JPH09224685A - 細菌株及びプラスミド - Google Patents
細菌株及びプラスミドInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多くの技術分野で適用でき、特に有効成分が
たんぱく質である医薬の製造に適用できる細菌株の提
供。 【解決手段】 C.N.C.M.に寄託番号I−528
及びI−529としてそれぞれ寄託した菌株の一般的特
性を有する細菌株、及びC.N.C.M.に寄託番号I
−530として寄託したプラスミドの一般的特性を有す
るプラスミド。
たんぱく質である医薬の製造に適用できる細菌株の提
供。 【解決手段】 C.N.C.M.に寄託番号I−528
及びI−529としてそれぞれ寄託した菌株の一般的特
性を有する細菌株、及びC.N.C.M.に寄託番号I
−530として寄託したプラスミドの一般的特性を有す
るプラスミド。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、当該たんぱく質の
前駆体をコードするDNA配列体を当該細菌に導入し
て、特定の型の突然変異を担う(Carry)グラム陰
性菌を培養することによって、たんぱく質を得ることを
可能にする微生物学的方法に用いる細菌株及びプラスミ
ドに関する。
前駆体をコードするDNA配列体を当該細菌に導入し
て、特定の型の突然変異を担う(Carry)グラム陰
性菌を培養することによって、たんぱく質を得ることを
可能にする微生物学的方法に用いる細菌株及びプラスミ
ドに関する。
【0002】本発明は、多くの技術分野で適用でき、特
に有効成分がたんぱく質である医薬の製造に適用でき
る。
に有効成分がたんぱく質である医薬の製造に適用でき
る。
【0003】
【従来の技術】多数のたんぱく質は、翻訳後の成熟を受
けた後にのみ、生物学的活性を獲得することが知られて
いる。細胞質中で前駆体の形で生合成され、それから細
胞質から運び出されるたんぱく質の場合には、この成熟
の第1段階は、シグナルペプチドと称されるN未端をこ
の前駆体から酵素的に除去することであることが多い。
前駆体の形で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核
生物と真核生物の両方について知られている。このよう
なたんぱく質として特に言及できるものには、例えば、
大腸菌(Escherichia coli)の種など
により産生されるβ−ラクタマーゼ TEM−1とアル
カリ性 ホスファターゼ、黄色ブドウ球菌(Staph
ylococcus aureus)の種により産生さ
れるプロティンA、デンプン液化バチルス(Bacil
lus amyloliquefaciens)の種な
どにより産生されるα−アミラーゼ(これらは原核生物
由来のたんぱく質である)、また、ヒト成長ホルモン、
ヒトインシュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、
上皮成長因子(これらは真核細胞により産生されるたん
ぱく質である)などがある。
けた後にのみ、生物学的活性を獲得することが知られて
いる。細胞質中で前駆体の形で生合成され、それから細
胞質から運び出されるたんぱく質の場合には、この成熟
の第1段階は、シグナルペプチドと称されるN未端をこ
の前駆体から酵素的に除去することであることが多い。
前駆体の形で生合成されたこの型のたんぱく質は、原核
生物と真核生物の両方について知られている。このよう
なたんぱく質として特に言及できるものには、例えば、
大腸菌(Escherichia coli)の種など
により産生されるβ−ラクタマーゼ TEM−1とアル
カリ性 ホスファターゼ、黄色ブドウ球菌(Staph
ylococcus aureus)の種により産生さ
れるプロティンA、デンプン液化バチルス(Bacil
lus amyloliquefaciens)の種な
どにより産生されるα−アミラーゼ(これらは原核生物
由来のたんぱく質である)、また、ヒト成長ホルモン、
ヒトインシュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、
上皮成長因子(これらは真核細胞により産生されるたん
ぱく質である)などがある。
【0004】更に、当該たんぱく質を製造するために、
天然のたんぱく質前駆体をコードするDNA配列体を担
うプラスミドを用いて形質転換したグラム陰性菌を、使
用できることが知られている(G.L.Gray et
al.,Biotechnology 2(198
4)161−165;G.L.Gray et a
l.,Gene 39(1985)247−254)。
この場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行わ
れる。細胞質区画で、DNA配列体が転写され、それか
ら対応するメッセンジャーRNAが翻訳される。このよ
うにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移
動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナ
ルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前
駆体に対応するたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができ
る。
天然のたんぱく質前駆体をコードするDNA配列体を担
うプラスミドを用いて形質転換したグラム陰性菌を、使
用できることが知られている(G.L.Gray et
al.,Biotechnology 2(198
4)161−165;G.L.Gray et a
l.,Gene 39(1985)247−254)。
この場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行わ
れる。細胞質区画で、DNA配列体が転写され、それか
ら対応するメッセンジャーRNAが翻訳される。このよ
うにして生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移
動する間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナ
ルペプチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前
駆体に対応するたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができ
る。
【0005】上記のDNA配列体が、シグナルペプチド
に関して、天然の前駆体(つまり、通常の産生を行う細
胞で合成される形)と異なる前駆体をコードする場合に
も、類似する結果が得られている。例えば、真核生物由
来のたんぱく質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペ
プチドが結合した前駆体が合成された(K.Talma
dge et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,77(1980)3988−39
92;G.L.Gray et al.,Gene 3
9(1985)247−254)。
に関して、天然の前駆体(つまり、通常の産生を行う細
胞で合成される形)と異なる前駆体をコードする場合に
も、類似する結果が得られている。例えば、真核生物由
来のたんぱく質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペ
プチドが結合した前駆体が合成された(K.Talma
dge et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,77(1980)3988−39
92;G.L.Gray et al.,Gene 3
9(1985)247−254)。
【0006】また、細菌に、オペロンの発現を制限する
または、抑制さえも行う突然変異を起こせることが知ら
れている。このオペロンの転写は、アデノシン3′,
5′−環状リン酸(cAMP)がCRP(環状AMPレ
セプタたんぱく質)(これはCAP(カタボライト活性
化たんぱく質)とも称される)と会合して生じるcAM
P−CRP複合体が、このオペロンの調節要素へ固定さ
れた後にのみ開始されるような転写である。これらのオ
ペロンの機能に関しては、「オペロン」(TheOpe
ron,J.H.Miller and W.S.Re
znikoff,Cold Spring Harbo
r Laboratory,1980)中の「Lacプ
ロモータ」(W.S.Reznikoff and
J.N.Abelson)の章に説明されている。
または、抑制さえも行う突然変異を起こせることが知ら
れている。このオペロンの転写は、アデノシン3′,
5′−環状リン酸(cAMP)がCRP(環状AMPレ
セプタたんぱく質)(これはCAP(カタボライト活性
化たんぱく質)とも称される)と会合して生じるcAM
P−CRP複合体が、このオペロンの調節要素へ固定さ
れた後にのみ開始されるような転写である。これらのオ
ペロンの機能に関しては、「オペロン」(TheOpe
ron,J.H.Miller and W.S.Re
znikoff,Cold Spring Harbo
r Laboratory,1980)中の「Lacプ
ロモータ」(W.S.Reznikoff and
J.N.Abelson)の章に説明されている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】そのような生合成能が
減少した細菌(阻害されたオペロンは、多くの酵素の合
成を支配するので)が、始めから、たんぱく質工業生産
用の好ましい宿主を形成できないことは明らかであっ
た。
減少した細菌(阻害されたオペロンは、多くの酵素の合
成を支配するので)が、始めから、たんぱく質工業生産
用の好ましい宿主を形成できないことは明らかであっ
た。
【0008】グレイらによる1984年と1985年の
報告(上記)には、当該たんぱく質の前駆体をコードす
るDNA配列体を導入した細菌を培養することによっ
て、たんぱく質を製造するこれまでの研究が、調節要素
(特にプロモータ)を特に選択することによりプラスミ
ド構造の効率を高めることに向けられていたことが示さ
れている。
報告(上記)には、当該たんぱく質の前駆体をコードす
るDNA配列体を導入した細菌を培養することによっ
て、たんぱく質を製造するこれまでの研究が、調節要素
(特にプロモータ)を特に選択することによりプラスミ
ド構造の効率を高めることに向けられていたことが示さ
れている。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者は細菌宿主に関
心を払い、別の方向の研究を行った。驚くべきことに、
転写がcAMP−CRP複合体の固定に依存するオペロ
ンの発現を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1
つの突然変異を担うクロモソームを有するグラム陰性菌
が、前駆体の形で生合成されるたんぱく質の工業生産の
ための好ましい宿主を構成することが見出された。
心を払い、別の方向の研究を行った。驚くべきことに、
転写がcAMP−CRP複合体の固定に依存するオペロ
ンの発現を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1
つの突然変異を担うクロモソームを有するグラム陰性菌
が、前駆体の形で生合成されるたんぱく質の工業生産の
ための好ましい宿主を構成することが見出された。
【0010】第1の特徴によれば、本発明は、当該たん
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を導入したグ
ラム陰性菌を培養することによって、たんぱく質を生産
する微生物学的方法に関する。この方法は、転写がcA
MP−CRP複合体の固定に依存するオペロンの発現を
制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1つの突然変
異を担うクロモソームを有する細菌種の使用を包含す
る。
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体を導入したグ
ラム陰性菌を培養することによって、たんぱく質を生産
する微生物学的方法に関する。この方法は、転写がcA
MP−CRP複合体の固定に依存するオペロンの発現を
制限するまたは抑制さえも行う少なくとも1つの突然変
異を担うクロモソームを有する細菌種の使用を包含す
る。
【0011】この突然変異は、cAMPの細胞内濃度を
減少する傾向があるもの;機能形のCRP合成を制限ま
たは抑制するもの;突然変異形のCRPの合成を導き、
DNAへの固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ち
るようなcAMP−CRP複合体の形成を起こすもの;
および、当該複合体の固定が妨げられるまたは比較的に
効率が落ちるような仕方に、DNAに対するcAMP−
CRP複合体の固定の部位を修飾するものである。これ
らは、発現が温度などのパラメータに依存する条件突然
変異であってよい。
減少する傾向があるもの;機能形のCRP合成を制限ま
たは抑制するもの;突然変異形のCRPの合成を導き、
DNAへの固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ち
るようなcAMP−CRP複合体の形成を起こすもの;
および、当該複合体の固定が妨げられるまたは比較的に
効率が落ちるような仕方に、DNAに対するcAMP−
CRP複合体の固定の部位を修飾するものである。これ
らは、発現が温度などのパラメータに依存する条件突然
変異であってよい。
【0012】これらの突然変異の中で、クロモソーム遺
伝子cya自身またはその発現を調節するDNA配列体
に、この遺伝子がコードするアデニル酸シクラーゼが合
成されないか、またはその特異的な活性、すなわちアデ
ノシン三リン酸(ATP)のcAMPへの変換を行うこ
とができない形で合成するように影響を及ぼす突然変異
が、特に特徴づけられる。クロモソーム遺伝子crp自
身またはその発現を調節するDNA配列体に、この遺伝
子がコードするCRPが合成されないか、またはDNA
への効率的な固定を可能にする十分に安定なcAMP−
CRP複合体が形成されないような突然変異形で合成す
るように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜
上、これらの突然変異をここではcya突然変異および
crp突然変異と称する。
伝子cya自身またはその発現を調節するDNA配列体
に、この遺伝子がコードするアデニル酸シクラーゼが合
成されないか、またはその特異的な活性、すなわちアデ
ノシン三リン酸(ATP)のcAMPへの変換を行うこ
とができない形で合成するように影響を及ぼす突然変異
が、特に特徴づけられる。クロモソーム遺伝子crp自
身またはその発現を調節するDNA配列体に、この遺伝
子がコードするCRPが合成されないか、またはDNA
への効率的な固定を可能にする十分に安定なcAMP−
CRP複合体が形成されないような突然変異形で合成す
るように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜
上、これらの突然変異をここではcya突然変異および
crp突然変異と称する。
【0013】cyaおよびcrp突然変異は任意の種類
のものでよいが、特に可能なものは、置換による突然変
異、挿入による突然変異、変換による突然変異、または
例えば欠失による突然変異である。突然変異は、一対の
ヌクレオチドのみに影響を与えるものであってよいが、
この型の点突然変異は可逆的なので、幾対かのヌクレオ
チドに同時に影響を与える不可逆的突然変異が好まし
い。多重点突然変異が更に可能性がある。cya突然変
異の場合には、cAMPは合成されず、cAMP−CR
P複合体の形成は起き得ない。外来性cAMPの添加に
よって、この合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を
回復することが可能となる。crp突然変異の場合に
は、CRPはもはや機能形では合成されず、同様に、c
AMP−CRP複合体の形成は起き得ない。ここでは、
外来性cAMPの添加は、乱された細胞機能の回復には
無力である。
のものでよいが、特に可能なものは、置換による突然変
異、挿入による突然変異、変換による突然変異、または
例えば欠失による突然変異である。突然変異は、一対の
ヌクレオチドのみに影響を与えるものであってよいが、
この型の点突然変異は可逆的なので、幾対かのヌクレオ
チドに同時に影響を与える不可逆的突然変異が好まし
い。多重点突然変異が更に可能性がある。cya突然変
異の場合には、cAMPは合成されず、cAMP−CR
P複合体の形成は起き得ない。外来性cAMPの添加に
よって、この合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を
回復することが可能となる。crp突然変異の場合に
は、CRPはもはや機能形では合成されず、同様に、c
AMP−CRP複合体の形成は起き得ない。ここでは、
外来性cAMPの添加は、乱された細胞機能の回復には
無力である。
【0014】本発明は、cya遺伝子およびその発明を
調節するDNA配列体により形成される系、またはcr
p遺伝子およびその発現を調節するDNA配列体により
形成される系、またはその両方の系に影響を及ぼす少な
くとも1つの突然変異を担うクロモソームを有する細菌
株を使用する上に定めた微生物学的方法に、有利に関連
している。
調節するDNA配列体により形成される系、またはcr
p遺伝子およびその発現を調節するDNA配列体により
形成される系、またはその両方の系に影響を及ぼす少な
くとも1つの突然変異を担うクロモソームを有する細菌
株を使用する上に定めた微生物学的方法に、有利に関連
している。
【0015】本発明では、cAMPが、種々のオペロン
の発現の制御を行うCRPとカップリングしている任意
のグラム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この
型の細菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対し
て驚く程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利と
なる(Sushil Kumar,J.Bact.12
5(1976)545−555)。好ましい細菌の種は
大腸菌である。
の発現の制御を行うCRPとカップリングしている任意
のグラム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この
型の細菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対し
て驚く程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利と
なる(Sushil Kumar,J.Bact.12
5(1976)545−555)。好ましい細菌の種は
大腸菌である。
【0016】他の特徴によれば、本発明は、使用する突
然変異細菌株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学
的方法に関する。
然変異細菌株が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学
的方法に関する。
【0017】本発明者は特に、1986年2月17日に
国立微生物寄託機関(Collection Nati
onale de Cultures de Micr
oorganismes(C.N.C.M.),Par
is, France)に寄託した大腸菌の2つの突然
変異菌株を選択した。菌株の1つは点crp突然変異を
担い(寄託番号I−528)、他の菌株は欠失による非
点cya突然変異を担う(寄託番号I−529)。
国立微生物寄託機関(Collection Nati
onale de Cultures de Micr
oorganismes(C.N.C.M.),Par
is, France)に寄託した大腸菌の2つの突然
変異菌株を選択した。菌株の1つは点crp突然変異を
担い(寄託番号I−528)、他の菌株は欠失による非
点cya突然変異を担う(寄託番号I−529)。
【0018】本発明は、好ましくは、突然変異菌株が、
寄託番号I−528およびI−529としてC.N.
C.M.に寄託された菌株の一方または他方の特性を有
する上記の微生物学的方法に関する。
寄託番号I−528およびI−529としてC.N.
C.M.に寄託された菌株の一方または他方の特性を有
する上記の微生物学的方法に関する。
【0019】本発明の方法によって、多くのたんぱく質
を得ることが可能となる。製造を望むたんぱく質が、前
駆体の形で天然に生合成されるか否かはほとんど重要で
ないことを理解する必要がある。また、この方法は非天
然のたんぱく質の製造にも適している。例えば、1次構
造を2つまたはそれ以上の既知のたんぱく質から選択し
たハイブリッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、
この方法は、N未端にシグナルペプチドとして挙動する
ペプチドが結合した上記のたんぱく質をコードするDN
A配列体の製造を満足する。
を得ることが可能となる。製造を望むたんぱく質が、前
駆体の形で天然に生合成されるか否かはほとんど重要で
ないことを理解する必要がある。また、この方法は非天
然のたんぱく質の製造にも適している。例えば、1次構
造を2つまたはそれ以上の既知のたんぱく質から選択し
たハイブリッドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、
この方法は、N未端にシグナルペプチドとして挙動する
ペプチドが結合した上記のたんぱく質をコードするDN
A配列体の製造を満足する。
【0020】本発明による方法は、ヒト成長ホルモン
(以後、hGHと称する)の製造に対して特に有利であ
る。
(以後、hGHと称する)の製造に対して特に有利であ
る。
【0021】図1は、hGHが合成される下垂体細胞か
ら単離された天然hGH前駆体の1つをコードするDN
A配列体、および、この前駆体のアミノ酸配列体を示し
ている。最初の26のアミノ酸(図中の−26位のアミ
ノ酸から数える)がシグナルペプチドを構成し、他の1
91のアミノ酸(ここでは1から191までの番号を付
ける)は実際のhGH(以後、「成熟hGH」と称す
る)のアミノ酸である。
ら単離された天然hGH前駆体の1つをコードするDN
A配列体、および、この前駆体のアミノ酸配列体を示し
ている。最初の26のアミノ酸(図中の−26位のアミ
ノ酸から数える)がシグナルペプチドを構成し、他の1
91のアミノ酸(ここでは1から191までの番号を付
ける)は実際のhGH(以後、「成熟hGH」と称す
る)のアミノ酸である。
【0022】次の表1に図1中で使用したアミノ酸の略
語を説明する。
語を説明する。
【0023】表1 アミノ酸 略語 アラニン A アルギニン R アスパラギン N アスパラギン酸 D システイン C グルタミン Q グルタミン酸 E グリシン G ヒスチジン H イソロイシン I ロイシン L リジン K メチオニン M フェニルアラニン F プロリン P セリン S トレオニン T トリプトファン W チロシン Y バリン V
【0024】図1に示したDNA配列体のコドンでは、
通常の意味でA,C,T,Gを使用している。これらは
それぞれ、アデニン、シトシン、チミン、グアニンの塩
基を示す。
通常の意味でA,C,T,Gを使用している。これらは
それぞれ、アデニン、シトシン、チミン、グアニンの塩
基を示す。
【0025】本発明を実施するためには、突然変異細菌
が、所望のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列
体を含むことが必要である。「前駆体」の語は、それが
存在する場合は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグ
ナルペプチドを修飾して得られた上記の天然前駆体の任
意の誘導体を、更に、シグナルペプチドとして挙動でき
るペプチドが上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体
を意味するものとして理解される。前駆体は特に、既知
の原核および真核生物のシグナルペプチドまたはその誘
導体を包含する群から選択できる。
が、所望のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列
体を含むことが必要である。「前駆体」の語は、それが
存在する場合は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグ
ナルペプチドを修飾して得られた上記の天然前駆体の任
意の誘導体を、更に、シグナルペプチドとして挙動でき
るペプチドが上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体
を意味するものとして理解される。前駆体は特に、既知
の原核および真核生物のシグナルペプチドまたはその誘
導体を包含する群から選択できる。
【0026】上記たんぱく質の前駆体をコードするDN
A配列体を、プラスミドなどの複製可能な発現ベクター
により細菌に導入できる。上記配列体の発現に必要な調
節要素(特に、プロモータ)が、その機能を行うために
その配列体の付近に位置することが必要であることは明
白である。
A配列体を、プラスミドなどの複製可能な発現ベクター
により細菌に導入できる。上記配列体の発現に必要な調
節要素(特に、プロモータ)が、その機能を行うために
その配列体の付近に位置することが必要であることは明
白である。
【0027】例えば、使用する細菌株内で複製できるこ
とを条件として、従来技術(G.L.Gray et
al.,Gene 39(1985)247−254)
に説明されているプラスミドを使用できる。これらのプ
ラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所望
のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が誘導
可能である必要はないことが示された。上記の配列体が
幾つかの複写として存在することも重要である。
とを条件として、従来技術(G.L.Gray et
al.,Gene 39(1985)247−254)
に説明されているプラスミドを使用できる。これらのプ
ラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所望
のたんぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が誘導
可能である必要はないことが示された。上記の配列体が
幾つかの複写として存在することも重要である。
【0028】本発明者は、実際に、細菌細胞内での複製
の後、細胞当り50ないし300の比率で複写が存在
し、それぞれの複写が所望のたんぱく質の前駆体をコー
ドするDNA配列体の複写を担うことができる幾つかの
プラスミドを構築し、選択した。これらのプラスミドの
1つによって形質転換された大腸菌MC1061株を、
1986年2月17日にC.N.C.M.に寄託した。
この菌株は寄託番号I−530である。便宜上、以後の
説明では、寄託番号I−530としてC.N.C.M.
に寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミ
ド(以後、内部参照によりp163,1とも称する)
は、hGHの天然の前駆体の1つをコードするDNA配
列体を担う。図1に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞
で合成された前駆体の1つから決定された配列体と同一
である。これを、 1)5′未端から始まり、RNAポリメラーゼ認識部位
(−35位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、
文献(M.Takanami et al.,Natu
re 260(1976)297−302)に定められ
ている)を含むトリプトファン プロモーターの断片、
および、 2)RNAポリメラーゼ認識部位(−35位に位置する
そのヌクレオチドの中央の部位)と、固定部位(−10
位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、文献
(D.Pribnow,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA72(1975)784−789)
に定められている)とを分離している領域と5′未端と
の間の部分を除いたプロモーターオペレータ(prom
oter−operator)ラクトース UV5が結
合したハイブリッド プロモーターオペレータの制御下
に置いた。
の後、細胞当り50ないし300の比率で複写が存在
し、それぞれの複写が所望のたんぱく質の前駆体をコー
ドするDNA配列体の複写を担うことができる幾つかの
プラスミドを構築し、選択した。これらのプラスミドの
1つによって形質転換された大腸菌MC1061株を、
1986年2月17日にC.N.C.M.に寄託した。
この菌株は寄託番号I−530である。便宜上、以後の
説明では、寄託番号I−530としてC.N.C.M.
に寄託されたこのプラスミドを参照する。このプラスミ
ド(以後、内部参照によりp163,1とも称する)
は、hGHの天然の前駆体の1つをコードするDNA配
列体を担う。図1に示すこの配列体は、ヒト下垂体細胞
で合成された前駆体の1つから決定された配列体と同一
である。これを、 1)5′未端から始まり、RNAポリメラーゼ認識部位
(−35位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、
文献(M.Takanami et al.,Natu
re 260(1976)297−302)に定められ
ている)を含むトリプトファン プロモーターの断片、
および、 2)RNAポリメラーゼ認識部位(−35位に位置する
そのヌクレオチドの中央の部位)と、固定部位(−10
位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、文献
(D.Pribnow,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA72(1975)784−789)
に定められている)とを分離している領域と5′未端と
の間の部分を除いたプロモーターオペレータ(prom
oter−operator)ラクトース UV5が結
合したハイブリッド プロモーターオペレータの制御下
に置いた。
【0029】図2に、上記のプラスミドについて、主要
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
【0030】
【表1】
【0031】この地図は、また、一定の制限酵素、つま
り、SalI、BamHI、HindIII 、PstI、
EcoRI、XhoI、およびPvuIの酵素の作用部
位を示している。
り、SalI、BamHI、HindIII 、PstI、
EcoRI、XhoI、およびPvuIの酵素の作用部
位を示している。
【0032】プラスミドp163,1中に突然変異UV
5(「オペロン」中の「Lacプロモータ」の章(前記
参照)に説明されている)が存在するために、hGH前
駆体をコードするDNA配列体の発現が、cAMPおよ
ひCRPの併合作用に不感受性となる。このプラスミド
は、その一般的特性を仮定して、天然のhGH前駆体の
1つをコードするDNA配列体を、他の前駆体特に他の
たんぱく質の前駆体をコードする配列体に置換すること
によって、他のプラスミドを構築するために使用でき
る。
5(「オペロン」中の「Lacプロモータ」の章(前記
参照)に説明されている)が存在するために、hGH前
駆体をコードするDNA配列体の発現が、cAMPおよ
ひCRPの併合作用に不感受性となる。このプラスミド
は、その一般的特性を仮定して、天然のhGH前駆体の
1つをコードするDNA配列体を、他の前駆体特に他の
たんぱく質の前駆体をコードする配列体に置換すること
によって、他のプラスミドを構築するために使用でき
る。
【0033】他の特徴によれば、本発明は、所望のたん
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が、その発現
を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担われる上
記の微生物学的方法に関する。特に、上記のDNA配列
体が、C.N.C.M.に寄託された寄託番号I−53
0のプラスミドの一般的特性を有するプラスミドによっ
て担われる上記の微生物学的方法に関する。
ぱく質の前駆体をコードするDNA配列体が、その発現
を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担われる上
記の微生物学的方法に関する。特に、上記のDNA配列
体が、C.N.C.M.に寄託された寄託番号I−53
0のプラスミドの一般的特性を有するプラスミドによっ
て担われる上記の微生物学的方法に関する。
【0034】他の特徴によれば、本発明は、上記細菌株
が、hGH前駆体をコードするDNA配列体を含有する
上記の微生物学的方法に関する。
が、hGH前駆体をコードするDNA配列体を含有する
上記の微生物学的方法に関する。
【0035】他の特徴によれば、本発明は、寄託番号I
−528およびI−529としてC.N.C.M.に寄
託された細菌株に関する。
−528およびI−529としてC.N.C.M.に寄
託された細菌株に関する。
【0036】更に他の特徴によれば、本発明は、寄託番
号I−530としてC.N.C.M.に寄託されたプラ
スミドに関する。
号I−530としてC.N.C.M.に寄託されたプラ
スミドに関する。
【0037】次に、具体例を用いて本発明を説明する。
当然、本発明は、これらの例で説明されている本発明の
方法の適用には制限されない。本発明には、特許請求の
範囲によって定められる範囲の変法の全てが含まれる。
当然、本発明は、これらの例で説明されている本発明の
方法の適用には制限されない。本発明には、特許請求の
範囲によって定められる範囲の変法の全てが含まれる。
【0038】
【実施例】例 I.使用する細菌およびプラスミド 4つの細菌株および4つのプラスミドを使用した。
【0039】これらの例では、C.N.C.M.に寄託
した寄託番号I−528およびI−529の菌株とは別
に、他に次の2つの大腸菌の菌株に言及する。
した寄託番号I−528およびI−529の菌株とは別
に、他に次の2つの大腸菌の菌株に言及する。
【0040】・欠失による非点cya突然変異および欠
失による非点crp突然変異の両方を担う菌株。以後、
内部参照によりAと称する。C.N.C.M.I−52
9株はこの菌株から誘導される。
失による非点crp突然変異の両方を担う菌株。以後、
内部参照によりAと称する。C.N.C.M.I−52
9株はこの菌株から誘導される。
【0041】・cAMP−CRP複合体の固定後にのみ
転写が開始されるオペロンの発現を、制限または抑制で
きる突然変異を担わない菌株。MC1061(大腸菌、
Genetic Sock Center,New−H
aven,Connecticut,USA)として知
られている。以後、内部参照によりTと称する。C.
N.C.M.I−528株はこの菌株から誘導される。
転写が開始されるオペロンの発現を、制限または抑制で
きる突然変異を担わない菌株。MC1061(大腸菌、
Genetic Sock Center,New−H
aven,Connecticut,USA)として知
られている。以後、内部参照によりTと称する。C.
N.C.M.I−528株はこの菌株から誘導される。
【0042】これらの例では、C.N.C.M.に寄託
した寄託番号I−530のプラスミドとは別に、他に3
つのプラスミドに言及する。これらは内部参照により、
p164,1、p200,3、p212,6と称する。
した寄託番号I−530のプラスミドとは別に、他に3
つのプラスミドに言及する。これらは内部参照により、
p164,1、p200,3、p212,6と称する。
【0043】プラスミドp164,1はプラスミドp1
63,1と非常に類似しており、本質的な相違は突然変
異UV5が存在しないことである。
63,1と非常に類似しており、本質的な相違は突然変
異UV5が存在しないことである。
【0044】プラスミドp212,6はプラスミドp1
63,1と類似している。図3に、これについて、主要
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
63,1と類似している。図3に、これについて、主要
なDNA配列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図
中に使用した記号の意味は次の通りである。
【0045】
【表2】
【0046】図2に示したプラスミドp163,1と同
様に、一定の制限酵素の作用部位を図3に示す。
様に、一定の制限酵素の作用部位を図3に示す。
【0047】プラスミドp200,3はプラスミドp2
12,6と等価であり、hGH前駆体をコードするDN
A配列体の発現に関する非抑制特性のために選択した。
12,6と等価であり、hGH前駆体をコードするDN
A配列体の発現に関する非抑制特性のために選択した。
【0048】天然のhGH前駆体の1つをコードし、プ
ラスミドp212,6およびp200,3により担われ
るDNA配列体は、図1に示す配列体と、2つの置換に
おいて異なっている。つまり、コドンACCは、−24
位に位置するアミノ酸をコードするコドンACAに置換
され、同様に、コドンTCTは、−22位に位置するア
ミノ酸をコードするコドンTCCに置換された。
ラスミドp212,6およびp200,3により担われ
るDNA配列体は、図1に示す配列体と、2つの置換に
おいて異なっている。つまり、コドンACCは、−24
位に位置するアミノ酸をコードするコドンACAに置換
され、同様に、コドンTCTは、−22位に位置するア
ミノ酸をコードするコドンTCCに置換された。
【0049】II.一般的方法論 行なった実験は、問題の宿主ベクター対を予め調製し(
§2.1参照)、宿主がhGH前駆体をコードするDN
A配列体を発現できるような条件下に培養し(§2.2
参照)、必要ならば発現を誘導(§2.3参照)するこ
とと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を採取すること
と(§2.4参照)、ペリプラズムhGHを同定するこ
と(§2.5参照)とからなる。
§2.1参照)、宿主がhGH前駆体をコードするDN
A配列体を発現できるような条件下に培養し(§2.2
参照)、必要ならば発現を誘導(§2.3参照)するこ
とと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を採取すること
と(§2.4参照)、ペリプラズムhGHを同定するこ
と(§2.5参照)とからなる。
【0050】2.1.宿主ベクター対の調製 当業者に知られており、特に以下の著書に記載されてい
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。
【0051】・「分子クローニング(実験室マニア
ル)」(Molecular cloning−A L
aboratory Manual,T.Maniat
is,E.F.Fritsch and J.Samb
rook,Cold Spring Harbor L
aboratory,1982) ・「分子遺伝学の実験」(Experiments i
n molecular genetics,J.H.
Miller,Cold Spring Harbor
Laboratory,1972) 2.2.培養 a)接種 固体培地(LB培地+寒天)で得られた分離コロニー
を、以下の特性を有し、かつ100μg/mlのアンピ
シリンを添加した5mlの培地(LB培地)中に懸濁さ
せる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物(DIFCOからのバクトトリプトン) 10g 酵母抽出物 5g 塩化ナトリウム 5g 蒸溜水添加 1l であり、 ・加圧滅菌前にpHを7.3に調節した。
ル)」(Molecular cloning−A L
aboratory Manual,T.Maniat
is,E.F.Fritsch and J.Samb
rook,Cold Spring Harbor L
aboratory,1982) ・「分子遺伝学の実験」(Experiments i
n molecular genetics,J.H.
Miller,Cold Spring Harbor
Laboratory,1972) 2.2.培養 a)接種 固体培地(LB培地+寒天)で得られた分離コロニー
を、以下の特性を有し、かつ100μg/mlのアンピ
シリンを添加した5mlの培地(LB培地)中に懸濁さ
せる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物(DIFCOからのバクトトリプトン) 10g 酵母抽出物 5g 塩化ナトリウム 5g 蒸溜水添加 1l であり、 ・加圧滅菌前にpHを7.3に調節した。
【0052】b)一次インキュベーション 37℃、18時間で培養菌が定常的な成長相に達する。
【0053】c)希釈 600nmにおける読み(分光光度計 Bausch−
Lomb spectronic 20)での光学密
度、即ちOD600nmが約0.05になるように、細
菌懸濁液をLB培地中で希釈する。
Lomb spectronic 20)での光学密
度、即ちOD600nmが約0.05になるように、細
菌懸濁液をLB培地中で希釈する。
【0054】d)二次インキュベーション 2.2.cに従って得られた細菌懸濁液50mlを、O
D600nmが約0.2になるまで37℃でインキュベ
ーションした。
D600nmが約0.2になるまで37℃でインキュベ
ーションした。
【0055】2.3.誘導 2.2.dに従って得られた細菌懸濁液中に、イソプロ
ピル−β−D−チオガラクトース(IPTG)をその最
終濃度が1mMになる量だけ添加する。ここで、IPT
Gはリプレッサー(通常はラクトース オペレータに結
合する)の作用を中和することによって、hGH前駆体
の合成を開始し、かつ維持するために用いる。
ピル−β−D−チオガラクトース(IPTG)をその最
終濃度が1mMになる量だけ添加する。ここで、IPT
Gはリプレッサー(通常はラクトース オペレータに結
合する)の作用を中和することによって、hGH前駆体
の合成を開始し、かつ維持するために用いる。
【0056】2.4.浸透圧ショック (文献(The Journal of Biolog
ical Chemistry 241(1966)3
055−3062)において、N.G.Nossalお
よびL.A.Heppelが発表したプロトコールを参
照してもよい。) a)細菌懸濁液の調製 2.2.d(誘導が必要とされない場合)のようにして
得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸
濁液の試料を採取し、OD600nmが約10になるよ
うにこれを処理(6000gで5分間遠心分離、上澄み
を除去、細菌をLB培地中に再度懸濁)する。
ical Chemistry 241(1966)3
055−3062)において、N.G.Nossalお
よびL.A.Heppelが発表したプロトコールを参
照してもよい。) a)細菌懸濁液の調製 2.2.d(誘導が必要とされない場合)のようにして
得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られた懸
濁液の試料を採取し、OD600nmが約10になるよ
うにこれを処理(6000gで5分間遠心分離、上澄み
を除去、細菌をLB培地中に再度懸濁)する。
【0057】b)洗浄 2.4.aで得られた懸濁液を6000gで5分間遠心
分離する。
分離する。
【0058】一定容量の残渣を、次の組成を有する溶液
A中に採取する。即ち、溶液Aは蒸溜水に下記のものを
添加することによって調製されたpH=7の緩衝液であ
る。
A中に採取する。即ち、溶液Aは蒸溜水に下記のものを
添加することによって調製されたpH=7の緩衝液であ
る。
【0059】・トリ(ヒドロキシメチル)アミノエタン
−HCl、即ち、Tris−HCl 最終濃度が30mMのように添加する。
−HCl、即ち、Tris−HCl 最終濃度が30mMのように添加する。
【0060】・エチレンジアミン四酢酸、即ち、EDT
A 最終濃度が1mMになるように添加する。
A 最終濃度が1mMになるように添加する。
【0061】c)スクロースの作用 2.4.bで得られた懸濁液を6000gで5分間遠心
分離する。
分離する。
【0062】溶液Aに対応する組成を有し、かつ、15
g/100mlのスクロースを添加した溶液B中に、残
渣の一定量を注意深く採取し、直ちに用いる。
g/100mlのスクロースを添加した溶液B中に、残
渣の一定量を注意深く採取し、直ちに用いる。
【0063】その懸濁液を20℃で10分間放置する。
【0064】それから、6000gで5分間遠心分離す
る。
る。
【0065】遠心管を氷水中に静置する。
【0066】上澄みを注意深く除去し、氷水温度に保た
れた脱イオン水中に再度静置する(一定容量で)。
れた脱イオン水中に再度静置する(一定容量で)。
【0067】この方法で調製された懸濁液(OD600
nmは約10)を0℃で5分間放置する。
nmは約10)を0℃で5分間放置する。
【0068】d)細胞周辺腔に存在するたんぱく質の採
集 2.4.cで得られた懸濁液を、18,000gで10
分間遠心分離する。
集 2.4.cで得られた懸濁液を、18,000gで10
分間遠心分離する。
【0069】上澄みを集める。これには細胞周辺腔に存
在するたんぱく質が含まれる。
在するたんぱく質が含まれる。
【0070】2.5.ペリプラズムhGHの同定 a)方法論 2.4.dで得られた上澄みを、ヒト成長ホルモンのラ
ジオイムノアッセイにかける(COATRIAR 125 I
−hGH kit−Biomerieux,Franc
e)。
ジオイムノアッセイにかける(COATRIAR 125 I
−hGH kit−Biomerieux,Franc
e)。
【0071】この同定は、次の操作を連続して行なうこ
とからなる。
とからなる。
【0072】・ヨウ素125で標識されたhGHを予め
定められた量だけ導入し、予め定められた量の第一の抗
−hGH抗体を目当てとして、同定されるべき分析試料
中に含まれるhGHとの間で競合させる反応。
定められた量だけ導入し、予め定められた量の第一の抗
−hGH抗体を目当てとして、同定されるべき分析試料
中に含まれるhGHとの間で競合させる反応。
【0073】・第一の抗体を前記第一の抗体に対する第
二の抗体に結合させ、固体物質に固定する反応。
二の抗体に結合させ、固体物質に固定する反応。
【0074】インキュベーション後には、ヨウ素125
で標識したhGHの比率は、分析試料中のhGHの量に
逆比例する。
で標識したhGHの比率は、分析試料中のhGHの量に
逆比例する。
【0075】2.6.ペリプラズムhGHの特性チェッ
ク 1)方法論 2.4.dで得られた上澄みから採集したhGHの性質
をチェックした。
ク 1)方法論 2.4.dで得られた上澄みから採集したhGHの性質
をチェックした。
【0076】これは、次の操作を連続して行なうことに
より実施した。
より実施した。
【0077】・上澄み中に含まれる異なったたんぱく質
の、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分離
(文献(U.K.Laemmli,Nature 22
7(1970)680−685)中にLaemmliに
より記載されたプロトコールによる)。
の、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動による分離
(文献(U.K.Laemmli,Nature 22
7(1970)680−685)中にLaemmliに
より記載されたプロトコールによる)。
【0078】この方法では、成熟形のhGHおよびhG
H前駆体が、それぞれの見かけの分子量に応じて2つの
異なった点に移動する。
H前駆体が、それぞれの見かけの分子量に応じて2つの
異なった点に移動する。
【0079】・ゲル中に含まれる前記たんぱく質の、ニ
トロセルロースフィルター上への移動(文献(H.To
wbin et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 76(1979)4350−43
54)の技術に従う)。
トロセルロースフィルター上への移動(文献(H.To
wbin et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 76(1979)4350−43
54)の技術に従う)。
【0080】・バーネットの技術(W.W.Burne
tte,anal.Biochem.112(198
1)195−203)に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。
tte,anal.Biochem.112(198
1)195−203)に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。
【0081】・ニトロセルロースフィルターを緩衝液A
(Tris−HCl 10mM,NaCl 170m
M,KI 1mM)で10分間濯ぐ。
(Tris−HCl 10mM,NaCl 170m
M,KI 1mM)で10分間濯ぐ。
【0082】・ニトロセルロースフィルターを、37℃
で30分間、緩衝液B(3g/100mlの割合で牛血
清アルブミンを添加した緩衝液A)に接触させる。
で30分間、緩衝液B(3g/100mlの割合で牛血
清アルブミンを添加した緩衝液A)に接触させる。
【0083】・ニトロセルロースフィルターを、20℃
で18時間、免疫血清(成熟hGHおよびその前駆体を
認識する多クローン性抗体)に接触させる。
で18時間、免疫血清(成熟hGHおよびその前駆体を
認識する多クローン性抗体)に接触させる。
【0084】・ニトロセルロースフィルターを緩衝液B
で濯ぐ。
で濯ぐ。
【0085】・ニトロセルロースフィルターを、20℃
で6時間、1ml当り0.1マイクロキュリーのヨウ素
125で標識されたプロテインAの溶液と接触させる。
で6時間、1ml当り0.1マイクロキュリーのヨウ素
125で標識されたプロテインAの溶液と接触させる。
【0086】・フィルターを緩衝液Aで濯ぐ。
【0087】・フィルターを2枚の吸収性シートの間で
乾燥する。
乾燥する。
【0088】・X線フィルターに接触させる。
【0089】・フィルムを現像する。
【0090】2)結果 処理条件を選択することによって、使用する細菌株およ
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムhGHは分子の
約98%が成熟形で存在することに注目すべきである。
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムhGHは分子の
約98%が成熟形で存在することに注目すべきである。
【0091】III .結果 3.1.例A 宿主ベクター対である大腸菌T株/p212,6と、大
腸菌CNCM I−528株/p212,6によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
腸菌CNCM I−528株/p212,6によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
【0092】これらの結果は、突然変異株(CNCM
I−528株)の方が、非突然変異株(T株)よりも2
倍以上高い効率で、ペリプラズムhGHを生産できるこ
とを示している。
I−528株)の方が、非突然変異株(T株)よりも2
倍以上高い効率で、ペリプラズムhGHを生産できるこ
とを示している。
【0093】3.2.例B 宿主ベクター対である大腸菌T株/p163,1と、大
腸菌CNCM I−528株/p163,1と、大腸菌
T株/p164,1と、大腸菌CNCM I−528株
/p164,1によってそれぞれ生産されたペリプラズ
ムhGHのレベルの比較。
腸菌CNCM I−528株/p163,1と、大腸菌
T株/p164,1と、大腸菌CNCM I−528株
/p164,1によってそれぞれ生産されたペリプラズ
ムhGHのレベルの比較。
【0094】誘導時間を3時間とし、浸透圧ショックお
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。
【0095】 ペリプラズムhGHの量 (浸透圧ショックおよびOD600nm=1となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りng数) p163,1 p164,1 T株 5.8 6.4 CNCM I−528株 7.8 10.8
【0096】誘導時間を3時間30分とし、浸透圧ショ
ックおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採
取した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測
定したところ、次の結果が得られた。
ックおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採
取した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測
定したところ、次の結果が得られた。
【0097】ペリプラズムhGHの量 (浸透圧ショックおよびOD600nm=1となるよう
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg
数) T株/p212,6 0.86 CNCM 2.00 I−528株/p212,6
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg
数) T株/p212,6 0.86 CNCM 2.00 I−528株/p212,6
【0098】hGH前駆体をコードするDNA配列体
が、その発現に関して、シグナルの制御下においてcA
MPおよびCRPの併合作用に感受性であると考えられ
るか否かにかかわらず、突然変異株(CNCM I−5
28株)は著しく増大した量のペリプラズムhGHを生
産できると考えられる(一例では約30%の増加、他の
例では70%の増加)。
が、その発現に関して、シグナルの制御下においてcA
MPおよびCRPの併合作用に感受性であると考えられ
るか否かにかかわらず、突然変異株(CNCM I−5
28株)は著しく増大した量のペリプラズムhGHを生
産できると考えられる(一例では約30%の増加、他の
例では70%の増加)。
【0099】3.3.例C 宿主ベクター対である大腸菌T株/p220,3と、大
腸菌CNCM I−528株/p200,3によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
腸菌CNCM I−528株/p200,3によってそ
れぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
【0100】実験は誘導なしで行なった。浸透圧ショッ
クおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取
した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定
したところ、次の結果が得られた。
クおよび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取
した上澄み1ml当りのペリプラズムhGHの量を測定
したところ、次の結果が得られた。
【0101】ペリプラズムhGHの量 (浸透圧ショックおよびOD600nm=1となるよう
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りng
数) T株/p200,3 200 CNCM 512 I−528株/p200,3
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りng
数) T株/p200,3 200 CNCM 512 I−528株/p200,3
【0102】突然変異株(CNCM I−528株)
は、非突然変異株(T株)よりも2倍以上高い効率で、
ペリプラズムhGHを生産できると考えられる。
は、非突然変異株(T株)よりも2倍以上高い効率で、
ペリプラズムhGHを生産できると考えられる。
【0103】この実験は、前駆体の合成が誘導可能であ
るか否かにかかわらず、得られる効果が同じオーダーで
あることを示している。
るか否かにかかわらず、得られる効果が同じオーダーで
あることを示している。
【0104】3.4.例D 宿主ベクター対である大腸菌CNCM I−529株/
p212,6によって、cAMPの存在下または非存在
下でそれぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの
比較。
p212,6によって、cAMPの存在下または非存在
下でそれぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの
比較。
【0105】誘導時間を30分〜120分の間で変化さ
せたところ、次の結果が得られた。これらの結果は、い
ずれも浸透圧ショックおよび濁度をOD600nm=1
に調節した後に、採取した上澄み1ml当りの成熟ペリ
プラズムhGHの量(μg)を測定したものである。
せたところ、次の結果が得られた。これらの結果は、い
ずれも浸透圧ショックおよび濁度をOD600nm=1
に調節した後に、採取した上澄み1ml当りの成熟ペリ
プラズムhGHの量(μg)を測定したものである。
【0106】 成熟hGHの量 (浸透圧ショックおよびOD600nm=1となるように 濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg数) cAMP非存在 cAMP存在 表現型[cya- ] 表現型[cya+ ]* 30分後 0.153 0.100 60分後 0.670 0.243 120分後 1.650 0.975 *CAMPの存在下ではcya変異の効果は発現せず、菌株は野生型[cya + ]を有している。
【0107】:それは、cya特性に関する変異を受け
ていない菌株の特徴を有している。
ていない菌株の特徴を有している。
【0108】突然変異株(CNCM I−529株)
は、処理条件の選択下でcya変異の発現においてのみ
異なる親株よりも高い効率で、ペリプラズムhGHを生
産できると考えられる。
は、処理条件の選択下でcya変異の発現においてのみ
異なる親株よりも高い効率で、ペリプラズムhGHを生
産できると考えられる。
【0109】3.5.例E 与えられた宿主ベクター対によって生産されるペリプラ
ズムhGHレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。
ズムhGHレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。
【0110】この実験は誘導時間3時間で行ない、次の
結果が得られた。
結果が得られた。
【0111】
【表3】 ペリプラズムhGHの値は、浸透圧ショックおよび濁度
をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄み1
ml当りのペリプラズムhGHのμg数で表した。
をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄み1
ml当りのペリプラズムhGHのμg数で表した。
【0112】全ペリプラズムたんぱく質はブラッドフォ
ードの方法(M.M.Bradford,Analyt
ical Biochemistry 72(197
6)248−264)で測定し、浸透圧ショックおよび
濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄
み1ml当りのペリプラズムhGHのmg数で表した。
ードの方法(M.M.Bradford,Analyt
ical Biochemistry 72(197
6)248−264)で測定し、浸透圧ショックおよび
濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した上澄
み1ml当りのペリプラズムhGHのmg数で表した。
【0113】この実験は、細胞周辺腔内に存在するたん
ぱく質レベルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプ
ラズム酵素の生産が、野生型菌株の存在により得られた
値およびクロモソームがcya変異(外因性cAMP添
加のないCNCM I−529株)またはcrp変異
(外因性cAMP添加のあるA株)を有する菌株の存在
下での実質的な量に比較して、減少することを示してい
る。同時に、突然変異の一方または他方が発現すると
き、ペリプラズムgHGの生産は大幅に増大する。
ぱく質レベルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプ
ラズム酵素の生産が、野生型菌株の存在により得られた
値およびクロモソームがcya変異(外因性cAMP添
加のないCNCM I−529株)またはcrp変異
(外因性cAMP添加のあるA株)を有する菌株の存在
下での実質的な量に比較して、減少することを示してい
る。同時に、突然変異の一方または他方が発現すると
き、ペリプラズムgHGの生産は大幅に増大する。
【0114】3.6.例F cAMPの非存在下に、宿主ベクター対であるA株/p
212,6とI−529株/p212,6によってそれ
ぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
212,6とI−529株/p212,6によってそれ
ぞれ生産されたペリプラズムhGHのレベルの比較。
【0115】誘導時間を2時間とし、浸透圧ショックお
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りの成熟したペリプラズムhGHの量
(μg)を測定したところ、次の結果が得られた。
よび濁度をOD600nm=1に調節した後に採取した
上澄み1ml当りの成熟したペリプラズムhGHの量
(μg)を測定したところ、次の結果が得られた。
【0116】成熟hGHの量 (浸透圧ショックおよびOD600nm=1となるよう
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg
数) T株/p212,6 2.08 CNCM 2.07 I−529株/p212,6
に濁度を調節した後に収集した上澄み1ml当りμg
数) T株/p212,6 2.08 CNCM 2.07 I−529株/p212,6
【0117】クロモソームがcya欠失変異およびcr
p欠失変異を有するA株と、クロモソームが同様のcy
a欠失変異を有するI−529株は、同一の挙動をする
と考えられる。
p欠失変異を有するA株と、クロモソームが同様のcy
a欠失変異を有するI−529株は、同一の挙動をする
と考えられる。
【0118】これらの例は、cAMP−CMP複合体の
固定後にのみ転写が開始され得るオペロンの発現を制限
しまたは抑制する変異をもった菌株を使用することによ
って、明白な利点がもたらされることを示している。:
事実、これらの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の
生産を実質的に増大(これらの例では、成熟形でのたん
ぱく質について98%)させることが可能である。例E
では、このような細菌の使用によって与えられる絶対的
な一次的利点(absolutely first−r
ate advantage)が強調される。:変異株
は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産
を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。;これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
固定後にのみ転写が開始され得るオペロンの発現を制限
しまたは抑制する変異をもった菌株を使用することによ
って、明白な利点がもたらされることを示している。:
事実、これらの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の
生産を実質的に増大(これらの例では、成熟形でのたん
ぱく質について98%)させることが可能である。例E
では、このような細菌の使用によって与えられる絶対的
な一次的利点(absolutely first−r
ate advantage)が強調される。:変異株
は細胞周辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産
を制限するから、観察される増大は絶対的なだけでな
く、相対的である。;これは、目標とするたんぱく質の
細胞周辺腔の内容物からの精製を容易にする。
【図1】天然hGH前駆体の1つをコードするDNA配
列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。
列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。
【図2】ペリプラズムについて、主要なDNA配列体の
位置と配向を示す機能地図である。
位置と配向を示す機能地図である。
【図3】ペリプラズムについて、主要なDNA配列体の
位置と配向を示す機能地図である。
位置と配向を示す機能地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 パスカル・レプラトワ フランス国、81470 キューク・トゥール サ、キャンボン・レ・ラボア、アン・サ ン・ピエール (番地無し) (72)発明者 ウイレム・ロスカム フランス国、31450 モンジスカール、マ ジョウレ (番地無し) (72)発明者 イブリン・リオウズン・ジョセフ フランス国、31650 サン・オレン・ド ゥ・ギャンビル、リュ・デュ・パレ 8
Claims (1)
- 【請求項1】 下記に示す遺伝子地図を有し、C.N.
C.M.に寄託番号I−530として寄託したプラスミ
ド。 【化1】 ただし、上記遺伝子地図における各記号の意味は、それ
ぞれ次の通りである。 【化2】
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US5279947A (en) * | 1988-08-24 | 1994-01-18 | Sanofi | DNA sequence participating in the regulation of the expression of a DNA sequence coding for a precursor of a polypeptide, expression vectors and process for the periplasmic production of the polypeptide |
US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
WO2013068445A1 (en) | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Sanofi | Diacylglycerol lipase and uses thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59125895A (ja) * | 1983-01-07 | 1984-07-20 | Rikagaku Kenkyusho | ヒト生長ホルモン遺伝子の合成法 |
JPS6045595A (ja) * | 1983-04-25 | 1985-03-12 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 大腸菌及びシユ−ドモナスに於ける正確に処理されたヒト成長ホルモンの分泌 |
JPS60221091A (ja) * | 1983-12-21 | 1985-11-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プロモ−タ− |
JPS60234584A (ja) * | 1984-05-09 | 1985-11-21 | Morio Ikehara | 組換プラスミド |
-
1986
- 1986-04-10 FR FR8605133A patent/FR2597114B1/fr not_active Expired - Lifetime
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1987
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