10
分間遠心分離する。
在するたんぱく質が含まれる。
ジオイムノアッセイにかける(COATRIAR 125 I
−hGH kit−Biomerieux,Franc
e)。
とからなる。
定められた量だけ導入し、予め定められた量の第一の抗
−hGH抗体を目当てとして、同定されるべき分析試料
中に含まれるhGHとの間で競合させる反応。
二の抗体に結合させ、固体物質に固定する反応。
で標識したhGHの比率は、分析試料中のhGHの量に
逆比例する。
ク 1)方法論 2.4.dで得られた上澄みから採集したhGHの性質
をチェックした。
より実施した。
の、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分離
(文献(U.K.Laemmli,Nature 22
7(1970)680−685)中にLaemmliに
より記載されたプロトコールによる)。
H前駆体が、それぞれの見かけの分子量に応じて2つの
異なった点に移動する。
トロセルロースフィルター上への移動(文献(H.To
wbin et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 76(1979)4350−43
54)の技術に従う)。
tte,anal.Biochem.112(198
1)195−203)に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。
(Tris−HCl 10mM,NaCl 170m
M,KI 1mM)で10分間濯ぐ。
で30分間、緩衝液B(3g/100mlの割合で牛血
清アルブミンを添加した緩衝液A)に接触させる。
で18時間、免疫血清(成熟hGHおよびその前駆体を
認識する多クローン性抗体)に接触させる。
で濯ぐ。
で6時間、1ml当り0.1マイクロキュリーのヨウ素
125で標識されたプロテインAの溶液と接触させる。
乾燥する。
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムhGHは分子の
約98%が成熟形で存在することに注目すべきである。
腸菌CNCM I−528株/p212,6によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
I−528株)の方が、非突然変異株(T株)よりも2
倍以上高い効率で、ペリプラズムhGHを生産できるこ
とを示している。
腸菌CNCM I−528株/p163,1と、大腸菌
T株/p164,1と、大腸菌CNCM I−528株
/p164,1によってそれぞれ生産されたペリプラズ
ムhGHのレベルの比較。
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。
度をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄み
1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定したとこ
ろ、次の結果が得られた。
関して、シグナルの制御下においてcAMPおよびCR
Pの併合作用に感受性であると考えられるか否かにかか
わらず、突然変異株(CNCM I−528株)は著し
く増大した量のペリプラズムhGHを生産できると考え
られる(一例では約30%の増加、他の例では70%の
増加)。
腸菌CNCM I−528株/p200,3によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
クおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取
した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定
したところ、次の結果が得られた。
株(T株)よりも2倍以上高い効率で、ペリプラズムh
GHを生産できると考えられる。
るか否かにかかわらず、得られる効果が同じオーダーで
あることを示している。
p212,6によって、cAMPの存在下または非存在
下でそれぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの
比較。
せたところ、次の結果が得られた。これらの結果は、い
ずれも浸透圧ショックおよび濁度をOD600nm=1
に調節した後に、採取した上澄み1ml当りの成熟ペリ
プラズムhGHの量(μg)を測定したものである。
ていない菌株の特徴を有している。
は、処理条件の選択下でcya変異の発現においてのみ
異なる親株よりも高い効率で、ペリプラズムhGHを生
産できると考えられる。
ズムhGHレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。
結果が得られた。
クおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取
した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHのμg数で
表した。
ードの方法(M.M.Bradford,Analyt
ical Biochemistry 72(197
6)248−264)で測定し、浸透圧ショックおよび
濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄
み1ml当りのペリプラズムhGHのmg数で表した。
ぱく質レベルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプ
ラズム酵素の生産が、野生型菌株の存在により得られた
値およびクロモソームがcya変異(外因性cAMP添
加のないCNCM I−529株)またはcrp変異
(外因性cAMP添加のあるA株)を有する菌株の存在
下での実質的な量に比較して、減少することを示してい
る。同時に、突然変異の一方または他方が発現すると
き、ペリプラズムgHGの生産は大幅に増大する。
212,6とI−529株/p212,6によってそれ
ぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りの成熟したペリプラズムhGHの量
(μg)を測定したところ、次の結果が得られた。
有するA株と、クロモソームが同様のcya欠失変異を
有するI−529株は、同一の挙動をすると考えられ
る。
固定後にのみ転写が開始され得るオペロンの発現を制限
しまたは抑制する変異をもった菌株を使用することによ
って、明白な利点がもたらされることを示している。:
事実、これらの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の
生産を実質的に増大(これらの例では、成熟形でのたん
ぱく質について98%)させることが可能である。例E
では、このような細菌の使用によって与えられる絶対的
な一次的利点(absolutely first−r
ate advantage)が強調される。:変異株
は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産
を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。;これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。
位置と配向を示す機能地図である。
位置と配向を示す機能地図である。
Claims (3)
- 【請求項1】 C.N.C.M.に寄託番号I−528
として寄託した菌株の一般的特性を有する細菌株。 - 【請求項2】 C.N.C.M.に寄託番号I−529
として寄託した菌株の一般的特性を有する細菌株。 - 【請求項3】 C.N.C.M.に寄託番号I−530
として寄託したプラスミドの一般的特性を有するプラス
ミド。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8605133 | 1986-04-10 | ||
FR8605133A FR2597114B1 (fr) | 1986-04-10 | 1986-04-10 | Procede microbiologique pour l'obtention d'une proteine par culture d'une souche bacterienne mutante |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62088603A Division JP2528872B2 (ja) | 1986-04-10 | 1987-04-10 | 突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法 |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9034087A Division JP2708403B2 (ja) | 1986-04-10 | 1997-02-18 | 細菌株及びプラスミド |
JP9034088A Division JPH09224685A (ja) | 1986-04-10 | 1997-02-18 | 細菌株及びプラスミド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08228789A true JPH08228789A (ja) | 1996-09-10 |
JP2661894B2 JP2661894B2 (ja) | 1997-10-08 |
Family
ID=9334099
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62088603A Expired - Lifetime JP2528872B2 (ja) | 1986-04-10 | 1987-04-10 | 突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法 |
JP8021278A Expired - Lifetime JP2661894B2 (ja) | 1986-04-10 | 1996-02-07 | 細菌株及びプラスミド |
JP9034087A Expired - Lifetime JP2708403B2 (ja) | 1986-04-10 | 1997-02-18 | 細菌株及びプラスミド |
JP9034088A Pending JPH09224685A (ja) | 1986-04-10 | 1997-02-18 | 細菌株及びプラスミド |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62088603A Expired - Lifetime JP2528872B2 (ja) | 1986-04-10 | 1987-04-10 | 突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9034087A Expired - Lifetime JP2708403B2 (ja) | 1986-04-10 | 1997-02-18 | 細菌株及びプラスミド |
JP9034088A Pending JPH09224685A (ja) | 1986-04-10 | 1997-02-18 | 細菌株及びプラスミド |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4945047A (ja) |
EP (1) | EP0245138B1 (ja) |
JP (4) | JP2528872B2 (ja) |
CA (1) | CA1304021C (ja) |
DE (1) | DE3786947T2 (ja) |
ES (1) | ES2059401T3 (ja) |
FR (1) | FR2597114B1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2636644B1 (fr) * | 1988-08-24 | 1990-12-28 | Sanofi Sa | Sequence d'adn participant a la regulation de l'expression d'une sequence d'adn codant pour un precurseur d'un polypeptide, vecteurs d'expression et procede de production periplasmique du polypeptide |
US5279947A (en) * | 1988-08-24 | 1994-01-18 | Sanofi | DNA sequence participating in the regulation of the expression of a DNA sequence coding for a precursor of a polypeptide, expression vectors and process for the periplasmic production of the polypeptide |
US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
AR088699A1 (es) | 2011-11-09 | 2014-06-25 | Sanofi Sa | Diacilglicerol lipasa y usos de la misma |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59125895A (ja) * | 1983-01-07 | 1984-07-20 | Rikagaku Kenkyusho | ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 |
US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
JPS60221091A (ja) * | 1983-12-21 | 1985-11-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プロモ−タ− |
JPS60234584A (ja) * | 1984-05-09 | 1985-11-21 | Morio Ikehara | 組換プラスミド |
-
1986
- 1986-04-10 FR FR8605133A patent/FR2597114B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-04-09 US US07/036,263 patent/US4945047A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-10 EP EP87400813A patent/EP0245138B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-10 JP JP62088603A patent/JP2528872B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-10 ES ES87400813T patent/ES2059401T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-10 DE DE87400813T patent/DE3786947T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-10 CA CA000534359A patent/CA1304021C/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-07 JP JP8021278A patent/JP2661894B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-02-18 JP JP9034087A patent/JP2708403B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 JP JP9034088A patent/JPH09224685A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH09224685A (ja) | 1997-09-02 |
DE3786947D1 (de) | 1993-09-16 |
EP0245138A1 (fr) | 1987-11-11 |
FR2597114B1 (fr) | 1994-02-25 |
JP2528872B2 (ja) | 1996-08-28 |
CA1304021C (en) | 1992-06-23 |
US4945047A (en) | 1990-07-31 |
JP2708403B2 (ja) | 1998-02-04 |
DE3786947T2 (de) | 1994-02-24 |
FR2597114A1 (fr) | 1987-10-16 |
ES2059401T3 (es) | 1994-11-16 |
JP2661894B2 (ja) | 1997-10-08 |
JPS637793A (ja) | 1988-01-13 |
EP0245138B1 (fr) | 1993-08-11 |
JPH09224684A (ja) | 1997-09-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5646016A (en) | Peptide and protein fusions to thioredoxin, thioredoxin-like molecules, and modified thioredoxin-like molecules | |
EP0574506B1 (en) | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules | |
US5292646A (en) | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules | |
JP3503705B2 (ja) | 細菌におけるポリペプチド産生の調節方法 | |
US7662609B2 (en) | E.coli host cells with modified PhoS/PstS periplasmic phosphate-binding proteins, and method of manufacturing recombinant fabs | |
US20080254511A1 (en) | Process for the fermentative production of proteins | |
JP2019058195A (ja) | 大腸菌における組換えcrm197の産生強化 | |
JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
US20080076158A1 (en) | Process for the fermentative production of proteins | |
KR20220152186A (ko) | 고초균 및 엔도뉴클레아제를 이용하여 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자를 제조하는 방법 | |
JP2019195327A (ja) | 枯草菌(bacillus subtilis)において真正で生物活性を有する塩基性線維芽細胞増殖因子を発現させる方法及び手段 | |
JP2661894B2 (ja) | 細菌株及びプラスミド | |
JP7242829B2 (ja) | 新規細菌lpp突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用 | |
Ulmke et al. | Identification of a new porin, RafY, encoded by raffinose plasmid pRSD2 of Escherichia coli | |
Rigi et al. | Optimization of Expression, Purification and Secretion of Functional Recombinant Human Growth Hormone in Prokaryotic Hosts Using Modified Staphylococcal Protein A Signal Peptide | |
JPWO2004031243A1 (ja) | タンパク質ポリマー及びその製造方法 | |
CN112888787B (zh) | 新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途 | |
KR101081334B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스를 이용한 인간 BMPs 단백질의 생산 방법 | |
KR100497204B1 (ko) | 유산균으로부터 분리된 신규한 분비신호 | |
JP2662044B2 (ja) | Dna配列、発現ベクターおよびポリペプチドの周辺質生産方法 | |
JP2000078989A (ja) | ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 | |
JP2537764B2 (ja) | 高発現ベクタ―、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 | |
JPS62155080A (ja) | 新規な大腸菌宿主 | |
JPH09313191A (ja) | 蛋白質の分泌生産法 | |
JPH0355111B2 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970506 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |