JPS637793A - 突然変異細菌株の培養によるたんぱく質の微生物学的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、当該たんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ
配列体を当該細菌に導入して、特定の型の突然変異を担
う（ｃａｒｒｙ　）グラム陰性菌を培養することによっ
て、たんぱく質を得ることを可能にする微生物学的方法
に関する。

本発明は、多くの技術分野で適用でき、特に有効成分が
たんぱく質である医薬の製造に適用できる。

多数のたんぱく質は、翻訳後の成熟を受けた後にのみ、
生物学的活性を獲得することが知られている。細胞質中
で前駆体の形で生合成され、それから細胞質から運び出
されるたんぱく質の場合には、この成熟の第１段階は、
シグナルペプチドと称されるＮ末端をこの前駆体から酵
素的に除去することであることが多い。前駆体の形で生
合成されたこの型のたんぱく質は、原核生物と真核生物
の両方について知られている。このようなたんぱく質と
して特に言及できるものには、例えば、大腸菌（Ｅ　５
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）の種などにより産生
されるβ−ラクタマーゼ　ＴＥＭ−１とアルカリ性　ホ
スファターゼ、黄色ブドウ球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ　）
の種により産生されるプロティンＡ１デンプン液化バチ
ルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　ａＩＩｌｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｌｅｎｓ）の柾などにより産生されるα−アミ
ラーゼ（これらは原核生物由来のたんぱく質である）、
また、ヒト成長ホルモン、ヒトインシュリン、組織プラ
スミノーゲン活性化因子、上皮成長因子（これらは真核
細胞により産生されるたんぱく質である）などがある。

更に、当該たんぱく質を製造するために、天然のたんぱ
く質前駆体をコードするＤＮＡ配列体を担うプラスミド
を用いて形質転換したグラム陰性菌を、使用できること
が知られている（Ｇ、Ｌ。

Ｇｒａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　　２　　（１９８４）１８１−１８５　　；
　Ｇ、　　Ｌ、　Ｇｒａｙ　　ｅｔ　　ａｔ、、　Ｇｅ
ｎｅ　　３９（１９８５）　２４７−２５４　）。この
場合には、細胞機構によって次の過程が確実に行われる
。細胞質区画で、ＤＮＡ配列体が転写され、それから対
応するメツセンジャーＲＮＡが翻訳される。このように
して生合成された前駆体は、細胞質膜を横切って移動す
る間または移動の後、酵素開裂または分解、シグナルペ
プチドの除去を受ける。シグナルペプチドのない前駆体
に対応するこのたんぱく質は、細菌のペリプラズムに蓄
積される。ここからこのたんぱく質を得ることができる
。

上記のＤＮＡ配列体が、シグナルペプチドに関して、天
然の前駆体（つまり、通常の産生を行う細胞で合成され
る形）と異なる前駆体をコードする場合にも、類似する
結果が得られている。例えば、真核生物由来のたんぱく
質に、細菌由来のたんぱく質のシグナルペプチドが結合
した前駆体が合成された（　Ｋ　、　Ｔ　ａｌｍａｄｇ
ｅ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｐ　ｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ１．　　ＵＳＡ、　
７７（１９８０）　３９８８−３９９２；Ｇ、　　Ｌ、
　Ｇｒａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｇｅｎｅ　　３９
（１９８５）　２４７−２５４　）。

また、細菌に、オペロンの発現を制限するまたは抑制さ
えも行う突然変異を起こせることが知られている。この
オペロンの転写は、アデノシン３’　、５’　−環状リ
ン酸（ｃＡＭＰ）がＣＲＰ（環状ＡＭＰレセプタたんぱ
く質）（これはＣＡＰ　（カタボライト活性化たんぱく
質）とも称される）と会合して生じるｃＡＭ’Ｐ−ＣＲ
Ｐ複合体が、このオペロンの調節要素へ固定された後に
のみ開始されるような転写である。これらのオペロンの
機能に関しては、「オペロンＪ（ＴｈｅＯｐｅｒｏｎ、
　　Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ　　ａｎｄ　　Ｗ、　　Ｓ
。

Ｒｅｚｎｉｋｏｆ’ｆ’、　　Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｌ
ｎｇ　　　Ｈａｒｂｏｒ　　　Ｌ％ｂｏｒａｔｏｒｙ、
　　１９８０）中のｒＬａｃＬａ上−タ」（Ｗ、　　Ｓ
、　　Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ’　　ａｎｄ　　Ｊ、　　Ｎ
、　Ａｂｅｌｓｏｎ）の章に説明されている。

そのような生合成能が減少した細菌（阻害されたオペロ
ンは、多くの酵素゛の合成を支配するので）が、始めか
ら、たんぱく質工業生産用の好ましい宿主を形成できな
いことは明らかであった。

グレイらによる１９８４年と１９８５年の報告（上記）
には、当該たんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列
体を導入した細菌を培養することによって、たんぱく質
を製造するこれまでの研究が、調節要素（特にプロモー
タ）を特に選択することによりプラスミド構造の効率を
高めることに向けられていたことが示されている。

本発明者は細菌宿主に関心を払い、別の方向の研究を行
った。驚くべきことに、転写がｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体
の固定に依存するオペロンの発現を制限するまたは抑制
さえも行う少なくとも１つの突然変異を担うクロモソー
ムを有するグラム陰性菌が、前駆体の形で生合成される
たんぱく質の工業生産のための好ましい宿主を構成する
ことが見出された。

第１の特徴によれば、本発明は、当該たんぱく質の前駆
体をコードするＤＮＡ配列体を導入したグラム陰性菌を
培養することによって、たんぱく質を生産する微生物学
的方法に関する。この方法は、転写がｃＡＭＰ−ＣＲＰ
複合体の固定に依存するオペロンの発現を制限するまた
は抑制さえも行う少なくとも１つの突然変異を担うクロ
モソームを有する細菌種の使用を包含する。

この突然変異は、ｃＡＭＰの細胞内濃度を減少する傾向
があるもの；機能形のＣＲＰ合成を制限または抑制する
もの；突然変異形のＣＲＰの合成を導き、ＤＮＡへの固
定が妨げられるまたは比較的に効率が落ちるようなｃＡ
ＭＰ−ＣＲＰ複合体の形成を起こすもの；および、当該
複合体の固定が妨げられるまたは比較的に効率が落ちる
ような仕方に、ＤＮＡに対するｃＡＭＰ−ＣＲＰＩ合体
の固定の部位を修飾するものである。これらは、発現が
温度などのパラメータに依存する条件突然変異であって
よい。

これらの突然変異の中で、クロモソーム遺伝子り」−自
身またはその発現を調節するＤＮＡ配列体に、この遺伝
子がコードするアデニル酸シクラーゼが合成されないか
、またはその特異的な活性、すなわちアデノシン　三リ
ン酸（ＡＴＰ）のｃＡＭＰへの変換を行うことができな
い形で合成するように影響を及ぼす突然変異が、特に特
徴づけられる。クロモソーム遺伝子ｃｒｐ自身またはそ
の発現を調節するＤＮＡ配列体に、この遺伝子がコード
するＣＲＰが合成されないか、またはＤＮＡへの効率的
な固定を可能にする十分に安定すｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ　−Ｃ
ＲＰ複合体が形成されないような突然変異形で合成する
ように影響を及ぼす突然変異も、同様である。便宜上、
これらの突然変異をここではり」−突然変異およびり」
−突然変異と称する。

虱およびｃｒｐ突然変異は任意の種類のものでよいが、
特に可能なものは、置換による突然変異、挿入による突
然変異、変換による突然変異、または例えば欠失による
突然変異である。突然変異は、−対のヌクレオチドのみ
に影響を与えるものであってよいが、この型の点突然変
異は可逆的なので、幾対かのヌクレオチドに同時に影響
を与える不可逆的突然変異が好ましい。多重点突然変異
が更に可能性がある。Ｑ７ａ突然変異の場合には、ｃＡ
ＭＰは合成されず、ｃＡＭＰ−ＣＲＰＩ合体の形成は起
き得ない。外来性ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの添加によって、この
合成の欠如を克服し、乱された細胞機能を回復すること
が可能となる。す」−突然変異の場合には、ＣＲＰはも
はや機能形では合成されず、同様に、ｃＡＭＰ−ＣＲＰ
複合体の形成は起き得ない。ここでは、外来性ｃＡＭＰ
の添加は、乱された細胞機能の回復には無力である。

本発明は、ｃｙａ遺伝子およびその発現を調節するＤＮ
Ａ配列体により形成される系、ま・たはｃｒｐ遺伝子お
よびその発現を調節するＤＮＡ配列体により形成される
系、またはその両方の系に影響を及ぼす少なくとも１つ
の突然変異を担うクロモソームを有する細菌株を使用す
る上に定めた微生物学的方法に、有利に関連している。

本発明では、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐが、種々のオペロンの発現
の制御を行うＣＲＰとカップリングしている任意のグラ
ム陰性菌の種に属する細菌株を使用できる。この型の細
菌株は、多くのバクテリオファージの作用に対して驚く
程に耐性なので、工業生産での使用は一層有利となる（
　Ｓ　ｕｓｈｉｌ　　Ｋ　ｕｍａｒ。

Ｊ　、’　Ｂ　ａｃｔ、　１２５　（１９７Ｂ）　５４
５−５５５　）　、好ましい細菌の種は大腸菌である。

他の特徴によれば、本発明は、使用する突然変異細菌株
が大腸菌の種の菌株である上記の微生物学的方法に関す
る。

本発明者は特に、１９８６年２月１７日に国立微生物寄
託機関（Ｃｏｆ　Ｉｅｃｔｉｏｎ　　Ｎ　ａｔｉｏｎａ
ｌｅ　　ｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓ　　ｄｅ　　Ｍ　ｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　（Ｃ、Ｎ　、　　Ｃ。

Ｍ、　）　、　　Ｐａｒｉｓ、　　Ｆｒａｎｃｅ　）に
寄託した大腸菌の２つの突然変異菌株を選択した。菌株
の１つは点ｃｒｐ突然変異を担い（寄託番号　１−５２
８）、他の菌株は欠失による非点ｃｙａ突然変異を担う
（寄託番号　１−５２９）。

本発明は、好ましくは、突然変異菌株が、寄託番号ｌ−
５２８およびｌ−５２９としてＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。

に寄託された菌株の一方または他方の特性を有する上記
の微生物学的方法に関する。

本発明の方法によって、多くのたんぱく質を得ることが
可能となる。製造を望むたんぱく質が、前駆体の形で天
然に生合成されるか否かはほとんど重要でないことを理
解する必要がある。また、この方法は非天然のたんぱく
質の製造にも適している。例えば、１次構造を２つまた
はそれ以上の既知のたんぱく質から選択したハイブリッ
ドたんぱく質でもよい。いずれの場合も、この方法は、
Ｎ末端にシグナルペプチドとして挙動するペプチドが結
合した上記のたんぱく質をコードするＤＮＡ配列体の製
造を満足する。

本発明による方法は、ヒト成長ホルモン（以後、ｈＧＨ
と称する）の製造に対して特に有利である。

第１図は、ｈＧＨが合成される下垂体細胞から単離され
た天然ｈＧＨ前駆体の１つをコードするＤＮＡ配列体、
および、この前駆体のアミノ酸配列体を示している。最
初の２６のアミノ酸（図中の一２６位のアミノ酸から数
える）がシグナルペプチドを構成し、他の　１９１のア
ミノ酸（ここでは１から　１９１までの番号を付ける）
は実際のｈＧＨ（以後、「成熟ｈＧＨＪと称する）のア
ミノ酸である。

次の第１表に第１図中で使用したアミノ酸の略語を説明
する。

第１表 アミノ酸　　　　　　　　　　略語 アラニン　　　　　　　　　　　Ａ アルギニン　　　　　　　　　　Ｒ アスパラギン　　　　　　　　　　Ｎ アスパラギン酸　　　　　　　　Ｄ システィン　　　　　　　　　　Ｃ グルタミン　　　　　　　　　　Ｑ グルタミン酸　　　　　　　　　　Ｅ グリシン　　　　　　　　　　　Ｇ ヒスチジン　　　　　　　　　　Ｈ イソロイシン　　　　　　　　　■ ロイシン　　　　　　　　　　　　Ｌ リジン　　　　　　　　　　　　Ｋ メチオニン　　　　　　　　　　Ｍ フェニルアラニン　　　　　　　Ｆ プロリン　　　　　　　　　　　　Ｐ セリン　　　　　　　　　　　Ｓ トレオニン　　　　　　　　　　Ｔ トリプトファン　　　　　　　　Ｗ チロシン　　　　　　　　　　　Ｙ バリン　　　　　　　　　　　■ 第１図に示したＤＮＡ配列体のコドンでは、通常の意味
でＡＳＣＸＴ、Ｇを使用している。これらはそれぞれ、
アデニン、シトシン、チミン、グアニンの塩基を示す。

本発明を実施するためには、突然変異細菌が、所望のた
んぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体を含むこと
が必要である。「前駆体」の語は、それが存在する場合
は天然のたんぱく質前駆体を、また、シグナルペプチド
を修飾して得られた上記の天然前駆体の任意の誘導体を
、更に、シグナルペプチドとして挙動できるペプチドが
上記のたんぱく質と結合した任意の前駆体を意味するも
のとして理解される。前駆体は特に、既知の原核および
真核生物のシグナルペプチドまたはその誘導体を包含す
る群から選択できる。

上記たんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体を、
プラスミドなどの複製可能な発現ベクターにより細菌に
導入できる。上記配列体の発現に必要な調節要素（特に
、プロモータ）が、その機能を行うためにその配列体の
付近に位置することが必要であることは明白である。

例えば、使用する細菌株内で復製できることを条件とし
て、従来技術（Ｇ、　　Ｌ、　Ｇｒａｙ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、。

Ｇｅｎｅ　　３９　　（１９８５）　２４７−２５４　
）に説明されているプラスミドを使用できる。これらの
プラスミドの選択に関しては、使用する構造体内で、所
望のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列体が誘
導可能である必要はないことが示された。上記の配列体
が幾つかの複写として存在することも重要である。

本発明者は、実際に、細菌細胞内での複製の後、細胞当
り５０ないし３００の比率で複写が存在し、それぞれの
複写が所望のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配
列体の複写を担うことができる幾つかのプラスミドを構
築し、選択した。これらのプラスミドの１つによって形
質転換された大腸菌Ｍ　Ｃｆｏｅｔ株を、１９８６年２
月１７日にＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。

に寄託した。この菌株は寄託番号１−５３０である。

便宜上、以後の説明では、寄託番号１−５３０としてＣ
，Ｎ、Ｃ，Ｍ、　　に寄託されたこのプラスミドを参照
する。このプラスミド（以後、内部参照によりｐｌＢ３
．１とも称する）は、ｈＧＨの天然の前駆体の１つをコ
ードするＤＮＡ配列体を担う。第１図に示すこの配列体
は、ヒト下垂体細胞で合成された前駆体の１つから決定
された配列体と同一である。これを、 １）　５′末端から始まり、ＲＮＡポリメラーゼ認識部
位（−３５位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位
、文献（Ｍ　、　　Ｔ　ａｋａｎａＩＩｌｉ　　ｅｔ　
　ａｔ、。

Ｎａｔｕｒｅ　　２６０　（１９７Ｂ）　２９７−３０
２　）に定められている）を含むトリプトファン　プロ
モーターの断片、および、 ２）　　ＲＮＡポリメラーゼ認識部位（−３５位に位置
するそのヌクレオチドの中央の部位）と、固定部位（−
１０位に位置するそのヌクレオチドの中央の部位、文ｔ
ｄ　（Ｄ　、　　Ｐ　ｒｉｂｎｏｗ、　　Ｐ　ｒｏｅ、
　　Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　　７２（１９７５）
　７８４−７８９　）に定められている）とを分離して
いる領域と５′末端との間の部分を除いたプロモーター
オペレータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ　−ｏｐｅｒａｔｏｒ）
　　ラクトース　ＵＶ５が結合したハイブリッド　プロ
モーターオペレータの制御下に置いた。

第２図に、上記のプラスミドについて、主要なりＮＡ配
列体の位置と配向を示す機能地図を示す。

図中に使用した記°号の意味は次の通りである。

□プラスミドル　Ｂ　Ｒ３２２ 一一一−−−−−−−−−−−−−−−一−−由来のＤ
ＮＡ切片含むＤＮＡ切片 ＤＮＡ切片 一ラクトース　ＵＶ５を 含むＤＮＡ切片 ＣＡｐＲ：アンビシリン耐性） この地図は、また、−定の制限酵素、つまり、　　５ａ
ｌｌ　、　ＢａｍＨＩ、ＨｌｎｄＩＩＩ、ｐ　ｓｔ　ｒ
、ＥｃｏＲＩ、　　；ＸｈｏＩ、およびＰｖｕｌの酵素
の作用部位を示して　　＝いる。

プラスミドｐｌＢ３．１中に突然変異ＵＶ５（ｒオペロ
ン」中のｒＬａｃＬａ上−タ」の章（前記参照）に説明
されている）が存在するために、ｈＧＨ前駆体をコード
するＤＮＡ配列体の発現が、ｃＡＭＰおよびＣＲＰの併
合作用に不感受性となる。このプラスミドは、その−船
釣特性を仮定して、天然のｈＧＨ前駆体の１つをコード
するＤＮＡ配列体を、他の前駆体特に他のたんぱく質の
前駆体をコードする配列体に置換することによって、他
のプラスミドを構築するために使用でき　　“る。

他の特徴によれば、本発明は、所望のたんぱく　　′質
の前駆体をコードするＤＮＡ配列体が、その発　　。

現を可能にする調節要素と共に、プラスミドに担　　（
われる上記の微生物学的方法に関する。特に、上記のＤ
ＮＡ配列体が、Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託さｈた寄託番号
ｌ−５３０のプラスミドの一般的特性を町するプラスミ
ドによって担われる上記の微生物を内方法に関する。

他の特徴によれば、本発明は、上記細菌株が、ｈＧＨ前
駆体をコードするＤＮＡ配列体を含有する上記の微生物
学的方法に関する。

他の特徴によれば、本発明は、寄託番号Ｉ　−５２８ｂ
よびｌ−５２９としてＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、　に寄託され辷
細菌株に関する。

更に他の特徴によれば、本発明は、寄託番号ｌ−５３０
としてＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、　　に寄託されたプラスミドに
関する。

次に、具体例を用いて本発明を説明する。当然、本発明
は、これらの例で説明されている本発明のη法の適用に
は制限されない。本発明には、特許請求の範囲によって
定められる範囲の変法の全てう（含まれる。

列 １、使用する細菌およびプラスミド ４つの細菌株および４つのプラスミドを使用した。

これらの例では、Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託した寄託番号
１−５２８およびｌ−５２９の菌株とは別に、他に次の
２つの大腸菌の菌株に言及する。

・欠失による非点ｃｙａ突然変異および欠失による非点
り四−突然変異の両方を担う菌株。以後、内部参照によ
りＡと称する。Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、ｌ−５２９株はこの菌
株から誘導される。

・ｃＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定後にのみ転写が開始さ
れるオペロンの発現を、制限または抑制できる突然変異
を担わない菌株。Ｍ　Ｃ１０８１（大腸菌、Ｇ　ｅｎｅ
ｔｉｃ　　Ｓ　ｏａｋ　　Ｃｅｎｔｅｒ、　　Ｎ　ｅｗ
　−Ｈａｖｅｎ。

Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）として知ら
れている。以後、内部参照によりＴと称する。Ｃ，Ｎ、
Ｃ，Ｍ。

１−５２８株はこの菌株から誘導される。

これらの例では、Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託した寄託番号
！−５３０のプラスミドとは別に、他に３つのプラスミ
ドに言及する。これらは内部参照により、り１６４．ｌ
、　ｐ２Ｇ０，３、ｐ２１２．８と称する。

プラスミドｐ１８４．１はプラスミドｐｔａａ、ｔと非
常に類似しており、本質的な相違は突然変異ＵＶ５が存
在しないことである。

プラスミドｐ２１２，８はプラスミドｐｔｅａ、ｔと類
似している。第３図に、これについて、主要なりＮＡ配
列体の位置と配向を示す機能地図を示す。図中に使用し
た記号の意味は次の通りである。

□プラスミドル　Ｂ　Ｒ３２２ 一＋−＋−＋−＋−＋−＋−由来のＤＮＡ切片含むＤＮ
Ａ切片 ＤＮＡ切片 ＤＮＡ切片 ハイブリッド　プロモータ 含むＤＮＡ切片 第２図に示したプラスミドｐｌＢ３．１と同様に、−定
の制限酵素の作用部位を第３図に示す。

プラスミドｐ２００，３はプラスミドｐ２Ｌ２，６と等
価であり、ｈＧＨ前駆体をコードするＤＮＡ配列体の発
現に関する非抑制特性のために選択した。

天然のｈＧＨ前駆体の１つをコードし、プラスミドｐ２
１２．８およびｐ２００．３により担われるＤＮＡ配列
体は、第１図に示す配列体と、２つの置換において異な
っている。つまり、コドンＡＣＣは、−２４位に位置す
るアミノ酸をコードするコドンＡＣＡに置換され、同様
に、コドンＴＣＴは、−２２位に位置するアミノ酸をコ
ードするコドンＴＣＣに置換された。

■、−般的方法論 行なった実験は、問題の宿主ベクター対を予め調製しく
　ｇ　２．１参照）、宿主がｈＧＨ前駆体をコードする
ＤＮＡ配列体を発現できるような条件下に培養しく　！
９２．２参照）、必要ならば発現を誘導（ＩＩ　２．３
参照）することと、細胞周辺腔に含まれるたんぱく質を
採取することと（ｇ　２．４参照）、ペリプラズムｈＧ
Ｈを同定すること（８２，５参照）とからなる。

２．１．宿主ベクター対の調製 当業者に知られており、特に以下の著書に記載されてい
る細菌形質転換技術で宿主ベクター対を調製した。

・　「分子クローニング（実験室マニアル）」（Ｍ　ｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　−Ａ　　　　
Ｌ　　ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　　Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、　　Ｅ、　　Ｆ、　　Ｆｒ１ｔｓｃｈ
ａｎｄ　Ｊ　、　　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ、　　Ｃｏｌｄ
　　Ｓ　ｐｒｌｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　　１９８２）０　「分子遺伝学の実験Ｊ　　
　（Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　Ｉｎｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　Ｊ、　　Ｈ，Ｍｉｌｌ
ｅｒ。

Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｒ＋ｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ
　ａｂｏｒａｔｏｒｙ１２．２．培養 ａ）接種 固体培地（ＬＢ培地十寒天）で得られた分離コロニーを
、以下の特性を有し、かつ１００μｇ　／　ｄｌのアン
ピシリンを添加した５ｍｌの培地（ＬＢ培地）中に懸濁
させる。即ち、 ・加圧滅菌前に培養培地に導入した基本成分は、カゼイ
ンのパンクレアチンによる 加水分解物（ＤＩＦＣＯからの　　　１ｏｇバクトドリ
プトン） 酵母抽出物　　　　　　　　　　　　５ｇ塩化ナトリウ
ム　　　　　　　　　　　５ｇ蒸蒸水水添加　　　　　
　　　　　　ＩＩ！であり、 ・加圧滅菌前にｐＨを７．３に調節した。

ｂ）−次インキュベーション ３７℃、１８時間で培養菌が定常的な成長相に達する。

Ｃ）希釈 ８００ｎｆｆｌにおける読み（分光光度計　Ｂ　ａｕｓ
ｃｈ−Ｌｏｍｂ　５ｐｅｃｔｒｏｎｉｃ　２０　）での
光学密度、即ちＯＤ　　６００ｎａ＋が約０，０５にな
るように、細菌懸濁液をＬＢ培地中で希釈する。

ｄ）二次インキュベーション ２．２．ｃに従って得られた細菌懸濁液５ｈｔｃ＋を、
ＯＤ　６００ｎｍが約０．２になるまで３７℃でインキ
ュベーションした。

２．３．誘導 ２．２．ｄに従って得られた細菌懸濁液中に、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトース（ＩＰＴＧ）をその最
゛終、Ｑ度が１ｍＭになる量だけ添加する。

ここで、Ｉ　ＰＴＧはリプレッサー（通常はラクトース
　オペレータに結合する）の作用を中和することによっ
て、ｈＧＨ前駆体の合成を開始し、かつ維持するために
用いる。

２．４．浸透圧ショック （文献（Ｔ　ｈｅ　　Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｒＢ　ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　２４１　　（
１９１１ｉ６）　３０５５−３０６２）において、Ｎ、
　Ｇ、　Ｎｏ５ｓａｌおよびＬ　、　Ａ　、　Ｈｅｐｐ
ｅｌが発表したプロトコールを参照してもよい） ａ）細菌懸濁液の３！１製 ２．２．ｄ　　（誘導が必要とされない場合）のように
して得られた懸濁液、または所定の誘導期間後に得られ
た懸濁液の試料を採取し、ＯＤ　［１００ｒ＋ｍが約１
０になるようにこれを処理（ＧＯＯＯｇで５分間遠心分
離、上澄みを除去、細菌をＬＢ培地中に再度懸濁）する
。

ｂ）洗浄 ２．４．ａて得られた懸濁液を６０００　ｇで５分間遠
心分離する。

一定容量の残渣を、次の組成を有する溶液Ａ中に採取す
る。即ち、溶液Ａは蒸溜水に下記のものを添加すること
によって調製されたｐＨ−７の緩衝液である。

・トリ　（ヒドロキシメチル）アミノエタン−ＨＣノ、
即ち、Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣノ 最終濃度が３０ｍ　Ｍのように添加する。

・エチレンジアミン四酢酸、即ち、ＥＤＴＡ最終濃度が
１ｍＭになるように添加する。

Ｃ）スクロースの作用 ２．４．ｂで得られた懸濁液を６０００　ｇで５分間遠
心分離する。

溶液Ａに対応する組成を有し、かつ１５ｇ／１００１の
スクロースを添加した溶液Ｂ中に、残渣の一定量を注意
深く採取し、直ちに用いる。

その懸濁液を２０°Ｃで１０分間放置する。

それから、ｅｏｏｏ　ｇで５分間遠心分離する。

遠心管を氷水中に静置する。

上澄みを注意深く除去し、氷水温度に保たれた脱イオン
水中に再度静置する（−定容量で）。

この方法で調製された懸濁液（ＯＤ　８００ｎｍは約１
０）を０℃で５分間放置する。

ｄ）細胞周辺腔に存在するたんぱく質の採集２．４．ｃ
で得られた懸濁液を、１８，０００ｇで１０分間遠心分
離する。

上澄みを集める。これには細胞周辺腔に存在するたんぱ
く質が含まれる。

２．５．ペリプラズムｈＧＨの同定 ａ）方法論 ２．４．ａで得られた上澄みを、ヒト成長ホルモンのラ
ジオイムノアッセイにかける（ＣＯＡＴＲＩＡＲ”　２
５１−　ｈにＨｋｉｔ　−ＢｉｏＬｌｅｒｉｅｕｘ。

Ｆ　ｒａｎｃｅ　）　ｏ　　　’ この同定は、次の操作を連続して行なうことからなる。

・ヨウ素１２５で標識されたｈＧＨを予め定められた量
だけ導入し、予め定められた量の第一の抗−ｈＧＨ抗体
を目当てとして、同定されるべき分析試料中に含まれる
ｈＧＨとの間で競合させる反応。

・第一の抗体を前記第一の抗体に対する第二の抗体に結
合させ、固体物質に固定する反応。

インキュベーション後には、ヨウ素１２５で標識したｈ
ＧＨの比率は、分析試料中のｈＧＨの量に逆比例する。

２６６、ペリプラズムｈＧＨの特性チエツク１）方法論 ２．４．ｄで得られた上澄みから採集したｈＧＨの性質
をチエツクした。

これは、次の操作を連続して行なうことにより実施した
。

・上澄み中に含まれる異なったたんぱく質の、ポリアク
リルアミドゲル上での電気泳動による分離（文献（Ｕ　
、　Ｋ　、　　Ｌ　ａｅｍｍｌ’ｉ、　　Ｎ　ａｔｕｒ
ｅ　　２２７（１９７０）　６８０−８８５　）中にｔ
、ａｅｍｍ＋＋により記載されたプロトコールによる）
。

この方法では、成熟形のｈＧＨおよびｈＧＨ前駆体が、
それぞれの見かけの分子量に応じて２つの異なった点に
移動する。

・ゲル中に含まれる前記たんぱく質の、ニトロセルロー
スフィルター上への移動（文献（Ｈ。

Ｔｏｗｂｉｎ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ　Ｓ　Ａ　　７Ｂ　（１９７９）　４３５０−４３５
４）　１７）技術に従う）。

・バーネットの技術（Ｗ、　Ｗ、　Ｂ　ｕｒｎｅｔｔｅ
。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２　　（１９８１）
　１９５−２０３　）に従って行なわれる免疫検出。こ
れには次のような連続的工程が含まれる。

・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ａ（Ｔ　ｒｌｓ
−ＨＣ）　１０ｍＭ、　　Ｎ　ａ　Ｃノ　１７０ｍ　Ｍ
　。

Ｋ１１ｍＭ）で１０分間濯ぐ。

・ニトロセルロースフィルターを、３７℃で３０分間、
緩衝液Ｂ　（３ｇ／１００　ｒｎｉの割合で牛血清アル
ブミンを添加した緩衝液Ａ）に接触させる。

・ニトロセルロースフィルターを、２０℃で１８時間、
免疫血清（成熟ｈＧＨおよびその前駆体を認識する多ク
ローン性抗体）に接触させる。

・ニトロセルロースフィルターを緩衝液Ｂで濯ぐ。

・ニトロセルロースフィルターを、２０℃で６時間、１
ｄ当り０．１マイクロキユリーのヨウ素１２５で標識さ
れたプロティンＡの溶液と接触させる。

・フィルターを緩衝液Ａで濯ぐ。

・フィルターを２枚の吸収性シートの間で乾燥する。

・Ｘ線フィルムに接触させる。

・フィルムを現像する。

２）結果 処理条件を選択することによって、使用する細菌株およ
びプラスミドと関係なく、ペリプラズムｈＧＨは分とそ
の約９８％が成熟形で存在することに注目すべきである
。

■、結果 ３．１９例Ａ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ２１２，８と、大
腸菌ＣＮ　ＣＭ　　ｌ−５２８株／ｐ２１２，６によっ
てそれぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比
較。

誘導時間を３時間３０分とし、浸透圧シヨ・ツクおよび
濁度をＯＤ　　８００ｎｍ＝　１に調節した後に採取し
た上澄み１ｄ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。

ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ　−１となるよ
うに濁度を調節した後に収集 した上澄み１１当りのμｇ数） Ｔ株／Ｉ）２１２，８　　　　　　　　　０．８８ＣＮ
ＣＭ　　　　　　　　　　　　２．００これらの結果は
、突然変異株（ＣＮＣＭｌ−５２８株）の方が、非突然
変異株（Ｔ株）よりも２倍以上高い効率で、ペリプラズ
ムｈＧＨを生産　　・できることを示している。

３．２０例Ｂ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ１８３．１と、大
腸菌ＣＮ　ＣＭ　　ｌ−５２８株／ｐ１８３．１と、大
腸菌Ｔ株／ｐｌＢ４．１と、大腸菌ＣＮ　ＣＭ　　Ｉ　
−５２８株／ｐｌＢ４．１によってそれぞれ生産された
ペリプラズムｈＧＨのレベルの比較。

誘導時間を３時間とし、浸透圧ショックおよび濁度を０
Ｄ８００ｎ−一１に調節した後に採取した上澄み１１１
ｉ当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定たところ、次の
結果が得られた。

ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよび０Ｄ６００ｒｕａ　−１となる
ように濁度を調節した後に収集 Ｔ株　　　　　　　　　５．８　　　　８．４ｈＧＨ前
駆体をコードするＤＮＡ配列体が、その発現に関して、
シグナルの制御下においてｃ　Ａ　Ｍ　ＰおよびＣＲＰ
の併合作用に感受性であると考えられるか否かにかかわ
らず、突然変異株（ＣＮ　ＣＭ　　ｌ−５２８株）は著
しく増大した量のペリプラズムｈＧＨを生産できると考
えられる（−例では約３０％の増加、他の例では７０％
の増加）。

３．３２例Ｃ 宿主ベクター対である大腸菌Ｔ株／ｐ２００，３と、大
腸菌ＣＮ　ＣＭ　　Ｉ　−５２８株／　ｐ２００．３に
よってそれぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベル
の比較。

実験は誘導なしで行なった。浸透圧ショックおよび濁度
をＯＤ　　８００ｎｍ＝　１に調節した後に採取した上
澄み１ｍ７７当りのペリプラズムｈＧＨの量を測定した
ところ、次の結果が得られた。

ペリプラズムｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ８００ｎｍ　−１となるよ
うに濁度を調節した後に収集 した上澄み１ｄ当りのｎｇ数） Ｔ株／ｐ２００，３　　　　　　　　　２００ＣＮＣＭ
　　　　　　　　　　　　　５１２１−５２８株／ｐ２
００．３ 突然変異株（ＣＮ　ＣＭ　　ｌ−５２８株）は、非突然
変異株（Ｔ株）よりも２倍以上高い効率で、ペリプラズ
ムｈＧＨを生産できると考えられる。

この実験は、前駆体の合成が誘導可能であるか否かにか
かわらず、得られる効果が同じオーダーであることを示
している。

３．４１例り 宿主ベクター対である大腸菌ＣＮ　ＣＭ　　Ｉ　−５２
９株／９２１２．８によって、ｃＡＭＰの存在下または
非存在下でそれぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレ
ベルの比較。

誘導時間を３０分〜１２０分の間で変化させたところ、
次の結果が得られた。これらの結果は、いずれも浸透圧
ショックおよび濁度をＯＤ　６００ｎｍ−１に調節した
後に、採取した上澄み１ｄ当りの成熟ペリプラズムｈＧ
Ｈの量（μｇ）を測定したものである。

成熟ｈＧＨの量 （浸透圧ショックおよびＯＤ　６００ｎｍ　−１となる
ように濁度を調節した後に収集 した上澄み１ｍｌ！当りのμｇ数） ｃＡＭＰ非存在　　ｃＡＭＰ存在 表現型［ｃｙａ−１表現型［ｃｙａ”　］　＊３０分後
　　　　　０．１５３　　　　　　　　０．１００６０
分後　　　　　０．８７０　　　　　　　　０．２４３
１２０分後　　　１．８５０　　　　　　０．９７５＊
ｃＡＭＰの存在下ではり」工変異の効果は発現せず、菌
株は野生型［ｃｙａ”　］を有している。

：それは、ｃｙａ特性に関して変異を受けていない菌株
の特徴を有している。

突然変異株（ＣＮ　ＣＭ　　ｌ−５２９株）は、処理条
件の選択下でり」−変異の発現においてのみ異なる親株
よりも高い効率で、ペリプラズムｈＧＨを生産できると
考えられる。

３．５８例Ｅ 与えられた宿主ベクター対によって生産されるペリプラ
ズムｈＧＨレベル、および全てのペリプラズムたんぱく
質レベルの比較。

この実験は誘導時間３時間で行ない、次の結果が得られ
た。

ペリプラズムｈＧＨの値は、浸透圧ショックおよび濁度
をＯＤ　　６００ｎｍ−１に調節した後に採取した上澄
み１ＩＩｉＦ当りのペリプラズムｈＧＨのμ９数で表し
た。

全ペリプラズムたんぱく質はブラッドフォードの方法（
Ｍ　、　Ｍ　、　Ｂ　ｒａｄｆｏｒｄ、　　Ａ　ｎａｌ
ｙｔｌｃａｌＢ　ｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　７２　（１
９７Ｂ）　２４８−２８４　）で測定し、浸透圧ショッ
クおよび濁度をＯＤ　　８００ｎｍ　−１に調節した後
に採取した上澄み１１！１１当りのペリプラズムｈＧＨ
の篤数で表した。

この実験は、細胞周辺”腔内に存在するたんぱく質レベ
ルの測定で評価された細菌の成熟形のペリプラズム酵素
の生産が、野生型菌株の存在により得られた値およびク
ロモソームがり」−変異（外因性ｃＡＭＰ添加のないＣ
Ｎ　ＣＭ　　ｌ−５２９株）またはり」−変異（外因性
ｃＡＭＰ添加のあるＡ株）を有する菌株の存在下での実
質的な量に比較して、減少することを示している。同時
に、突然変異の一方または他方が発現するとき、ペリプ
ラズムｇＨＧの生産は大幅に増大する。

３６６、匹ヱ ｃＡＭＰの非存在下に、宿主ベクター対であるＡ株／　
ｐ２Ｌ２，８と１−５２９株／　９２１２．６によって
それぞれ生産されたペリプラズムｈＧＨのレベルの比較
。

誘導時間を２時間とし、浸透圧ショックおよび濁度をＯ
Ｄ　ＨＯｒ＋ｍ　−１に調節した後に採取した上澄みｌ
Ｔ１１当りの成熟したペリプラズムｈＧＨの量（μｇ）
を測定したところ、次の結果が得られた。

（浸透圧ショックおよびＯＤ６００ｎｍ　＝　１となる
ように濁度を調節した後に収集 した上澄み１Ｍ当りのμｇ数） Ａ株／ｐ２１２．８　　　　　　　　２．０８ＣＮＣＭ
　　　　　　　　　　　　２．０７１−５２９株／ｐ２
１２，１３ クロモソームが■Ｌ欠失変異およびｃｒｐ欠失変異を存
するＡ株と、クロモソームが同様の■Ｌ欠失変異を有す
るｌ−５２９株は、同一の挙動をすると考えられる。

これらの例は、ｃＡＭＰ−ＣＲｐＨｊ合体の固定後にの
み転写が開始され得るオペロンの発現を制限しまたは抑
制する変異をもった菌株を使用することによって、明白
な利点がもたらされることを示している。：事実、これ
らの菌株は所望のペリプラズムたんぱく質の生産を実質
的に増大（これらの例では、成熟形でのたんぱく質につ
いて９８％）させることが可能である。例Ｅでは、この
ような細菌の使用によって与えられる絶対的な一次的利
点（ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ　ｆｉｒｓｔ−ｒａｔｅ　ａ
ｄｖａｎｔａｇｅ　）が強調される。：変異株は細胞周
辺腔内に通常存在する固有のたんぱく質の生産を制限す
るから、観察される増大は絶対的なだけでなく、相対的
である。

これは、目標とするたんぱく質の細胞周辺腔の内容物か
らの精製を容易にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、天然ｈＧＨ前駆体の１つをコードするＤＮＡ
配列体およびこれのアミノ酸配列を示す配列図である。 第２図および第３図は、プラスミドについて、主要なり
ＮＡ配列体の位置と配向を示す機能地図である。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）当該たんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配列
   体を導入されたグラム陰性菌を培養することによってた
   んぱく質を製造する微生物学的方法であって、転写がｃ
   ＡＭＰ−ＣＲＰ複合体の固定に依存するオペロンの発現
   を制限するまたは抑制さえも行う少なくとも１つの突然
   変異を担うクロモソームを有する細菌株を使用すること
   を包含する、たんぱく質を製造する微生物学的方法。
2. （２）当該細菌のクロモソームが、￥ｃｙａ￥遺伝子と
   その発現を調節するＤＮＡ配列体とにより形成される系
   に影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異を担う特許請
   求の範囲第１項記載の微生物学的方法。
3. （３）当該細菌のクロモソームが、￥ｃｒｐ￥遺伝子と
   その発現を調節するＤＮＡ配列体とにより形成される系
   に影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異を担う特許請
   求の範囲第１項記載の微生物学的方法。
4. （４）当該細菌のクロモソームが、￥ｃｙａ￥遺伝子と
   その発現を調節するＤＮＡ配列体とにより形成される系
   に影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異、および、￥
   ｃｒｐ￥遺伝子とその発現を調節するＤＮＡ配列体とに
   より形成される系に影響を及ぼす少なくとも１つの突然
   変異を担う特許請求の範囲第１項記載の微生物学的方法
   。
5. （５）使用する突然変異細菌株が大腸菌の種の菌株であ
   る特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項
   に記載する微生物学的方法。
6. （６）突然変異細菌株がＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ
   −５２９として寄託した菌株の特性を有する特許請求の
   範囲第２項から第５項までのいずれか１項に記載する微
   生物学的方法。
7. （７）突然変異細菌株がＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ
   −５２８として寄託した菌株の特性を有する特許請求の
   範囲第３項から第５項までのいずれか１項に記載する微
   生物学的方法。
8. （８）クロモソームが２つの欠失を有し、その一方が、
   ￥ｃｙａ￥遺伝子とその発現を調節するＤＮＡ配列体と
   により形成される系に影響を及ぼし、他方が、￥ｃｒｐ
   ￥遺伝子とその発現を調節するＤＮＡ配列体とにより形
   成される系に影響を及ぼす大腸菌の菌株を、突然変異細
   菌株として使用する特許請求の範囲第４項または第５項
   に記載する微生物学的方法。
9. （９）所望のたんぱく質の前駆体をコードするＤＮＡ配
   列体が、その発現を可能にする調節要素と共に、プラス
   ミドに担われている特許請求の範囲第１項から第８項ま
   でのいずれか１項に記載する微生物学的方法。
10. （１０）当該細菌株がヒト成長ホルモンの前駆体をコー
    ドするＤＮＡ配列体を含有する特許請求の範囲第１項か
    ら第９項までのいずれか第１項に記載する微生物学的方
    法。
11. （１１）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−５３０として
    寄託したプラスミドの一般的特性を有するプラスミドに
    、当該ＤＮＡ配列体が担われる特許請求の範囲第１０項
    記載の微生物学的方法。
12. （１２）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−５２８として
    寄託した菌株の一般的特性を有する細菌株。
13. （１３）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−５２９として
    寄託した菌株の一般的特性を有する細菌株。
14. （１４）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−５３０として
    寄託したプラスミドの一般的特性を有するプラスミド。