ES2544645T3

ES2544645T3 - Variantes de fitasa de Hafnia

Info

Publication number: ES2544645T3
Application number: ES13170321.7T
Authority: ES
Inventors: Soeren Flensted Lassen; Lars Kobberoee Skov; Leonardo De Maria; Tomoko Matsui; Allan Noergaard; Jesper Vind; Esben Peter Friis
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2029-09-28
Also published as: WO2010034835A3; ES2426717T3; AU2009295852A1; EP2933329A1; CA2736321C; EP2342323B1; DK2650364T3; CN102165059A; EP2342323A2; US8206962B2; US8507240B2; CA2736321A1; BRPI0919314A2; EP2650364B1; MX2011003132A; US20120225468A1; EP2933329B1; WO2010034835A2; ES2636369T3; AU2009295852B2

Abstract

Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto al perfil de pH y con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción en una o varias de las posiciones: 92, 48, 26, 45, 49, 68, 100, 162, 217, 228, 304, 308 y 358, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2, el método comprende a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la variante de fitasa y e) recuperación de la fitasa.

Description

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Modificaciones, tal como sustituciones, deleciones, inserciones

[0051] Una variante de fitasa puede comprender varios tipos de modificaciones en relación a un molde (es decir, una fitasa de referencia o progenitora, o una secuencia de aminoácidos comparativa tal como la SEQ ID N.º:2): un

5 aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido; un aminoácido puede ser eliminado; un aminoácido puede ser insertado entre dos residuos; al igual que cualquier combinación de cualquier número de modificaciones de este tipo. En el presente contexto, el término "inserción" tiene como objetivo abarcar también las extensiones N-y/o C-terminales.

[0052] La nomenclatura general usada en este documento para una única modificación es la siguiente: XDcY, donde "X"

10 e "Y" designan independientemente un código de aminoácido de una sola letra, o un "*" (deleción de un aminoácido), "D" designa un número y "c" designa un contador alfabético (a, b, c, etcétera), que únicamente está presente en inserciones. Se hace referencia a la Tabla 1 a continuación que describe ejemplos puramente hipotéticos de la aplicación de esta nomenclatura para varios tipos de modificaciones.

15 Tabla 1 Ejemplos de nomenclatura

Tipo: Descripción Ejemplo

Sustitución: X=Aminoácido en molde D=Posición en el molde c vacío Y=Amino ácido en la variante G80A

Inserción: X="*" D=Posición en el molde antes de la inserción c="a" para primera inserción a esta posición, "b" para siguiente, etc. *80aT *80bY *85aS

Deleción: X=Aminoácido en molde D=Posición en el molde c vacío Y="*" V81*

Extensión N-terminal: Inserciones en la posición "0". *0aA *0bT *0cG

Extensión C-terminal: Inserciones después del aminoácido N-terminal *275aS *275bT

[0053] Como se explica más arriba, el número de posición ("D") se cuenta a partir del primer residuo de aminoácido de la SEQ ID N.º:2.

20 [0054] Las diferentes alteraciones en la misma secuencia se separan por "/" (barra), por ejemplo, la designación"1*/2*/3*" significa que los aminoácidos en el número de posición 1, 2 y 3 se eliminan todos y la designación

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temperatura de 20-90° C (en pasos de 10° C). Un tampón preferido es en un tampón de 0,25 M de Na-acetato pH 5,5. La actividad a cada temperatura es indicada preferiblemente como actividad relativa (en %) normalizada al valor a temperatura óptima. La temperatura óptima es la temperatura dentro de las temperaturas evaluadas (es decir, aquellas con saltos de 5-10° C) donde la actividad es máxima.

Perfil de pH

[0085] Si una fitasa de la invención tiene o no un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia se puede determinar como se describe en los Ejemplos. Por consiguiente, una fitasa de la invención tiene un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia, donde el perfil de pH se determina como actividad de fitasa como una función de pH en fitato de sodio a 37° C en el intervalo de pH de 2, 0 a 7,5 (en pasos de unidad de pH de 0,5). Un tampón preferido es un cóctel de 50 mM de glicina, 50 mM de ácido acético y 50 mM de Bis-Tris. La actividad en cada pH es indicada preferiblemente como actividad relativa (en %) normalizada al valor de pH óptimo.

[0086] Un ejemplo de un perfil de pH alterado es donde la curva del pH (actividad relativa como función de pH) se desplaza hacia un pH más alto, o más bajo. Las sustituciones preferidas que proporcionan un cambio de 0,5 unidades de pH a un pH más alto en comparación con la fitasa de referencia de la SEQ ID N.º:2. No obstante, para ciertos fines, puede ser preferible proporcionar un cambio de 0,5 unidades de pH hacia un pH inferior en comparación con la fitasa de referencia de SEQ ID N.º2.

[0087] Otro ejemplo de un perfil de pH alterado es donde el pH óptimo es cambiado, en dirección hacia arriba o hacia abajo.

[0088] En una forma de realización particular, la fitasa de la invención puede tener un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia. Más en particular, el perfil de pH está modificado en el intervalo de pH de 3,55,5. Todavía más en particular, la actividad a pH 4,0; 4,5; 5,0 y/o 5,5 está a un nivel de al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o al menos un 95% de la actividad al pH óptimo.

Actividad específica

[0089] En particular, la fitasa de la invención puede tener una actividad específica mejorada en relación a una fitasa de referencia. Más en particular, la actividad específica de una fitasa es al menos un 105%, en relación a la actividad específica de una fitasa de referencia determinada por el mismo procedimiento. En otras formas de realización particulares adicionales, la actividad específica relativa es al menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 o incluso un 400%, todavía en relación a la actividad específica de la fitasa de referencia como se determina mediante el mismo procedimiento.

[0090] En la alternativa, el término actividad específica alta se refiere a una actividad específica de al menos 200 FYT/mg de proteína enzimática (PE). En particular, la actividad específica es al menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 FYT/mg de PE.

[0091] La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de poliacrilamida SDS debería mostrar la presencia de un único componente). La concentración de proteína enzimática se puede determinar por análisis de aminoácido y la actividad de fitasa en las unidades de FYT se puede determinar como se describe en el Ejemplo 1. La actividad específica es una característica de la variante de fitasa específica en cuestión y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa. Véanse los Ejemplos para obtener más detalles.

[0092] Una actividad específica modificada se espera de las siguientes variantes de la fitasa de la SEQ ID N.º:2, en la que, en orden de preferencia, el bucle entre los residuos 115 y 127 (HQQNTQQADPL) que da al sitio activo es sustituido por un bucle seleccionado de, por ejemplo, HQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL, HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL.

Rendimiento en el alimento para animales

[0093] Una fitasa de la invención puede tener un rendimiento mejorado en el alimento para animales en comparación con una fitasa de referencia. El rendimiento en el alimento para animales se puede determinar por el modelo in vitro de los Ejemplos. Por consiguiente, la fitasa de la invención tiene un rendimiento mejorado en el alimento para animales, donde el rendimiento se determina en un modelo in vitro, preparando muestras de alimento para animales compuestas por un 30% de harina de soja y 70% de harina de maíz con CaCl2 añadido a una concentración de 5 g de calcio por kg

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346: Gly Ser, Thr

355: Val Ser, Thr

382: Pro Ser, Thr

Creación de nuevos sitios de glicosilación del tipo XXT [0110]

Número res.: Tipo res. Cambio a

33: Asp Asn

48: Tyr Asn

93: Gln Asn

96: Arg Asn

118: Gln Asn

320: Thr Asn

Creación de nuevos sitios de glicosilación del tipo XXS [0111]

Número res.: Tipo res. Cambiar a

138: Asp Asn

162: Gln Asn

175: Pro Asn

190: Asp Asn

246: Trp Asn

293: Asp Asn

383: Gly Asn

394: Pro Asn

401: Leu Asn

403: Ser Asn

Estabilidad del vapor

10 [0112] La termoestabilidad es un parámetro importante, pero asociada a esta la estabilidad del vapor también es importante. En este aspecto, se hace referencia al Ejemplo 8 más abajo.

Variantes hipoalergénicas

15 [0113] Las fitasas de la presente invención pueden ser (también) variantes hipoalergénicas, diseñadas para recurrir a una respuesta inmunológica reducida cuando es expuesta a animales, incluido el hombre. El término respuesta

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[0140] En el aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromices lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

[0141] En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según es definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están generalmente caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0142] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

[0143] En el aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides,o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una cepa de célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0144] Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular en un modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huéspedes de Aspergillus y Trichoderma están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene

78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology

153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción

[0145] La presente invención también se refiere a métodos para producir una fitasa de la presente invención que comprende (a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la fitasa; y (b) recuperación de la fitasa.

[0146] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de los polipéptidos usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación y fermentación a gran o pequeña escala (incluidas fermentaciones continuas de lote, lote alimentado o en estado sólido) en el laboratorio o fermentadores industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan al polipéptido ser expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Hay disponibles medios adecuados de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es secretado en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisatos celulares.

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de reactivo de parada (el reactivo de parada es 0,1 M de tetraborato de sodio en agua) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Una unidad de fosfatasa se define como la actividad enzimática que libera 1 micromol de fosfato/min bajo las condiciones de reacción dadas (tampón ciego sustraído). Se determina que la absorbancia de 1 micromol de p-nitrofenol es 56 AU (AU= unidades de absorbancia) bajo condiciones de ensayo.

Determinación de actividad de fitasa

[0209] 75 microlitos de solución enzimática con fitasa, diluidos apropiadamente (por ejemplo, en 0 25 M de acetato sódico, 0,005% (p/v) Tween-20. pH 5,5), se dispensan en un pocillo de placa de microtitulación, por ejemplo, NUNC 269620 y se añaden 75 microlitros de sustrato (preparados disolviendo 100 mg de fitato de sodio de arroz (Aldrich Cat.No. 274321) en 10 ml 0,25 M de tampón de acetato de sodio, pH 5,5). La placa se sella y se incuba 15 min. agitada a 750 r.p.m. a 37° C. Después de la incubación, se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de parada se prepara mezclando 10 ml de solución de molibdato (10% (p/v) de hepta-molibdato de amonio en 0,25% (p/v) de solución de amoníaco); 10 ml de vanadato de amonio (0,24% producto comercial de Bie&Berntsen, Cat.No. LAB17650) y 21,7 % (p/v) de ácido nítrico) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La actividad de fitasa se expresa en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 microml de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones anteriores. Un valor absoluto para la actividad de fitasa medida se obtiene por referencia a una curva estándar preparada a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico o por referencia a una curva estándar hecha de diluciones de una preparación de enzima de fitasa con actividad conocida (tal preparación enzimática estándar con una actividad conocida está disponible a petición de Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd).

Ejemplo 2: actividad específica

[0210] La actividad específica de una variante de fitasa se determina en muestras altamente purificadas dializadas contra 250 mM de acetato sódico, pH 5,5. La pureza se controla previamente en un gel de poliacrilamida SDS que muestra la presencia de solo un componente.

[0211] La concentración de proteína se determina mediante el análisis de aminoácidos de la siguiente manera: una alícuota de la muestra es hidrolizada en 6N HCl, 0,1 % de fenol durante 16 h a 110° C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes son cuantificados usando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A accionado según las instrucciones del fabricante. A partir de las cantidades de los aminoácidos se puede calcular la masa -y por lo tanto también la concentración-de proteína en la alícuota hidrolizada.

[0212] La actividad de fitasa se determina en las unidades de FYT como se describe en el Ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa") y la actividad específica se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades de FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa.

Ejemplo 3: estabilidad de temperatura

Cepas y plásmidos

[0213] Se utilizó E.coli DH12S (disponible de Gibco BRL) para el rescate de plásmido de levadura.

[0214] pJHP000 es un vector transportador de S. cerevisiae y E.coli bajo el control de promotor TPI, construido a partir de pJC039 descrito en WO 01/92502, en el cual se ha insertado el gen de fitasa de Hafnia alvei.

[0215] Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 se utilizó para la expresión de variantes de fitasa. Está descrito en J. Biol. Chem. 272 (15), págs 9720-9727, 1997.

Medios y sustratos

[0216] 10X Solución Basal: 66,8 g/l base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCOI, 100 g/l succinato, 60 g/l NaOH.

[0217] Glucosa SC: 100 ml/l 20% glucosa (es decir, una concentración final de 2% = 2 g/100ml), 4 ml/l 5% treonina, 10 ml/l 1% triptófano, 25 ml/l 20% casamino ácidos, 100 ml/l 10 X solución basal. La solución es esterilizada usando un

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filtro de un tamaño de poro de 0,20 µm. Agar y H2O (aprox. 761 ml) se someten juntos a autoclave y la solución de glucosa SC separadamente esterilizada se añade a la solución de agar.

[0218] YPD: 20 g/l bacto peptona, 10 g/l extracto de levadura, 100 ml/l 20% glucosa 5 [0219] Solución de PEG/LiAc: 50ml 40% PEG4000, 1ml 5M acetato de litio

Manipulaciones de ADN

10 [0220] A menos que se declare de otra manera, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos estándares de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. and Cutting, S. M. (eds.).

15 Transformación de levadura

[0221] La transformación de levadura se realizó por el método de acetato de litio. Mezclar 0,5 microL de vector (digerido por endonucleasas de restricción) y 1 microL de fragmentos de la PCR. Descongelar células competentes YNG318 en hielo. Mezclar 100µl de las células, la mezcla de ADN y 10µl de ADN portador (Clontech) en tubos de polipropileno de 20 12ml (Falcon 2059). Añadir 0,6 ml de solución de PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30 min. a 30º C y 200 r.p.m. Incubar durante 30 min. a 42º C (choque térmico). Transferir a un tubo Eppendorf y centrifugar durante 5 seg. Eliminar el sobrenadante y redisolver en 3ml de YPD. Incubar la suspensión celular durante 45 min. a 200 r.p.m. a 30 º

C. Verter la suspensión en placas de glucosa SC e incubar a 30º C durante 3 días para formar colonias. El ADN total de

la levadura es extraído por medio del método de Robzik y Kassir descrito en Nucleic acids research vol. 20, No14 (1992) 25 3790.

Secuenciación del ADN

[0222] Una transformación de E. coli para la secuenciación de ADN fue obtenida por electroporación (BIO-RAD Gene

30 Pulser). Los plásmidos de ADN fueron preparados por medio de un método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el Qiagen® Plasmid Kit. Los fragmentos de ADN fueron recuperados del gel de agarosa por medio del kit de extracción en gel Qiagen. Se realizó la PCR con el PTC-200 DNA Engine. Se usó el ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer para determinar todas las secuencias de ADN.

35 Construcción de vector de expresión de fitasa

[0223] El gen de fitasa de Hafnia fue amplificado con los pares de cebadores (HafPhyF y HafPHyR). Los fragmentos de la PCR resultantes fueron introducidos en S. cerevisiae YNG318 con el vector pJC039 digerido con enzimas de restricción para eliminar la parte madura de gen de cutinasa de Humicola insolens.

40 HafPhyF (34mer) CTCCTGAACTTGTTGCCCGGTCGGATACAGCCCC HafPhyR (39mer) ATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAGGGGAGCTGACATG

45 [0224] Se recuperó el plásmido, que se denomina pJHP000 de los transformantes de levadura en las placas de glucosa SC y se determinó la secuencia interna para confirmar el gen de fitasa.

Construcción de librería de levadura y variantes dirigidas al sitio

50 [0225] Librería en levadura y variantes dirigidas se construyeron por el método SOE PCR (empalme por extensión por superposición, véase "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University Press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido de recombinación in vivo de levadura.

55 Cebadores generales para amplificación y secuenciación

[0226] Los cebadores siguientes se utilizan para hacer fragmentos de ADN que contienen cualquier fragmento mutado por el método SOE junto con cebadores degenerados (AM34 + cebador inverso y AM35 + cebador directo) o solo para amplificar un gen de asparaginasa entero (AM34 + AM35).

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020: D77G 46% a 72°C (WT26%)

021: D77W 40% a 72°C (WT26%)

023: T95A 44% a 72°C (WT26%)

024: E100W/H363R 42% a 72°C (WT26%)

025: D111S 69% a 72°C (WT26%)

027: D138V/Y48H 48% a 72°C (WT39%)

028-1: K234C 50% a 72°C (WT39%)

028-2: K234V 50% a 72°C (WT39%)

029: K251S 46% a 72°C (WT39%)

030: H363V 40% a 72°C (WT39%)

031: H363R 53% a 72°C (WT39%)

046-1: A132V/A217G 42% a 70°C (WT13%)

046-2: A132V/Q162R/Q181L/A217G 42% a 70°C (WT13%)

047: D293R 30% a 70°C (WT13%)

048: Q93E 22% a 70°C (WT13%)

050-1: P348R/H363R 30% a 70°C (WT13%)

050-2: P348S 30% a 70°C (WT13%)

051: Q69L 20% a 70°C (WT13%)

052: Q245E 19% a 70°C (WT13%)

053: Q9S/D92Y 42% a 70°C (WT13%)

054-2: D92Y/H115L 28% a 70°C (WT13%)

054-re1,2: D92Y/H115M 32% a 70°C (WT17%)

057: N78Q 56% a 70°C (WT28%)

058: K76V 57% a 70°C (WT28%)

061-1: G325K 47% a 70°C (WT28%)

062: E100W/A217G/H363R(reference) 63% a 72°C (WT17%)

063: A217G/K251S 40% a 72°C (WT17%)

064: E100W/A217G/K251S 38% a 72°C (WT17%)

065: E100W/K251S 26% a 72°C (WT17%)

066: A217G 29% a 72°C (WT10%)

067: E100W/I555V/A217G 45% a 72°C (WT9%)

068: Q9S/E100W/R160G/A217G/H363R 45% a 72°C (WT9%)

069: D92Y/E100W/A217G/H363R(reference) 79% a 72°C (WT9%)

070: E100W/H115M/A217G/H363R 41% a 72°C (WT9%)

071: E100W/A217G/P348R/H363R 63% a 72°C (WT9%)

072: Q9S/A89A/D92Y/H115M/A217G/H363R 67% a 72°C (WT9%)

073: A132T 21% a 72°C (WT16%)

Referencia=variante no. 62

075: N78Q/E100W/A217G/H363R 47% a 72°C (62 40%)

04-08-2015 E13170321

076: K76V/N78Q/E100W/A217G/H363R 47% a 72°C (62 40%)

077: D83G/E100W/A217G/H363R 39% a 72°C (62 40%)

078: E100W/Y179W/A217G/H363R 48% a 72°C (62 40%)

079: E100W/A217G/K234V/K251 E/I286T/H363R 60% a 72°C (62 40%)

081: E100W/A217G/K234V/P348R/H363R 50% a 72°C (62 35%)

082: Q9S/R18K/A89A/D92Y/H115M/A217G/K234V/ H363R 61% a 72°C (62 35%)

082v2-1: Q9S/D92Y/H115M/A217G/K234V/H363R 61 % a 72°C (62 35%)

083: Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115M/K234V/P348R/ H363R 39% a 72°C (62 35%)

084: Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Q181L/A217G/K234V/P348R(reference) 64% a 72°C (62 35%)

Referencia=WT y/o variante n.º 69

085: Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/ A217G/H363R 82% a 72°C (69 74% WT 14%)

086: E54C/N78S/D92Y/A101C/H143C/L199C/A217G/ H363R 74% a 72°C (wt 49% 69 80%)

088: E54C/A101C/M168V/A217G/H363R 33% a 72°C (62 36% 69 73%)

089-1: P82S/D92Y/E100W/H143C/I201C/A217G/H363R 65% a 72°C (62 36% 69 73%)

089-2: P82S/D92Y/E100W/H143C/I201C/A217G/H363R 65% a 72°C (62 36% 69 73%)

090: Q9S/N78Q//D92Y/L112S/H115M/A217G/K234V/ P348R/H363R 65% a 72°C (62 36% 69 73%)

091: D92Y/A217G/K234V/H363R 81% a 72°C (62 36% 69 73%)

092-1: Y64S/D92Y/E100W/Y179W/A217G/H363R 80% a 72°C (69 74% WT 14%)

092-2: D92Y/A217G/H363R 80% a 72°C (69 74% WT 14%)

094: Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/H143C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R 54% a 74°C (wt 9% 69 45%)

095: Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R 75% a 74°C (wt 9% 69 45%)

097: Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Y179W/Q181L/A217G/K234V/P348R 76% a 74°C (wt 9% 69 45%)

100: D33C/D92Y/E100W/Y179C/A217G/H363R/ 49% a 72°C (69 79%)

103-1: Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Y179W/A217G/K234V/P348R/H363R 103% a 72°C (69 88%)

103-3: Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Y179W/A217G/K234V/S261 F/P348R/H363R 99% a 72°C (69 88%)

Referencia=variante 69 y/o variante 84

101: D92Y/E100W/A217G/H363R/+ 116-123(HQQNTQQA>TQADTSSP) 21% a 76°C (69 39%, 84 55%)

102: Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/ A217G/N298S/H363R +116-123(HQQNTQQA>TQADTSSP) 29% a 76°C (69 39%, 84 55%)

104: Q9S/N78Q/A69A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ G151 D/Q162R/Y179W/Q181L/I201 C/A217G/ K234V/P348R(reference) 55% a 74°C (69 57% 84 65%)

105: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R 77% a 74°C (69 57% 84 65%)

04-08-2015 E13170321

(reference)

Referencia=variante 104 y variante 69

106: E54C/D92Y/A101C/M168V/A217G/H363R 22% a 74°C (104 70% 69 54%)

107: Q9S/N78Q/A132V/K139C/Q162R/Y179W/I201C/ A217G/K234L/P348R/H363R 34% a 74°C (104 70% 69 54%)

Referencia=variante 105

108: D92Y/E100W/H143C/A144R/I201C/A217G/ N247D/H363R 37% a 80°C (105 36%)

109: D92Y/E100W/H116S/K139C/1201C/A217G/ N247D/H363R 43% a 78°C (105 36%)

110: D92Y/E100W/H128R/K139C/H143V/I201C/ A217G/N247D/H363R 44% a 78°C (105 36%)

111: D92Y/E100W/K139C/I201C/N206G/A217G/ N247D/H363R 45% a 78°C (105 36%)

112: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ H363R 51% a 78°C (105 36%)

113: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ Q256D/H363R 98% a 78°C (105 36%)

114: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ H363R 49% a 78°C (105 36%)

115: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ N344K/H363R 32% a 78°C (105 36%)

117: D92Y/E100W/K139C/A144S/K176E/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R 38% a 80C (105 34%)

118: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/H363R/E54C/H55E/A101C 32% a 80C (105 34%)

123: D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 27% a 80C (105 15%)

124: Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R 17% a 80C (105 15%)

125: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/S284C/H363R 20% a 80C (10515%)

126: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/T287W/H363R 20% a 80C (105 15%)

127: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289M/H363R 18% a 80C (105 15%)

128: Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/R289W/H363R 17% a 80C (10515%)

129: N78Q/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 103% a 80C (105 34%)

130: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/P348R/H363R 99% a 80C (105 34%)

131: D92Y/E100W/K139C/Q162R/Q181L/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 76% a 80C (105 34%)

132: D92Y/E100W/A113G/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 34% a 80C (105 34%)

133: D92Y/E100W/T120GorA*/K139C/I201C/ 41% a 80C (105 34%)

04-08-2015 E13170321

A217G/K234V/N247D/H363R/L395LorV

135: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/S284M/H363R 24% a 80C (105 34%)

137: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/H363R/A366S 31 % a 80C (105 34%)

138: D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247W/Q256D/H363R 89% a 80C (10514%)

140: D92Y/E100W/H128R/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247E/Q256D/H363R 49% a 80C (10514%)

141: D92Y/E100W/K139C/Q141S/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 24% a 80C (105 14%)

142: D92Y/E100W/K139C/A144S/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 18% a 80C (10514%)

144: P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/ 1201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 71 % a 80C (105 30%)

145: D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 27% a 80C (105 30%)

147: D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/I294T/H363R 90% a 80C (105 26%)

Referencia=variante 113

143: D33N/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 29% a 80C (113 62%)

148: Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q1256D/H363R 74% a 80C (113 80%)

150: D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 67% a 82C (113 33%)

151: D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 29% a 82C (113 33%)

152: D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/L199S/ 1201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 38% a 80C (113 80%)

153: Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/ I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 38% a 80C (113 54%)

154: E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 91% a 80C (113 73%)

155: Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/1201C/ A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 88% a 80C (113 80%)

156: D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/R289W/H363R 41% a 82C (113 33%)

157: Y48H/D92/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247W/Q1256D/R289W/H363R 79% a 80C (113 80%)

158: Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247W/Q256D/H363R 95% a 80C (113 80%)

159: Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 20% a 80C (113 57%)

160: Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 92% a 80C (113 80%)

04-08-2015

161: Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/ 1201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 55% a 80C (113 80%)

162: Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247W/R289W/H363R 56% a 80C (113 80%)

163: Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/R289W/H363R 66% a 80C (113 80%)

Referencia=variante 138

164: Y48H/E54C/D92Y/E100W/A101C/K139C/T152A/ 1201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 94% a 80C (138 78%)

165: Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 65% a 80C (138 78%)

166: T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R 15% a 80C (138 78%)

167: Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 61 % a 80C (138 78%)

Referencia=wt

168: E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ Q256D/H363R 69% a 80C (w 7%)

169: E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/I201C/A217G/H363R 33% a 80C (w 7%)

170: E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/V208T/ A217G/H363R 32% a 80C (w 7%)

171: E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/I201C/V208T/A217G/H363R 36% a 80C (w 7%)

172: Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/ A101C/K139C/T152A/I201C/V208T/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R 48% a 80C (w 7%)

173: E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/I201C/V208T/A217G/K234V/N239S/N247D/ Q256D/H363R 50% a 80C (w 7%)

Ejemplo 4. Termoestabilidad

[0238] Una alícuota de la muestra de proteína de fitasa Hafnia alvei (purificada como se describe en el ejemplo 1) fue

5 bien desalada y cambiada de búfer en 20 mM de Na-acetato, pH 4,0 usando una columna preempaquetada PD-10 dializada contra 2 x 500 ml 20 mM de Na-acetato, pH 4,0 a 4° C en un paso de 2-3h seguido por un paso durante toda la noche. La muestra fue 0,45 µm filtrada y diluida con tampón para aprox. 2 unidades A280. El tampón de diálisis fue usado como referencia en la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las muestras fueron desgasificadas usando succión de vacío y agitando durante aprox. 10 minutos.

10 [0239] Se realizó una calorimetría por análisis diferencial en un calorímetro VP-DSC de MicroCal a una tasa de barrido constante de 1,5 °C/min de 20-90 °C. La manipulación de datos fue realizada usando el software Origin de MicroCal (versión 4.10) y la temperatura de desnaturalización, Td (también llamada la temperatura de fusión, Tm) se define como la temperatura en el ápice del valor máximo en el termograma.

15 [0240] Los resultados de la DSC para variantes de fitasa Hafnia alvei se resumen en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Termoestabilidad comparativa de fitasas Hafnia alvei

Variante: 1.º calorimetría

Td (°C)

A150C/L259C: 62,4

E13170321

04-08-2015

Q162N/R96N: 63,8

L16V/I1310L/I313L/M319L/M354L: 64,3

V87I/L103A/L112I/A113T/I114V: 67,4

E66C/L370C: 67,2

H363R: 68,3

Q162N/G186S: 67,5

E54C/A101C: 68,0

V130L/M137L/V146I/I120V/M260L/I266V: 67,8

wt: 69

K45P: 70,9

K139C/I201C: 70,8

E54C/A101C/K139C/I201C: 72,6

D92Y/E100W/A217G/H363R: 75,1

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132/ K139C/Q162/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R: 75,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R: 77,7

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R: 78,0

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R: 78,9

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R: 79,8

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R: 80,0

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/1201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R: 80,2

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R: 81,7

Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256/H363R: 82,7

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R: 83,1

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R: 84,2

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S: 71,9

Ejemplo 5. Perfil de temperatura

[0241] El perfil de temperatura (actividad de fitasa como una función de temperatura) fue determinado para la fitasa de

5 Hafnia alvei y las variantes en el intervalo de temperatura de 20-90°C esencialmente como se describe anteriormente ("Determinación de la actividad de fitasa"). Sin embargo, las reacciones enzimáticas (100 microlitros de solución enzimática con fitasa + 100 microlitros de sustrato) fueron realizadas en tubos PCR en vez de en placas de microtitulación. Después de un periodo de reacción de 15 minutos a temperatura deseada los tubos fueron enfriados a 20° C durante 20 segundos y 150 microlitros de la mezcla reactiva fueron transferidos a una placa de microtitulación. 75

10 microlitros de reactivo de parada fueron añadidos y la absorbancia a 405 nm fue medida en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Los resultados se resumen en la Tabla 4 de abajo. Los números dados para cada temperatura son actividad relativa (en %) normalizados al valor en condiciones óptimas.

Tabla 4: Perfiles de temperatura relativa en estabilidad del orden de 75°C

Variante de fitasa: Temperatura (°C)

20: 30 40 50 60 65 70 75 80 85 90

*wt: 18 29 50 75 100 94 93 24 12 7 5

E13170321

04-08-2015 E13170321

*K131Q: 21 34 53 77 94 99 100 26 16 10 6

Q162N/D138N: 17 28 44 66 88 100 95 26 14 9 7

1294L: 18 30 46 64 90 100 90 26 14 11 11

G72A: 17 29 45 67 83 100 78 26 13 11 8

H143C/I201C: 10 22 37 62 85 100 91 26 5 5 4

Q162R: 18 30 49 73 91 100 95 26 15 11 9

I49L: 17 29 45 65 90 100 94 26 13 9 11

*E66C/L370C: 15 27 43 66 100 88 99 27 12 6 5

T369S: 18 28 47 64 92 100 95 27 15 11 9

I201V: 16 27 41 59 78 100 82 27 13 11 8

K148R: 19 35 51 71 98 97 100 27 11 7 6

A163K: 14 27 38 63 79 100 93 27 12 9 6

S1QS: 15 26 40 62 87 93 100 27 9 4 2

F8M: 15 27 38 67 96 100 91 27 10 5 5

F8Y: 16 27 44 69 96 100 93 27 10 6 6

T242S: 18 30 48 66 91 100 93 27 12 11 10

K176R: 17 33 43 66 100 96 96 28 8 5 3

S403N: 14 32 42 67 84 100 96 28 14 10 8

S1P: 17 27 44 60 87 100 92 28 13 11 8

E41Q: 16 28 44 63 87 100 99 28 13 9 9

*K131L: 18 30 50 72 85 95 100 29 15 8 4

*K207R: 18 30 48 70 88 93 100 29 15 8 5

*K207Q: 23 37 58 81 92 97 100 29 18 10 7

G346S: 16 28 47 65 95 100 92 29 10 6 4

T308A: 9 17 33 56 80 99 100 29 12 9 6

S396K: 19 31 44 69 86 100 87 30 14 12 10

L401N: 14 33 43 68 86 100 87 30 13 10 7

I201G: 16 28 43 62 81 100 87 30 14 11 8

P348R: 18 30 43 62 81 100 91 31 14 11 8

E100W: 18 29 40 61 79 100 85 31 13 10 7

K187E: 16 28 39 66 90 100 92 31 10 -6 4

N239R: 19 30 48 66 89 100 96 32 12 11 10

A304V: 15 24 42 58 86 100 98 32 14 11 8

S396D: 16 28 41 60 81 100 87 32 13 10 8

T152G: 16 28 42 66 85 100 95 32 14 10 9

K12R: 18 29 42 64 82 100 98 33 14 12 8

1303L: 17 27 40 62 86 100 88 33 13 11 10

Q162N: 16 27 42 62 89 90 100 34 10 7 3

04-08-2015 E13170321

S192A: 17 26 43 59 88 100 94 35 13 9 9

T369D: 18 29 43 66 86 100 90 35 14 12 11

V130L/M137L/V146I/I201V/ M260L/I266V: 13 25 43 67 89 98 100 35 14 10 6

Q109G: 17 33 44 68 94 100 94 36 11 6

N239K: 19 31 47 70 92 100 94 38 14 12 11

K234V: 17 29 42 63 79 100 94 39 15 11 8

K234E: 17 27 43 61 86 100 92 40 15 11 7

H363R: 18 28 42 66 90 100 90 41 11 6 5

S261A: 13 24 39 62 83 98 100 41 14 10 7

A217G: 14 32 41 65 84 100 90 43 15 11 7

E54C/A101C/K207Q: 21 33 48 68 89 100 95 55 13 10 6

K45P: 19 29 43 68 86 100 93 59 18 11 10

E54C/A101C: 16 27 42 64 85 100 88 64 9 7 4

D33C/E54C/A101C/Y179C: 16 31 45 67 94 100 82 74 9 6 3

E54C/A101C/K139C/I201C/ K207Q: 18 30 41 62 85 80 100 84 36 9 10

D92Y/E100W/A217G/H363R: 6 13 27 50 89 85 100 84 32 10 5

E54C/A101C/K139C/I201C: 15 28 40 59 86 78 100 86 47 8 9

K139C/I201C: 18 25 37 56 91 91 100 87 15 7 4

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/ K139C/Q162N/G186S/I201C/ K207Q/ G346S: 26 37 49 67 80 100 92 90 18 13 10

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/K207Q/ V208T/A217G/K234V/N247D R289W/ H363R: 10 20 39 63 85 81 100 92 58 11 6

T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/ D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R: 5 9 28 50 77 80 100 93 13 5 1

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/V208T/ A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R: 5 13 26 53 76 83 100 95 75 11 4

E54C/D92Y/A101C/K139C/ I201C/A217G/H363R: 10 15 28 52 81 93 100 96 83 10 1

E54C/D92Y/A101C/K139C/ I201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/ H363R: 9 16 33 58 81 84 100 96 79 18 6

D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/ K234V/N247D/ H363R: 6 13 27 49 85 84 100 98 71 13 6

P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/: 6 15 30 51 81 82 100 98 76 20 5

04-08-2015

H363R

Y48H/D92Y/E100W/K139C/: 8 11 25 44 78 88 100 99 68 10 2

1201C/A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/ A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/ K234V/P348R: 8 16 32 54 85 86 100 100 81 14 6

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ 1201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R: 3 12 24 46 77 89 85 100 75 14 1

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ T152I/I201C/A217G/K234V/ N247D/ H363R: 4 12 24 45 76 92 87 100 66 14 4

D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R: 9 16 22 47 70 81 89 100 78 24 6

D92Y/E100W/K139C/D173N/ P175S/I201C/A217G/K234V/ N247D/ Q256D/H363R: 6 16 37 52 81 89 88 100 37 9 3

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ I201C/ V208T/A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R: 9 15 22 47 76 91 90 100 68 18 6

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R: 9 16 26 57 78 89 90 100 80 21 7

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ 1201C/A217G/K234V/N247W/ Q256D/ H363R: 9 12 19 46 68 76 85 100 77 29 4

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ T152A/I201C/A217G/K234V/ N247W/Q256D/H363R: 8 12 20 46 66 78 80 100 81 33 4

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/ N247D/R289W/ H363R: 4 8 21 44 80 91 88 100 81 17 3

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/1201C/A217G/K234V/ N247W/ R289W/H363R: 7 13 22 48 76 87 84 100 82 24 6

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201C/A217G/K234V/ N247W/R289W/H363R: 5 11 20 46 77 89 79 100 81 27 4

Tabla 5: Estabilidad térmica a 75º C, actividad relativa a la actividad máxima

Mutación: Actividad relativa

wt: 24

K131Q: 26

E13170321

04-08-2015 E13170321

Q162N/D138N: 26

I294L: 26

G72A: 26

H143C/I201C: 26

Q162R: 26

I49L: 26

E66C/L370C: 27

T369S: 27

I201V: 27

K148R: 27

A163K: 27

S1QS: 27

F8M: 27

F8Y: 27

T242S: 27

K176R: 28

S403N: 28

S1P: 28

E41Q: 28

K131L: 29

K207R: 29

K207Q: 29

G346S: 29

T308A: 29

S396K: 30

L401N: 30

I201G: 30

P348R: 31

E100W: 31

K187E: 31

N239R: 32

A304V: 32

S396D: 32

T152G: 32

K12R: 33

1303L: 33

Q162N: 34

S192A: 35

04-08-2015 E13170321

T369D: 35

V130L/M137L/V146I/I201V/ M260L/I266V: 35

Q109G: 36

N239K: 38

K234V: 39

K234E: 40

H363R: 41

S261A: 41

A217G: 43

E54C/A101C/K207Q: 55

K45P: 59

E54C/A101C: 64

D33C/E54C/A101C/Y179C: 74

E54C/A101C/K139C/I201C/ K207Q: 84

D92Y/E100W/A217G/H363R: 84

E54C/A101C/K139C/I201C: 86

K139C/I201C: 87

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/ K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S: 90

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201 C/K207QN208T/A217G/ K234V/N247D R289W/H363R: 92

T35A/Y48H/E54C/P75N/ K76N/ D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201 C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R: 93

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201CN208T/ A217G/ K234V/N247D/ R289W/ H363R: 95

E54C/D92Y/A101C/K139C/ I201C/ A217G/H363R: 96

E54C/D92Y/A101C/Kl39C/ I201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/ H363R: 96

D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/ K234V/N247D/ H363R: 98

P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/ E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R: 98

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R: 99

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/ A132V/K139C/ Q162R/Q181 L/I201C/A217G/ K234V/ P348R: 100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/1201 C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R: 100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152VI201C/A217G/K234V/N247D/H363R: 100

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R: 100

D92Y/E100W/K139C/D173N/ P175S/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/ H363R: 100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/1201C/V208T/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R: 100

Y48H/E54C/D92Y/A101 C/K139C/I201 C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R: 100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/1201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R: 100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R: 100

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/ H363R: 100

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R: 100

04-08-2015

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247W/R289W/H363R

100

Ejemplo 6. Perfil de pH

[0242] El perfil de pH se determinó a 37°C en el intervalo de pH de 2,0 a 7,5 (en pasos de 0,05 unidades de pH) como se describe eanteriormente en la sección "Determinación de la actividad de fitasa", exceptuando que se usó un cóctel de tampón (50 mM de glicina, 50 mM de ácido acético y 50 mM de bis-tris en vez del tampón de 0,25 M de acetato sódico pH 5,5. Los resultados se resumen en la Tabla 1 de abajo. Los valores dados para cada pH en el intervalo de 2, 0-7,5 son la actividad relativa en % normalizada al valor óptimo.

Tabla 6: Perfiles de pH relativos a 37º C

Mutación/pH: 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

K26P: 72 89 100 96 81 67 55 37 21 8 1 3

K26Q: 40 69 91 100 98 95 84 59 35 12 -1 1

K26R: 48 66 85 100 99 98 87 64 40 14 2 -1

D92Y/E100W/ A217G/H363R: 63 78 94 100 95 76 46 20 7 1 -1 9

Q9S/N78Q/A89A/ D92Y/H115M/ A132V/K139C/ Q162R/Q181L/ 1201C/A217G/ K234V/P348R: 50 68 90 100 99 79 42 17 3 0 0 5

T35C/L172C: 39 65 87 100 99 94 73 51 30 10 1 1

D92Y/E100W/ A217G/H363R: 63 78 94 100 95 76 46 20 7 1 -1 9

Q9S/N78Q/A89A/D9 2Y/H115M/A132V/ K139C/Q162R/Q181 L/ I201C/ A217G/ K234V/P348R: 50 68 90 100 99 79 42 17 3 0 0 5

H143C/I201C: 49 71 89 100 93 90 77 55 33 12 2 0

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/K139C/ I201C/A217G/ K234V/N247D/ R289W/ H363R: 42 65 89 100 98 85 53 21 7 1 0 -1

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/K139C/ T152A/I201C/ A217G/K234V/N247 W/R289W/H363R: 47 62 89 100 97 85 52 18 6 0 0 0

T35A/Y48H/E54C P75N/K76N/D77Q/ N78T/D92Y/A101C/ K139C/T152A I201C/A217G/ K234V/N247D/ R289W/H363R: 41 74 88 100 96 78 49 17 5 0 -1 -2

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/ K139C/: 39 70 87 100 94 82 52 21 7 2 1 -1

E13170321

04-08-2015 E13170321

T152A/ I201C/ A217G/ K234V/ N247D/R289W/ H363R

E54C/D92Y/A101C/ K139C/ I201C/ A217G/H363R: 40 65 87 100 99 88 57 23 7 1 0 -1

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/ K139C/ T152A/I201C/ V208T/ A217G/ K234V/N247D/ R289W/H363R: 40 70 84 100 98 90 65 29 11 3 1 -1

K131P: 50 64 83 95 100 99 95 83 65 36 5 3

K131Q: 51 67 82 98 100 99 95 80 69 39 7 -2

K207R: 38 51 71 85 100 97 95 81 50 27 3 3

D33C/Y179C: 40 53 72 86 100 92 83 65 38 18 2 5

G325C/T358C: 40 54 78 93 100 100 90 68 41 16 0 -3

H228C/H363C: 36 53 75 92 100 97 88 67 38 16 2 -1

A150C/L259C: 36 57 78 95 100 97 89 64 42 16 3 -2

D92Y/E100W/ K139C/I201C/ A217G/N247D/ H363R: 58 73 90 99 100 84 49 20 6 1 -1 3

D92Y/E100W/ K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/ H363R: 58 73 90 99 100 84 49 20 6 1 -1 3

T308A: 39 58 79 99 100 94 85 76 55 36 4 -3

E54C/A101C: 42 55 77 98 100 90 85 63 0 15 2 1

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/T152I/ I201C/A217G K234V/ N247D/ H363R: 54 68 84 98 100 93 54 20 5 0 0 -6

K131Q Q: 51 67 82 98 100 99 95 80 9 39 7 -2

I49L: 40 62 83 97 100 94 80 58 37 14 2 -1

Y48H/E54C/D92Y /A101C/ K139C/ I201C/A217G/ K234V/ N247W/ R289W/H363R: 42 62 87 96 100 81 50 22 6 0 0 -1

Q162N: 40 66 75 96 100 93 91 73 47 22 6 1

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/201C/ A217G/K234V/ N247D/R289W/ H363R: 46 69 86 95 100 79 55 23 9 2 0 0

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/T152A/ 1201 C/A217G/ K234V/: 41 59 75 94 100 95 66 24 6 1 0 -1

04-08-2015 E13170321

N247W/ Q256D/H363R

E66C/L370C: 33 58 80 94 100 100 87 66 41 14 2 0

E41Q: 44 62 78 93 100 97 86 68 41 17 3 0

Q109G: 37 57 77 92 100 100 96 73 48 23 41 0

A163K: 47 63 75 92 100 99 89 67 41 13 3 0

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/Q256D/ H363R: 50 55 72 91 100 91 57 19 4 -1 -1 -1

A304V: 53 60 82 91 100 95 88 68 45 19 3 3

E54C/D92Y/A101C/: 35 48 68 90 100 94 64 22 6 0 -1 -1

K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/ Q256D/ H363R

P75N/K76N/D77Q/ N78T/ D92Y/ E100W/K139C/ I201C/A217G/ K234V/N247D/ Q256D/H363R: 42 55 71 88 100 95 62 23 6 0 0 0

D92Y/E100W/ K139C/I201 C/ A217G/K234V/ N247W/Q256D/ H363R: 37 51 65 89 100 97 69 20 2 -3 -5 -4

Y48H/D92Y/T98S/ E100W/ K139C/ T152A/I201C/ A217G/K234V/ N247W/Q256D/ H363R: 39 50 69 89 100 99 73 28 8 0 -1 -1

K234E: 44 53 75 88 100 99 95 71 47 19 3 1

D92Y/E100W/ K139C/D173N/ P175S/I201C/ A217G/ K234V/ N247D/ Q256D/ H363R: 44 54 70 87 100 93 62 22 5 1 0 -1

K207R: 38 51 71 85 100 97 95 81 50 27 3 3

D33C/E54C/A101C/ Y179C: 37 59 74 84 100 88 82 65 41 21 5 2

Q162N/D138N: 39 58 81 95 100 100 91 71 47 21 4 3

Q162R: 38 58 78 88 100 100 96 72 48 22 3 0

N285D: 45 61 81 96 100 100 97 71 39 18 2 7

E66C/L370C: 33 58 80 94 100 100 87 66 41 14 2 0

T369S: 46 56 79 92 100 100 94 72 47 22 3 2 -1

S192A: 46 58 81 90 100 100 93 62 42 15 2 0

04-08-2015 E13170321

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/K139C/ T152A/I201C/ K207Q/V208T/ A217G/K234V/ N247D/ R289W/ H363R: 36 63 83 96 100 100 85 61 36 14 2 -1

Tipo salvaje: 41 57 77 93 99 100 94 75 48 20 3 0

K131L: 45 59 75 93 98 100 96 84 71 44 13 -1

D33C/P178C: 37 61 77 90 94 100 88 66 43 15 1 1

F63C/L368C: 29 55 78 92 98 100 83 65 38 14 2 -1

S1QS: 45 56 80 86 99 100 83 63 45 14 3 0

1303L: 40 59 75 89 98 100 91 73 45 18 2 0

F8Y: 44 59 78 93 98 100 88 64 37 14 3 -4

1201V: 36 53 73 91 98 100 88 68 40 13 -1 -2

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/I201C/ V208T/A217G/ K234V/ N247D/ Q256D/H363R: 46 60 76 88 98 100 74 35 10 1 0 1

K176R: 38 58 76 90 97 100 94 72 45 18 0 -4

S1P: 46 56 80 90 97 100 84 64 40 15 2 -2

T242S: 38 58 73 85 97 100 97 73 48 22 2 -1

S396D: 41 54 76 87 97 100 93 71 47 19 4 0

F8M: 48 57 71 90 96 100 82 70 40 14 5 1

N239R: 32 46 69 93 96 100 98 74 50 24 1 2

N239K: 38 52 70 91 96 100 95 73 48 20 3 0

S396K: 37 51 72 87 96 100 96 73 46 21 3 -1

K139C/I201C: 34 48 69 84 96 100 94 72 45 17 1 -2

K148R: 35 57 70 90 95 100 92 75 47 15 1 -1

P348R: 38 54 73 91 95 100 98 72 48 25 3 1

I201G: 36 52 73 93 95 100 89 68 41 14 -1 -5

V130UM137U V146I/I201V/ M260L/I266V: 32 53 69 88 95 100 89 71 52 26 8 2

T152G: 30 50 67 84 94 100 95 73 47 19 2 0

L401N: 30 50 63 87 94 100 100 72 50 23 2 1

I294L: 37 53 78 83 93 100 94 73 46 20 2 -1

G346S: 34 55 71 86 93 100 90 69 43 18 2 -5

H363R: 29 50 67 87 92 100 96 77 49 22 2 0

T369D G72A: 35 54 68 82 92 100 90 72 51 18 3 0

35: 47 67 85 90 100 80 61 37 14 -1 -2

E54C/A101C/ K139C/I201C: 37 49 75 87 90 100 89 66 50 23 6 0

04-08-2015

S261A: 30 46 69 83 90 100 84 67 43 19 -1 -3

K187E: 34 57 72 88 89 100 92 70 44 21 1 -1

E54C/A101C/ K139C/1201C/ K207Q: 28 48 65 79 89 100 98 85 71 47 18 1

A217G: 39 54 73 85 88 100 85 59 39 -1 -1

K207L: 41 52 69 84 92 98 100 92 69 41 11 1

K207Q: 38 49 69 83 95 95 100 92 65 45 10 5

S403N: 33 51 72 85 99 99 100 77 49 22 1 -1

K45P: 34 60 72 90 91 98 100 75 48 23 2 0

E100W: 29 44 69 78 93 98 100 84 57 28 3 0

S1QGPS/K26H/ E54C/A101C/ K139C/Q162N/ G186S/I201C/ K207Q/ G346S: 38 54 69 83 92 98 100 88 64 29 2 -1

K234V: 35 54 65 94 93 96 100 74 44 26 3 1

E54C/A101C/K207Q: 34 52 70 85 96 96 100 92 76 47 14 1

K207Q: 38 49 69 83 95 95 100 92 65 45 10 5

Ejemplo 7: Estabilidad del vapor

Método 1

5 [0243] La actividad residual de las moléculas de fitasa después del tratamiento de vapor fue evaluada usando el siguiente ensayo:

20 µL de cada muestra de enzima purificada se dispensa en un único pocillo de una placa de 96 pocillos de Corning® (1

10 x 8 Stripwell™) (Corning, Lowell, MA, EE. UU.) y posteriormente es evaporada a sequedad en un centrifugador de vacío (Genevac EZ-1 Plus, Genevac Ltd, Suffolk, Reino Unido). La incubación de vapor se realiza en un contenedor styropor cerrado con las dimensiones internas 27 x 18 x 20 cm. Las muestras, en bandas abiertas, se colocan aproximadamente 10 cm sobre el fondo del contenedor en una cremallera metálica, para no estar en contacto con el agua.

15 [0244] Un litro de agua hierviendo se vierte en el contenedor, la tapa se cierra y la temperatura del vapor producido es monitoreada usando un termómetro montado en la tapa del contenedor. La incubación procede durante 60 segundos desde el momento que el agua se vierte en el contenedor. Durante este periodo, la temperatura aumenta a aproximadamente 85° C. Inmediatamente después de la incubación, las muestras son enfriadas en hielo, resuspendidas y evaluadas respecto a la actividad de la fitasa usando ensayo de fosfato de p-nitrofenilo colorimétrico (pNPP) (Sigma,

20 Broendby, DK). Cada muestra enzimática es comparada con una muestra similar que ha sido tratada con vapor para calcular la actividad residual.

[0245] Los resultados se presentan en tablas 7 y 8 más abajo.

Tabla 7: Estabilidad al vapor determinada por el método 1

Variante: Actividad residual [%]

Experimento 1: Wt 12

E66C/L370C: 23

D33C/E54C/A101C/Y179C: 22

Experimento 2: Wt 14

G346S: 25

E13170321

04-08-2015

Q109G: 22

H143C/I201C: 16

Experimento 3: Wt 10

Q162N (realizado dos veces): 31;35

Experimento 4: Wt 20

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R: 88

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R: 62

D92Y/E100W/K139C/1201C/A217G/N247D/H363R: 51

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ Q256D/H363R: 54

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R: 45

Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/ I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R: 86

E54C/D92Y/A101C/K139C/1201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R: 91

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R: 88

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/ I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R: 90

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ V208T/A217G/K234VM247D/R289W/H363R: 95

T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R: 81

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R: 95

Experimento 5: Wt 25,9

D92Y/E100W/A217G/H363R: 39,5

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R: 57,5

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R: 68,5

Método 2

[0246] En estos experimentos, se usó una configuración modificada por la cual el vapor es provisto desde un generador de vapor y conducido a la caja. Las muestras colocadas en una placa se insertan en la caja a través de un cajón cuando se ha alcanzado la temperatura. Tras la inserción de las muestras, la temperatura cae 4° C. La incubación se realiza durante 30 segundos mientras la temperatura permanece aproximadamente constante a 90° C. Luego la placa es rápidamente quitada de la caja y las muestras son colocadas en hielo. Las muestras se analizan como en el método 1.Tabla 8: Estabilidad al vapor determinada por el método 2

Variante: Actividad residual [%]

Experimento 1: Wt 15

V130L/M137L/V1461/I201V/M260L/I266V: 27

Experimento 2: Wt 6

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/ G186S/I201C/K207Q/G346S: 29

Experimento 3: Wt 4

S261A: 12

T308A: 9

E13170321

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Experimento 4: wt 8

L401N: 14

S403N: 9

T308A: 11

Experimento 5: wt 4

E54C/A101C: 9

Experimento 6: wt 6

T152G: 10

Experimento 7: wt 5

S1P: 10

F8M: 14

Experimento 1: wt 15

Experimento 8: wt 3

K139C/I201C: 13

Experimento 9: wt 5

S1QS: 9

A217G: 9

Ejemplo 8: actividad residual de glicación

[0247] Inactivación por glicación

[0248] El efecto de glicación fue investigado por incubación de variantes de fitasa purificadas con glucosa. Para esto 0,5mg/ml de enzima en 0,1 M HEPES pH 7,5 se mezcló con 1 M de glucosa y se incubó a 50° C durante 5 h. La actividad de fosfatasa fue medida antes y después de la incubación y los resultados se indicaron más abajo en la tabla 9 Tabla 9: Modifiación de glicación

mutación: Actividad residual

Wt: 18%

K26Q: 55%

K26R: 47%

10

[0249] Los resultados mostrados arriba indican que la enzima de tipo salvaje es fuertemente inhibida por glicación (18% de actividad residual). Las variantes en la posición K26 son claramente mucho mejores en este aspecto siendo menos afectadas.

Ejemplo 9: pruebas de estabilidad de granulación

15 Mediciones de estabilidad de granulación

[0250] Aproximadamente 50 g de granulado enzimático fue premezclado con 10 kg de alimento durante 10 minutos en un mezclador horizontal pequeño. Esta premezcla fue mezclada con 90 kg de alimento durante 10 minutos en un 20 mezclador horizontal más grande. Del mezclador, el alimento fue llevado al acondicionador (un mezclador de cascada con inyección de vapor) a razón de aproximadamente 300 kg/hora. El acondicionador calentó el alimento a 95 °C (medido a la salida) por vapor de inyección. El periodo de permanencia en el acondicionador fue 30 segundos. Del acondicionador, el alimento fue llevado a una prensa Simon Heesen equipada con boquilla horizontal de 3,0x35 mm y se prensó a gránulos con una longitud de alrededor de 15 mm. Después de la prensa, los gránulos fueron colocados en

25 un refrigerador de aire y enfriados durante 15 minutos.

imagen21

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Degradación de fitato de la variante como porcentaje de degradación de fitato por el tipo salvaje (dos números representan datos de dos ensayos diferentes)

Dosificación de fitasa (FYT/kg de alimento)

Variante de fitasa

D92Y/E100W/A217G/H363R: 125 181

Como se indica arriba: 250 199

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R: 125 74; 101

Como se indica arriba: 250 71; 137

Como se indica arriba: 500 72

Como se indica arriba: 1000 76

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R: 125 252; 543

Como se indica arriba: 250 219; 347

Como se indica arriba: 500 184; 215

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R: 125 237; 297

Como se indica arriba: 250 160; 246

Como se indica arriba: 500 148;197

K207Q: 250 57

E54C/A101C: 250 119

G346S: 250 79

Q162N: 250 180

S1QS: 255 68*

S1P: 277 70*

F8M: 246 74*

F8Y: 229 71*

K139C/I201C: 250 105

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S: 250 90

* Para estos datos el peso fue evaluado a 250 FTU/kg

Ejemplo 11: rendimiento en una prueba de cerdo in vivo

[0274] Evaluación comparativa de los efectos de cantidades valoradas de dos variantes de fitasa Hafnla alveii en la 5 digestibilidad fecal y excreción de fósforo y calcio en cerdos en crecimiento.

[0275] Se utilizaron sesenta y cuatro cerdos blancos grandes Landrace con un peso corporal inicial de 43,55 ± 4,35 kg.

[0276] Los animales fueron alojados en jaulas de corral de piso en una cámara del medio ambiente controlado. Cada

10 corral tenía un suelo con cables soldados revestidos de plástico y estaba equipado con dos boquillas de agua y cuatro alimentadores individualizados de acero inoxidable. La temperatura ambiente fue 21-22° C y el porcentaje de humedad fue 50 %.

[0277] Los cerdos fueron alimentados con una dieta básica formulada para proporcionar fósforo (P) exclusivamente de 15 origen vegetal durante un periodo adaptativo de 14 días. Después de ese periodo, fueron asignados en 16 grupos iguales de 4 animales cada uno.

5

10

15

20

25

30

35

40

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[0278] Fueron alimentados durante 12 días con la dieta básica o esta dieta suplementada con 1000, 2000 U/kg y 4000 U/kg de fitasa Hafnia alveii de tipo salvaje, con 500,1000 y 2000 U/kg de la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R o con 500,1000 y 2000 U/kg de la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V / N247D/H363R.

[0279] Un marcador indigerible (óxido de cromo) se añadió a una concentración de 0,4 % a todas las dietas permitiendo el cálculo del digestibilidad de P y calcio (Ca). El alimento fue distribuido ad libitum en la forma de trituración, bajo control de consumo de alimentación de corral y los animales tenían libre acceso al agua potable. La digestibilidad de Ca no era corregida para la ingesta de Ca con el agua potable.

[0280] Las concentraciones de P Fecal, Ca y Cr fueron medidas al 12º día del segundo periodo. Las heces fueron muestreadas individualmente, en aproximadamente la misma cantidad al mismo tiempo del día, durante los últimos 3 días antes de esa fecha. De ese modo, para cada tratamiento dietético y para cada criterio, se han realizado un total de 12 determinaciones individuales. Todos los minerales fueron determinados según los métodos estándares de Association of Official Analytical Chemists (1990) usando un espectómetro Vista-MPX ICP-OES. La digestibilidad aparente (% de la toma) de los minerales fue calculada para el periodo mencionado de 3 días.

[0281] La concentración media de P fecal de los animales suplementados con enzima fue muy significativamente inferior a la observada para los animales que ingirieron la dieta de control (a).

[0282] La digestibilidad P dependió de la dosis y mejoró muy significativamente con las cinco fitasas en todos los grupos suplementados (b). La máxima digestibilidad P fue observada en la dieta suplementada con 4000 U/kg de Hafnia alvei de tipo salvaje y en el grupo JHP113 con 2000 U/kg.

[0283] La excreción fecal de P fue significativamente reducida en todos los animales suplementados con fitasa y para todos los niveles de inclusión evaluados (c).

[0284] El P aparente absorbido fue superior al 2,25 g/kg recomendado para los cerdos en crecimiento en el grupo de 4000 U/kg de Hafnia alvei de tipo salvaje y muy cerca de éste con JHP113 y "C. braakii" de tipo salvaje con 2000 U/kg y 4000 U/kg respectivamente (d).

[0285] Las equivalencias P, consideradas como P suplementario digerido comparativamente con el control no suplementado, fueron muy significantivamene superiores al control en las cinco dietas suplementadas con fitasas (e).

[0286] La digestibilidad de Ca fue mejorada y la excreción fecal de Ca fue reducida con todas las enzimas evaluadas y en todos los niveles de inclusión (f).

[0287] El máximo de eficiencia en estos parámetros fue observado con Hafnia alvei de tipo salvaje al nivel de inclusión de 4000 U/kg, mientras que la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C / A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R tuvo el mejor rendimiento al comparar la eficacia con las suplementaciones de 1000 U/kg y 2000 U/kg.

[0288] Los resultados se presentan en la siguiente tabla 12

Tabla 12: Niveles residuales de de parámetros para digestibilidad

Dosis (U/kg)

0: 500 1000 2000

(a) concentración fecal de fósforo (mg/g DM)

Wt: 14,3 11,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R: 13,7 12,6 11,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R: 14,5 13,9 11,0

Control: 18,3

(b) digestibilidad fecal aparente de fósforo (%)

Wt: 47,3 50,1

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R: 44,1 55,3 58,0

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R: 43,1 48,6 51,4

Control: 27,9

(c) excreción de fósforo (mg/g DM)

Claims

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