DE60223937T2

DE60223937T2 - Nukleinsäuren kodierend miteinander verbundene chromo/fluoreszenzdomänen und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE60223937T2
Application number: DE60223937T
Authority: DE
Inventors: Sergey Anatolievich Lukyanov
Original assignee: Clontech Laboratories Inc
Current assignee: Takara Bio USA Inc
Priority date: 2001-10-12
Filing date: 2002-10-10
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: JP2010017186A; EP1434483B1; JP2005507657A; US20040216180A1; WO2003031590A3; EP1434483A4; CA2461824A1; WO2003031590A2; JP5043287B2; US7183399B2; ATE379967T1; EP1434483A2; DE60223937D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Chromoproteine und Fluoreszenzproteine.
Hintergrund der Erfindung
Das Markieren ist ein Werkzeug zum Markieren eines Proteins, einer Zelle oder eines Organismus von Interesse und spielt eine bekannte Rolle bei vielen biochemischen, molekularbiologischen und medizinischen, diagnostischen Anwendungen. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Markierungen wurde entwickelt, einschließlich radioaktive Markierungen, Chromomarkierungen, fluoreszierende Markierungen, chemilumineszierende Markierungen usw. Jedoch besteht noch immer Interesse an der Entwicklung von neuen Markierungen. Von besonderem Interesse ist die Entwicklung von neuen Proteinmarkierungen, einschließlich Chromo- und/oder Fluoreszenzproteinmarkierungen.
Eine wichtige neue Klasse von Fluoreszenzproteinen, die kürzlich entwickelt wurde, sind die Fluoreszenzproteine hermatypischer Korallen (Reef Coral Fluorescent Proteins), wie in Matz, M. V., et al. (1999) Nature Biotechnol., 17: 969-973 beschrieben. Während diese Fluoreszenzproteine viele positive Merkmale zeigen, neigen bestimmte Versionen zu unvorhersehbarer Oligomerisierung, was Probleme aufwerfen kann und folglich ihre Verwendbarkeit einschränkt.
An sich besteht starkes Interesse an der Entwicklung von Versionen dieser wichtigen neuen Klasse von Fluoreszenzproteinen, wobei die Oligomerisierungseigenschaften vorhersehbar sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
Relevante Literatur

US-Patente von Interesse umfassen: 6,066,476 ; 6,020,192 ; 5,985,577 ; 5,976,796 ; 5,968,750 ; 5,968,738 ; 5,958,713 ; 5,919,445 ; 5,874,304 und 5,491,084 . Internationale Patentveröffentlichungen von Interesse umfassen: WO 00/46233 ; WO99/49019 und DE 197 18 640 A . Ebenso von Interesse sind: Anderluh et al., Biochemical and Biophysical Research Communications (1996) 220: 437-442; Dove et al., Biological Bulletin (1995) 189: 288-297; Fradkov et al., FEBS Lett. (2000) 479 (3): 127-30; Gurskaya et al., FEBS Lett., (2001) 507 (1): 16-20; Gurskaya et al., BMC Biochem. (2001) 2: 6; Lukyanov, K., et al (2000) J Biol Chemistry 275 (34): 25879-25882; Macek et al., Eur. J. Biochem. (1995) 234: 329-335; Martynov et al., J Biol Chem. (2001) 276: 21012-6; Matz, M. V., et al. (1999) Nature Biotechnol., 17: 969-973; Terskikh et al., Science (2000) 290: 1585-8; Tsien, Annual Rev. of Biochemistry (1998) 67: 509-544; Tsien, Nat. Biotech. (1999) 17: 956-957; Ward et al., J. Biol. Chem. (1979) 254: 781-788; Wiedermann et al., Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Tropenökologie-gto. Ulm. 17.–19.02.1999. Poster P-4.20; Yanushevich et al., FEBS Lett (30. Januar 2002) 511 (1-3): 11-4; und Yarbrough et al., Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-7.
WO 00/22128 offenbart Nukleinsäuren, die Proteinkonjugate kodieren, enthaltend Multimere von grün fluoreszierendem Protein aus der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Nukleinsäurezusammensetzungen, die Polypeptidprodukte mit mindestens zwei verknüpften Chromo/Fluoreszenz-Domänen kodieren, sowie Proteine, die von selbigen kodiert werden, werden bereitgestellt. Es werden ebenso die Polypeptide, die von den gegenständlichen Nukleinsäuren kodiert werden, sowie Antikörper für die gegenständlichen Proteine und transgene Zellen und nicht-menschliche Organismen bereitgestellt. Das gegenständliche Protein und die Nukleinsäurezusammensetzungen finden Verwendung in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen, z. B. bei der Herstellung von markierten Fusionsproteinen, die ein genaues und vorhersehbares Signal für das Fusionspartnerverhältnis aufweisen. Schließlich werden Kits zur Verwendung in solchen Anwendungen, z. B. die, die die gegenständlichen Nukleinsäurezusammensetzungen umfassen, bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Cr-449-Tandem-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit (4-Aminosäurelinker zwischen Monomeren ist doppelt unterstrichen). (SEQ ID Nr.: 01 & 02)
2 stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Cr-449-Tandem-Actin-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit (4-Aminosäurelinker zwischen Cr-449-Monomeren ist doppelt unterstrichen angegeben; 4-Aminosäurelinker zwischen zweitem Cr-449 und Actin ist mit Strichlinie unterstrichen angegeben). (SEQ ID Nr.: 03 & 04)
3 stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der HcRed-Cr1-Tandem-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit (4-Aminosäurelinker zwischen Monomeren ist doppelt unterstrichen). (SEQ ID Nr.: 05 & 06)
4 stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der AsRed 35-5 NA-Tandem-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit (4-Aminosäurelinker zwischen Monomeren ist doppelt unterstrichen). (SEQ ID Nr.: 07 & 08)
5 stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der AsRed 35-5D-Tandem-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit (4-Aminosäurelinker zwischen Monomeren ist doppelt unterstrichen). (SEQ ID Nr.: 09 & 10)
6A bis 6C. Schematische Darstellung der verwendeten Konstrukte. (6A) Eine Darstellung der kodierenden Region von Tandem-FP, das mit dem Zielprotein fusioniert ist. Dunklere Rechtecke stellen FPs dar, während die helleren Rechtecke das Zielprotein darstellen. Kurze Linien entsprechen den Linkern zwischen dem ersten FP, zweiten FP und dem Zielprotein. Aminosäuresequenzen der Linker werden nachstehend gezeigt. (6B) Mögliches Verhalten von dimeren FP in fusionierten Konstrukten. Dunklere Kreise stellen gefaltete FP-Moleküle dar, während hellere Quadrate gefaltete Zielproteinmoleküle zeigen (andere graphische Symbole wie in 6A). Im Fall von einzelnen Markierungen führt die intermolekulare FP-Dimerisierung zu gezwungener Nähe von zwei Zielproteinmolekülen. Im Gegensatz dazu bildet das Tandem-FP ein intramolekulares Dimer und wird daher als monomere Markierung betrachtet. (6C) Mögliches Verhalten von tetramerem FP in Fusionskonstrukten. Graphische Symbole wie in A und B. Intermolekulare Tetramerisierung der einzelnen Markierung bringt vier Zielmoleküle in enge Nähe. Im Gegensatz dazu, enthält bei einer Tandem-Markierung jedes „Tetramer" (Dimer von Dimeren) nur zwei Zielproteine.
7. Vergleich von verschiedenen β-Actinfusionskonstrukten, exprimiert in L929-Fibroblasten.
DEFINITIONEN
Gemäß der vorliegenden Erfindung können konventionelle molekularbiologische, mikrobiologische und DNA-Rekombinationstechniken innerhalb des Standes der Technik eingesetzt werden. Diese Techniken werden vollständig in der Literatur erläutert. Siehe z. B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach", Bände I und II (D. N. Glover Hrsg. 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Hrsg. 1984); „Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1985)); „Transcription and Translation" (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1984)); „Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, Hrsg. (1986))", „Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment gebunden werden kann, um so die Replikation des gebundenen Segments hervorzurufen.
Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) in entweder einzelsträngiger Form oder einer doppelsträngigen Helix. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls, und beschränkt es nicht auf irgendwelche speziellen tertiären Formen. Daher umfaßt dieser Ausdruck doppelsträngige DNA, die unter anderem in linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird.
Eine DNA-„kodierende Sequenz” ist eine DNA-Sequenz, die in ein Polypeptid in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulationssequenzen gegeben wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz sind durch ein Startcodon an dem 5'-(Amino)-Terminus und ein Translationsstopcodon an dem 3'-(Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säuger-)DNA und synthetische DNA-Sequenzen umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. 3' an der kodierenden Sequenz können sich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz befinden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Hybridisierung" auf das Verfahren der Assoziation von zwei Nukleinsäuresträngen unter Bildung eines antiparallelen Doppelstranges, stabilisiert mittels Wasserstoffbindung zwischen Resten der gegenüberliegenden Nukleinsäurestränge.
Der Ausdruck „Oligonucleotid" bezieht sich auf ein kurzes (unter 100 Basen lang) Nukleinsäuremolekül.
„DNA-Regulationssequenzen", wie hierin beschrieben, sind transkriptionelle und translationelle Kontrollsequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und dergleichen, die für eine Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen und/oder diese regulieren.
Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion, die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer Stromabwärts-kodierenden Sequenz (3'-Richtung) initiieren kann. Zur Definierung der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), wodurch sie die minimale Anzahl an Basen oder Elementen umfaßt, die notwendig ist, um die Transkription bei Niveaus, die über dem Hintergrund detektierbar sind, zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz werden eine Transkriptionsinitiationsstelle sowie Proteinbindungsdomänen gefunden, die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren werden oftmals, aber nicht immer, „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen enthalten. Verschiedene Promotoren, einschließlich induzierbare Promotoren, können verwendet werden, um die verschiedenen Vektoren der vorliegenden Erfindung anzutreiben.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme" auf bakterielle Enzyme, die jeweils doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nukleotidsequenz schneiden.
Eine Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA „transformiert" oder „transfektiert, wenn diese DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle integriert (kovalent verknüpft) sein oder nicht. Bei Prokaryoten, Hefe und Säugerzellen kann beispielsweise die transformierende DNA auf einem Episomelement wie einem Plasmid gehalten werden. In bezug auf eukaryotische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine, bei der die transformierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist, so daß es von Tochterzellen durch Chromosomreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle, Zellinien und Klone zu schaffen, die aus einer Population von Tochterzellen bestehen, die die transformierende DNA enthalten, gezeigt. Ein „Klon" ist eine Population von Zellen, abgeleitet aus einer Einzelzelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose. Eine „Zellinie" ist ein Klon einer primären Zelle, die in vitro über viele Generationen stabil wachsen kann.
Eine „heterologe" Region des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares Segment von DNA innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das in der Natur zusammen mit dem größeren Molekül nicht gefunden wird. Daher wⁱrd, wenn die heterologe Region ein Säugergen kodiert, das Gen normalerweise von DNA flankiert, die die Säuger-Genom-DNA in dem Genom des Quellorganismus nicht flankiert. In einem anderen Beispiel umfaßt die heterologe DNA eine kodierende Sequenz in einem Konstrukt, wo Teile von Genen aus zwei unterschiedlichen Quellen zusammen gebracht wurden, um so ein Fusionsproteinprodukt zu erzeugen. Allelvariationen oder natürlich vorkommende Mutationsvorgänge führen nicht zu einer heterologen Region der DNA, wie hierin definiert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Reportergen" auf eine kodierende Sequenz, die an heterologe Promotor- oder Enhancerelemente gebunden ist, und deren Produkt leicht und quantifizierbar analysiert werden kann, wenn das Konstrukt in Gewebe oder Zellen eingeführt wird.
Die hierin beschriebenen Aminosäuren liegen bevorzugt in der „L"-Isomerform vor. Die Aminosäuresequenzen werden in einem Einbuchstabencode angegeben (A: Alanin; C: Cystein; D: Asparaginsäure; E: Glutaminsäure; F: Phenylalanin; G: Glycin; H: Histidin; I: Isoleucin; K: Lysin; L: Leucin; M: Methionin; N: Asparagin; P: Prolin; Q: Glutamin; R: Arginin; S: Serin; T: Threonin; V: Valin; W: Tryptophan; Y: Tyrosin; X: irgendein Rest). NH₂ bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die an dem Aminoterminus eines Polypeptids vorliegt. COOH bezieht sich auf die freie Carboxygruppe, die an dem Carboxyterminus eines Polypeptids vorliegt. Demgemäß wird die Standardpolypeptidnomenklatur, J Biol. Chem., 243 (1969), 3552-59, verwendet.
Der Ausdruck „immunologisch aktiv" definiert die Fähigkeit des natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Chromo/Fluoreszenzproteins oder irgendeines Oligopeptids davon, eine spezifische Immunantwort in entsprechenden Tieren oder Zellen zu induzieren und mit spezifischen Antikörpern zu binden. Wie hierin verwendet, ist unter „antigener Aminosäuresequenz" eine Aminosäuresequenz zu verstehen, die entweder allein oder in Verbindung mit einem Trägermolekül eine Antikörperreaktion in einem Säuger auslösen kann. Der Ausdruck „spezifische Bindung" im Zusammenhang mit der Antikörperbindung an ein Antigen ist ein Ausdruck, der in der Technik allgemein bekannt ist, und bezieht sich auf das Binden eines Antikörpers an das Antigen, zu dem der Antikörper gezüchtet wurde, aber nicht an andere, nicht verwandte Antigene.
Wie hierin verwendet, beschreibt der Ausdruck „isoliert" ein Polynukleotid, ein Polypeptid, einen Antikörper oder eine Wirtszelle, das/der/die in einer anderen Umgebung als der vorliegt, in der das Polynukleotid, das Polypeptid, der Antikörper oder die Wirtszelle natürlich vorkommt.
Biolumineszenz (BL) wird als Emission von Licht durch lebende Organismen definiert, die im Dunkeln gut sichtbar ist und das Sehverhalten von Tieren beeinflußt (siehe z. B. Harvey, E. N. (1952). Bioluminescence. New York: Academic Press; Hastings, J. W. (1995). Bioluminescence. In: Cell Physiology (hrsg. von N. Speralakis). S. 651-681. New York: Academic Press.; Wilson, T. and Hastings, J. W. (1998). Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol 14, 197-230.). Biolumineszenz umfaßt keine sogenannte ultraschwache Lichtemission, die in so gut wie allen lebenden Strukturen unter Verwendung von empfindlicher luminometrischer Vorrichtung detektiert werden kann (Murphy, M. E. und Sies, H. (1990). Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems. Meth. Enzymol. 186, 595-610; Radotic, K, Radenovic, C, Jeremic, M. (1998.) Spontaneous ultra-weck bioluminescence in plants: origin, mechanisms and properties. Gen Physiol Biophys 17, 289-308), und aus schwacher Lichtemission, die höchstwahrscheinlich keine ökologische Rolle spielt, wie das Leuchten des Bambuswachstumskonus (Totsune, H., Nakano, M., Inaba, H. (1993). Chemiluminescence from bamboo shoot cut. Biochem. Biophys. Res Comm. 194, 1025-1029) oder Emission von Licht während der Befruchtung von Tiereiern (Klebanoff, S. J., Froeder, C. A., Eddy, E. M., Shapiro, B. M. (1979). Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of peroxidatic mechanism. J. Exp. Med. 149, 938-953; Schomer, B. und Epel, D. (1998). Redox changes during fertilization and maturation of marine invertebrate eggs. Dev Biol 203, 1-11).
BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nukleinsäurezusammensetzungen, die Polypeptidprodukte mit mindestens zwei verknüpften Chromo/Fluoreszenz-Domänen kodieren, sowie Proteine, die von selbigen kodiert werden, werden bereitgestellt. Es werden ebenso die Polypeptide, die von den gegenständlichen Nukleinsäuren kodiert werden, sowie Antikörper für die gegenständlichen Proteine und transgene Zellen und nicht-menschliche Organismen bereitgestellt. Das gegenständliche Protein und die Nukleinsäurezusammensetzungen finden Verwendung in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen, z. B. bei der Herstellung von markierten Fusionsproteinen, die ein genaues und vorhersehbares Signal für das Fusionspartnerverhältnis aufweisen. Schließlich werden Kits zur Verwendung in solchen Anwendungen, z. B. die, die die gegenständlichen Nukleinsäurezusammensetzungen umfassen, bereitgestellt.
Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, ist es selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf die speziellen Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung beschränkt ist, da Variationen der speziellen Ausführungsformen gemacht werden können und noch in den Umfang der anhängenden Ansprüche fallen. Es ist ebenso selbstverständlich, daß die eingesetzte Terminologie für den Zweck der Beschreibung der speziellen Ausführungsformen gedacht ist, und diese nicht einschränken soll. Statt dessen wird der Umfang der vorliegenden Erfindung durch die anhängende Ansprüche festgelegt.
In dieser Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen umfassen die Einzahlformen „ein", „eine" und „der/die/das" Pluralverweise, wenn im Kontext nicht deutlich anders angegeben. Wenn nicht anderweitig definiert, weisen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung auf, wie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden.
Wo ein Bereich an Werten bereitgestellt wird, ist es selbstverständlich, daß jeder Zwischenwert bis zu einem Zehntel der Einheit der unteren Grenze, sofern der Kontext nicht deutlich etwa anderes angibt, zwischen der oberen und unteren Grenze des Bereiches und jeder andere angegebene oder Zwischenwert in dem genannten Bereich in der Erfindung enthalten ist. Die obere und untere Grenze dieser kleineren Bereiche können unabhängig in den kleineren Bereichen enthalten sein, und sind ebenso in die Erfindung einbezogen, vorbehaltlich irgendeiner speziell ausgeschlossenen Grenze in dem genannten Bereich. Wo der genannte Bereich eine oder beide Grenzen umfaßt, sind Bereiche, die irgendeinen oder beide dieser einbezogenen Grenzen ausschließen, in der Erfindung enthalten.
Wenn nicht anderweitig definiert, weisen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung auf, wie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden. Obwohl jegliche Verfahren, Vorrichtungen und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent zu denen sind, in der Praxis oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
Alle hierin genannten Veröffentlichungen werden hierin durch Verweis zum Zweck der Beschreibung und Offenbarung der Zellinien, Vektoren, Methodologien und anderen Erfindungskomponenten, die in den Veröffentlichungen beschrieben sind, aufgenommen, die in Verbindung mit der derzeit beschriebenen Erfindung verwendet werden können.
Bei der weiteren Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die gegenständlichen Nukleinsäurezusammensetzungen zunächst beschrieben, gefolgt von einer Erläuterung der gegenständlichen Proteinzusammensetzungen, Antikörperzusammensetzungen und transgenen Zellen/nicht-menschlichen Organismen. Dann wird eine Übersicht der repräsentativen Verfahren, bei denen die gegenständlichen Proteine Verwendung finden, bereitgestellt.
NUKLEINSÄUREZUSAMMENSETZUNGEN
Wie oben zusammengefaßt, stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäurezusammensetzungen bereit, die Polypeptidprodukte kodiert, die mindestens zwei Chromo/Fluoreszenz-Domänen umfaßt, wobei die zwei oder mehr Domänen durch eine verknüpfende Domäne verbunden sind. Die zwei oder mehr Chromo/Fluoreszenz-Domänen sind in „Kopf-zu-Schwanz"-Weise lokalisiert, so daß die Domänen in Tandemform vorliegen. Ein Merkmal von vielen Ausführungsformen der gegenständlichen Nukleinsäuren ist, daß sich die zwei oder mehr Chromo/Fluoreszenz-Domänen der kodierten Polypeptide zumindest unter intrazellulären Bedingungen miteinander verbinden, so daß das kodierte Polypeptid eine tertiäre Struktur annimmt, die das Produkt der zwei oder mehr sich miteinander verbindenden Chromo/Fluoreszenz-Domänen ist. Mit anderen Worten, die zwei oder mehr Chromo/Fluoreszenz-Domänen „oligomerisieren" miteinander, wodurch ein Polypeptid mit einer „verknüpften", oligomeren, „tertiären" Struktur erzeugt wird. Wo beispielsweise das kodierte Polypeptid zwei Chromo/Fluoreszenz-Domänen aufweist, verbinden sich diese Domänen in dem kodierten Produkt miteinander, wodurch eine „verknüpfte" dimere Struktur erzeugt wird.
Die Anzahl an verschiedenen Chromo/Fluoreszenz-Domänen in den kodierten Polypeptiden kann variieren und beträgt mindestens 2, wobei die Anzahl bis zu 10 oder mehr betragen kann, aber typischerweise etwa 8 nicht überschreitet, normalerweise etwa 6 nicht überschreitet, und üblicherweise etwa 4 nicht überschreitet, wobei in bestimmten Ausführungsformen die Anzahl an verschiedenen Chromo/Fluoreszenz-Domänen in den kodierten Polypeptiden 2, 3 oder 4 beträgt, und in vielen Ausführungsformen 2 oder 3 und oftmals 2 beträgt. Die Chromo/Fluoreszenz-Domänen werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Wie oben erwähnt, sind in den kodierten Polypeptiden die zwei oder mehr Chromo/Fluoreszenz-Domänen durch eine verknüpfende Domäne verbunden. Die verknüpfende Domäne liegt oftmals in Bereichen von etwa 1 bis etwa 50 Resten in bezug auf die Länge, wobei in vielen Ausführungsformen die verknüpfende Domäne etwa 1 bis etwa 25 Reste lang, normalerweise etwa 1 bis etwa 15 Reste lang und üblicherweise etwa 1 bis etwa 10 Reste lang ist, und in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen etwa 1 bis etwa 5 Reste lang ist. Die verknüpfende Domäne kann jede geeignete Restsequenz, d. h. Aminosäuresequenz, aufweisen, wobei die Domäne eine flexible Domäne sein kann oder eine rigide Konfiguration annimmt, wenn erwünscht.
Wie oben erwähnt, umfassen die kodierten Polypeptide zwei oder mehr Chromo/Fluoreszenz-Domänen. Unter Chromo- und/oder Fluoreszenz-Domäne ist eine Domäne zu verstehen, die gefärbt ist, d. h. pigmentiert ist, wobei die Domäne fluoreszierend sein kann oder nicht, z. B. kann sie geringe, mittlere oder hohe Fluoreszenz bei Bestrahlung mit Licht mit einer Anregungswellenlänge zeigen. In jedem Fall sind die Chromo/Fluoreszenz-Domänen die, bei denen das gefärbte Merkmal, d. h. das Chromo- und/oder Fluoreszenzmerkmal, eines ist, das aus der Interaktion der zwei oder mehr Reste der Domäne und nicht aus einem einzelnen Rest, spezieller einer einzelnen Seitenkette eines einzelnen Rests, des Proteins hervorgeht. An sich umfassen die Chromo/Fluoreszenz-Domänen der vorliegenden Erfindung keine Domänen, die nur Fluoreszenz aus Resten zeigen, die selbst als intrinsische Fluorophore agieren, d. h. Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. An sich sind die Chromo/Fluoreszenz-Domänen der vorliegenden Erfindung Domänen, deren Fluoreszenz aus einer Struktur in der Domäne hervorgeht, die anders als die obigen spezifizierten einzelnen Reste ist, z. B. geht sie aus einer Interaktion von zwei oder mehr Resten hervor.
Die Chromo/Fluoreszenz-Domänen der Polypeptide, die durch die gegenständlichen Nukleinsäuren kodiert werden, sind Wildtyp-Proteine (oder Mutanten davon), nicht-biolumineszierende Nesseltier-Spezies, z. B. nicht-biolumineszierende Anthozoen-Spezies. Von besonderem Interesse in bestimmten Ausführungsformen sind Chromo/Fluoreszenz-Domänen, die die folgenden Wildtyp-Proteine sind (oder Mutanten davon): (1) amFP485, cFP484, zFP506, zFP540, drFP585, dsFP484, asFP600, dgFP512, dmFP592, wie in der Anmeldung Serien Nr. 10/006,922 offenbart, (2) hcFP640, wie in der Anmeldung Serien-Nr. 09/976,673 offenbart; (3) CgCP, wie in der Anmeldung Serien-Nr. 60/255,533 offenbart, und (4) hcriGFP, zoanRFP, scubGFP1, scubGFP2, rfloRFP, rfloGFP, mcavRFP, mcavGFP, cgigGFP, afraGFP, rfloGFP2, mcavGFP2, mannFP, wie in der Anmeldung Serien-Nr. 60/332,980 offenbart.
Nukleinsäuren, die Mutanten der obigen spezifischen Wildtyp-Proteine kodieren, sind ebenso von Interesse zur Verwendung als Chromo/Fluoreszenz-Domänen der kodierten Polypeptide. Mutantennukleinsäuren können durch Zufallsmutagenese oder gezielte Mutagenese unter Verwendung allgemein bekannter Techniken, die in der Technik Routine sind, erzeugt werden. In einigen Ausführungsformen weisen die Chromo- oder Fluoreszenz-Domänen, die durch Nukleinsäuren kodiert werden, die Homologa oder Mutanten kodieren, dieselben Fluoreszenzeigenschaften wie das Stamm-Wildtyp-Fluoreszenzprotein auf. In anderen Ausführungsformen kodieren homologe oder mutierte Nukleinsäuren Chromo- oder Fluoreszenzproteine mit veränderten Spektraleigenschaften im Vergleich zu dem Stamm.
Eine Mutantenkategorie, die von besonderem Interesse ist, ist die nicht-aggregierende Mutante. In vielen Ausführungsformen unterscheidet sich die nicht-aggregierende Mutante von der Stamm-Wildtyp-Sequenz durch eine Mutation in dem N-Terminus, der die Ladung moduliert, die auf Seitengruppen der N-Terminus-Reste erscheint, z. B. um die Ladung in einer Weise umzukehren oder zu neutralisieren, die ausreichend ist, um eine nicht-aggregierende Mutante des natürlich vorkommenden Proteins oder der Mutante zu erzeugen, wo ein spezielles Protein nicht aggregierend sein soll, wenn es unter Verwendung des Assays, der in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 60/270,983 angegeben ist, als nicht-aggregierend bestimmt wird. Spezieller werden basische Reste, die nahe den N-Termini der Proteine lokalisiert sind, substituiert, z. B. werden Lys- und Arg-Reste nahe dem N-Terminus mit negativ geladenen oder neutralen Resten substituiert. Spezifische nicht-aggregierende Mutanten von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: FP1-NA; FP3-NA; FP4-NA; FP6-NA; E5-NA; 6/9Q-NA; 7A-NA und dergleichen, wobei diese speziellen nicht-aggregierenden Mutanten weiter in der Anmeldung Serien-Nr. 10/006,922, eingereicht am 4. Dezember 2001, beschrieben sind.
Eine andere Mutantenkategorie von besonderem Interesse ist die modulierte Oligomerisationsmutante. Eine Mutante wird als eine modulierte Oligomerisationsmutante betrachtet, wenn ihre Oligomerisationseigenschaften im Vergleich zu dem Wildtyp-Protein anders sind. Wenn beispielsweise eine spezielle Mutante zu einem größeren oder geringeren Ausmaß oligomerisiert als der Wildtyp, wird sie als eine Oligomerisationsmutante betrachtet. Von besonderem Interesse sind Oligomerisationsmutanten, die nicht oligomerisieren, d. h. Monomere unter physiologischen (z. B. intrazellulären) Bedingungen sind, oder zu einem geringeren Ausmaß als der Wildtyp oligomerisieren, z. B. Dimere oder Trimere unter intrazellulären Bedingungen sind. Beispielsweise sind in bestimmten Ausführungsformen die Chromo/Fluoreszenz-Domänen Proteine, die für Tetramere natürlich sind. In anderen Ausführungsformen sind die Domänen Mutanten von Tetramer-bildenden Proteinen, wobei die Mutanten Dimere, aber keine Tetramere bilden.
Unter Nukleinsäurezusammensetzung ist eine Zusammensetzung zu verstehen, umfassend eine DNA-Sequenz mit einem offenen Leseraster, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, wie oben beschrieben, und unter geeigneten Bedingungen als ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert werden kann, wie oben beschrieben. Ebenso sind in diesem Ausdruck Nukleinsäuren einbezogen, die homolog, im wesentlichen den Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung ähnlich oder mit denen identisch sind. Daher stellt die vorliegende Erfindung kodierende Sequenzen, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, sowie Homologa davon bereit.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen spezifischen Nukleinsäurezusammensetzungen sind Homologa der obigen Sequenzen ebenso von Interesse. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Sequenzähnlichkeit zwischen Homologa mindestens etwa 20%, manchmal mindestens etwa 25%, und kann 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% oder höher sein, einschließlich 75%, 80%, 85%, 90% und 95% oder höher. Die Sequenzähnlichkeit wird berechnet, basierend auf einer Referenzsequenz, die eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein kann, wie ein konserviertes Motiv, eine kodierende Region, eine flankierende Region usw. Eine Referenzsequenz wird normalerweise mindestens etwa 18 nt lang, üblicherweise mindestens etwa 30 nt lang sein, und kann sich über die komplette Sequenz erstrecken, die verglichen wird. Algorithmen für die Sequenzanalyse sind in der Technik bekannt, wie BLAST, beschrieben in Altschul et al. (1990), J, Mol. Biol. 215: 403-10 (unter Verwendung von Voreinstellungen, d. h. Parametern w = 4 und T = 17). Von besonderem Interesse in bestimmten Ausführungsformen sind Nukleinsäuren von im wesentlichen derselben Länge wie die Nukleinsäure, identifiziert als SEQ ID Nr.: 1 & 3, wobei unter im wesentlichen derselben Länge zu verstehen ist, daß jeder Unterschied in bezug auf die Länge etwa 20 Zahlen-% nicht überschreitet, normalerweise etwa 10 Zahlen-% nicht überschreitet und üblicherweise etwa 5 Zahlen-% nicht überschreitet; und eine Sequenzidentität mit jeder dieser Sequenzen von mindestens etwa 90%, normalerweise mindestens etwa 95% und üblicherweise mindestens etwa 99% über die gesamte Länge der Nukleinsäure aufweist. In vielen Ausführungsformen weisen die Nukleinsäuren eine Sequenz auf, die im wesentlichen ähnlich (d. h. dieselbe ist) oder identisch zu den Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1 & 3 ist. Unter im wesentlichen ähnlich ist zu verstehen, daß die Sequenzidentität im allgemeinen mindestens etwa 60%, normalerweise mindestens etwa 75% und oftmals mindestens etwa 80, 85, 90 oder sogar 95% betragen wird.
Es werden ebenso Nukleinsäuren, die die Proteine kodieren, die durch die oben beschriebenen Nukleinsäuren kodiert werden, aber sich in der Sequenz von den oben beschriebenen Nukleinsäuren aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden, bereitgestellt.
Es werden ebenso Nukleinsäuren, die mit den oben beschriebenen Nukleinsäuren unter stringenten Bedingungen hybridisieren, bereitgestellt. Ein Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung bei 50°C oder mehr und 0,1 × SSC (15 mM Natriumchlorid/1,5 mM Natriumcitrat). Ein anderes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung: 50% Formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Lachsspermium-DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen, die zumindest so stringent wie die obigen repräsentativen Bedingungen sind, wobei die Bedingungen als mindestens so stringent betrachtet werden, wenn sie mindestens etwa 80%, typischerweise mindestens etwa 90% so stringent wie die obigen spezifischen stringenten Bedingungen sind. Andere stringente Hybridisierungsbedingungen sind in der Technik bekannt und können ebenso eingesetzt werden, um Nukleinsäuren von dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung zu identifizieren.
Nukleinsäuren, die Mutanten der Polypeptide der Erfindung kodieren, werden ebenso bereitgestellt. Mutierte Nukleinsäuren können durch Zufallsmutagenese oder gezielte Mutagenese unter Verwendung allgemein bekannter Techniken erzeugt werden, die in der Technik Routine sind. In einigen Ausführungsformen weisen Polypeptide, die durch Nukleinsäuren kodiert werden, die Homologa oder Mutanten kodieren, dieselben Fluoreszenzeigenschaften wie das Stammpolypeptid auf. In anderen Ausführungsformen kodieren homologe oder mutierte Nukleinsäuren Polypeptide mit veränderten Spektraleigenschaften.
Die gegenständlichen Nukleinsäuren können in einem geeigneten Vektor zur extrachromosomalen Erhaltung oder zur Integration in ein Wirtsgenom vorliegen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die Nukleinsäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können die gesamten oder einen Teil der gegenständlichen Polypeptide kodieren. Doppel- oder einzelsträngige Fragmente können aus der DNA-Sequenz durch chemisches Synthetisieren von Oligonukleotiden gemäß konventionellen Verfahren, durch Restriktionsenzymdigestion, durch PCR-Amplifikation usw. erhalten werden. Größtenteils werden die DNA-Fragmente mindestens etwa 15 nt, normalerweise mindestens etwa 18 nt oder etwa 25 nt betragen, und können mindestens etwa 50 nt betragen. In einigen Ausführungsformen können die gegenständlichen Nukleinsäuremoleküle etwa 100 nt, etwa 200 nt, etwa 300 nt, etwa 400 nt, etwa 500 nt, etwa 600 nt, etwa 700 nt oder etwa 720 nt in bezug auf die Länge betragen. Die gegenständlichen Nukleinsäuren können Fragmente der gegenständlichen Proteine oder der Vollängen-Proteine kodieren, z. B. können die gegenständlichen Nukleinsäuren Polypeptide von etwa 25 AS, etwa 50 AS, etwa 75 AS, etwa 100 AS, etwa 125 AS, etwa 150 AS, etwa 200 AS, etwa 210 AS, etwa 220 AS, etwa 230 AS oder etwa 240 AS bis zu dem gesamten Protein kodieren.
Die gegenständlichen Polynukleotide und Konstrukte davon werden bereitgestellt. Diese Moleküle können durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Protokollen, die dem Fachmann bekannt sind, synthetisch hergestellt werden. Geeignete Polynucleotidkonstrukte werden unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationstechniken, wie beispielsweise in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben, und unter den gegenwärtigen Bestimmungen, beschrieben in United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research, gereinigt.
Es werden ebenso Nukleinsäuren, die Fusionsproteine kodieren, enthaltend die zwei oder mehr Chromo/Fluoreszenz-Domänen oder Fragmente davon, in Tandemform, die an ein zweites Protein fusioniert sind, z. B. eine Abbausequenz, ein Signalpeptid, ein Protein von Interesse (d. h. ein Protein, das untersucht wird) usw., bereitgestellt. Fusionsproteine können ein gegenständliches Polypeptid oder ein Fragment davon und einen Fusionspartner, der inframe an dem N-Terminus und/oder C-Terminus des gegenständlichen Polypeptids fusioniert ist, umfassen (das zwei oder mehr, oftmals zwei, Chromo/Fluoreszenz-Domänen umfaßt, die durch eine verknüpfende Gruppe verbunden sind, wie oben beschrieben). Fusionspartner umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt auf Polypeptide, die Antikörper spezifisch an den Fusionspartner binden können (z. B. Epitop-Markierungen); Antikörper oder Bindungsfragmente davon; Polypeptide, die eine katalytische Funktion bereitstellen oder eine zelluläre Reaktion induzieren; Liganden oder Rezeptoren oder Mimetika davon; und dergleichen. Bei solchen Fusionsproteinen ist der Fusionspartner im allgemeinen nicht natürlich mit den Chromo/Fluoreszenz-Domänen des Fusionsproteins verbunden, und in bestimmten Ausführungsformen kein Nesseltier-Protein oder Derivat/Fragment davon, d. h. es wird nicht in Nes seltierspezies gefunden. Ein wichtiges Merkmal von solchen Fusionsproteinen ist, daß unter intrazellulären Bedingungen jedes Fusionspartnerprotein mit einer bekannten Anzahl an Chromo/Fluoreszenz-Domänen verbunden ist, so daß Fusionsproteine mit einem vorhersehbaren Signal für das Fusionspartnerverhältnis erzeugt werden. In bevorzugten Ausführungsformen mit zwei Chromo/Fluoreszenz-Domänen, die in Tandemform angeordnet und durch eine Verknüpfungsgruppe verknüpft sind, verbinden sich die beiden Chromo/Fluoreszenz-Domänen miteinander, wodurch eine dimere Struktur, fusioniert an einen Fusionspartner, erzeugt wird, deren Struktur nicht mit weiteren Chromo/Fluoreszenz-Domänen verbunden ist, so daß ein Fusionsprotein erzeugt wird, das bekanntermaßen zwei Chromo/Fluoreszenz-Domänen für den Fusionspartner aufweist. Von besonderem Interesse in diesen Ausführungsformen sind zwei Tandem-Chromo/Fluoreszenz-Domänen, die miteinander verbunden sind, wodurch ein verknüpftes Dimer erzeugt wird, das sich wie ein Monomer verhält, d. h. die Dimerstruktur oligomerisiert nicht mit einer/einem oder mehreren weiteren Chromo/Fluoreszenz-Domänen/Proteinen.
Es werden ebenso Konstrukte, umfassend die gegenständlichen Nukleinsäuren, die in einen Vektor eingeführt sind, bereitgestellt, wobei solche Konstrukte für eine Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen, einschließlich Propagierung, Proteinproduktion usw. verwendet werden können. Virale und nicht-virale Vektoren können hergestellt und verwendet werden, einschließlich Plasmide. Die Wahl des Vektors wird von dem Typ der Zelle, in der die Propagierung gewünscht ist, und dem Propagierungszweck abhängen. Bestimmte Vektoren sind zum Amplifizieren und Herstellen großer Mengen der gewünschten DNA-Sequenz nützlich. Andere Vektoren sind für die Expression in Zellen in Kultur geeignet. Noch weitere Vektoren sind für den Transfer und die Expression in Zellen in einem ganzen Tier oder Person geeignet. Die Wahl des entsprechenden Vektors ist dem Fachmann bekannt. Viele dieser Vektoren sind kommerziell erhältlich. Um die Konstrukte herzustellen, wird das Teil- oder Vollängen-Polynukleotid in einen Vektor typischerweise mittels DNA-Ligase-Anlagerung an eine gespaltene Restriktionsenzymstelle in dem Vektor eingeführt. Alternativ kann die gewünschte Nukleotidsequenz durch homologe Rekombination in vivo eingeführt werden. Typischerweise wird dies durch Anlagern von Regionen mit Homologie für den Vektor an den Flanken der gewünschten Nukleotidsequenz erreicht. Die Regionen mit Homologie werden durch Ligation von Oligonukleotiden oder durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Pri mern, beispielsweise umfassend sowohl die Region mit Homologie als auch einen Teil der gewünschten Nukleotidsequenz, zugefügt.
Es werden ebenso Expressionskassetten oder -systeme, die neben anderen Anwendungen Verwendung bei der Synthese der gegenständlichen Polypeptide finden, bereitgestellt. Für die Expression wird das Genprodukt, das von einem Polynukleotid der Erfindung kodiert wird, in jedem passenden Expressionssystem exprimiert, einschließlich beispielsweise Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Amphibien- und Säugersystemen. Geeignete Vektoren und Wirtszellen werden in US-Patent Nr. 5,654,173 beschrieben. In dem Expressionsvektor wird ein gegenständliches Polynukleotid mit einer Regulationssequenz, wenn geeignet, verknüpft, um die gewünschten Expressionseigenschaften zu erhalten. Diese Regulationssequenzen können Promotoren (angelagert entweder an dem 5'-Ende des codierenden Stranges oder an dem 3'-Ende des Antisense-Stranges), Enhancer, Terminatoren, Operatoren, Repressoren und Inducer umfassen. Die Promotoren können reguliert werden oder konstitutiv sein. Bei einigen Situationen kann es wünschenswert sein, konditionell aktive Promotoren zu verwenden, wie gewebespezifische oder entwicklungsphasen-spezifische Promotoren. Diese werden mit der gewünschten Nukleotidsequenz unter Verwendung der Techniken, die oben für die Verknüpfung mit Vektoren beschrieben sind, verknüpft. Jegliche im Stand der Technik bekannte Techniken können verwendet werden. Mit anderen Worten wird der Expressionsvektor eine transkriptionelle und translationelle Initiationsregion, die induzierbar oder konstitutiv sein kann, wobei die kodierende Region unter der transkriptionellen Kontrolle der transkriptionellen Initiationsregion operabel verknüpft wird, und eine transkriptionelle und translationelle Terminationsregion bereitstellen. Diese Kontrollregionen können für die gegenständlichen Spezies natürlich sein, aus der die gegenständliche Nukleinsäure erhalten wird, oder können von exogenen Quellen abgeleitet sein.
Expressionsvektoren weisen im allgemeinen passende Restriktionsstellen auf, die nahe der Promotorsequenz lokalisiert sind, um die Einführung von Nukleinsäuresequenzen, die heterologe Proteine kodieren, bereitzustellen. Ein selektierbarer Marker, der in dem Expressionswirt wirksam ist, kann vorliegen. Expressionsvektoren können unter anderem für die Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, wie oben beschrieben.
Expressionskassetten können hergestellt werden, umfassend eine Transkriptionsinitiationsregion, das Gen oder Fragment davon und eine transkriptionelle Terminationsregion. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Sequenzen, die die Expression von funktionellen Epitopen oder Domänen ermöglichen, normalerweise mindestens etwa 8 Aminosäuren lang, üblicherweise mindestens etwa 15 Aminosäuren lang, bis etwa 25 Aminosäuren und bis zum vollständigen offenen Leseraster des Gens. Nach der Einführung der DNA können die Zellen, die das Konstrukt enthalten, mittels eines selektierbaren Markers selektiert werden, die Zellen expandiert und dann zur Expression verwendet werden.
Die oben beschriebenen Expressionssysteme können mit Prokaryoten oder Eukaryoten gemäß konventioneller Wege in Abhängigkeit des Zweckes der Expression eingesetzt werden. Für die großtechnische Herstellung des Proteins können ein einzelliger Organismus, wie E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Insektenzellen in Kombination mit Baculovirusvektoren, oder Zellen eines höheren Organismus, wie Wirbeltieren, z. B. COS 7 Zellen, HEK 293, CHO, Xenopus Oocytes usw., als Expressionswirtszellen verwendet werden. In einigen Situationen ist es wünschenswert, das Gen in eukaryotischen Zellen zu exprimieren, wo das exprimierte Protein aus der natürlichen Faltung und posttranslationellen Modifikationen seinen Nutzen ziehen wird. Kleine Peptide können ebenso im Labor synthetisiert werden. Polypeptide, die Teilmengen der vollständigen Proteinsequenz sind, können verwendet werden, um Teile des Proteins, die für die Funktion wichtig sind, zu identifizieren und zu untersuchen.
Spezifische Expressionssysteme von Interesse umfassen Bakterien-, Hefe-, Insektenzellen- und Säugerzellen-abgeleitete Expressionssysteme. Repräsentative Systeme von jeder dieser Kategorien werden nachstehend bereitgestellt:

Bakterien. Expressionssysteme in Bakterien umfassen die, die in Chang et al., Nature (1978) 275: 615; Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544; Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057; EP 0 036 776 ; US-Patent Nr. 4,551,433 ; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80: 21-25; und Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269 beschrieben sind.
Hefe. Expressionssysteme in Hefe umfassen die, die in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Micro biol. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; US-Patent Nr. 4,837,148 und 4,929,555 ; Beach and Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284-289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205-221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81: 1470-1474; Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479; EP 0 244 234 und WO 91/00357 beschrieben sind.
Insektenzellen. Expression von heterologen Genen in Insekten wird erreicht, wie in US-Patent Nr. 4,745,051 ; Friesen et al., „The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler, Hrsg.); EP 0 127 839 ; EP 0 155 476 ; und Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765-776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177; Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409; Maeda et al., Nature (1985) 315: 592-594; Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82: 8844; Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273; und Martin et al., DNA (1988) 7: 99 beschrieben. Zahlreiche Baculovirusstämme und Varianten und entsprechende zulässige Insektenwirtszellen aus Wirten sind in Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47-55, Miller et al., Generic Engineering (1986) 8: 277-279, und Maeda et al., Nature (1985) 315: 592-594 beschrieben.
Säugerzellen. Säugerexpression wird erreicht, wie in Dijkema et al., EMBO J (1985) 4: 761, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79: 6777, Boshart et al., Cell (1985) 41: 521 und US-Patent Nr. 4,399,216 beschrieben. Andere Merkmale der Säugerexpression werden erleichtert, wie in Ham and Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44, Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255, US-Patenten Nr. 4,767,704 , 4,657,866 , 4,927,762 , 4,560,655 , WO 90/103430 , WO 87/00195 und U.S. RE 30,985 beschrieben.

Wenn irgendwelche der obigen Wirtszellen oder andere geeignete Wirtszellen oder nicht-menschliche Organismen verwendet werden, um die Polynukleotide oder Nukleinsäuren der Erfindung zu replizieren und/oder zu exprimieren, liegt die resultierende replizierte Nukleinsäure, die RNA, das exprimierte Protein oder Polypeptid innerhalb des Umfangs der Erfin dung als ein Produkt der Wirtszelle oder des nicht-menschlichen Organismus. Das Produkt wird durch irgendein in der Technik bekanntes Mittel rückgewonnen.
Die gegenständlichen Nukleinsäuren können in verschiedenen in der Technik bekannten Wegen mutiert werden, um gezielte Veränderungen in der Sequenz des kodierten Proteins, die Eigenschaften des kodierten Proteins, einschließlich Fluoreszenzeigenschaften des kodierten Proteins usw., zu erzeugen. Die DNA-Sequenz oder das Proteinprodukt einer solchen Mutation wird normalerweise den hierin bereitgestellten Sequenzen im wesentlichen ähnlich sein, z. B. wird sie/es sich um mindestens ein Nukleotid bzw. Aminosäure unterscheiden, und kann sich um mindestens zwei, aber nicht mehr als etwa zehn Nukleotide oder Aminosäuren unterscheiden. Die Sequenzveränderungen können Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder eine Kombination davon sein. Deletionen können ferner größere Veränderungen umfassen, wie Deletionen einer Domäne oder eines Exons, z. B. von Streckungen von 10, 20, 50, 75, 100, 150 oder mehr AS-Resten. Techniken für die In-vitro-Mutagenese von geklonten Genen sind bekannt. Beispiele von Protokollen für ortsspezifische Mutagenese sind in Gustin et al. (1993), Biotechniques 14: 22; Barany (1985), Gene 37: 111-23; Colicelli et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 537-9 und Prentki et al. (1984), Gene 29: 303-13 zu finden. Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, S. 15.3-15.108; Weiner et al. (1993), Gene 126: 35-41; Sayers et al. (1992), Biotechniques 13: 592-6; Jones and Winistorfer (1992), Biotechniques 12: 528-30; Barton et al. (1990), Nucleic Acids Res 18: 7349-55; Marotti and Tomich (1989), Gene Anal. Tech. 6: 67-70 und Zhu (1989), Anal Biochem 177: 120-4 zu finden. Diese mutierten Nukleinsäurederivate können verwendet werden, um Struktur-Funktions-Beziehungen eines speziellen Chromo/Fluoreszenz-Proteins zu untersuchen, oder um die Eigenschaften des Proteins, das seine Funktion oder Regulierung beeinflußt, zu verändern.
Ebenso von Interesse sind humanisierte Versionen der gegenständlichen Nukleinsäuren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „humanisiert" auf Veränderungen an der Nukleinsäuresequenz, um die Codone zur Expression des Proteins in menschlichen Zellen zu optimieren (Yang et al., Nucleic Acids Research 24 (1996), 4592-4593). Siehe ebenso US-Patent Nr. 5,795,737 , das die Humanisierung von Proteinen beschreibt, wobei dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen wird.
PROTEIN/POLYPEPTID-ZUSAMMENSETZUNGEN
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Polypeptide, die von den gegenständlichen Nukleinsäuren kodiert werden, sowie damit verbundene Polypeptidzusammensetzungen bereit. Der Ausdruck Polypeptidzusammensetzung, wie hierin verwendet, bezieht sich sowohl auf das Vollängen-Protein als auch auf Proteine oder Fragmente davon. Ebenso sind in diesem Ausdruck Variationen des Stammpolypeptids, wobei diese Variationen homolog zu dem Stammpolypeptid oder diesem im wesentlichen ähnlich sind, und Mutanten der Stammpolypeptide einbezogen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben.
In vielen Ausführungsformen weisen die Chromo/Fluoreszenz-Domänen der gegenständlichen Polypeptide ein Extinktionsmaximum im Bereich von etwa 300 bis 700, normalerweise etwa 350 bis 650 und üblicherweise etwa 400 bis 600 nm auf. Wo die gegenständlichen Domänen Fluoreszenzdomänen sind, worunter zu verstehen ist, daß sie von Licht bei einer Wellenlänge angeregt werden können, woraufhin sie Licht bei einer anderen Wellenlänge emittieren werden, liegen die Anregungsspektren der gegenständlichen Domänen typischerweise in Bereichen von etwa 300 bis 700, normalerweise etwa 350 bis 650 und üblicherweise etwa 400 bis 600 nm, während die Emissionsspektren der gegenständlichen Domänen typischerweise in Bereichen von etwa 400 bis 800, normalerweise von etwa 425 bis 775 und üblicherweise von etwa 450 bis 750 nm liegen. Die gegenständlichen Domänen weisen im allgemeinen einen maximalen Extinktionskoeffizienten auf, der in Bereichen von etwa 10.000 bis 50.000 und normalerweise etwa 15.000 bis 45.000 liegt. Die gegenständlichen Domänen liegen in bezug auf die Länge typischerweise in dem Bereich von etwa 150 bis 300 und normalerweise etwa 200 bis 300 Aminosäureresten, und weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 15 bis 35 kDa, normalerweise etwa 17,5 bis 32,5 kDa auf.
Bei bestimmten Ausführungsformen leuchten die gegenständlichen Domänen, wobei unter leuchtend zu verstehen ist, daß die Chromoproteine und ihre fluoreszierenden Mutanten durch übliche Verfahren detektiert werden können (z. B. visuelles Screening, Spektrophotometrie, Spektrofluorometrie, Fluoreszenzmikroskopie, durch FACS-Maschinen usw.). Die Fluoreszenzleuchtkraft von speziellen Fluoreszenzproteinen wird durch ihre Quantenausbeute, multipliziert mit dem maximalen Extinktionskoeffizienten, bestimmt. Die Leuchtkraft eines Chromoproteins kann durch seinen maximalen Extinktionskoeffizienten ausgedrückt werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen falten sich die gegenständlichen Domänen schnell nach der Expression in der Wirtszelle. Unter schnellem Falten ist zu verstehen, daß die Domänen ihre tertiäre Struktur erreichen, die ihre Chromo- oder Fluoreszenzqualität in einer kurzen Zeit hervorbringt. In diesen Ausführungsformen falten sich die Domänen in einem Zeitraum, der im allgemeinen etwa 3 Tage nicht überschreitet, normalerweise etwa 2 Tage nicht überschreitet und üblicherweise etwa 1 Tag nicht überschreitet.
Spezielle Domänen von Interesse sind Polypeptide oder Varianten von Chromo/Fluoroproteinen (und Mutanten davon) aus den folgenden speziellen Anthozoen-Spezies: Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp., Zoanthus sp., Discosoma striata, Discosoma sp. „rot", Anemonia sulcata, Discosoma sp. „grün", Discosoma sp. „magenta", sowie die weiteren speziellen oben aufgelisteten Spezies.
Homologa oder Proteine (oder Fragmente davon), die in der Sequenz von den Aminosäuresequenzen der oben bereitgestellten spezifischen Polypeptide variieren, sind ebenso von Interesse als Chromo/Fluoreszenz-Domänen. Unter Homolog ist ein Protein mit mindestens etwa 10%, normalerweise mindestens etwa 20% und üblicherweise mindestens etwa 30%, und in vielen Ausführungsformen mindestens etwa 35%, normalerweise mindestens etwa 40% und üblicherweise mindestens etwa 60% Aminosäuresequenzidentität zu dem Protein der vorliegenden Erfindung zu verstehen, wie unter Verwendung von MegAlign, DNAstar (1998) clustal Algorithm bestimmt, wie in D. G. Higgins und P. M. Sharp, „Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments an a Microcomputer", (1989) CABIOS, 5: 151-153 beschrieben. (Die verwendeten Parameter sind Ktuple 1, Gap Penalty 3, Window 5 und Diagonals Saved 5). Bei vielen Ausführungsformen weisen Homologa von Interesse viel höhere Sequenzidentität auf, z. B. 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder höher.
Es werden ebenso Domänen, die im wesentlichen mit den Sequenzen der oben bereitgestellten spezifischen Proteine identisch sind, bereitgestellt, wobei unter im wesentlichen identisch zu verstehen ist, daß das Protein eine Aminosäuresequenzidentität zu einem der oben speziell bereitgestellten Proteine von mindestens etwa 60%, normalerweise mindestens etwa 65% und üblicherweise mindestens etwa 70% aufweist, wobei in einigen Fällen die Identität viel höher sein kann, z. B. 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder höher.
Bei vielen Ausführungsformen weisen die entsprechenden Homologa Strukturmerkmale auf, die in den oben bereitgestellten spezifischen Sequenzen gefunden werden, wobei diese Strukturmerkmale die β-can-Faltung umfassen.
Proteine, die Mutanten der oben speziell beschriebenen Proteine sind, sind als Chromo/Fluoreszenz-Domänen ebenso von Interesse. Mutanten können biologische Eigenschaften der Wildtyp-Proteine (z. B. natürlich vorkommend) behalten, oder können biologische Eigenschaften aufweisen, die sich von den Wildtyp-Proteinen unterscheiden. Der Ausdruck „biologische Eigenschaft" der gegenständlichen Proteine umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf Spektraleigenschaften, wie Extinktionsmaximum, Emissionsmaximum, maximaler Extinktionskoeffizient, Leuchtkraft (z. B. im Vergleich zu dem Wildtyp-Protein oder einem anderen Referenzprotein, wie dem grün fluoreszierenden Protein aus A. victoria), und dergleichen; In-vivo- und/oder In-vitro-Stabilität (z. B. Halbwertszeit) usw. Mutanten umfassen einzelne Aminosäureveränderungen, Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren, N-terminale Verkürzungen, C-terminale Verkürzungen, Insertionen usw.
Mutanten können unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie, z. B. Zufallsmutagenese und gezielte Mutagenese, erzeugt werden. Mehrere Mutanten sind hierin beschrieben. In Anbetracht der in den Beispielen bereitgestellten Anleitung und unter Verwendung der Standardtechniken kann der Fachmann ohne weiteres eine breite Vielzahl an weiteren Mutanten erzeugen und testen, ob eine biologische Eigenschaft verändert wurde. Beispielsweise kann die Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Spektrophotometers bei verschiedenen Anregungswellenlängen gemessen werden.
Mutanten der obigen speziell bereitgestellten Proteine werden ebenso bereitgestellt. Im allgemeinen umfassen diese Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die durch ein offenes Leseraster (ORF) des Gens kodiert wurde, welches das gegenständliche Wildtyp-Protein kodiert, einschließlich das Vollängen-Protein und Fragmente davon, speziell biologisch aktive Fragmente und/oder Fragmente, die den funktionellen Domänen entsprechen, und dergleichen; und einschließlich Fusionen der gegenständlichen Polypeptide an andere Proteine oder Teile davon. Fragmente von Interesse werden typischerweise mindestens etwa 10 AS lang, normalerweise mindestens etwa 50 AS lang sein, und können bis zu 300 AS lang oder länger sein, aber werden normalerweise etwa 1000 AS in bezug auf die Länge nicht überschreiten, wobei das Fragment eine Streckung von Aminosäuren, die mit dem gegenständlichen Protein identisch ist, von mindestens etwa 10 AS und normalerweise mindestens etwa 15 AS, und in vielen Ausführungsformen mindestens etwa 50 AS in bezug auf die Länge aufweist. In einigen Ausführungsformen sind die gegenständlichen Polypeptide etwa 25 AS, etwa 50 AS, etwa 75 AS, etwa 100 AS, etwa 125 AS, etwa 150 AS, etwa 200 AS, etwa 210 AS, etwa 220 AS, etwa 230 AS oder etwa 240 AS lang, bis zu dem gesamten Protein. In einigen Ausführungsformen behält ein Proteinfragment die gesamte oder im wesentlichen gesamte biologische Eigenschaft des Wildtyp-Proteins.
Die gegenständlichen Proteine und Polypeptide, die die Chromo/Fluoreszenz-Domänen bilden, können unter Verwendung irgendeines geeigneten Protokolls synthetisch hergestellt werden, z. B. durch Exprimieren eines rekombinanten Gens oder Nukleinsäurekodierungssequenz, die das Protein von Interesse in einem geeigneten Wirt codiert, wie oben beschrieben. Jegliche günstigen Proteinreinigungsverfahren können eingesetzt werden, wobei geeignete Proteinreinigungsmethoden in Guide to Protein Purification, (Deuthser Hrsg.) (Academic Press, 1990) beschrieben sind. Beispielsweise kann ein Lysat aus der ursprünglichen Quelle hergestellt und unter Verwendung von HPLC, Ausschlußchromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie und dergleichen gereinigt werden.
ANTIKÖRPERZUSAMMENSETZUNGEN
Es werden ebenso Antikörper, die spezifisch an die gegenständlichen kodierten Polypeptide binden, bereitgestellt. Geeignete Antikörper werden durch Immunisieren eines Wirtstieres mit Peptiden, umfassend die gesamten oder einen Teil der gegenständlichen Polypeptide, erhalten. Geeignete Wirtstiere umfassen Maus, Ratte, Schaf, Ziege, Hamster, Kaninchen usw. Das Immunogen kann das vollständige Protein oder Fragmente und Derivate davon umfassen.
Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern ist der erste Schritt die Immunisierung des Wirtstieres mit dem Zielprotein, wobei das Zielprotein bevorzugt in im wesentlichen reiner Form vorliegt, umfassend weniger als etwa 1% Kontaminanten. Das Immunogen kann das vollständige Zielprotein, Fragmente oder Derivate davon umfassen. Um die Immunantwort des Wirtstieres zu erhöhen, kann das Zielprotein mit einem Adjuvans vereinigt werden, wobei geeignete Adjuvanzien Alaun, Dextran, Sulfat, große polymere Anionen, Öl- & Wasseremulsionen, z. B. Freund-Adjuvans, komplettes Freund-Adjuvans, und dergleichen umfassen. Das Zielprotein kann ebenso mit synthetischen Trägerproteinen oder synthetischen Antigenen konjugiert werden. Eine Vielzahl von Wirten kann immunisiert werden, um die polyklonalen Antikörper zu erzeugen. Diese Wirte umfassen Kaninchen, Meerschweinchen, Nagetiere, z. B. Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und dergleichen. Das Zielprotein wird an den Wirt, normalerweise intradermal, mit einer anfänglichen Dosierung verabreicht, gefolgt von einer oder mehreren, normalerweise mindestens zwei, zusätzlichen Booster-Dosierungen. Nach der Immunisierung wird das Blut aus dem Wirt gesammelt, gefolgt von der Trennung des Serums von den Blutzellen. Das Ig, das in dem resultierenden Antiserum vorliegt, kann unter Verwendung bekannter Verfahren, wie Ammoniumsalzfraktionierung, DEAE-Chromatographie und dergleichen weiter fraktioniert werden.
Monoklonale Antikörper werden durch konventionelle Techniken hergestellt. Im allgemeinen stellen die Milz und/oder Lymphknoten eines immunisierten Wirtstieres eine Quelle von Plasmazellen bereit. Die Plasmazellen werden durch Fusion mit Myelomzellen immortalisiert, um Hybridomzellen herzustellen. Der Kulturüberstand aus einzelnen Hybridomen wird unter Verwendung von Standardtechniken gescreent, um die zu identifizieren, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität erzeugen. Geeignete Tiere zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern für das menschliche Protein umfassen Maus, Ratte, Hamster usw. Um die Antikörper gegen das Mausprotein zu züchten, wird das Tier im allgemeinen ein Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen usw. sein. Der Antikörper kann aus den Hybridomzellüberständen oder Aszitesflüssigkeit durch konventionelle Techniken gereinigt werden, z. B. Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein, das an einen unlöslichen Träger gebunden ist, Protein-A-Sepharose usw.
Der Antikörper kann als eine Einzelkette anstelle der normalen Mehrfachstruktur hergestellt werden. Einzelkettenantikörper sind in Jost et al. (1994) J. B. C. 269: 26267-73 und anderen beschrieben. DNA-Sequenzen, die die variable Region der schweren Kette und die variable Region der leichten Kette kodieren, werden mit einem Spacer ligiert, der mindestens etwa 4 Aminosäuren von kleinen neutralen Aminosäuren, einschließlich Glycin und/oder Serin, kodiert. Das Protein, das durch diese Fusion kodiert wird, ermöglicht die Vereinigung einer funktionellen variablen Region, die die Spezifität und Affinität des ursprünglichen Antikörpers behält.
In bestimmten Ausführungsformen sind humanisierte Antikörper ebenso von Interesse. Verfahren zum Humanisieren von Antikörpern sind in der Technik bekannt. Der humanisierte Antikörper kann das Produkt eines nicht-menschlichen Lebewesens mit Genen einer transgenen, menschlichen, Immunglobulin-konstanten Region sein (siehe beispielsweise internationale Patentanmeldungen WO 90/10077 und WO 90/04036 ). Alternativ kann der Antikörper von Interesse durch DNA-Rekombinationstechniken entwickelt werden, um die CH1-, CH2-, CH3-, hinge-Domänen und/oder die Rahmendomäne mit der entsprechenden menschlichen Sequenz zu substituieren (siehe WO 92/02190 ).
Die Verwendung von Ig-cDNA zur Konstruktion von chimären Immunoglobulingenen ist in der Literatur bekannt (Liu et al. (1987) P. N. A. S. 84: 3439 und (1987) J. Immunol. 139: 3521). mRNA wird aus einem Hybridom oder einer anderen Zelle isoliert, die den Antikörper erzeugt und verwendet wird, um DNA zu erzeugen. Die cDNA von Interesse kann durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von spezifischen Primern amplifiziert werden ( US-Patent Nr. 4,683,195 und 4,683,202 ). Alternativ wird eine Bibliothek hergestellt und gescreent, um die Sequenz von Interesse zu isolieren. Die DNA-Sequenz, die die variable Region des Antikörpers kodiert, wird dann mit menschlichen Sequenzen konstanter Region fusioniert. Die Sequenzen von menschlichen Genen konstanter Region können in Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. Veröffentlichung Nr. 91-3242 gefunden werden. Menschliche Gene der C-Region sind ohne weiteres aus bekannten Klonen erhältlich. Die Wahl des Isotyps wird durch die gewünschten Effektorfunktionen, wie Komplementfixation oder Aktivität bei Antikörper-abhängiger zellulärer Zytotoxizität, gelenkt. Bevorzugte Isotypen sind IgG1, IgG3 und IgG4. Jede der menschlichen konstanten Regionen mit leichter Kette, kappa oder lambda, kann verwendet werden. Der chimäre, humanisierte Antikörper wird dann durch konventionelle Verfahren exprimiert.
Antikörperfragmente, wie Fv, F(ab')₂ und Fab, können durch Spaltung des intakten Proteins, z. B. durch Protease oder chemische Spaltung, hergestellt werden. Alternativ wird ein verkürztes Gen konstruiert. Beispielsweise würde ein chimäres Gen, das einen Teil des F(ab')₂-Fragmentes kodiert, DNA-Sequenzen umfassen, die die CH1-Domäne und hinge-Region der H-Kette kodieren, gefolgt von einem Translationsstopcodon, um das verkürzte Molekül zu erhalten.
Consensus-Sequenzen von H- und L-J-Regionen können verwendet werden, um Oligonukleotide zur Verwendung als Primer zu konstruieren, um nützliche Restriktionsstellen in die J-Region zur anschließenden Verknüpfung der V-Regionsegmente mit menschlichen C-Regionsegmenten einzuführen. C-Region-cDNA kann durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert werden, um eine Restriktionsstelle an der analogen Position in der menschlichen Sequenz zu plazieren.
Expressionsvektoren umfassen Plasmide, Retroviren, YACs, EBV-abgeleitete Episome und dergleichen. Ein günstiger Vektor ist einer, der eine funktionell vollständige menschliche CH- oder CL-Immunoglobulinsequenz kodiert, mit entsprechenden Restriktionsstellen, die so konstruiert sind, daß jede VH- oder VL-Sequenz leicht insertiert und exprimiert werden kann. Bei solchen Vektoren tritt das Splicing normalerweise zwischen der Spleißdonatorstelle in der insertierten J-Region und der Spleißakzeptorstelle, die der menschlichen C-Region vorausgeht, auf, und ebenso an den Spleißregionen, die innerhalb der menschlichen CH-Exons auftreten. Die Polyadenylierungs- und Transkriptionstermination treten an nativen Chromosomenorten stromabwärts der kodierenden Regionen auf. Der resultierende chimäre Antikörper kann mit jedem starken Promotor verbunden sein, einschließlich Retrovirus LTRs, z. B. SV-40 früher Promotor, (Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Bio. 3: 280), Rous-Sarkom-Virus LTR (Gorman et al. (1982) P. N. A. S. 79: 6777), und Moloney-Mausleukämie-Virus LTR (Grosschedl et al. (1985) Cell 41: 885); native Ig-Promotoren usw.
TRANSGENE VERBINDUNGEN
Die gegenständlichen Nukleinsäuren können verwendet werden, um transgene, nicht-menschliche Pflanzen oder Tiere oder ortsspezifische Genmodifikationen in Zellinien zu erzeugen. Transgene Zellen der vorliegenden Erfindung umfassen eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung, die als ein Transgen vorliegen, wobei innerhalb dieser Definition die Stammzellen eingeschlossen sind, die transformiert werden, damit sie das Transgen und die Nachkommenschaft davon einschließen. In einigen Ausführungsformen sind die transgenen Zellen Zellen, die normalerweise keine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen oder enthalten. In diesen Ausführungsformen, wo die transgenen Zellen natürlicherweise die gegenständlichen Nukleinsäuren enthalten, wird die Nukleinsäure in der Zelle in einer anderen Position als ihrer natürlichen Stelle vorliegen, d. h. integriert in das genomische Material der Zelle an einer nicht-natürlichen Stelle. Transgene nicht-mensch liche Lebewesen können durch homologe Rekombination hergestellt werden, wobei der endogene Ort verändert wird. Alternativ wird ein Nukleinsäurekonstrukt zufällig in das Genom integriert. Vektoren für die stabile Integration umfassen Plasmide, Retroviren und andere Tierviren, YACs und dergleichen.
Transgene nicht-menschliche Organismen der vorliegenden Erfindung umfassen Zellen und multizelluläre Organismen, z. B. Pflanzen und nicht-menschliche Lebewesen, die endogene Knockouts sind, bei denen die Expression des endogenen Gens zumindest verringert wird, wenn nicht beseitigt. Transgene nicht-menschliche Organismen von Interesse umfassen ebenso Zellen und multizelluläre Organismen, z. B. Pflanzen und nicht-menschliche Lebewesen, bei denen das Protein oder Varianten davon in Zellen oder Geweben exprimiert werden, wo es normalerweise nicht und/oder bei Niveaus, die normalerweise nicht in solchen Zellen oder Geweben vorliegen, exprimiert wird.
DNA-Konstrukte für die homologe Rekombination werden mindestens einen Teil des Gens der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei das Gen die gewünschten genetischen Modifikationen) aufweist, und Regionen mit Homologie für den Zielort umfaßt. DNA-Konstrukte für die zufällige Integration müssen keine Regionen mit Homologie umfassen, um die Rekombination zu vermitteln. Günstigerweise sind Marker für positive und negative Selektion einbezogen. Verfahren zum Erzeugen von Zellen mit gezielten Genmodifikationen durch homologe Rekombination sind in der Technik bekannt. Für verschiedene Techniken zum Transfektieren von Säugerzellen siehe Keown et al. (1990), Meth. Enzymol 185: 527-537.
Für nicht-menschliche embryonale Stammzellen (ES-Zellen) kann eine ES-Zellinie eingesetzt werden, oder Embryonalzellen können frisch aus einem nicht-menschlichen Wirt erhalten werden, z. B. Maus, Ratte, Meerschweinchen usw. Diese Zellen wuchsen auf einer entsprechenden Fibroblast-Feeder-Schicht oder wuchsen in Gegenwart von Leukämie inhibierendem Faktor (LIF). Wenn nicht-menschliche ES- oder nicht-menschliche Embryonalzellen transformiert wurden, können sie verwendet werden, um transgene nicht-menschliche Lebewesen erzeugen. Nach der Transformation wurden die Zellen auf einer Feeder-Schicht in einem entsprechenden Medium plattiert. Die Zellen, die das Konstrukt enthalten, können unter Einsatz eines selektiven Mediums detektiert werden. Nach ausreichender Wachstumszeit für die Kolonien werden sie ausgewählt und hinsichtlich des Auftretens von homologer Rekombination oder Integration des Konstrukts analysiert. Die Kolonien, die positiv sind, können dann für die nicht-menschliche Embryomanipulation und Blastozysteninjektion verwendet werden. Blastozysten werden aus 4 bis 6 Wochen alten superovulierten Weibchen erhalten. Die nicht-menschlichen ES-Zellen werden trypsiniert, und die modifizierten Zellen werden in das Blastozöl der Blastozyste injiziert. Nach der Injektion werden die Blastozysten in jedes Gebärmutterhorn von scheinschwangeren nicht-menschlichen Weibchen rückgeführt. Die Weibchen konnten dann austragen, und die resultierende Nachkommenschaft wurde hinsichtlich des Konstrukts gescreent. Zur Bereitstellung eines anderen Phänotyps der Blastozyste und der genetisch modifizierten Zellen kann die chimäre Nachkommenschaft ohne weiteres detektiert werden.
Die chimären nicht-menschlichen Lebewesen werden hinsichtlich der Gegenwart des modifizierten Gens gescreent, und Männchen und Weibchen mit der Modifikation werden gepaart, um homozygote Nachkommenschaft zu erzeugen. Wenn die Genveränderungen Letalität an einem Entwicklungspunkt hervorruft, können Gewebe oder Organe als allogenetische oder kongene verpflanzte Gewebe oder Transplantate oder in In-vitro-Kultur gehalten werden. Die transgenen nicht-menschlichen Lebewesen können jeder nicht-menschliche Säuger sein, wie Labortiere, Haustiere usw. Die transgenen nicht-menschlichen Lebewesen können in funktionellen Studien, Arzneimittelscreening usw. verwendet werden. Repräsentative Beispiele der Verwendung von transgenen nicht-menschlichen Lebewesen umfassen die unten beschriebenen.
Transgene Pflanzen können in einer ähnlichen Weise hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen sind in US-Pat. Nr. 5,767,367 ; 5,750,870 ; 5,739,409 ; 5,689,049 ; 5,689,045 ; 5,674,731 ; 5,656,466 ; 5,633,155 ; 5,629,470 ; 5,595,896 ; 5,576,198 ; 5,538,879 ; 5,484,956 beschrieben; wobei deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen wird. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen werden ebenso in Plant Biochemistry and Molecular Biology (Hrsg. Lea & Leegood, John Wiley & Sons) (1993) S. 275-295 besprochen. Kurz, eine geeignete Pflanzenzelle oder -gewebe wird in Abhängigkeit der Natur der Pflanzenspezies geerntet. An sich werden in bestimmten Fällen Protoplasten isoliert, wobei diese Protoplasten aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Pflanzengeweben, z. B. Blatt, Hypokotyl, Wurzel usw., isoliert werden können. Für die Protoplastisolation werden die geernteten Zellen in Gegenwart von Zellulasen inkubiert, um die Zellwand zu entfer nen, wobei die exakten Inkubationsbedingungen in Abhängigkeit des Typs der Pflanze und/oder des Gewebes, aus dem die Zelle stammt, variieren. Die resultierenden Protoplasten werden dann aus den resultierenden Zellbruchstücken durch Sieben und Zentrifugation getrennt. Anstelle der Verwendung von Protoplasten können embryogene Explantate, die Somazellen umfassen, zur Herstellung des transgenen Wirts verwendet werden. Nach der Zell- oder Gewebeernten wird die exogene DNA von Interesse in die Pflanzenzellen eingeführt, wobei eine Vielzahl von unterschiedlichen Techniken für diese Einführung verfügbar ist. Mit isolierten Protoplasten besteht die Möglichkeit zur Einführung via DNA-vermittelter Gentransferprotokolle, einschließlich: Inkubation der Protoplasten mit nackter DNA, z. B. Plasmide, umfassend die exogene kodierende Sequenz von Interesse in Gegenwart von mehrwertigen Kationen, z. B. PEG oder PLO; und Elektroporation der Protoplasten in Gegenwart von nackter DNA, umfassend die exogene Sequenz von Interesse. Protoplasten, die die exogene DNA erfolgreich aufgenommen haben, werden dann selektiert, wuchsen zu einem Kallus und schließlich zu einer transgenen Pflanze durch den Kontakt mit den entsprechenden Mengen und Verhältnissen von stimulierenden Faktoren heran, z. B. Auxine und Zytokinine. Mit embryogenen Explantaten erfolgt ein günstiges Verfahren zum Einführen der exogenen DNA in die Zielsomazellen durch die Verwendung von Teilchenbeschleunigung oder „Genkanonen"-Protokollen. Die resultierenden Explantate konnten dann zu chimären Pflanzen heranwachsen, gekreuzte und transgene Nachkommenschaft wird erhalten. Anstelle der oben beschriebenen nackten DNA-Ansätze ist ein anderes günstiges Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen Agrobacterium-vermittelte Transformation. Mit der Agrobacterium-vermittelten Transformation werden co-integrative oder binäre Vektoren, umfassend die exogene DNA, hergestellt und dann in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z. B. A. tumefaciens, eingeführt. Die resultierenden Bakterien werden dann mit hergestellten Protoplasten oder Gewebeexplantaten, z. B. Blattscheiben, inkubiert und ein Kallus wird erzeugt. Der Kallus wuchs dann unter selektiven Bedingungen, wurde selektiert und Wachstumsmedien unterzogen, um das Wurzel- und Triebwachstum zu induzieren, um schließlich eine transgene Pflanze herzustellen.
NUTZEN
Die gegenständlichen Polypeptide finden in einer Vielzahl von verschiedenen Anwendungen Verwendung, wobei sich die Anwendungen notwendigerweise in Abhängigkeit dessen unterscheiden, ob die Chromo/Fluoreszenz-Domänen Chromoproteine oder Fluoreszenzproteine sind. Repräsentative Verwendungen für jeden dieser Typen von Proteinen werden nachstehend beschrieben, wobei die folgenden beschriebenen Verwendungen nur repräsentativ sind und keineswegs die Verwendung der gegenständlichen Proteine auf die nachstehend beschriebenen einschränken.
Chromoproteine
Die gegenständlichen Chromoprotein-enthaltenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung finden in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen Verwendung. Eine Anwendung von Interesse ist die Verwendung der gegenständlichen Proteine als Färbemittel, die einer speziellen Stoffzusammensetzung Farbe oder Pigment verleihen können. Von besonderem Interesse in bestimmten Ausführungsformen sind nicht-toxische Chromoproteine. Die gegenständlichen Chromoproteine können in eine Vielzahl von unterschiedlichen Stoffzusammensetzungen eingeführt werden, wobei repräsentative Stoffzusammensetzungen umfassen: Lebensmittelzusammensetzungen, Pharmazeutika, Kosmetika, lebende Organismen, z. B. Tiere und Pflanzen, und dergleichen. Wo es als ein Färbemittel oder Pigment verwendet wird, wird eine ausreichende Menge des Chromoproteins in die Stoffzusammensetzung eingeführt, um die gewünschte Farbe oder das Pigment zu verleihen. Das Chromoprotein kann in die Stoffzusammensetzung unter Verwendung irgendeines günstigen Protokolls eingeführt werden, wobei das speziell eingesetzte Protokoll notwendigerweise zumindest teilweise von der Beschaffenheit der zu färbenden Stoffzusammensetzung abhängen wird. Protokolle, die eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Mischen, Diffusion, Reibung, Sprühen, Injektion, Tätowieren und dergleichen.
Die Chromoproteine können ebenso als Markierungen in Analytdetektionsassays, z. B. Assays für biologische Analyten von Interesse Verwendung finden. Beispielsweise können die Chromoproteine in Addukte mit Analyt-spezifischen Antikörpern oder Bindungsfragmente davon eingeführt und anschließend in Immunoassays für Analyten von Interesse in einer Komplexprobe eingesetzt werden, wie in US-Patent Nr. 4,302,536 beschrieben; wobei deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen wird. Anstelle von Antikörpern oder Bindungsfragmenten davon können die entsprechenden Chromoproteine oder chromogenen Fragmente davon mit Liganden, die spezifisch an einen Analyten von Interesse binden, oder andere Komponenten, Wachstumsfaktoren, Hormone und dergleichen konjugiert werden; wie dem Fachmann bereits offensichtlich sein wird.
In noch anderen Ausführungsformen können die gegenständlichen Chromoproteine als selektierbare Marker in DNA-Rekombinationsanwendungen verwendet werden, z. B. der Produktion von transgenen Zellen und nicht-menschlichen Organismen, wie oben beschrieben. An sich kann man ein spezielles transgenes Produktionsprotokoll konstruieren, um die Expression der gegenständlichen Chromoproteine als einen selektierbaren Marker entweder für ein erfolgreiches oder nicht erfolgreiches Protokoll einzusetzen. Daher kann das Auftreten der Farbe des gegenständlichen Chromoproteins in dem Phänotyp des transgenen nicht-menschlichen Organismus, der durch ein spezielles Verfahren erzeugt wurde, dahingehend verwendet werden, um anzugeben, daß der spezielle nicht-menschliche Organismus erfolgreich das Transgen von Interesse enthält, oftmals integriert in einer Weise, die die Expression des Transgens in dem Organismus bereitstellt. Wenn als selektierbarer Marker verwendet, kann eine Nukleinsäure, die für das gegenständliche Chromoprotein kodiert, in dem transgenen Generationsprozeß eingesetzt werden, wobei dieses Verfahren oben ausführlicher beschrieben ist. Spezielle transgene nicht-menschliche Organismen von Interesse, wo die gegenständlichen Proteine als selektierbare Marker eingesetzt werden können, umfassen transgene Pflanzen, nicht-menschliche Lebewesen, Bakterien, Pilze und dergleichen.
In noch anderen Ausführungsformen finden die Chromoproteine (und Fluoreszenzproteine) der vorliegenden Erfindung in Sonnenschutzmitteln als selektive Filter usw. in einer Weise Verwendung, die den Verwendungen der Proteine, die in WO 00/46233 beschrieben sind, ähnlich ist.
Fluoreszenzproteine
Die gegenständlichen Fluoreszenzprotein-enthaltenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung (sowie andere Komponenten der vorliegenden oben beschriebenen Erfindung) finden Verwendung in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen, wobei diese Anwendungen folgendes umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die erste Anwendung von Interesse ist die Verwendung der gegenständlichen Proteine in Fluoreszenzresonanzenergieübertragungsanwendungen (FRET-Anwendungen). Bei diesen Anwendungen dienen die gegenständlichen Proteine als Donator und/oder Akzeptoren in Kombination mit einem zweiten Fluoreszenzprotein oder Farbstoff, z. B. ein Fluoreszenzprotein, wie in Matz et al., Nature Biotechnology (Oktober 1999) 17: 969-973 beschrieben, ein grün fluoreszierendes Protein aus Aequoria victoria oder eine fluoreszierende Mutante davon, z. B. wie in US-Patent Nr. 6,066,476 ; 6,020,192 ; 5,985,577 ; 5,976,796 ; 5,968,750 ; 5,968,738 ; 5,958,713 ; 5,919,445 ; 5,874,304 beschrieben, andere Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. Coumarin und seine Derivate, z. B. 7-Amino-4-methylcoumarin, Aminocoumarin, Bodipy-Farbstoffe, wie Bodipy FL, Kaskadenblau, Fluorescein und seine Derivate, z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Oregon-Grün, Rhodaminfarbstoffe, z. B. Texas-Rot, Tetramethylrhodamin, Eosine und Erythrosine, Cyaninfarbstoffe, z. B. Cy3 und Cy5, makrocyclische Chelate von Lanthanidionen, z. B. Quantumfarbstoff usw., chemilumineszierende Farbstoffe, z. B. Luciferasen, einschließlich denen, die in US-Patenten Nr. 5,843,746 ; 5,700,673 ; 5,674,713 ; 5,618,722 ; 5,418,155 ; 5,330,906 ; 5,229,285 ; 5,221,623 ; 5,182,202 beschrieben sind. Spezielle Beispiele, wo FRET-Assays, die die gegenständlichen Fluoreszenzproteine einsetzen, verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: die Detektion von Protein-Protein-Interaktionen, z. B. Säuger-Zwei-Hybrid-System, Transkriptionsfaktordimerisierung, Membranproteinmultimerisierung, Multiproteinkomplexbildung usw., als ein Biosensor für eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorgängen, wo ein Peptid oder Protein kovalent eine FRET-Fluoreszenzkombination verknüpft, einschließlich die gegenständlichen Fluoreszenzproteine, und das verknüpfende Peptid oder Protein ist z. B. ein Protease-spezifisches Substrat, z. B. für die Caspase-vermittelte Spaltung, ein Linker, der der Konformationsänderung beim Empfangen eines Signals unterliegt, das FRET erhöht oder verringert, z. B. PKA-Regulationsdomäne (cAMP-Sensor), Phosphorylierung, z. B. wo es eine Phosphorylierungsstelle in dem Linker gibt oder der Linker eine Bindungsspezifität an eine phosphorylierte/dephosphorylierte Domäne eines anderen Proteins aufweist oder der Linker eine Ca²⁺-Bindungsdomäne aufweist. Repräsentative Fluoreszenzresonanzenergieübertragungs- oder FRET-Anwendungen, bei denen die gegenständlichen Proteine Verwendung finden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die, die in den US-Patenten Nr. 6,008,373 ; 5,998,146 ; 5,981,200 ; 5,945,526 ; 5,945,283 ; 5,911,952 ; 5,869,255 ; 5,866,336 ; 5,863,727 ; 5,728,528 ; 5,707,804 ; 5,688,648 : 5,439,797 beschrieben sind.
Eine andere Anwendung, bei der die gegenständlichen Fluoreszenzproteine Verwendung finden, ist BREI (Biolumineszenzresonanzenergieübertragung). BREI ist ein Protein-Protein-Interaktionsassay, basierend auf der Energieübertragung von einem biolumineszierenden Donator zu einem fluoreszierenden Akzeptorprotein. Das BRET-Signal wird durch die Menge an Licht, das von dem Akzeptor emittiert wird, zu der Menge an Licht, das von dem Donator emittiert wird, gemessen. Das Verhältnis dieser zwei Werte erhöht sich, wenn die zwei Proteine näher zueinander gebracht werden. Der BRET-Assay wurde reichlich in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. US-Patente Nr. 6,020,192 ; 5,968,750 und 5,874,304 ; und Xu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 151-156. BRET-Assays können durch genetische Fusionierung eines Biolumineszenz-Donatorproteins und eines Fluoreszenz-Akzeptorproteins unabhängig mit zwei unterschiedlichen biologischen Partnern durchgeführt werden, um Partner-A-Biolumineszenz-Donator- und Partner-B-Fluoreszenz-Akzeptorfusionen zu erzeugen. Veränderungen in der Interaktion zwischen den Partnerteilen der Fusionsproteine, die z. B. durch Liganden oder Testverbindungen moduliert werden, können durch eine Veränderung im Verhältnis von Licht, das von biolumineszierenden und fluoreszierenden Teilen der Fusionsproteine emittiert wird, überwacht werden. BRET-Assays können in vielen der Assays, wie FRET, verwendet werden, wobei Assays oben angegeben sind.
Die gegenständlichen Fluoreszenzproteine finden ebenso Verwendung als Biosensoren in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, z. B. als Ca²⁺-Innenindikator; als pH-Indikator, als Phosphorylierungsindikator, als ein Indikator von anderen Ionen, z. B. Magnesium, Natrium, Kalium, Chlorid und Halogeniden. Beispielsweise translozieren für die Detektion von Ca-Ionen Proteine, die ein EF-Hand-Motiv enthalten, bekanntermaßen aus dem Zytosol zu Membranen bei der Ca²⁺-Bindung. Diese Proteine enthalten eine Myristoylgruppe, die in dem Molekül durch hydrophobe Wechselwirkungen mit anderen Regionen des Proteins versteckt ist. Die Bindung von Ca²⁺ induziert eine Konformationsänderung, die die Myristoylgruppe exponiert, die dann für die Einfügung in die Lipiddoppelschicht verfügbar ist (genannt „Ca²⁺-Myristoyl-Umschalter"). Die Fusion eines solchen EF-Hand-enthaltenden Proteins mit Fluoreszenzproteinen (FP) macht es zu einem Indikator von intrazellulärem Ca²⁺ durch Überwachen der Translokation aus dem Zytosol zu der Plasmamembran durch konfokale Mikroskopie. EF-Hand-Proteine, die zur Verwendung in diesem System geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Recoverin (1-3), Calcineurin B, Troponin C, Visinin, Neurocalcin, Calmodulin, Parvalbumin und dergleichen. Für den pH kann ein System, basierend auf Hisactophilinen, eingesetzt werden. Hisactophiline sind myristoylierte Histidin-reiche Proteine, die bekanntermaßen im Dictyostelium existieren. Ihre Bindung an Actin und saure Lipide ist stark pH-abhängig innerhalb des Bereiches von zytoplasmatischen pH-Schwankungen. Bei lebenden Zellen scheint die Membranbindung die Interaktion von Hisactophilinen mit Actinfilamenten aufzuheben. Bei pH ≤ 6,5 ordnen sie sich an der Plasmamembran und dem Kern an. Im Gegensatz dazu verteilen sie sich bei pH 7,5 gleichmäßig durch den zytoplasmatischen Raum. Diese Veränderung der Verteilung ist umkehrbar und wird Histidin-Clustern zugeschrieben, die in Schleifen auf der Oberfläche des Moleküls exponiert werden. Die Umkehr der intrazellulären Verteilung in dem Bereich der zytoplasmatischen pH-Schwankungen stimmt mit einem pK von 6,5 der Histidinreste überein. Die zelluläre Verteilung ist von der Myristoylierung des Proteins abhängig. Durch Fusionieren von FPs (Fluoreszenzproteinen) mit Hisactophilin kann die intrazelluläre Verteilung des Fusionsproteins durch Laserscanning, konfokale Mikroskopie oder Standardfluoreszenzmikroskopie verfolgt werden. Quantitative Fluoreszenzanalyse kann mittels Durchführen von Zeilenscans durch Zellen (konfokale Laserscanningmikroskopie) oder andere elektronische Datenanalyse (z. B. unter Verwendung von Metamorph-Software (Universal Imaging Corp.)) und Mittelwertbildung der Daten, die in einer Population von Zellen gesammelt wurden, durchgeführt werden. Der im wesentlichen pH-abhängige Rücktransport von Hisactophilin-FP aus dem Zytosol zu der Plasmamembran tritt innerhalb von 1 bis 2 min auf und erreicht ein stationäres Niveau nach 5 bis 10 min. Die Umkehrreaktion findet in einem ähnlichen Zeitmaßstab statt. An sich kann Hisactophilin-Fluoreszenzprotein-Fusionsprotein, das in einer analogen Weise fungiert, verwendet werden, um die zytosolischen pH-Veränderungen in Echtzeit in lebenden Säugerzellen zu überwachen. Diese Verfahren finden Verwendung in Hochdurchsatzanwendungen, z. B. bei der Messung von pH-Veränderungen als Folge der Wachstumsfaktorrezeptoraktivierung (z. B. epithelialer oder aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor), chemotaktischen Stimulation/Zellbewegung, bei der Detektion von intrazellulären pH-Veränderungen als zweiter Messenger, bei der Überwachung von intrazellulärem pH bei pH-Manipulationsexperimenten und dergleichen. Zur Detektion der PKC-Aktivität nutzt das Reportersystem die Tatsache, daß ein Molekül, genannt MARCKS (myristoyliertes Alanin-reiches C-Kinase-Substrat), ein PKC-Substrat ist. Es ist in der Plasmamembran über Myristoylierung und eine Streckung von positiv geladenen Aminosäuren (ED-Domäne), die an die negativ geladene Plasmamembran über elektrostatische Wechselwirkungen binden, verankert. Bei der PKC-Aktivierung wird die ED-Domäne durch PKC phosphoryliert, wodurch sie negativ geladen wird, und als Folge der elektrostatischen Abstoßung transloziert MARCKS von der Plasmamembran zu dem Zytoplasma (genannt der „Myristoyl-elektrostatische Umschalter"). Die Fusion des N-Terminus von MARCKS im Bereich des Myristoylierungsmotivs bis zur ED-Domäne von MARCKS mit Fluoreszenzproteinen der vorliegenden Erfindung macht obiges zu einem Detektorsystem für die PKC-Aktivität. Wenn durch PKC phosphoryliert, transloziert das Fusionsprotein von der Plasmamembran zu dem Zytosol. Diese Translokation wird durch Standardfluoreszenzmikroskopie oder konfokale Mikroskopie, z. B. unter Verwendung der Cellomics-Technologie oder anderen High Content Screening Systemen (z. B. Universal Imaging Corp./Becton Dickinson), verfolgt. Das obige Reportersystem findet Anwendung in High Content Screening, z. B. Screening für PKC-Inhibitoren, und als ein Indikator für die PKC-Aktivität bei vielen Screening-Vorgängen für mögliche Reagenzien, die mit diesem Signaltransduktionsweg interferieren. Verfahren zur Verwendung von Fluoreszenzproteinen als Biosensoren umfassen ebenso die, die in US-Patenten Nr. 972,638 ; 5,824,485 und 5,650,135 (sowie den darin zitierten Referenzen) beschrieben sind, wobei deren Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Die gegenständlichen Fluoreszenzproteine finden ebenso in Anwendungen, einschließlich dem automatisierten Screening von Anordnungen von Zellen, die Fluoreszenzreportergruppen exprimieren, unter Verwendung von mikroskopischer Bild- und elektronischer Analyse Verwendung. Das Screening kann für die Entwicklung neuer Pharmazeutika und in dem Gebiet der funktionellen molekularen Genforschung verwendet werden: z. B. wo die gegenständlichen Proteine als Marker von intakten Zellen verwendet werden, um Veränderungen bei der multizellulären Reorganisation und Migration zu detektieren, z. B. Bildung von multizellulären Tubuli (Blutgefäßbildung) durch Endothelzellen, Migration von Zellen durch Fluoroblok Insert Sytem (Becton Dickinson Co.), Wundheilung, Neuritauswuchs usw.; wobei die Proteine als Marker verwendet werden, die mit Peptiden fusioniert sind (z. B. Zielsequenzen), und Proteine, die die Detektion der Veränderung der intrazellulären Lokation als Indikator für die zelluläre Aktivität ermöglichen, beispielsweise: Signaltransduktion, wie Kinase und Transkriptionsfaktortranlokation bei Reizen, wie Proteinkinase C, Proteinkinase A, Transkriptionsfaktor NFkB und NFAT; Zellzyklusproteine, wie Cyclin A, Cyclin B1 und Cyclin E; Proteasespaltung mit anschließender Bewegung des gespaltenen Substrats, Phospholipide, mit Markern für intrazelluläre Strukturen, wie endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat, Mitochondrien, Peroxisomen, Nukleus, Nucleoli, Plasmamembran, Histone, Endosome, Lysosome, Mikrotubuli, Actin als Tools für High Content Screening: Co-Lokalisation von anderen Fluoreszenzfusionsproteinen mit diesen Lokalisationsmarkern als Indikatoren der Bewegungen von intrazellulären Fluoreszenzfusionsproteinen/peptiden oder als Marker allein; und dergleichen. Beispiele von Anwendungen, einschließlich dem automatisierten Screening von Anordnungen von Zellen, bei denen die gegenständlichen Fluoreszenzproteine Verwendung finden, umfassen: US-Patent Nr. 5,989,835 sowie WO 00/17624 ; WO 00/26408 ; WO 00/17643 und WO 00/03246 , wobei deren Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen werden.
Die gegenständlichen Fluoreszenzproteine finden ebenso Verwendung in Hochdurchsatz-Screeningassays. Die gegenständlichen Fluoreszenzproteine sind stabile Proteine mit Halbwertszeiten von mehr als 24 h. Es werden ebenso destabilisierte Versionen der gegenständlichen Fluoreszenzproteine mit kürzeren Halbwertszeiten, die als Transkriptionsreporter für die Entwicklung neuer Pharmazeutika verwendet werden können, bereitgestellt. Beispielsweise kann ein Protein gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer mutmaßlichen proteolytischen Signalsequenz, abgeleitet von einem Protein mit kürzerer Halbwertszeit, z. B. PEST-Sequenz aus dem Maus-Omithin-Decarboxylasegen, Maus-Cyclin B1 Destruktionsbox und Ubiquitin, usw. fusioniert werden. Für eine Beschreibung der destabilisierten Proteine und Vektoren, die eingesetzt werden können, um selbiges herzustellen, siehe z. B. US-Patent Nr. 6,130,313 ; dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen wird. Promotoren in Signaltransduktionswegen können detektiert werden unter Verwendung von destabilisierten Versionen der gegenständlichen Fluoreszenzproteine für Arzneimittel-Screening, z. B. AP1, NFAT, NFkB, Smad, STAT, p53, E2F, Rb, myc, CRE, ER, GR und TRE, und dergleichen.
Die gegenständlichen Proteine können als Detektoren des zweiten Messengers verwendet werden, z. B. durch Fusionieren der gegenständlichen Proteine mit spezifischen Domänen: z. B. PKCgamma-Ca-Bindungsdomäne, PKCgamma-DAG-Bindungsdomäne, SH2-Domäne und SH3-Domäne usw.
Sekretierte Formen der gegenständlichen Proteine können hergestellt werden, z. B. durch Fusionieren sekretierter Führungssequenzen mit den gegenständlichen Proteinen zur Konstruktion sekretierter Formen der gegenständlichen Proteine, die wiederum in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen verwendet werden können.
Die gegenständlichen Proteine finden ebenso Verwendung in fluoreszenzaktivierten Zellsortierungsanwendungen. Bei diesen Anwendungen wird das gegenständliche Protein als eine Markierung verwendet, um eine Population von Zellen zu markieren, und die resultierende markierte Population von Zellen wird dann mit einer fluoreszenzaktivierten Zellsortiervor richtung sortiert, wie in der Technik bekannt. FACS-Verfahren sind in US-Patenten Nr. 5,968,738 und 5,804,387 beschrieben; wobei deren Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen werden.
Die gegenständlichen Proteine finden ebenso Verwendung als In-vivo-Marker bei nicht-menschlichen Lebewesen (z. B. transgenen nicht-menschlichen Lebewesen). Beispielsweise kann die Expression des gegenständlichen Proteins durch gewebespezifische Promotoren angetrieben werden, wobei diese Verfahren Verwendung bei der Forschung für die Gentherapie, z. B. Testeffizienz der transgenen Expression, neben anderen Anwendungen finden. Eine repräsentative Anwendung von Fluoreszenzproteinen bei transgenen nicht-menschlichen Lebewesen, die diese Klasse von Anwendungen der gegenständlichen Proteine darstellt, wird in WO 00/02997 gefunden, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen wird.
Weitere Anwendungen der gegenständlichen Proteine umfassen: als Marker nach der Injektion in Zellen oder Tiere und bei der Kalibrierung für quantitative Messungen (Fluoreszenz und Protein); als Marker oder Reporter in Sauerstoffbiosensorvorrichtungen zum Überwachen der Lebensfähigkeit der Zelle; als Marker oder Markierungen für Tiere, Haustiere, Spielzeug, Lebensmittel usw.; und dergleichen.
Die gegenständlichen Fluoreszenzproteine finden ebenso Verwendung in Proteasespaltungsassays. Beispielsweise können spaltungsinaktivierte Fluoreszenzassays unter Verwendung der gegenständlichen Proteine entwickelt werden, wobei die gegenständlichen Proteine so konstruiert sind, daß sie eine Protease-spezifische Spaltungssequenz ohne Zerstörung des Fluoreszenzcharakters des Proteins umfassen. Bei der Spaltung des Fluoreszenzproteins durch eine aktivierte Protease würde sich die Fluoreszenz aufgrund der Zerstörung eines funktionellen Chromophors stark verringern. Alternativ kann die spaltungsaktivierte Fluoreszenz unter Verwendung der gegenständlichen Proteine entwickelt werden, wobei die gegenständlichen Proteine so konstruiert sind, daß sie eine zusätzliche Spacer-Sequenz nahe/oder im Inneren des Chromophors enthalten. Diese Variante würde in ihrer Fluoreszenzaktivität signifikant verringert, da Teile des funktionellen Chromophors durch den Spacer geteilt werden würden. Der Spacer würde durch zwei identische Protease-spezifische Spaltungsstellen gerahmt. Bei der Spaltung über die aktivierte Protease würde der Spacer herausgeschnitten, und die zwei restlichen „Untereinheiten" des Fluoreszenzproteins könnten sich wieder vereinigen, um ein funktionelles Fluoreszenzprotein zu erzeugen. Beide der obigen Anwendungstypen konnten in Assays für eine Vielzahl von unterschiedlichen Proteasentypen, z. B. Caspasen, usw. entwickelt werden.
Die gegenständlichen Proteine können ebenso in Assays verwendet werden, um die Phospholipidzusammensetzung in biologischen Membranen zu bestimmen. Beispielsweise können Fusionsproteine der gegenständlichen Proteine (oder jede andere Art von kovalenter oder nicht-kovalenter Modifikation der gegenständlichen Proteine), die die Bindung an spezifische Phospholipide ermöglichen, um Muster der Phospholipidverteilung in biologischen Membranen zu lokalisieren/visualisieren, was ebenso die Co-Lokalisation von Membranproteinen in spezifischen Phospholipidrafts ermöglicht, mit den gegenständlichen Proteinen erreicht werden. Beispielsweise weist die PH-Domäne von GRP1 eine hohe Affinität für Phosphatidylinositol-tri-phosphat (PIP3), aber nicht für PIP2 auf. An sich kann ein Fusionsprotein zwischen der PH-Domäne von GRP1 und den gegenständlichen Proteinen konstruiert werden, um spezifisch PIP3-reiche Flächen in biologischen Membranen zu markieren.
Noch eine andere Anwendung der gegenständlichen Proteine ist als ein Fluoreszenztimer, bei dem der Umschalter einer fluoreszierenden Farbe zu einer anderen (z. B. grün zu rot) gleichzeitig mit der Alterung des Fluoreszenzproteins verwendet wird, um die Aktivierung/Deaktivierung der Genexpression, z. B. Entwicklungsgenexpression, Zellzyklus-abhängige Genexpression, Zirkadianrhythmus-spezifische Genexpression und dergleichen zu bestimmen. Die gegenständlichen Fluoreszenzproteine der vorliegenden Erfindung können ebenso bei Zellmarkierungsanwendungen verwendet werden, wie in US-Anmeldung Serien-Nr. 60/261,448 beschrieben; dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen wird.
Die Antikörper der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung finden ebenso Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Differenzierung der gegenständlichen Proteine von anderen Fluoreszenzproteinen.
KITS
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Kits zur Verwendung bei der Praktizierung von einer oder mehreren der oben beschriebenen Anwendungen bereit, wobei die gegenständlichen Kits typischerweise Elemente zum Markieren der gegenständlichen Polypeptide umfassen, z. B. ein Konstrukt, umfassend einen Vektor, der eine kodierende Region für das gegenständliche Protein umfaßt. Die gegenständlichen Kitkomponenten liegen typischerweise in einem geeigneten Speichermedium, z. B. gepufferter Lösung, typischerweise in einem geeigneten Behälter vor. Ebenso können in den gegenständlichen Kits Antikörper für das bereitgestellte Protein vorliegen. In bestimmten Ausführungsformen umfaßt das Kit eine Vielzahl von unterschiedlichen Vektoren, die jeweils die gegenständlichen Polypeptide kodieren, wobei die Vektoren für die Expression in verschiedenen Umgebungen und/oder unter unterschiedlichen Bedingungen konstruiert sind, z. B. konstitutive Expression, wo der Vektor einen starken Promotor zur Expression in Säugerzellen umfaßt, einen Promotor-freien Vektor mit einer mehrfachen Klonierungsstelle für die übliche Einführung eines Promotors und zugeschnittene Expression, usw.
Zusätzlich zu den obigen Komponenten werden die gegenständlichen Kits ferner Instruktionen für die Praktizierung der gegenständlichen Verfahren umfassen. Diese Instruktionen können in den gegenständlichen Kits in einer Vielzahl von Formen vorliegen, von denen eine oder mehrere in dem Kit vorliegen kann/können. Eine Form, in der diese Instruktionen vorliegen kann, ist eine gedruckte Information auf einem geeigneten Medium oder Substrat, z. B. ein Stück Papier oder mehrere Stücke Papier, auf die die Information gedruckt ist, in der Verpackung des Kits, in einer Packungsbeilage usw. Noch ein anderes Mittel würde ein computerlesbares Medium sein, z. B. Diskette, CD usw., auf dem die Information aufgezeichnet wurde. Noch ein anderes Mittel, das vorliegen kann, ist eine Websiteadresse, die über das Internet verwendet werden kann, um Zugang zu der Information an einem entfernten Ort zu haben. Jedes geeignete Mittel kann in den Kits vorliegen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Darstellung und nicht zur Einschränkung.
EXPERIMENTE
I. Fusionskonstrukte
Eine Cr-44-9-Tandem-(verknüpftes Dimer) und eine Cr-44-9-Tandem-Actinfusion wurden konstruiert. Die Aminosäuresequenz und kodierende Nukleotidsequenz für das Cr-44-9-Tandem-Fusionsprotein werden in 1 (SEQ ID Nr.: 1 & 2) bereitgestellt. Die Aminosäure und kodierende Nukleotidsequenz für das Cr-44-9-Tandem-Actin-Fusionsprotein werden in 2 (SEQ ID Nr.: 3 & 4) bereitgestellt. Die obigen Konstrukte wurden in Säugerzellen exprimiert, und die kodierten Fluoreszenzproteine waren detektierbar.
Die folgenden weiteren Tandemkonstrukte wurden hergestellt: HcRed-cr-1-Tandem (3; SEQ ID Nr.: 5 & 6); AsRed-35-5NA-Tandem (4; SEQ ID Nr.: 7 & 8) und AsRed-35-5D-Tandem (5; SEQ ID Nr.: 9 & 10). Wie das Cr-44-9-Tandemkonstrukt wurden gute Ergebnisse erhalten, wenn diese Tandems mit Actin fusioniert wurden – die Tandems wurden in die Actilamente eingeführt.
II. Zusätzliche Konstrukte und Charakterisierung
A. Materialien und Verfahren
1. Plasmidkonstruktion.
pEGFP-Actin (Clontech) wurde als Stammvektor für die Konstruktion von allen Fusionsplasmiden verwendet. HcRed2A, HcRed, M355NA und DsRed2 kodierende Regionen wurden in diesen Vektor zwischen AgeI- und BglII-Restriktionsstellen geklont, anstelle der EGFP-kodierenden Region. Um Tandems zu erzeugen, wurde die zweite Kopie des entsprechenden FP in diese Plasmide geklont (zwischen dem ersten FP und β-Actingenen) unter Verwendung der BglII- und EcoRV-Restriktionsstellen. Alle Plasmide enthielten den Vier-Aminosäurelinker, RTRA, zwischen FP und Actin. In dem Fall von Tandems wurden FP-Gene durch den Vier-Aminosäurelinker, RSPG, getrennt. Die Fibrillarinkodierende Region wurde mit Primern amplifiziert, 5'-GGTGCTCGAGCCATGAAGCCAGGATTCAG (SEQ ID Nr.: 11) und 5'-GGTGGGATCCTCAGTTCTTCACCTTGGGGG (SEQ ID Nr.: 12) (Restriktionsstellen sind unterstrichen) unter Verwendung von Marathon-Ready Human Liver cDNA (Clontech) als eine Matrize, und zwischen XhoI- und BamHI-Restriktionsstellen anstelle der Actinkodierenden Region geklont.
Zur prokaryotischen Expression von FP wurden Vollängen-Kodierungsregionen in den pQE30-Vektor geklont (Qiagen). Proteine, fusioniert mit einer N-terminalen 6 × His-Markierung, wurden in E. coli-XL1-Blue-Stamm exprimiert (Invitrogen) und unter Verwendung des TALON-Metall-Affinitätsharzes gereinigt (Clontech). Gelfiltrationsanalysen wurden durchgeführt, wie in Gurskaya et al., FEBS Lett. (2001) 507: 16-20 beschrieben.
2. Zellkultur.
L929- und HEK293-Zellen wurden aus ATCC erhalten und in Standard-Dulbecco's modifiziertem MEM-Medium (Invitrogen), ergänzt mit 10% FKS (Sigma), kultiviert. Zellen, die auf 50–70% Konfluenz auf 18 × 18 mm Deckgläsern in 35 mm Schalen (Falcon) wuchsen, wurden mit den obigen Plasmiden unter Verwendung von LipofectAMINE PLUS (Invitrogen) oder FuGENE 6 (Roche) Reagenzien für L929- oder HEK293-Zellen transfektiert. Nach der Transfektion (48 h) wurden die Zellen mit Dulbecco's PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min fixiert. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden die Deckgläser auf Objektträgern unter Verwendung von Vectashield-Einbettungsmittel (Vector Laboratories) befestigt.
3. Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalysen.
Bilder von fixierten Zellen wurden mit einer ORCA-ER-Digitalkamera (Hamamatsu) erfaßt, die mit einem Eclipse E800 Mikroskop (Nikon) verbunden ist, ausgestattet mit Plan Apo100x/1.40 Ölimmersionsobjektiv, unter Verwendung von Standard-GFP/FITC (Anregung, 460–505 nm; Emission, 510–560 nm), G-2A (Anregung, 510–560; Emission, LP 590 nm) und TxRed (Anregung, 540–580 nm; Emission, 600–660 nm) Filtereinheiten für EGFP, M355NA bzw. HcRed oder HcRed2A. Belichtungszeiten von 0,24 bis 4,08 s und hochauflösende 1 × 1 Binning-Modus der Kamera wurden eingesetzt. Digitalbilder wurden heruntergeladen, pseudogefärbt, in AquaCosmos-Software (Hamamatsu) einkopiert und ferner in AdobePhotoshop zusammengestellt.
4. FRET-Assay.
Ein pQE30-basierendes Plasmid, das ein Dreifachfusions-HcRed2A-HcRed2A-EYFP kodiert, wurde konstruiert. Die EYFP-kodierende Region wurde aus dem pEYFP-N1-Vektor amplifiziert (Clontech). Ein Aminosäurelinker, RTRAPAGIEGR, zwischen den zwei HcRed2A und EYFP wurde durch Polymerase-Kettenreaktion eingeführt (Erkennungsstelle für Faktor Xa ist unterstrichen). Gereinigtes Protein wurde mit Faktor Xa (Promega) in Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ und 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, digeriert. Fluoreszenzspektren (Anregung bei 490 nm) vor und nach der Digestion wurden unter Verwendung eines Carry Eclipse Fluorescence Spektrophotometers (Varian) gemessen. Filter mit einer Anregung von 460–490 nm, Emission LP 510 nm und Emission LP 610 nm wurden mit einem OlympusSZX12 Stereomikroskop verwendet, um die Proteinproben sichtbar zu machen.
B. Ergebnisse
Folgendes beschreibt eine dunkelrote Fluoreszenzmarkierung, die allgemein zur Proteinmarkierung verwendet werden kann. Die Markierung basiert auf zwei Kopf-Schwanz-verknüpften identischen HcRed2A-fluoreszierenden Mutanten des Chromoproteins hcCP mit einem Emissionsmaximum von 640 nm. Da gereinigtes HcRed2A Dimere in Lösung bildet, nahmen wir an, daß kovalent verknüpfte Kopien von diesem Protein intramolekulare Dimere bilden, die als eine nicht-oligomerisierende Markierung in vivo verwendet werden können.
Anfangs testeten wir das HcRed2A-Tandem-Konstrukt in einem prokaryotischen Expressionssystem. Mehrere Aminosäurelinker von unterschiedlichen Längen und Zusammensetzungen zwischen Monomeren wurden untersucht. Die besten Ergebnisse bezüglich der Rate und Vollständigkeit der Proteinreifung und Fluoreszenzleuchtkraft wurden mit einem Vier-Aminosäurelinker, RSPG, der anschließend in allen weiteren Konstrukten verwendet wurde, erhalten. Tandem HcRed2A zeigte dieselben Spektraleigenschaften wie das Stammprotein. Außerdem besitzen E. coli-Kolonien, die HcRed2A-Tandem exprimieren, leuchtendere Fluoreszenz und violettere Färbung im Verbleich zu Kolonien mit Einzel-HcRed2A. Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Proteindimerisierung effektiver zwischen eher eng verknüpften als freien Monomeren stattfindet. Gelfiltrationschromatographie zeigte ähnliche Beweglichkeit für HcRed2A und HcRed2A-Tandem. Beide Proteine scheinen „Dimere" zu sein, wie aus den ähnlichen Einzelpeaks offensichtlich, die zwischen den tetrameren DsRed- und monomeren EGFP-Peaks beobachtet wurden (Daten nicht gezeigt). Daher bildet verknüpftes HcRed2A intramolekulare, aber keine intermolekulare Dimere, und kann deshalb als eine monomere Markierung für Fusionspartner genutzt werden.
Um die Eigenschaften von HcRed2A-Tandem in eukaryotischen Zellen zu untersuchen, fusionierten wir es mit zytoplasmatischem β-Actin und nukleolärem Protein, Fibrillarin. Eine Reihe von Plasmiden, die eine oder zwei Kopien in dem HcRed2A-Tandem, das mit einem Actin oder Fibrillarin verknüpft ist, exprimieren, wurde konstruiert. Entsprechende EGFP-markierte funktionelle Fusionsproteine wurden als positive Kontrollen verwendet, um die gewünschten Fluoreszenzmuster sichtbar zu machen. Die gleichzeitige transiente Co-Transfektion von Zellen mit zwei Plasmiden, die EGFP- und HcRed2A-markierter fusionierte Konstrukte exprimieren, ermöglicht den Vergleich von grün und rot fluoreszierenden Bildern innerhalb derselben Zellen, und daher die Schätzung von jeglichen Fehlern in den verwendeten roten Markierungen. Bei der Fusion mit Actin erzeugte die Einzel-HcRed2A-Markierung ziemlich hohe Niveaus an zytoplasmatischer Aggregation in L929-Fibroblasten, obwohl einige Filamente und Spannungsfasern teilweise sichtbar waren. Im Gegensatz dazu war das Muster von Actinstrukturen mit der HcRed2A-Tandemmarkierung sehr ähnlich der mit EGFP-Actin. HcRed2A-Tandem und EGFP-Markierung von Fasern, zellulären Kortizes und Verfahren waren praktisch nicht zu unterscheiden.
Die Unterschiede zwischen Einzel- und Tandem-HcRed2A-Markierungen, die zusammen mit Fibrillarin in HEK293-Zellen verwendet wurden, waren nicht so offensichtlich. HcRed2A-Fibrillarin zeigte das korrekte Muster in der Mehrzahl von Zellen, obwohl etwa 20% der Zellen noch hohe Niveaus an zytoplasmatischer roter Fluoreszenz zeigten, die nicht der EGFP-Fibrillarin-Verteilung entsprach. Andererseits zeigten praktisch alle Zweifarben-markierten Zellen sehr ähnliche grün und rot fluoreszierende Signale im Fall der HcRed2A-Tandem-Markierung. Die doppelte Größe der Tandemmarkierung hatte keinen Einfluß auf die High-Level-Expression in Zellen, genaues Falten von filamentösem Actin und Markieren der feinen Actinstrukturen oder den Transport von Fusionsproteinen zu den Kernen. Basierend auf diesen Ergebnissen schlußfolgerten wir, daß das HcRed2A-Tandemkonstrukt für die Proteinmarkierung im selben Maße wie für EGFP nützlich ist.
Wir wandten diesen Ansatz ferner auf drei andere tetramere rote FPs an. Eines ist DsRed2, die kommerziell erhältliche verbesserte (nicht-aggregierende und schnell faltende) Version von DsRed. Das zweite, HcRed, ist die dunkelroteste fluoreszierende Mutante des nichtfluoreszierenden Chromoproteins, hcCP. Das dritte, M355NA, ist nicht-aggregierend und die hellroteste Mutante des Chromoproteins asFP595 (asCP). Diese FPs in sowohl Einzel- als auch Tandemform wurden mit β-Actin fusioniert und in L929-Zellen exprimiert, zusammen mit der EGFP-Actinkontrolle. Wie erwartet, zeigten alle drei Einzel-FPs offenkundig inkorrekte Muster der Lokalisation mit sehr hoher zytoplasmatischer Aggregation (7). Im Gegensatz dazu markierten FP-Tandemproteine adäquat filamentöse Actinstrukturen. In dem letzteren Fall waren die Hauptmuster von Actinstrukturen deutlich unterscheidbar, obwohl der Markierungsgrad und Kontrast zwischen Actinfilamenten und dem zytoplasmatischen Hintergrundsignal noch geringer war als der in EGFP-Actin-Bildern. Eine gewisse nichtspezifische Aggregatbildung wurde außerdem mit allen drei FP-Tandems beobachtet.
Rekombinante DsRed2-Tandem-, M355NA-Tandem- und HcRed-Tandem-Proteine, die in E. coli exprimiert wurden, waren von ihren Stammeinzelelementen bei Gelfiltrationsexperimenten, wo sie als Tetramere migrierten (Daten nicht gezeigt), nicht zu unterscheiden. Dies zeigt, daß jedes Tandemproteinmolekül ein intramolekulares „Dimer" bildet, bestehend aus zwei kovalent verknüpften FP-Barrels, und zwei von diesen Dimeren vereinigen sich zu der „tetrameren" Struktur (6C). Folglich verhalten sich diese Tandemproteine als dimere Markierungen. Dies kann der Hauptgrund für die Überlegenheit von DsRed2-, M355NA- und HcRed-Tandems gegenüber Einzelelementen bei der Proteinmarkierung sein.
Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Fluoreszenzresonanzenergieübertragungsanwendungen (FRET-Anwendungen) verwendeten wir ein einfaches Modellsystem, um FRET zwischen EYFP- und HcRed2A-Tandemproteinen zu demonstrieren. Ein pQE30-basierendes Plasmid, das dreifach fusioniertes HcRed2A-Tandem-EYFP kodiert und die Faktor-Xa-Proteasespaltungsstelle innerhalb des Linkers zwischen dem zweiten HcRed2A und EYFP enthält, wurde konstruiert. Wir erwarteten, Spektralveränderungen bei der Faktor-Xa-Digestion aufgrund von FRET-Elimination analog zu den gut dokumentierten Beispielen von Paaren von GFP-Mutanten mit unterschiedlichen Farben zu detektieren. Statt dessen führte die Inkubation von gereinigtem Fusionskonstrukt mit Faktor Xa zu einer allmählichen Erhöhung des Gelbemissionspeaks bei 528 nm und gleichzeitiger Verringerung der Rotemission bei 650 nm mit einem isosbestischen Punkt bei 625 nm. Die Proteasedigestion führte zu einer 80%igen Erhöhung der Gelbfluoreszenz und 30%igen Verringerung der Rotfluoreszenz. Das Verhältnis von Donator-zu-Akzeptorfluoreszenz veränderte sich um das 2,5fache, was mit FRET-Niveaus zwischen anderen FP-Paaren vergleichbar war.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß das neue dunkelrote HcRed2A-Tandem erfolgreich in zahlreichen biotechnologischen und zellbiologischen Anwendungen verwendet werden kann, ähnlich wie GFP und seine Mutanten. Diese dunkelrote Markierung zeigt die Möglichkeit der Mehrfarbenmarkierung von Fusionsproteinen, die mit einzelnen roten FP-Markierungen aufgrund der hohen zytoplasmatischen Aggregation von Fusionskonstrukten unmöglich ist. Unsere Ergebnisse zeigen, daß die Tandemverknüpfung ebenso das Targeting von anderen roten tetrameren FPs verbessert. Aufgrund von intensiven Spektralunterschieden zwischen den GFP-Varianten, die zur Doppelmarkierung verwendet werden, sollte die zusätzliche Einfüh rung von dunkelrotem HcRed2A-Tandem zusammen mit rotem M355NA-Tandem oder DsRed2-Tandem potentiell Vierfarbenanwendungen ermöglichen.
Unsere Daten zeigen außerdem die Verwendung von HcRed2A-Tandem als FRET-Akzeptor für andere FP-Donatoren, wie EYFP. Dies stützt seine Anwendung bei der Entwicklung von tieferen gewebedurchdringbaren dunkelroten FRET-basierenden Assays, um in vivo die Proteaseaktivitäten und Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen, und erzeugt intrazelluläre Sensoren. Außerdem sollten Emissions- und Anregungsspektralüberlagerungen von GFP-Varianten sowie rote M355NA- und dunkelrote HcRed2A-Tandems die gleichzeitige Verwendung von zwei unabhängigen FRET-Paaren von FPs in einer einzelnen lebenden Zelle ermöglichen.
C. Schlußfolgerung
In dem obigen Experiment setzten wir eine Strategie ein, um das Oligomerisierungsproblem durch die Verwendung von zwei kovalent verknüpften identischen roten FPs als nicht-oligomerisierende Fusionsmarkierungen zu überwinden. Wir wandten diesen Ansatz auf das dimere dunkelrote fluoreszierende Protein, HcRed2A (Emission/Anregung von 590/640 nm) an, und zeigten seine Überlegenheit bei der In-vivo-Markierung von feinen Zytoskelettstrukturen und winzigen Nucleoli. Die resultierenden Markierungsmuster waren nicht von denen zu unterscheiden, die durch die üblicherweise verwendeten analogen verstärkten GFP (EGFP) Fusionskonstrukte hergestellt wurden. Die Anwendung dieser Strategie auf tetramere rote FPs (einschließlich DsRed2) verringert signifikant die nicht-spezifische Aggregation von Fusionsproteinen und verbessert stark die intrazelluläre Lokalisation. Die mögliche Verwendung von diesen FP-Tandemmarkierungen als Akzeptoren für Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) wurde durch eine 2,5fache Veränderung in dem Emissionsverhältnis von verstärkter gelber GFP-Mutante (EYFP) und HcRed2A-Tandem-FRET-Paar in einem Proteaseassay gezeigt. HcRed2A-Tandem stellt die erste rote fluoreszierende Markierung dar, der es an den Hauptnachteilen von stark oligomerisierenden DsRed-Varianten fehlt, und kann sicher als monomere GFP-Mutanten in einer breiten Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, die charakteristische dunkelrote Farbe bereitstellen.
Es ist aus der obigen Erläuterung und den Ergebnissen offensichtlicht, daß die vorliegende Erfindung wichtige neue Mutantennukleinsäurekonstrukte, die Chromo/Fluoreszenzproteine kodieren, bereitstellt, die in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen Verwendung finden. Die gegenständlichen Nukleinsäurekonstrukte stellen eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorteilen bereit. Beispielsweise werden, wo die gegenständlichen Nukleinsäuren bei der Produktion von Fusionsproteinen eingesetzt werden, die Fusionsteile mit Fluoreszenzproteinen markiert, die vorhersehbare oligomere Strukturen erzeugen können, so daß ein genaues Signal für die Protein-Niveaus bestimmt werden kann. An sich stellt die vorliegende Erfindung einen signifikanten Beitrag für die Technik bereit.
Obwohl die vorstehende Erfindung durch Illustration und die Beispiele für ein besseres Verständnis ausführlich beschrieben wurde, ist es für den Fachmann im Lichte der Lehren dieser Erfindung ohne weiteres offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der anhängenden Ansprüche abzuweichen.
Sequenzprotokoll
Sequenzprotokoll

Claims

Nukleinsäure, die ein Polypeptidprodukt kodiert, das eine erste und zweite Chromo/Fluoreszenz-Domäne umfasst, die durch eine verknüpfende Domäne verbunden sind, worin genannte erste und zweite Chromo/Fluoreszenz-Domäne unter intrazellulären Bedingungen miteinander in Verbindung stehen, sodass genanntes kodiertes Polypeptid eine intramolekulare dimere Struktur annimmt, und worin genannte erste und zweite Chromo/Fluoreszenz-Domäne identische Chromo- oder Fluoreszenz-Proteine aus einer nicht-biolumineszierenden Nesseltier-Spezies sind.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, worin genannte erste und zweite Chromo/Fluoreszenz-Domäne Oligomer-erzeugende Domänen sind.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, worin genannte nicht-biolumineszierende Nesseltier-Spezies eine Anthozoen-Spezies ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, worin genannte Nukleinsäure ein Fusionsprotein von genannter erster und zweiter Chromo/Fluoreszenz-Domäne kodiert, die mit einer Nicht-Chromo/Fluoreszenz-Proteindomäne fusioniert sind.
Konstrukt, das einen Vektor und eine Nukleinsäure nach Ansruch 1 umfasst.
Expressionskassette, die Folgendes umfasst: (a) eine Region der transkriptionellen Initiation, die in einem Expressionswirt funktionsfähig ist; (b) eine Nukleinsäure nach Anspruch 1; und (c) eine Region der transkriptionellen Termination, die in genanntem Expressionswirt funktionsfähig ist.
Zelle, mit Ausnahme einer menschlichen embryonalen Stammzelle, oder die nicht-menschliche Nachkommenschaft davon, die eine Expressionskassette nach Anspruch 6 als Teil eines extrachromosomalen Elements oder integriert in das Genom einer Wirtszelle als Ergebnis der Einführung von genannter Expressionskassette in genannte Wirtszelle umfasst.
Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptidprodukts, das eine erste und zweite Chromo/Fluoreszenz-Domäne umfasst, wobei genanntes Verfahren Folgendes umfasst: Wachsen einer Zelle nach Anspruch 7, wodurch genanntes Polypeptidprodukt exprimiert wird.
Protein, das durch eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 kodiert wird.
Antikörper, der spezifisch zu einem Protein nach Anspruch 9 bindet.
Nicht-menschliche transgene Zelle oder die nicht-menschliche Nachkommenschaft davon, die ein Transgen umfasst, das eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 ist.
Nicht-menschlicher transgener Organismus, der ein Transgen umfasst, das eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 ist.
In einer Anwendung, in der ein Chromo- oder Fluoreszenz-Protein eingesetzt wird, umfasst die Verbesserung Folgendes: Einsetzen eines Proteins nach Anspruch 9.
In einer Anwendung, in der eine Nukleinsäure eingesetzt wird, die ein Chromo- oder Fluoreszenz-Protein kodiert, umfasst die Verbesserung Folgendes: Einsetzen einer Nukleinsäure nach Anspruch 1.
Kit, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.