DE69726306T2

DE69726306T2 - Renilla luciferase und green fluorescent protein fusionsgene

Info

Publication number: DE69726306T2
Application number: DE69726306T
Authority: DE
Inventors: A. Aldar SZALAY; Gefu Wang; Yubao Wang
Original assignee: Loma Linda University
Current assignee: Loma Linda University
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: EP0934425A1; AU4500497A; ATE254664T1; EP0934425B1; DE69726306D1; EP0934425A4; US5976796A; CA2267068A1; AU730040B2; WO1998014605A1; CA2267068C; JP2001501100A

Description

HINTERGRUND
Grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist ein Lichtemittierendes Protein, das aus der Qualle Aequorea victoria rein erhalten wird. GFP kann grünes Licht emittieren indem es Energietransfer von Quellen akzeptiert, die exogenes blaues Licht und durch Renilla-Luciferase katalysierte Reaktionen einschließen. Das Gen für GFP wurde kloniert und seine cDNA ist ein wirkungsvolles Reportergen bei einer Vielzahl von lebenden Systemen einschließlich Bakterien, Pilzen und Säugetiergeweben. Die durch UV-Licht angeregte GFP-Fluoreszenz erfordert keine Cofaktoren und das Genprodukt alleine kann ausreichend sein, um die Detektion lebender Zellen unter dem Lichtmikroskop zu ermöglichen.
WO9101305A befasst sich mit der Modifikation eines Licht-emittierenden Proteins, um Licht oder Strahlung mit modifizierten Eigenschaften zu erzeugen. Unlängst wurde GFP in einer menschlichen Zelle und in vivo exprimiert. C. Kaether, H. H. Gerdes, "Visualization of protein transport along the secretory pathway using green fluorescent protein", FEBS-Lett. 1995, 369: 267–71. "Humanisiertes" GFP wurde mit Nukleotidänderungen synthetisiert, welche bis auf eine Ausnahme die Aminosäuresequenzen nicht verändert haben.
Renilla-Luciferase ist ein Enzym, das aus Renilla reniformis rein erhalten wird. Das Enzym katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Coelenterazin in Anwesenheit von Sauerstoff, um blaues Licht mit einem Emissionswellenlängen-Maximum von 478 nm zu erzeugen. In Renillareniformis-Zellen ist diese Reaktion jedoch aufgrund eines Energietransfers zu einem grün fluoreszierenden Protein in Richtung Grün, mit einem Wellenlängen-Maximum von 510 nm, verschoben.
Das Gen für Renilla-Luciferase (ruc) wurde kloniert und es zeigte sich, dass seine cDNA als Reportergen bei einer Vielzahl von lebenden Systemen geeignet ist. Lorenz et al., "Isolation and Expression of a cDNA Encoding Renilla Reniformia Luciferase", Proc. Natl. Acad Sci. USA, (Mai 1991), Vol. 88 pp. 4438–4442. Durch die Bereitstellung geeigneter Promotoren für die cDNA als Genkassetten, wurde das Gen in Bakterien, transformierten Pflanzenzellen und Säugetierzellen exprimiert. Die hohe Effizienz der Renilla-Luciferase ist ein wertvolles Merkmal eines Markierungsenzyms für Untersuchungen der Genexpression.
Angesichts der Eigenschaften von GFP und Renilla-Luciferase wäre es nützlich, ein einzelnes Protein zu haben, das sowohl die Funktionen von Renilla-Luciferase-Enzymen als auch die von GFP kombiniert, um Genexpression qualitativ durch UV-Licht-Anregung oder quantitativ durch Messungen der Enzymaktivität zu überwachen.
ZUSAMMENFASSUNG
Gemäß eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung werden Fusionsgenkonstrukte bereitgestellt, welche die cDNA von Renilla-Luciferase und die cDNA des "humanisierten" Aequorea-grün-fluoreszierendes-Proteins umfassen. Die Fusionsgenkonstrukte wurden verwendet, um sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen zu transformieren. Ein Konstrukt wurde als Polypeptid exprimiert, das ein Molekulargewicht von ungefähr 65 kDa besitzt. Dieses Polypeptid, das "Renilla-GFP-Fusionsprotein", war bifunktional und zeigte sowohl die Luciferase-Aktivität von Renilla-Luciferase wie auch die grüne Fluoreszenz von GFP. Das Renilla-GFP-Fusionsgen ist als Doppel-Marker zur Überwachung der Genexpression in lebenden Zellen und quantitativ mittels enzymatischer Aktivität geeignet.
Die Erfindung schließt ein Protein ein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die in SEQ ID Nr: 1 dargelegt ist. Bevorzugt liegt das Protein in gereinigter und isolierter Form vor.
Die Erfindung schließt weiterhin ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches ein Polypeptid kodiert, das sowohl Luciferase- als auch GFP-Aktivität besitzt oder dessen komplementäre Stränge ein. Das Polynukleotid umfasst die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Sequenz.
Die Erfindung schließt weiterhin einen Vektor ein, der ein DNA-Molekül enthält, das ein Polypeptid kodiert, welches sowohl Luciferase- als auch GFP-Aktivität besitzt. Das Polynukleotid umfasst die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Sequenz. Der Vektor kann verwendet werden, um eine Wirtszelle stabil zu transformieren oder transient zu transfizieren.
Die Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids ein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche in SEQ ID Nr: 1 dargelegt ist. Das Verfahren umfasst die Schritte der Kultivierung eines Mikroorganismus, der mit einem Vektor transformiert ist, welcher die SEQ ID Nr: 1 umfasst, unter Bedingungen, die ausreichend sind um das Protein zu erzeugen und das Protein zu gewinnen.
Die Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zur Quantifizierung von Promotor-Aktivierungen und GFP-Fluoreszenz, basierend auf Messungen der Luciferase-Aktivität, ein. Das Verfahren umfasst den Schritt der Bereitstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids.
Die Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers ein. Das Verfahren umfasst den Schritt der Verabreichung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Nukleinsäuresequenz kodiert wird, an einen Wirt ein. Das Polypeptid wird in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um die Produktion von Antikörpern gegen das Polypeptid zu induzieren. Die antikörpererzeugenden Zellen werden aus dem Wirt gewonnen und Zellhybride werden durch Fusion der antikörpererzeugenden Zellen mit Zellen gebildet, die zur im Wesentlichen unbegrenzten Reproduktion imstande sind. Die Hybride werden kultiviert und die monoklonalen Antikörper werden als ein Produkt der Hybride gesammelt.
Die Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zum quantitativen und qualitativen Monitoring der Genexpression in einer Zelle unter Verwendung eines Genkonstrukts ein, das ein Polypeptid kodiert, welches sowohl Luciferase- als auch GFP-Aktivität besitzt. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte, wobei zuerst ein Gen-Fusionskonstrukt bereitgestellt wird, das ein Polypeptid kodiert, welches sowohl Renilla-Luciferase- als auch GFP-Aktivität besitzt. Als nächstes wird das Gen-Fusionskonstrukt in eine Zelle eingeführt. Dann wird die Zelle, welche das Gen-Fusionskonstrukt enthält, in einer Art erhalten, die es der Zelle erlaubt das Polypeptid zu exprimieren. Dann wird die Zelle auf Luciferase- und Fluoreszenz-Aktivität untersucht. Das Produkt schließt die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Polynukleotidsequenz ein.
FIGUREN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die folgende Beschreibung, die angefügten Ansprüche und begleitenden Zeichnungen besser verstanden werden, wobei:
1 ist ein schematisches Diagramm, welches die Konstruktion einer Renilla-Luciferase- und einer "humanisierten" GFP-Fusionsgenkassette gemäß der Erfindung zur Genexpression in E. coli zeigt, wobei "RG", oben, die Fusionsgenkassette mit der die Renilla-Luciferase kodierenden Sequenz (ruc) am 5'-Terminus ist und "GR", unten, die Fusionsgenkassette mit der das GFP kodierenden Sequenz (gfp_h) am 5'-Terminus ist;
2 ist ein schematisches Diagramm, welches die Konstruktion einer Renilla-Luciferase- und einer "humani sierten" GFP-Fusionsgenkassette gemäß der Erfindung zur Genexpression in Säugetierzellen zeigt, wobei "RG", oben, die Fusionsgenkassette mit der die Renilla-Luciferase kodierenden Sequenz (ruc) am 5'-Terminus ist und "GR", unten, die Fusionsgenkassette mit der das GFP kodierenden Sequenz (gfp_h) am 5'-Terminus ist;
3 ist eine Karte des Plasmids, das zum Klonieren und zur Expression des RG-Genkonstrukts in E. coli (oben) und des GR-Genkonstrukts in E. coli (unten) verwendet wird;
4 ist eine Karte des zur Klonierung und zur Expression des RG-Genkonstrukts in Säugetier-Systemen (oben) und des GR-Genkonstrukts in Säugetier-Systemen (unten) verwendet wird;
5 sind Mikroaufnahmen von durch Fusionsgene transformierte Zellen, welche unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenz-Bildgebung erhalten wurden, um GFP-Aktivität zu zeigen;
6 sind Balkendiagramme der Luciferase-Aktivität des Fusionsgenkonstrukts in E. coli (oben) und Säugetierzellen (unten);
7 ist eine spektroskopische Messung von Renil-la-Luciferase-Aktivität und GFP-Aktivität in E. coli;
8 ist ein Western-Blot, welcher die Detektion der Fusionsgen-Expression in E. coli, unter Verwendung von Anti-Renilla-Luciferase-Antikörper, zeigt;
9 sind unter Verwendung von Fluoreszenzbildanalyse erhaltene Mikroaufnahmen von embryonalen Maus-Stammzellen, womit die Expression des RG-Fusionsgens gezeigt wird und
10 sind unter Verwendung von Fluoreszenzbildanalyse erhaltene Mikroaufnahmen von Maus-Embryos, womit die Expression des RG-Fusionsgens gezeigt wird.
BESCHREIBUNG
Gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Fusionsgen bereitgestellt, das die cDNA von Renilla-Luciferase und die cDNA des "humanisierten" Aequorea-grün-fluoreszierendes-Protein umfasst. Gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein einzelnes Polypeptid bereitgestellt, das sowohl Renilla-Luciferase- als auch GFP-Aktivität zeigt. Dieses bifunktionale Polypeptid kann die Identifizierung transformierter Zellen auf der Einzelzellen-Ebene, in Zellkulturen, transformierten Geweben und Organen, basierend auf der Fluoreszenz des Polypeptids, erleichtern. Gleichzeitig kann das Polypeptid auch verwendet werden, um die Promotor-Aktivierungen und GFP-Fluoreszenz, basierend auf Messungen der Luciferase-Aktivität, zu quantifizieren
Die cDNA der Renilla-reniformis-Luciferase (ruc) ist kloniert worden und erfolgreich als Markierungsgen bei einer Vielzahl transgener Spezies verwendet worden. Siehe zum Beispiel W. W. Lorenz, R. O. McCann, M. Longiaru und M. J. Cormier, "Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88: 4438–4442; R. Mayerhofer, W. H. R. Langridge, M. J. Cormier und A. A. Szalay, "Expression of recombinant Renilla luciferase in transgenic plants results in high levels of light emission", The Plant Journal 1995, 7: 1031–1038 und W. W. Lorenz, M. J. Cormier, D. J. O'Kane, D. Hua, A. A. Escher, A. A. Szalay, "Expression of the Renilla reniformis luciferase gene in mammalian cells", J. Biolumin. Chemilumin. 1995, 11: 31–37, welche hierin in ihrer Gesamtheit als Referenz einbezogen werden. Ebenso resultierte der Transfer und die Expression von cDNA aus grün fluoreszierendem Protein (GFP) der Aequorea victoria in einer hohen Konzentration von GFP in transformierten Zellen, was die komfortable Visualisie rung individueller Zellen unter dem Mikroskop gestattet. Siehe beispielsweise M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward und D. C. Prasher, "Green fluorescent protein as a marker for gene expression", Science 1994, 263: 802–805, hierin in ihrer Gesamtheit als Referenz einbezogen.
Die vorliegende Erfindung schließt die Herstellung von Fusionsgenen aus der cDNA von Renilla (ruc) und der cDNA des "humanisierten" Aequorea-GFP (gfp_h) ein. Eine Beschreibung des "humanisierten" Aequorea-GFP (gfp_h) kann zum Beispiel in S. Zolotukhin, M. Potter und W. W. Huaswirth, J. Guy, und N. Muzyczka, "A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells", J. Virology 1996, 70: 46464654, gefunden werden und wird hierin in seiner Gesamtheit als Referenz einbezogen.
Das erste Fusionsgen, das "RG-Fusionsgen" genannt wird, SEQ ID Nr: 1 und im oberen Bereich der 1 und 2 gezeigt, enthält die Renilla-cDNA, die am modifizierten 3'-Ende mit einer Linkersequenz von fünfzehn Polynukleotiden verknüpft ist, welche fünf Aminosäuren, Ala-Ala-Ala-Ala-Thr, Reste 312–316 der SEQ ID Nr: 1 kodiert, gefolgt vom 5'-Ende der intakten GFP-cDNA. Das zweite Fusionsgen, als "GR-Fusionsgen" bezeichnet, SEQ ID Nr: 2 und im unteren Bereich der 1 und 2 gezeigt, enthält die cDNA von GFP, welche mit einer Linkersequenz von siebenundzwanzig Polynukleotiden verknüpft ist, die neun Aminosäuren, Gly-Try-Gln-Ile-Glu-Phe-Ser-Leu-Lys, Reste 239–247 der SEQ ID Nr: 2 kodiert, gefolgt vom 5'-Ende der Renilla-cDNA. Beide Gene wurden in prokaryotischen pGEM-5zf(+)- und eukaryotischen pCEP4-Expressionvektoren platziert und in E. coli und verschiedene Säugetier-Zelllinien transformiert und in Mausembryos mikroinjiziert. PT₇ war der bakterielle T7-Promotor, der für die Genexpression verwendet wurde. P_cmv war der CMV-Promotor, der für die Genexpression in Maus-Fibroblastzellen, embryonalen Stammzellen und Mausembryos verwendet wurde.
Überraschenderweise zeigten nur Zellen, die mit dem RG-Fusionsgen transformiert waren, starke Fluoreszenz während die Zellen, welche das GR-Fusionsgen enthielten, unter dem Mikroskop nur eine geringe Reaktion auf UV-Licht ergaben. Im Gegensatz dazu waren die Luciferase-Messungen in Homogenaten von Zellen, die mit RG-Genkassetten oder mit GR-Genkassetten transformiert waren, sowohl in Bakterien- als auch in Säugetierzellen von einander nicht zu unterscheiden. Weiterhin wiesen die Spektrofluorimeter-Werte darauf hin, dass in Zellen, die das RG-Fusionsgen enthielten, Energietransfer zwischen Renilla-Luciferase und GFP stattfand, aber sie zeigten nicht an, dass ein solcher Energietransfer in Zellen stattfand, welche das GR-Fusionsgen enthielten. Das in den Zellen, die das RG-Fusionsgen enthalten, exprimierte Protein wurde analysiert und als ein 65 kDa Polypeptid bestimmt. Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion und Expression der Fusionsgene und Analysen ihrer Proteinprodukte werden unten angegeben.
Herstellung des Fusionsgenkonstrukts
Die zur Klonierung und Expression verwendeten Vektoren der Genkonstrukte in E. coli und Säugetier-Systemen waren pGEM-5zf(+) (Promega) beziehungsweise pCEP4. 3 ist eine Karte des Plasmids, das zur Klonierung und Expression des RG-Genkonstrukts in E. coli, pGEM-5zf(+)-RG (oben) verwendet wurde und die Karte des Plasmids, das zur Klonierung und Expression des GR-Genkonstrukts in E. coli, pGEM-5zf(+)-GR (unten), verwendet wurde. Beide standen unter der transkriptionellen Kontrolle des T7-Promotors. Die E.-coli-Stämme, die transformiert wurden, waren DLT101 und DH5α.
Ebenso ist 4 eine Karte der Plasmide, die zur Klonierung und Expression des RG-Genkonstrukts in Säugetier-Systemen, pCEP4-RG (oben) verwendet wurden und eine Karte der Plasmide, die zur Klonierung und Expression des GR-Genkonstrukts in Säugetiersystemen, pCEP4-GR (unten), verwendet wurden. Beide standen unter der transkriptionellen Kontrolle des CMV-Promotors. Die Säugetierzelllinie, die transformiert wurde, waren embryonale LM-TK^–-Stammzellen und Embryos.
Es wurden fünf Primer zur Klonierung der RG- und GR-Genkonstrukte gestaltet. Einfache Unterstreichungen kennzeichnen Shine-Dalgarno-Sequenzen. Doppelte Unterstreichungen kennzeichnen die Restriktionsstellen. Die Start-Codons sind fett geschrieben. Sequenzen in kursiver Fettschrifft kennzeichnen das Entfernen der Stop-Codons sowohl aus ruc- als auch aus gfp_h-Genen.
Das Renilla-Luciferase-GFP-Fusionsgen (RG-Genkassette) und das GFP-Renilla-Luciferase-Fusionsgen (GR-Genkassette) wurden durch Entfernen von Stop-Codons und durch Hinzufügen von Restriktionsstellen und Shine-Dalgarno-Sequenzen an das 5'-Ende der cDNAs, unter Verwendung von PCR gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren, konstruiert. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des pGEM-T-Systems (Promega Corporation, Madison, WI) designt. Primer wurden so designt, dass die stromabwärts gelegene cDNA in frame mit der stromaufwärts liegenden cDNA ist. Die Linker-Sequenzen werden in den 1 und 2 gezeigt und oben beschrieben. Nach der Klonierung standen die RG- und GR-Genkassetten unter der transkriptionellen Kontrolle von T7 im pGEM-5zf(+)-Vektor und CMV im pCEP4-Vektor, welche zur Expression in E. coli beziehungsweise Säugetierzellen verwendet wurden.
Bestimmung der Aktivität von Fusionsgenen und ihrer korrespondierenden Proteinprodukte
Die GFP-Aktivität in vivo wurde wie folgt visualisiert. Der E.-coli-Stamm DH5α wurde mit den Plasmiden pGEM-5zf(+)-RG und pGEM-5zf(+)-GR transformiert. Gemäß Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, wurden positive Kolonien identifiziert und in LB-Medium mittels 100 g/ml Ampicillin-Selektion kultiviert. Zwölf Stunden später wurde ein Tropfen der E.-coli-Kultur auf einen Objektträger gegeben und mittel Fluoreszenzmikroskopie mit 1000-facher Vergrößerung visualisiert. LM-TK^–-Zellen wurden mit den Plasmiden pCEP4-RG und pCEP4-GR unter Verwendung von Calcium-Phosphat-Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, transfiziert. Die Petrischalen wurden 12 Stunden nach der Transfektion unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskops kontrolliert.
Die Luciferase-Aktivität wurde wie folgt untersucht. Ein Aliquot transformierter E. coli wurde für ein Luciferase-Assay in einem Turner TD 20e Luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA), sowohl vor als auch nach der IPTG-Induktion, verwendet. Die Ergebnisse wurden als relative Licht-Einheiten aufgezeichnet. Säugetierzellen wurden 36 Stunden nach der Transfektion geerntet und auf Luciferase-Aktivität untersucht.
Korrigierte Emissionsspektren wurden spektrofluorimetrisch unter Verwendung eines SPEX Fluorolog Spektrofluorimeters differenziert registriert. Die Fluoreszenz-Emission wurde bei 390 nm angeregt. Die Biolumineszenz-Emission wurde aufgezeichnet, wobei der Anregungsstrahl nach der Zugabe von 0,1 μg Coelenterazin in angesäuertem Methanol blockiert wurde. Für jede Probe wurden fünf Spektren über einen Wellenlängenbereich von 400 bis 600 nm gemittelt.
Die Fusionsproteine wurden isoliert und die Immunaktivität wie folgt detektiert. 1 ml E. coli (OD₆₀₀ = 1,0) wurde geerntet. 400 μl Zellsuspensionspuffer (0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl pH 7,6, 0,001 M EDTA, 100 μg/ml PMSF) und 100 μl Loading Buffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol) wurden hinzugefügt. Die Proben wurden 4 Minuten lang gekocht und auf ein 7,5%–20% SDS-Polyacrylamid-Gradientgel aufgetragen. Polyklonale anti-Renilla-Luciferase wurde als primärer Antikörper und Goat-Anti-IgG-Peroxidase (anti-rabbit) als sekundärer Antikörper zur Detektion verwendet.
Es wird nun auf 5 Bezug genommen, in der Mikroaufnahmen von GFP-Aktivität in transformierten E.-coli-Zellen (5A, linke Seite) und LM-TK^–-Maus-Fibroblastzellen (5B, rechte Seite) durch Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenz-Bildgebung gezeigt werden. Wie man sehen kann, zeigten mit dem RG-Fusionsgenkonstrukt transformierte individuelle E.-coli-Zellen und Säugetierzellen unter Ölimmersion starke grüne Fluoreszenz.
Es wird nun auf 6 Bezug genommen, in der Balkendiagramme der Luciferase-Aktivität des Genkonstrukts in E.-coli (oben) und Säugetierzellen (unten) gezeigt werden. Die weißen Balken kennzeichnen Aktivität vor der Promotor-Induktion. Die schwarzen Balken kennzeichnen Aktivität nach der Promotor-Induktion. Wie man sehen kann besitzen Zellen, die mit dem RG-Fusionsgenkonstrukt transformiert sind, signifikante Luciferase-Aktivität, die bei Zellen, die mit dem GR-Fusionsgenkonstrukt transformiert sind, dreifach reduziert ist.
Es wird nun Bezug auf 7 genommen, in der eine spektroskopische Messung der Renilla-Luciferase-Aktivität und GFP-Aktivität in E. coli gezeigt wird, die mit verschiedenen Genkonstrukten transformiert sind. Wie man sehen kann, zeigen Zellen, die Renilla-Luciferase-Gen (kurze Striche) enthalten nur einen Emissionspeak bei ungefähr 478 nm. Zellen, die das GR-Gen-Fusionskonstrukt (hell durchgezogen) enthalten, zeigen auch einen Emissionspeak bei ungefähr 478 nm, wodurch nur Renilla-Luciferase-Aktivität angezeigt wird. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die das RG-Gen-Fusionskonstrukt (massiv durchgezogen) enthalten, einen Emissionspeak bei ungefähr 510 nm mit Anregung bei 390 nm. Zellen, welche das RG-Gen-Fusionskonstrukt mit der Zugabe von Coelanterizin (lange Striche) enthalten, zeigen Emissionspeaks sowohl bei ungefähr 478 nm als auch bei 510 nm, was anzeigt, dass der Energietransfer zwischen Renilla-Luciferase und GFP in diesen Zellen stattgefunden hat. Das Fehlen von GFP-Aktivität in mit der GR-Genkassette transformierten Zelllinien könnte auf einer inkorrekten Faltung, aufgrund des Erfordernisses eines freien GFP-C-Terminus, oder auf einer Interferenz des Linkerpolypeptids mit GFP-Aktivität in dem Fusionsprotein, neben anderen möglichen Erklärungen, beruhen.
Es wird nun auf 8 Bezug genommen, die einen Western-Blot zeigt, der eingesetzt wird, um die Fusionsgenexpression in E. coli, unter Verwendung von Anti-Renilla-Luciferase-Antikörper, zu detektieren. Von links nach rechts betrachtet zeigt die "C"-Bahn das Gesamtprotein, das aus nicht-transformierten E.-coli-Zellen extrahiert wurde. Die "R"-Bahn zeigt das Gesamtprotein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, die ausschließlich mit ruc-Gen transformiert wurden. Die "G"-Bahn zeigt das Gesamtprotein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, die ausschließlich mit gfp_h-Gen transformiert wurden. Die "RG"-Bahn zeigt das Gesamtprotein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, die mit der RG-Fusionsgenkassette transformiert wurden. Die "GR"-Bahn zeigt das Gesamtprotein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, die mit der GR-Fusionsgenkassette transformiert wurden.
Wie man sehen kann, erzeugt das Protein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, welche ausschließlich mit dem ruc-Gen transformiert wurden, eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 34 kDa. Protein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, welche mit der RG-Fusionsgenkassette transformiert wurden, erzeugte eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65 kDa. Protein, das aus E.-coli-Zellen extrahiert wurde, welche mit der GR-Fusionsgenkassette transformiert wurden, erzeugte eine Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 34 kDa. Diese Daten implizieren, dass Zellen, welche mit der GR-Fusionsgenkassette transformiert wurden, Luciferase aber kein Fusionsprotein erzeugten. Ein solches Fehlen der Erzeugung von Fusionsprotein bei Zellen, welche mit der GR-Fusionskassette transformiert wurden, würde das Fehlen der grünen Fluoreszenz-Aktivität in diesen Zellen erklären.
Es wird nun auf 9 Bezug genommen, in der Mikroaufnahmen unter Verwendung von Fluoreszenzbildanalyse gezeigt werden, welche die Expression von RG-Fusionsgen in embryonalen Maus-Stammzellen demonstrieren, die durch Elektroporationsverfahren transformiert wurden. Transformierte Kolonien wurden basierend auf der GFP-Aktivität unter dem Fluoreszenzmikroskop selektiert.
Es wird nun auf 10 Bezug genommen, in der Mikroaufnahmen unter Verwendung von Fluoreszenzbildanalyse gezeigt werden, welche die Expression von RG-Fusionsgenen in Mausembryos demonstrieren. Den Embryos wurde das linearisierte RG-Plasmid injiziert und sie wurden in vitro kultiviert. Die Expression von GFP-Aktivität wurde täglich mittels eines Fluoreszenz-Mikroskops überwacht und mittels eines Bildspeichersystems aufgezeichnet.
Basierend auf diesen Werten folgern wir, dass das hierin offenbarte RG-Fusionskonstrukt sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen exprimiert werden kann, um ein bifunktionales Polypeptid zu erzeugen, das sowohl Renilla-Luciferase- als auch GFP-Aktivität zeigt. Dieses bifunktionale Polypeptid ist ein wertvolles Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen auf der Einzelzellen-Ebene, basierend auf Fluoreszenz. Es erlaubt die simultane Quantifizierung von Promotor-Aktivierung in transformierten Geweben und transgenen nicht-menschlichen Organismen durch Messung der Luciferase-Aktivität. Die Doppelfunktion dieses Proteins gestattet die Überwachung von Bakterienzellen in ihren lebenden Wirten und die Differenzierung von Zellen im sich entwickelnden nichtmenschlichen Embryo und im gesamten Tier.
Sequenz-Protokoll

Claims

Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Nukleinsäuresequenz kodiert wird.
Protein nach Anspruch 1, in gereinigter und isolierter Form.
Polynukleotidsequenz, die für eine Protein gemäß Anspruch 1 kodiert, oder deren komplementäre Stränge.
Polynukleotid gemäß Anspruch 3, worin das Polynukleotid die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Sequenz umfasst.
Vektor, der ein Polynukleotid enthält, das die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Sequenz umfasst.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, welche durch den Vektor nach Anspruch 5 transformiert oder transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Nukleinsäuresequenz kodiert wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren eines Mikroorganismus, der mit einem Vektor transformiert ist, welcher die SEQ ID Nr: 1 umfasst, unter Bedingungen, die ausreichend sind, um das Protein herzustellen und (b) Rückgewinnung des Proteins.
Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, wobei das Verfahren umfasst: (a) Verabreichung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die in SEQ ID Nr: 1 dargelegte Nukleinsäuresequenz kodiert ist, an einen Wirt in einer Menge, die ausreichend ist, die Bildung von Antikörpern gegen das Polypeptid zu induzieren: (b) Rückgewinnung der antikörpererzeugenden Zellen aus dem Wirt; (c) Bildung von Zellhybriden durch Verschmelzen der antikörpererzeugenden Zelle mit Zellen, die zur im Wesentlichen unbegrenzten Reproduktion imstande sind; (d) Kultivieren der Hybride und (e) Sammeln der monoklonalen Antikörper als ein Produkt der Hybride.
Verfahren zur Quantifizierung der Promoteraktivierungen und der Fluoreszenz des grünen fluoreszierenden Proteins, basierend auf den Messungen der Luziferase-Aktivität, wobei das Verfahren den Schritt der Bereitstellung eines Proteins gemäß Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zum quantitativen und qualitativen Monitoring der Genexpression in einer Zelle unter Verwendung eines Fusionskonstrukts, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung eines Gen-Fusionskonstrukts, das eine wie in Anspruch 1 dargelegte Aminosäuresequenz kodiert; (b) Einführung des Gen-Fusionskonstrukts in die Zelle; (c) Erhalten der Zelle, die das Gen-Fusionskonstrukt enthält, in einer Art, die es der Zelle erlaubt, das Polypeptid zu exprimieren und (d) Untersuchung der Zelle auf Luziferase- und Fluoreszenzaktivität.