JPH09224684A - 細菌株及びプラスミド - Google Patents
細菌株及びプラスミドInfo
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Abstract
たんぱく質である医薬の製造に適用できる細菌株の提
供。 【解決手段】 C.N.C.M.に寄託番号I−528
及びI−529としてそれぞれ寄託した菌株の一般的特
性を有する細菌株、及びC.N.C.M.に寄託番号I
−530として寄託したプラスミドの一般的特性を有す
るプラスミド。
Description
前駆体をコードするDNA配列体を当該細菌に導入し
て、特定の型の突然変異を担う(Carry)グラム陰
性菌を培養することによって、たんぱく質を得ることを
可能にする微生物学的方法に用いる細菌株及びプラスミ
ドに関する。
に有効成分がたんぱく質である医薬の製造に適用でき
る。
けた後にのみ、生物学的活性を獲得することが知られて
いる。細胞質中で前駆体の形で生合成され、それから細
胞質から運び出されるたんぱく質の場合には、この成熟
の第1段階は、シグナルペプチドと称されるN未端をこ
の前駆体から酵素的に除去することであることが多い。
前駆体の形で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核
生物と真核生物の両方について知られている。このよう
なたんぱく質として特に言及できるものには、例えば、
大腸菌(Escherichia coli)の種など
により産生されるβ−ラクタマーゼ TEM−1とアル
カリ性 ホスファターゼ、黄色ブドウ球菌(Staph
ylococcus aureus)の種により産生さ
れるプロティンA、デンプン液化バチルス(Bacil
lus amyloliquefaciens)の種な
どにより産生されるα−アミラーゼ(これらは原核生物
由来のたんぱく質である)、また、ヒト成長ホルモン、
ヒトインシュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、
上皮成長因子(これらは真核細胞により産生されるたん
ぱく質である)などがある。
天然のたんぱく質前駆体をコードするDNA配列体を担
うプラスミドを用いて形質転換したグラム陰性菌を、使
用できることが知られている(G.L.Gray et
al.,Biotechnology 2(198
4)161−165;G.L.Gray et a
l.,Gene 39(1985)247−254)。
この場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行わ
れる。細胞質区画で、DNA配列体が転写され、それか
ら対応するメッセンジャーRNAが翻訳される。このよ
うにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移
動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナ
ルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前
駆体に対応するたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができ
る。
に関して、天然の前駆体(つまり、通常の産生を行う細
胞で合成される形)と異なる前駆体をコードする場合に
も、類似する結果が得られている。例えば、真核生物由
来のたんぱく質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペ
プチドが結合した前駆体が合成された(K.Talma
dge et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,77(1980)3988−39
92;G.L.Gray et al.,Gene 3
9(1985)247−254)。
または、抑制さえも行う突然変異を起こせることが知ら
れている。このオペロンの転写は、アデノシン3′,
5′−環状リン酸(cAMP)がCRP(環状AMPレ
セプタたんぱく質)(これはCAP(カタボライト活性
化たんぱく質)とも称される)と会合して生じるcAM
P−CRP複合体が、このオペロンの調節要素へ固定さ
れた後にのみ開始されるような転写である。これらのオ
ペロンの機能に関しては、「オペロン」(TheOpe
ron,J.H.Miller and W.S.Re
znikoff,Cold Spring Harbo
r Laboratory,1980)中の「Lacプ
ロモータ」(W.S.Reznikoff and
J.N.Abelson)の章に説明されている。
減少した細菌(阻害されたオペロンは、多くの酵素の合
成を支配するので)が、始めから、たんぱく質工業生産
用の好ましい宿主を形成できないことは明らかであっ
た。
報告(上記)には、当該たんぱく質の前駆体をコードす
るDNA配列体を導入した細菌を培養することによっ
て、たんぱく質を製造するこれまでの研究が、調節要素
(特にプロモータ)を特に選択することによりプラスミ
ド構造の効率を高めることに向けられていたことが示さ
れている。
心を払い、別の方向の研究を行った。驚くべきことに、
転写がcAMP−CRP複合体の固定に依存するオペロ
ンの発現を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1
つの突然変異を担うクロモソームを有するグラム陰性菌
が、前駆体の形で生合成されるたんぱく質の工業生産の
ための好ましい宿主を構成することが見出された。
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を導入したグ
ラム陰性菌を培養することによって、たんぱく質を生産
する微生物学的方法に関する。この方法は、転写がcA
MP−CRP複合体の固定に依存するオペロンの発現を
制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1つの突然変
異を担うクロモソームを有する細菌種の使用を包含す
る。
減少する傾向があるもの;機能形のCRP合成を制限ま
たは抑制するもの;突然変異形のCRPの合成を導き、
DNAへの固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ち
るようなcAMP−CRP複合体の形成を起こすもの;
および、当該複合体の固定が妨げられるまたは比較的に
効率が落ちるような仕方に、DNAに対するcAMP−
CRP複合体の固定の部位を修飾するものである。これ
らは、発現が温度などのパラメータに依存する条件突然
変異であってよい。
伝子cya自身またはその発現を調節するDNA配列体
に、この遺伝子がコードするアデニル酸シクラーゼが合
成されないか、またはその特異的な活性、すなわちアデ
ノシン三リン酸(ATP)のcAMPへの変換を行うこ
とができない形で合成するように影響を及ぼす突然変異
が、特に特徴づけられる。クロモソーム遺伝子crp自
身またはその発現を調節するDNA配列体に、この遺伝
子がコードするCRPが合成されないか、またはDNA
への効率的な固定を可能にする十分に安定なcAMP−
CRP複合体が形成されないような突然変異形で合成す
るように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜
上、これらの突然変異をここではcya突然変異および
crp突然変異と称する。
のものでよいが、特に可能なものは、置換による突然変
異、挿入による突然変異、変換による突然変異、または
例えば欠失による突然変異である。突然変異は、一対の
ヌクレオチドのみに影響を与えるものであってよいが、
この型の点突然変異は可逆的なので、幾対かのヌクレオ
チドに同時に影響を与える不可逆的突然変異が好まし
い。多重点突然変異が更に可能性がある。cya突然変
異の場合には、cAMPは合成されず、cAMP−CR
P複合体の形成は起き得ない。外来性cAMPの添加に
よって、この合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を
回復することが可能となる。crp突然変異の場合に
は、CRPはもはや機能形では合成されず、同様に、c
AMP−CRP複合体の形成は起き得ない。ここでは、
外来性cAMPの添加は、乱された細胞機能の回復には
無力である。
調節するDNA配列体により形成される系、またはcr
p遺伝子およびその発現を調節するDNA配列体により
形成される系、またはその両方の系に影響を及ぼす少な
くとも1つの突然変異を担うクロモソームを有する細菌
株を使用する上に定めた微生物学的方法に、有利に関連
している。
の発現の制御を行うCRPとカップリングしている任意
のグラム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この
型の細菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対し
て驚く程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利と
なる(Sushil Kumar,J.Bact.12
5(1976)545−555)。好ましい細菌の種は
大腸菌である。
然変異細菌株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学
的方法に関する。
国立微生物寄託機関(Collection Nati
onale de Cultures de Micr
oorganismes(C.N.C.M.),Par
is, France)に寄託した大腸菌の2つの突然
変異菌株を選択した。菌株の1つは点crp突然変異を
担い(寄託番号I−528)、他の菌株は欠失による非
点cya突然変異を担う(寄託番号I−529)。
寄託番号I−528およびI−529としてC.N.
C.M.に寄託された菌株の一方または他方の特性を有
する上記の微生物学的方法に関する。
を得ることが可能となる。製造を望むたんぱく質が、前
駆体の形で天然に生合成されるか否かはほとんど重要で
ないことを理解する必要がある。また、この方法は非天
然のたんぱく質の製造にも適している。例えば、1次構
造を2つまたはそれ以上の既知のたんぱく質から選択し
たハイブリッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、
この方法は、N未端にシグナルペプチドとして挙動する
ペプチドが結合した上記のたんぱく質をコードするDN
A配列体の製造を満足する。
(以後、hGHと称する)の製造に対して特に有利であ
る。
ら単離された天然hGH前駆体の1つをコードするDN
A配列体、および、この前駆体のアミノ酸配列体を示し
ている。最初の26のアミノ酸(図中の−26位のアミ
ノ酸から数える)がシグナルペプチドを構成し、他の1
91のアミノ酸(ここでは1から191までの番号を付
ける)は実際のhGH(以後、「成熟hGH」と称す
る)のアミノ酸である。
語を説明する。
通常の意味でA,C,T,Gを使用している。これらは
それぞれ、アデニン、シトシン、チミン、グアニンの塩
基を示す。
が、所望のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列
体を含むことが必要である。「前駆体」の語は、それが
存在する場合は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグ
ナルペプチドを修飾して得られた上記の天然前駆体の任
意の誘導体を、更に、シグナルペプチドとして挙動でき
るペプチドが上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体
を意味するものとして理解される。前駆体は特に、既知
の原核および真核生物のシグナルペプチドまたはその誘
導体を包含する群から選択できる。
A配列体を、プラスミドなどの複製可能な発現ベクター
により細菌に導入できる。上記配列体の発現に必要な調
節要素(特に、プロモータ)が、その機能を行うために
その配列体の付近に位置することが必要であることは明
白である。
とを条件として、従来技術(G.L.Gray et
al.,Gene 39(1985)247−254)
に説明されているプラスミドを使用できる。これらのプ
ラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所望
のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が誘導
可能である必要はないことが示された。上記の配列体が
幾つかの複写として存在することも重要である。
の後、細胞当り50ないし300の比率で複写が存在
し、それぞれの複写が所望のたんぱく質の前駆体をコー
ドするDNA配列体の複写を担うことができる幾つかの
プラスミドを構築し、選択した。これらのプラスミドの
1つによって形質転換された大腸菌MC1061株を、
1986年2月17日にC.N.C.M.に寄託した。
この菌株は寄託番号I−530である。便宜上、以後の
説明では、寄託番号I−530としてC.N.C.M.
に寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミ
ド(以後、内部参照によりp163,1とも称する)
は、hGHの天然の前駆体の1つをコードするDNA配
列体を担う。図1に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞
で合成された前駆体の1つから決定された配列体と同一
である。これを、 1)5′未端から始まり、RNAポリメラーゼ認識部位
(−35位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、
文献(M.Takanami et al.,Natu
re 260(1976)297−302)に定められ
ている)を含むトリプトファン プロモーターの断片、
および、 2)RNAポリメラーゼ認識部位(−35位に位置する
そのヌクレオチドの中央の部位)と、固定部位(−10
位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、文献
(D.Pribnow,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA72(1975)784−789)
に定められている)とを分離している領域と5′未端と
の間の部分を除いたプロモーターオペレータ(prom
oter−operator)ラクトース UV5が結
合したハイブリッド プロモーターオペレータの制御下
に置いた。
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
り、SalI、BamHI、HindIII 、PstI、
EcoRI、XhoI、およびPvuIの酵素の作用部
位を示している。
5(「オペロン」中の「Lacプロモータ」の章(前記
参照)に説明されている)が存在するために、hGH前
駆体をコードするDNA配列体の発現が、cAMPおよ
ひCRPの併合作用に不感受性となる。このプラスミド
は、その一般的特性を仮定して、天然のhGH前駆体の
1つをコードするDNA配列体を、他の前駆体特に他の
たんぱく質の前駆体をコードする配列体に置換すること
によって、他のプラスミドを構築するために使用でき
る。
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が、その発現
を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担われる上
記の微生物学的方法に関する。特に、上記のDNA配列
体が、C.N.C.M.に寄託された寄託番号I−53
0のプラスミドの一般的特性を有するプラスミドによっ
て担われる上記の微生物学的方法に関する。
が、hGH前駆体をコードするDNA配列体を含有する
上記の微生物学的方法に関する。
−528およびI−529としてC.N.C.M.に寄
託された細菌株に関する。
号I−530としてC.N.C.M.に寄託されたプラ
スミドに関する。
当然、本発明は、これらの例で説明されている本発明の
方法の適用には制限されない。本発明には、特許請求の
範囲によって定められる範囲の変法の全てが含まれる。
した寄託番号I−528およびI−529の菌株とは別
に、他に次の2つの大腸菌の菌株に言及する。
失による非点crp突然変異の両方を担う菌株。以後、
内部参照によりAと称する。C.N.C.M.I−52
9株はこの菌株から誘導される。
転写が開始されるオペロンの発現を、制限または抑制で
きる突然変異を担わない菌株。MC1061(大腸菌、
Genetic Sock Center,New−H
aven,Connecticut,USA)として知
られている。以後、内部参照によりTと称する。C.
N.C.M.I−528株はこの菌株から誘導される。
した寄託番号I−530のプラスミドとは別に、他に3
つのプラスミドに言及する。これらは内部参照により、
p164,1、p200,3、p212,6と称する。
63,1と非常に類似しており、本質的な相違は突然変
異UV5が存在しないことである。
63,1と類似している。図3に、これについて、主要
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
様に、一定の制限酵素の作用部位を図3に示す。
12,6と等価であり、hGH前駆体をコードするDN
A配列体の発現に関する非抑制特性のために選択した。
ラスミドp212,6およびp200,3により担われ
るDNA配列体は、図1に示す配列体と、2つの置換に
おいて異なっている。つまり、コドンACCは、−24
位に位置するアミノ酸をコードするコドンACAに置換
され、同様に、コドンTCTは、−22位に位置するア
ミノ酸をコードするコドンTCCに置換された。
§2.1参照)、宿主がhGH前駆体をコードするDN
A配列体を発現できるような条件下に培養し(§2.2
参照)、必要ならば発現を誘導(§2.3参照)するこ
とと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を採取すること
と(§2.4参照)、ペリプラズムhGHを同定するこ
と(§2.5参照)とからなる。
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。
ル)」(Molecular cloning−A L
aboratory Manual,T.Maniat
is,E.F.Fritsch and J.Samb
rook,Cold Spring Harbor L
aboratory,1982) ・「分子遺伝学の実験」(Experiments i
n molecular genetics,J.H.
Miller,Cold Spring Harbor
Laboratory,1972)
を、以下の特性を有し、かつ100μg/mlのアンピ
シリンを添加した5mlの培地(LB培地)中に懸濁さ
せる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物(DIFCOからのバクトトリプトン) 10g 酵母抽出物 5g 塩化ナトリウム 5g 蒸溜水添加 1l であり、 ・加圧滅菌前にpHを7.3に調節した。
Lomb spectronic 20)での光学密
度、即ちOD600nmが約0.05になるように、細
菌懸濁液をLB培地中で希釈する。
D600nmが約0.2になるまで37℃でインキュベ
ーションした。
ピル−β−D−チオガラクトース(IPTG)をその最
終濃度が1mMになる量だけ添加する。ここで、IPT
Gはリプレッサー(通常はラクトース オペレータに結
合する)の作用を中和することによって、hGH前駆体
の合成を開始し、かつ維持するために用いる。
ical Chemistry 241(1966)3
055−3062)において、N.G.Nossalお
よびL.A.Heppelが発表したプロトコールを参
照してもよい。) a)細菌懸濁液の調製 2.2.d(誘導が必要とされない場合)のようにして
得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸
濁液の試料を採取し、OD600nmが約10になるよ
うにこれを処理(6000gで5分間遠心分離、上澄み
を除去、細菌をLB培地中に再度懸濁)する。
分離する。一定容量の残渣を、次の組成を有する溶液A
中に採取する。即ち、溶液Aは蒸溜水に下記のものを添
加することによって調製されたpH=7の緩衝液であ
る。
−HCl、即ち、Tris−HCl 最終濃度が30mMのように添加する。
A 最終濃度が1mMになるように添加する。
分離する。
g/100mlのスクロースを添加した溶液B中に、残
渣の一定量を注意深く採取し、直ちに用いる。
る。
れた脱イオン水中に再度静置する(一定容量で)。
nmは約10)を0℃で5分間放置する。
集 2.4.cで得られた懸濁液を、18,000gで10
分間遠心分離する。上澄みを集める。これには細胞周辺
腔に存在するたんぱく質が含まれる。
ジオイムノアッセイにかける(COATRIAR 125 I
−hGH kit−Biomerieux,Franc
e)。
とからなる。
定められた量だけ導入し、予め定められた量の第一の抗
−hGH抗体を目当てとして、同定されるべき分析試料
中に含まれるhGHとの間で競合させる反応。
二の抗体に結合させ、固体物質に固定する反応。
で標識したhGHの比率は、分析試料中のhGHの量に
逆比例する。
ク 1)方法論 2.4.dで得られた上澄みから採集したhGHの性質
をチェックした。
より実施した。
の、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分離
(文献(U.K.Laemmli,Nature 22
7(1970)680−685)中にLaemmliに
より記載されたプロトコールによる)。
H前駆体が、それぞれの見かけの分子量に応じて2つの
異なった点に移動する。
トロセルロースフィルター上への移動(文献(H.To
wbin et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 76(1979)4350−43
54)の技術に従う)。
tte,anal.Biochem.112(198
1)195−203)に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。
(Tris−HCl 10mM,NaCl 170m
M,KI 1mM)で10分間濯ぐ。
で30分間、緩衝液B(3g/100mlの割合で牛血
清アルブミンを添加した緩衝液A)に接触させる。
で18時間、免疫血清(成熟hGHおよびその前駆体を
認識する多クローン性抗体)に接触させる。
で濯ぐ。
で6時間、1ml当り0.1マイクロキュリーのヨウ素
125で標識されたプロテインAの溶液と接触させる。
乾燥する。
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムhGHは分子の
約98%が成熟形で存在することに注目すべきである。
腸菌CNCM I−528株/p212,6によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
I−528株)の方が、非突然変異株(T株)よりも2
倍以上高い効率で、ペリプラズムhGHを生産できるこ
とを示している。
腸菌CNCM I−528株/p163,1と、大腸菌
T株/p164,1と、大腸菌CNCM I−528株
/p164,1によってそれぞれ生産されたペリプラズ
ムhGHのレベルの比較。
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。
ックおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採
取した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測
定したところ、次の結果が得られた。
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg
数) T株/p212,6 0.86 CNCM 2.00 I−528株/p212,6
が、その発現に関して、シグナルの制御下においてcA
MPおよびCRPの併合作用に感受性であると考えられ
るか否かにかかわらず、突然変異株(CNCM I−5
28株)は著しく増大した量のペリプラズムhGHを生
産できると考えられる(一例では約30%の増加、他の
例では70%の増加)。
腸菌CNCM I−528株/p200,3によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
クおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取
した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定
したところ、次の結果が得られた。
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りng
数) T株/p200,3 200 CNCM 512 I−528株/p200,3
は、非突然変異株(T株)よりも2倍以上高い効率で、
ペリプラズムhGHを生産できると考えられる。
るか否かにかかわらず、得られる効果が同じオーダーで
あることを示している。
p212,6によって、cAMPの存在下または非存在
下でそれぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの
比較。
せたところ、次の結果が得られた。これらの結果は、い
ずれも浸透圧ショックおよび濁度をOD600nm=1
に調節した後に、採取した上澄み1ml当りの成熟ペリ
プラズムhGHの量(μg)を測定したものである。
ていない菌株の特徴を有している。
は、処理条件の選択下でcya変異の発現においてのみ
異なる親株よりも高い効率で、ペリプラズムhGHを生
産できると考えられる。
ズムhGHレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。
結果が得られた。
をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄み1
ml当りのペリプラズムhGHのμg数で表した。
ードの方法(M.M.Bradford,Analyt
ical Biochemistry 72(197
6)248−264)で測定し、浸透圧ショックおよび
濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄
み1ml当りのペリプラズムhGHのmg数で表した。
ぱく質レベルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプ
ラズム酵素の生産が、野生型菌株の存在により得られた
値およびクロモソームがcya変異(外因性cAMP添
加のないCNCM I−529株)またはcrp変異
(外因性cAMP添加のあるA株)を有する菌株の存在
下での実質的な量に比較して、減少することを示してい
る。同時に、突然変異の一方または他方が発現すると
き、ペリプラズムgHGの生産は大幅に増大する。
212,6とI−529株/p212,6によってそれ
ぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りの成熟したペリプラズムhGHの量
(μg)を測定したところ、次の結果が得られた。
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg
数) T株/p212,6 2.08 CNCM 2.07 I−529株/p212,6
p欠失変異を有するA株と、クロモソームが同様のcy
a欠失変異を有するI−529株は、同一の挙動をする
と考えられる。
固定後にのみ転写が開始され得るオペロンの発現を制限
しまたは抑制する変異をもった菌株を使用することによ
って、明白な利点がもたらされることを示している。:
事実、これらの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の
生産を実質的に増大(これらの例では、成熟形でのたん
ぱく質について98%)させることが可能である。例E
では、このような細菌の使用によって与えられる絶対的
な一次的利点(absolutely first−r
ate advantage)が強調される。:変異株
は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産
を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。;これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。
位置と配向を示す機能地図である。
位置と配向を示す機能地図である。
Claims (1)
- 【請求項1】 C.N.C.M.に寄託番号I−529
として寄託した大腸菌株であって、該菌株の染色体がc
ya遺伝子およびその発現を調節するDNA配列によっ
て形成される系に影響を与えるなくとも一つの突然変異
を有しているる菌株。
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