JPH09313191A - 蛋白質の分泌生産法 - Google Patents
蛋白質の分泌生産法Info
- Publication number
- JPH09313191A JPH09313191A JP6658597A JP6658597A JPH09313191A JP H09313191 A JPH09313191 A JP H09313191A JP 6658597 A JP6658597 A JP 6658597A JP 6658597 A JP6658597 A JP 6658597A JP H09313191 A JPH09313191 A JP H09313191A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- protein
- escherichia coli
- sec
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物での分泌生産が困難であった有用蛋白
質にも有効な、分泌効率の高い組換え蛋白質の分泌生産
方法を提供する。 【解決手段】 組換え蛋白質の遺伝子を含有し、さらに
ＳｅｃＢ、ＳｅｃＤ／Ｆ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙのい
ずれか一つの遺伝子を人為的かつ過剰発現が抑制される
ような制御下で含有してなる組換えプラスミドで大腸菌
を形質転換し、該組換え蛋白質をペリプラズムに効率よ
く分泌生産させる。
質にも有効な、分泌効率の高い組換え蛋白質の分泌生産
方法を提供する。 【解決手段】 組換え蛋白質の遺伝子を含有し、さらに
ＳｅｃＢ、ＳｅｃＤ／Ｆ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙのい
ずれか一つの遺伝子を人為的かつ過剰発現が抑制される
ような制御下で含有してなる組換えプラスミドで大腸菌
を形質転換し、該組換え蛋白質をペリプラズムに効率よ
く分泌生産させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は大腸菌を用いた有用
蛋白質の分泌生産法に関するものであり、さらに詳しく
は大腸菌のペリプラズムに組換え蛋白質を分泌蓄積させ
るに際して、分泌効率の高い生産を可能ならしめるため
に、蛋白質の膜輸送に関与する蛋白質遺伝子を目的蛋白
質の遺伝子とともに共発現させる、大腸菌形質転換体を
用いた組換え蛋白質の分泌生産法に関するものである。
蛋白質の分泌生産法に関するものであり、さらに詳しく
は大腸菌のペリプラズムに組換え蛋白質を分泌蓄積させ
るに際して、分泌効率の高い生産を可能ならしめるため
に、蛋白質の膜輸送に関与する蛋白質遺伝子を目的蛋白
質の遺伝子とともに共発現させる、大腸菌形質転換体を
用いた組換え蛋白質の分泌生産法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術による有用蛋白質の生
産には大腸菌が多く使用される。大腸菌を用いたそのよ
うな蛋白質の生産法は、大きく分類して菌体内生産法と
分泌生産法に分けられる。分泌生産法は、菌体内生産法
に比べて膜輸送及び前駆体プロセッシングの過程が余分
に必要なため、その生産効率は一般に低い。特に、哺乳
動物由来の蛋白質を大腸菌などの原核生物を使って分泌
生産すると、原核生物由来の蛋白質を分泌生産させた場
合に比べ生産効率が極めて低いことが知られている。そ
こで、哺乳動物由来の蛋白質生産にも応用可能な優れた
分泌生産法が望まれていた。
産には大腸菌が多く使用される。大腸菌を用いたそのよ
うな蛋白質の生産法は、大きく分類して菌体内生産法と
分泌生産法に分けられる。分泌生産法は、菌体内生産法
に比べて膜輸送及び前駆体プロセッシングの過程が余分
に必要なため、その生産効率は一般に低い。特に、哺乳
動物由来の蛋白質を大腸菌などの原核生物を使って分泌
生産すると、原核生物由来の蛋白質を分泌生産させた場
合に比べ生産効率が極めて低いことが知られている。そ
こで、哺乳動物由来の蛋白質生産にも応用可能な優れた
分泌生産法が望まれていた。
【０００３】これまでに、細胞質膜透過実験法、遺伝生
化学的実験法の確立により大腸菌での蛋白質分泌の膜輸
送にＳｅｃ蛋白質（例えば，ＳｅｃＢ，ＳｅｃＡ，Ｓｅ
ｃＤ，ＳｅｃＦ，ＳｅｃＥ，ＳｅｃＹ，ＳｅｃＧ）が関
与していることが明らかになっている。ＳｅｃＢは、細
胞質に存在し、多くの前駆体と結合してその前駆体を膜
輸送に適した状態（アンフォールディング状態）に保つ
いわゆる分子シャペロンとして働く。ＳｅｃＢは分泌型
蛋白質に特異的なシャペロンである。その他に、一般的
なシャペロンとして、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪなどの存在も知られている。ＳｅｃＡは細
胞質膜の細胞質側にある膜表在性蛋白質であり、分泌型
蛋白質の膜輸送に必須の因子である。ＳｅｃＡは、細胞
質内に生成した前駆体蛋白質のＮ末端に存在するシグナ
ルペプチドに結合して、前駆体を膜輸送装置へと導くと
考えられている。また、ＳｅｃＡは膜輸送に必須である
ＡＴＰａｓｅ活性を持ち、前駆体蛋白質を原形質膜中に
挿入して膜輸送を開始させる役割を果たしている。Ｓｅ
ｃＥおよびＳｅｃＹは、ＳｅｃＡと同様に膜輸送の必須
な因子であることが知られている。ＳｅｃＥおよびＳｅ
ｃＹは共に細胞質膜内在性蛋白質であり、複合体として
機能を果たしている。また、ＳｅｃＹは不安定な蛋白で
あるため通常はＳｅｃＥとの複合体ＳｅｃＥ／Ｙと表記
して一つの因子として扱うこともある。ＳｅｃＡの有す
るＡＴＰａｓｅ活性の再構成には、ＳｅｃＡ−ＳｅｃＥ
−ＳｅｃＹの３者が必要であることも知られている。Ｓ
ｅｃＧは、膜輸送の必須因子であるＳｅｃＡ−ＳｅｃＥ
−ＳｅｃＹ複合体の活性化に関与し、低温での大腸菌の
生育及び蛋白質分泌に必須であることが明かになってい
る。ＳｅｃＤおよびＳｅｃＦは、共に細胞質膜内在性蛋
白質でありその分子の大部分がペリプラズム側に存在す
ることが知られている。ＳｅｃＤとＳｅｃＦはオペロン
を形成していることからＳｅｃＤ／Ｆと表記し、一つの
因子として扱う。ＳｅｃＤは膜輸送の最終段階である分
泌蛋白質の膜からの遊離に関与することが示唆されてい
る。ＳｅｃＦの機能は明らかではないがＳｅｃＤと同様
の働きをしていると考えられている。
化学的実験法の確立により大腸菌での蛋白質分泌の膜輸
送にＳｅｃ蛋白質（例えば，ＳｅｃＢ，ＳｅｃＡ，Ｓｅ
ｃＤ，ＳｅｃＦ，ＳｅｃＥ，ＳｅｃＹ，ＳｅｃＧ）が関
与していることが明らかになっている。ＳｅｃＢは、細
胞質に存在し、多くの前駆体と結合してその前駆体を膜
輸送に適した状態（アンフォールディング状態）に保つ
いわゆる分子シャペロンとして働く。ＳｅｃＢは分泌型
蛋白質に特異的なシャペロンである。その他に、一般的
なシャペロンとして、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪなどの存在も知られている。ＳｅｃＡは細
胞質膜の細胞質側にある膜表在性蛋白質であり、分泌型
蛋白質の膜輸送に必須の因子である。ＳｅｃＡは、細胞
質内に生成した前駆体蛋白質のＮ末端に存在するシグナ
ルペプチドに結合して、前駆体を膜輸送装置へと導くと
考えられている。また、ＳｅｃＡは膜輸送に必須である
ＡＴＰａｓｅ活性を持ち、前駆体蛋白質を原形質膜中に
挿入して膜輸送を開始させる役割を果たしている。Ｓｅ
ｃＥおよびＳｅｃＹは、ＳｅｃＡと同様に膜輸送の必須
な因子であることが知られている。ＳｅｃＥおよびＳｅ
ｃＹは共に細胞質膜内在性蛋白質であり、複合体として
機能を果たしている。また、ＳｅｃＹは不安定な蛋白で
あるため通常はＳｅｃＥとの複合体ＳｅｃＥ／Ｙと表記
して一つの因子として扱うこともある。ＳｅｃＡの有す
るＡＴＰａｓｅ活性の再構成には、ＳｅｃＡ−ＳｅｃＥ
−ＳｅｃＹの３者が必要であることも知られている。Ｓ
ｅｃＧは、膜輸送の必須因子であるＳｅｃＡ−ＳｅｃＥ
−ＳｅｃＹ複合体の活性化に関与し、低温での大腸菌の
生育及び蛋白質分泌に必須であることが明かになってい
る。ＳｅｃＤおよびＳｅｃＦは、共に細胞質膜内在性蛋
白質でありその分子の大部分がペリプラズム側に存在す
ることが知られている。ＳｅｃＤとＳｅｃＦはオペロン
を形成していることからＳｅｃＤ／Ｆと表記し、一つの
因子として扱う。ＳｅｃＤは膜輸送の最終段階である分
泌蛋白質の膜からの遊離に関与することが示唆されてい
る。ＳｅｃＦの機能は明らかではないがＳｅｃＤと同様
の働きをしていると考えられている。
【０００４】このように、大腸菌の蛋白質分泌のメカニ
ズムや蛋白質の膜輸送にＳｅｃ蛋白質が関与しているこ
とが明らかになっている。しかし、これらのＳｅｃ蛋白
質を有用蛋白の分泌生産に応用することは試みられては
いるものの、その応用例は数例しか知られていない。
ズムや蛋白質の膜輸送にＳｅｃ蛋白質が関与しているこ
とが明らかになっている。しかし、これらのＳｅｃ蛋白
質を有用蛋白の分泌生産に応用することは試みられては
いるものの、その応用例は数例しか知られていない。
【０００５】その一つにインターロイキン−６（ＩＬ−
６）の大腸菌での分泌生産に関する報告（ＢＩＯ／ＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２，ｐｐ．１７８−１８０，（１
９９４））がある。該文献では、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＹ
（別名：ｐｒｌＡ）、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹの変異蛋白
質）の遺伝子を単独であるいは一緒に発現ベクターに組
み込んだプラスミドとＩＬ−６遺伝子を含むプラスミド
の２つのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた各
形質転換大腸菌のＩＬ−６の分泌生産量を比較してい
る。その結果、ＳｅｃＥとｐｒｌＡ４の両遺伝子を共発
現させた場合には顕著なＩＬ−６の分泌効率の向上が見
られたが、ＳｅｃＥ遺伝子単独あるいはｐｒｌＡ４遺伝
子単独をＩＬ−６と共発現させた場合にはＩＬ−６の分
泌効率の向上はほとんど認められず、また、ＳｅｃＹと
ＳｅｃＥの両遺伝子を共発現させた場合には逆にＩＬ−
６の分泌効率は低下した。
６）の大腸菌での分泌生産に関する報告（ＢＩＯ／ＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２，ｐｐ．１７８−１８０，（１
９９４））がある。該文献では、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＹ
（別名：ｐｒｌＡ）、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹの変異蛋白
質）の遺伝子を単独であるいは一緒に発現ベクターに組
み込んだプラスミドとＩＬ−６遺伝子を含むプラスミド
の２つのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた各
形質転換大腸菌のＩＬ−６の分泌生産量を比較してい
る。その結果、ＳｅｃＥとｐｒｌＡ４の両遺伝子を共発
現させた場合には顕著なＩＬ−６の分泌効率の向上が見
られたが、ＳｅｃＥ遺伝子単独あるいはｐｒｌＡ４遺伝
子単独をＩＬ−６と共発現させた場合にはＩＬ−６の分
泌効率の向上はほとんど認められず、また、ＳｅｃＹと
ＳｅｃＥの両遺伝子を共発現させた場合には逆にＩＬ−
６の分泌効率は低下した。
【０００６】また、同研究者らはＨｕｍａｎ Ｇｒａｎ
ｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ
ｇ ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ）の大腸菌での分泌生産
についても報告している。（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１０（２），ｐ
ｐ．５２４−５２９，（１９９５））。該論文中には、
シャペロンであるＳｅｃＢ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ遺伝子を単独あるいは複数含むプラ
スミドを構築し、そのプラスミドで形質転換した大腸菌
を培養し、各シャペロン遺伝子の共発現によるＧ−ＣＳ
Ｆ分泌効率への効果を比較している。その結果、Ｄｎａ
ＫあるいはＤｎａＪ遺伝子を単独で共発現させた場合に
は前駆体のプロセスについて多少の改善が見られ、Ｄｎ
ａＫとＤｎａＪの両シャペロン遺伝子を共発現させた場
合にもっとも顕著な効果があった。それに対し、Ｓｅｃ
Ｂ単独やＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの両シャペロン遺伝子
を共発現させた場合では全く効果がなかった。また、Ｉ
Ｌ−６の分泌生産効率への前記各種シャペロン遺伝子の
共発現についても同様に検討され、効果は全く見られな
かったことも同時に報告している。
ｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ
ｇ ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ）の大腸菌での分泌生産
についても報告している。（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１０（２），ｐ
ｐ．５２４−５２９，（１９９５））。該論文中には、
シャペロンであるＳｅｃＢ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ遺伝子を単独あるいは複数含むプラ
スミドを構築し、そのプラスミドで形質転換した大腸菌
を培養し、各シャペロン遺伝子の共発現によるＧ−ＣＳ
Ｆ分泌効率への効果を比較している。その結果、Ｄｎａ
ＫあるいはＤｎａＪ遺伝子を単独で共発現させた場合に
は前駆体のプロセスについて多少の改善が見られ、Ｄｎ
ａＫとＤｎａＪの両シャペロン遺伝子を共発現させた場
合にもっとも顕著な効果があった。それに対し、Ｓｅｃ
Ｂ単独やＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの両シャペロン遺伝子
を共発現させた場合では全く効果がなかった。また、Ｉ
Ｌ−６の分泌生産効率への前記各種シャペロン遺伝子の
共発現についても同様に検討され、効果は全く見られな
かったことも同時に報告している。
【０００７】以上のことは、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子をただ
単純に共発現させただけでは分泌効率を必ずしも向上さ
せることはできないことを示している。つまり、膜輸送
に関与することがｉｎ ｖｉｔｒｏで立証されているこ
れらのＳｅｃ蛋白質遺伝子をどのように発現させれば分
泌効率の向上に寄与させ得るかについての指針はない。
前述のＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２，ｐｐ．１
７８−１８０（１９９４）は、ＳｅｃＹの変異体（ｐｒ
ｌＡ４）を使用した極めて特殊な成功例である。さらに
は、２つのプラスミド（ＳｅｃＥ／ｐｒｌＡ４遺伝子を
含むプラスミドとＩＬ−６遺伝子を含むプラスミド）で
形質転換された大腸菌を使用している。２つのプラスミ
ドで形質転換された細胞は一般にプラスミドの不和合性
からコピー数の恒常的制御が困難であるため、蛋白質生
産効率が不安定で、工業生産上の使用に耐え得ないとい
う問題がある。
単純に共発現させただけでは分泌効率を必ずしも向上さ
せることはできないことを示している。つまり、膜輸送
に関与することがｉｎ ｖｉｔｒｏで立証されているこ
れらのＳｅｃ蛋白質遺伝子をどのように発現させれば分
泌効率の向上に寄与させ得るかについての指針はない。
前述のＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１２，ｐｐ．１
７８−１８０（１９９４）は、ＳｅｃＹの変異体（ｐｒ
ｌＡ４）を使用した極めて特殊な成功例である。さらに
は、２つのプラスミド（ＳｅｃＥ／ｐｒｌＡ４遺伝子を
含むプラスミドとＩＬ−６遺伝子を含むプラスミド）で
形質転換された大腸菌を使用している。２つのプラスミ
ドで形質転換された細胞は一般にプラスミドの不和合性
からコピー数の恒常的制御が困難であるため、蛋白質生
産効率が不安定で、工業生産上の使用に耐え得ないとい
う問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的とすると
ころは、これまで微生物での分泌生産が困難であった有
用蛋白質にも有効な、分泌効率の高いプラスミドを提供
すること、該プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換
体を提供すること、該大腸菌形質転換体を使用した組換
え蛋白質の分泌生産法を提供することにある。
ころは、これまで微生物での分泌生産が困難であった有
用蛋白質にも有効な、分泌効率の高いプラスミドを提供
すること、該プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換
体を提供すること、該大腸菌形質転換体を使用した組換
え蛋白質の分泌生産法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｓｅｃ蛋
白質遺伝子を目的とする蛋白質の遺伝子と共発現させる
ことが可能な種々のプラスミドを構築し、該プラスミド
で形質転換させた大腸菌を作製し、目的蛋白質のペリプ
ラズムへの分泌効率を比較した。すると驚いたことに、
Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の発現を過剰でないように抑制する
ことが非常に重要であり、その適正な共発現量でのみ目
的蛋白質の分泌効率の向上が可能であることを見い出し
本発明を完成した。Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の発現量が目的
蛋白質の分泌効率の向上に大きな影響を与えることは、
これまでのｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果からは予測不可
能であり、前述のＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦの分泌生産に関
する報告においても、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の発現量の影
響に関する記載はない。
白質遺伝子を目的とする蛋白質の遺伝子と共発現させる
ことが可能な種々のプラスミドを構築し、該プラスミド
で形質転換させた大腸菌を作製し、目的蛋白質のペリプ
ラズムへの分泌効率を比較した。すると驚いたことに、
Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の発現を過剰でないように抑制する
ことが非常に重要であり、その適正な共発現量でのみ目
的蛋白質の分泌効率の向上が可能であることを見い出し
本発明を完成した。Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の発現量が目的
蛋白質の分泌効率の向上に大きな影響を与えることは、
これまでのｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果からは予測不可
能であり、前述のＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦの分泌生産に関
する報告においても、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の発現量の影
響に関する記載はない。
【００１０】即ち本発明は、蛋白質の遺伝子及びＳｅｃ
Ｂ、ＳｅｃＤ／Ｆ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙよりなる群
から選ばれる少なくとも一つの大腸菌由来のＳｅｃ蛋白
質遺伝子を含有し、更に該Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の過剰発
現を抑制的に制御するＤＮＡを含有する組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドで形質転換することにより得ら
れ、蛋白質の遺伝子と大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子
が発現することを特徴とする大腸菌形質転換体、及び該
大腸菌形質転換体を培養して蛋白質を大腸菌のペリプラ
ズムに分泌生産させることを特徴とする蛋白質の分泌生
産方法を提供するものである。
Ｂ、ＳｅｃＤ／Ｆ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙよりなる群
から選ばれる少なくとも一つの大腸菌由来のＳｅｃ蛋白
質遺伝子を含有し、更に該Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の過剰発
現を抑制的に制御するＤＮＡを含有する組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドで形質転換することにより得ら
れ、蛋白質の遺伝子と大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子
が発現することを特徴とする大腸菌形質転換体、及び該
大腸菌形質転換体を培養して蛋白質を大腸菌のペリプラ
ズムに分泌生産させることを特徴とする蛋白質の分泌生
産方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における蛋白質膜の輸送に関与する蛋白質（Ｓｅ
ｃ蛋白質）とは、具体的には大腸菌由来のＳｅｃＢ、Ｓ
ｅｃＥ、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧおよ
びそれらと同様の機能を有する一残基あるいは数残基の
アミノ酸が部分的に挿入、置換あるはい欠損した変異体
（例えば、ＳｅｃＹの変異体であるｐｒｌＡ４）を意味
する。これらのＳｅｃ蛋白質の遺伝子の取得は、例えば
大腸菌の染色体ＤＮＡなどから実施例に記載の方法によ
り可能であるが、化学合成により構築されたものなど如
何なるものでもよい。Ｓｅｃ蛋白質遺伝子は本来大腸菌
の染色体内に予め存在するものであるが、本発明におい
てはＳｅｃ蛋白質遺伝子を人為的に発現させるために、
例えば大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子をプラスミドに
存在させ、大腸菌が本来生産しているＳｅｃ蛋白質遺伝
子とは別に発現させる。
本発明における蛋白質膜の輸送に関与する蛋白質（Ｓｅ
ｃ蛋白質）とは、具体的には大腸菌由来のＳｅｃＢ、Ｓ
ｅｃＥ、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＤ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧおよ
びそれらと同様の機能を有する一残基あるいは数残基の
アミノ酸が部分的に挿入、置換あるはい欠損した変異体
（例えば、ＳｅｃＹの変異体であるｐｒｌＡ４）を意味
する。これらのＳｅｃ蛋白質の遺伝子の取得は、例えば
大腸菌の染色体ＤＮＡなどから実施例に記載の方法によ
り可能であるが、化学合成により構築されたものなど如
何なるものでもよい。Ｓｅｃ蛋白質遺伝子は本来大腸菌
の染色体内に予め存在するものであるが、本発明におい
てはＳｅｃ蛋白質遺伝子を人為的に発現させるために、
例えば大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子をプラスミドに
存在させ、大腸菌が本来生産しているＳｅｃ蛋白質遺伝
子とは別に発現させる。
【００１２】本発明においては、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を
目的蛋白質遺伝子と共発現させる方法として両遺伝子を
同一プラスミド内に存在させる方法を用いているが、両
遺伝子を共に染色体内に存在させる方法、染色体とプラ
スミドあるいは２つの異なるプラスミドに別々に存在さ
せる方法も可能かもしれない。
目的蛋白質遺伝子と共発現させる方法として両遺伝子を
同一プラスミド内に存在させる方法を用いているが、両
遺伝子を共に染色体内に存在させる方法、染色体とプラ
スミドあるいは２つの異なるプラスミドに別々に存在さ
せる方法も可能かもしれない。
【００１３】本発明におけるＳｅｃ蛋白質遺伝子の過剰
発現を抑制的に制御する方法には、転写抑制の制御と翻
訳抑制の制御の方法がある。転写抑制には、Ｓｅｃ蛋白
質遺伝子の発現に誘導型プロモーター（例えば、ｔａｃ
プロモーター、ｌａｃプロモーターなど）を使用し、誘
導剤を低い濃度で添加あるいは無添加で培養する方法
や、実施例１〜４に記載のようにプロモーターのリプレ
ッサー遺伝子（例えば、ｔａｃプロモーターに対するｌ
ａｃＩq）を用いる方法などがある。翻訳抑制の制御方
法には実施例３に記載のように、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の
発現に関与するＳＤ配列とＳｅｃ蛋白質遺伝子の翻訳開
始コドンまでの塩基数（距離）を増加する方法などが挙
げられる。
発現を抑制的に制御する方法には、転写抑制の制御と翻
訳抑制の制御の方法がある。転写抑制には、Ｓｅｃ蛋白
質遺伝子の発現に誘導型プロモーター（例えば、ｔａｃ
プロモーター、ｌａｃプロモーターなど）を使用し、誘
導剤を低い濃度で添加あるいは無添加で培養する方法
や、実施例１〜４に記載のようにプロモーターのリプレ
ッサー遺伝子（例えば、ｔａｃプロモーターに対するｌ
ａｃＩq）を用いる方法などがある。翻訳抑制の制御方
法には実施例３に記載のように、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の
発現に関与するＳＤ配列とＳｅｃ蛋白質遺伝子の翻訳開
始コドンまでの塩基数（距離）を増加する方法などが挙
げられる。
【００１４】本発明において、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の過
剰発現は培養した大腸菌破砕液の電気泳動分析を実施す
れば容易に確認可能である。
剰発現は培養した大腸菌破砕液の電気泳動分析を実施す
れば容易に確認可能である。
【００１５】本発明者らは、ＳｅｃＡについても種々検
討したが、共発現による分泌促進効果は見いだせなかっ
た。しかし、共発現系の検討をさらに詳細に実施すれば
ＳｅｃＡ共発現による分泌促進効果を見いだせる可能性
は大いに有り得る。
討したが、共発現による分泌促進効果は見いだせなかっ
た。しかし、共発現系の検討をさらに詳細に実施すれば
ＳｅｃＡ共発現による分泌促進効果を見いだせる可能性
は大いに有り得る。
【００１６】本発明で分泌生産される目的蛋白質は、大
腸菌において分泌可能な蛋白質であれば特に限定されな
いが、真核生物、特に哺乳類由来の蛋白質が適当であ
る。真核生物由来の蛋白質を大腸菌により分泌生産させ
た場合、原核生物由来の蛋白質に比べ分泌生産が困難で
あることが知られている。その理由は、大腸菌内で発現
した真核生物由来の蛋白質は、大腸菌体内で異物として
認識され、その結果プロテオリシスを受けやすいと考え
られている。さらに、分泌された真核生物由来の蛋白質
は、膜透過の際のフォールディングが正しく起こらず不
活性型になり易い。また、分泌の際にシグナルペプチド
のプロセッシングが必ずしも正しく起こるとは限らず、
正しいＮ末端アミノ酸配列を持った蛋白質が得難い。こ
のような問題点が真核生物由来の蛋白質の分泌生産を困
難にしている。これらの問題点は、膜透過機構が原核生
物とは異なる真核生物由来の蛋白質を原核生物の膜透過
機構で分泌させることに起因している。従って、大腸菌
由来のβ−ラクタマーゼなどの原核生物由来の蛋白質を
分泌生産する際は、該蛋白質本来の膜透過機構により分
泌されるため障害が少なくＳｅｃ蛋白質の共発現による
効果は顕著ではない。他方、哺乳類由来の蛋白質を原核
生物で分泌生産させる際にそのＳｅｃ蛋白質の共発現の
効果が明確に現われる。本発明における分泌生産可能な
哺乳類由来の蛋白質としては、Ｇ−ＣＳＦ、インシュリ
ン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、プロ
ラクチン、ＧＨ結合蛋白などの蛋白質が挙げられる。特
に、分子量約２００００のヒト成長ホルモン（以下２０
ｋＧＨ）の分泌に関して顕著な効果があるので適当であ
る。
腸菌において分泌可能な蛋白質であれば特に限定されな
いが、真核生物、特に哺乳類由来の蛋白質が適当であ
る。真核生物由来の蛋白質を大腸菌により分泌生産させ
た場合、原核生物由来の蛋白質に比べ分泌生産が困難で
あることが知られている。その理由は、大腸菌内で発現
した真核生物由来の蛋白質は、大腸菌体内で異物として
認識され、その結果プロテオリシスを受けやすいと考え
られている。さらに、分泌された真核生物由来の蛋白質
は、膜透過の際のフォールディングが正しく起こらず不
活性型になり易い。また、分泌の際にシグナルペプチド
のプロセッシングが必ずしも正しく起こるとは限らず、
正しいＮ末端アミノ酸配列を持った蛋白質が得難い。こ
のような問題点が真核生物由来の蛋白質の分泌生産を困
難にしている。これらの問題点は、膜透過機構が原核生
物とは異なる真核生物由来の蛋白質を原核生物の膜透過
機構で分泌させることに起因している。従って、大腸菌
由来のβ−ラクタマーゼなどの原核生物由来の蛋白質を
分泌生産する際は、該蛋白質本来の膜透過機構により分
泌されるため障害が少なくＳｅｃ蛋白質の共発現による
効果は顕著ではない。他方、哺乳類由来の蛋白質を原核
生物で分泌生産させる際にそのＳｅｃ蛋白質の共発現の
効果が明確に現われる。本発明における分泌生産可能な
哺乳類由来の蛋白質としては、Ｇ−ＣＳＦ、インシュリ
ン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、プロ
ラクチン、ＧＨ結合蛋白などの蛋白質が挙げられる。特
に、分子量約２００００のヒト成長ホルモン（以下２０
ｋＧＨ）の分泌に関して顕著な効果があるので適当であ
る。
【００１７】本発明者らは既に大腸菌での２０ＫｈＧＨ
の生産方法を確立し、２０ＫｈＧＨの分泌生産において
バチルス・アミロリキファシエンス中性プロテアーゼの
分泌に関与するシグナルペプチドのオリジナル配列より
も好ましい改変シグナルペプチドを得ている。本発明者
らは２０ＫｈＧＨの分泌効率に与えるＳｅｃ蛋白質遺伝
子の共発現の効果を検討するため、この改変シグナルペ
プチド配列を有するプラスミドｐＧＨＲ１０（該プラス
ミドは、本発明者らがＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託している２０
ＫｈＧＨ分泌大腸菌株ＭＴ−１０７６５より抽出でき
る。）から実施例に記載のようなプラスミドを構築し、
そのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた大腸菌
形質転換体の分泌生産性を比較した。蛋白質の分泌効率
を向上させるためには、蛋白質の一連の分泌過程で律速
となっているステップに関与しているＳｅｃ蛋白質を共
発現させることが有効である。その律速ステップは分泌
させる目的蛋白質により異なるため、目的蛋白質ごとに
律速ステップに関与するＳｅｃ蛋白質を選択し、適度に
そのＳｅｃ蛋白質遺伝子の発現量を抑制し共発現させれ
ば、あらゆる種類の分泌蛋白質の分泌効率を向上でき
る。実施例に記載のように、２０ＫｈＧＨの分泌におい
て異なるＳｅｃ蛋白質遺伝子の共発現が有効であったこ
とは、２０ＫｈＧＨの分泌に複数の律速ステップが存在
することを意味し、それが２０ｋｈＧＨが分泌し難い蛋
白質である理由の一つと考えられる。
の生産方法を確立し、２０ＫｈＧＨの分泌生産において
バチルス・アミロリキファシエンス中性プロテアーゼの
分泌に関与するシグナルペプチドのオリジナル配列より
も好ましい改変シグナルペプチドを得ている。本発明者
らは２０ＫｈＧＨの分泌効率に与えるＳｅｃ蛋白質遺伝
子の共発現の効果を検討するため、この改変シグナルペ
プチド配列を有するプラスミドｐＧＨＲ１０（該プラス
ミドは、本発明者らがＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託している２０
ＫｈＧＨ分泌大腸菌株ＭＴ−１０７６５より抽出でき
る。）から実施例に記載のようなプラスミドを構築し、
そのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた大腸菌
形質転換体の分泌生産性を比較した。蛋白質の分泌効率
を向上させるためには、蛋白質の一連の分泌過程で律速
となっているステップに関与しているＳｅｃ蛋白質を共
発現させることが有効である。その律速ステップは分泌
させる目的蛋白質により異なるため、目的蛋白質ごとに
律速ステップに関与するＳｅｃ蛋白質を選択し、適度に
そのＳｅｃ蛋白質遺伝子の発現量を抑制し共発現させれ
ば、あらゆる種類の分泌蛋白質の分泌効率を向上でき
る。実施例に記載のように、２０ＫｈＧＨの分泌におい
て異なるＳｅｃ蛋白質遺伝子の共発現が有効であったこ
とは、２０ＫｈＧＨの分泌に複数の律速ステップが存在
することを意味し、それが２０ｋｈＧＨが分泌し難い蛋
白質である理由の一つと考えられる。
【００１８】２０ＫｈＧＨは、現在臨床で使用されてい
る分子量約２２０００のヒト成長ホルモン（２２ＫｈＧ
Ｈ）を構成する１９１個のアミノ酸配列のうち、３２〜
４６番目のアミノ酸配列（１５残基）が欠失した１７６
個のアミノ酸配列を有する。２０ＫＧＨは２２ＫｈＧＨ
投与の際のリスクとして指摘されている耐糖能異常誘発
性や白血病原性が低い可能性があり、その生物学的特性
から新しい医薬品ｈＧＨとして期待されている蛋白質で
ある。また、２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列のＮ末端から
第１４番目のアミノ酸については、セリンとメチオニン
の２種類の報告がある。即ち、Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，９４９，ｐ．１２５，（１９８
８）では、Ｎ末端から第１４番目のアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡ塩基配列がＡＧＴ（セリンのコード）で
あり、Ｍａｒｔｉａｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２０５，ｐ．６０２，（１９７９）では、Ｎ末
端から第１４番目のアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列
がＡＵＧ（メチオニンのコード）である。本発明におけ
る２０ＫｈＧＨとは、第１４番目のアミノ酸がメチオニ
ンあるいはセリンである両アミノ酸配列を意味する。本
発明の２０ＫＧＨとしては、アミノ酸配列が１〜２個置
換、欠失、挿入されたものも含む。
る分子量約２２０００のヒト成長ホルモン（２２ＫｈＧ
Ｈ）を構成する１９１個のアミノ酸配列のうち、３２〜
４６番目のアミノ酸配列（１５残基）が欠失した１７６
個のアミノ酸配列を有する。２０ＫＧＨは２２ＫｈＧＨ
投与の際のリスクとして指摘されている耐糖能異常誘発
性や白血病原性が低い可能性があり、その生物学的特性
から新しい医薬品ｈＧＨとして期待されている蛋白質で
ある。また、２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列のＮ末端から
第１４番目のアミノ酸については、セリンとメチオニン
の２種類の報告がある。即ち、Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，９４９，ｐ．１２５，（１９８
８）では、Ｎ末端から第１４番目のアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡ塩基配列がＡＧＴ（セリンのコード）で
あり、Ｍａｒｔｉａｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２０５，ｐ．６０２，（１９７９）では、Ｎ末
端から第１４番目のアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列
がＡＵＧ（メチオニンのコード）である。本発明におけ
る２０ＫｈＧＨとは、第１４番目のアミノ酸がメチオニ
ンあるいはセリンである両アミノ酸配列を意味する。本
発明の２０ＫＧＨとしては、アミノ酸配列が１〜２個置
換、欠失、挿入されたものも含む。
【００１９】本発明における組換えプラスミドの構築方
法は、例えば、取得した遺伝子のＤＮＡ断片の両端を制
限酵素で切断し、大腸菌内で複製可能なプラスミドの当
該部位に挿入する常法により容易に実施可能である。こ
の際に利用されるプラスミドベクターとしては、例えば
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９などがあり、これらは市販品
であり容易に入手可能である。
法は、例えば、取得した遺伝子のＤＮＡ断片の両端を制
限酵素で切断し、大腸菌内で複製可能なプラスミドの当
該部位に挿入する常法により容易に実施可能である。こ
の際に利用されるプラスミドベクターとしては、例えば
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９などがあり、これらは市販品
であり容易に入手可能である。
【００２０】本発明で宿主として使用できる大腸菌株と
しては、いかなるものでも良いが、好ましくは病原性が
なく、使用経験豊富な大腸菌株が好ましく、そのような
ものとして、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０（Ａ
ＴＣＣ ２７３２５）（ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ
カルチャー・コレクションの番号である）などが好適に
使用される。
しては、いかなるものでも良いが、好ましくは病原性が
なく、使用経験豊富な大腸菌株が好ましく、そのような
ものとして、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０（Ａ
ＴＣＣ ２７３２５）（ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ
カルチャー・コレクションの番号である）などが好適に
使用される。
【００２１】本発明の大腸菌形質転換体を得る方法とし
ては、例えば、塩化ルビジウム法あるいは塩化カルシウ
ム法で宿主大腸菌からコンピテントセルを調製し、その
コンピテントセルとプラスミドを混合し、高温（４２
℃）の液中に６０〜９０秒間さらすことによりコンピテ
ントセルにプラスミドを取り込ませ、その細胞含有液を
薬剤（例えばテトラサイクリン）を含むプレート培地上
に均等に広げ、培養後、プレート培地上に形成されるコ
ロニーを回収する方法が挙げられる。
ては、例えば、塩化ルビジウム法あるいは塩化カルシウ
ム法で宿主大腸菌からコンピテントセルを調製し、その
コンピテントセルとプラスミドを混合し、高温（４２
℃）の液中に６０〜９０秒間さらすことによりコンピテ
ントセルにプラスミドを取り込ませ、その細胞含有液を
薬剤（例えばテトラサイクリン）を含むプレート培地上
に均等に広げ、培養後、プレート培地上に形成されるコ
ロニーを回収する方法が挙げられる。
【００２２】かくしてＳｅｃ蛋白質遺伝子を組換え蛋白
質遺伝子と共発現させることで組換え蛋白質を効率良く
分泌生産することができる。２０ＫｈＧＨの分泌生産に
おいては複数のＳｅｃ蛋白質遺伝子の共発現が有効であ
る。本発明において各Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させ
る２０ＫｈＧＨ分泌生産菌株の例としては、ＳｅｃＹ／
ＳｅｃＥはＭＴ−１０８２７、ｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥは
ＭＴ−１０８２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８３０）、Ｓｅ
ｃＢはＭＴ−１０８２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８３
１）、ＳｅｃＧはＭＴ−１０８２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５８３２）、ＳｅｃＤ／ＦはＭＴ−１０８２６（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５８３３）を挙げることができる。これらの
大腸菌株の２０ＫｈＧＨの分泌生産量は１Ｌの培養液あ
たり５０〜６５ｍｇであり、その分泌効率はＳｅｃ蛋白
質遺伝子を共発現させない株に比べ約１．６〜２．０倍
上昇した。
質遺伝子と共発現させることで組換え蛋白質を効率良く
分泌生産することができる。２０ＫｈＧＨの分泌生産に
おいては複数のＳｅｃ蛋白質遺伝子の共発現が有効であ
る。本発明において各Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させ
る２０ＫｈＧＨ分泌生産菌株の例としては、ＳｅｃＹ／
ＳｅｃＥはＭＴ−１０８２７、ｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥは
ＭＴ−１０８２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８３０）、Ｓｅ
ｃＢはＭＴ−１０８２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８３
１）、ＳｅｃＧはＭＴ−１０８２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５８３２）、ＳｅｃＤ／ＦはＭＴ−１０８２６（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５８３３）を挙げることができる。これらの
大腸菌株の２０ＫｈＧＨの分泌生産量は１Ｌの培養液あ
たり５０〜６５ｍｇであり、その分泌効率はＳｅｃ蛋白
質遺伝子を共発現させない株に比べ約１．６〜２．０倍
上昇した。
【００２３】本発明において大腸菌形質転換体を培養す
るには、該菌株が資化可能な炭素源、窒素源および無機
塩類からなる培地或いはそれを改変した培地を用い公知
の培養法或いはそれを適宜改良した方法により培養すれ
ばよい。培養法としては液体培養が好適に使用される。
好ましい培地としては、グリセロールを０．２〜１．０
％濃度に含む２倍濃度のＬＢ培地（ポリペプトン２０ｇ
／Ｌ，酵母エキス１０ｇ／Ｌ）などが挙げられる。
るには、該菌株が資化可能な炭素源、窒素源および無機
塩類からなる培地或いはそれを改変した培地を用い公知
の培養法或いはそれを適宜改良した方法により培養すれ
ばよい。培養法としては液体培養が好適に使用される。
好ましい培地としては、グリセロールを０．２〜１．０
％濃度に含む２倍濃度のＬＢ培地（ポリペプトン２０ｇ
／Ｌ，酵母エキス１０ｇ／Ｌ）などが挙げられる。
【００２４】本発明の大腸菌形質転換体を培養すること
により、形質転換体のペリプラズム中には、分泌蛋白質
が蓄積される。該大腸菌形質転換体のペリプラズムから
の分泌蛋白質の調製は、通常のペリプラズムからの蛋白
質の回収精製方法により行うことが可能であり、例えば
浸透圧ショック法（Ｎｏｓｓａｌ Ｇ．Ｎ；Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１（１３），ｐｐ．３０５５−３
０６２，（１９６６））等が実施可能である。
により、形質転換体のペリプラズム中には、分泌蛋白質
が蓄積される。該大腸菌形質転換体のペリプラズムから
の分泌蛋白質の調製は、通常のペリプラズムからの蛋白
質の回収精製方法により行うことが可能であり、例えば
浸透圧ショック法（Ｎｏｓｓａｌ Ｇ．Ｎ；Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１（１３），ｐｐ．３０５５−３
０６２，（１９６６））等が実施可能である。
【００２５】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこの例により何ら限定されるものではな
い。 [実施例１]ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の共発現が２０ＫｈＧＨ
の分泌効率に与える影響 （１）ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子をｔａｃプロモーターで発現
させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ４５ＤＦの
作製 作製の方法は図１（図１）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子を
含むオペロンを配列番号１と配列番号２の合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを使ったＰＣＲ法により増幅し、
ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子を含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。このＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用
いて末端平滑化してインサートフラグメントを得た。次
に、２０ＫｈＧＨ発現プラスミドｐＧＨＶ４５ＧＲ（該
プラスミドは、プラスミドｐＧＨＲ１０を制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩで切断し、その結果得られた大き
い方のＤＮＡフラグメントをライゲートすることで、ｌ
ａｃＩq遺伝子部分を削除したものである。）を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて平滑末端化を行い、ベクターフラグメン
トを調製した。このベクターフラグメントを上記インサ
ートフラグメントの存在下でライゲートして大腸菌Ｓｅ
ｃＤ／Ｆ遺伝子を共発現する２０ＫｈＧＨ分泌プラスミ
ドｐＧＨＶ４５ＤＦを作製した。
るが、本発明はこの例により何ら限定されるものではな
い。 [実施例１]ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の共発現が２０ＫｈＧＨ
の分泌効率に与える影響 （１）ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子をｔａｃプロモーターで発現
させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＶ４５ＤＦの
作製 作製の方法は図１（図１）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子を
含むオペロンを配列番号１と配列番号２の合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを使ったＰＣＲ法により増幅し、
ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子を含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。このＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用
いて末端平滑化してインサートフラグメントを得た。次
に、２０ＫｈＧＨ発現プラスミドｐＧＨＶ４５ＧＲ（該
プラスミドは、プラスミドｐＧＨＲ１０を制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩで切断し、その結果得られた大き
い方のＤＮＡフラグメントをライゲートすることで、ｌ
ａｃＩq遺伝子部分を削除したものである。）を制限酵
素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて平滑末端化を行い、ベクターフラグメン
トを調製した。このベクターフラグメントを上記インサ
ートフラグメントの存在下でライゲートして大腸菌Ｓｅ
ｃＤ／Ｆ遺伝子を共発現する２０ＫｈＧＨ分泌プラスミ
ドｐＧＨＶ４５ＤＦを作製した。
【００２６】（２）ｐＧＨＶ４５ＤＦで形質転換した大
腸菌形質転換体の分泌生産 前項（１）で作製したｐＧＨＶ４５ＤＦを使って大腸菌
ＨＢ１０１株及びＪＭ１０９株を形質転換し、それぞれ
の形質転換体をテトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ含む
ＬＢ寒天培地に接種し、３０℃で一晩培養してコロニー
形成させた。単離したそれぞれの形質転換体をテトラサ
イクリンを１０μｇ／ｍｌで含む２倍濃度のＬＢ培地
（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，酵母エキス１０ｇ／Ｌ）中
で、培養温度３０℃、２４時間培養した。ｐＧＨＶ４５
ＤＦプラスミド上のＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の発現はｔａｃ
プロモーターによる転写機構を有するため、両大腸菌株
形質転換体について、ＩＰＴＧが無添加の場合及び培養
開始時にＩＰＴＧを１ｍＭ添加した場合の、ＳｅｃＤ／
Ｆ遺伝子の発現量の２０ＫｈＧＨ分泌量への影響を以下
のように検討した。両大腸菌形質転換体を培養後、浸透
圧ショック法によりペリプラズムに分泌蓄積された２０
ＫｈＧＨを回収し、該ペリプラズム画分溶液中の２０Ｋ
ｈＧＨの濃度をｈＧＨに対する抗体を用いた酵素免疫学
的測定法（Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１１６，ｐ．１５５４，（１９７６））を利用
して測定した。具体的なペリプラズム画分溶液の調製方
法を以下に説明する。即ち、培養液を遠心分離すること
により菌体を沈澱画分に回収し、元の培養液容量の１／
１０量の等張液（２０％シュークロース、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０））に懸濁した。該懸濁液を３０分間放置後、遠心分
離をして菌体を回収した。次に、回収した菌体を元の培
養液容量の１／１０量の冷水（４℃）に再び懸濁し、遠
心分離することによりペリプラズムに分泌蓄積した２０
ＫｈＧＨを上清中に回収した。このペリプラズム画分溶
液中の２０ＫｈＧＨ濃度を上記酵素免疫学的測定法によ
り測定し、その測定値から培養液１Ｌあたりの２０Ｋｈ
ＧＨ分泌量を換算した。結果を表１（表１）に示す。
腸菌形質転換体の分泌生産 前項（１）で作製したｐＧＨＶ４５ＤＦを使って大腸菌
ＨＢ１０１株及びＪＭ１０９株を形質転換し、それぞれ
の形質転換体をテトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ含む
ＬＢ寒天培地に接種し、３０℃で一晩培養してコロニー
形成させた。単離したそれぞれの形質転換体をテトラサ
イクリンを１０μｇ／ｍｌで含む２倍濃度のＬＢ培地
（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，酵母エキス１０ｇ／Ｌ）中
で、培養温度３０℃、２４時間培養した。ｐＧＨＶ４５
ＤＦプラスミド上のＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の発現はｔａｃ
プロモーターによる転写機構を有するため、両大腸菌株
形質転換体について、ＩＰＴＧが無添加の場合及び培養
開始時にＩＰＴＧを１ｍＭ添加した場合の、ＳｅｃＤ／
Ｆ遺伝子の発現量の２０ＫｈＧＨ分泌量への影響を以下
のように検討した。両大腸菌形質転換体を培養後、浸透
圧ショック法によりペリプラズムに分泌蓄積された２０
ＫｈＧＨを回収し、該ペリプラズム画分溶液中の２０Ｋ
ｈＧＨの濃度をｈＧＨに対する抗体を用いた酵素免疫学
的測定法（Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１１６，ｐ．１５５４，（１９７６））を利用
して測定した。具体的なペリプラズム画分溶液の調製方
法を以下に説明する。即ち、培養液を遠心分離すること
により菌体を沈澱画分に回収し、元の培養液容量の１／
１０量の等張液（２０％シュークロース、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０））に懸濁した。該懸濁液を３０分間放置後、遠心分
離をして菌体を回収した。次に、回収した菌体を元の培
養液容量の１／１０量の冷水（４℃）に再び懸濁し、遠
心分離することによりペリプラズムに分泌蓄積した２０
ＫｈＧＨを上清中に回収した。このペリプラズム画分溶
液中の２０ＫｈＧＨ濃度を上記酵素免疫学的測定法によ
り測定し、その測定値から培養液１Ｌあたりの２０Ｋｈ
ＧＨ分泌量を換算した。結果を表１（表１）に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】ＪＭ１０９の形質転換体においては、ＩＰ
ＴＧ添加による誘導のない場合に２０ＫｈＧＨの分泌量
が有意に高く、ＨＢ１０１の形質転換体においては、Ｉ
ＰＴＧ添加のいずれの場合においても２０ＫｈＧＨの分
泌量は低かった。
ＴＧ添加による誘導のない場合に２０ＫｈＧＨの分泌量
が有意に高く、ＨＢ１０１の形質転換体においては、Ｉ
ＰＴＧ添加のいずれの場合においても２０ＫｈＧＨの分
泌量は低かった。
【００２９】この大腸菌株の違いによるＳｅｃＤ／Ｆ遺
伝子の共発現が２０ＫｈＧＨの分泌量に与える影響の原
因は、ＪＭ１０９がｌａｃＩq遺伝子（ｔａｃプロモー
ターのリプレッサー遺伝子）を有する株であるのに対
し、ＨＢ１０１はｌａｃＩq遺伝子を持たないためと考
えられた。即ち、本発明者らは以下の通り仮定した。Ｈ
Ｂ１０１はｌａｃＩq遺伝子を持たないため、ＩＰＴＧ
を添加したときはもちろんのこと、ＩＰＴＧを添加しな
い場合でもｔａｃプロモーターによりＳｅｃＤ／Ｆ遺伝
子が過剰に発現されてしまい、２０ＫｈＧＨの分泌効率
は向上されない。一方、ｌａｃＩq遺伝子を有するＪＭ
１０９では、ｔａｃプロモーター により発現されるＳ
ｅｃＤ／Ｆ遺伝子はＩＰＴＧ誘導条件下では過剰すぎて
２０ＫｈＧＨの分泌を促進しないが、非誘導条件下では
ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の発現量が過剰にならない程度に抑
制されているため、２０ＫｈＧＨの分泌効率は向上す
る。その仮定に基づき、ｌａｃＩq遺伝子をＳｅｃＤ／
Ｆ遺伝子及び２０ＫｈＧＨ遺伝子を含むプラスミドに存
在させ、ｌａｃＩq遺伝子を有しないＨＢ１０１を宿主
とした形質転換体における２０ＫｈＧＨ分泌量への影響
について検討することにした。
伝子の共発現が２０ＫｈＧＨの分泌量に与える影響の原
因は、ＪＭ１０９がｌａｃＩq遺伝子（ｔａｃプロモー
ターのリプレッサー遺伝子）を有する株であるのに対
し、ＨＢ１０１はｌａｃＩq遺伝子を持たないためと考
えられた。即ち、本発明者らは以下の通り仮定した。Ｈ
Ｂ１０１はｌａｃＩq遺伝子を持たないため、ＩＰＴＧ
を添加したときはもちろんのこと、ＩＰＴＧを添加しな
い場合でもｔａｃプロモーターによりＳｅｃＤ／Ｆ遺伝
子が過剰に発現されてしまい、２０ＫｈＧＨの分泌効率
は向上されない。一方、ｌａｃＩq遺伝子を有するＪＭ
１０９では、ｔａｃプロモーター により発現されるＳ
ｅｃＤ／Ｆ遺伝子はＩＰＴＧ誘導条件下では過剰すぎて
２０ＫｈＧＨの分泌を促進しないが、非誘導条件下では
ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の発現量が過剰にならない程度に抑
制されているため、２０ＫｈＧＨの分泌効率は向上す
る。その仮定に基づき、ｌａｃＩq遺伝子をＳｅｃＤ／
Ｆ遺伝子及び２０ＫｈＧＨ遺伝子を含むプラスミドに存
在させ、ｌａｃＩq遺伝子を有しないＨＢ１０１を宿主
とした形質転換体における２０ＫｈＧＨ分泌量への影響
について検討することにした。
【００３０】（３）ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の過剰発現がｌ
ａｃＩq遺伝子により抑制的に制御可能な２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＲ９の作製 作製の方法は図２（図２）に示されている。２０ＫｈＧ
Ｈ分泌大腸菌株であるＭＴ−１０７６５から抽出した２
０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ１０を制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩで消化し、ｌａｃＩq遺伝子を含
む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、前述のｐＧ
ＨＶ４５ＤＦを制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＡｖａＩで消
化し、ベクターフラグメントを調製した。このベクター
フラグメントを上記ｌａｃＩq遺伝子を含むＤＮＡ断片
の存在下でライゲートしてｌａｃＩq遺伝子によりＳｅ
ｃＤ／Ｆ遺伝子の過剰発現が抑制的に制御を受ける２０
ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ９を作製した。このプ
ラスミドを使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より購
入）を形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８２６
を得た。このＭＴ−１０８２６株は受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８３３として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。
ａｃＩq遺伝子により抑制的に制御可能な２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＲ９の作製 作製の方法は図２（図２）に示されている。２０ＫｈＧ
Ｈ分泌大腸菌株であるＭＴ−１０７６５から抽出した２
０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ１０を制限酵素Ｅｃ
ｏＴ１４ＩとＡｖａＩで消化し、ｌａｃＩq遺伝子を含
む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、前述のｐＧ
ＨＶ４５ＤＦを制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＡｖａＩで消
化し、ベクターフラグメントを調製した。このベクター
フラグメントを上記ｌａｃＩq遺伝子を含むＤＮＡ断片
の存在下でライゲートしてｌａｃＩq遺伝子によりＳｅ
ｃＤ／Ｆ遺伝子の過剰発現が抑制的に制御を受ける２０
ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ９を作製した。このプ
ラスミドを使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より購
入）を形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８２６
を得た。このＭＴ−１０８２６株は受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８３３として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。
【００３１】（４）ｐＧＨＲ９を使った２０ＫｈＧＨの
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５（該プラスミドは、プラス
ミドｐＧＨＲ１０を制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＡｃｃＩ
ＩＩで消化し、その結果得られる大きい方のＤＮＡフラ
グメントをライゲートすることにより、ｌａｃＩq遺伝
子部分及びグルタチオンレダクターゼ発現遺伝子部分を
削除したものである。）で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして、前項（３）で作
製したｐＧＨＲ９を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換した菌株ＭＴ−１０８２６を（１）と同様の方法で培
養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。その結果を表
２（表２）に示す。
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５（該プラスミドは、プラス
ミドｐＧＨＲ１０を制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＡｃｃＩ
ＩＩで消化し、その結果得られる大きい方のＤＮＡフラ
グメントをライゲートすることにより、ｌａｃＩq遺伝
子部分及びグルタチオンレダクターゼ発現遺伝子部分を
削除したものである。）で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして、前項（３）で作
製したｐＧＨＲ９を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換した菌株ＭＴ−１０８２６を（１）と同様の方法で培
養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。その結果を表
２（表２）に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の過剰発現をｌａｃＩ
qにより抑制することにより、２０ＫｈＧＨの分泌量が
Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていないものに比べて
約１．９倍増加することが明らかになった。また、ＩＰ
ＴＧ添加によりＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の発現が促進される
と２０ＫｈＧＨの分泌量は逆に低下した。
qにより抑制することにより、２０ＫｈＧＨの分泌量が
Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていないものに比べて
約１．９倍増加することが明らかになった。また、ＩＰ
ＴＧ添加によりＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の発現が促進される
と２０ＫｈＧＨの分泌量は逆に低下した。
【００３４】このようにＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子について
は、発現プロモーターとしてｔａｃプロモーターを用
い、その過剰発現をｌａｃＩqで抑制させる２０ＫｈＧ
Ｈの分泌プラスミドで形質転換させた大腸菌ＨＢ１０１
株で高い２０ＫｈＧＨの分泌量が得られた。そこで、以
下に記載する他の大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子の共
発現効果の検討についても、同様の方法を用いることに
した。
は、発現プロモーターとしてｔａｃプロモーターを用
い、その過剰発現をｌａｃＩqで抑制させる２０ＫｈＧ
Ｈの分泌プラスミドで形質転換させた大腸菌ＨＢ１０１
株で高い２０ＫｈＧＨの分泌量が得られた。そこで、以
下に記載する他の大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子の共
発現効果の検討についても、同様の方法を用いることに
した。
【００３５】[実施例２]ＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子の共発現が
２０ＫｈＧＨ分泌効率に与える影響 （１）２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発
現する分泌プラスミドｐＧＨＲ４の作製 作製の方法は図３（図３）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を
それぞれ配列番号３と配列番号４、及び配列番号５と配
列番号６の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使った
ＰＣＲ法により増幅した（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ
ａｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５,
ｐｐ.３３５−３５０）。これら２つのＤＮＡ断片をそ
れぞれの両端に存在する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，Ｘｈｏ
Ｉ，ＰｓｔＩ）を用いて消化し、ＳｅｃＥ遺伝子をコー
ドする約０．４ｋｂのＤＮＡ断片とＳｅｃＹ遺伝子をコ
ードする約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、プラ
スミドｐＧＨＲ１０を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで
消化し、単離した約６．０ｋｂのＤＮＡ断片を上記約
０．４ｋｂ及び約１．３ｋｂのＤＮＡ断片の存在下でラ
イゲートしてＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発現する２０Ｋｈ
ＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ４を作製した。この際に、
インサート断片である約０．４ｋｂと約１．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片は制限酵素ＸｈｏＩ部位を利用して接続した。
発現系の構造は、ｔａｃプロモーターによりＳｅｃＥ及
びＳｅｃＹ遺伝子のｍＲＮＡが転写される。そして、両
遺伝子の翻訳開始点からそれぞれ９及び４塩基上流側に
はＡＧＧＡから成るＳＤ配列を挿入して、アミノ酸コド
ンフレームを合わせた。このプラスミドを使って大腸菌
ＨＢ１０１株（宝酒造より購入）をＩｎｏｕｅ，Ｈ．ら
の方法（Ｇｅｎｅ ９６，ｐｐ．２３−２８，（１９９
０））により形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０
８２７を得た。
２０ＫｈＧＨ分泌効率に与える影響 （１）２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発
現する分泌プラスミドｐＧＨＲ４の作製 作製の方法は図３（図３）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を
それぞれ配列番号３と配列番号４、及び配列番号５と配
列番号６の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使った
ＰＣＲ法により増幅した（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ
ａｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５,
ｐｐ.３３５−３５０）。これら２つのＤＮＡ断片をそ
れぞれの両端に存在する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，Ｘｈｏ
Ｉ，ＰｓｔＩ）を用いて消化し、ＳｅｃＥ遺伝子をコー
ドする約０．４ｋｂのＤＮＡ断片とＳｅｃＹ遺伝子をコ
ードする約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次に、プラ
スミドｐＧＨＲ１０を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで
消化し、単離した約６．０ｋｂのＤＮＡ断片を上記約
０．４ｋｂ及び約１．３ｋｂのＤＮＡ断片の存在下でラ
イゲートしてＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発現する２０Ｋｈ
ＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ４を作製した。この際に、
インサート断片である約０．４ｋｂと約１．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片は制限酵素ＸｈｏＩ部位を利用して接続した。
発現系の構造は、ｔａｃプロモーターによりＳｅｃＥ及
びＳｅｃＹ遺伝子のｍＲＮＡが転写される。そして、両
遺伝子の翻訳開始点からそれぞれ９及び４塩基上流側に
はＡＧＧＡから成るＳＤ配列を挿入して、アミノ酸コド
ンフレームを合わせた。このプラスミドを使って大腸菌
ＨＢ１０１株（宝酒造より購入）をＩｎｏｕｅ，Ｈ．ら
の方法（Ｇｅｎｅ ９６，ｐｐ．２３−２８，（１９９
０））により形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０
８２７を得た。
【００３６】（２）２０ＫｈＧＨ遺伝子とｐｒｌＡ４／
ＳｅｃＥ遺伝子を共発現する分泌プラスミドｐＧＨＲ５
の作製 作製の方法は図４（図４）に示されている。まず、ｐｒ
ｌＡ４の変異点であるＦ２８６，Ｉ４０８をそれぞれＹ
２８６，Ｎ４０８に置換するプライマー（配列番号７〜
配列番号１０）を作製した。これらとＳｅｃＹ遺伝子ク
ローニングのためのプライマー（配列番号５と配列番号
６）を使い、ｐＧＨＲ４を鋳型としたＰＣＲ増幅を行っ
た。このＰＣＲ増幅によりｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤ
ＮＡ断片に分けた形式でクローニングした。これら３つ
のＤＮＡ断片を図２（図２）の中で示したそれぞれの制
限酵素（ＸｈｏＩ，ＮｈｅＩ，ＢｃｌＩ，ＥｃｏＴ２２
Ｉ）で処理し、ＤＮＡ断片（ｐｒｌＡ４−ａ，ｐｒｌＡ
４−ｂ，ｐｒｌＡ４−ｃ）を得た。一方、プラスミドｐ
ＧＨＲ４を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＴ２２Ｉを用いて
消化し、ベクターフラグメントを得た。このベクターフ
ラグメントを上記３つのＤＮＡ断片が過剰に存在する条
件下でライゲートし、ＰｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子を共
発現する２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ５を作製
した。このｐＧＨＲ５を使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝
酒造より購入）を形質転換し、ＭＴ−１０８２３株を得
た。このＭＴ−１０８２３株は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−５８３０として工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。
ＳｅｃＥ遺伝子を共発現する分泌プラスミドｐＧＨＲ５
の作製 作製の方法は図４（図４）に示されている。まず、ｐｒ
ｌＡ４の変異点であるＦ２８６，Ｉ４０８をそれぞれＹ
２８６，Ｎ４０８に置換するプライマー（配列番号７〜
配列番号１０）を作製した。これらとＳｅｃＹ遺伝子ク
ローニングのためのプライマー（配列番号５と配列番号
６）を使い、ｐＧＨＲ４を鋳型としたＰＣＲ増幅を行っ
た。このＰＣＲ増幅によりｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤ
ＮＡ断片に分けた形式でクローニングした。これら３つ
のＤＮＡ断片を図２（図２）の中で示したそれぞれの制
限酵素（ＸｈｏＩ，ＮｈｅＩ，ＢｃｌＩ，ＥｃｏＴ２２
Ｉ）で処理し、ＤＮＡ断片（ｐｒｌＡ４−ａ，ｐｒｌＡ
４−ｂ，ｐｒｌＡ４−ｃ）を得た。一方、プラスミドｐ
ＧＨＲ４を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＴ２２Ｉを用いて
消化し、ベクターフラグメントを得た。このベクターフ
ラグメントを上記３つのＤＮＡ断片が過剰に存在する条
件下でライゲートし、ＰｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子を共
発現する２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ５を作製
した。このｐＧＨＲ５を使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝
酒造より購入）を形質転換し、ＭＴ−１０８２３株を得
た。このＭＴ−１０８２３株は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−５８３０として工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。
【００３７】（３）ｐＧＨＲ４及びｐＧＨＲ５を使った
２０ＫｈＧＨの分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、さらに前項（１）及
び（２）で作製したｐＧＨＲ４及びｐＧＨＲ５を使って
大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した菌株（ＭＴ−１０８
２７及びＭＴ−１０８２３）をそれぞれテトラサイクリ
ンを１０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に接種し、３０℃
で一晩培養してコロニーを形成させた。単離したそれぞ
れの形質転換体をテトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌで
含む２倍濃度のＬＢ培地（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，酵
母エキス１０ｇ／Ｌ）中で、ＩＰＴＧ添加を行わず、培
養温度３０℃、２４時間培養した。培養後、実施例１と
同様の方法でペリプラズム画分溶液を調製し、該溶液中
の２０ＫｈＧＨの濃度を測定した。結果を表３（表３）
に示す。
２０ＫｈＧＨの分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、さらに前項（１）及
び（２）で作製したｐＧＨＲ４及びｐＧＨＲ５を使って
大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した菌株（ＭＴ−１０８
２７及びＭＴ−１０８２３）をそれぞれテトラサイクリ
ンを１０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に接種し、３０℃
で一晩培養してコロニーを形成させた。単離したそれぞ
れの形質転換体をテトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌで
含む２倍濃度のＬＢ培地（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，酵
母エキス１０ｇ／Ｌ）中で、ＩＰＴＧ添加を行わず、培
養温度３０℃、２４時間培養した。培養後、実施例１と
同様の方法でペリプラズム画分溶液を調製し、該溶液中
の２０ＫｈＧＨの濃度を測定した。結果を表３（表３）
に示す。
【００３８】
【表３】
【００３９】ＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発現させることに
より、２０ＫｈＧＨの分泌量は、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を
共発現させていないものに比べて約１．６倍上昇した。
また、ｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子を共発現させた場合
には、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていないものに
比べて約１．８倍の分泌量を示した。
より、２０ＫｈＧＨの分泌量は、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を
共発現させていないものに比べて約１．６倍上昇した。
また、ｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子を共発現させた場合
には、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていないものに
比べて約１．８倍の分泌量を示した。
【００４０】[実施例３]ＳｅｃＢ遺伝子の共発現が２０
ＫｈＧＨ分泌効率に与える影響 （１）２０ＫｈＧＨとＳｅｃＢ遺伝子を共発現する分泌
プラスミドｐＧＨＲ６の作製 作製の方法は図５（図５）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＢ遺伝子をそれ
ぞれ配列番号１１、配列番号１２の合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを使ったＰＣＲ法により増幅し、Ｓｅｃ
Ｂ遺伝子を含む約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この
ＤＮＡ断片を両端に存在する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，Ｐ
ｓｔＩ）を用いて消化し、インサートフラグメントを得
た。次に、２０ＫｈＧＨの分泌生産株であるＭＴ−１０
７６５から抽出したプラスミドｐＧＨＲ１０を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、単離した約６．０ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記インサートフラグメントの存在下で
ライゲートしてＳｅｃＢ遺伝子を共発現する２０ＫｈＧ
Ｈ分泌プラスミドｐＧＨＲ６を作製した。このプラスミ
ドｐＧＨＲ６を使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より
購入）をＩｎｏｕｅ，Ｈ．らの方法（Ｇｅｎｅ ９６，
ｐｐ．２３−２８，（１９９０））により形質転換して
大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８２８を得た。
ＫｈＧＨ分泌効率に与える影響 （１）２０ＫｈＧＨとＳｅｃＢ遺伝子を共発現する分泌
プラスミドｐＧＨＲ６の作製 作製の方法は図５（図５）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＢ遺伝子をそれ
ぞれ配列番号１１、配列番号１２の合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを使ったＰＣＲ法により増幅し、Ｓｅｃ
Ｂ遺伝子を含む約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この
ＤＮＡ断片を両端に存在する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，Ｐ
ｓｔＩ）を用いて消化し、インサートフラグメントを得
た。次に、２０ＫｈＧＨの分泌生産株であるＭＴ−１０
７６５から抽出したプラスミドｐＧＨＲ１０を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、単離した約６．０ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記インサートフラグメントの存在下で
ライゲートしてＳｅｃＢ遺伝子を共発現する２０ＫｈＧ
Ｈ分泌プラスミドｐＧＨＲ６を作製した。このプラスミ
ドｐＧＨＲ６を使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より
購入）をＩｎｏｕｅ，Ｈ．らの方法（Ｇｅｎｅ ９６，
ｐｐ．２３−２８，（１９９０））により形質転換して
大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８２８を得た。
【００４１】（２）ｐＧＨＲ６を使った２０ＫｈＧＨの
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして前項で作製し
たｐＧＨＲ６を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し
た菌株ＭＴ−１０８２８を実施例２に記載の方法と同様
の方法で培養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。そ
の結果を表４（表４）に示す。
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして前項で作製し
たｐＧＨＲ６を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し
た菌株ＭＴ−１０８２８を実施例２に記載の方法と同様
の方法で培養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。そ
の結果を表４（表４）に示す。
【００４２】
【表４】
【００４３】ＳｅｃＢ遺伝子の過剰発現をｌａｃＩq遺
伝子により抑制して２０ＫｈＧＨと共発現させたとこ
ろ、２０ＫｈＧＨの分泌量は有意に増加した。しかし、
この培養後の菌体の超音波破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析したところ、ＳｅｃＢ蛋白質（分子量：１６Ｋ
Ｄａ）が多く発現していることが判明した。そこで、Ｓ
ｅｃＢ遺伝子の発現の抑制が十分でなく、そのため充分
な２０ＫｈＧＨ分泌量が得られないと考え、ＳｅｃＢ遺
伝子の過剰発現をさらに抑制した共発現プラスミドを作
製することにした。
伝子により抑制して２０ＫｈＧＨと共発現させたとこ
ろ、２０ＫｈＧＨの分泌量は有意に増加した。しかし、
この培養後の菌体の超音波破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析したところ、ＳｅｃＢ蛋白質（分子量：１６Ｋ
Ｄａ）が多く発現していることが判明した。そこで、Ｓ
ｅｃＢ遺伝子の発現の抑制が十分でなく、そのため充分
な２０ＫｈＧＨ分泌量が得られないと考え、ＳｅｃＢ遺
伝子の過剰発現をさらに抑制した共発現プラスミドを作
製することにした。
【００４４】（３）２０ＫｈＧＨ遺伝子と適正量のＳｅ
ｃＢ遺伝子を共発現する分泌プラスミドｐＧＨＲ７の作
製 作製の方法は図６（図６）に示されている。ＳｅｃＢ遺
伝子の過剰発現量をさらに抑制するためにｐＫＫ２２３
−３由来のＳＤ配列から翻訳開始点までの距離を長くす
ることにした。具体的には、前述のｐＧＨＲ６では１０
ｂｐであった間隔（距離）を５０ｂｐに増やし、翻訳開
始点上流１０ｂｐの位置にＳｅｃＢ遺伝子由来のＳＤ配
列を挿入することを目的としたＰＣＲプライマー（配列
番号１２と配列番号１３）を用いて、ｐＧＨＲ６プラス
ミドを鋳型としたＰＣＲ増幅を行いＳＤ配列を変換させ
たＳｅｃＢ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得
た。これを両端に存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ，Ａｃｃ
ＩＩＩで消化し、インサートフラグメントを作製した。
次に、ｐＧＨＲ６をＥｃｏＲＩとＡｃｃＩＩＩで消化
し、ベクターフラグメントを調製した。得られたベクタ
ーフラグメントを上記インサートフラグメントの存在下
でライゲートして、ＳｅｃＢ遺伝子の過剰発現を抑制し
た２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ７を作製した。
このプラスミドを使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造よ
り購入）を形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８
２４を得た。このＭＴ−１０８２４株は受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５８３１として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。
ｃＢ遺伝子を共発現する分泌プラスミドｐＧＨＲ７の作
製 作製の方法は図６（図６）に示されている。ＳｅｃＢ遺
伝子の過剰発現量をさらに抑制するためにｐＫＫ２２３
−３由来のＳＤ配列から翻訳開始点までの距離を長くす
ることにした。具体的には、前述のｐＧＨＲ６では１０
ｂｐであった間隔（距離）を５０ｂｐに増やし、翻訳開
始点上流１０ｂｐの位置にＳｅｃＢ遺伝子由来のＳＤ配
列を挿入することを目的としたＰＣＲプライマー（配列
番号１２と配列番号１３）を用いて、ｐＧＨＲ６プラス
ミドを鋳型としたＰＣＲ増幅を行いＳＤ配列を変換させ
たＳｅｃＢ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得
た。これを両端に存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ，Ａｃｃ
ＩＩＩで消化し、インサートフラグメントを作製した。
次に、ｐＧＨＲ６をＥｃｏＲＩとＡｃｃＩＩＩで消化
し、ベクターフラグメントを調製した。得られたベクタ
ーフラグメントを上記インサートフラグメントの存在下
でライゲートして、ＳｅｃＢ遺伝子の過剰発現を抑制し
た２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ７を作製した。
このプラスミドを使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造よ
り購入）を形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８
２４を得た。このＭＴ−１０８２４株は受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５８３１として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。
【００４５】（４）ｐＧＨＲ７を使った２０ＫｈＧＨの
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして、前項で作製
したｐＧＨＲ７を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
した菌株ＭＴ−１０８２４を実施例１と同様の方法で培
養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。その結果を表
５（表５）に示す。
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして、前項で作製
したｐＧＨＲ７を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
した菌株ＭＴ−１０８２４を実施例１と同様の方法で培
養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。その結果を表
５（表５）に示す。
【００４６】
【表５】 * ｐＧＨＲ６よりもＳｅｃＢ遺伝子の発現は抑制されている
【００４７】実験の結果より、ＳｅｃＢ遺伝子の共発現
量を下げ適正量に調節することにより、Ｓｅｃ蛋白質遺
伝子を共発現させていないものに比べて、２０ＫｈＧＨ
の分泌量が約１．８倍増加することが明らかになった。
なお、ＳｅｃＢ遺伝子の共発現量の低下はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで確認した。
量を下げ適正量に調節することにより、Ｓｅｃ蛋白質遺
伝子を共発現させていないものに比べて、２０ＫｈＧＨ
の分泌量が約１．８倍増加することが明らかになった。
なお、ＳｅｃＢ遺伝子の共発現量の低下はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで確認した。
【００４８】[実施例４]ＳｅｃＧ遺伝子の共発現が２０
ＫｈＧＨ分泌効率に与える影響 （１）２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＧ遺伝子を共発現す
る分泌プラスミドｐＧＨＲ８の作製 作製の方法は図７（図７）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＧ遺伝子を配列
番号１５と配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使ったＰＣＲ法により増幅し、ＳｅｃＧ遺伝子
を含む約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片を両端に存在する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）を用いて消化し、インサートフラグメントを得
た。このインサートフラグメントをファルマシア社より
購入した発現プラスミドｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ
とＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングして、ｐＫＫＳＧ
１を作製した。続いて、２０ＫｈＧＨ発現プラスミドに
ＳｅｃＧ発現領域を組み込むために、このｐＫＫＳＧ１
を鋳型として、配列番号１４と配列番号１５を用いたＰ
ＣＲ増幅を行い、得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＡ
ｃｃＩＩＩで消化して、インサートフラグメントを調製
した。次に、２０ＫｈＧＨ発現プラスミドｐＧＨＲ１０
を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｃｃＩＩＩで消化し、単離し
たベクターフラグメントを上記インサートフラグメント
の存在下でライゲートしてＳｅｃＧ遺伝子を共発現する
２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ８を作製した。こ
のプラスミドを使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より
購入）を形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８２
５を得た。このＭＴ−１０８２５株は受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８３２として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。
ＫｈＧＨ分泌効率に与える影響 （１）２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＧ遺伝子を共発現す
る分泌プラスミドｐＧＨＲ８の作製 作製の方法は図７（図７）に示されている。Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ ２３
７１６）の染色体を鋳型として、ＳｅｃＧ遺伝子を配列
番号１５と配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使ったＰＣＲ法により増幅し、ＳｅｃＧ遺伝子
を含む約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片を両端に存在する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）を用いて消化し、インサートフラグメントを得
た。このインサートフラグメントをファルマシア社より
購入した発現プラスミドｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ
とＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングして、ｐＫＫＳＧ
１を作製した。続いて、２０ＫｈＧＨ発現プラスミドに
ＳｅｃＧ発現領域を組み込むために、このｐＫＫＳＧ１
を鋳型として、配列番号１４と配列番号１５を用いたＰ
ＣＲ増幅を行い、得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＡ
ｃｃＩＩＩで消化して、インサートフラグメントを調製
した。次に、２０ＫｈＧＨ発現プラスミドｐＧＨＲ１０
を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｃｃＩＩＩで消化し、単離し
たベクターフラグメントを上記インサートフラグメント
の存在下でライゲートしてＳｅｃＧ遺伝子を共発現する
２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ８を作製した。こ
のプラスミドを使って大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造より
購入）を形質転換して大腸菌形質転換株ＭＴ−１０８２
５を得た。このＭＴ−１０８２５株は受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８３２として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。
【００４９】（２）ｐＧＨＲ８を使った２０ＫｈＧＨの
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして、前項で作製
したｐＧＨＲ８を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
した菌株ＭＴ−１０８２５を実施例１と同様の方法で培
養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。その結果を表
６（表６）に示す。
分泌生産 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていない２０ＫｈＧＨ
分泌プラスミドｐＧＨＶ４５で大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した菌株ＭＴ−１０８２９、そして、前項で作製
したｐＧＨＲ８を使って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
した菌株ＭＴ−１０８２５を実施例１と同様の方法で培
養し、２０ＫｈＧＨの分泌量を比較した。その結果を表
６（表６）に示す。
【００５０】
【表６】
【００５１】実験の結果より、ＳｅｃＧ遺伝子の共発現
により、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていないもの
に比べ２０ＫｈＧＨの分泌量が約１．８倍増加すること
が明らかになった。
により、Ｓｅｃ蛋白質遺伝子を共発現させていないもの
に比べ２０ＫｈＧＨの分泌量が約１．８倍増加すること
が明らかになった。
【００５２】
【発明の効果】本発明の方法により、これまで微生物で
の分泌生産が困難であった２０ＫｈＧＨのような有用蛋
白質を、大腸菌形質転換体のペリプラズム中に効率よく
分泌蓄積させることができる。すなわち、蛋白質の膜輸
送に関与する蛋白質であるＳｅｃＢ，ＳｅｃＤ／Ｆ，Ｓ
ｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙよりなる群から選ばれる少なくと
も１つのＳｅｃ蛋白質遺伝子を過剰発現を抑制する制御
下で組換え蛋白質遺伝子と同時に発現させることで該組
換え蛋白質を効率よく分泌生産させることができる。
の分泌生産が困難であった２０ＫｈＧＨのような有用蛋
白質を、大腸菌形質転換体のペリプラズム中に効率よく
分泌蓄積させることができる。すなわち、蛋白質の膜輸
送に関与する蛋白質であるＳｅｃＢ，ＳｅｃＤ／Ｆ，Ｓ
ｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙよりなる群から選ばれる少なくと
も１つのＳｅｃ蛋白質遺伝子を過剰発現を抑制する制御
下で組換え蛋白質遺伝子と同時に発現させることで該組
換え蛋白質を効率よく分泌生産させることができる。
【００５３】
配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCAAGCTTA AGGGAATTGC CGTGT 25
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGAGCTCA AATCCCGATC TTCTGA 26
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGAATTCA TGAGTGCGAA TACCGAAGCT CAA 33
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAACTCGAGT CACCTCAGGC CAGTGATAAA GGA 33
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCTCGAGA GGAAACAATG GCTAAACAAC CGGGATTAGA T 41
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCTGCAGA TGCATTTATC GGCCGTAGCC TTTCAGGTT 39
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGCTAGCG AAGATTGCCG GGAT 24
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCGCTAGCA GTATTATTCT GTACCCG 27
【００６１】配列番号：９ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCATGATCAC GACAACAACG TTAAG 25
【００６２】配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTGATCATG GACTTTATGG CTCAA 25
【００６３】配列番号：１１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAGAATTCA TGTCAGAACA AAACAACACT 30
【００６４】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAAGCTTTC TTGCCAGGGT 20
【００６５】配列番号：１３ 配列の長さ：８５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACAGAATTCC CGGGGATCCG TCGACCTGCA GTATTTAAGG ACAACACTTA AGGGTTTTCT 60 ACACATGTCA GAACAAAACA ACACT 85
【００６６】配列番号：１４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGATCCGGAG CAAAAACAGG AAGGC 25
【００６７】配列番号：１５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGAATTCC GCAAGGAACA GGTTG 25
【００６８】配列番号：１６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAAGCTTT TTAGTTCGGG ATATC 25
【図１】 図１は、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＤ／Ｆ
遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧ
ＨＶ４５ＤＦの構築方法を示している。
遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧ
ＨＶ４５ＤＦの構築方法を示している。
【図２】 図２は、ＳｅｃＤ／Ｆ遺伝子の過剰発現をｌ
ａｃＩq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳ
ｅｃＤ／Ｆ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラ
スミドｐＧＨＲ９の構築方法を示している。
ａｃＩq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳ
ｅｃＤ／Ｆ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラ
スミドｐＧＨＲ９の構築方法を示している。
【図３】 図３は、ＳｅｃＥ／Ｙ遺伝子の過剰発現をｌ
ａｃＩq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳ
ｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラ
スミドｐＧＨＲ４の構築方法を示している。
ａｃＩq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳ
ｅｃＥ／Ｙ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラ
スミドｐＧＨＲ４の構築方法を示している。
【図４】 図４は、ｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子の過剰
発現をｌａｃＩq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺
伝子とｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子を共発現させる２０
ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ５の構築方法を示して
いる。
発現をｌａｃＩq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺
伝子とｐｒｌＡ４／ＳｅｃＥ遺伝子を共発現させる２０
ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ５の構築方法を示して
いる。
【図５】 図５は、ＳｅｃＢ遺伝子の過剰発現をｌａｃ
Ｉq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃ
Ｂ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐ
ＧＨＲ６の構築方法を示している。
Ｉq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃ
Ｂ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐ
ＧＨＲ６の構築方法を示している。
【図６】 図６は、ｌａｃＩq遺伝子に加え、さらにＳ
ｅｃＢ遺伝子翻訳開始部位とＳＤ配列までの距離を長く
することにより、より強くＳｅｃＢ遺伝子の過剰発現を
抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＢ遺伝子を共
発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ７の構
築方法を示している。
ｅｃＢ遺伝子翻訳開始部位とＳＤ配列までの距離を長く
することにより、より強くＳｅｃＢ遺伝子の過剰発現を
抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃＢ遺伝子を共
発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ７の構
築方法を示している。
【図７】 図７は、ＳｅｃＧ遺伝子の過剰発現をｌａｃ
Ｉq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃ
Ｇ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐ
ＧＨＲ８の構築方法を示している。
Ｉq遺伝子で抑制しつつ、２０ＫｈＧＨ遺伝子とＳｅｃ
Ｇ遺伝子を共発現させる２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐ
ＧＨＲ８の構築方法を示している。
配列１→ ：配列番号１で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列２ ：配列番号２で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列３→ ：配列番号３で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列４ ：配列番号４で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列５→ ：配列番号５で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列６ ：配列番号６で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列７ ：配列番号７で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列８→ ：配列番号８で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列９ ：配列番号９で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列１０→ ：配列番号１０で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 配列１１→ ：配列番号１１で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 ←配列１２ ：配列番号１２で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 配列１３→ ：配列番号１３で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 ←配列１４ ：配列番号１４で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 配列１５→ ：配列番号１５で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 ←配列１６ ：配列番号１６で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 NP promoter ：バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域 20KhGH ：分子量約２００００のヒト成長ホルモ
ン遺伝子 GR ：グルタチオンレダクターゼ遺伝子 tac promoter ：ｔａｃプロモーター領域 lacIq ：ｌａｃＩq遺伝子 prlA4-a ：ｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤＮＡ断片
に分けてクローニングした際、制限酵素ＸｈｏＩと制限
酵素ＮｈｅＩで認識されて得られるＤＮＡ断片 prlA4-b ：ｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤＮＡ断片
に分けてクローニングした際、制限酵素ＮｈｅＩと制限
酵素ＢｃｌＩで認識されて得られるＤＮＡ断片 prlA4-c ：ｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤＮＡ断片
に分けてクローニングした際、制限酵素ＢｃｌＩと制限
酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで認識されて得られるＤＮＡ断片
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列２ ：配列番号２で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列３→ ：配列番号３で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列４ ：配列番号４で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列５→ ：配列番号５で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列６ ：配列番号６で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列７ ：配列番号７で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列８→ ：配列番号８で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 ←配列９ ：配列番号９で示される合成オリゴヌク
レオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成してい
く方向を示す。 配列１０→ ：配列番号１０で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 配列１１→ ：配列番号１１で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 ←配列１２ ：配列番号１２で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 配列１３→ ：配列番号１３で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 ←配列１４ ：配列番号１４で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 配列１５→ ：配列番号１５で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 ←配列１６ ：配列番号１６で示される合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを示し、矢印は遺伝子を合成して
いく方向を示す。 NP promoter ：バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域 20KhGH ：分子量約２００００のヒト成長ホルモ
ン遺伝子 GR ：グルタチオンレダクターゼ遺伝子 tac promoter ：ｔａｃプロモーター領域 lacIq ：ｌａｃＩq遺伝子 prlA4-a ：ｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤＮＡ断片
に分けてクローニングした際、制限酵素ＸｈｏＩと制限
酵素ＮｈｅＩで認識されて得られるＤＮＡ断片 prlA4-b ：ｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤＮＡ断片
に分けてクローニングした際、制限酵素ＮｈｅＩと制限
酵素ＢｃｌＩで認識されて得られるＤＮＡ断片 prlA4-c ：ｐｒｌＡ４遺伝子を３つのＤＮＡ断片
に分けてクローニングした際、制限酵素ＢｃｌＩと制限
酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで認識されて得られるＤＮＡ断片
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 蛋白質の遺伝子及びＳｅｃＢ、ＳｅｃＤ
／Ｆ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＥ／Ｙよりなる群から選ばれる
少なくとも一つの大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子を含
有し、更に該Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の過剰発現を抑制的に
制御するＤＮＡを含有する組換えプラスミド。 - 【請求項２】 蛋白質が補乳類由来の蛋白質である請求
項１に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項３】 哺乳類由来の蛋白質が分子量約２０００
０のヒト成長ホルモンである請求項２に記載の組換えプ
ラスミド。 - 【請求項４】 Ｓｅｃ蛋白質遺伝子の過剰発現を抑制的
に制御するＤＮＡが誘導型プロモーター、或いは誘導型
プロモーター及びそのリプレッサー遺伝子である請求項
１または請求項２に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項５】 誘導型プロモーターがｔａｃプロモータ
ーであり、リプレッサー遺伝子がｌａｃＩqである請求
項３に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項６】 宿主大腸菌を請求項１または２記載の組
換えプラスミドで形質転換することにより得られ、蛋白
質の遺伝子と大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子が発現す
ることを特徴とする大腸菌形質転換体。 - 【請求項７】 宿主大腸菌を請求項３に記載の組換えプ
ラスミドで形質転換することにより得られ、蛋白質の遺
伝子と大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子が発現すること
を特徴とする大腸菌形質転換体。 - 【請求項８】 大腸菌形質転換体がＦＥＲＭ ＢＰ−５
８３０、ＦＥＲＭＢＰ−５８３１、ＦＥＲＭ ＢＰ−５
８３２、ＦＥＲＭ ＢＰ−５８３３のいずれか一つであ
る請求項７に記載の大腸菌形質転換体。 - 【請求項９】 請求項６に記載の大腸菌形質転換体を培
養して蛋白質を大腸菌のペリプラズムに分泌生産させる
ことを特徴とする蛋白質の分泌生産方法。 - 【請求項１０】 請求項７または請求項８に記載の大腸
菌形質転換体を、誘導剤を添加または添加していない培
地で培養して大腸菌由来のＳｅｃ蛋白質遺伝子の過剰発
現を抑制的に制御して、蛋白質を大腸菌のペリプラズム
に分泌生産させることを特徴とする蛋白質の分泌生産方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6658597A JPH09313191A (ja) | 1996-03-28 | 1997-03-19 | 蛋白質の分泌生産法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-74193 | 1996-03-28 | ||
| JP7419396 | 1996-03-28 | ||
| JP6658597A JPH09313191A (ja) | 1996-03-28 | 1997-03-19 | 蛋白質の分泌生産法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09313191A true JPH09313191A (ja) | 1997-12-09 |
Family
ID=26407781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6658597A Withdrawn JPH09313191A (ja) | 1996-03-28 | 1997-03-19 | 蛋白質の分泌生産法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09313191A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009510998A (ja) * | 2005-07-22 | 2009-03-19 | カロビオス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | シグナルペプチドを用いない、細菌からの抗体分泌 |
-
1997
- 1997-03-19 JP JP6658597A patent/JPH09313191A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009510998A (ja) * | 2005-07-22 | 2009-03-19 | カロビオス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | シグナルペプチドを用いない、細菌からの抗体分泌 |
| US8211648B2 (en) | 2005-07-22 | 2012-07-03 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Secretion of antibodies without signal peptides from bacteria |
| US9127046B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-09-08 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Secretion of antibodies without signal peptides from bacteria |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8148494B2 (en) | Signal peptide for the production of recombinant proteins | |
| US20230151374A1 (en) | Preparation of human basic fibroblast growth factor by using bacillus subtilis and endonuclease | |
| US20080254511A1 (en) | Process for the fermentative production of proteins | |
| JP2000050888A (ja) | 栄養要求性を相補することによる、抗生物質によらない選抜に基づく新規の大腸菌／宿主ベクタ―系 | |
| JP2014525255A (ja) | タンパク質発現 | |
| US5824502A (en) | Method for secretory production of protein | |
| JP4751347B2 (ja) | 組み換えタンパク質の製造のための微生物菌株 | |
| CA2624923C (en) | Novel transformation selection system comprising pyrc gene complementation | |
| JP7242829B2 (ja) | 新規細菌ｌｐｐ突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用 | |
| JPH07163347A (ja) | 組換えｄ−ヒダントイナーゼ、その生産方法および使用 | |
| JPH09313191A (ja) | 蛋白質の分泌生産法 | |
| US5654169A (en) | Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures | |
| US20050153398A1 (en) | Flavobacterium heparinum expression system | |
| JP2551746B2 (ja) | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 | |
| JP2509410B2 (ja) | 組換えＩｇＡ−プロテア―ゼの製法、組換えＤＮＡ、組換えベクタ―、細胞 | |
| AU594012B2 (en) | Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin | |
| JPH08228789A (ja) | 細菌株及びプラスミド | |
| JP3325512B2 (ja) | 大腸菌変異株 | |
| JP5957443B2 (ja) | フェリチンの製造方法 | |
| WO2022201917A1 (ja) | 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 | |
| JP2537764B2 (ja) | 高発現ベクタ―、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 | |
| JP2012200242A (ja) | かご状タンパク質の製造方法 | |
| JP2000078989A (ja) | ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 | |
| Pyne et al. | Strain improvement of Escherichia coli to enhance recombinant protein production | |
| JP2023065708A (ja) | 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
Effective date: 20041013 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 |