DE1492060C3 - Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen - Google Patents

Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen

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DE1492060C3 DE19651492060 DE1492060A DE1492060C3 DE 1492060 C3 DE1492060 C3 DE 1492060C3 DE 19651492060 DE19651492060 DE 19651492060 DE 1492060 A DE1492060 A DE 1492060A DE 1492060 C3 DE1492060 C3 DE 1492060C3
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Nordmark-Werke 2000 Hamburg GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Description

Die Instabilität der Enzyme führt bei Enzymzubereitungen zu zum Teil großen Aktivitätsverlusten, besonders bei wäßrigen Enzymlösungen. Diese Qualitätsminderung gab Anlaß, bei der Herstellung therapeutisch anwendbarer Enzymzubereitungen Enzymüberdosierungen vorzunehmen, um Mindestaktivitäten deklarieren und garantieren zu'können. Es ist daher ein allgemeines und betontes Anliegen, Enzymzubereitungen durch Zusatz von entsprechend wirksamen Substanzen zu stabilisieren.
In der deutschen Auslegeschrift 1 185 768 und der deutschen Patentschrift 1 121 769 werden Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Trypsin- und Chymotrypsinlösungen beschrieben. Schwefelfreie Aminosäuren finden als Stabilisatoren unter Zusatz von wasserlöslichen Calciumsalzen in beiden Verfahren Verwendung. Auch die österreichische Patentschrift 234 279 beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung therapeutisch anwendbarer Plasminlösungen unter Verwendung von Aminosäuren als Stabilisatoren. Auch für wäßrige Pepsinzubereitungen wurden stabilisierende Effekte der Aminosäuren und Peptide bzw. Peptone, peptische Hydrolyseprodukte von Edestin. Casein und Gelatine, beschrieben: A. Ss. Zypero wit sch, Ukrain. biochem. J. 29, S. 79 bis 89 (1957), zitiert n. Chem. Zentralblatt 1957, S. 10519; A. L. Lossewa, Ukrain. biochem. J. 29, S. 173
ίο bis 185 (1957), zitiert n. Chem. Zentralblatt 1958, S. 3924. Schließlich ist in der britischen Patentschrift 817 329 die Verwendung verschiedenster Zusatzstoffe wie Carboxymethylcellulose, Mucin, Pektin, Gelatine und verschiedene Kohlehydrate in trockenen Zubereitungen von Proteasen wie Pepsin beschrieben.
Die Instabilität von Pepsin in wäßriger Lösung,
d. h. das hier bedeutende Problem stellt sich bei trockenen Zubereitungen von Pepsin jedoch nicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen ist dadurch gekennzeichnet, daß man der wäßrigen Pepsinlösung 5 bis 10 Gewichtsprozent eines Polyäthylenglykols mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 400 bis etwa 2000, eines Polyvinylpyrrolidons mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von etwa 20000 oder eines Gemisches aus einem Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1000 und einem Polyvinylpyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20000 zumischt. Beim Einsatz eines Gemisches aus einem Polyäthylenglykol und einem Polyvinylpyrrolidon werden die beiden Verbindungen vorzugsweise im Verhältnis 1:1 eingesetzt und der wäßrigen Pepsinlösung in einer Menge von 5 bis 10 Gewichtsprozent zugesetzt.
Die Untersuchungen über die Stabilität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Lösungen wurden an Schweinepepsinlösungen (pH 2.2 bis 2,5) durchgeführt. Die Ausgangsaktivitäten lagen zwischen 7 und 8 Pepsineinheiten pro Gramm Lösung.
Tabelle 1 Ergebnisse der Stabilitätsprüfung bei r-20"C, nach einem Jahr
Zubereitung
Aktivitatsverlust in
Anzahl der
Meß reihen
Anzahl der
Eiinzelmessungen
Gelatine 1 Gewichtsprozent
Dextrin 10. Gewichtsprozent
Carboxymethylcellulose 1 Gewichtsprozent
Sorbit 20 Gewichtsprozent
Standard-Pepsinlösung
Glycerin 28 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 400)
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 1000)
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 2000)
10 Gewichtsprozent
Polyvinylpyrrolidon (PVP) (mittleres Molgewicht
etwa 20 000) 10 Gewichtsprozent
PVP (mittleres Molgewicht 20 000 — Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 1000) (1:1) 5 Gewichtsprozent
PVP (mittleres Molgewicht etwa 20 000 — Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 1000) (1:1)
10 Gewichtsprozent
38
37
35
31
38
16
Tabelle 2
Ergebnisse der Stabilitätsprüfung bei +370C nach 60 Tagen
Zubereitung
Aktivitätsverlust in Anzahl der
Meßreihen		 Anzahl der
Einzelmessungen
78
48		 3
3		 9
9
66
60		 2
2		 Os Os
58
48		 4
4		 12
12
52 2 6
48 2 6
43
37		 4
4 		12
12
38 2 6
38 2 6
Standard-Pepsinlösung
Glycerin 28 Gewichtsprozent
Mucin — NNR
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 400)
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent ,
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 1000)
5 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 2000)
5 Gewichtsprozent
Polyvinylpyrrolidon (PVP) (mittleres Molgewicht etwa 20 000)
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 1000)
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 2000) 10 Gewichtsprozent
Tabelle 3
Ergebnisse der Stabilitätsprüfung bei +530C nach 15 Tagen
Zubereitung
Aktivitätsverlust in Anzahl der Anzahl der
°/o Meßreihen Einzelmessungen
84 6 18
74 2 6
67 2 6
64 8 24
68 2 6
68 3 9
82 2 6
71 4 12
68 3 9
66 2 6
67 3 9
81 2 6
72 2 6
77 2 6
54 3 9
43 6 18
80 3 9
86 3 9
90 3 9
86 3 9
85 3 9
88 2 6
Standard-Pepsinlösung
Mucin (NNR)
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Glycerin 28 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 400)
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 1000)
1 Gewichtsprozent
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 2000)
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Polyäthylenglykol (Molgewicht etwa 5000 bis 6000)
1 Gewichtsprozent
5 Gewichtsprozent
Polyvinylpyrrolidin (PVP) mittleres Molgewicht 20 000)
1 Gewichtsprozent
5 Gewichtsprozent
10 Gewichtsprozent
Sorbit 20 Gewichtsprozent
Dextrin 10 Gewichtsprozent
Dextran 10 Gewichtsprozent
Carboxymethylcellulose 1 Gewichtsprozent
Gelatine 1 Gewichtsprozent
Pektin 1 Gewichtsprozent
Die proteolytische Wirksamkeit des Pepsins wird mit der Hämoglobin-Substrat-Methode bestimmt; hierbei handelt es sich um eine Modifikation der Methode nach A η s ο η, ausführlich beschrieben im »Wissenschaftlichen Beiblatt zur Materia Medica Nordmark«, Nr. 25, S. 18 (1963). Die zu prüfenden Substanzen wurden in Konzentrationen von 1 bis 20 Gewichtsprozent, vorzugsweise 5 bis 10 Gewichtsprozent, angewandt. Die Untersuchungen wurden bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt: +20, +37 und +530C.
Zur Prüfung gelangten folgende Substanzen: Pektin, Dextrin, Dextran, Carboxymethylcellulose, Gelatine, Mucin, Sorbit, Glycerin, Polyäthylenglykole und Polyvinylpyrrolidon. Die Verwendung von PoIyäthylenglykolen, Polyvinylpyrrolidonen und Gemischen hieraus als Enzymstabilisatoren für wäßrige Pepsinlösungen ist in der Literatur noch nicht beschrieben.
Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in den Tabellen 1 bis 3 für die verschiedenen Temperaturen aufgeführt. Die Ausgangsaktivitäten werden hierbei gleich 100 °/0 gesetzt und die Aktivitätsabnahme pro angegebene Zeiträume in Prozent der Ausgangsaktivitäten angegeben.
Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1
22,6 g roher salzsaurer Schweinemagenextrakt mit 35 Pepsineinheiten pro Gramm Extrakt werden mit den üblichen Konservierungsmitteln und Geschmackskorrigentien versetzt. 10 g Polyvinylpyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20000 werden in 20 ml Wasser gelöst und zur obigen Pepsinlösung gegeben. Mit verdünnter Salzsäure wird der pH-Wert auf 2,2 bis 2,5 eingestellt, dann mit Wasser ad 100 ml Endvolumen aufgefüllt.
B e i s ρ i e 1 2
Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 5 Gewichtsprozent des im Beispiel 1 verwendeten Polyvinylpyrrolidone hergestellt.
Beispiel 3
Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 10 Gewichtsprozent eines Polyäthylenglykols mit einem Molgewicht von etwa 400 bzw. etwa 1000 bzw. etwa 2000 hergestellt.
Beispiel 4
Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 5 Gewichtsprozent eines Polyäthylenglykols mit einem Molekulargewicht von etwa 400 bzw. etwa 1000 bzw. etwa 2000 hergestellt.
!5 B e i s ρ i e 1 5
20 g dialysierter salzsaurer Schweinemagenextrakt (mit 38 PE/g) werden analog Beispiel 1 mit 5 bzw. 10 Gewichtsprozent des im Beispiel 1 verwendeten Polyvinylpyrrolidons zubereitet.
Beispiel 6
20 g dialysierter salzsaurer Schweinemagenextrakt (mit 38 PE/g) werden analog Beispiel 1 mit 5 bzw. 10 Gewichtsprozent eines Polyäthylenglykols mit einem Molekulargewicht von etwa 400 bzw. etwa 1000 bzw. etwa 2000 zubereitet.
Beispiel 7
Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 10 Gewichtsprozent eines 1:1-Gemisches aus dem im Beispiel 1 verwendeten Polyvinylpyrrolidon und einem Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 zubereitet.
Beispiel 8
Analog Beispiel 1 bis 7 werden Pepsinzubereitungen mit kristallisiertem Pepsin 1:10 000 bzw. 1:6000 bzw. 1:3000 bzw. getrockneter Schweinemagenextrakt mit etwa 300 PE/g zubereitet.

Claims (1)

  1. I 492 060
    Patentanspruch:
    Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man der wäßrigen Pepsinlösung 5 bis 10 Gewichtsprozent eines Polyäthylenglykols mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von etwa 400 bis etwa 2000, eines Polyvinylpyrrolidons mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20000 oder eines Gemisches aus einem Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1000 und einem Polyvinylpyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20000 zumischt.
DE19651492060 1965-09-08 1965-09-08 Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen Expired DE1492060C3 (de)

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