MX2011003132A - Variantes de fitasa de hafnia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con fitasas que tienen por lo menos 76% de identidad con una fitasa derivada de Hafnia alvei y que comprende por lo menos una modificación en la secuencia de aminoácidos de la misma. Estas variantes de fitasa tienen propiedades modificadas, preferiblemente mejoradas tales como sensibilidad reducida a proteasa, preferiblemente presentan propiedades mejoradas respecto al desempeño térmico tales como estabilidad al calor (estabilidad a la temperatura, termoestabilidad), estabilidad al vapor, estabilidad al granulado y/o perfil de temperatura; y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad a pepsina, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, desempeño en pienso animal (tal como liberación mejorada y/o degradación de fitato) susceptibilidad a glucación y/o patrón de glucosilación. La invención también se relaciona con ADN que codifica para estas fitasas, método para su producción así como el uso de las mismas, por ejemplo, en pienso animal y aditivos de pienso animal.

Description

VARIANTES DE FITASA DE HAFNIA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una fitasa la cual tiene por lo menos 76% de identidad con una fitasa derivada de Hafnia alvei, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en el listado de secuencias que se anexa como la SEC ID NO: 2 y comprende por lo menos una modificación en comparación con esta fitasa (es decir, es una variante de la misma) . La invención también se relaciona con ADN que codifica para estas fitasas, construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos así como métodos de su producción, así como el uso de los mismos, por ejemplo en pienso para animales y aditivos de pienso para animales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las fitasas son enzimas bien conocidas dado que agregan las ventajas de adicionarlas a los productos alimenticios para animales, incluyendo humanos. Las fitasas se han aislado de diversas fuentes que incluyen muchas cepas micóticas y bacterianas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos alternativos que tengan actividad de fitasa (fitasas) y polinucleótidos que codifican para los polipéptidos. Estas variantes de fitasa de la invención presentan propiedades modificadas o alteradas, Ref.: 218370 preferiblemente mejoradas, en comparación con la fitasa original. Los ejemplos no limitantes de estas propiedades son: estabilidad (tal como estabilidad al ácido, estabilidad al calor, estabilidad al vapor, estabilidad al granulado y/o estabilidad a la proteasa, en particular estabilidad a pepsina) , perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, desempeño en pienso animal (tal como liberación mejorada y/o degradación de fitato), susceptibilidad a glucación y/o patrón de glucos i lac ión .

Se conocen numerosas estructuras tridimensionales de fitasas del tipo de fosfato ácido de histidina (HAP, por sus siglas en inglés) (por ejemplo Lim et al. Nature struct . biol . 7, 108-113 (2000)) . Estas fitasas están relacionadas estructuralmente porque existen diferencias muy grandes en las secuencias de aminoácidos.

El documento PCT/EP2008 / 053561 describe una secuencia de aminoácidos de una fitasa HAP natural de Hafnia alvei DSM 19197 (es decir, la SEC ID NO: 2 en la presente) , como la SEC ID NO: 10 en PCT/EP2008/053561. La estructura tridimensional de la fitasa HAP natural de Hafnia alvei DSM 19197 también se describe en PCT/EP2008 / 053561. La estructura - - corresponde bien con las estructuras conocidas.

Un objetivo de la invención es proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente o mejoradas en comparación con la fitasa original o de referencia de la cual se derivan.

SUMARIO DEL LISTADO DE SECUENCIA En el listado de secuencia, la SEC ID NO: 1 y 2 proporcionan secuencias de ADN y de aminoácidos para la fitasa de Hafnia alvei DSMZ 19197.

SUMARIO DE LOS EJEMPLOS En la especificación se proporcionan los siguientes ejemplos: Ejemplo 1: Preparación de variantes y determinación de actividad Ejemplo 2: Actividad específica Ejemplo 3: Estabilidad a la temperatura Ejemplo 4: Te rmoe s t ab i 1 i dad Ejemplo 5: Perfil de temperatura Ejemplo 6: Perfil de pH Ejemplo 7: Estabilidad al vapor Ejemplo 8: Actividad residual de glucación Ejemplo 9: prueba de estabilidad de sedimentación Ejemplo 10: Desempeño en pienso animal en un modelo in vitro para pollos.

Ejemplo 11: Desempeño en un ensayo en cerdos m vivo.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una fitasa la cual tiene por lo menos 76% de identidad con los residuos aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2 y la cual comprende por lo menos una modificación en por lo menos una posición que se selecciona de las siguientes: 139, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28', 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 48, 49, 54, 55, 59 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 77, 78, 79, 80 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, , 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112 113, 115 116 117, 118, 119, 120 121, 122, 123, 124, 125 126, 128 130 131, 132, 133, 134 136, 137, 138, 140, 143 144, 145 146 147, 148, 149, 150 151, 152, 153, 154, 155 156, 158 159 160, 161, 162, 163 168, 172, 173, 175, 176 177, 178 179 180, 181, 182, 183 184, 185, 186, 187, 189 190, 192 193 194, 195, 196, 198 199, 200, 201, 202, 203 204, 205 206 207, 208, 209, 211 215, 217, 219, 221, 224 227, 228 230 233, 234, 235, 236 238, 239, 240, 241, 242 243, 244 245 246, 247, 248, 249 251, 256, 258, 259, 260 261, 266 268 270, 279, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290 292, 293 294 295, 296, 297, 298 299, 301, 303, 304, 308 310, 312 313 314, 316, 318, 319 320, 322, 324, 325, 331, 335 343 344, 345, 346, 347 348, 354, 355, 356, 358, 360, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388,389, 390, 391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404, 406, 408, 409, 411, 412 y 413, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, con la condición de que la fitasa no es la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2.

La presente invención se relaciona adicionalmente con una fitasa la cual tiene por lo menos 76% de identidad con los residuos aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2 y la cual comprende por lo menos una modificación en por lo menos una posición que se selecciona de las siguientes: 139. 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 , 123 , 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133 , 134, 136, 137, 138, 140, 143, 144, 145, ' 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 , 153, 154 , 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163 , 168, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 , .182 , 183 , 184, 185, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202 , 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227, 228, 230, 233 , 234 , 235 , 236 , 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261, 266, 268, 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312, 313, 314, 316, 318, 319, 5 320, 322, 324, 325, 326, 331, 335, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 354, 355, 356, 358, 360, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404, 406, 408, 409, 411, 412 y 413; y por lo 10 menos una modificación adicional de por lo menos una posición que se selecciona de las siguientes: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 15 92, 93, 95, 96, 97.98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 134> 136, 137, 138, 139, 140, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 168, 172, 173, 20 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227, 228, 230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, __. 259, 260, 261, 266, 268, 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312, 313, 314, 316, 318, 319, 320, 322, 324, 325, 326, 331, 335, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 354, 355, 356, 358, 360, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404, 406, 408, 409, 411, 412 y 413, con la condición de que la fitasa no sea la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO : 2.

La invención también se relaciona con una fitasa la cual tiene por lo menos 76% de identidad con los residuos aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2 y la cual comprende por lo menos una modificación en por lo menos una posición que se selecciona de las siguientes modificaciones: 8L, C, 9K,P,S, 10V, 12S, R, 16V, 18K, 25A, 26R,Q, 27A, 28A, 29P, R, K, A, 30P,L, 311, 32Q,I,L, 33C, N, 35C, 36C, 37D,R,K, 38A, 41T, 45P, 48H,W,N, 49L, 54C,G, 55E, 59R,K, 63C, 66C, 68L, 69E,L, 70E, 74S, 75A, 76R,V, 77K,G,W, 78G,R,K,Q,S, 79L, 81E, 82S, 83G, 92Y, 93P,E,N, 95P,A, 96N,V, 97R, 100W, 101C, 103A, 109D, 111R,K,S, 112S, 115L, M,R,K, 116S,T,N, 117A,Q, 118A,N, E, P, T, 119D,K,E, 120G,L,I,M, 121A, S , T, G, K, 122A,S,T,K, 123P, M, V, A, T, 128N,R, 130L, 131R, 132T,V, 134V, 136Q, 137L, 138N,V, 139C,R, 140P, 143C,V, 144R, 148R, 150C, 151D, 160G, 162N,R, 163P, 168V, 172C, 173N, 175N,S 176C,Q, 177C, 178C,E 179C,L, , 181L, 185R,K, 186S,T, 187E, 190N, 193R, 195L, 198E, 199C, 201C, 202A,K, 203Y, 206G,T,A, 207N,L, 208A, 2098, 211T,R, 215S, 217S,G, 219M,L, 221T,G, 224C, 227Q, 228C,Q, 230E, 234L,R,C,V, 235P, 236C, 239R, 243P, 244P, 245E, 246N, 247D, 248T, 249S,T, 2518,D,E,R, 256D,A, 258Y, 259C, 260L, 261F,Q,A, 268R, 270R, 284P, 285D, 286T, 287P, 288P, 293R,K,N, 298S, 299R, 301M, 308A, 310L, 312A, 313L, 314G, 316P,A, 318E, 319L, 320N, 325C,K, 326C, 331C,S,T, 335E, 343C, 344K, 346S,T, 347R, 348D,E,S,R 354L, 355S,T, 356F, 358C, 360P,Q, 362M, 363C,R,K,V, 365K, 366T, 368C, 369S, 370C, 374C,P, 376E, 378K, 380, 382S,T, 383N, 394N, 395E, 396D,E, 401N, 403N, y 411S.

Las variantes de fitasa de la invención presentan propiedades modificadas o alteradas, preferiblemente mejoradas en comparación con la fitasa original. Los ejemplos no limitantes de estas propiedades son: estabilidad (tal como estabilidad al ácido, estabilidad al calor, estabilidad al vapor y/o estabilidad a proteasa, en particular estabilidad a pepsina) , perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, desempeño en pienso animal (tal como una liberación y/o degradación mejorada de fitato) , susceptibilidad a glucación y/o patrón de glucosilación . Las variantes de fitasa de la invención preferiblemente presentan propiedades mejoradas respecto al desempeño térmico, tal como estabilidad térmica (estabilidad a la temperatura, termoestabilidad) , estabilidad al vapor, estabilidad al granulado y/o perfil de temperatura; y/o - - estabilidad a proteasa, en particular estabilidad a pepsina, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, desempeño en pienso animal (tal como liberación mejorada y/o degradación de fitato) , susceptibilidad a glucación y/o patrón de glucosilación.

La invención también se relaciona con ADN que codifica para estas fitasas, métodos para su producción así como el uso del mismo, por ejemplo en pienso animal y en aditivos de pienso animal.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una fitasa la cual tiene por lo menos 76% de identidad con la SEC ID NO: 2 y la cual comprende por lo menos una modificación en por lo menos una posición que se selecciona de las siguientes: 139, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63 , 64 , 66 , 68, 69, 70, 71, 72 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, ni, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 168, 172, 173 , 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 , 184 , 185, 186 , 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227, 228, 230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261, 266, 268, 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312, 313, 314, 316, 318, 319, 320, 322, 324, 325, 326, 331, 335, 343 , 344 , 345, 346 , 347, 348, 354, 355, 356, 358, 360, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374 , 375, 376, 378, 382, 383 , 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404, 406.408, 409, 411, 412, y 413. El porcentaje de identidad se determina como se describe en la sección "polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad".

Los números de posición se refieren a la numeración de posición de la SEC ID NO: 2, como se describe en la sección "numeración de posición" . Las posiciones que corresponden a estos números de posición de la SEC ID NO: 2 en otras fitasas se determina como se describe en la sección "identificación de los números de posición correspondientes".

La fitasa de la invención es una variante de la fitasa de la SEC ID NO: 2, es decir, no es idéntica a la SEC ID NO: 2, dado que comprende por lo menos una modificación en comparación con la SEC ID NO: 2.

En una modalidad preferida, la fitasa de la invención comprende por lo menos una de las siguientes - - modificaciones: 8L,C, 9K,P,S, 10V, 12S,R, 16V, 18K, 25A, 26R,Q, 27A, 28A, 29P,R,K,A, 30P,L, 311, 32Q,I,L, 33C,N, 35C, 36C, 37D,R,K, 38A, 41T, 45P, 48H, ,N, 49L, 54C,G, 55E, 59R,K, 63C, 66C, 68L, 69E,L, 70E, 74S, 75A, 76R,V( 77K,G,W, 78G,R,K,Q,S, 79L, 81E, 82S, 83G, 92Y, 93P,E,N, 95P,A, 96N,V, 97R, 100 , 101C, 103A, 109D, 111R,K,S, 112S, 115L,M,R,K, 116S,T,N, 117A,Q, 118A, , E, P, T, 119D,K,E, 120G,L,I;M, 121A,S,T,G,K, 122A,S,T,K, 123P, M, V, A, T, 128N,R, 130L, 131R, 132T,V, 134V, 136Q, 137L, 138N,V, 139C,R, 140P, 143C,V, 144R, 148R, 150C, 151Q, 160G, 162N,R, 163P, 168V, 172C, 173N, 175N,S 176C,Q 177C, 178C,E 179C,L,W, 181L, 185R,K, 186S,T, 187E, 190N, 193R, 195L, 198E, 199C, 201C, 202A,K, 203Y, 206G,T,A, 207N,L, 208A, 209S, 211T,R, 215S, 217S,G, 219 ,L, 221T,G, 224C, 227Q, 228C,Q, 230E, 234L,R,C,V, 235P, 236C, 239R, 243P, 244P, 245E, 246N, 247D, 248T, 249S,T, 251S,D,E,R, 256D,A, 258Y, 259C, 260L, 261F,Q,A, 268R, 270R, 284P, 285D, 286T, 287P, 288P, 293R,K,N, 298S, 299R, 301M, 308A, 310L, 312A, 313L, 314G, 316P,A, 318E, 319L, 320N, 325C,K, 326C, 331C,S,T, 335E, 343C, 344K, 346S,T, 347R, 348D,E,S,R 354L, 355S,T, 356F, 358C, 360P,Q, 362M, 363C,R,K,V, 365K, 366T, 368C, 369S, 370C, 374C,P, 376E, 378K, 380, 382S,T, 383N, 394N, 395E, 396D,E, 401N, 403N, y 411S.

La nomenclatura utilizada en la presente para modificaciones se describe detalladamente en la sección "modificaciones, tales como sustituciones, supresiones o - - inserciones" .

Preferiblemente, la fitasa de la invención que presenta termoestabilidad mejorada comprende por lo menos una de las siguientes modificaciones: 8C, 33C 35C, 36C, 54C, 63C, 66C, 101C, 139C, 143C, 201C, 150C, 172C, 176C, 177C, 178C. 179C, 224C, 228C, 236C, 259C, 325C, 326C, 331C, 343C, 358C, 363C, 368C, 370C, 374C. Específicamente, comprende conjuntos de modificaciones que se seleccionan de lo siguiente: 8C/343C, 139C/201C, 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 8C/343C en combinación con 139C/201C, 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 139C/201C en combinación con 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 179C/33C en combinación con 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 178C/33C en combinación con 172C/35C, - - 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C. 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 172C/35C en combinación con 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 177C/36C en combinación con 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C. 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 176C/36C en combinación con 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 143C/201C en combinación con 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C. 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 54C/101C en combinación con 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 63C/368C en combinación con 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 66C/370C en combinación con 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones - - como 224C/236C en combinación con 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 150C/259C en combinación con 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La 5 invención también comprende tales combinaciones como 331C/326C en combinación con 358C/325C, 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 358C/325C en combinación con 228C/363C, o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 10 228C/363C en combinación con 368C/374C.

En otras modalidades para mejorar la termoestabilidad, la fitasa comprende una modificación que se selecciona de las siguientes: 29P, 30P, 93P, 95P, 140P, 163P, 235P, 243P, 244P, 284P, 287P, 288P, 316P, y 360P.

^ La fitasa también comprende una modificación que se selecciona de las siguientes: 8L, 9K, 12S, 16V, 27A, 30.L, 32Q, 37D, 38A, 41T, 48W, 49L, 54G, 55E, 75A, 77K, 78G, 93E, 103A, 109D, 128N, 130L, 132T, 134V, 136Q, 137L, 173N, 176Q, 195L, 198E, 206T, 207N, 209S, 211T, 215S, 219M, 221T, 227Q, 20 228Q, 248T, 258Y, 260L, 261Q, 310L, 313L, 314G, 316A, 318E, 319L, 320N, 335E, 354L, 356F, 360Q, 362M, 251S, 363R, 365K, 366T, 369S, 374P, 376E, 378K y 411S.

La fitasa también puede comprender una modificación que se selecciona de las siguientes: 9R, 29R,K, 37R,K, 59R,K, _c 69E, 70E, 78R,K, 81E, 93E, 111R,K, 115R,K, 119D, 185R,K, 230E, 239R, 245E, 251D,E, 293R,K, 348D,E, 363R,K, 395E, y 396D,E.

La fitasa también puede comprender una modificación que se selecciona de las siguientes: 12R, 25A, 26R, 28A, 29A, 30L, 45P, 48W, 76R, 97R, 117A, 118A, 119D, 120L, 121A, 122A, 131R, 139R, 148R, 176R, 179L, 187E, 202A, 206A, 207L, 219L, 234R, 251R, 261A, 268R, 270R, 299R, 347R, 256A. 308A y 312A.

Además, la eficacia de la fitasa se puede mejorar cuando comprende una modificación que se selecciona de las siguientes: 311, 1201, I134V, N202K, D203Y, y V208A.

En modalidades específicas que mejoran la eficiencia de la fitasa, los residuos aminoácidos entre las posiciones 180 y 189 han sido sustituidos por un péptido pequeño que tiene una longitud de 4 , 5, 6, 7 u 8 residuos aminoácidos, especialmente los pentapéptidos QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV o KTDKL y/o también comprende los residuos aminoácidos entre las posiciones 115 y 124 que han sido sustituidos por un péptido pequeño que tiene una longitud de 5 , 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos aminoácidos, especialmente el octapéptido TQADTSSP.

En modalidades preferidas adicionales, la fitasa comprende las siguientes combinaciones de modificaciones: 54C/55E/101C, 33C/178E/179C y 33C/175S/176Q/178E/179C .

La fitasa de la invención puede ser una variante de cualquier fitasa natural o variante.

Específicamente para la fitasa de la SEC ID NO: 2, se incluyen las siguientes modificaciones específicas: M31I, 1201, I134V, N202K, D203Y, V208A, Y179W, A221G, R32I, R32L, D77G, D77 , T95A, D111S, K234C, K234V, K251S, H363V, H363R, D293R, Q93E, P348S, Q69L, Q245E, N78Q, 76V, G325K, G325G, A217G, A132T y las siguientes variantes de combinación: A132V/Q162R, A132V/Q181L, A132V/E211R, A132V/D83G, A132V/A217G, A132V/A217S, E100W/H363R D138V/Y48H, A132V/A217G, A132V/Q162R/Q181L/A217G, P348R/H363R, Q9S/D92Y, Q9P/L10V/D92Y/H115M, Q9P/L10V/D92Y/H115/L, D92Y/H115M, D92Y/H115M/L, D92Y/H115M, E100W/A217G/H363R, A217G/K251S, E100 /A217G/K251S, E100 /K251S, E100W/I555V/A217G, Q9S/E100W/R160G/A217G/H363R, D92Y/E100W/A217G/H363R, E100W/H115M/A217G/H363R, E100W/A217G/P348R/H363R, Q9S/A89A/D92Y/H115M/A217G/H363R, N78Q/E100W/A217G/H363R, K76V/N78Q/E100W/A217G/H363R, D83G/E100W/A217G/H363R, E100W/Y179 /A217G/H363R, E100W/A217G/K234V/K251E/-I286T/H363R, E100W/A217G/K234V/P348R/H363R, Q9S/R18K/A89A/D92Y/H115M/A217G/K234V/H363R, Q9S/D92Y/-H115M/A217G/K234V/H363R, Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115M/K234V/-P348R/H363R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/- Q181L/A217G/K234V/P348R, Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/-Q193R/I201C/A217G/H363R, E54C/N78S/D92Y/A101C/H143C/-L199C/A217G/H363R, E54C/A101C/M168V/A217G/H363R, P82S/D92Y/E100 /H143C/I201C/A217G/H363R, P82S/D92Y/E100W/ - H143C/I201C/A217G/H363R, Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115M/ - A217G/K234V/P348R/H363R, D92Y/A217G/K234V/H363R( Y64S/D92Y/E100 /Y179W/A217G/H363R, D92Y/A217G/H363R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/H143C/Q162R/Q181L/I201C/A217G/ K234V/P348R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/- Q162R/Q181L/I201C/A217G/ 234V/P348R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/ - H115M/A132V/K139C/Q162R/Q181L/L199C/A217G/K234V/L301M/P348R, Q9SN78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/Y179W/Q181L/A217G/K234V/P 348R, D92Y/E100 /A217G/H363R/+D33C/Y179C, D92Y/E100W/A217G/H363R1+116-123 (HQQNTQQA- >TQADTSSP) D92Y/E100W/H116T/Q118A/N119D/Q121S/Q122S/A123P/A217G/H363R, Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/A217G/N298S/H363R + 116-123 (HQQNTQQA- >TQADTSSP) = Q9S/E54C/D92Y/A 101C/H116T/Q118A/N119D/Q121S/Q122S/A123P/H143C/Q193R/I201C/A2 17G/N298S/H363R, Q9S/N78Q/-A89A/D92Y/H115M/132V/Q162R/Y179W/A217G/K234V/P348R/H363R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/Y179W/A217G/K234V/S261F/ P348R/H363R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/ - 132V/K139C/G151D/Q162R/Y179W/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R, D92Y/E100 /K139C/I201C/A217G/N247D/H363R, E54C/D92Y/A101C/ -168V/A217G/H363R, Q9S/N78Q/A132V/K139C/- 162R/Y179W/I201C/A217G/K234L/P348R/H363R, D92Y/E100 /H143C/ -144R/I201C/A217G/N247D/H363R, D92Y/E100 /H116S/K139C/ - 201C/A217G/N247D/H363R, D92Y/E100 /H128R/K139C/- 143V/I201C/A217G/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/- 206G/A217G/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/- 217G/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/- 217G/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/-217G/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/-217G/N247D/N344K/H363R, D92Y/E100 /K139C/A144S/ - 176E/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, 92Y/E100W/K139C/- 201C/A217G/K234V/N247D/H363R/E54C/H55E/A101C, D92Y/E100W/-139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/ -139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, D92Y/E100 /K139C/-201C/A217G/K234V/N247D/S284C/H363R, D92Y/E100W/K139C/- 201C/A217G/K234V/N247D/T287W/H363R, D92Y/E100W/K139C/ - 201C/A217G/K234V/N247D/R289M/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/-201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, N78Q/D92Y/E100 / -139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100 /K139C/-201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/P348R/H363R, D92Y/E100W/K139C/-162R/Q181A/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100W/-113G/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, D92Y/E100W/T120G o A*/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R/L395L o V, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/S284M/H363R, D92Y/-100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R/A366S, D92Y/E100W/K139C/201C/A217G/K234V/N247 /Q256D/H363R, D92Y-/E100W/H128R/K139C/I201C/A217G/K234V/N247E/Q256D/H363R, D92Y/E100 /K139C/Q141S/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/A144S/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, - - P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R, D92Y/E100W/K139C/D173N/ - P175S/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100W/- 139C/T152A/I201C/A217G/ 234V/N247D/Q256D/I294T/H363R, D33N/D92Y/E100 /K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/-H363R, D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/- K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/T98S/-E100 /K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/L199S/I201C/A217G/K234V/N247W/Q25 6D/H363R, Y48H/D92Y/T98S/E100W/- K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247 /Q256D/H363R, E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/-H363R, D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/- N247W/Q256D/R289W/H363R, Y48H/D92/E100W/K139C/T152I/ - I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/R289W/H363R, Y48H/D92Y/- E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/-E100 /K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/D92Y/E100 /K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/-H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/- K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/- K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R, Y48H/E54C/- D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247 1R289 /H363R, Y48H/E54C/D92Y/E100W/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247 - - W/Q256D/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/ - I201C/208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, T35A/Y48H/E54C/ - P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/ -K139C/T152A/I201C/K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/Q256D/H363R, E54C/P75N/-K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R, E54C/-D92Y/A101C/K139C/I201C/V208T/A217G/H363R, E54C/P75N/K76N/ - D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/I201C/V208T/A217G/H363R, ?48?/-E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/V208T/-A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, E54C/P75N/K76N/ - D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/I201C/V208T/A217G/K234V/N239S/-N247D/D256D/H363R.

La invención también se relaciona con un método para producir una variante de fitasa, de una fitasa de referencia u original que tiene por lo menos 76% de identidad con la SEC ID NO: 2, por lo que esta variante presenta por lo menos una sustitución, inserción o supresión en una o más de las posiciones 139, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54. 55, 59, 63, 64, 66, 88, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 144, 145, - - 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158. 159, 160, 161, 162, 163 , 168, 172 , 173 , 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227, 228, 230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247 , 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261, 266, 268, 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294 , 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303 , 304, 308, 310, 312, 313, 314, 316, 318, 319, 320, 322, 324, 325, 326, 331, 335, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 354, 355, 356, 358, 360 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372 , 373 374, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389 390, 391, 394 , 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404 , 406, 408 409, 411, 412, y 413, en donde la posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, el método comprende, con la condición de que la variante no sea la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, a) mutar el ADN o gen que codifica para la fitasa original de una manera en donde el ADN o gen codifique para la sustitución, inserción y/o supresión, b) enlazar operablemente el ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un hospedador de expresión adecuado para crear una - - construcción (plásmido recombinante) de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferir la construcción o vector a un hospedador adecuado, d) cultivar el hospedador para producir la fitasa variante, y e) recuperar la fitasa.

Específicamente, el método proporciona variantes que tienen propiedades mejoradas con respecto al desempeño térmico que incluyen estabilidad al calor, estabilidad a la temperatura, termoestabilidad, estabilidad al vapor, estabilidad al granulado y/o perfil de temperatura y/o una eficiencia mejorada que incluye un perfil de pH mejorado, una actividad específica mejorada, un patrón de glucosilación alterado, un desempeño mejorado en pienso animal y/o el cual incorpora un cambio de un sitio potencial de ruptura por proteasa y/o sitio de glucación.

ESTRATEGIA PARA PREPARAR VARIANTES La estructura de la fitasa de H. alvei DSM 19197 (aminoácidos 1 a 413 de la SEC ID NO: 2) se describe en PCT/EP2008/053561.

La estructura se ha sometido a simulaciones de dinámica molecular (MD, por sus siglas en inglés) y cálculos electrostáticos. También se identificaron posiciones de puentes disulfuro putativos y prolinas así como otras - - posiciones de importancia potencial respecto a las diversas propiedades enzimáticas deseables. Finalmente se identificaron sitios de glucosilación putativos (cadenas de NXT o NXS) .

Todas estas sugerencias se evaluaron dentro de la infraestructura de la estructura de elaboración modelada y los resultados de estimulación para la propiedad de termoestabilidad con énfasis particular al final de la alta temperatura .

Las variantes de fitasa correspondientes se prepararon por métodos conocidos en el ámbito y se probaron como se describe en la parte experimental .

POLIPEPTIDOS DE FITASA, PORCENTAJE DE IDENTIDAD En el presente contexto, una fitasa es un polipéptido que tiene actividad de fitasa, es decir, una enzima la cual cataliza la hidrólisis de fitato (hexaquisfosfato de mió- inositol ) a (1) mio-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentadiol fosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico.

En el presente contexto, el término sustrato de fitasa abarca, por ejemplo, ácido fítico y cualquier fitato (sal de ácido fítico) así como los fosfatos incluidos en el inciso (2) anterior.

El sitio ENZYME en la Internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un depositario de información en relación a la nomenclatura de enzimas. Se basa principalmente en las recomendaciones de la Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-B) y describe cada tipo de enzima caracterizada para las cuales se ha proporcionado un número EC (Comisión de enzimas) (Bairoch A. The ENZYME datábase, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Véase también el manual Enzyme Nomenclature from NC-IUBMB, 1992) .

De acuerdo con el sitio ENZYME, se conocen tres tipos diferentes de fitasas: unas denominadas 3-fitasa (nombre alternativo 1-fitasa; mio-inositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8), una denominada 4-fitasa (nombre alternativo 6-fitasa, nombre basado en sistema de numeración 1L y no en numeración ID, EC 3.1.3.26) y la denominada 5-fitasa (EC 3.1.3.72). Para los propósitos de la presente invención, los tres tipos se incluyen en la definición de fitasa .

En una modalidad particular, las fitasas de la invención pertenecen a la familia de histidina fosfatasas ácidas (HAP, por sus siglas en inglés) , las cuales incluyen la fosfatasa ácida de pH 2.5 de Escherichia coli (gen appA) , así como fitasas micóticas tales como las fitasas A y B de Aspergillus awamorii (EC: 3.1.3.8) (gen phyA y phyB) . Las histidina fosfatasas ácidas comparten dos regiones de similitud de secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo histidina conservado. Estas dos histidinas parecen estar involucradas en el mecanismo catalítico de las enzimas. La primera histidina se localiza en la sección N terminal y forma un intermediario fósforo-histidina mientras que la segunda se localiza en la sección C terminal y posiblemente actúa como un donador de protones .

En una modalidad particular adicional, las fitasas de la invención tienen un motivo de sitio activo conservado, es decir, R-H-G-X-R-X-P, en donde X indica cualquier aminoácido (véanse los aminoácidos 18 a 24 de la SEC ID NO: 2) . En una modalidad preferida, el motivo de sitio activo conservado es R-H-G-V-R-A-P, es decir, los aminoácidos 18-24 (con referencia a la SEC ID NO : 2) son RHGVRAP.

Para los propósitos de la presente invención, la actividad de fitasa se determina en la unidad de FYT, una FYT es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las siguientes condiciones: pH 5.5; temperatura 37°C, sustrato: fitato de sodio (C6 H6024P6Nai2) en una concentración de 0.0050 moles/1. Los análisis de fitasa adecuados son los análisis FYT y FTU descritos en el ejemplo 1 del documento WO 00/20569. FTU es para determinar actividad de fitasa en pienso y premezcla. La actividad de fitasa también se puede determinar utilizando los análisis del ejemplo 1 ("determinación de actividad de fosfatasa" o "determinación de actividad de fitasa").

En una modalidad particular, la fitasa de la invención está aislada. El término "aislado", como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido el cual es por lo menos 20% puro, preferiblemente por lo menos 40% puro, de manera más preferible por lo menos 60% puro, incluso de manera más preferible por lo menos 80% puro, de manera más preferible por lo menos 90% e incluso de manera más preferible por lo menos 95% puro, determinado por SDS-PAGE. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir que, la preparación polipeptídica esté esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual se asocia de manera nativa. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al preparar el polipéptido por medio de métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación clásicos.

La relación entre las dos secuencias de aminoácidos se describe por el parámetro "identidad". Para los propósitos de la presente invención, la alineación de las dos secuencias de aminoácidos se determina mediante la utilización del programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org), verión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineación global descrito en Needleman, S. B. y Wunsh, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución utilizada es BLOSUM62, el castigo por abertura de separación es 10 y el castigo por extensión de separación es 0.5.

El grado de identidad entre la secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención") y la secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia a las reivindicaciones (SEC ID NO: 2) se calcula como el número de coincidencias exactas en una alineación de las dos secuencias, divido entre la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la SEC ID NO: 2, la que sea más corta. El resultado se expresa por ciento de identidad.

Se produce una coincidencia exacta cuando la "secuencia de la invención" y la SEC ID NO: 2 tienen residuos aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de superposición (en la alineación del ejemplo siguiente esto se presenta por "|") . La longitud de una secuencia es el número de residuos aminoácidos en la secuencia (por ejemplo, la longitud de los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2 es 413) .

Para una explicación detallada adicional se hace referencia a 02007/112739 en la página 7, línea 24 a página 8, línea 5.

En modalidades particulares de la fitasa de la invención, el grado de identidad de la SEC ID NO: 2 es por lo menos 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos 99%. En modalidades particulares aún adicionales, el grado de identidad es de por lo menos 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 90.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% o por lo menos 99.9%. En modalidades alternativas, el grado de identidad es de por lo menos 70%, 71%, 72% o por lo menos 73%.

En modalidades particulares aún adicionales, la fitasa de la invención tiene un máximo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o un máximo de 10 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2; un máximo de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o un máximo de 20 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29 o un máximo de 30 modificaciones en comparación con la SEC ID NO : 2 ; un máximo de 31, 32, 33 , 34, 35, 36 , 37 , 38, 39 o un máximo de 40 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o un máximo de 50 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o un máximo de 60 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 o un máximo de 70 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o un máximo de 80 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o un máximo de 90 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un máximo de 100 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2 ; un máximo de 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o - - un máximo de 110 modificaciones en comparación con la SEC ID NO: 2.

NUMERACION DE POSICION La nomenclatura utilizada en la presente para definir posiciones de aminoácidos se basa en la secuencia de aminoácidos de la fitasa derivada de Hafnia alvei DSM 19197, cuya secuencia madura se proporciona en el listado de secuencia como la SEC ID NO: 2 (aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO 2) . En consecuencia, en el presente contexto, la base para numeración de las posiciones en la SEC ID NO: 2 comenzando con SI y finalizando con P413.

Cuando se utiliza en la presente, el término parte (o secuencia) "madura" se refiere a aquella parte del polipéptido la cual es secretada por una célula la cual contiene como parte de su equipo genético un polinucleótido que codifica para el polipéptido. En otras palabras, la parte de polipéptido madura se refiere a aquella parte del polipéptido la cual permanece después de que la parte de péptido señal así como la parte propéptido, si la hay, se han eliminado por ruptura. La parte del péptido señal se puede predecir por programas conocidos en el ámbito (por ejemplo SignalP) . La SEC ID NO: 2 es la parte madura esperada. Generalmente, el primer aminoácido de la parte madura de una enzima se puede determinar por secuenciado N terminal de la enzima purificada. Cualquier diferencia entre la parte de - - péptido señal y la parte madura después se puede deber a la presencia de un polipéptido.

MODIFICACIONES TALES COMO SUSTITUCIONES, SUPRESIONES E INSERCIONES Una variante de fitasa puede comprender diversos tipos de modificaciones en relación a una plantilla (es decir, una fitasa original o de referencia, o una secuencia de aminoácidos comparativa tal como la SEC ID NO: 2) . Un aminoácido ¦ se puede sustituir con otro aminoácido; un aminoácido se puede suprimir; un aminoácido se puede insertar entre dos residuos; así como cualquier combinación de cualquier cantidad de tales modificaciones. En el presente contexto, el término "inserción" se pretende que abarque también las extensiones de las partes N y/o C terminal.

La nomenclatura general utilizada en la presente para una modificación única es la siguiente: XDcY, en donde "X" e "Y" designan independientemente el código de aminoácidos de una letra o una " * 11 (supresión de un aminoácido) , "D" designa un número y "c" designa un contador alfabético (a, b, c, y así sucesivamente) , el cual está presente únicamente en las inserciones. Se hace referencia a la tabla 1 siguiente la cual describe ejemplos puramente hipotéticos de aplicación de esta nomenclatura a diversos tipos de modificaciones.

TABLA 1 EJEMPLOS DE NOMENCLATURA Como se explica en lo anterior, el número de posición ("D") se cuenta a partir del primer residuo aminoácido de la SEC ID NO: 2.

Varias modificaciones en la misma secuencia están separadas por "/" (diagonal) por ejemplo la designación "l*/2*/3*" significa que los aminoácidos en el número de posición 1, 2 y 3 todos han sido suprimidos y la designación "104A/105F" significa que el aminoácido en la posición número 104 está sustituido por A y el aminoácido en la posición número 105 está sustituido por F.

Las modificaciones alternativas están separadas por "," (coma), por ejemplo la designación "119R,K" significa que el aminoácido en la posición 119 está sustituido con R o K.

Las comas que se utilizan en la presente en diversas otras enumeraciones o posibilidades significan lo que habitualmente hacen gramaticalmente, es decir, con frecuencia y/o. Por ejemplo, la primera coma en el listado "53V,Q, 121D y/o 167Q" indica una alternativa (V o Q) mientras que las dos comas siguientes se deben interpretar como opciones y/o: 53V o 53Q, y/o 121D y/o 167Q.

En el presente contexto "por lo menos uno" (por ejemplo modificación) significa uno o más, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 modificaciones; o 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28 ó 30 modificaciones; y así sucesivamente hasta un número máximo de modificaciones de 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o de 200. No obstante, las variantes de fitasa de la invención aún necesitan ser por lo menos 76% idénticas a la SEC ID NO: 2, este porcentaje está determinado como se describe en lo anterior.

Una sustitución o extensión sin indicación alguna de lo que sustituye o el grado al cual se refiere a la extensión de cualquier aminoácido natural o no natural, excepto aquel que ocupa esta posición en la plantilla.

IDENTIFICACION DE NUMEROS DE POSICION CORRESPONDIENTES Como se explica en lo anterior, la fitasa madura de Hafnia alvei DSM 19197 (SEC ID NO: 2) se utiliza como el estándar para numeración de posición y de esta manera también para nomenclatura.

Para otra fitasa, en particular una variante de fitasa de la invención, la posición que corresponde a la posición D en la SEC ID NO : 2 se encuentra al alinear las dos secuencias como se especifica en lo anterior en la sección intitulada "polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad". A partir de la alineación, la posición en la secuencia de la invención que corresponde a la posición D de la SEC ID NO: 2 se puede identificar de manera clara e inequívoca (las dos posiciones una sobre la otra en la alineación) .

A continuación se incluyen algunos ejemplos adicionales, puramente hipotéticos, los cuales se derivan de la tabla 1 anterior los cuales en la tercera columna incluyen un número de alineaciones de dos secuencias: - - Considérese la tercera celda en la primera hilera de la tabla 1: la secuencia superior es la plantilla, la inferior es la variante. La posición número 80 se refiere al residuo aminoácido G en la plantilla. El aminoácido A ocupa la posición correspondiente en la variante. En consecuencia, esta sustitución se denomina G80A.

Considere ahora la tercera celda en la segunda hilera de la tabla 1: la secuencia superior es nuevamente la plantilla y la inferior es la variante. La posición número 80 nuevamente se refiere al residuo aminoácido G en la plantilla. La variante tiene dos inserciones, es decir, TY después de G80 y antes de V81 en la plantilla mientras que T e Y por supuesto tienen sus propios números de posición "reales" en la secuencia de aminoácidos variante, para los presentes propósitos siempre nos referimos a los números de posición de la plantilla y en consecuencia la T y la Y se dice que están en la posición número 80a y 80b, respectivamente .

Finalmente, considérese la tercera celda en la última hilera de la tabla 1: la posición número 275 se refiere al último aminoácido de la plantilla. Una extensión en la parte G terminal de ST se dice que está en la posición número 275a y 275b, respectivamente aunque, nuevamente, por supuesto tienen su propio número de posición "real" en la secuencia de aminoácidos variante.

- PROPIEDADES MODIFICADAS, FITASA DE REFERENCIA U ORIGINAL En una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene propiedades alteradas o modificadas, preferiblemente mejoradas. Los términos "alterado", "modificado" y "mejorado" implican una comparación con otra fitasa. Los ejemplos de las otras fitasas de referencia, originales comparativas son: SEC ID NO: 2 y/u otras fitasas que tienen una identidad de secuencia con la SEC ID NO: 2 de más de 76%, preferiblemente mayor de 80, 85, 90, 95 o 98%.

Los ejemplos no limitantes de propiedades que son modificadas, preferiblemente mejoradas son las siguientes: Termoestabilidad, estabilidad al vapor, estabilidad al granulado, perfil de pH, actividad específica, desempeño , en pienso animal, sensibilidad a proteasa y/o patrón de glucosilación . La fitasa de la invención también puede tener un perfil de temperatura alterado, preferiblemente mejorado y/o puede incorporar cambios de sitios de ruptura de proteasa potenciales para reducir la sensibilidad a proteasa. Especialmente el desempeño térmico, que incluye estabilidad al calor, estabilidad a la temperatura, termoestabilidad, estabilidad al vapor y/o estabilidad al granulado se consideran una característica o propiedad importantes.

DESEMPEÑO TERMICO Temperatura-Estabilidad La estabilidad a la temperatura se puede determinar como se describe en el ej emplo 3 al determinar la actividad residual después de incubación durante 30 minutos a temperaturas de 70°C a 80 °C .

Termoestabilidad La termoestabilidad se puede determinar como se describe en el ejemplo 4, es decir, utilizando mediciones de DSC para determinar la temperatura de desnaturalización, td de la proteína fitasa purificada. La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína; cuanto mayor sea la Td mayor será la termoestabilidad. En consecuencia, en una modalidad preferida, la fitasa de la invención tiene una Td la cual es mayor que la Td de la fitasa de referencia, en donde la Td se determina sobre muestras de fitasa purificadas (preferiblemente con una pureza de por lo menos 90% o 95%, determinado por SDS-EAGE) .

Estabilidad al calor La estabilidad al calor se puede determinar como se describe en el ej emplo 5 al determinar el perf il de temperatura/actividad de las f itasas variantes .

Estabil idad al vapor La estabilidad al vapor se puede determinar como se describe en el ej emplo 7 al determinar la actividad residual de las moléculas de f itasa después de tratamiento con vapor a 85 °C o 90 °C por un tiempo breve .

Estabilidad al granulado La estabilidad al granulado se puede determinar como se describe en el ej emplo 9 mediante la utilización de - - premezclado de granulado de enzima con pienso. Esta premezcla se combina con el pienso. Desde el mezclador, el pienso se acondiciona con vapor a 95 °C. Después del acondicionamiento el pienso se presiona para formar pellas y se determina la actividad residual.

En modalidades preferidas, las propiedades térmicas tales como estabilidad al calor, estabilidad a la temperatura, termoestabilidad, estabilidad al vapor y/o estabilidad al granulado, como se proporciona por la actividad residual, Td u otro parámetro de la fitasa de la invención es mayor que el valor correspondiente, tal como la actividad residual o Td de la fitasa de la SEC ID NO: 2, de manera más preferible por lo menos 101% de la misma o por lo menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, o por lo menos 110% de la misma. Incluso de manera más preferible, el valor del parámetro tal como la actividad residual o Td de la fitasa de la invención es de por lo menos 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, o por lo menos 190% del valor de la fitasa de la SEC ID NO : 2.

En modalidades particulares adicionales, la fitasa termoestable de la invención tiene una temperatura de fusión, Tm (o una temperatura de desnaturalización, Td) determinada utilizando calorimetría de exploración diferencial (DSC) como se describe en los ejemplos (es decir, en acetato de sodio 20 mM, pH 4.0), de por lo menos 50°C. En modalidades - - particulares adicionales la Tm es de por lo menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62.5, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o por lo menos 100°C. Las mediciones de DSC también se pueden realizar como se describe en los ejemplos.

La estructura descrita en PCT/EP2008/053561 se utiliza para identificar posiciones que se seleccionan para modificación. La estructura también se compara con otras estructuras de fitasa HAP conocidas para el mismo propósito.

Mediante la utilización de simulaciones de dinámica molecular para analizar movilidades a altas temperaturas se identificaron las siguientes posiciones para modificación para proporcionar propiedades térmicas mejoradas: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 37, 38, 39, 40, 41, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 91, 108, 109, 110, 111, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 131, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 144, 145, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 163, 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 193, 194, 196, 198, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 319, 320, 322, 324, 343, 344, 345, 346, 347, 364, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 373, 375, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 396, 397, 400, 403, 404, 408, 409, 412 y 413.

Se propone específicamente que las modificaciones en algunas de estas posiciones se seleccionan de las siguientes: 8L,C,M,Y, 9K,P,S, 26R,Q,H, 27A, 28A, 29P,R,K,A, 30P,L, 32Q,I,L, 33C,N, 37D,R,K, 38A, 41T,Q, 69E,L, 70E, 72A, 74S, 75A, 76R,V,N, 77K,G, ,Q, 78G, R, K, Q, S , T, 79L, 81E, 82S, 83G, 109D,G, 111R,K,S, 117A,Q, 118A, , E , P, T, 119D,K,E, 120G,L,I,M, 121A, S,T,G, K, 122A,S,T,K, 131R,Q, 132T,V, 134V, 138N,V, 139C,R, 140P, 144R, 148R, 150C, 151D, 152A,G,T,I, 160G, 163P,K, 175N,S, 178C,E 179C,L, , 181L, 185R,K, 186S,T, 187E, 190N, 193R, 198E, 201C,G,V, 202A,K, 203Y, 206G,T,A, 207N,L,Q,R, 234L, R, C, V, E, 235P, 236C, 239R,K, 242S, 243P, 244P, 285D, 286T, 287P, 288P, 289W, 293R,K,N, 294L, 319L, 320N, 343C, 344K, 346S,T, 347R, 365K, 366T, 369S,D, 370C, 382S,T, 383N, 396D,E,K 403N, y 411S.

En base en comparaciones con otras fitasas conocidas se identifican las siguientes posiciones como capaces de proporcionar propiedades térmicas mejoradas tales como termoestabilidad: 12, 16, 48, 49, 54, 55, 77, 93, 100, 103, 128, 130, 136, 137, 173, 176, 195, 209, 211, 215, 219, 221, 227, 228, 248, 251, 258, 260, 261, 310, 313, 314, 316, 318, 335, 354, 356, 360, 362, 363, 374, 376, 378 y 411.

A partir de las comparaciones, se indica específicamente que las sustituciones se pueden seleccionar de entre las siguientes: 12S, 16V, 48W, 49L, 54G, 55E, 77K, 93E, 100 , 103A, 128N, 130L, 136Q, 137L, 173N, 176Q, 195L, 209S, 211T, 215S, 219M, 221T, 227Q, 228Q, 248T, 251S, 258Y, 260L, 261Q, 310L, 313L, 314G, 316A, 318E, 335E, 354L, 356F, 360Q, 362M, 363R, 374P, 376E, 378K, y 411S .

En relación a las variantes producidas a partir de la fitasa de la SEC ID NO: 2, las modificaciones se pueden seleccionar de las siguientes: K12S, L16V, Y48W, I49L, E54G, H55E, D77K, Q93E, L103A, H128N, V130L, S136Q, M137L, D173N, 176Q, M195L, A209S, E211T, G215S, T219M, A221T, E227Q, H228Q, S248T, K251S, D258Y, M260L, S261Q, I310L, I313L, S314G, M316A, G318E, A335E, M354L, Y356F, A360Q, L362M, H363R, A374P, S376E, R378K, y/o Q411S.

En modalidades particulares, en donde se generan en la molécula puentes disulfuro, se espera una termoestabilidad mejorada a partir de las siguientes variantes de una fitasa que tiene por lo menos 76% de identidad con los residuos aminoácidos 2-413 de la SEC ID NO: 2: 8C/343C, 139C/201C, 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, y 368C/374C Similarmente , también se espera una termoestabilidad mejorada a partir de la sustitución de residuos prolina por residuos existentes en posiciones seleccionadas. Esto se espera a partir de las siguientes variantes de fitasa: 29P, 30P, 93P, 95P, 140P, 163P, 235P, 243P, 244P, 284P, 287P, 288P, 316P, y 360P. Específicamente para modificaciones en la SEC ID NO: 2, las siguientes modificaciones deben mejorar la estabilidad térmica Q29P, T30P, Q93P, K95P, S140P, A163P, V235P, E243P, Q244P, S284P, T287P, S288P, M316P, y A360P.

Además, la optimización de residuos cargados es susceptible de mejorar propiedades térmicas tales como termoestabilidad . La optimización se relaciona con interacciones carga-carga sobre la superficie de la molécula de fitasa.

Se incluyen en lo siguiente tres grupos de sustituciones para modificar fitasas originales o de referencia que tienen por lo menos 76% de identidad con los residuos aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2 con residuos como se ha indicado. Los residuos cuya carga se puede invertir, los residuos que se cambian a una carga negativa y los residuos que se cambian a una carga positiva son: Inversión de Carga D111R,K, K251D,E y D293R,K.

Cambio a Negativo Q69E, Q70E, T81E, Q93E, N119D, Q230E, Q245E, P348D,E, L395E, Y S396D,E.

Cambio a Positivo Q9R, Q29R,K, H37R,K, L59R,K, N78R,K, H115R,K, I185R,K, N239R y H363R,K.

Perfil de temperatura/estabilidad de temperatura Que la fitasa de la invención tenga o no un perfil de temperatura modificado en comparación con una fitasa de referencia se puede determinar como se describe en el ejemplo 5. En consecuencia, en una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene un perfil de temperatura modificado en comparación con una fitasa de referencia, en donde el perfil de temperatura se determina como actividad de fitasa como una función de la temperatura de fitato de sodio a pH 5.5 en el intervalo de temperatura de 20-90°C (en etapas de 10°C) . Un amortiguador preferido está en el amortiguador de acetato de Na 0.25M, pH 5.5. La actividad a cada temperatura preferiblemente se indica como actividad relativa (en %) normalizada con el valor a temperatura óptima. La temperatura óptima es aquella temperatura dentro de las temperaturas probadas (es decir, aquellas con saltos de 5-10°C) en donde la actividad es más alta. Perfil de pH Que una fitasa de la invención tenga o no un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia se puede determinar como se describe en los ejemplos. En consecuencia, en una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia, en donde el perfil de pH se determina como actividad de fitasa como una función del pH sobre fitato de sodio a 37°C en el intervalo de pH de 2.0 a 7.5 (en etapas de 0.5 unidades de pH) . Un amortiguador preferido es una combinación de glicina 50 mM, ácido acético 5 50 mM y Bis-Tris 50 mM. La actividad a cada pH preferiblemente se indica como actividad relativa (en %) normalizada al valor de pH óptimo.

Un ejemplo de un perfil de pH alterado es cuando la curva de pH (actividad relativa como una función del pH) se 10 desplaza hacia un pH mayor o menor. Las sustituciones preferidas las cuales proporcionan un desplazamiento de 0.5 unidades de pH hacia un pH mayor en comparación con la fitasa de referencia de la SEC ID NO: 2. No obstante, para algunos propósitos se puede preferir proporcionar un desplazamiento ^?- de 0.5 unidades de pH hacia un pH menor en comparación con la fitasa de referencia de la SEC ID NO : 2.

Otro ejemplo de un perfil de pH alterado es cuando se cambia el pH óptimo en la dirección hacia arriba o hacia abajo. 20 En una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia. De manera más particular, el perfil de pH se modifica en un intervalo de pH de 3.5-5.5. De manera aún más particular, la actividad a pH 4.0, 4.5, 5.0, y/o 5.5 está en un nivel de por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, - - 75%, 80%, 85%, 90%, o por lo menos 95% de la actividad a un pH óptimo.

Actividad específica' En una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene una actividad específica mejorada en relación a una fitasa de referencia. De manera más particular, la actividad específica de una fitasa de la invención es por lo menos 105% en relación a la actividad específica de una fitasa de referencia determinada por el mismo procedimiento. En modalidades particulares adicionales la actividad específica relativa es de por lo menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 o incluso 400%, aún en relación con la actividad específica de la fitasa de referencia, determinada por el mismo procedimiento.

En la alternativa, el término actividad específica alta se refiere a una actividad específica de por lo menos 200 FYT/mg de proteína de enzima (EP) . En modalidades particulares, la actividad específica es de por lo menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 FYT/mg de EP.

La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de SDS y poliacrilamida deben presentar la presencia de solo un componente) . La - - concentración de proteína de enzima se puede determinar por análisis de aminoácidos y la actividad de fitasa en las unidades de FYT, determinado como se describe en el ejemplo 1. La actividad específica es característica de la variante de fitasa específica en cuestión y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína de enzima variante de fitasa. Véanse ejemplos para detalles adicionales .

En modalidades particulares, se espera que una actividad específica modificada de las siguientes variantes de la fitasa de la SEC ID NO: 2 en las cuales, el orden de preferencia, el bucle intermedio que sustituye al bucle entre los residuos 115 y 127 (HQQNTQQADPL) el cual está orientado hacia el sitio activo con un bucle que se selecciona, por ejemplo, de HQEK GTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL, HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL .

Desempeño en pienso animal En una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene un desempeño mejorado en pienso de animal en comparación con una fitasa de referencia. El desempeño en pienso animal se puede determinar por el modelo in vitro indicado en los ejemplos. En consecuencia, en una modalidad preferida, la fitasa de la invención tiene un desempeño mejorado en pienso de animal, en donde el desempeño se determina en un modelo in vitro al preparar muestras de - - pienso constituidas de harina de soya 30% y harina de maíz 70% a las que se les ha agregado CaCl2 a una concentración de 5 g de calcio por kg de pienso; preincubación de las mismas a 40°C y pH 3.0 durante 30 minutos seguido por adición de pepsina (3000 U/g de pienso) y fitasa; incubación de las muestras a 40°C y pH 3.0 durante 60 minutos seguido por pH 4.0 durante 30 minutos; detención de las reacciones; extracción de ácido fítico y fosfatos de inositol por adición de HCl a una concentración final de 0.5 e incubación a 40 °C durante 2 horas, seguido por un ciclo de congelamiento-recalentamiento e incubación durante 1 hora a 40°C; separación de ácido fítico y fosfato de inositol por cromatografía iónica de alta resolución; determinación de la cantidad de fósforo fitato residual (IP6-P) ; cálculo de la diferencia en IP6-P residual entre la muestra tratada con fitasa y un blanco o testigo no tratado con fitasa (esta difefencia es IP6-P degradado) ; y expresar el IP6-P degradado de la fitasa de la invención en relación a IP6-P degradado de la fitasa de referencia.

La fitasa de la invención y la fitasa de referencia son por supuesto dosificadas en la misma cantidad, preferiblemente en base en unidades de actividad de fitasa (FYT) una dosificación preferida es de 125 FYT/kg de pienso. Otra dosificación preferida es de 250 FYT/kg de pienso. Las fitasas se pueden dosificar en forma de fitasas purificadas o - - en forma de sobrenadantes de fermentación. Las fitasas purificadas preferiblemente tienen una pureza de por lo menos 95%, determinado por SDS-PAGE.

En modalidades preferidas, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, en relación al valor IP6-P degrado de la fitasa de referencia es de por lo menos 101%, o por lo menos 102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115%, o por lo menos 120%. En modalidades preferidas adicionales, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, en relación al valor de IP6-P degradado de la fitasa de referencia es de por lo menos 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, o por lo menos 200%. Preferiblemente, el valor de IP6-P degradado de la fitasa de la invención, en relación al valor IP6-P degradado de la fitasa de la SEC ID NO: es de por lo menos 105%, 110%, 113%, 115%, 120%, 125%, o por lo menos 130%.

El desempeño relativo de una fitasa de la invención también se puede calcular como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de referencia.

En una modalidad particular adicional, el desempeño relativo de la fitasa de la invención se puede calcular como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de la invención en relación a la cantidad de fósforo liberado por la fitasa de referencia.

En modalidades particulares adicionales, el - - desempeño relativo de la fitasa de la invención es de por lo menos 105%, preferiblemente por lo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o por lo menos 200%.

REDUCCION EN GLUCACION La glucación no enzimática es un procedimiento postraduccional espontáneo en donde azúcares reductores se unen covalentemente a grupos amino libres en proteínas principalmente en residuos lisina (K) . Con el fin de reducir la glucación que resulta en una reducción de actividad de la fitasa, la actividad se mejora al sustituir ciertos residuos aminoácidos tales como Lys.

Por lo tanto, se propone realizar una o más de las siguientes modificaciones en la fitasa de la SEC ID NO: 2: K12R,Q, K26R,Q, K45P, K76R,Q, K97R,Q, K131R,Q, K139R,Q, K148R,Q, K176R,Q, K187E, K207L, K234R,Q, K251R,Q, K268R,Q, K299R,Q, K347R,Q, S261A, T308A, T25A, T28A, T30L, T219L, T120L, N202A, N206A, N270R,Q, N312A, N119D, Q256A, Q29A, Q121A, Q122A, Q117A, Q118A, Y48W e Y179L. Las modificaciones preferidas específicamente con respecto a esta mejora en la eficiencia son las modificaciones K26Q y K26R.

SENSIBILIDAD A PROTEASA REDUCIDA En una modalidad particular, la fitasa de la invención tiene una sensibilidad a proteasa reducida. De manera más particular, tiene una sensibilidad reducida hacia las proteasas pepsina y tripsina, lo que significa una - 4 - tendencia reducida a ser escindida por esta proteasa.

Las posiciones que se van a modificar a respecto están indicadas en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2 POSICIONES PARA MODIFICACION DE SENSIBILIDAD PROTEASA Para reducir la sensibilidad a pepsina el residuo aminoácido debe modificarse a un aminoácido diferente de F, L, W o Y. En el caso de tripsina se debe modificar a un residuo aminoácido diferente de R o K.

PATRON DE GLUCOSILACION La glucosilación es un fenómeno el cual se observa únicamente cuando se expresan proteínas en eucariotas tales como hongos y plantas transgénicas pero no en procariotas tales como bacterias. Existen varios tipos de glucosilación, pero en el presente contexto el más relevante es la N-glucosilación, es decir, la glucosilación unida a asparagina en donde los azúcares se unen a una proteína, a partir de una molécula de N-acetiglucosamina unida a asparaginas. Se ha encontrado que la N-glucosilación se produce únicamente hacia asparaginas que en la secuencia son parte de los siguientes tripéptidos: N-X-T o N-X-S, en donde X indica cualquier aminoácido.

Se ha observado que la termoestabilidad puede mejorarse para fitasas expresadas en hongos al alterar sitios de glucosilación potenciales. En consecuencia, la presente invención también se relaciona con variantes de fitasa que tienen un patrón de glucosilación modificado, preferiblemente sitios de N-glucosilación modificados. Se espera que la glucosilación modificada confiera termoestabilidad mejorada ante las variantes de fitasa, cuando se expresan en un hongo.

Los ejemplos de fitasas son fitasas bacterianas, por ejemplo fitasas gramnegativas tales como fitasas de E. coli, Citrobacter y Hafnia y variantes de las mismas que incluyen las fitasas de la presente invención. Los ejemplos de hospedadores de expresión micótica son las especies Pichia, Saccharomyces y Aspergillus .

En modalidades particulares, un patrón de - - glucosilacion modificado se espera de las siguientes fitasas de la invención: Eliminación de un sitio de glucosilacion Creación de sitios de glucosilación nuevos del tipo XXS ESTABILIDAD A VAPOR La termoestabilidad es un parámetro importante pero asociado con la estabilidad al vapor que también es importante. A este respecto se hace referencia al Ejemplo 8 más adelante.

VARIANTES POCO ALERGENICAS En una modalidad específica, las fitasas de la presente invención (también) son variantes poco alergénicas, diseñadas para inducir una respuesta inmunológica reducida cuando se exponen a animales, incluyendo al humano. El - - término respuesta inmunológica debe entenderse como cualquier reacción por el sistema inmunitario de un animal expuesto a la variante de fitasa. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que genera niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Se pueden preparar variantes poco alergénicas utilizando técnicas conocidas en el ámbito. Por ejemplo, la variante de fitasa se puede conjugar con porciones poliméricas que protegen porciones o epítopos de la variante de fitasa involucradas en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede involucrar acoplamiento químico in vitro de polímero a la variante de fitasa, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 y/o 99/00489. La conjugación, de manera adicional o alternativa a la misma, puede involucrar acoplamiento in vivo de polímeros a la variante de fitasa. Esta conjugación se puede obtener por manipulación genética de la secuencia nucleotídica que codifica para la variante de fitasa, inserción de las secuencias de consenso que codifican para sitios de glucosilación adicionales en la variante de fitasa y expresión de la variante de fitasa en un hospedador capaz de glucosilar la variante de fitasa, véase, por ejemplo, el documento WO 00/26354. Otra manera de proporcionar variantes poco alergénicas es manipulación genética de la secuencia nucleotídica que codifica para la variante de fitasa de - - manera que provoque que las variantes de fitasa autooligomericen, efectuando que los monómeros de variante de fitasa puedan proteger los epítopos de otros monómeros de variante de fitasa y de esta manera disminuir la antigenicidad de los oligómeros. Estos productos y su preparación se describen, por ejemplo, en WO 96/16177. Los epítopos involucrados en una respuesta inmunológica se pueden identificar por diversos métodos tales como el método de presentación de fago descrito en los documentos WO 00/26230 y WO 01/83559, o el enfoque aleatorio descrito en el documento EP 561907. Una vez que se ha identificado un epítopo, su secuencia de aminoácido se puede alterar para producir propiedades inmunológicas modificadas de la variante de fitasa por técnicas de manipulación de genes conocidas tales como mutagénesis dirigida a sitio (véase, por ejemplo Wo 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o conjugación de un polímero la cual se puede realizar en proximidad suficiente al epítopo del polímero para proteger al epítopo.

SECUENCIAS Y CONSTRUCCIONES DE ACIDO NUCLEICO La presente invención también se relaciona con secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido la cual codifica para una variante de fitasa de la invención .

El término "secuencia aislada de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico la cual está - - esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente por lo menos aproximadamente 40% pura, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 60% pura, incluso de manera más preferible por lo menos aproximadamente 80% pura y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 90% pura, determinada por electroforesis en agarosa. Por ejemplo, se puede obtener una secuencia aislada de ácido nucleico por procedimientos de clonación estándar utilizados en manipulación genética para reubicar la secuencia de ácido nucleico desde su ubicación natural a un lugar diferente en donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden involucrar el corte y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula vector e incorporación del vector recombinante en una célula hospedadora en donde se replicarán copias múltiples o clones de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético o sintético, o cualquier combinación de los mismos .

Las secuencias de ácido nucleico de la invención se pueden preparar al introducir por lo menos una mutación en una secuencia codificante para fitasa plantilla o una - - subsecuencia de la misma, en donde la secuencia de ácido nucleico mutante codifica para una fitasa variante. La introducción de una mutación en la secuencia de ácido nucleico para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede llevar a cabo por cualquiera de los métodos conocidos en el ámbito, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida a sitio, por mutagénesis aleatoria o por mutagénesis con impurezas, con concentraciones conocidas o localizada aleatoria .

La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente ya sea como mutagénesis aleatoria localizada o específica de región en por lo menos tres partes del gen que traduce a la secuencia que se mostrará, en cuestión o dentro del gen completo. Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleotido, el oligonucleotido puede presentar impurezas o concentraciones conocidas con los tres nucleótidos no originales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones las cuales se van a cambiar. La adición de impurezas o la adición de concentraciones conocidas se puede llevar a cabo de manera que los codones para aminoácidos no deseados se eviten. El oligonucleótido con impurezas o con concentraciones conocidas se puede incorporar en el ADN que codifica para la enzima fitasa por cualquier técnica, utilizando, por ejemplo PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa que se considere - - apropiada .

Preferiblemente, la adición de impurezas se lleva a cabo utilizando "adición -de impurezas aleatoria constante" en la cual el porcentaje de la parte natural y la de mutación en cada posición se define de antemano. Además, la adición de impurezas se puede dirigir hacia una preferencia para la introducción de ciertos nucleótidos y de esta manera una preferencia por la introducción de uno o más residuos aminoácidos específicos. La adición de impurezas se puede realizar, por ejemplo, de manera que permite la introducción de 90% natural y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de adición de impurezas se basa en genética así como en limitaciones estructurales de proteína.

La mutagénesis aleatoria se puede localizar ventajosamente en una parte de la fitasa original en cuestión. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando algunas regiones de la enzima han sido identificadas como de importancia particular para una propiedad dada de la enzima.

Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen barajado de genes, por ejemplo, como se describe en O 95/22625 o en WO 96/00343, y el procedimiento de derivación de consenso como se describe en EP 897985.

CONSTRUCCIONES DE ACIDO NUCLEICO Una construcción (plásmido recombinante) de ácido - - nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención unida operablemente a una o más secuencias de control las cuales dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Se comprenderá que la expresión incluye cualquier etapa involucrada en la producción del polipéptido que incluye, pero que no se limita a transcripción, modificación postranscripcional , traducción, modificación postraduccional y secreción.

El término "construcción de ácido nucleico" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o doble, la cual está aislada de un gen como se encuentra de manera natural o la cual se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo al término "cásete de expresión" en donde la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control necesarias para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención .

El término "secuencias de control" se define en la presente para incluir todos los componentes los cuales son necesarios o útiles para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención.

Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido. Las secuencias de control incluyen, pero no se limitan a un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica , promotor, secuencia de péptido señal y terminádor de transcripción. En un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de detención transcripcionales y traduccionales . Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazantes con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido .

El término "unido operablemente" indica en la presente una configuración en la cual una secuencia de control se coloca en una posición apropiada en relación a la secuencia codificante de la secuencia polinucleotídica de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

Cuando se utiliza en la presente, el término "secuencia codificante" (CDS, por sus siglas en inglés) significa una secuencia nucleotídica la cual especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan por un marco de lectura abierto, el cual habitualmente comienza con el codón de inicio ÁTOMOS DE HALÓGENO o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc o una secuencia nucleotídica recombinante .

VECTOR DE EXPRESION El término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción del polipéptido que incluye, pero que no se limita a transcripción, modificación postranscripcional , traducción, modificación postraduccional y secreción.

El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención y el cual está unido operablemente a nucleótidos adicionales que se proporcionan para su expresión.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante de fitasa de la invención se puede expresar utilizando un vector de expresión el cual típicamente incluye secuencias de control que codifican para un promotor, operador, sitio de unión de ribosoma, señal de inicio de traducción y, opcionalmente , un gen represor o diversos genes activadores .

El vector de expresión recombinante que transporta las secuencias de ADN que codifica para una variante de fitasa de la invención puede ser cualquier vector el cual puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes y la selección del vector con frecuencia dependerá de la célula hospedadora y la cual se va a introducir. El vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con uno o varios de los cromosomas en los cuales se ha integrado.

La variante de fitasa también se puede coexpresar junto con por lo menos otra enzima de interés de pienso animal, tal como una fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, -galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, amilasa y/o ß-glucanasa. Las enzimas se pueden coexpresar a partir de vectores diferentes, a partir de un vector o utilizando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se utilizan vectores diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables diferentes y orígenes de replicación diferentes. Cuando se utiliza únicamente un vector, los genes se pueden expresar a partir de uno o más promotores. Si se clona bajo regulación de un promotor (disistrónico o multicistrónico) , el orden en el cual se clonan los genes puede afectar los niveles de expresión de las proteínas. La variante de fitasa también se puede expresar como una proteína de fusión, es decir, que el gen que codifica para la variante de fitasa ha sido fusionado en marco con el gen que - - codifica para otra proteína. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

CELULAS HOSPEDADORAS El término "célula hospedadora", como se utiliza en la presente, incluye cualquier tipo de célula el cual sea susceptible de transformación, transíección, transducción y similar con una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención.

La presente invención también se relaciona con células hospedadoras recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención las cuales se utilizan ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos . Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula hospedadora de manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector autorreplicante extracromosómico, como se ha descrito anteriormente. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia de una célula original que no es idéntico a la célula original debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La selección de una célula hospedadora en gran medida dependerá del gen que codifica para el polipéptido y su fuente .

La célula hospedadora puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo un procariota, o un microorganismo no - - unicelular, por ejemplo un eucariota.

Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias grampositivas que incluyen pero que no se limitan a una célula de Bacillus, por ejemplo Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis ; o una célula de Streptomyces, por ejemplo Streptomyces lividans y Streptomyces urinus o bacterias gramnegativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis . En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico .

La introducción de un vector en una célula hospedadora bacteriana puede llevarse a cabo, por ejemplo, por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), utilizando células competentes (véase, por ejemplo Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (véase, por - - ejemplo Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) .

La célula hospedadora también puede ser una eucariota tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta o micótica.

En un aspecto preferido, la célula hospedadora es una célula micótica. Como se utiliza en la presente "hongo" incluye a los fila Asco ycota, Basidio ycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se definen por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungí, Octava Edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como Oomycota (como se menciona en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, sup a) .

En un aspecto más preferido, la célula hospedadora micótica es una célula de levadura. Como se utiliza en la presente, "levadura" incluye levaduras ascosporogenosas (Endomycetales) , levaduras basidioesporogenosas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomycetes) . Dado c[ue la clasificación de levaduras puede cambiar en el futuro, para propósitos de esta invención levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc . App. Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980) .

En un aspecto incluso más preferido, la célula - - hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

En un aspecto más preferido, la célula hospedadora de levadura es una célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasil , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norhensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la 0 célula hospedadora de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora de levadura es una célula, de Yarrowia lipolytica.

En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora micótica es una célula de hongo filamentoso. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared micelial constituida de quitina, celulosa, glucano, quitosana, mañano 0 y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación de hifal y el catabolismo de carbono es aeróbico obligatorio. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por gemación de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono c. puede ser fermentativo.

- - En un aspecto incluso más preferido, la célula hospedadora micótica filamentosa es una célula de Acre onium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, 5 Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma . 10 En un aspecto más preferido, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryza. En otro aspecto más preferido, la célula -Lj- hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, 20 Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, t. Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, - - Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phiebla radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Tra etes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o 0 Trichoderma viride cepa.

Las células micóticas se pueden transformar por un procedimiento que involucra formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida por si misma. Los procedimientos adecuados para transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma se describen en el documento EP 238 023 y Yelton et al, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen 0 por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y O 96/00787.

La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editoress, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-c 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

METODO DE PRODUCCIÓN La presente invención también se relaciona con métodos para producir una fitasa de la presente invención que comprende (a) cultivar una célula hospedadora bajo condiciones que generan la producción de la fitasa; y (b) recuperar la fitasa.

En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en el ámbito. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación y fermentación a pequeña escala o a gran escala (que incluye fermentaciones continua, por lotes, de alimentación por lote o en estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales que funcionan en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido se exprese y/o aisle. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en el ámbito. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si el polipétido es secretado al medio nutriente, el - - polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisados celulares .

El polipéptido resultante se puede recuperar 5 utilizando métodos conocidos en el ámbito. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen pero que no se limitan a centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. 10 Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una diversidad de procedimientos conocidos en el ámbito que incluyen pero que no se limitan a cromatografía (por ejemplo de intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque y exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) . 20 PLANTAS TRANSGENICAS La presente invención también se relaciona con una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal la cual ha sido transformada con una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene actividad de fitasa de „.. la presente invención de manera que exprese y produce el - - polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o de la parte de la planta. De manera alternativa, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo mejorando el valor nutricional, el sabor agradable al paladar y las propiedades reológicas o para destruir un factor antinutritivo.

En una modalidad particular, el polipéptido está dirigido a las vacuolas de almacenamiento de endosperma en las semillas. Esto se puede obtener al sintetizarlo como un precursor con un péptido señal adecuado, véase Horvath et al en PNAS Feb. 15, 2000, vol . 97, no. 4, p. 1914-1919.

La planta transgénica puede ser una dicotiledónea o una monocotiledónea o variantes manipuladas de las mismas. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas son pastos tales como pasto meadow (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como Festuca, Lolium, pasto temperado tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, tritical (híbrido estabilizado de trigo (Triticum) y centeno (Sécale) , y maíz (elotes) . Los ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, legumbres tales como girasol (Helianthus) , algodón (Gossypium) , lupinos, papa, remolacha de azúcar, chícharo, frijol y soya y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, colza y los - - organismos modelo relacionados estrechamente Arabidopsis thaliana . Las plantas con poco fitato como se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 5,689,054 and y en la patente de E.U.A. número 6,111,168 son ejemplos de plantas manipuladas .

Los ejemplos de partes de las plantas son el tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemos. Además los compartimientos de células vegetales específicos, tales como cloroplastos , apoplastos, mitocondrias , vacuolas, peroxisomas y citoplasma se considera que son una parte de una planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera que es una parte de una planta. De igual manera, las partes de una planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran como partes de una planta, por ejemplo embriones, endospermas, aleuron y cubiertas de semillas.

También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la descendencia de estas plantas, partes de las plantas o células vegetales .

La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir de acuerdo con métodos conocidos en el ámbito. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye al incorporar uno o más construcciones de expresión que codifican para un polipéptido de la presente invención en el genoma hospedador vegetal y 5 propagar la planta modificada resultante o la célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal .

Convenientemente, la construcción de expresión es una construcción de ácido nucleico la cual comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido 10 de la presente invención unido operablemente con secuencias reguladoras apropiadas que se requieren para la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta o la parte de la planta seleccionada. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para ^?- identificar células hospedadoras en las cuales la construcción de expresión se ha integrado y las secuencias de ADN necesarias para introducción en la construcción dentro de la planta en cuestión (esto último depende del método de introducción de ADN que se va a utilizar) . 20 La selección de secuencias reguladoras tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias de señal o de tránsito se determinan, por ejemplo, en base en cuando, donde y como se desea que se exprese el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser - - constitutivo o inducible o puede ser específico de desarrollo, de etapa o de tejido y el producto del gen puede estar dirigido a un compartimiento celular específico, tejido o parte de la planta tal como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para expresión constitutiva se pueden utilizar los siguientes promotores: el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), la ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and prometer activity following transfer to protoplasts by electroporation) , o el promotor actina 1 de arroz (Plant Mo. Biol . 18,675-689.; Zhang W, McElroy D. y Wu R 1991, Analysis of rice Actl 5' región activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Los promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos de pozo de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o a partir de tejidos de acumulación metabólicos tales como meristemos (Ito et al., 1994, Plant Mol. Blol . 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen para la proteína de semillas conocido de Vicia taba (Conrad et al, 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo oleoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941) , el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en el ámbito, por ejemplo como se describe en el documento WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico para hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000) , el promotor del gen adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) , o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de papa (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588) . De igual manera, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o modificaciones en la salinidad, o inducibles por sustancias aplicadas de manera exógena que activen el promotor, por ejemplo etanol o estógenos, hormonas vegetales como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico y/o metales pesados.

Un elemento mejorador promotor también se puede utilizar para obtener una mayor expresión del polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador promotor puede ser un intrón el cual se coloca entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993 supra describe el uso del primer intrón del gen para actina 1 de arroz para incrementar la expresión.

Además, el uso del codón se puede optimizar para las especies vegetales en cuestión para mejorar la expresión (véase Horvath et al, al que se hace referencia antes) .

El gen marcador seleccionable y otras partes de la construcción de expresión se pueden seleccionar de aquellos disponibles en el ámbito.

La construcción de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en el ámbito que incluyen transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al, 1989, Nature 338: 274).

Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es un método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión véase Hooykas y Schilperoort , 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) , y también se puede utilizar para transformar monocotiledóneas , aunque para estas plantas se utilizan con mayor frecuencia otros métodos de transformación. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas , suplementando el enfoque de Agrobacterium es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante) de callos embriónicos o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al, 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiledóneas se basa en transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Después de la transformación, los transformantes que han incorporado en los mismos la construcción de expresión se seleccionan y regeneran en plantas completas de acuerdo con métodos bien conocidos en el ámbito. Con frecuencia el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones mediante la utilización, por ejemplo, de co-transformación con dos construcciones de T-ADN separadas o corte específico de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de fitasa de la presente invención bajo condiciones que generan la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

ANIMALES TRANSGENICOS La presente invención también se relaciona con un animal no humano transgénico y productos ejemplos de los cuales son fluidos corporales tales como leche y sangre, órganos, carne y células animales. Las técnicas para expresar proteínas, por ejemplo en células de mamífero se conocen en el ámbito, véase, por ejemplo, el manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds) , Oxford University Press (1999) , y los otros tres manuales en la serie en relación con transcripción de genes, procesamiento de A N y procesamiento postraduccional . Hablando de manera general, para preparar un animal transgénico, las células seleccionadas de un animal seleccionado se transforman con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de fitasa de la presente invención de manera que expresa y produce el polipéptido. El polipéptido se puede recuperar del animal, por ejemplo, de la leche de animales hembra o el polipéptido se puede expresar para beneficio del animal mismo, por ejemplo, para ayudar a la digestión del animal. Los ejemplos de animales se mencionan en lo siguiente en la sección encabezada pienso de animal .

Para producir un animal transgénico con el objetivo de recuperar el polipéptido de la leche del animal, un gen que codifica para el polipéptido se puede insertar en los óvulos fertilizados de un animal en cuestión, por ejemplo, mediante el uso de un vector de expresión de transgen el cual comprende un promotor de proteína de leche adecuado y el gen que codifica para el polipéptido. El vector de expresión del transgen se microinyecta en óvulos fertilizados y preferiblemente se integra de manera permanente en el cromosoma. Una vez que el óvulo comienza a crecer y dividirse, el embrión potencial se implanta en una madre sustituta y se identifican los animales que presenten el transgen. El animal resultante después se puede multiplicar por cría convencional. El polipéptido se puede purificar de la leche del animal, véase, por ejemplo, Meade, H.M. et al (1999) : Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animáis, Gene expression systems : Using nature for the art of expression. J. M. Fernandez and J. P. Hoeffler (eds) . , Academic Press.

De manera alternativa, con el fin de producir un animal no humano transgénico que presente el genoma de sus células somáticas y/o germinales, una secuencia de ácido nucleico que incluye una construcción de transgen heterólogo que incluye un transgen que codifica para el polipéptido, el transgen se puede unir operablemente a una primera secuencia reguladora para expresión específica de glándula salival del polipéptido, como se describe en WO 00/064247.

COMPOSICIONES Y USOS En aspectos adicionales, la presente invención se relaciona con composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención así como métodos para uso de estos.

Las composiciones polipeptídicas se pueden preparar 0 de acuerdo con métodos conocidos en el ámbito y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición polipeptídica puede estar en forma de granulados o microgranulados . El polipéptido que se va a incluir en la composición puede ser estabilizada de acuerdo con métodos 5 conocidos en el ámbito.

La fitasa de la invención se puede utilizar para degradación, en cualquier contexto industrial de, por ejemplo, fitato, ácido fítico y/o el mono-, di-, tri-, tetra- y/o penta-fosfatos de y/o inositol. Es bien sabido que las 0 porciones fosfato de estos compuestos forman quelatos con cationes divalentes y trivalentes tales como iones metálicos, es decir, los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio, así como minerales en trazas de manganeso, cobre y molibdeno. Además, el ácido fítico también (- en cierta medida se une a proteínas por interacción electrostática .

En consecuencia, los usos preferidos de los polipéptidos de la invención son en preparaciones de pienso de animal (que incluyen alimentos humanos) o en aditivos para estas preparaciones.

En una modalidad particular, el polipéptido de la invención se puede utilizar para mejorar el valor nutricional de un pienso de animal. Los ejemplos no limitantes de mejoramiento del valor nutricional del pienso de animal (que incluye alimento para humanos) son: digestibilidad del pienso mejorada; promoción del crecimiento del animal; mejoramiento de utilización del pienso; biodisponibilidad mejorada de proteínas; incremento en el nivel de fosfato digerible; mejoramiento de la liberación y/o degradación de fitato, mejoramiento de la biodisponibilidad de minerales en trazas; mejoramiento de la biodisponibilidad de macrominerales; eliminación o reducción de la necesidad de agregar fosfato suplementario, minerales en trazas y/o macrominerales; y/o mejoramiento de la calidad de la cascara de huevo. El valor nutricional del pienso por lo tanto se incrementa y la tasa de crecimiento y/o la ganancia de peso y/o la conversión de pienso (es decir, el peso de pienso ingerido en relación a la ganancia de peso) del animal se puede incrementar.

Además, el polipéptido de la invención se puede utilizar para reducir el nivel de fitato del estiércol. Las - - variantes de fitasa de la invención también se pueden utilizar en un método para producir un producto de fermentación que comprende: (a) fermentación utilizando un microorganismo de fermentación de un material que contiene carbohidratos en presencia de una fitasa de la invención, y (b) producir el producto de fermentación o el coproducto de fermentación a partir del material que contiene carbohidratos fermentados .

Cuando se utiliza para este propósito, los productos de fermentación preferiblemente son etanol, cerveza, vino o granos secos de destilería (DDG, por sus siglas en inglés) .

ANIMALES, PIENSO DE ANIMALES Y ADITIVOS DE PIENSO DE ANIMALES El término animal incluye todos los animales, que incluye a los seres humanos. Los ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como borregos, chivos y ganado, por ejemplo vacas tales como ganado para carne y vacas productoras de leche. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo, cerdo o marrano (que incluyen pero que no se limitan a lechones, cerdos en crecimiento y marranas) ; aves de corral tales como pavos, patos y pollos (que incluye pero que no se limita a pollos chicos, gallinas); peces (que incluye, pero que no se limita a salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpa) ; y crustáceos (que incluye pero que no se limita a camarón y gamba) .

El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada o diseñada para ingestión por un animal.

En el uso de acuerdo con la invención, el polipéptido puede ser alimentado al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

En una modalidad particular, el polipéptido, en forma en la cual se agrega el pienso o cuando se incluye en un aditivo de pienso, está sustancialmente puro. En una modalidad particular, está bien definido. El término "bien definido" significa que la preparación de fitasa es por lo menos 50% pura, determinada por cromatografía de exclusión de tamaño (véase el ejemplo 12 del documento WO 01/58275) . En otras modalidades particulares, la preparación de fitasas es de por lo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o por lo menos 95% puro, determinado por este método.

Es ventajosa una preparación de polipéptido sustancialmente puro y/o bien definida. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al pienso un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos que interfieren o que contaminan. El término dosis se refiere correctamente en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes y la capacidad de optimizar la dosificación en base en el efecto deseado.

No obstante, para uso en pienso de animales, el polipéptido de fitasa de la invención no necesita ser tan puro; puede incluir, por ejemplo, otros polipéptidos , en cuyo caso se le puede denominar una preparación de fitasa.

La preparación de fitasa puede ser: (a) agregada directamente al pienso (o se puede utilizar directamente en un procedimiento de tratamiento de proteínas) o (b) se puede utilizar en la producción de una o más composiciones intermediarias tales como aditivos de pienso o premezclas que subsecuentemente se agregan al pienso (o que se utilizan en un procedimiento de tratamiento) . El grado de pureza descrito en lo anterior se refiere a la pureza de la preparación polipeptídica original, ya sea utilizada de acuerdo con el inciso (a) o (b) anterior.

Las preparaciones polipeptídicas con purezas en este orden de magnitud se pueden obtener en particular utilizando métodos de producción recombinantes mientras que no son obtenidas fácilmente y también sometidas a una variación lote a lote mucho mayor cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicionales.

Tal preparación polipeptídica por supuesto se puede mezclar con otros polipéptidos.

El polipéptido se puede agregar al pienso en cualquier forma, puede estar como un polipéptido relativamente puro o en mezcla con otros componentes diseñados para adición al pienso animal, es decir, en forma de aditivos de pienso animal tales como los denominados premezclas para pienso animal.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con composiciones para uso en pienso animal, aditivos de pienso animal, por ejemplo premezclas.

Además del polipéptido de la invención, los aditivos de pienso animal de la invención contiene por lo menos una vitamina soluble en grasa y/o por lo menos una vitamina hidrosoluble y/o por lo menos un mineral en trazas. El aditivo de pienso también puede contener por lo menos un macromineral .

De manera adicional, y opcional, los ingredientes de aditivos de pienso son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tales como ß-caroteno, astaxantina y luteína; compuestos aromáticos; estabilizantes; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especies generadoras de oxígeno reactivo; y/o por lo menos otro polipéptido que se selecciona de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); fosfatasa (EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC 3.1.3.39); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); a-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa Al (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, a-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o ß-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6) .

En una modalidad particular estos otros polipéptidos están bien definidos (como se define en lo anterior para preparaciones de fitasa) .

La fitasa de la invención también se puede combinar con otras fitasas, por ejemplo fitasas de ascomicete tal como fitasas de Aspergillus, por ejemplo derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger o Aspergillus awamori; o fitasas de basidiomicete , por ejemplo derivadas de Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Trametes pubescens o Paxillus involutus; o derivados, fragmentos o variantes de los mismos los cuales tienen actividad de fitasa.

De esta manera, en modalidades preferidas del uso en pienso de animal de la invención y en modalidades preferidas del aditivo de pienso de animal y el pienso de animal de la invención, la fitasa de la invención se combina con tales fitasas.

Los ejemplos de péptidos antimicrobianos (A P, por sus siglas en inglés) son CAP18, Leucocina A, tritrpticina, protegrina-1 , tanatina, defensina, lactoferrina , lactoferricina y ovispirina tal como novispirina (Robert Lehrer, 2000) , plectasinas y estatinas que incluyen los compuestos y polipéptidos descritos en los documentos WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

Los ejemplos de polipéptidos antimicóticos (AFP, por sus siglas en inglés) son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos los cuales retienen actividad antimicótica, como se describe en los documentos WO 94/01459 y WO 02/090384.

Los ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos poliinsaturados de 18 átomos de carbono, 20 átomos de carbono y 22 átomos de carbono, tales como ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentaenoico y ácido ?-linoleico.

Los ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son sustancias químicas tales como perborato, persulfato o percarbonato ,· y polipéptidos tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

Habitualmente las vitaminas solubles en grasa y agua así como minerales en trazas forman parte de lo que se denomina la premezcla diseñada para adición al pienso mientras que los macrominerales habitualmente se agregan por separado al pienso. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con un polipéptido de la invención, es un aditivo de pienso de animal de la invención.

En una modalidad particular, el aditivo de pienso de animal de la invención está diseñado para ser incluido (o prescrito para tener que ser incluido) en dietas o en pienso animal en concentraciones de 0.01 a 10.0%; de manera más particular 0.05 a 5.0%; o 0.2 a 1.0% (% significa g de aditivo por 100 g de pienso) . Esto es así, en particular para premezclas .

Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: Los ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3 , vitamina E y vitamina K, por ejemplo vitamina K3.

Los ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina Bl, vitamina B2 , vitamina B6 , niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato .

Los ejemplos de minerales en trazas son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto.

Los ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

Los requerimientos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) se incluyen en la tabla A del documento O 01/58275. El requerimiento nutricional significa que estos componentes se deben proporcionar en la dieta en las concentraciones indicadas.

En la alternativa, el aditivo de pienso de animal de la invención comprende por lo menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275. Por lo menos uno significa cualquiera de uno o más de, uno o dos, o tres o cuatro y así sucesivamente hasta la totalidad de los trece o hasta la totalidad de los quince componentes individuales. De manera más específica, esté por lo menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal que proporciona una concentración en el pienso dentro del intervalo indicado en la columna 4, o la columna 5 o la columna 6 de la tabla A.

La presente invención también se relaciona con composiciones de pienso de animal. Las composiciones o dietas de pienso de animal tienen un contenido de proteína relativamente alto. Las dietas de aves de corral y cerdos se pueden caracterizar como se indica en la tabla B del documento WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además, estas dietas para peces habitualmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.

El documento WO 01/58275 corresponde al documento de E.U.A. 09/779334, el cual se incorpora en la presente como referencia .

Una composición de pienso de animal de acuerdo con la invención tiene un contenido de proteína cruda de 50- - - 800 g/kg y además comprende por lo menos un polipéptido como se reivindica en la presente.

Además, o de manera alternativa (al contenido de proteína cruda indicado antes) , la composición de pienso de animal de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0.1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50 g/kg.

En modalidades particulares, el contenido de energía metabilizable , en proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína y/o lisina está dentro de cualquiera de los intervalos 2, 3, 4 ó 5 en la tabla B del documento WO 01/58275 (R.2-5).

La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6.25, es decir, proteína cruda (g/kg) = N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed. , Association of Official Analytical Chemists, Washington DC) .

La energía metabolizable se puede calcular en base en los requerimientos de nutrientes de la publicación NRC en porcinos, novena edición revisada 1988, subcomité de nutrición porcina, comité de nutrición animal, departamento de agricultura, consejo de investigación nacional. National Academy Press, Washington, D.C., p . 2-6, and the European Table of Energy Valúes for Poultry Feeds-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extensión, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv. Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

El contenido de calcio en la dieta, el fósforo disponible y los aminoácidos en dietas completas de animales se calcula en base en las tablas de pienso tal como Veevoerdertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

En una modalidad particular, la composición de pienso de animales de la invención contiene por lo menos una proteína. La proteína puede ser una proteína animal, tal como carne y harina de huesos; y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal. El término proteínas vegetales, como se utilizan en la presente, se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye por lo menos una proteína derivada o que se origina de un vegetal, que incluye proteínas modificadas y derivados de proteína. En modalidades particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50 ó 60% (p/p) .

Las proteínas vegetales se pueden derivar de fuentes de proteína vegetal tales como legumbres y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de frijol de soya, harina de lupino y harina de colza .

En una modalidad particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo frijol de soya, lupino, chícharo o f ijol .

En otra modalidad particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo remolacha, remolacha de azúcar, espinaca o quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son colza, semilla de girasol, semilla de algodón y calabaza.

El frijol de soya es una fuente de proteína vegetal preferida .

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (elote), arroz, tritical y sorgo.

En modalidades particulares adicionales, la composición de pienso animal de la invención contiene 0-80% del maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soya; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y hueso; y/o 0-20% de suero.

Las dietas para animales se pueden fabricar, por ejemplo, como un pienso macerado (no sedimentado) o un pienso sedimentado o un pienso extruido. Típicamente, las materias alimenticias molidas se mezclan y se agregan cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para las especies en cuestión. Se pueden agregar polipéptidos como formulaciones de polipéptidos sólidos o líquidos. Por ejemplo, una formulación de polipéptido sólido típicamente se agrega antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación de polipéptido líquido típicamente se agrega después de la etapa de sedimentación. El polipéptido también se puede incorporar en un aditivo de pienso o premezcla.

La concentración de polipéptido final en la dieta está dentro del intervalo de 0.01-200 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta, por ejemplo en el intervalo de 5-30 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta animal.

La fitasa de la invención por supuesto se debe aplicar en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutricional del pienso. Actualmente se contempla que el polipéptido se administra en una o más de las siguientes cantidades (intervalos de dosificación): 0.01-200; 0.01-100; 0.5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0.05-50; o 0.10-10 - todos - - estos intervalos están en mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de pienso (ppm) .

Para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de pienso, la fitasa se purifica a partir de la composición de pienso y se determina la actividad específica de la fitasa purificada utilizando un análisis relevante. La actividad de fitasa de la composición de pienso como tal también se determina utilizando el mismo análisis y, en base en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína de fitasa por kg de pienso.

Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa en aditivos de pienso. Por supuesto, si una muestra está disponible de la fitasa utilizada para la preparación del aditivo de pienso o del pienso, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (no se necesita purificar la fitasa a partir de la composición de pienso o el aditivo) .

La invención descrita y reivindicada en la presente no debe limitarse al alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, dado que estas modalidades se pretende que sean ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente se pretende que se encuentre dentro del alcance de esta invención. En realidad, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente se volverán evidentes para aquellos expertos en el ámbito a partir de la descripción precedente. Las modificaciones también se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción que incluye las definiciones.

En la presente se hace referencia a diversas referencias, cuya descripción se incorpora como referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Las sustancias químicas utilizadas son productos comerciales de por lo menos grado reactivo.

EJEMPLO 1: PREPARACION DE VARIANTES Y DETERMINACION DE ACTIVIDAD Preparación de variantes de fitasa Expresión de variantes de fitasa en Aspergillus oryzae Las construcciones que comprenden los genes variantes de fitasa de Hafnia en los ejemplos se utilizaron para construir los vectores de expresión para Aspergillus. Los vectores de expresión para Aspergillus consisten en cásete de expresión basado en el promotor de amilasa II neutra de Aspergillus niger fusionado a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (Tamg) . También están presentes en el plásmido el marcador selectivo de Aspergillus amdS a partir de Aspergillus nidulans que habilita el crecimiento en acetamida como única fuente de nitrógeno. Los plásmidos de expresión para las variantes de fitasa se transforman en Aspergillus como se describe en Lassen et al. (2001), Applied and Environmental icrobiology, 67, 4701-4707. Para cada una de las construcciones se aislan 10-20 cepas, se purifican y cultivan en matraces de agitación.

Purificación de variantes de fitasa de Hafnia alvei El sobrenadante de fermentación con la variante de fitasa se filtra a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un límite de 0.22 µt?. La solución resultante se diluye con agua hasta duplicar el volumen y se ajusta el pH a 4.5 con ácido acético. Ocasionalmente la solución se vuelve un poco turbia y esto se separa por filtración a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un límite de 0.22 u .

Después de pretratamiento, la variante de fitasa se purifica por cromatografía en S Sepharose, aproximadamente 30 mi en una columna XK26, utilizando un amortiguador de acetato de sodio A 50 mM, pH 4.5 y como amortiguador B acetato de sodio 50 mM + NaCl 1 M pH 4.5. Las fracciones de la columna se analizan para determinar actividad utilizando el análisis de fosfatasa (véase más adelante) y se acumulan las fracciones con actividad.

Finalmente, la solución que contiene la variante de fitasa purificada se concentra utilizando un dispositivo de filtración Amicon ultra-15 con una membrana con límite de 30 kDa.

El peso molecular, calculado a partir de SDS-PAGE, es de aproximadamente 45 kDa y la pureza es de > 95%.

Determinación de actividad de fosfatasa Una solución de enzima que contiene fitasa 75 µ? se suministra en un pozo de placa de microtitulación, por ejemplo NU C 269620 y se agregan 75 µ? de sustrato (para preparar el sustrato se disuelven dos tabletas de fosfato de p-nitrofenilo 5 mg (Sigma, Cat . N-9389) en 10 mi de amortiguador de acetato de Na 0.1 M, pH 5.5) . La placa se sella y se incuba durante 15 min, se agita con 750 rpm a 37 °C. Después de un tiempo de incubación se agregan 75 µ? de reactivo de detención (el reactivo de detención es tetraborato disódico 0.1 M en agua) y la absorbencia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Una unidad de fosfatasa se define como la actividad de enzima que libera 1 micromol de fosfato/min bajo las condiciones de reacción dadas (restando amortiguador ciego) . La absorbancia de 1 micromol de p-nitrofenol se determina que es de 56 AU (AU = unidades de absorbancia, en inglés) bajo condiciones de análisis .

Determinación de la actividad de fitasa Una cantidad de 75 µ? de solución de enzima que - - contiene fitasa, se diluyen aproximadamente en acetato de sodio 0.25M, Tween-20 0.005% (p/v) , pH 5.5 y se suministran en un pozo de placa de microtitulación, por ejemplo NUNC 269620 y se agregan 75 microlitros de sustrato (que se prepara al disolver 100 mg de fitato de sodio de arroz (Aldrich Cat . No. 274321) en 10 mi de amortiguador de acetato de sodio 0.25M, pH 5.5) . La placa se sella y se incuba 15 min, se agita con 750 rpm a 37°C. Después de incubación, se agregan 75 microlitros de reactivo de detención (el reactivo de detención se prepara al mezclar 10 mi de solución de molibdato (10% (p/v) , heptamolibdato de amonio en una solución de amoníaco 0.25% (p/v)), 10 mi de vanadato de amonio (0.24%, producto comercial de Bie&Berntsen, Cat. No. LAB17650) y 20 mi de 21.7% (p/v) de ácido nítrico) y se mide la absorbancia a 405 nm en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La actividad de fitasa se expresa en unidad de FYT, una FYT es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de orto-fosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones anteriores. Un valor absoluto para la actividad de fitasa medida se puede obtener con referencia a una curva estándar preparada a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico o con referencia a una curva estándar elaborada a partir de diluciones de una preparación de enzima fitasa con actividad conocida (tal preparación de enzima estándar con actividad conocida está disponible según se solicite de Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd) .

EJEMPLO 2: ACTIVIDAD ESPECIFICA La actividad específica de una variante de fitasa se determina en muestras altamente purificadas dializadas contra acetato de sodio 250 mM, pH 5.5. La pureza se verifica de antemano en un gel de poliacrilamida SDS que muestra la presencia de solo un componente.

La concentración de proteína se determina por análisis de aminoácidos como sigue: Una alícuota de la muestra se hidroliza en HC1 6N, fenol 0.1% durante 16 h a 110 °C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes se cuantifican utilizando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A operado de acuerdo con las instrucciones de fabricante. A partir de las cantidades de los aminoácidos se puede calcular la masa total - y por lo tanto también la concentración - de la proteína en la alícuota hidrolizada .

La actividad de fitasa se determina en las unidades de FYT como se describe en el Ejemplo 1 ("Determinación de actividad de fitasa"), y la actividad específica se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína de enzima variante de fitasa.

EJEMPLO 3 : ESTABILIDAD A LA TEMPERATURA Se utiliza E. coli DH12S (disponible de Gibco BRL) para el rescate del plásmido de levadura.

El vector pJHPOOO es un vector lanzadera de S. cerevisiae y E. coli bajo el control del promotor TPI, construido a partir de pJC039 5 descrito en el documento WO 01/92502, en el cual se ha insertado el gen para fitasa de Hafnia alvei.

Se utiliza Saecharomyees cerevisiae YNG318: MATa Dpep4 [cir+] ura3-52, Ieu2-D2, his 4-539 para expresión de variantes de fitasa. Se describe en J. Biol . Chem. 272 (15), 0 pp 9720-9727, 1997.

Medios y sustratos Solución basal 10X: base de nitrógeno en levadura sin aminoácidos (DIFCO) 66.8 g/1, succinato 100 g/1, NaOH 60 g/1.

SC-glucosa: glucosa 20% (es decir, una 15 concentración final de 2% = 2 g/100 mi)), 100 ml/1, 5% de treonina 4 ml/1, 1% de triptofano 10 ml/1, 20% de casamino ácidos 25 ml/1, solución basal 10 X, 100 ml/1. La solución se esteriliza utilizando un filtro de un tamaño de poro de 0.20 micrómetros. Se someten a autoclave juntos agar y H20 20 (aproximadamente 761 mi) y se esteriliza por separado una solución de SC-glucosa agregada a la solución de agar.

YPD : Bacto peptona 20 g/1, extracto de levadura 10 g/1, 20% de glucosa 100 ml/1.

Solución PEG/LiAc: 40% de PEG4000 50 mi, acetato de __. litio 5M, 1 mi Manipulaciones de ADN A menos que se indique en otro sentido, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizan utilizando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. and Cutting, S.M. (eds) .

Transformación de levadura La transformación de levadura se lleva a cabo por el método de acetato de litio. Se mezclan 0.5 µ? del vector (digerido por endonucleasas de restricción) y 1 µ? de fragmentos de PCR. Se recalientan células YNG318 competentes en hielo. Se mezclan 100 µ? de las células, la mezcla de ADN y 10 µ? del ADN portador (Clontech) en tubos de polipropileno de 12 mi (Falcon 2059). Se agregan 0.6 mi de solución PEH/LIAc y se mezcla ligeramente. Se incuba durante 30 minutos a 30°C y 200 rpm. Se incuba durante 30 minutos a 42 °C (choque térmico) . Se transfiere a un tubo Eppedndorf y se somete a centrifugación durante 5 seg. La separación del sobrenadante y se resuelve en 3 mi de YPD. Se incuba la suspensión celular durante 45 min a 200 rpm a 30°C. Se vierte la suspensión en placas de SC-glucosa y se incuba a 30°C durante 3 días para producir las colonias. El ADN total de levadura se extrae por el método de Robzyk y Kassir descrito en Nucleic acids research vol . 20, No. 14 (1992) 3790.

Secuenciado de ADN La transformación de E. coli para secuenciado de ADN se lleva a cabo por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser) . Se preparan plásmidos de ADN por el método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el equipo QiagenMR Plasmid Kit . Se recuperan fragmentos de ADN del gel de agarosa por el equipo de extracción en gel Qiagen. Se 0 realiza la PCR utilizando un equipo PTC-200 DNA Engine. Se utiliza el analizador genético ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer para determinación de todas las secuencias de ADN. Construcción del vector de expresión de fitasa El gen para fitasa de Hafnia se amplifica con los pares cebadores (HafPhyF y HafPHyR) . Los fragmentos de PCR resultantes se introducen en S. cerevisiae YNG318 junto con el vector pJC039 digerido con las enzimas de restricción para quitar la parte madura de el gen para cutinasa de Huicola insolens.

HafPhyF (34 unidades) 0 CTCCTGAACTTGTTGCCCGGTCGGATACAGCCCC HafPhyR (39 unidades) ATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAGGGGAGCTGACATG El plásmido, el cual se denomina como pJHPOOO a partir de los transformantes de levadura en placas de SC-¡. glucosa se recupera y la secuencia interna se determina que - - confirma el gen para fitasa.

Construcción de la biblioteca de levadura y variantes dirigidas a sitio La biblioteca en levadura y las variantes dirigidas 5 a sitio se construyen por el método de PCR SOE (siglas en inglés para empalmado por extensión de superposición, véase "PCR: A practical approach" , p. 207-209, Oxford University press, eds . McPherson, Quirke, Taylor) , seguido por recombinación in vivo en levadura. 10 Cebadores generales para amplificación y secuenciado Se utilizan los siguientes cebadores para producir fragmentos de ADN que contienen cualquier fragmento mutado por el método SOE junto con cebadores degenerados (AM34 + cebador inverso y A 35 + cebador directo) o solo para , c- amplificar un gen para asparaginasa completo (AM34 + AM35) .

AM34 TAGGAGTTTAGTGAACTTGC AM35 TTCGAGCGTCCCAAAACC Sistema de reacción de PCR Condiciones 48.5 µ? de H20 1 94°C 2 min 2 esferas puRe Taq Ready-To-Go PCR 2 94°C 30 seg Esferas (Amersham biosciences) 3 55°C 30 seg 0.5 µ? X 2100 pmol/micro L cebadores 4 72°C 90 seg 0.5 µ? ADN plantilla 2-4 25 ciclos 5 72°C 10 min Los fragmentos de ADN se recuperan de gel de - - agarosa por el equipo de extracción en gel Qiagen. Los fragmentos purificados resultantes se mezclan con el digerido de vector. La solución mixta se introduce en Saccharomyces cerevisiae para construir bibliotecas de variantes dirigidas a sitio por recombinación in vivo.

Cribado de biblioteca (el análisis de membrana primaria) Las bibliotecas de levadura se cultivan en una placa SC-glucosa con una membrana de acetato de celulosa (parte superior) y una membrana de Biodyne C (de Pall gelman) (inferior) a 30°C durante por lo menos 3 días. Las membranas BiodyneC se transfieren a placas preincubadas que contienen amortiguador de acetato 20 mM, pH 4.0 y se incuban durante 1-2 horas a cierta temperatura (50°C en el caso de WT como una estructura principal) .

Después las membranas se separan y se enjuagan en la solución de sustrato fresca (10 mi de amortiguador de acetato 20 mM, pH 4.0; 0.01 g de fosfato de a-naftilo (Sigma) ; 0.02 g de Fast Garnet GBC (Sigma) ) . Los clones de levadura que corresponden a las posiciones del color rojo desarrollado en las membranas de BiodyneC se aislan de las membranas de acetato de celulosa.

Cribado de biblioteca (la selección de actividad relativa secundaria) Se inoculan clones de levadura en membranas de acetato de celulosa a un pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos y se cultivan a 28°C durante 3 días. Se mide la actividad de fitasa tanto a 37°C como a una temperatura superior (60, 62, 64, 66°C, etc.), para determinar la actividad relativa a cierta temperatura. Después, los clones con mayor actividad relativa se seleccionan y se confirma la secuencia .

Sustrato, solución de fitato de sodio 2,0 mM (cada vez) Ejemplo de preparación de 100 mi: Fitato de sodio 0.1847 g Amortiguador de acetato 0.1M, pH 4.0 hasta 100 mi Reactivo formador de complejo Ejemplo de preparación de 200 mi: FeS04.7H20 14.64 g 5 Solución de heptamolibdato de amonio, hasta 200 mi Reactivo de detención de complejo Ejemplo de preparación de 600 mi de reactivo de detención de complejo H2S04 0.5M 200 mi 10 Reactivo formador de complejo 400 mi Solución de heptamolibdato de amonio Ejemplo de preparación de 100 mi: (NH4) 6??7?24.4?2? 10.0 g Ácido sulfúrico 32 mi ^?- Agua desmineralizada hasta 100 mi Los resultados se proporcionan a continuación. La columna que indica la actividad relativa proporciona la primera actividad relativa de la variante y posteriormente la actividad relativa de 20 la fitasa de referencia utilizada en la determinación. La referencia es natural o las variantes números 62, 69, 84, 104, 105, 113 y/o 138. Las variantes típicamente se utilizan como referencia cuando la actividad residual de la forma natural es ? _ b_. muy baja.

RESULTADOS Q9S/E100W/R160G/A217G/H363R 45% a 72eC(WT9%) D92Y/E100W/A217G/H363R (Referencia) 79% a 72°C(WT9%) E100W/H115M/A217G/H363R 41% a 72'C(WT9%) E100W/A217G/P348RH363R 63% a 72°C(WT9%) Q9S/A89A/D92Y/H115MA217G/H363R 67% a 72eC(WT9%L A132T 21% a 72"C (WT16%) (Referencia = variante no.62) N78QE100W/A217G/H363R 47% a 72°C(6240%) K76V/N78QE100W/A27G/H363R 47% a 72eC (6240%) D83G/E100W/A217G/H363R 39% a 72eC (6240%) E100W/Y179W/A217G/H363R 48% a 72eC(6240%) E100W/A217G/K234V/K251EV1286T/H363R 60% a 72eC(6240%) E100W/A217G/K234V/P348RH363R 50% a 72eC (6235%) Q9S/R18WA89A/D92Y/H115WA217GK234V/H363R 61% a 72'C (6235%) v2- Q9SD92Y/H115M/A217GK234V/H363R 61% a 72'C (6235%) Q9S/N78Q/D92YL112SH115 K234VP348R 39% a 72eC (6235%) H363R Q9SN78QA89AD92Y/H 15 /A132V/Q162R 64% a 72'C (6235%) Q181L/A217G/K234V/P348R (Referencia) Referencia = WT y/o variante no.69 Q9S/E54C/D92Y/A101 C/H143C/Q193R/I201 C/ 82% a 72'C (6974% A217GH363R WT 14%) E54CN78S/D92Y/A101 C/H 143CL199CA217G/ 74% a 72'C (wt 49% 69 H363R 80%) E54C/A101 C/M168V/A217G/H363R 33% a 72'C (6236% 69 73%) -1 P82S/D92Y/E100W/H143C1201C/A217G/H363R 65% a 72'C (6236% 69 73%) -2 P82S/D92Y/E100W/H143CI201 CA217G/H363R 65% a 72'C (6236% 69 73%) Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115 /A217GK234V/ 65% a 72°C (6236% 69 P348RH363R 73%) D92Y/A217G/K234V/H363R 81% a 72'C (6236% 69 73%) -1 Y64S/D92Y/E100WY179W/A217G/H363R 80% a 72'C (6974% WT 14%) -2 D92Y/A217G/H363R 80% a 72'C (6974% WT 14%) Q9S/N78Q/A89AD92Y/H115 A132V/H143C/ 54% a 74eC (wí 9% 69 Q162RQ181 L/1201 C/A217G/K234V/P348R 45%) Q9S/N78Q/AB9A/D92Y/H1 5M/A132V/K139C/ 75% a 74eC (wt 9% 69 Q162RQ181UI201C/A217G/K234V/P348R 45%) Q9S/N78QA89A/D92YH115MA132V/Q162R 76% a 74eC(wt9%69 Y179W/Q181 L/A217G/K234V/P348R 45%) D33C/D92Y/E100WY179C/A217G/H363R/ 49% a 72'C (6979%) -1 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115 A132V/Q162R/ 103% a 72°C (6988%) Y179W/A217G/K234V/P348R/H363R -3 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ 99% a 72'C (6988%) Y179W/A217G/K234V/S261 F/P348RH363R Referencia = variante no.69 ?/? variante 84 101 D92Y/E100W/A217G/H363R/+ 16-123(HQQNTQQA- 21% a 76eC (6939%, >TQADTSSP) 8455%) 102 Q9SE54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C 29% a 76eC (6939%.

A217G/N298S/H363R +116- 23{HQQNTQQA- 8455%) >TQADTSSP) 104 Q9SN78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K 39C/ 55% a 74°C (6957% 84 G151 D/Q162RY179W/Q181 L/1201 C/A217G/ 65%) K234V/P348R (referencia) 05 D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R 77% a 74eC (6957% 84 (referencia) 65%) Referencia = variante no.104 y variante 69 106 E54CD92Y/A10 C/M168V/A217G/H363R 22% a 74°C(10470% 6954%) 107 Q9S/N78QA132V/K139C/Q162RY179W/I201C 34% a 74eC(10470% A217GK234UP348R/H363R 6954%) Referencia = variante no.105 108 D92Y/E 100W/H 143C/A144R/I201 CA217G/ 37% a 80eC(10536%) N247D/H363R 109 D92Y/E1 OOW/H 116S/K139C/I201 C/A217G/ 43% a 78°C(10536%) N247D/H363R 110 D92Y/E100W/H128R/K139C/H143V/I201C/ 44% a 78X(10536%) A217G/N247D/H363R 111 D92Y/E100WK139C/I201 C/N206G/A217G/ 45% a 78eC(10536%) N247CVH363R 112 D92Y/E100WK139C/I201 C/A217G/ 247D/ H363R 51% a 78°C(10536%) 113 D92Y/E100W/K13901201 CA217G/N247D/ 98% a 78*0(10536%) Q256D/H363R 114 D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/N247D/ H363R 49% a 78°C(10536%) 115 D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/N247D/ 32% a 78*0(10536%) N344KH363R 117 D92Y/E100W/K139C/A144S/K176E/I201C 38% a 800(10534%) A217GK234V/N247DH363R 118 D92Y/E 00W/K139C/I20 CA217G/K234V/ 32% a 80C (10534%) N247D/H363R/E54CH55EA101 C 123 D92Y/E100W/K139C/T152A/1201 CA217G/ 27% a 80C(10515%) K234V/N247D/H363R 124 Y48HD92Y/E100WK139CT1521/1201 C/ 17% a 800(10515%) A217GK234V/N247D/H363R 125 D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/ 20% a 800(10515%) N247D/S284C/H363R 126 D92Y/E10OWK139CI201 C/A217GK234V/ 20% a 800(10515%) N247D/T287W/H363R 127 D92YE100W/K139C/I201 C/A217GK234V/ 18% a 800(10515%) N247D/R289MH363R 128 Y48H/D92Y/E100WK139C/I201 C/A217GI 17% a 800(10515%) K234V/N247D/R289WH363R 129 N78QD92Y/E 100W/ 139C/I201 CA217G/ 103% a 800(10534%) K234V/ 247DQ256D/H363R 130 D92Y/E100W/K139C/I201 C/A27GK234V/ 99% a 800 (10534%) N247D/Q256D/P348R/H363R 131 D92Y/E100W/K139C/Q162RQ181IJI201C/ 76% a 80C (10534%) A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 132 D92Y/E100W/A113G/K139C/I201 CA217G/ 34% a 80C(10534%) K234V/N247D/H363R 133 D92Y/E100W/T120GorA7K139C/I2010/ 41% a 80C(10534%) A217GK234V/N247DH363RL395LorV 135 D92Y/E100W/K139CI201 C/A217G/K234V/ 24% a 800(10534%) N247D/S284MH363R 137 D92Y/E100W/K139C/1201 C/A217G/K234V/ 31% a 80C(10534%) N247D/H363RA366S 138 D92Y/E100W/K139CI201 CA217G/K234V/ 89% a 80C(10514%) N247W/Q256D/H363R 140 D92Y/E100W/H128R/K139CI201C/A217G/ 49% a 80C (10514%) K234V/N247E/Q256D/H363R 141 D92Y/E100W/K139C/Q 141 S/I201 C/A217G/ 24% a 80C(10514%) 234V/N247D/H363R 142 D92 Y/E100 W/K139C/A144S/I201 C/A217G/ 18% a 80C(10514%) K234V/N247DH363R 144 P75N/ 76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/ K139C/ 71% a 800(10530%) 120 C/A217GK234V/N247D/Q256D/H363R 145 D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201 C/ 27% a 80C (10530%) A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 147 D92Y/E100W/K139CT152A/I201 CA217G/ 90% a 80C (10526%) K234V/N247D/Q256D/I294T/H363R Referencia = variante no.113 143 D33N/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ 29% a 800(11362%) K234 V/N247 D/Q256D/H363R 148 Y48H/D92Y/E100W/K139C/T1521/1201 C/ 74% a 800(11380%) A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 150 D92Y/E100W7K139C/T152A/I201 C/A217G/ 67% a 820(11333%) K234V/N247D/Q256D/H363R 151 D92Y/T98S/E100VW 139CT152A/I201 Cl 29% a 820(11333%) A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 152 D92Y/T98S/E 100WK139C/T152A/L199S/ 38% a 800(11380%) 1201 CA217G/K234VN247W/Q256D/H363R 153 Y48H/D92YT98S/E100W/K139Cm52A/ 38% a 800(11354%) 1201 C/A217G/K234V/ 247W/Q256D/H363R 154 E54C/D92Y/A101C/ 139C/I201CA217G/ 91% a 800(11373%) K234V/N247D/Q256D/H363R 155 Y48H/E54C/D92Y/A101 C/K139CI201 C/ 88% a 800(11380%) A217G 234V/N247D/R289W/H363R 156 D92Y/T98S/E100W 1390?? 52A/I201 C/ 41% a 820(11333%) A217G/ 234V/N247W/Q256D/R289W/H363R 157 Y48H/D92E100W/K1390?? 52I/I201 C/A217G/ 79% a 800(11380%) K234V/N247W/Q256D/R289W/H363R 158 Y48H/D92Y/E100W/K139CI201 CA217G/ 95% a 800(11380%) K234V/N247W/Q256D/H363R 159 Y48HD92Y/E100W/K139CT152AI201 C 20% a 800(11357%) A217G/K234V/N247D/R289WH363R 160 Y48HD92 Y/E100W/K139CT152AI201 C/ 92% a 800(11380%) A217GK234V/ 247W/Q256D/H363R 161 Y48HE54C/D92Y/A101 C/K139CT152A/ 55% a 80C(11380%) I201C/A217GK234V/N247D/R289W/H363R 162 Y48H/E54C/D92Y/A101 C/K139C/I201 C/A217G/ 56% a 80C(11380%) K234V/N247W/R289WH363R 163 Y48H/E54C/D92Y/A101 C/K139CT152AI201 C/ 66% a 80C(11380%) A217G/K234V/N247W/R289W/H363R Referencia = variante no.138 164 Y48H/E54C/D92Y/E10OW/A101 C/K139Cm 52A/ 94% a 80C(13878%) 1201 CA217GK234V/N247W/Q256D/H363R 165 Y48H/E54C/D92Y/A101CK139C/T152A/I201C/ 65% a 80C (13878%) V208T/A217G/ 234V/N247D/R289W/H363R 166 T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/ 15% a 80C(13878%) D92Y/A101 CK139CT152A/I201 C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R 167 Y48H/E54CD92Y/A101 C/K139CT 52A/I201 C/ 61% a 80C(13878%) K207CW208T/A217Grt<234V/N247D/R289Vv7H363R Referencia = wt 168 E54CD92Y/A101 C/K139C/I201 C/A217G/ 69% a 80C(w7%) Q256D/H363R 169 E54CP75NK76N/D77Q/N78T/D92Y/A101 C/ 33% a 80C(w7%) K139C/I201 C/A217G/H363R 170 E54C/D92Y/A101 C/K139CI201 CV208T/ 32% a 80C(w7%) A217G/H363R 171 E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101 C 36% a 80C(w7%) K139CI201 CV208T/A217G/H363R 172 Y48HE54CP75NK76N/D77Q/N78T/D92Y/ 48% a 80C(w7%) A101C/K139C/T152AI201C/V208T/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R 173 E54aP75N/K76N/D77QN78T/D92Y/A101 C/ 50% a 80C( 7%) K139C/I201 C/V208T/A217G/K234V/N239S/N247D/ Q256D/H363R EJEMPLO 4.

TERMOESTABILIDAD Una alícuota de la muestra de proteína de fitasa de Hafnia alvei (purificada como se describe en el ejemlo 1) se elimina la sal y se cambia el amortiguador en acetato de Na 20 mM , pH 4.0 utilizando una columna PD-10 preempacada o se dializa contra 500 mi de acetato de Na 20 mM , 2 veces, pH 4.0 a 4°C en una etapa de 2-3 h, seguido por una etapa durante la noche. La muestra se filtra a 0.45 µp\ y se diluye con amor iguador a aproximadamente 2 unidades A280. El amortiguador de diálisis se utiliza como referencia en calorimetría de exploración diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) . A las muestras se les elimina el gas utilizando succión al vacío y agitación durante aproximadamente 10 minutos.

Se realiza una exploración DSC en un equipo MicroCal VP-DSC a una velocidad de exploración constante de 1.5°C/min desde 20-90°C. El manejo de datos se realiza utilizando el programa MicroCal Origin (versión 4.10) y la temperatura de desnaturalización, Td (también denominada temperatura de fusión, Tm) se define como la temperatura en el vértice del pico en el termograma.

Los resultados de DSC para las variantes de f itasa de Hafnia alvei se resumen en la tabla 3 a cont inuació .

TABLA 3.

TERMOESTABILID D COMPARATIVA DE FITASAS DE Hafnia alvei Variante Td de primera exploración (°C) A150C/L259C 62.4 Q162N/R96N 63.8 L16V/I310 313UM319L/ 354L 64.3 V87I/L103A/L1 12I/A1 13T/11 14V 67.4 E66C/L370C 67.2 H363R 68.3 Q162N/G186S 67.5 E54C/A101 C 68.0 V130L/M137LA 146I/I201V/M260IJI266V 67.8 wt 69 K45P 70.9 K139C/I201 C 70.8 E54C/A101 C/K139C/I201 C 72.6 D92Y/E100W/A217G/H363R 75.1 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H1 15M/A132/K139C/Q162/Q181 IJI201 C/A 75.5 217G/K234V/P348R - 11 - EJEMPLO 5.

PERFIL DE TEMPERATURA El perfil de temperatura (actividad de fitasa como una función de la temperatura) se determinó para la fitasa de Hafnia alvei y variantes en un intervalo de temperatura de 20-90°C esencialmente como se describe en lo anterior ("determinación de actividad de fitasa") . No obstante, las reacciones enzimáticas (100 µ 1 de solución de enzima que contiene fitasa + 100 µ? de sustrato) se realizan en tubos PCR, en vez de placas de m i c r o t i t u 1 a c i ón . Después de un período de reacción de 15 minutos a la temperatura deseada, los tubos se enfrían a 20°C durante 20 segundos y se transfieren 150 µ? de cada mezcla de reacción a una placa de m i c r o t i t u 1 a c i ó n . Se agregan 75 µ? del reactivo de detención y se mide la absorbancia a 405 nm en un e s p e c t r o f o t óme t r o de placa de m i c r o t i t u 1 a c i ón . Los resultados se resumen en la tabla 4 a continuación. Los números propo cionados para cada temperatura son actividad relativa (en %) normalizado a un valor en el óptimo.

TABLA 4 : PERFILES DE TEMPERATURA RELATIVA EN ESTABILIDAD A 75°C ORDEN? Variante de Fitasa Temperatura (°C) 20 30 40 50 60 65 70 75 80 85 90 *wt 18 29 50 75 100 94 93 24 12 7 5 •K131Q 21 34 53 77 94 99 100 26 16 10 6 Q162N/D138N 17 28 44 66 88 100 95 26 14 9 7 I294L 18 30 46 64 90 100 90 26 14 11 11 G72A 17 29 45 67 83 100 78 26 13 11 8 H143C I201 C 10 22 37 62 85 100 91 26 5 5 4 Q162 18 30 49 73 91 100 95 26 15 11 9 I49L 17 29 45 65 90 100 94 26 13 9 11 *E66C/L370C 15 27 43 66 100 88 99 27 12 6 5 T369S 18 28 47 64 92 100 95 27 15 11 9 I201V 16 27 41 59 78 100 82 27 13 11 8 K148R 19 35 51 71 98 97 100 27 11 7 6 A163K 14 27 38 63 79 100 93 27 12 9 6 S1QS 15 26 40 62 87 93 100 27 9 4 2 F8 15 27 38 67 96 100 91 27 10 5 5 F8Y 16 27 44 69 96 100 93 27 10 6 6 T242S 18 30 48 66 91 100 93 27 12 11 10 K176R 17 33 43 66 100 96 96 28 8 5 3 S403N 14 32 42 67 84 100 96 28 14 10 8 S1 P 17 27 44 60 87 100 92 28 13 11 8 E41Q 16 28 44 63 87 100 99 28 13 9 9 * 131L 18 30 50 72 85 95 100 29 15 8 4 *K207R 18 30 48 70 88 93 100 29 15 8 5 *K207Q 23 37 58 81 92 97 100 29 18 10 7 G346S 16 28 47 65 95 100 92 29 10 6 4 T308A 9 17 33 56 80 99 100 29 12 9 6 S396 19 31 44 69 86 100 87 30 14 12 10 L401N 14 33 43 68 86 100 87 30 13 10 7 1201 G 16 28 43 62 81 100 87 30 14 11 8 P348R 18 30 43 62 81 100 91 31 14 11 8 E100W 18 29 40 61 79 100 85 31 13 10 7 K187E 16 28 39 66 90 100 92 31 10 -6 4 N239R 19 30 48 66 89 100 96 32 12 11 10 A304V 15 24 42 58 86 100 98 32 14 11 8 S396D 16 28 41 60 81 100 87 32 13 10 8 T152G 16 28 42 66 85 100 95 32 14 10 9 K12R 18 29 42 64 82 100 98 33 14 12 8 I303L 17 27 40 62 86 100 88 33 13 11 10 Q162N 16 27 42 62 89 90 100 34 10 7 3 S192A 17 26 43 59 88 100 94 35 13 9 9 T369D 18 29 43 66 86 100 90 35 14 12 11 V130L/M137UV1 61/1201 / 13 25 43 67 89 98 100 35 14 10 6 260UI266V Q109G 17 33 44 68 94 100 94 36 11 6 ?23T? 19 31 47 70 92 100 94 38 14 12 11 234V 17 29 42 63 79 100 94 39 15 11 8 K234E 17 27 43 61 86 100 92 40 15 11 7 H363R 18 28 42 66 90 100 90 41 11 6 5 S261A 13 24 39 62 83 98 100 41 14 10 7 A217G 14 32 41 65 84 100 90 43 15 11 7 E64C A101C/K207Q 21 33 48 68 89 100 95 55 13 10 6 K45P 19 29 43 68 86 100 93 59 18 11 10 E54C A101C 16 27 42 64 85 100 88 64 9 7 4 D33C/E54C/A101 C/Y179C 16 31 45 67 94 100 82 74 9 6 3 E54C A101 C K139C/I201 C/ 18 30 41 62 85 80 100 84 36 9 10 K207Q D92Y/E100W/A217G/H363R 6 13 27 50 89 85 100 84 32 10 5 E54C A 01 C/K139C/I201 C 15 28 40 59 86 78 100 86 47 8 9 K139C/I201C 18 25 37 56 91 91 100 87 15 7 4 S1QGPS/ 26H/E54C/A101C/ 26 37 49 67 80 100 92 90 18 13 10 K139C/Q162N/G186S/I201C/ K207Q/ G346S Y48H/E54C/D92Y/A101C/ 10 20 39 63 85 81 100 92 58 11 6 K139C/ T152A/I201C K207Q/ V208T/A217G/K234V/N247D R289W/ H363R T35A/Y48H/E54C/P75N/ K76 5 9 28 50 77 80 100 93 13 5 1 D77Q N78T/D92Y/A101 Cl K139C/ T152A/I201 C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R Y48H/E54C/D92Y/A101 C/ 5 13 26 53 76 83 100 95 75 11 4 K139C/ T152A I201 C V208T/ A217G/ K234V/N247D/ R289VW H363R E54C/D92Y/A101C/K139C 10 15 28 52 81 93 100 96 83 10 1 I201C/ A217G/H363R E54C/D92Y/A101 C/ 139C 9 16 33 58 81 84 100 96 79 18 6 1201 C/ A217G/K234V/N247D/ Q256D/ H363R D92Y/E100W/K139C/I201C/ 6 13 27 49 85 84 100 98 71 13 6 A217G/ 234V/N247D/ H363R P75N/K76N/D77Q/N78T/ 6 15 30 51 81 82 100 98 76 20 5 D92Y/ E100W/K139C/I201C/ A217G/ K234V/N247D/Q256D/ H383R Y48H/D92Y/E100W/ 139 8 11 25 44 78 88 100 99 68 10 2 I201C/A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R Q9S N78Q A89A D92Y/H115IW 8 16 32 54 85 86 100 100 81 14 6 A132V/K139C/ Q162R/Q181UI201C/A217G/ K234V/ P348R Y48H/D92Y/E100W/K139C/ 3 12 24 46 77 89 85 100 75 14 1 I201C/A217G K234V/N247D/ Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/ 4 12 24 45 76 92 87 100 66 14 4 T152I/ I201C/A217G/ 234V/ N247D/ H363R D92Y/E100W/K139C/I201C/ 9 16 22 47 70 81 89 100 78 24 6 A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R D92Y/E100W/K139C/D173 N/ 6 16 37 52 81 89 88 100 37 9 3 P175S/I201 C/A217G/K234V/ N247CV Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W K139C 9 15 22 47 76 91 90 100 68 18 6 1201 C/ V208T/A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R Y48H/E54C/D92Y/A101 C/ 9 16 26 57 78 89 90 100 80 21 7 K139C/ I201C/A217G/K234V/ N247D/ R289W/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C 9 12 19 46 68 76 85 100 77 29 4 1201 A217G K234V/N247W/ Q256D/ H363R Y48H/D92 Y/E100W K139C/ 8 12 20 46 66 78 80 100 81 33 4 T 52A/I201 C/A217G/K234V/ N247W/Q256D/H363R Y48H/E64C D92Y/A101 C 4 8 21 44 80 91 88 100 81 17 3 K139C/ T152A/I201 C/A217G/ K234V/ N247D/R289W/ H363R Y48H/E54C/D92Y/A101 C/ 7 13 22 48 76 87 84 100 82 24 6 K139Q I201C/A217G/K234V/ N247W/ R289W/H363R Y48H/E54C/D92Y/A101 1 5 11 20 46 77 89 79 100 81 27 4 K139C/ T152A/I201 C/A217G/ 234V/ N247W/R289W/H363R Tabla 5: Estabilidad al calor, a 75°C, actividad relativa respecto a la actividad máxima Mutación Actividad relativa Wt 24 K131Q 26 Q162N/D138N 26 I294L 26 G72A 26 H143C I201C 26 Q162R 26 I49L 26 D33C/E54G/A101 C/Y179C 74 E54C/A101C K139C/I201C/ 207Q 84 D92Y/E100W/A217G H363R 84 E54C/A101C/K139C/I201C 86 K139C I201C 87 S1QGPS/K26H E54C/A101C K139C/Q162 G186S I201C/K207Q/G346S 90 Y48H^54C/D92Y/A101C/K139C T152A/I201 C K207CW208T/A217G/ 92 K234V/N247D R289W/H363R T35A/Y48H/E54C/P75N K76N/ D77Q/N78T/D92Y/A10 C/ K139C/ 93 T152A I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201C/V208T/ A217G/ 95 K234V/N247D/ R289W/ H363R E54C/D92Y/A101C/K139C/ 1201 C/ A217G/H363R 96 E54C/D92Y/A101C/K139C 1201 C/ A217G K234V/N247D/ Q256D/ H363R 96 D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/ K234V/N247D/ H363R 98 P75N/K76N/D77Q/N7aT/ D92Y/ E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247D/ 98 Q256D/ H363R Y48H/D92Y/E1O0W/K139ai2O1C/A217G/K234V/N247[y R289W/ H363R 99 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H1 5NV A132V/K139C Q162R/Q181L/I201C/A217G/ 100 K234V/ P348R Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V N247D/Q256D/H363R 100 Y48H/D92Y/E100W/ 139Cn"1521/ 1201 C/A217G/K234V/N247D/H363R 100 D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R 100 D92Y/E100W/K139C/D173N/ P175S/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/ 100 H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201CA/208T/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 100 Y48H/E54C/D92Y/A101 C/ 139C/I201 C/A217G/ 234V/N247D/R289W/H363R 100 Y48H/D92Y/E100W/ 139C/ 1201 C/ A217G/ 234V/N247W/Q256D H363R 100 Y48H/D92Y/E100W/K139C T152A/I201 C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 100 Y48H E54C/D92Y/A101C/K139C/T152Afl201C/A217G 234V/N247D/R289W/ 100 H363R Y48H/E54C/D92Y/A101 C/K139C/I201 C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R 100 Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/ T152A I20 C/A217G K234V/ 100 N247W/R289 /H363R EJEMPLO 6. PERFIL DE pH El perfil de pH se determina a 37 °C en el intervalo de pH de 2.0 a 7.5 (en etapas de 0.5 unidades de pH) como se describe en lo anterior y en la sección "Determinación de actividad de fitasa", excepto que se utilizó una combinación de amortiguador (glicina 50 mM, ácido acético 50 mM y bis- - - tris 50 mM, en vez de acetato de sodio 0.25M, amortiguador de pH 5.5) . Los resultados se resumen en la Tabla 1 siguiente. Los valores proporcionados para cada pH en el intervalo de 2.0 - 7.5 son actividad relativa en % normalizada al valor en el óptimo.

TABLA 6: PERFILES DE pH RELATIVO A 37 °C - Y48H/E54C/D92Y/ 39 70 87 100 94 82 52 21 7 2 1 -1 A101 C/K139C/ T152A/I201 C/ A217G/K234V/ N247D/R289W/ H363R E54C/D92Y/A191C/ 40 65 87 100 99 88 57 23 7 1 0 -1 K139C/I201C/ A217G/H363R Y48H/E54C/D92Y/ 40 70 84 100 98 90 65 29 11 3 1 -1 A101 C/K139C/ T152A/I201 C/ V208T/A217G/ K234V/N247D/ R289W/H363R K131 P 50 64 83 95 100 99 95 83 65 36 5 3 K131Q 51 67 82 98 100 99 95 80 69 37 7 -2 K207R 38 51 71 85 100 97 95 81 50 27 3 3 D33C/Y179C 40 53 72 86 100 92 83 65 38 18 2 5 G325C/T358C 40 54 78 93 100 100 90 68 41 16 0 -3 H228C/H363C 36 53 75 92 100 97 88 67 38 16 2 -1 A150C/L259C 36 57 78 95 100 97 89 64 42 16 3 -2 D92Y/E100W/ 58 73 90 99 100 84 49 20 6 1 -1 3 K139C/I201 C/ A217G/N247D/ H363R D92Y/E100W/ 58 73 90 99 100 84 49 20 6 1 -1 3 K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/H363R T308A 39 58 79 99 100 94 85 76 55 36 4 -3 E54C/A101C 42 55 77 98 100 90 85 63 40 15 2 1 Y48H/D92Y/E100W/ 54 68 84 98 100 93 54 20 5 0 0 -6 K139C/T152I/ I201 C/A217G K234V/N247D/ H363R K131Q 51 67 82 98 100 99 95 80 69 39 7 -2 I49L 40 62 83 97 100 94 80 58 37 14 2 -1 Y48H/E54C/D92Y 42 62 87 96 100 81 50 22 6 0 0 -1 /A101C/K139C/ I201C/A217G/ K234V/NH247W/ R289W/H363R Q162N 40 66 75 96 100 93 91 73 47 22 6 1 Y48H/D92Y/E100W/ 46 69 86 95 100 79 55 23 9 2 0 0 K139C/201 C A217G/K234V/ N247D/R289W/ H363R Y48H/D92Y/E100W/ 41 59 75 94 100 95 66 24 6 1 0 -1 K139C/T152A/ I201 C/A217G/ K234V/N247W/ Q256D/H363R E66C/L370C 33 58 80 94 100 100 87 66 41 14 2 0 E41Q 44 62 78 93 100 97 86 68 41 17 3 0 Q109G 37 57 77 92 100 100 96 73 48 23 4 0 A163K 47 63 75 92 100 99 89 67 41 13 3 0 Y48H/D92Y/E100W/ 50 55 72 91 100 91 57 19 4 -1 -1 -1 K139C/I201 C/ A217G/K234W N247D/Q256D/ H363R A304V 53 60 82 91 100 95 88 68 45 19 3 3 E54C/D92Y/A101 C/ 35 48 68 90 100 94 64 22 6 0 -1 -1 K139C/I201 C/ A217G/K234V/ N247D/Q256D/ H363R P75N/K576N/D77Q/ 42 55 71 88 100 95 62 23 6 0 0 0 N78T/D92Y/ E100W/K139C/ I201 C/A217G/ K234V/N247D/ Q256D/H363R D92Y/E100W/ 37 51 65 89 100 97 69 20 2 -3 -5 -4 K139C/I201 C/ A217G/K234V/ N247W/Q256D/ H363R Y48H/D92Y/T98S/ 39 50 69 89 100 99 73 28 8 0 -1 -1 E100W/K139C/ T152A/I201 C/ A217G/K234V/ N247W/Q256D/ H363R K234E 44 53 75 88 100 99 95 71 47 19 3 1 K92Y/E100W/ 44 54 70 87 100 93 62 22 5 1 0 -1 K139C/D173N/ P175S/I201 C/ A217G/K234V/ N247D/Q256D/ H363R K207R 38 51 71 85 100 97 95 81 50 27 3 3 D33C/E54C/A101 C/ 37 59 74 84 100 88 82 65 41 21 5 2 Y179C Q162N/D138N 39 58 81 95 100 100 91 71 47 21 4 3 Q162R 38 58 78 88 100 100 96 72 48 22 3 0 N285D 45 61 81 96 100 100 97 71 39 18 2 7 E66C/L370C 33 58 80 94 100 100 87 66 41 14 2 0 T369S 46 56 79 92 100 100 94 72 47 22 3 -1 S192A 46 58 81 90 100 100 93 62 42 15 2 0 Y48H/E54C/D92Y/ 36 63 83 96 100 100 85 61 36 14 2 -1 A101 C/K139C/ T152A/I201 C/ K207Q/V208T/ A217G/K234V/ N247D/R289W/ H363R natural 41 57 77 93 99 100 94 75 48 20 3 0 K131 L 45 59 75 93 98 100 96 84 71 44 13 -1 D33C/P178C 37 61 77 90 94 100 88 66 43 15 1 1 F63C/K357C 29 55 78 92 98 100 83 65 38 14 2 -1 S1QS 45 56 80 86 99 100 83 63 45 14 3 0 I303L 40 59 75 89 98 100 91 73 45 18 2 0 F8Y 44 59 78 93 98 100 88 64 37 14 3 -4 F8Y 44 59 78 93 98 100 88 64 37 14 3 -4 1201V 36 53 73 91 98 100 88 68 40 13 -1 -2 Y48H/D92Y/E100W/ 46 60 76 88 98 100 74 35 10 1 0 1 K139C/I201CV V208T/A217G/ K234V/N247D/ Q256D/H363R K176R 38 58 76 90 97 100 94 72 45 18 0 -4 S1 P 46 56 80 90 97 100 84 64 40 15 2 -2 T242S 38 58 73 85 97 100 97 73 48 22 2 -1 S396D 41 54 76 87 97 100 93 71 47 19 4 0 F8M 48 57 71 90 96 100 82 70 40 14 5 1 N239R 32 46 69 93 96 100 98 74 50 24 1 2 N239K 38 52 70 91 96 100 95 73 48 20 3 0 S396K 37 51 72 87 96 100 96 73 46 21 3 -1 K139C/I201 C 34 48 69 84 96 100 94 72 45 17 1 -2 K148R 35 57 70 90 95 100 92 75 47 15 1 -1 P348R 38 54 73 91 95 100 98 72 48 25 3 1 - - - EJEMPLO 7: ESTABILIDAD AL VAPOR Método 1 La actividad residual de moléculas de fitasa después de tratamiento al vapor, se evaluó utilizando el siguiente análisis: 20 µ? de cada muestra de enzima purificada se suministró en un pozo único de una placa CorningMR de 96 pozos (1 x 8 StripwellMR) (Corning, Lo ell, MA, Estados Unidos) y posteriormente se evaporó a sequedad en una centrífuga al vacío (Genevac EZ-1 Plus, Genevac Ltd, Suffolk, Reino Unido) . El vapor de incubación se genera en un recipiente styropor cerrado con las dimensiones interiores de 27 x 18 x 20 cm . Las muestras, en tiras abiertas, se colocan aproximadamente 10 cm por encima del fondo del recipiente sobre un gabinete metálico con el fin de que no estén en contacto con el agua.

Se vierten en el recipiente un litro de agua en ebullición, la tapa se cierra y la temperatura de la corriente producida monitoreada utilizando un termómetro colocado en la tapa del recipiente. La incubación se llevó a cabo durante 60 segundos desde el momento en que se vierte el agua en el recipiente. Durante este período la temperatura se incrementa a aproximadamente 85 °C. Inmediatamente después de la incubación, las muestras se enfrían en hielo, se resuspenden y se evalúan con respecto a la actividad de fitasa utilizando el análisis de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) colorimétrico (Sigma, Broendby, DK) . Cada muestra de enzima se compara con una muestra similar que no ha sido tratada, con el fin de calcular la actividad residual.

Los resultados se presentan en la tabla 7 y 8 a continuación .

TABLA 7: ESTABILIDAD AL VAPOR DETERMINADA POR EL METODO 1 Variante Actividad residual [%] Experimento 1 Wtl2 E66C/L370C 23 D33C/E54C/A101C/Y179C 22 Experimento 2 Nt 14 G346S 25 Q109G 22 H143C/I201C 16 Experimento 3 Wt 10 Q162N (realizado dos veces) 31;35 Experimento 4 Wt 20 E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R 88 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ 62 Q162R/Q81L/I201C/A217G/K234V/P348R D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R 51 D92Y/E100 /K139C/I201C/A217G/N247D/ 54 Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ 45 A217G/K234V/N247D/H363R Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/ 86 I201C/A217G/K234V/N247 /Q256D/H363R E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ 91 K234V/N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/T52A/I201C/ 88 A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/ 90 I201C/A217G/K234V/N247D/R289 /H363R Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ 95 V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/ 81 D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ 95 K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289 /H363R Experimento 5 Wt 25.9 D92Y/E100W/A217G/H363R 39.5 D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R 57.5 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ 68.5 Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R Método 2 En estos ex erimentos se utilizó una instalación modificada por lo que el vapor se proporciona desde un generador de vapor y se dirige a la caja. Las muestras colocadas en una placa se insertan en la caja a través de un cajón cuando se ha alcanzado la temperatura. Ante la inserción de las muestras la temperatura desciende 4°C. La incubación se realiza durante 30 segundos mientras la temperatura permanece aproximadamente constante a 90°C. Posteriormente, la placa se separa rápidamente de la caja y las muestras se colocan en hielo. Las muestras se analizan como en el método 1.

TABLA 8: ESTABILIDAD AL VAPOR DETERMINADA POR EL METODO 2 Variante Actividad residual [%] Experimento 1 Wt 15 V130L/M137L/V146I/I201V/M260L/I266V 27 Experimento 2 Wt 6 S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/ 29 G186S/I201C/K207Q/G346S Experimento 3 Wt 4 S261A 12 T308A 9 Experimento 4 wt 8 L401N 14 S403N 9 T308A 11 Experimento 5 wt 4 E54C/A101C 9 Experimento 6 wt 6 T152G 10 Experimento 7 wt 5 S1P 10 F8M 14 Experimento 8 wt 3 K139C/I201C 13 - - EJEMPLO 8 ACTIVIDAD RESIDUAL DE GLUCACION Inactivación por glucación Se investigó el efecto de la glucación por incubación de variantes de fitasa purificadas con glucosa. Para esto, se mezclan 0.5 mg/ml de enzima en HEPES 0.1M, pH 7.5 con glucosa 1M y se incuba a 50 °C durante 5 h. Se mide la actividad de fosfatasa antes y después de la incubación y los resultados se indican a continuación en la Tabla 9.

TABLA 9: MODIFICACION DE GLUCACION Los resultados mostrados en lo anterior indican que la enzima natural se inhibe fuertemente por glucación (18% de actividad residual) . Las variantes en la posición K26 claramente mejoran mucho respecto a ser menos afectadas.

EJEMPLO 9: PRUEBAS DE ESTABILIDAD A LA SEDIMENTACION Mediciones de estabilidad al granulado.

Aproximadamente 50 g de granulado de enzima se premezclan con 10 kg de pienso durante 10 minutos en un mezclador horizontal pequeño. Esta premezcla se combina con 90 kg de pienso durante 10 minutos en un mezclador horizontal más grande. Desde el mezclador el pienso se dirige al acondicionador (un mezclador en cascada con inyección de vapor) a una velocidad de aproximadamente 300 kg/hora. El acondicionador se calienta hasta que el pienso está a 95 °C (medido en la salida) mediante inyección de vapor. El tiempo de residencia en el acondicionador es de 30 segundos. Desde el acondicionador el pienso se dirige a una prensa Simón Heesen equipada con un troquel horizontal de 3.0 x 35 mm y se presiona en pellas con una longitud de aproximadamente 15 mm. Después de prensar las pellas se colocan en un enfriador de aire y se enfrían durante 15 minutos.

Formulación de pienso: 74.0% de maíz molido 5.0% de aceite de soya 20.7% de gritas de soya tostada 0.3% de premezcla Solivit Mikro 106 de minerales y vitaminas 12% de contenido de agua Prueba 1 Un polvo que consiste de: I.5 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.75 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 II.552 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.75 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex 80 2.49 kg de concentrado de fitasa Hafnia wt 0.45 kg de agua La granulación se realiza de una manera como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,106,991, Ejemplo 1. El granulado que se obtiene se seca en un lecho fluido hasta un contenido de agua inferior a 1% y cerner para obtener un producto con un intervalo de partícula de 250 µt? a 850 µp?. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 10% y carbonato de calcio 22% de la manera como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,106,991, Ejemplo 22.

Prueba 2 Un polvo que consiste de: 1.6 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 12.027 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM 50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 3.5 kg del concentrado de variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R 0.02 kg de agua La granulación, secado y cernido se realizan como - - se indicó antes. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 9% y carbonato de calcio 22% de la manera indicada antes .

Prueba 3 Un polvo que consiste de: 1.6 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 12.013 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM 50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex 80 3.2 kg de concentrado de variante 2 de fitasa 0.30 kg de agua La granulación, secado y cernido se realizan como en lo anterior. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 9.8% y carbonato de calcio 22% de la misma manera a lo indicado antes.

Prueba 4 Un polvo que consiste de: 1.6 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 12.225 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM 50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 3.50 kg de concentrado de variante 2 de E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R La granulación, secado y cernido se realizan como en lo anterior. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 9.0% y carbonato de calcio 22% de la misma manera a lo indicado antes .

Prueba 5 Un polvo que consiste de: 1.6 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 12.225 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM 50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 3.50 kg de concentrado de variante 2 de Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R La granulación, secado y cernido se realizan como en lo anterior. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 9.0% y carbonato de calcio 22% de la misma manera a lo indicado antes.

Prueba 6 Un polvo que consiste de: 1.6 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 12.435 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM 50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 3.50 kg de concentrado de variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R 0.30 kg de agua La granulación, secado y cernido se realizan como en lo anterior. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 9.7% y carbonato de calcio 22% de la misma manera a lo indicado antes.

Prueba 7 Un polvo que consiste de: 1.6 kg de celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0.80 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex 80 12.193 kg de sulfato de sodio finamente molido se granula en un mezclador Lódige FM 50 con un líquido de granulación que consiste de: 0.64 kg de aglutinante de carbohidrato, Avedex W80 3.50 kg de concentrado de fitasa, variante 5 0.16 kg de agua La granulación, secado y cernido se realizan como en lo anterior. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma 8.3% y carbonato de calcio 22% de la misma manera a lo indicado antes.

Las muestras producidas en la Prueba 1 a la Prueba 7 se analizan en un ensayo de sedimentación a 95 °C, salida del acondicionador. El contenido de fitasa se mide utilizando el método analítico EB-SM 0559.02 versión 01 (disponible de Novozymes a solicitud) antes de la formación de granulado y en las pellas de alimentación después del granulado. Se encontraron las siguientes actividades residuales de la fitasa: TABLA 10: ESTABILIDAD AL GRANULADO La conclusión es que las variantes tienen una estabilidad a granulación mejorada, en comparación con la prueba 1 de referencia.

EJEMPLO 10 : DESEMPEÑO EN PIENSO ANIMAL EN UN MODELO IN VITRO El desempeño en pienso animal de diversas variantes - - de fitasa de la invención se comparan en un modelo un vitro con el desempeño de una proteína de referencia tal como la SEC ID NO: 2. El modelo in vitro simula condiciones gastrointestinales en un animal monogástrico y se correlaciona bien con los resultados que se obtienen en ensayos animales in vivo. La versión utilizada en este ejemplo simula el buche y estómago de un pollo. La comparación se realiza como sigue: La actividad de fitasa en la muestra variante se determina como se describe en el ejemplo 1 bajo "determinación de actividad de fitasa".

Las pellas de pienso de un ensayo de alimentación de pollo - y con maíz, harina de frijol de soya y aceite de frijol de soya como constituyentes principales - se preincuba a 40°C y pH 4.6 durante 5 minutos seguido por la adición de dosificaciones adecuadas de las fitasas (se utilizan dosificaciones idénticas para todas las fitasas que se van a probar para permitir comparación) , por ejemplo entre 125 a 1000 unidades de fitasa FYT/kg de pienso o amortiguador en las muestras control. Después de 5 minutos de incubación se agrega pepsina (3000 U/g de pienso) en una solución de HC1 y de esta manera el pH se reduce a 3. Las muestras después se incuban a 40°C durante otros 5 minutos.

Las reacciones se detienen y el ácido fítico y los fosfatos de inositol se extraen por adición de HC1 hasta una concentración final de 0.5M e incubación a 40°C durante 2 horas seguido por un ciclo de congelamiento-recalentamiento y 1 hora de incubación a 40°C.

El ácido fítico y los fosfatos de inositol se separan por cromatografía iónica de alto desempeño como se describe por Chen et al en Journal of Chromatography A (2003) vol . 1018, pp . 41-52 y se cuantifican como se describe por Skoglund et al en J. Agrie. Food Chem. (1997), vol. 45, pp. 431-436.

La degradación de fitato después se calcula como la diferencia en fósforo unido a inositol-6-fosfato (IP6-P) entre muestras tratadas con fitasa y muestras no tratadas. El desempeño relativo de la variante se calcula como el porcentaje de degradación de fitato por la fitasa natural.

La degradación relativa de las variantes de fitasa (tabla 11) muestra que las variantes son, todas, capaces de degradar inositol -6 -fosfato en el sistema in vitro aplicado. Ciertos candidatos funcionan mejor que la forma natural (por ejemplo la variante: D92Y/E100W/A217G/H363R, la variante: Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, la variante : Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/-N247D/H363R) mientras que otras no son tan eficientes in vitro como la natural (por ejemplo, la variante: K207Q) .

TABLA 11. Degradación in vitro de IP6-P de una dieta basada en frijol de soya/maíz. La degradación de fitato de la variante se calcula como el porcentaje de degradación de fitato por la fitasa natural Degradación de fitato de la variante como porcentaje de degradación de fitato por la forma natural (los dos números representan datos de dos ensayos diferentes) Dosificación de fitasa (FYT/kg de pienso) Variante de fitasa D92Y/E100W/A217G/H363R 125 181 Como en el anterior 250 199 D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/N247D/H363R 125 74; 101 Como en el anterior 250 71 ; 137 Como en el anterior 500 72 Como en el anterior 100 76 0 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 125 252; 543 Como en el anterior 250 219; 347 Como en el anterior 500 184; 215 Y48H/D92Y/E100W/K139C T1521/1201 C/A217G/K234V/N247D/H363R 125 237; 297 Como en el anterior 250 160; 246 Como en el anterior 500 148; 197 K207Q 250 57 E54C/A101 C 250 1 19 G346S 250 79 Q162N 250 180 S1 QS 250 68* S1 P 277 70* F8M 246 74* F8Y 229 71 * K139C/120C 250 105 S1 QGPS/K26H/E54C/A101 C/K139C/Q162N/G186S/I201 C/K207Q/G34 250 90 6S *Para estos datos la forma natural se probó como 250 FYT/kg.

EJEMPLO 11: Desempeño en un ensayo en cerdo in vivo Evaluación comparativa de los efectos de cantidades graduadas de dos variantes de fitasa de Hafnia alvei sobre la digestibilidad fecal y la excreción de fósforo y calcio en cerdos en crecimiento.

Se utilizaron sesenta y cuatro cerdos Large White x Landrace con un peso corporal inicial de 43.55 + 4.35 kg.

- - Los animales se albergaron en cajas en piso de pocilga en un cuarto con ambiente controlado. Cada pocilga tiene un piso de alambre soldado recubierto con plástico y se equipa con dos bebederos de agua y cuatro alimentadores individualizados de acero inoxidable. La temperatura ambiente es de 21-22°C y el porcentaje de humedad es de 50%.

A los cerdos se les alimentó con una dieta basal formulada para proporcionar fósforo (P) exclusivamente de origen vegetal durante un período de adaptación de 14 días. Después de ese período se les asignó en 16 grupos iguales de 4 animales cada uno.

Se les alimentó durante 12 días con la dieta basal o con esta dieta suplementada con 1000, 2000 U/kg y 4000 U/kg de fitasa natural de Hafnia alvei, con 500, 1000 y 2000 U/kg de la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R o con 500, 1000 y 2000 U/kg de la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R.

Se agregó un trazador indigerible (óxido de cromo) en una concentración de 0.4% a todas las dietas para permitir el cálculo de digestibilidad de P y calcio (Ca) . El pienso se distribuyó libremente en forma de macerado, bajo control de consumo de pienso de la pocilga y los animales tuvieron acceso libre a agua para beber. La digestibilidad de Ca no se corrigió para la ingesta de Ca con el agua para beber.

Se midieron las concentraciones fecales de P, Ca y Cr en el décimo segundo día del segundo período. Las heces se muestrearon indi idualmente, en aproximadamente la misma cantidad a la misma hora del día, durante los últimos 3 días precedentes a esa fecha. De esta manera, para cada tratamiento dietario y para cada criterio se han realizado un total de 12 determinaciones individuales. Todos los minerales se determinaron de acuerdo con los métodos estándar de la Association of Official Analytical Chemists (1990) utilizando un espectrómetro Vista-MPX ICP-OES. La digest ibilidad aparente (% de la ingesta) de los minerales se calculó durante el período de 3 días menc i onado .

La concentración fecal media de P de los animales su 1 ement ados con enzima es significativamente mucho menor que la observada para animales que ingieren la dieta control (a) .

La digest ibi 1 i dad de P depende de la dosis y mejora de manera significativa con las cinco fitasas en todos los grupos suplement ados (b) . La dige s t ib i 1 idad más alta de P se observa en la dieta suplementada con 4000 U/kg de Hafnia alvei natural y el grupo JHP 113, a 2000 U/kg.

La excreción fecal de P se redujo significativamente en todos los animales a los que se les suplemento con fitasa y para todos los niveles de inclusión probados (c) .

El P absorbido aparente es mayor de 2.25 g/kg recomendado para los cerdos en crecimiento y el grupo con 4000 U/kg de Hafnia alvei natural se encuentra muy cercano a aquel con JHP113 y "C. braakii" natural a 2000 U/kg y 4000 U/kg, respectivamente (d) .

Las equivalencias de P, considerado como P suplementario digerido comparativamente con el control no suplementado, son significativamente mayores que el control en la totalidad de las cinco dietas suplementadas con fitasas (e) .

La dige s t ib i 1 idad de Ca mejoró y la excreción fecal de Ca se redujo en todas las enzimas probadas y a todos los niveles de inclusión (f) .

El máximo de eficiencia de estos parámetros se observó con Hafnia alvei natural con un nivel de inclusión de 4000 U/kg mientras que la variante Y48HD/92Y/E100W/K139C/ I 201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H 363R funciono mejor cuando se comparó la eficacia con suplementos de 1000 U/kg y 2000 U/kg.

Los resultados se presentan en la siguiente tabla 12.

TABLA 12: Niveles residuales de parámetros digestibilidad Dosis (U/kg) 0 500 1000 2000 (a) concentraciones fecales de fósforo (mg/g DM) Wt 14,3 1 1 ,5 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/ 13,7 12,6 1 1 ,5 N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C T1521/1201 C/A217G/ 14,5 13,9 1 1 ,0 K234V/N247D/H363R Control 18,3 (b) Digestibilidad fecal aparente de fósforo (%) Wt 47,3 50, 1 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234W 44, 1 55,3 58,0 N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/T1521/1201 C/A217G/ 43,1 48,6 51 ,4 K234V/N247D/H363R Control 27,9 (c) Excreción de fósforo (mg/g Oh Wt 2,06 1 ,93 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/ 2,14 1 ,74 1 ,61 N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/T1521/1201 C/A217G/ 2,16 1 ,97 1 ,81 K234V/N247D/H363R Control 2,80 (d) Absorción de fósforo (mg/g) Wt 1 ,85 1 ,94 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/ 1 ,69 2,16 2,22 N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/T1521/1201 C/A217G/ 1 ,63 1 ,86 1 ,91 K234V/N247D/H363R Control 1.09 (e) Equivalencias de fósforo (mg/g) Wt 0,77 0,86 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234V/ 0,61 1 ,07 1 ,14 N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C T1521/1201 C/A217G/ 0,56 0,78 0,83 K234V/N247D/H363R Control 0,00 (f) Digestibilidad aparente de calcio (%) Wt 58,9 55,2 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201 C/A217G/K234W 54,1 63,1 63,5 N247D/Q256D/H363R Y48H/D92Y/E100W/K139C/T1521/1201 C/A217G/ 53,2 55,3 57,9 K234V/N247D/H363R Control 51 ,0 hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (42)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una fitasa caracterizada porque tiene por lo menos 76% de identidad con los residuos aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2 y la cual comprende por lo menos una modificación en por lo menos una posición que se selecciona de las s iguientes : 139, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 168, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227, 228, 230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261, 266, 268, 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293 , 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312, 313, 314, 316, 318, 319, 320, 322, 324, 325, 326, 331, 335, 343, 344 , 345, 346, 347, 348, 354 , 355, 356 , 358, 360, 362 , 363 , 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388,389, 390, 391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404 , 406 , 408, 409, 411, 412 y 413, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, con la condición de que la fitasa no es fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2.

2. La fitasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende por lo menos uno en por lo menos una posición que se selecciona de las siguientes: 139; 1, 8, 41, 45, 49, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 95, 101, 109, 131, 143, 148, 152, 162, 163, 176, 179, 187, 192, 201, 207, 217, 221, 234, 239, 242, 245, 251, 261, 293, 294, 303, 304, 308, 325, 346, 348, 363, 369, 370, 396, 401, 403, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, con la condición de que la fitasa no sea la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2.

3. La fitasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación en por lo menos una posición que selecciona de las siguientes: 139. 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112 , 113 , 115, 116, 117, 118 , 119, 120, 121, 122 , 123 , 124 , 125, 126 , 128, 130, 131, 132 , 133, 134 , 136, 137, 138, 140, 143, 144 , 145, 146, 147, 148 , 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 , 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 168, 172, 173, 175, 176, 177 , 178, 179, 180 , 181.182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190 , 192, 193 , 194, 195 , 196, 198, 199, 200, 201, 202 , 203, 204 , 205, 206, 207, 208 , 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227 , 228, 230, 233, 234 , 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243 , 244 , 245, 246, 247 , 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261 , 266, 268, 270, 279 , 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292 , 293, 294, 295, 296 , 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310 , 312, 313, 314, 316 , 318, 319, 320, 322, 324, 325, 326, 331 , 335, 343, 344, 345 , 346, 347, 348, 354 , 355, 356, 358, 360 , 362, 363, 364 365 , 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373 , 374, 375, 376 378 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389 , 390, 391, 394 395 , 396, 397, 400, 401, 403 , 404, 406 408, 409, 411, 412 Y 413; y por lo menos una modificación adicional de por lo menos una posición que selecciona de las siguientes: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63 , 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110 111, 112 , 113, 115 , 116, 117, 118, 119 , 120, 121 , 122, 123 , 124, 125, 126, 128 , 130, 131, 132, 133 , 134, 136 , 137, 138 , 139, 140, 143, 144 , 145, 146 , 147, 148 , 149, 150 , 151, 152 , 153, 154 , 155, 156 , 158, 159, 160, 161 , 162, 163 , 168, 172 , 173, 175, 176, 177 , 178, 179, 180, 181 , 182 , 183 , 184 , 185 , 186, 187, 189, 190 , 192 , 193 , 194, 195 , 196, 198 , 199, 200 , 201, 202, 203, 204 , 205, 206, 207, 208 , 209, 211 , 215, 217 , 219, 221, 224 , 227 , 228, 230, 233, 234 , 235, 236 , 238, 239 , 240, 241, 242, 243 , 244, 245, 246, 247 , 248, 249 , 251, 256 , 258, 259, 260, 261 , 266, 268, 270, 279 , 284 , 285 , 286, 287 , 288, 289, 290, 292 , 293, 294, 295, 296 , 297, 298 , 299, 301 , 303, 304, 308, 310 , 312, 313, 314, 316 , 318, 319 , 320, 322 , 324, 325, 326, 331 , 335, 343 , 344, 345 , 346, 347 , 348, 354 , 355, 356, 358, 360 , 362 , 363 , 364, 365 , 366, 367 , 368, 369 , 370, 371, 372 , 373 , 374 , 375, 376, 378 , 382, 383 , 384 , 385 , 386, 387 , 388, 389 , 390, 391, 394, 395 , 396, 397 , 400, 401 , 403, 404, 406 408, 409, 411, 412 y 413 en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, con la condición de que la fitasa no sea una fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2.

4. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la modificación o las modificaciones se seleccionan de: 1P,Q, *laG, *laP, "laS, *lbP, *lbS, "lcS, 1QGPS, 1QS, 8L,C,M,Y, 9K,P,S, 10V, 12S,R, 16V, 18K, 25A, 26R,Q,H, 27A, 28A, 29P,R,K,A, 30P(L( 311, 32Q,I,L, 33C,N, 35C,A, 36C, 37D,R,K, 38A, 41T,Q, 45P, 48H,W,N, 49L, 54C,G, 55E, 59R,K, 63C, 64S, 66C, 68L, 69E,L, 70E, 72A, 74S, 75A, 76R,V,N, 77K(G,W(Q, 78G, R, K, Q, S, T, 79L, 81E, 82S, 83G, 89A, 92Y, 93P,E,N, 95P,A,96N,V, 97R, 98S, 100 , 101C, 103A, 109D,G, 111R,K,S, 112S, 115L,M,R,K, 116S,T,N, 117A,Q, 118A,N,E,P,T, 119D,K,E, 120G,L,I,M, 121A, S,T,G, K, 122A,S,T,K, 123P, ,V,A,T, 128N,R, 130L, 131R,Q, 132T,V, 134V, 136Q, 137L, 138N,V, 139C,R, 140P, 143C,V, 144R, 1461, 148R, 150C, 151D, 152A,G,T,I, 160G, 162N,R, 163P,K, 168V, 172C, 173N, 175N,S 176C,Q,R, 177C, 178C,E 179C,L, , 181L, 185R,K, 186S,T, 187E, 190N, 192A, 193R, 195L, 198E, 199C, 201C,G,V, 202A,K, 203Y, 206G,T,A.207N,L(Q,R, 208A, 208T, 209S, 211T.R, 215S, 217S,G, 219M,L, 221T,G, 224C, 227Q. 228C,Q, 230E, 234L , R , C , , E , 235P, 236C, 239R,K, 242S, 243P, 244P, 245E, 246N, 247D,W, 248T, 2495, T, 251S,D,E,R, 256D,A, 258Y, 259C, 260L, 261F,A,Q,A, 266V, 268R, 270R, 284P, 285D, 286T, 287P, 288P, 289W, 293R,K,N, 294L, 298S, 299R, 301M, 303L, 304V, 308A, 310L, 312A, 313L, 314G, 316P,A, 318E, 319L, 320N, 325C,K, 326C, 331C,5,T, 335E, 343C, 344 , 346S,T, 347R, 348D,E,5,R 354L, 355S,T, 356F, 358C, 360P,Q, 362M, 363C,R,K,V, 365K, 366T, 368C, 369S,D, 370C, 374C,P, 376?, 378K, 380, 382S,T, 383N, 394N, 395E, 396D,E,K 401N, 403N y 411S.

5. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque además los residuos aminoácidos entre las posiciones 180 y 189 han sido sustituidos por un péptido pequeño que tiene una longitud de 4, 5, 6, 7 u 8 residuos aminoácidos, especialmente los pentapéptidos QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV o KTDKL.

6. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque además los residuos aminoácidos entre las posiciones 115 y 124 o 127 han sido sustituidos por un péptido pequeño que tiene una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos aminoácidos, especialmente el octapéptido TQADTSSP o un péptido que se selecciona del grupo que consiste de HQEKMGTMDPT , HQQDIKVDSL, HQPEIGKMDPV , TQAD SSPDPL, HQQDIKQADPL, TQ DTSSPDPL y NQADLKK DPL.

7. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: 8C, 33C, 35C, 36C, 54C, 63C, 66C, 101C, 139C, 143C, 201C, 150C, 172C, 176C, 177C, 178C, 179C, 224C, 228C, 236C, 259C, 325C, 326C, 331C, 358C, 363C, 368C, 370C, 374C.

8. La fitasa de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende por lo menos un conjunto de modificaciones que se seleccionan de las siguientes: 8C/343C, 139C/201C, 33C/179C, 33C/178C, 35C/172C, 36C/177C, 3G/C176C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 326C/331C, 325C/358C/, 228C/363C, 368C/374C.

9. La fitasa de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación adicional en una posición que se selecciona de: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54. 55, 59, 63, 64, 66, 88 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89 , 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120 121 122 123 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 134 136 137 138 140, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 151 152 153 154, 155, 156, 158. 159, 160, 161, 162, 163 168 172 173 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 184 185 186 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198 199 200 201 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211 215 217 219 221, 224, 227, 228, 230, 233, 234, 235, 236 238 239 240 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 251 256 258 259, 260, 261, 266, 268, 270, 279, 284, 285 286 287 288 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298 299 301 303 304, 308, 310, 312, 313, 314, 316, 318, 319 320 322 324 325, 326, 331, 335, 343, 344, 345, 346, 347 348 354 355 356, 358, 360, 362, 363, 364, 365, 366, 367 368 369 370 371, 372, 373, 374, 375, 376, 378, 382, 383 384 385 386 387, 388, 389, 390, 391, 394, 395, 396, 397 400 401, 403, 404, 406, 408, 409, 411, 412, y 413

10. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: 29P, 30P, 93P, 95P, 140P, 163P, 235P, 243P, 244P, 284P, 287P, 288P, 316P y 360P.

11. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes : 8L, 9 , 12S, 16V, 27A, 30L, 32Q, 37D , 38A, 41T, 48 , 49L, 54G, 55E, 75A, 77K, 78G, 93E, 103A, 109D, 128N, 130L, 132T, 134V, 136Q, 137L, 173N, 176Q, 195L, 198E, 206T, 207N, 209S, 211T, 215S, 219M, 221T, 227Q, 228Q, 248T, 258Y, 260L, 261Q, 310L, 313L, 314G, 316A, 318E, 319L, 320N, 335E, 354L, 356F, 360Q, 362M, 251S, 363R, 365K, 366T, 369S, 374P, 376E, 378K y 411S.

12. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: 9R, 29R,K, 37R,K, 59R,K, 69E, 70E, 78R,K, 81E, 93E, 111R,K, 115R,K, 119D, 185R,K, 230E, 239R, 245E, 251D,E, 293R,K, 348D,E, 363R,K, 395E, y 396D,E.

13. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque es una variante de la fitasa de la SEC ID NO: 2.

14. La fitasa de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: F8C, D33C, T35C, P36C, E54C, F63C, E66C, A101C, K139C, H143C, I201C, A150C, L172C, K176C, S177C, P178C, Y179C, F224C, 5 H228C, A236C, L259C, G325C, Q326C, P331C, T358C, H363C, L368C, L370C y A374C.

15. La fitasa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende por lo menos un conjunto de modificaciones que se selecciona de las 10 siguientes: F8C/D343C, K139C/I201C, Y179C/D33C, P178C/D33C, L172C/T35C, S177C/P36C, K176C/P36C, H143C/I201C, E54C/A101C, F63C/L368C, E66C/L370C, F224C/A236C, A150C/L259C, P33C/Q326C, T358C/G325C, H228C/H363C y L368C/A374C.

16. La fitasa de conformidad con cualquiera de las ^j- reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: Q29P, T30P, Q93P, K95P, S140P, A163P, V235P, E243P, Q244P, S284P, T287P, S288P, M316P, y A360P.

17. La fitasa de conformidad con cualquiera de las 20 reivindicaciones 13 a 16, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las Siguientes: F8L, Q9K, 12S, L16V, M27A, T30L, R32Q, H37D, Q38A, E41T, Y48 , 149L, E54G, H55E, P75A, D77K, N78G, Q93E, L103A, Q109D, H128N, V130L, A132T, I134V, S136Q, M137L, D173N, K176Q, M195L, R198E, N206T, K207N, A209S, E211T, G215S, T219M, A221T, E227Q, H228Q, S248T, D258Y, M260L, S261Q, I310L, I313L, S314G, M316A, G318E, M319L, T320N, A335E, M354L, Y356F, A360Q, L362M. K251S, H363R, Q365K, A366T, T369S, A374P, S376E. R378K y Q411S.

18. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: Dlll R, K. K251D,E, D293R,K, Q93E, Q230E, P348D,E, L395E, Q69E, Q70E, A245E, S396D,E, T81E, N119D, Q29R,LYS, H37R,K, H363R,K, N239R, Q9R, H115R,K, L59R,K, N78R,K, y I185R, K.

19. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: K12R,Q, K26R,Q, K45P, K76R,Q, K97R,Q, K131R,Q, K139R,Q, K148R,Q, K176R.Q, K187E, K207L, K234R,Q, K251R,Q, K268R,Q, K299R,Q, K347R,Q, S261A, T308A, T25A, T28A, T30L, T219L, T120L, N202A, N206A, N270R,Q, N312A, N119D, Q256A, Q29A, Q121A, Q122A, Q117A, Q118A, Y48W, y Y179L.

20. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizada porque comprende por lo menos una modificación que se selecciona de las siguientes: 1P, S1QGPS, S1QS, F8M, F8Y, Q9S, K26H, D33C, T35A, E41Q, Y48H, I49L, G72A, P75N, K76N, D77Q, N78Q, N78T, A89A, D92Y, T98S, E100W, Q109G, H115M, K131Q, A132V, D138N. K139C, V146I, T152A, T152G, T152I, Q162N, Q162R, A163K, P175S, Q181L, G186S, S192A, I201G, I201V, K207Q. K207R, V208T, A217G, K234E, K234V, N239K, T242S, N247D, N247W, Q2560, I266V, R289W, I294L, I303L, A304V, G346S, P348R, 5 T369D, S396K, L401N, S403N.

21. La fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque tiene propiedades mejoradas en comparación con la fitasa de referencia u original con respecto al desempeño térmico que 10 incluye estabilidad al calor, estabilidad a la temperatura, termoestabilidad, estabilidad al vapor, estabilidad al granulado y/o un perfil de temperatura y/o una eficiencia mejorada que incluyen un perfil de pH mejorado, una actividad especifica mejorada, un patrón de glucosilación alterado, un ^ desempeño mejorado en el pienso animal y/o el cual incorpora un cambio de un sitio de ruptura de proteasa potencial y/o sitio de glucación.

22. Un método para producir una variante de fitasa, de una fitasa de referencia u original que tiene por 20 lo menos 76% de identidad con la SEC ID NO: 2, en donde la variante presenta por lo menos una sustitución, inserción o supresión en una o más de las posiciones 139, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 54. 55, 59, 63, 64, 66, _c 88, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92 , 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113 , 115, 116 , 11 , 118, 119, 120, 121, 122 , 123, 124, 125, 126, 128, 130 , 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 144 , 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158. 159 , 160, 161, 162, 163, 168, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179 , 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 192, 193 , 194 , 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203 , 204 , 205, 206 , 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224 , 227, 228, 230 , 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245 , 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261, 266, 268 , 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294 , 295, 296 , 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312, 313 , 314, 316, 318, 319, 320, 322 , 324, 325, 326, 331, 335, 343 , 344 , 345, 346, 347, 348, 354, 355, 356, 358, 360, 362, 363 , 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375 , 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 394, 395, 396 , 397, 400, 401, 403, 404, 406 , 408, 409, 411 , 412 , y 413, en donde la posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID NO: 2, caracterizado porque comprende : a) mutar el ADN o gen que codifica para la fitasa original de una manera por la cual el ADN o gen codifique para la sustitución, inserción y/o supresión, b) enlazar operablemente el ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un hospedador de expresión adecuado para crear una construcción de ADN o un vector de expresión recombinante , c) transferir la construcción o vector a un hospedador adecuado, d) cultivar el hospedador para producir la fitasa variante, y e) recuperar la fitasa.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la variante producida tiene propiedades mejoradas respecto al desempeño térmico que incluyen estabilidad al calor, estabilidad a la temperatura, termoestabilidad, estabilidad al vapor, estabilidad al granulado y/o perfil de temperatura y/o una eficiencia mejorada que incluye un perfil de pH mejorado, una actividad específica mejorada, un patrón de glucosilación alterado, un desempeño mejorado en pienso animal y/o el cual incorpora un cambio de un sitio potencial de ruptura por proteasa y/o sitio de glucación.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizado porque las modificaciones se seleccionan de las siguientes sustituciones o inserciones: 1P,Q, *laG, *laP, "laS, *lbP, *lbS, "lcS, 1QGPS, 1QS, 8L,C,M,Y, 9 ,P,S, 10V, 12S,R, 16V, 18K, 25A, 26R,Q,H, 27A, 28A, 29P,R,K,A, 30P,L, 311, 32Q,I,L, 33C,N, 35C,A, 3SC, 37D,R,K, 38A, 41T,Q, 45P, 48H, ,N, 49L, 54C,G, 55E, 59R,K, 63C, 66C, 68L, 69E,L, 70E, 74S, 72A, 75A, 76R,V,N, 77K,G,W,Q, 78G,R,K,Q,S,T( 79L, 81E, 82S, 83G, 89A, 92Y, 93P,E,N, 95P,A,96N,V, 97R, 98S, 100W, 101C, 103A, 109D,G, 111R,K,S, 112S, 115L,M,R,K, 116S,T,N, 117A,Q, 118A,N,E,P,T( 119D,K,E, 120G,L,I,M, 121A, S , T, G, K, 122A,S,T,K, 123P,M, V,A,T, 128N,R, 130L, 131R,Q, 132T,V, 134V, 136Q, 137L, 138N,V, 139C,R, 140P, 143C,V, 144R, 1461, 148R, 150C, 151D, 152A,G,T,I, 160G, 162N,R, 163P,K, 168V, 172C, 173N, 175N,S 175C,Q,R, 177C, 178C,E 179C,L,W, 181L, 185R,K, 186?,?, 187E, 190N, 192A, 193R, 195L, 198E, 199C, 201C,G,V, 202A,K, 203Y, 206G,T,A.207N,L,Q,R, 208A, 208T, 209S, 211T,R, 215S, 217S,G, 219M,L, 221T,G, 224C, 227Q. 228C,Q, 230E, 234L,R,C,V, 234E, 235P, 236C, 239R,K, 242S, 243P, 244P, 245E, 246N, 247D,W, 248T, 2495, T, 251S,D,E,R, 256D,A, 258Y, 259C, 260L, 261F,A,Q,A, 266V, 268R, 270R, 284P, 285D, 286T, 287P, 288P, 289W, 293R,K,N, 294L, 298S, 299R, 301M, 303L, 304V, 308A, 310L, 312A, 313L, 314G, 316P,A, 318E, 319L, 320N, 325C,K, 326C, 331C,S,T, 335E, 343C, 344K, 346S,T, 347R, 348D,E,S,R 354L, 355S,T, 356F, 358C, 360P,Q, 362M, 363C,R, ,V, 365K, 366T, 368C, 369S,D, 370C, 374C,P, 376E, 378K, 380, 382S,T, 383N, 394N, 395E, 396D,E,K 401N, 403N y 411S.

25. El métcdo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque se produce una fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

26. Una secuencia aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

27. Una construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26 unida operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un hospedador de expresión adecuado.

28. Un vector de expresión recombinante caracterizado porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26.

29. Una célula hospedadora recombinante caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27 y/o el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 28.

30. Un método para producir la fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 29 para producir un sobrenadante que comprende la fitasa; y (b) recuperar la fitasa.

31. Una planta transgénica, o una parte de una planta caracterizada porque es capaz de expresar una fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

32. Un animal no humano transgénico o productos o elementos del mismo, caracterizados porque son capaces de expresar una fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

33. Una composición caracterizada porque comprende por lo menos una fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, y (a) por lo menos una vitamina soluble en grasa; (b) por lo menos una vitamina soluble en agua; y/o (c) por lo menos un mineral en trazas.

34. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque comprende además por lo menos una enzima que se selecciona del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, a-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o ß-glucanasa.

35. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizada porque es un aditivo de pienso animal.

36. La composición de pienso de animal caracterizada porque tiene un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende la fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.

37. Un método para mejorar el valor nutricional de un pienso de animal, caracterizado porque se agrega al pienso la fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36.

38. Un procedimiento para reducir los niveles de fitato en estiércol de animal, caracterizado porque comprende alimentar a un animal con una cantidad eficaz del pienso de conformidad con la reivindicación 36.

39. Un método para el tratamiento de proteínas vegetales, caracterizado porque comprende la etapa de agregar la fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 a por lo menos una proteína vegetal o fuente de proteína.

40. El uso de la fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 en pienso de animal; en la preparación de pienso de animal; para mejorar el valor nutricional de pienso de animal; para reducir los niveles de fitato en estiércol de animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.

41. Un método para producir un producto de fermentación, caracterizado porque comprende (a) fermentar utilizando un microorganismo de fermentación de un material que contiene carbohidratos en presencia de una fitasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y (b) producir el producto de fermentación o el coproducto de fermentación a partir del material que contiene carbohidrato fermentado.

42. El método de conformidad con reivindicación 41, caracterizado porque el producto fermentación es etanol, cerveza, vino o granos secos destiladería (DDG) .