KR100562603B1 - 콘센서스파이테이즈 - Google Patents

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마르틴 레흐만
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은
a) 규정된 단백질 군의 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상의 아미노산 서열을 당해 분야에 공지된 임의의 표준 정렬 프로그램을 이용하여 정렬시키는 단계;
b) 이렇게 정렬하였을 때 동일한 위치인 아미노산의 진화적 상사성을 당해 분야에 공지된 임의의 표준 프로그램을 이용하여 비교하는데, 여기서 상응하는 위치의 아미노산을 결정하는데 사용되는 아미노산의 최소 상사성을 한정하는 프로그램이 제공하는 상사도를 덜 엄격한 수로 설정하고, 상응하는 위치에서 단지 2개의 아미노산만이 동일하여도 프로그램이 그 아미노산을 콘센서스 단백질의 아미노산으로 결정할 수 있도록 매개 변수를 설정하지만, 비교되는 아미노산 서열중 나머지 서열의 상사도보다 훨씬 더 높은 상호간의 상사도를 나타내는 서열이 있는 경우, 이들 서열을, 콘센서스 단백질의 콘센서스 서열을 결정하기 위한 본 발명의 방법과 동일한 방식으로 결정된 이들의 콘센서스 서열로 표시하거나, 1을 이러한 서열의 수로 나눈 가중치(vote weight)를 이들 서열 각각에 할당하는 단계;
c) 규정된 위치에서 공통의 아미노산을 프로그램에서 식별할 수 없을 경우, 비교에 이용된 모든 서열의 아미노산중 임의의 아미노산, 바람직하게는 모든 이러한 서열에서 가장 높은 빈도로 나타나는 아미노산을 선택하거나, 실시예 2에서 주어진 사항을 기준으로 하나의 아미노산을 선택하는 단계;
d) 일단 콘센서스 서열이 규정되면, 바람직하게는 서열이 발현되는 유기체의 코돈 빈도 표를 사용하여 이러한 서열을 DNA 서열로 다시 번역하는 단계;
e) DNA 서열을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 합성하고, 적합한 발현 벡터내로 통합시키거나, 그 자체를 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
f) 형질전환된 숙주 세포를 적합한 배양 조건하에서 성장시키고, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 숙주 세포 또는 이의 배지로부터 콘센서스 단백질을 단리하는 단계를 특징으로 하는, 콘센서스 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

콘센서스 파이테이즈{CONSENSUS PHYTASES}
파이테이즈(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트 포스포히드롤레이즈; EC 3.1.3.8)는 파이테이트(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)를 미오-이노시톨 및 무기 인산염으로 가수분해시키는 효소로서 사료 부가물로서 가치있는 것으로 알려져 있다.
파이테이즈는 1907년 스즈키(Suzuki) 등의 문헌[Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495(1907)]에서 쌀겨내에 존재하는 것이 처음 기술되었고, 1911년 독스(Dox) 및 골든(Golden)의 문헌[J. Biol. Chem. 10, 183-186(1911)]에는 아스페르질루스(Aspergillus) 종으로부터 유래된 파이테이즈가 기술되어 있다. 파이테이즈는 하우센(Howsen) 및 데이비스(Davis)의 문헌[Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382(1983)], 람브렛츠(Lambrechts) 등의 문헌[Biotech. Lett. 14, 61-66(1992)], 및 쉬에(Shieh) 및 와레(Ware)의 문헌[Appl. Microbiol. 16, 1348-1351(1968)]을 참고하면, 밀겨, 식물 종자, 동물의 내장 및 미생물에서 또한 발견되었다.
아스페르질루스 니거(A. niger)(피쿰(ficuum)) 유래의 파이테이즈의 클로닝 및 발현은 판 하팅스펠트(Van Hartingsveldt) 등의 문헌[Gene, 127, 87-94(1993)] 및 유럽 특허원 공개 번호 (EP) 제 420 358 호에 기술되어 있고, 아스페르질루스 니거 변종 아와모리(awamori) 유래의 파이테이즈의 클로닝 및 발현은 피딩톤(Piddington) 등의 문헌[Gene 133, 55-62(1993)]에 기술되어 있다.
개선된 성질을 갖는 파이테이즈의 클로닝, 발현 및 정제는 EP 제 684 313 호에 기술되어 있다. 그러나, 특히 파이테이즈의 열안정성에 대해 추가로 개선된 파이테이즈가 여전히 요구되기 때문에, 본 발명의 목적은 하기 방법을 제공하는 것이지만, 단지 파이테이즈에만 적용가능한 것은 아니다.
본 발명에서는, 아미노산 서열의 진화적 상사성에 대하여 아미노산을 비교하는 프로그램을 사용하여 빈도가 높은 아미노산을 선별함으로써 안정성이 개선된 콘센서스 단백질을 제조하는, 신속하고 정확한 방법을 제공하고자 한다.
콘센서스 단백질의 제조 방법은 하기 단계를 특징으로 한다:
a) 규정된 단백질 군의 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상의 아미노산 서열을 당해 분야에 공지된 임의의 표준 정렬 프로그램을 이용하여 정렬시키는 단계;
b) 이렇게 정렬하였을 때 동일한 위치인 아미노산의 진화적 상사성을 당해 분야에 공지된 임의의 표준 프로그램을 이용하여 비교하는데, 여기서 상응하는 위치의 아미노산을 결정하는데 사용되는 아미노산의 최소 상사성을 한정하는 프로그램이 제공하는 상사도를 덜 엄격한 수로 설정하고, 상응하는 위치에서 단지 2개의 아미노산만이 동일하여도 프로그램이 그 아미노산을 콘센서스 단백질의 아미노산으로 결정할 수 있도록 매개 변수를 설정하지만, 비교되는 아미노산 서열중 나머지 서열의 상사도보다 훨씬 더 높은 상호간의 상사도를 나타내는 서열이 있는 경우, 이들 서열을, 콘센서스 단백질의 콘센서스 서열을 결정하기 위한 본 발명의 방법과 동일한 방식으로 결정된 이들의 콘센서스 서열로 표시하거나, 1을 이러한 서열의 수로 나눈 가중치를 이들 서열 각각에 할당하는 단계;
c) 규정된 위치에서 공통의 아미노산을 프로그램에서 식별할 수 없을 경우, 비교에 이용된 모든 서열의 아미노산중 임의의 아미노산, 바람직하게는 모든 이러한 서열에서 가장 높은 빈도로 나타나는 아미노산을 선택하거나, 실시예 2에서 주어진 사항을 기준으로 하나의 아미노산을 선택하는 단계;
d) 일단 콘센서스 서열이 규정되면, 바람직하게는 서열이 발현되는 유기체의 코돈 빈도 표를 사용하여 이러한 서열을 DNA 서열로 다시 번역하는 단계;
e) DNA 서열을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 합성하고, 적합한 발현 벡터내로 통합시키거나, 그 자체를 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
f) 형질전환된 숙주 세포를 적합한 배양 조건하에서 성장시키고, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 숙주 세포 또는 이의 배지로부터 콘센서스 단백질을 단리하는 단계.
이 방법의 바람직한 실시태양에서, 단계 b)는 하기와 같이 규정될 수 있다:
b) 이렇게 정렬시켰을 때 동일한 위치인 아미노산의 진화적 상사성을 당해 분야에 공지된 임의의 표준 프로그램을 이용하여 비교하는데, 여기서 이러한 프로그램에 의해 제공된 상사도는 가능한 가장 적은값으로 설정하고, 비교에 이용되는 서열의 최소한 절반에서 가장 유사한 아미노산을 콘센서스 단백질의 아미노산 서열의 상응하는 위치로 선택한다.
이러한 전체 과정의 바람직한 실시태양은 다수의 매우 상동적인 서열로부터 서열을 선택하고, 적당히 엄격한 조건하에 계산된 이 단백질 군의 콘센서스 서열과는 확연하게 다른 아미노산 잔기만을 대체하지만 정렬된 위치중에서 적당히 엄격한 조건하에서는 아미노산을 결정할 수 없는 모든 위치에서는 바람직한 서열의 아미노산을 취하는 방법이다.
본 발명의 추가의 목적은, 규정된 위치에서 아미노산의 진화적 상사성을 비교하는데 사용되는 프로그램이 프로그램 "PRETTY"인 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 규정된 단백질 군이 파이테이즈, 특히 진균류에서 기원된 파이테이즈의 군인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은, 숙주 세포가 진핵생물, 특히 진균류, 바람직하게는 아스페르질루스 또는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 한세눌라 기원인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 상기 방법에 의해 수득될 수 있거나 바람직하게는 수득된 콘센서스 단백질, 특히는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 콘센서스 단백질 또는 이의 변형물을 제공하는 것이다. 본원에서, "변형물"은 하나 이상의 위치에서 아미노산이 결실되거나, 첨가되거나, 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환된 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖지만, 단, 생성된 서열이 기본적인 성질, 예컨대 효소 활성(효소 유형 및 비활성), 열안정성, 및 특정 pH-범위에서의 활성(pH-안정성)이 유의하게 변화되지는 않는 단백질을 제공하는 콘센서스 단백질을 의미한다. 본원중 "유의하게"라는 용어는, 당해 분야의 숙련자가 변형물의 성질이 상이하여 서열 2의 아미노산 서열 그 자체를 갖는 콘센서스 단백질의 성질과 명확하게 다르다고 말할 것이라는 의미이다.
본원에서, 무테인(mutein)은 서열 2에 제시된 콘센서스 단백질의 아미노산 서열중 아미노산이 치환되어 추가로 개선된 성질(예: 활성)을 갖는 콘센서스 단백질을 유도하는 것을 의미한다. 이러한 무테인은 유럽 특허원 제 97810175.6 호에 제시된 교시를 기초로하여 정의되고 제조될 수 있다(예: Q50L, Q50T, Q50G, Q50L-Y51N, 또는 Q50T-Y51N). 본원에서, "Q50L"은 아미노산 서열의 위치 50에서 아미노산 Q가 아미노산 L에 의해 교체됨을 의미한다.
추가로, 상기 정의된 바와 같은 콘센서스 단백질을 포함하는 식품, 사료 또는 약학 조성물 또한 본 발명의 목적이다.
본원에서, "이러한 규정된 단백질 군의 3개 이상, 바람직하게는 3개의 아미노산 서열"은 3, 4, 5, 6 내지 12, 20, 50 또는 그 이상의 서열을 정렬 및 비교에 이용하여 콘센서스 단백질의 아미노산 서열을 만들 수 있음을 의미한다. "규정된 단백질 군의 서열"은 이러한 서열이 당해 분야의 숙련자에 의해 일컫어지는 바와 같은 α-나선, β-시트 및 β-회전 구조가 동일한 위치에 존재하여 이러한 구조가 서로 포개진 3차원적 구조로 접혀짐을 의미한다. 게다가, 이들 서열은 규정된 효소 부류(예: 파이테이즈)와 같은 동일한 유형의 생체 활성을 나타내는 단백질을 특징화한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이러한 서열중 하나의 3차원적 구조는 이러한 군의 다른 서열의 구조를 모델링하기에 충분하다. 예컨대, 이를 수행하는 방법이 본원의 실시예에서 제시된다. 본원에서, "진화적 상사성"은 당해 분야에 공지된 프로그램(예: PRETTY)에 의해 수행되는 것처럼 하나의 아미노산이 전체 구조적 형태에 최소의 영향력을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있게하는 구조적 상사성에 관해 아미노산을 분류하는 개요를 말한다. 본원에서, "이러한 프로그램에 의해 제공된 상사도는 ...덜 엄격한 수로 설정..."이라는 절은, 본 발명을 수행하는데 사용된 프로그램에서 상사도를 결정하는 매개 변수 값이, 프로그램이 공통의 아미노산을 전체 아미노산 서열의 최적 위치에 대해 한정하도록 하는 방식으로 선택됨(예를 들면, 프로그램 PRETTY의 경우, THRESHOLD로는 2 또는 3의 값이 선택되고 PLURALITY의 경우 2의 값이 선택될 수 있다)을 의미한다. 게다가, 본원에서, "1을 이러한 서열의 수로 나눈 가중치"는 단지 콘센서스 서열을 결정하는데 사용되는 다른 서열 보다 더 높은 상사도를 갖는 서열 군을 한정하는 서열이, 1을 이 군의 모든 서열의 수로 나눈 것과 동일한 인자로서 이런 결정에 기여함을 의미한다.
이전에 언급된 바와 같이, 프로그램은 가장 유사한 아미노산을 선택하는 것이 아니라, 가장 빈도가 높은 아미노산을 선택하여야 하고, 후자가 불가능한 경우, 당해 분야의 숙련자는 비교에 사용되는 모든 서열로부터 아미노산을 선택할 것이고, 단백질의 열안정성을 개선시키는 이의 성질에 대해서는 예컨대 제네켁(Janecek, S.)의 문헌(1993)[Process Biochem. 28, 435-445] 또는 페르쉬트(Fersht, A. R.) 및 세라노(Serrano, L.)의 문헌(1993)[Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75-83], 알버(Alber, T.)의 문헌(1989)[Annu. Rev. Biochem. 58, 765-798] 또는 매튜스(Matthews, B. W.)의 문헌(1987)[Biochemistry 26, 6885-6888], 및 매튜스의 문헌(1991)[Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17-21]에 논의된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다.
효소의 안정성은 많은 산업적 용도에서 중요한 인자이다. 따라서, 합리적인 접근[1998년의 판 덴 버그(van den Burg) 등의 문헌] 또는 비합리적인 접근[1998년의 아카누마(Akanuma) 등의 문헌]에 의해 안정성, 바람직하게는 효소의 열안정성을 개선시키기 위한 다소간 성공적인 시도가 있어왔다. 단백질의 열안정성에 영향을 미치는 힘은 펩타이드 스트랜드를 적당하게 절첩하는데 중요한 역할을 하는 힘[소수성 상호작용, 반데르발스힘, 수소결합, 염 가교, 구조적 응력(매튜스, 1993)]과 동일하다. 게다가, 매튜스 등(1997)에 의해 제시된 바와 같이, 비절첩된 상태의 자유 에너지는 또한 단백질의 안정성에 영향을 미친다. 단백질 안정성의 강화는 바람직한 상호작용의 수 및 강도를 증가시키고 바람직하지 않은 상호작용의 수 및 강도를 감소시키는 것을 의미한다. 비절첩된 상태의 자유 에너지를 감소시키기 위해 디설파이드 결합을 도입하거나, 글리신을 알라닌 잔기로 치환하거나, 프롤린 함량을 증가시키는 것이 가능하다(마가릿트(Margarit) 등, 1992)(사우어(Sauer) 등, 1986). 다른 그룹은 단백질의 안정성을 위해 추가적인 수소결합 또는 염 가교의 중요성에 관심을 갖거나[블라버(Blaber) 등, 1993], 매설된 소수성 표면적 및 반데르발스힘을 증가시키기 위해 단백질의 내부의 공간을 채우고자 하였다[카푸사스(Karpusas) 등, 1989]. 게다가, 예컨대 개선된 나선 캐핑(capping)에 의한 이중 구조 인자, 특히 α-나선의 안정화가 또한 연구되었다[무노즈(Munoz) 및 세라노(Serrano), 1995].
그러나, 안정성, 특히 단백질의 열안정성을 증가시킬 아미노산 치환을 확인하는 신속하고 정확한 전략은 존재하지 않는다. 통상적으로, 아미노산 치환이 단백질의 절첩된 상태를 안정화시킬 수 있는 경우 분자내에서의 위치를 알아내기 위해 단백질의 3차원 구조가 필요하다. 이 문제점을 해결하기 위한 선택적인 방식은 호열성- 또는 호고열성 유기체내의 동종 단백질을 찾거나, 또는 무작위 돌연변이 방법에 의해 안정성을 증가시키는 아미노산 치환체를 검출하는 것이다. 후자의 경우, 103개 내지 104개의 돌연변이가 필요하고, 신속한 선별 절차를 이용할 수 있는 효소로 제한된다(아라세(Arase) 등, 1993; 리세(Risse), 1992). 이들 모든 접근 방안의 경우, 성공은 가변적이고 예측할 수 없으며, 성공적일 경우 거의 대부분 열안정성이 그다지 향상되지 않았다.
본 발명은 단백질의 열안정성을 개선시키기 위한 선택적인 방식을 제공한다. 이마나카(Imanaka) 등(1986)의 문헌은 단백질의 안정성을 증진시키기 위해 동종 단백질을 비교 사용한 첫번째 예들 중 하나이다. 이들은 중온성 프로테이즈(protease)의 안정성을 증진시키기 위해 호열성 유기체의 프로테이즈를 중온성 유기체의 동종 프로테이즈와 비교하였다. 세라노(Serrano) 등(1993)은 보다 열에 안정한 리보뉴클리에이즈(ribonuclease)를 구축하기 위해 두개의 동종 중온성 리보뉴클리에이즈의 아미노산 서열을 비교하였다. 이들은 둘 사이에서 서로 다른 모든 잔사를 개별적으로 돌연변이시키고 다중 돌연변이체의 안정성을 증가시키는 돌연변이를 조합하였다. 판톨리아노(Pantoliano) 등(1989) 및, 특히 스테이페(Steipe) 등(1994)은 동종 단백질의 모든 정렬 위치에서 가장 빈도가 높은 아미노산이 단백질의 안정성에 가장 많이 기여한다고 제안하였다. 스테이페 등(1994)은 면역글로불린의 가변 도메인(domain)에 대해 상기 사항을 증명하는 반면, 판톨리아노 등(1989)은 서브틸리신(subtilisin)의 1차 서열에서의 위치를 조사하였고, 이때, 더 높은 안정성을 개선시키는 것으로 선택된 효소의 서열은 매우 다양하였다. 이들의 방법에 따라 치환체 M50F가 생성되었고, 이는 서브틸리신의 Tm을 1.8℃ 증가시켰다.
스테이페 등(1994)은 단지 도메인내의 특정 위치에서 가장 빈도가 높은 아미노산 잔기를 결정하는 통계 방법을 사용함으로써 60% 이상의 성공률을 갖는 안정한 돌연변이를 예견할 수 있음을 면역글로불린의 가변 도메인에서 증명하였다. 이 방법은 항체의 가변 도메인의 안정화뿐만 아니라 다른 단백질의 도메인에 유용하다는 것이 또한 제안되었다. 그러나, 이 방법은 모든 단백질로 확대 적용되는 것으로 언급되지는 않았다. 게다가, 개별적인 위치에서 아미노산 잔기의 빈도를 산출하기 위해 사용되는 프로그램, 또는 본원의 경우와 같이 스코어링 매트릭스(scoring matrix) 사용 여부에 대해서는 아무 언급이 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 소위 콘센서스 단백질의 거의 모든 위치의 아미노산 잔기를 계산하고 원핵 생물 또는 진핵 생물의 발현 시스템내에서 발현될 수 있는 이 서열로부터 완전한 유전자를 합성하는 방법을 포함하는 콘센서스 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 DNA 서열은 단백질, 예컨대 당해 분야의 문헌에 의해 공지된 파이테이즈와 같은 단백질을 코딩하는 게놈 또는 cDNA 서열로부터 개시하여 작성되거나[예컨대 EP 제 684 313 호에 언급된 참고 문헌의 서열 정보 또는 서열 테이터 베이스, 예를 들면 "Genbank(Intelligenetics, California, USA), European Bioinformatics Institute(Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF(Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) 및 Vecbase(University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA)"] 또는 시험관내의 돌연변이 방법에 의한 특징으로 개시되어 있다[예를 들면 삼브룩크(Sambrook) 등의 문헌"Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York"]. 본래 허친슨(Hurchinson) 및 에드겔(Edgell)의 문헌[J. Virol. 8, 181(1971)]에 의해 틀이 잡힌 이러한 "위치 지향된 돌연변이 발생"을 위해 광범위하게 사용되는 전략은 돌연변이가 도입되어야만 하는 단일-스트랜드 DNA 서열의 목적 위치에 요구되는 뉴클레오타이드를 치환시키는 합성 올리고뉴클레오타이드의 어니일링(annealing)을 포함한다{개론으로는 스미쓰(Smith)의 문헌[Annu. Rev. Genet. 19, 423(1985)]을 참고하고, 개선된 방법에 대해서는 스탄센(Stanssen) 등의 문헌[Nucl. Acid Res., 17, 4441-4454(1989)]을 참고할 수 있다}. 본 발명을 실시하기에 또한 바람직한 다른 방법은 주어진 DNA 서열의 돌연변이는 폴리머레이즈(polymerase) 쇄 반응(PCR)을 사용하는 돌연변이 반응이다. 출발 물질로서의 DNA는 당해 분야의 공지되고 예컨대 삼브룩크 등의 문헌[Molecular Cloning]에 기술된 방법에 의해 각각의 균주로부터 단리될 수 있다. 균주 정보에 대해서는, 예컨대 EP 제 684 313 호 또는 하기 제시된 임의의 기탁 기관을 참고한다. 아스페르질루스 니거[ATCC 9142], 미셀리옵토라 써모필라(M. thermophila)[ATCC 48102], 탈라로마이세스 써모필루스(Talaromyces thermophilus)[ATCC 20186] 및 아스페르질루스 푸미가투스(A. fumigatus)[ATCC 34625]는 각각 ATCC 74337, ATCC 74340, ATCC 74338 및 ATCC 74339의 등록 번호로 어메리칸 타입 컬쳐 셀 콜렉션(American Type Culture Cell Collection)에 부타페스트 조약(Budapest Treaty)의 조건에 따라 재기탁되었다. 그러나, 본 발명에 따른 콘센서스 단백질을 암호화하는 DNA는 예컨대 당해 분야의 공지된 방법에 의해 EP 제 747 483 호 또는 실시예에 기술된 바와 같이 합성 방식으로 또한 제조될 수 있다.
일단 본 발명의 완전한 DNA 서열이 수득되면, 이들은 당해 분야의 공지된 방법에 의해 벡터내로 통합될 수 있고, 적합한 숙주 시스템내에서 암호화된 폴리펩타이드를 과도하게 발현한다고 예컨대 삼브룩크 등의 문헌[상기 기술됨]에 기술된다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 DNA 서열 자체가 또한 암호화된 폴리펩타이드의 과도한 발현을 위해 본 발명의 적합한 숙주 시스템을 형질전환시키는데 사용될 수 있음을 알 것이다. 적합한 숙주 시스템은 예컨대 펜(Pen) 등의 문헌[Bio/Technology 11, 811-814(1994)]에 기술된 바와 같은, 예컨대 아스페르질루스(예: 아스페르질루스 니거[ATCC 9142] 또는 아스페르질루스 피쿰[NRRL 3135] 등), 트리코더마(Trichoderma)(예: 트리코더마 레에세이(T. reesei) 또는 효모), 사카로마이세스(예: 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae), 또는 피키아(Pichia)[예: 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)], 또는 한세눌라 폴리모파(H. polymorpha)[예: 한세눌라 폴리모파(DSM5215)]와 같은 진균류, 또는 식물이다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 미생물을 기탁 기관(예: American Type Culture Collection(ATCC), the Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS) 또는 the Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)] 또는 저널[Industrial Property, (1991) 1, 페이지 29-40]에 게재된 바와 같은 다른 임의의 기탁 기관으로부터 이용할 수 있다. 사용될 수 있는 박테리아는 이 콜라이, 바실러스(예: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)(예: 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)이다[예컨대 안네(Anne) 및 말라에르트(Mallaert)의 문헌"FEMS Microbiol. Letters 114, 121(1993)"을 참고]. 사용되는 이 콜라이는 M15[빌라레조(Villarejo) 등의 문헌"J. Bacteriol. 120, 466-474(1974)"에서 DZ 291로서 기술됨], HB 101[ATCC 제 33694 호] 또는 이 콜라이 SG 13009[고테스만(Gottesman) 등의 문헌"J. Bacteriol. 148, 265-273(1981)"]와 같은 이 콜라이 K12 균주이다.
진균류내의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 EP 제 420 358 호 또는 쿨렌(Cullen) 등의 문헌[Bio/Technology 5, 369-376(1987)] 또는 바르트(Ward)의 문헌[Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York(1991)], 웁샬(Upshall) 등의 문헌[Bio/Technology 5, 1301-1304(1987)], 귀네(Gwynne) 등의 문헌[Bio/Technology 5, 71-79(1987)], 푼트(Punt) 등의 문헌[J. Biotechnol. 17, 19-34(1991)]에 기술되어 있고, 효모의 경우, 스레에크리쉬나(Sreekrishna) 등의 문헌[J. Basic Microbiol. 28, 265-278(1988), Biochemistry 28, 4117-4125(1989)], 힛제만(Hitzemann) 등의 문헌[Nature 293, 717-722(1981)] 또는 EP 제 183 070 호, EP 제 183 071 호, EP 제 248 227 호, EP 제 263 311 호에 기술되어 있다. 이 콜라이내의 발현을 위해 사용될 수 있는 적합한 벡터는, 예컨대 삼브룩크 등의 문헌[상기 참고] 또는 피어스(Fiers) 등의 문헌[Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium], 두란드(Durand) 등의 문헌[Soc. Franc. de Microbiol., Paris, pp. 680-697(1998)] 또는 부자드(Bujard) 등의 문헌[Methods in Enzymology, eds. Wu and Grossmann, Academic Press, Inc. Vol. 155, 416-433(1987)] 및 스퉤버(Stuber) 등의 문헌[Immunological Methods, eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152(1990)]에서 언급된다. 바실러스내의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터는 당해 분야에 공지되고, 예컨대 얀수라(Yansura)의 문헌[EP 제 405 370 호, Procd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439(1984)] 및 헤너(Henner)의 문헌[Meth. Enzymol. 185, 199-228(1990)] 또는 EP 제 207 459 호에 기술되어 있다. 한세눌라 폴리모파내의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터는 당해 분야에 공지되고 겔리센(Gellissen) 등의 문헌[Biotechnology 9, 291-295(1991)]에 기술되어 있다.
본 발명의 프로모터(promotor)와 같은 조절 인자 또는 DNA 서열을 운반하는 벡터는 이러한 인자를 포함하도록 유전자 조작될(engineered) 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터 인자는 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 트리코데마 레에세이의 경우 하리키(Haariki) 등의 문헌[Biotechnology 7, 596-600(1989)]의 cbh1-프로모터 또는 쉰들러(Schindler) 등의 문헌[Gene 130, 271-275(1993)]의 pki1-프로모터, 아스페르질루스 오리자에의 경우, 크리스텐센(Christensen) 등의 문헌[Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23(1987)], 크리스텐센 등의 문헌[Biotechnology 6, 1419-1422(1988)] 및 타다(Tada) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet. 229, 301(1991)]의 amy-프로모터, 아스페르질루스 니거의 경우, 쿨렌 등의 문헌[Bio/Technology 5, 369-376(1987)], 귄네 등의 문헌[Bio/Technology 5, 713-719(1987)], 바르트의 문헌[Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 83-106(1991)]의 glaA-프로모터, 귄네 등의 문헌[Bio/Technology 5, 718-719(1987)]의 alcA-프로모터, 보디(Boddy) 등의 문헌[Curr. Genet. 24, 60-66(1993)]의 sucl-프로모터, 맥크레(MacRae) 등의 문헌[Gene 71, 339-348(1988)] 및 맥크레 등의 문헌[Gene 132, 193-198(1993)]의 aphA-프로모터, 맥나이트(McKnight) 등의 문헌[Cell 46, 143-147(1986)] 및 웁샬 등의 문헌[Bio/Technology 5, 1301-1304(1987)]의 tpiA-프로모터, 푼트 등의 문헌[Gene 69, 49-57(1988) 및 푼트 등의 문헌[J. Biotechnol. 17, 19-37(1991)]의 gpdA-프로모터, 및 그라프(de Graaff) 등의 문헌[Curr. Genet. 22, 21-27(1991)]의 pkiA-프로모터이다. 효모내의 발현을 위해 사용될 수 있는 적합한 프로모터 인자는 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 보겔(Vogel) 등의 문헌[Mol. Cell. Biol., 2050-2057(1989)] 및 루돌프(Rudolf) 및 히넨(Hinnen)의 문헌[Natl. Acad. Sci. 84, 1340-1344(1987)]의 pho5-프로모터이거나, 또는 사카로마이세스 세레비시애내의 발현을 위한 gap-프로모터이고 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 경우, 쿠쯔(Koutz) 등의 문헌[Yeast 5, 167-177(1989] 및 스레에크리쉬나(Sreekrishna) 등의 문헌[J. Microbiol. 28, 265-278(1988)]의 aoxl-프로모터이거나, 또는 한세눌라 폴리모파의 경우, 홀렌버그(Hollenberg) 등의 제 EP A 0299108 호의 FMD-프로모터 또는 레데보어(Ledeboer) 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 13, 3063-3082(1985)]의 MOX-프로모터이다.
따라서, 본 발명의 목적은 또한 바람직하게 박테리아 또는 진균류 또는 효모 숙주 및 형질전환된 이러한 박테리아 또는 진균류 또는 효모 숙주내의 DNA 서열의 발현을 위한 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명의 목적은 또한 발현에 사용되는 유기체, 예컨대 효모의 코돈 빈도 표를 기준으로 이러한 단백질의 암호화 DNA 서열의 코돈을 선택하고(실시예 3 참조), 선택적으로 신호 서열(signal sequence)을 위한 코돈을 실시예 3의 특정 경우를 위해 기술된 바와 같은 방식으로 선택함을 특징으로 하는, 한세눌라에서 단백질, 바람직하게는 본 발명의 콘센서스 파이테이즈와 같은 파이테이즈를 높게 발현시키는 시스템을 또한 제공하는 것이다. 이는 코돈 빈도 표를 규정된 단백질 군의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열에서 사용된 코돈을 기준으로 제조함을 의미한다. 이어, 신호 서열의 DNA 서열의 디자인을 위한 코돈을 발현에 사용되는 숙주 세포의 코돈 빈도 표로부터 선택하고, 이로 인하여 양쪽 표에서 비교가능한 빈도의 두개의 코돈이 항상 사용된다.
일단 이러한 DNA 서열이 적합한 배지의 적합한 숙주 세포에서 발현되면, 단백질이 배지내로 분비되는 경우에는 암호화된 단백질을 배지로부터 단리하고, 이러한 단백질이 세포 간극에 존재하는 경우에는 암호화된 단백질을 단백질 정제 분야에 공지된 방법, 또는 예컨대 파이테이즈의 경우 EP 제 420 358 호에 기술된 방법에 의해 숙주 유기체로부터 단리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법은 상기 기술된 바와 같은 형질전환된 박테리아 또는 숙주 세포를 적합한 배양 조건하에서 배양하고 폴리펩타이드를 이로부터 회수함을 특징으로 하고, 이러한 방법에 의해 제조된 폴리펩타이드 또는 본 발명의 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또한 본 발명의 목적이다.
일단 수득되면, 본 발명의 폴리펩타이드는 농업에서 유용하게 되는 이들의 성질을 특징화하고, 예컨대 시몬스(Simons) 등의 문헌[Br. J. Nutr. 64, 525-540(1990)], 쉐너(Schoner) 등의 문헌[J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248-255(1991)], 복트(Vogt)의 문헌[Arch. Geflugelk. 56, 93-98(1992)], 종블로에드(Jongbloed) 등의 문헌[J. Anim. Sci., 70, 1159-1168(1992)], 페르네이(Perney) 등의 문헌[Poultry Sci. 72, 2106-2114(1993)], 파렐(Farrell) 등의 문헌[J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278-283(1993)], 브로즈(Broz) 등의 문헌[Br. Poultry Sci. 35, 273-280(1994)] 및 뒝겔훼프(Dungelhoef) 등의 문헌[Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10(1994)] 등에 기술되어 있는 당해 분야에 공지된 임의의 분석법을 사용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 특정 적용 분야, 예컨대 파이테이트 등의 이노시톨 폴리포스페이트를 이노시톨과 무기 인산으로 전환시키는 파이테이즈에 한정되지 않고 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 약학 조성물 또는 배합 식품 또는 사료를 제조하는 방법에 사용될 수 있고, 여기서 이러한 조성물의 성분들은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드와 혼합된다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 배합 식품 또는 사료 또는 약학 조성물 또한 본 발명의 목적이다. 당해 분야의 숙련자는 이들 제조 방법에 익숙하다. 이러한 약학 조성물 또는 배합 식품 또는 사료는 이러한 목적을 위해 일반적으로 사용되고 당해 분야의 공지된 부가물 또는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 이러한 사료내에 함유된 파이테이트를 이노시톨과 무기 인산으로 전환시키는 유효량으로 사료 조성물을 동물에게 먹이는 것을 특징으로 하는, 동물 사료내의 파이테이트의 수준을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
실시예
참고 실시예
아스페르질루스 푸미가투스 및 아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46 파이테이즈의 상동성 모델링
아스페르질루스 푸미가투스 및 아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46 파이테이즈의 아미노산 서열을 아스페르질루스 니거 NRRL 3135 파이테이즈의 서열(서열 1을 참고)과 비교하고, 이를 위해 삼차원 구조를 X-레이 결정학에 의해 측정하였다.
아스페르질루스 니거 NRRL 3135 파이테이즈, 아스페르질루스 푸미가투스 파이테이즈 및 아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46 파이테이즈의 많은 아미노산 서열을 프로그램 "PILEUP"(Prog. Menu for the Wisconsin Package, version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison Wisconcin, USA 53711)을 사용하여 산출하였다. 아스페르질루스 푸미가투스 파이테이즈 및 아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46 파이테이즈의 삼차원 모델을, 주형으로서 아스페르질루스 니거 NRRL 3135 파이테이즈의 구조를 사용하고, 서열 정렬에 따라 아스페르질루스 니거 NRRL 3135 파이테이즈의 아미노산을 각각 아스페르질루스 푸미가투스 및 아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46 파이테이즈의 아미노산과 교환함으로써 제작하였다. 모델 제작 및 에너지 최적화를 프로그램 몰록(Moloc)[게르버(Gerber) 및 뮬러(Muller), 1995]을 사용하여 수행하였다. C-α 위치는 새로운 삽입/제거없이 유지시켰고, 이는 활성 부위와는 먼 루프(loop) 영역이다.
외부 루프에서는 모델화된 구조와 원래의 결정 구조가 아주 조금만 상이한 것으로 관찰될 수 있었다. 또한, 슈도모나스 sp. 박테리움 파이테이즈(Pseudomonas sp. bacterium phytase) 및, 확인한 한, 아스페르질루스 니거 NRRL 3135 파이테이즈[코스그로브(Cosgrove), 1980]에 의한 파이트산의 분해 경로에서 주로 발생되는 상이한 기질 분자를 구축하고, 각각의 파이테이즈 구조의 활성 부위 강으로 만들었다. 각각의 이들 기질은 히스티딘 산 포스파테이즈에 대해 제안된 가설 결합 모드(hypothetical binding mode)(반 에텐(Van Etten), 1982)로 배향되었다. 끊어지기 쉬운 포스페이트기는 촉매적으로 필수적인 His 59로 배향되어 공유 결합 포스포엔자임 중간체를 형성하였다. 끊어진 후 Asp 339에 의해 양성자화될 기질 포스포에스테르 결합의 산소는 양성자 공여체로 배향되었다. 기질의 잔여 구조 부분 및 주위의 활성 부위 잔기의 구조 형태적 이완은 프로그램 몰록을 사용하여 에너지를 최적화함으로써 수행되었다.
구조 모델을 기준으로, 활성 부위 강쪽을 향하는 잔기를 확인하였다. 이들 위치의 반 이상(60%)은 이들 3개의 파이테이즈들 사이에서 동일하지만, 단지 몇개의 위치는 보존되지 않았다(서열 1을 참고). 이들 관찰은 4개의 추가의 파이테이즈 서열(아스페르질루스 니둘란스, 아스페르질루스 테레우스 9A1, 탈라로마이세스 써모필루스 및 미셀리옵토라 써모필라)까지 연장될 수 있었다.
실시예 1
진균 파이테이즈의 아미노산 서열의 정렬
정렬을 표준 매개 변수(gap creation penalty 12, gap extension penalty 4)를 사용하여 시퀀스 애널라이시스 팩키지 릴리즈 9.0(Sequence Analysis Package Release 9.0)(데베록스 등, 1984)으로부터 프로그램 PILEUP을 사용하여 계산하였다. 갭의 위치를 텍스트 에디터(text editor)를 사용하여 정련하였다. 신호 서열을 갖지 않는 하기 서열(서열 1을 참고)을 하기 언급된 아미노산 (aa)으로 시작하는 정렬의 수행에 사용하였다:
아스페르질루스 테레우스 9A-1로부터의 phyA 유전자, aa 27(미첼 등, 1997)
아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46으로부터의 phyA 유전자, aa 27(판 룬 등, 1997)
아스페르질루스 니거 변종 아와모리로부터의 phyA 유전자, aa 27(피딩톤 등, 1993)
아스페르질루스 니거 T213으로부터의 phyA 유전자, aa 27
아스페르질루스 니거 균주 NRRL 3135로부터의 phyA 유전자, aa 27(판 하팅스펠트 등, 1993)
아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 13073으로부터의 phyA 유전자, aa 26(파사몬테스 등, 1997)
아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 32722로부터의 phyA 유전자, aa 26(판 룬 등, 1997)
아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 58128로부터의 phyA 유전자, aa 26(판 룬 등, 1997)
아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 26906으로부터의 phyA 유전자, aa 26(판 룬 등, 1997)
아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 32239로부터의 phyA 유전자, aa 30(판 룬 등, 1997)
아스페르질루스 니둘란스로부터의 phyA 유전자, aa 25(로체(Roche) Nr. R1288, 파사몬테스 등, 1997a)
탈라로마이세스 써모필루스 ATCC 20186으로부터의 phyA 유전자, aa 24(파사몬테스 등, 1997a)
미셀리옵토라 써모필라로부터의 phyA 유전자, aa 19(미첼 등, 1997).
표 2는 상기 언급된 파이테이즈 서열의 동종성을 보여준다.
실시예 2
진균 콘센서스 파이테이즈의 아미노산 서열의 계산
입력물로서 실시예 1의 규정된 정렬을 사용하여, 콘센서스 서열을 시퀀스 애널라이시스 팩키지 릴리즈 9.0(데베록스 등, 1984)으로부터 프로그램 PRETTY를 사용하여 계산하였다. PRETTY는 이들 컬럼이 정렬되게 서열을 인쇄하고, 정렬을 위한 콘센서스 서열을 디스플레이할 수 있다. 정렬된 파이테이즈의 아미노산 서열 사이의 상사성에 관한 가중치를 모든 서열에 할당하였다. 가중치는 하나의 서열 아군(동일한 종에서 기원하지만 상이한 균주)으로부터의 모든 파이테이즈, 예를 들면, 아스페르질루스 푸미가투스로부터 수득된 모든 파이테이즈의 아미노산 서열의 영향들의 합이 1로 설정되도록 설정한다. 즉, 각각의 서열이 1을 균주 서열의 갯수로 나눈 값으로 표시된다(표 1을 참고). 이로써, 예컨대 다른 아스페르질루스 푸미가투스 균주에서 나온 파이테이즈의 매우 유사한 아미노산 서열이 계산된 콘센서스 서열에서 우세한 것을 막을 수 있다.
하기 매개 변수를 이용하여 프로그램 PRETTY를 시작하였다: 그 아래로 콘센서스가 없는 표결 수를 정의하는 최고 표차를 2.0으로 설정한다. 아미노산 잔기의 연합을 위해 그 이하의 값에서는 아미노산이 표결될 수 없는 스코어링 매트릭스 값을 측정하는 역치는 2로 설정하였다. PRETTY는 펩타이드에 대해 PrettyPep.Cmp 콘센서스 스코어링 매트릭스를 사용하였다.
프로그램이 콘센서스 잔기를 측정할 수 없는, 정렬에서의 10군데의 위치(위치 46, 66, 82, 138, 162, 236, 276, 279, 280, 308; 서열 1)를 하기 법칙에 따라 수작업으로 채웠다: 가장 빈도가 높은 잔기가 존재한다면, 이 잔기를 선택하였다(138, 236, 280); 화학적으로 유사하거나 등가의 잔기의 유력한 그룹이 있다면, 가장 빈도가 높은 것을 택하고, 이것이 가능하지 않다면 이 그룹중 하나의 잔기를 선택하였다(46, 66, 82, 162, 276, 308). 유력한 잔기 또는 유력한 그룹이 존재한다면, 있는 잔기중 하나를 단백질 안정성에 대한 이들의 영향에 대한 일반적인 가정에 따라 선택하였다(279). 8개의 다른 위치(132, 170, 204, 211, 275, 317, 384, 447; 서열 1)는 프로그램에 의해 선택된 아미노산 잔기로 채우지 않고, 일반적으로 프로그램에 의해 선택된 잔기와 동일한 빈도로 발생하는 아미노산으로 채웠다. 대부분의 경우에, 3개의 아스페르질루스 니거 서열을 약간 과소평가(가중치의 합: 0.99)하는 것은 이런 보정에 의해 제거되었다.
표 3은 계산된 진균 콘센서스 파이테이즈 아미노산 서열의 산출을 위해 사용된 파이테이즈 서열과의 상종성을 보여준다.
실시예 3
진균 콘센서스 파이테이즈 아미노산 서열의 DNA 서열로의 전환
아스페르질루스 테레우스 cbs 116.46 파이테이즈의 첫부분의 26개 아미노산 잔기를 신호 펩타이드로서 사용하고, 이를 모든 콘센서스 파이테이즈의 N-말단에 융합시켰다. 이러한 연장을 위해, 우리는 상응하는 DNA 서열을 계산하기 위해 특별한 방법을 사용하였다. 푸비스 등(1987)은 유전자내로 희귀한 코돈이 혼입되면 단백질의 절첩 효과에 영향을 미친다고 제안하였다. 따라서, 진균 콘센서스 파이테이즈를 위해 사용되고 단백질 분비에 매우 중요하지만 사카로마이세스 세레비시애 코돈에서 사용되도록 전환된 아스페르질루스 네레우스 cbs 116.46의 신호 서열에 분포하고 있는 휘귀한 코돈은, 사카로마이세스 세레비시애에서의 발현을 위해 만들어진 새로운 신호 서열로 옮겨졌다. 단백질의 나머지 부분의 경우, 우리는 GCG 프로그램 팩키지로부터 수득된 매우 높게 발현되는 사카로마이세스 세레비시애 유전자의 코돈 빈도 표를 사용하여 계산된 아미노산 서열을 DNA 서열로 번역하였다.
생성된 fcp 유전자의 서열을 서열 2에 제시하였다.
실시예 4
진균 콘센서스 파이테이즈 유전자의 그룹 및 클로닝
진균 콘센서스 파이테이즈의 계산된 DNA 서열을 선택적으로 센스(sense) 및 안티센스(anti-sense) 스트랜드의 서열을 사용하여 85 bp의 올리고뉴클레오타이드로 분할하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드는 이의 선행되는 올리고뉴클레오타이드 및 이의 후속되는의 맞은편 스트랜드의 올리고뉴클레오타이드와 20bp씩 중첩되었다. 마이크로신쓰 발가(Microsynth, Balgach)(스위스)에서 시판하고 있는 PAGE-정제된 형태로 수득되는 모든 프라이머의 위치를 서열 2에 제시한다.
3회의 PCR 반응에서, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 전체 유전자로 조립되었다. PCR에서, 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)(독일 만하임 소재)의 하이 피델러티 킷트(High Fidelity Kit) 및 AMS 바이오테크놀로지(AMS Biotechnology)(Europe) 리미티드(Ltd.)(스위스 루가노 소재)의 열 순환기 프로토콜(Protokol, 상표명)을 사용하였다.
올리고뉴클레오타이드 CP-1 내지 CP-10(혼합물 1, 서열 2)을 각각의 올리고뉴클레오타이드 1μL당 0.2pM의 농도로 혼합하였다. 두번째 올리고뉴클레오타이드 혼합물(혼합물 2)을 CP-9 내지 CP-22(각 올리고뉴클레오타이드 1μL당 0.2pM)를 사용하여 제조하였다. 추가로, 4개의 짧은 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다:
CP-a: Eco RI
5'-TAT ATG AAT TCA TGG GCG TGT TCT TC-3'
CP-b:
5'-TGA AAA GTT CAT TGA AGG TTT C-3'
CP-c:
5'-TCT TCG AAA GCA GTA CAA GTA C-3'
CP-e: Eco RI
5'-TAT ATG AAT TCT TAA GCG AAA C-3'
PCR 반응 a:
혼합물 1 10μL(2.0pM의 각각의 올리고뉴클레오타이드)
뉴클레오타이드 2μL(10mM의 각각의 뉴클레오타이드)
프라이머 CP-a 2μL(10pM/μL)
프라이머 CP-c 2μL(10pM/μL)
PCR 완충액 10.0μL
폴리머레이즈 혼합물 0.75μL
물 73.25μL
PCR 반응 b:
혼합물 2 10μL(각각 2.0p몰의 올리고뉴클레오타이드)
뉴클레오타이드 2μL(10mM의 각각의 뉴클레오타이드)
프라이머 CP-b 2μL(10pM/μL)
프라이머 CP-e 2μL(10pM/μL)
PCR 완충액 10.0μL
폴리머레이즈 혼합물(2.6U) 0.75μL
물 73.25μL
PCR 반응 a 및 b를 위한 반응 조건:
단계 1은 2분 동안 45℃이고, 단계 2는 30초 동안 72℃이고, 단계 3은 30초 동안 94℃이고, 단계 4는 30초 동안 52℃이고, 단계 5는 1분 동안 72℃이다.
단계 3 내지 5를 40회 반복하였다.
PCR 생성물(670 및 905bp)을 아가로즈 겔 전기영동(0.9%의 아가로즈) 후 겔 추출(QIAEX II Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 정제하였다. 정제된 DNA 분획을 PCR 반응 c를 위해 사용하였다.
PCR 반응 c:
반응 a의 PCR 생성물 6μL(약 50ng)
반응 b의 PCR 생성물 6μL(약 50ng)
프라이머 CP-a 2μL(10pM/μL)
프라이머 CP-e 2μL(10pM/μL)
PCR 완충액 10.0μL
폴리머레이즈 혼합물(2.6U) 0.75μL
물 73.25μL
PCR 반응 c를 위한 반응 조건:
단계 1은 2분 동안 94℃이고, 단계 2는 30초 동안 94℃이고, 단계 3은 30초 동안 55℃이고, 단계 4는 1분 동안 72℃이다.
단계 2 내지 4를 31회 반복하였다.
생성된 PCR 생성물(1.4kb)을 상기 언급된 바와 같이 정제하고, Eco RI로 분해시키고, Eco RI에 의해 분해되고 탈인산화된 pBsk(-)-벡터[스트라타젠(Stratagene), La Jolla, CA, USA]내에서 라이게이션하였다(ligate). 라이게이션 혼합물 1μL를 이용하여 E. coli XL-1 컴피튼트(competent) 세포(스트라타젠, La Jolla, CA, USA)를 형질전환시켰다. 모든 표준 절차를 삼브룩크 등(1987)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 구축된 진균 콘센서스 파이테이즈 유전자(fcp)를 서열화하여 증명하였다(플라스미드 pBsk-fcp).
실시예 5
사카로마이세스 세레비시애내의 진균 콘센서스 파이테이즈 유전자 fcp 및 이의 변종의 발현, 및 배양 상청액으로부터의 이들의 정제
진균 콘센서스 파이테이즈 유전자는 사카로마이세스 세레비시애 발현 벡터 pYES2(Invitrogen, San Diego, CA, USA)의 발현 카세트(expression cassette)의 Eco RI 부위내로 라이게이션된 플라스미드 pBsk-fcp로부터 단리되거나, 제인스(Janes) 등(1990)에 의해 기술된 바와 같이 짧아진 GAPFL(글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로제네이즈) 프로모터와 pho5 터미네이터(terminator)의 사이에 서브클로닝되었다(subclone). 유전자의 정확한 배향을 PCR로 점검하였다. INVSc1(Invitrogen, San Diego, CA, USA)과 같은 사카로마이세스 세레비시애 균주의 형질전환은 히넨 등(1978)의 방법에 따라 수행하였다. GAPFL 프로모터의 조절하에 파이테이즈 유전자를 함유하는 단일 클론을 선택하여 하루 동안 30℃에서 격렬하게 진탕(250rpm)하면서 5mL의 선택 배지[SD-우라실, 쉐어만(Sherman) 등, 1986]내에서 배양하였다. 이어, 예비 배양체를 YPD 배지(쉐어만 등, 1986) 500mL에 첨가하고 동일한 조건하에서 배양하였다. 제작자의 지시에 따라 gal1 프로모터를 도입하였다. 배양 4일 후, 세포 배양액(broth)을 원심분리하여(7000rpm, GS3 로터, 15분, 5℃) 세포를 제거하고, 상청액을 아미콘(Amicon) 8400 장치(PM30 막) 및 울트라프리(ultrafree)-15 원심분리 필터 장치(Biomax-30K, Millipore, Bedford, MA, USA)에서 한외여과하여 농축시켰다. 농축물(10mL)을 용출 완충액으로 pH 5.0의 아세트산 나트륨 10mM을 사용하여 세파덱스 G25 수퍼파인 칼럼(Sephadex G25 Superfine column)(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) 40mL에서 탈염하였다. 탈염된 샘플을 2M의 (NH4)2SO4에 첨가한 후, 곧바로 pH 5.0의 10mM의 아세트산 나트륨내의 (NH4)2SO4의 2M 내지 0M의 선형 구배를 사용하여 용출되는 부틸 세파로즈 4 고속 유동 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(Pharmacia Biotech, Feiburg, Germany)상에 직접 부하하였다. 파이테이즈를 브레이크-쓰루(break-through)로 용출시키고, 농축시키고, 120mL들이 세파크릴 S-300 겔 투과 크로마토그래피 칼럼(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)에 부하하였다. 진균 콘센서스 파이테이즈 및 진균 콘센서스 파이테이즈 7를 균일하게 대칭인 피크로서 용출하며 SDS-PAGE로 확인하였을 때 약 95% 정제율을 나타내었다.
실시예 6
한세눌라 폴리모파에서의 진균 콘센서스 파이테이즈 유전자 fcp 및 이의 변형물의 발현
한세눌라 폴리모파를 형질전환시키는데 사용된 파이테이즈 발현 벡터를 한세눌라 폴리모파 발현 벡터 pFPMT121의 다중 콜로닝 부위내로 콘센서스 파이테이즈를 암호화하는 pBsk-fcp의 Eco RI 분획 또는 변형물을 삽입함으로써 제조하고, 이는 ura3 선택 마커(marker) 및 FMD 프로모터를 기준으로 한다. fcp 유전자의 5' 말단을 FMD 프로모터에 융합시키고, 3' 말단을 MOX 터미네이터에 융합시킨다[겔리센(Gellissen) 등, 1996; EP 제 0299108 B 호]. 생성된 발현 벡터는 pFPMTfcp 및 pBskfcp7를 지칭한다.
구축된 플라스미드를 E. coli내에서 증식시켰다. 플라스미드 DNA를 당해 분야의 표준 공정을 사용하여 정제하였다. 발현 플라스미드를 겔리센 등(1996)에서 기술된 바와 같이 컴피튼트 세포를 제조하고 효모를 형질전환시키는 절차를 사용하여 오로티딘-5'-포스페이트 데카복실레이즈(ura3)가 결핍된 한세눌라 폴리모파 균주 RP11로 형질전환시켰다. 각각의 형질전환 혼합물을 2%의 글루코즈 및 1.8%의 아가를 함유하는 YNB(0.14%의 w/v 디프코(Difco) YNB 및 0.5%의 황산 암모늄)상에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 4 내지 5일 후, 각각의 형질전환체 콜로니를 선택하여 37℃에 2일 동안 상기 기술된 액체 배지내에 배양하였다. 후속적으로, 이 배양액의 분취량을 2%의 글루코즈를 함유하는 YNB-배지가 있는 신선한 바이알에 접종하는데 사용하였다. 선택 배지내에서 추가로 7회 계대배양한 후, 발현 백터는 다량체 형태로 효모 게놈에 통합되었다. 후속적으로, 3mL의 비선택적 액체 배지(YPD, 2%의 글루코즈, 효모 추출물 10g 및 펩톤 20g)에서 두회의 추가 배양 단계에 의해 유사분열에도 안정한 형질전환체를 수득하였다. 유전적으로 동종의 재조합 균주를 수득하기 위해, 최종 안정화 배양액으로부터의 분취량을 선택성 플레이트상에 도말하였다. 단일 콜로니들을 단리하여 fmd 프로모터를 억제하기 위해 글루코즈 대신 2%의 글리세롤을 함유하는 YNB내에서 파이테이즈 발현을 분석하였다. 진균 콘센서스 파이테이즈를 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제하였다.
실시예 7
아스페르질루스 니거에서의 진균 콘센서스 유전자 fcp 및 이의 변형물의 발현
플라스미드 pBsk-fcp 또는 fcp 유전자의 변형물의 상응하는 플라스미드를, 유전자의 개시 코돈의 Bsp HI-부위 업스트림(upstream) 및 종결 코돈의 Eco RV-부위 다운스트림(downstream)을 도입하기 위한 주형으로서 사용하였다. 익스팬드(Expand, 상표명) 하이 피델러티 PCR 킷트(High Fidelity PCR Kit)(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 하기 프라이머와 함께 사용하였다:
프라이머 Asp-1:
Bsp HI
5'-TAT ATC ATG AGC GTG TTC GTC GTG CTA CTG TTC-3'
fcp 및 fcp7의 클로닝을 위한 프라이머 Asp-2:
3'ACC CGA CTT ACA AAG CGA ATT CTA TAG ATA TAT-5'
Eco RV
공급자가 설명한 대로 반응시켰다. PCR-증폭된 fcp 유전자는 프라이머 Asp-1에 의해 도입된 개시 코돈에서 새로운 Bsp HI 부위를 갖고, 이로인해 두번째 아미노산 잔기 글리신이 세린으로 치환되었다. 후속적으로, DNA-단편을 Bsp HI 및 Eco RV로 분해시키고, 아스페르질루스 니거의 글루코아밀레이즈 프로모터(glaA)의 Nco I 부위 다운스트림 및 아스페르질루스 니둘란스 트립토판 C 터미네이터(trpC)의 Eco RV 부위 업스트림으로 라이게이션하였다[물라니(Mullaney) 등, 1985]. 이 클로닝 단계 후, PCR에 의해 도입될 수 있는 결점을 탐색하기 위해 유전자를 서열화하였다. 생성된 발현 플라스미드는 기본적으로 EP 제 684 313 호의 실시예 9에 기술된 바와 같은 pGLAC 벡터에 상응하고, 선택 마커로서 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 오로티딘-5'-포스페이트 데카복실레이즈 유전자(pyr4)를 함유한다. 아스페르질루스 니거의 형질전환 및 콘센서스 파이테이즈 유전자의 발현을 EP 제 684 313 호에 기술된 바와 같이 수행하였다. 진균 콘센서스 파이테이즈를 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제하였다.
실시예 8
진균 콘센서스 파이테이즈의 무테인의 구축
아스페르질루스 니거, 사카로마이세스 세레비시애 또는 한세눌라 폴리모파에서 발현시키기 위한 무테인을 제조하기 위해, 진균 콘센서스 파이테이즈 유전자를 함유하는 상응하는 발현 플라스미드를, 부위-지향성 돌연변이 발생을 위한 주형으로 사용하였다. 상응하는 프라이머를 사용하여 제작자의 프로토콜에 따라 스트라타젠(La Jolla, CA, USA)의 "퀵 익스체인지(quick exchange, 상표명) 부위-지향된 돌연변이 발생 킷트"를 사용하여 돌연변이시켰다. 만들어진 모든 돌연변이체 및 상응하는 프라이머를 표 4에 요약한다. 요구되는 돌연변이를 함유하는 클론을 당해 분야에 공지된 바와 같이 DNA 서열 분석에 의해 식별하였다. 돌연변이된 파이테이즈를 전체 유전자를 서열화하여 검정하였다.
실시예 9
콘센서스 파이테이즈 및 이의 변형물의 파이테이즈 활성 및 최적 온도의 측정
파이테이즈 활성을 미첼 등(1997)에 의해 기술된 바를 기초로하여 측정하였다. 활성을 0.5%의 파이트산(약 5mM) 및 pH 5.0, 200mM의 아세트산 나트륨을 함유하는 분석 혼합물에서 정량화하였다. 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 동일한 부피의 15%의 트리클로로아세트산를 첨가함으로써 반응을 종결하였다. 100㎕의 검정 혼합물을 물 900μL 및 0.6M의 H2SO4 1mL, 2%의 아스코브산 및 0.5%의 암모늄 몰리브데이트와 혼합함으로써 유리된 포스페이트를 정량화하였다. 인산칼륨의 표준 용액을 기준으로 사용하였다. 효소 활성의 1 유닛을 37℃에서 1 분당 1μ몰의 포스페이트를 방출하는 효소의 양으로서 정의하였다. 파세(Pace) 등(1995)에 따라 계산된 280nm에서의 효소 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다: 진균 콘센서스 파이테이즈, 1.101; 진균 콘센서스 파이테이즈 7, 1.068.
pH-최적 곡선의 경우, 정제된 효소를 pH 5.0의 10mM의 아세트산 나트륨에서 희석하였다. 희석된 단백질 분취량을 동일한 부피의 하기 일련의 상이한 완충액중의 1%의 파이트산(약 10mM)과 혼합함으로써 배양을 시작하였다: 0.4M의 글리신/HCl, pH 2.5; 0.4M의 아세테이트/NaOH, pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5; 0.4M의 이미다졸/HCl, pH 6.0, 6.5; 0.4M의 트리스/HCl, pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0. 대조 시험에 의하면 pH가 혼합 단계에 의해 아주 약하게 영향을 받는다. 상기 기술된 바와 같이 37℃에서 15분 동안 배양하였다.
파이테이즈의 기질 특이성을 측정하기 위해, 분석 혼합물내의 파이트산을 5mM의 농도의 각각의 포스페이트 화합물로 대체하였다. 활성 시험을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
최적 온도를 측정하기 위해, 효소(100μL) 및 기질 용액(100μL)을 주어진 온도에서 5분 동안 예비-배양하였다. 효소에 기질 용액을 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 15분 동안 배양한 후, 트리클로로아세트산을 이용하여 반응을 종결시키고, 방출된 포스페이트의 양을 측정하였다.
원래의 진균 콘센서스 파이테이즈의 최적 pH는 약 pH 6.0 내지 6.5(70U/mg)이었다. Q50T 돌연변이의 도입에 의해 최적 pH-값이 pH 6.0(130U/mg)로 이동한 반면, 동일한 위치에서 루신으로 치환한 경우 pH 5.5(212U/mg) 부근에서 최대 활성을 나타내었다. Q50G 교체로 인해 상기 활성의 최적 pH-값이 pH 6.0을 초과하였다(도 2를 참고). 위치 51에서 티로신을 아스파라긴으로 대체함으로써 pH 5.0 이하에서 활성이 상대적으로 증가하였다(도 3을 참고). 특히 Q50L 돌연변이에 의해, 진균 콘센서스 파이테이즈의 파이테이트에 대한 특이성이 급격하게 증가하였다(도 4를 참고).
진균 콘센서스 파이테이즈의 최적 온도(70℃)는 콘센서스 서열을 계산하는데 사용된 야생형 파이테이즈의 최적 온도(45 내지 55℃)보다 15 내지 25℃ 높았다(표 5 및 도 1을 참고).
실시예 10
시차 주사 열량계(DSC)에 의한 융점의 측정
진균 콘센서스 파이테이즈의 풀림(unfolding) 온도를 측정하기 위해, 브루거(Brugger) 등(1997)에 의해 이미 공개된 바와 같이 시차 주사 열량계를 적용하였다. 동종 파이테이즈 50 내지 60mg/mL의 용액을 시험에 사용하였다. 10℃/분의 일정한 가열 속도를 90℃까지 적용하였다.
측정된 융점은 야생형 파이테이즈와 비교했을 때 진균 콘센서스 파이테이즈가 매우 개선된 열안정성을 가짐을 명확하게 나타낸다(표 5 및 도 5를 참고). 도 5는 진균 콘센서스 파이테이즈 및 이의 돌연변이체 Q50T의 용융 프로파일을 제시한다. 통상적인 융점은 78 내지 79℃의 범위로 측정되었다.
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이는 진균 파이테이즈의 콘센서스 서열을 계산하는데 사용되는 가중치를 제시한다.
정렬에 사용된 파이테이즈의 아미노산 서열을 표준 매개 변수를 사용하여 프로그램 GAP(GCG 프로그램 팩키지, 9; 데베록스(Devereux) 등., 1984)으로 비교하였다. 다소 다양한 신호 펩타이드가 없는 정렬(서열 1의 범례를 참고)을 위해 사용된 서열 부분만 비교하였다. 대각선의 위와 아래의 숫자는 각각 아미노산 동일성 및 상사성을 나타낸다.
프로그램 GAP(GCG 프로그램 팩키지, 9.0)를 사용하여 모든 파이테이즈의 아미노산 서열을 진균 콘센서스 파이테이즈 서열과 비교하였다. 또다시, 정렬에 사용된 서열 부분만 비교하였다.
각각의 돌연변이를 도입하기 위해, 목적하는 돌연변이를 함유하는 두개의 프라이머가 필요하였다(실시예 8을 참고). 변화된 코돈을 볼드체(bold) 문자로 강조하였다.
최적 온도는 도 1로부터 얻는다. Tm-값은 실시예 10에 기술되고 도 5에 제시된 바와 같이 시차 주사 열량계에 의해 측정되었다.
하기에 기재하는 서열 1은 거의 모두 공지된 진균 파이테이즈 아미노산 서열의 정렬로부터 콘센서스 파이테이즈 서열을 계산한 것이다. 문자들은 단일 문자 코드로 표현된 아미노산 잔기를 나타낸다. 하기 서열이 정렬에 사용되었다: 아스페르질루스 테레우스(Aspergillus terreus) 9A-1로부터의 phyA[미첼(Mitchell) 등., 1997; 아미노산 (aa) 27로부터], 아스페르질루스 테레우스 cbs116.46으로부터의 phyA[판 룬(van Loon) 등., 1997; aa 27로부터], 아스페르질루스 니거 변종 아와모리로부터의 phyA(피딩톤 등., 1993; aa 27로부터), 아스페르질루스 니거 T213으로부터의 phyA(aa 27로부터), 아스페르질루스 니거 균주 NRRL3135로부터의 phyA(판 하팅스벨트 등., 1993; aa 27로부터), 아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 13073으로부터의 phyA[파사몬테스(Pasamontes) 등., 1997b; aa 25로부터], 아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 32722로부터의 phyA(판 룬 등., 1997; aa 27로부터), 아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 58128로부터의 phyA(판 룬 등., 1997; aa 27로부터), 아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 26906으로부터의 phyA(판 룬 등., 1997; aa 27로부터), 아스페르질루스 푸미가투스 ATCC 32239로부터의 phyA(판 룬 등., 1997; aa 30으로부터), 아스페르질루스 니둘란스로부터의 phyA(파사몬테스 등., 1997a; aa 25로부터), 탈라로마이세스 써모필루스로부터의 phyA(파사몬테스 등., 1997a; aa 24로부터), 미셀리옵토라 써모필라로부터의 phyA(미첼 등., 1997; aa 19로부터). 정렬은 프로그램 PILEUP을 사용하여 산출되었다. 갭(gap)의 위치는 수작업으로 규정된다. 주어진 위치에서 정렬내의 대문자화된 아미노산 잔기는 콘센서스 잔기를 수립하는 아미노산 연합에 속한다. 계산된 콘센서스 서열 아래에 볼드체로, 최종적으로 구축된 진균 콘센서스 파이테이즈(Fcp)의 아미노산 서열이 제시된다. 산출된 콘센서스 서열내의 갭은 실시예 2에 기술된 이론에 따라 손으로 채워진다.
서열 2는 진균 콘센서스 파이테이즈 유전자(fcp) 및 유전자 구축을 위해 합성된 프라이머의 DNA 서열이다. 계산된 아미노산 서열(서열 1)은 프로그램 BACKTRANSLATE(데버룩스 등., 1984) 및 높게 발현되는 효모 유전자의 코돈 빈도 표(GCG 프로그램 팩키지, 9.0)를 사용하여 DNA 서열로 전환되었다. 아스페르질루스 테레우스 cbs에서 나온 파이테이즈의 신호 펩타이드를 N-말단에 융합시킨다. 볼드체 염기는 유전자를 만들기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오타이드의 명칭은 서열의 위 또는 아래에 나타낸다. 및줄친 염기는 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈을 나타낸다. 이탤릭체로 표기된 염기는 두개의 도입된 Eco RI 부위를 나타낸다.
[서열 1a]
[서열 1b]
[서열 1c]
[서열 1d]
[서열 2a]
[서열 2b]
[서열 2c]
본 발명에 따라서, 아미노산을 아미노산 서열의 진화적 상사성에 대해 비교하는 프로그램을 사용함으로써, 효소 활성, 열 안정성 및 특정-범위에서의 활성이 개선된 콘센서스 단백질, 및 이를 제조하는 신속하고 정확한 방법이 제공되었다.
도 1은 콘센서스 서열을 산출하기 위해 사용된 진균 콘센서스(consensus) 파이테이즈(phytase) 및 다른 파이테이즈의 최적 온도에 관한 것이다. 최적 온도를 측정하기 위해, 파이테이즈 표준 검정은 37℃ 내지 85℃의 일련의 온도에서 수행되었다. 사용된 파이테이즈는 실시예 5에 따라 정제되었다. ▽, 진균 콘센서스 파이테이즈; ▼, 아스페르질루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 13073 파이테이즈; □, 아스페르질루스 니거(Aspergillus niger) NRRL3135 파이테이즈; ○, 아스페르질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 파이테이즈; ■, 아스페르질루스 테레우스(Aspergillus terreus) 9A-1 파이테이즈; ●, 아스페르질루스 테레우스 cbs 파이테이즈.
도 2a 및 2b는 진균 콘센서스 파이테이즈 및 돌연변이체 Q50L, Q50T 및 Q50G의 pH-의존 활성 프로파일에 관한 것이다. 파이테이즈 활성은 상이한 pH-값에서 적합한 완충제내에서의 표준 검정을 사용하여(실시예 9를 참고) 측정되었다. 도 2a는 진균 콘센서스 파이테이즈(●)와 돌연변이체 Q50L(▽), Q50T(▼) 및 Q50G(○)를 비교(활성%)한 것이고, 도 2b는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)에서 발현된 정제된 효소의 특정 활성을 사용한, 진균 콘센서스 파이테이즈(○)와 돌연변이체 Q50L(●) 및 Q50T(▽)를 비교한 것이다.
도 3a 및 3b는 돌연변이체 Q50L, Y51N 및 Q50T, Y51N과 진균 콘센서스 파이테이즈의 돌연변이체 Q50T 및 Q51L의 pH-의존 활성 프로파일의 비교에 관한 것이다. 파이테이즈 활성은 상이한 pH-값에서 적합한 완충제(실시예 9를 참고)에서 표준 검정을 사용하여 측정된다. 도 3a는 돌연변이체 Q50L(○)에 대한 돌연변이 Y51N(●)의 영향을 나타내고, 도 3b는 돌연변이체 Q50T(○)에 대한 동일한 돌연변이(●)의 영향을 나타낸다.
도 4는 진균 콘센서스 파이테이즈 및 이의 돌연변이체 Q50L, Q50T 및 Q50G의 기질 특이성에 관한 것이다. 막대는 다양한 공지된 천연 및 합성 인산화된 화합물에 대한 활성을, 파이트에 대한 활성(100%)과 비교한 상대 활성을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 진균 콘센서스 파이테이즈 및 이의 돌연변이체 Q50T의 시차 주사 열량계(DSC)에 관한 것이다. 단백질 샘플은 약 50 내지 60mg/mL으로 농축되고 pH 5.0의 10mM 아세트산 나트륨에 대해 광범위하게 투석되었다. 10℃/분의 일정한 가열 속도는 90℃까지 적용되었다. 콘센서스 파이테이즈 Q50T(도 5a)의 DSC는 78.9℃의 용융 온도를 나타내고, 이는 진균 콘센서스 파이테이즈의 융점(78.1℃, 도 5b)과 거의 동일하다.

Claims (3)

  1. 서열 2에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 콘센서스 단백질, 또는 효소 활성의 유형 및 비활성, 열안정성, 특정 pH 범위에서의 활성(pH-안정성)과 같은 기본 성질이 유의하게 변화되지 않은 그의 변형물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열 2의 아미노산 서열에서, Q50L, Q50T, Q50G, Q50T-Y51N 또는 Q50L-Q51N의 치환이 이루어졌음을 특징으로 하는 콘센서스 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 청구된 바와 같은 콘센서스 단백질을 포함하는 식품 또는 사료.
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