DE560463C

DE560463C - Verfahren zur Trennung von Proteinasen und Carboxy-Polypeptidasen des Pankreas

Info

Publication number: DE560463C
Application number: DEK117894D
Authority: DE
Inventors: Dr Wilhelm Neugebauer
Original assignee: Kalle GmbH and Co KG
Current assignee: Kalle GmbH and Co KG
Priority date: 1929-12-10
Filing date: 1929-12-10
Publication date: 1932-10-03

Description

Verfahren zur Trennung von Proteinasen und Carboxy-Polypeptidasen des Pankreas Es ist bekannt, daß Trypsin aus einem Gemisch zweier Proteasen besteht, und zwar aus einer eigentlichen Proteinase und einem polvpeptidspaltenden Enzym. Letzteres unterscheidet sich von den Peptidasen des Erepsins dadurch, daß es nur solche Polypeptidketten angreift, die eine freie Carboxylgruppe besitzen, während die bisher bekannten Peptidasen nur Peptide mit freien Aminogruppen spalten. Die Polypeptidase des Trypsins ist daher als Carboxy-Polypeptidase bezeichnet worden.
Die Trennung der im Pankreas enthaltenen Proteinase von der Carboxy-Polypeptidase ist durch Adsorption mit Hilfe besonderer Tonerdesorten gelungen (vgl. z. B. Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft 1929, Seite 2217ff.).
Es wurde nun gefunden, daß sich die Proteinasen und Carbo."v-Polypeptidasen des Pankreas auf Grund ihrer Löslichkeitseigenschaften trennen lassen. Die Proteinasen sind im allgemeinen leichter löslich als die Carboxy-Polypeptidase. Versetzt man eine Lösung des Enzymgemisches mit Fällungsmitteln, wie Aceton oder Alkoholen, so scheidet sich zunächst die Carboxy-Polypeptidase ab. Bei Verwendung von Aceton und Alkoholen ist eine Konzentration von etwa 5o °/a am besten geeignet. Man kann natürlich auch so vorgehen, daß man feste Enzymgemische mit ähnlich konzentrierten Lösungen auszieht. Die Proteinase reichert sich dabei in den Lösungen an, während die CarDoxy-Polypeptidase in den Fällungen bzw. in den ungelösten Rückständen sich vorfindet. Durch geeignete Konzentrationsänderungen der proteinasehaltigen Mutterlaugen, z. B. durch Zusatz von bekannten Fällungsmitteln, wie Aceton, Alkoholen, oder durch andere geeignete Maßnahmen, wie vorsichtige Trocknung, läßt sich dann die Proteinase ebenfalls in fester Form gewinnen. Man kann bei geeigneten Bedingungen schon mit einem einzigen Fällungs-bzw. Lösungsprozeß eine weitgehende Trennung herbeiführen, die sich gewünschtenfalls durch Wiederholung des Verfahrens noch verbessern läßt. Die bei dem Verfahren auftretenden Verluste an Enzymen sind gering, so daß es für eine Ausführung in technischem Maßstab geeignet ist.
Es ist überraschend, daß sich so sehr verwandte Enzyme wie die Proteinasen und Carboxy-Polypeptidasen durch einfache fraktionierende Behandlung mit den bekannten Enzymfällungsmitteln voneinander trennen lassen.
Die nach dem beschriebenen Verfahren erhältlichen Einzelenzyme können in der pharmazeutischen Industrie Verwendung finden. Beispiele, i. Eine 5%ige wäßrige Lösung eines vollaktivierten Pankreasfrypsins, welches also durch Enterokinase in seiner Wirksamkeit nicht mehr gesteigert werden kann, wird mit dem gleichen Volumen Aceton versetzt. Die entstehende Fällung enthält etwa 8o % der Carboxy-Polypeptidase und etwa 15 bis 2o 0/0 der Proteinase. Durch Filtration oder Zentrifugieren wird die Fällung isoliert und nach bekanntem Verfahren auf Trockenpräparate verarbeitet. Aus den Mutterlaugen wird die Hauptmenge der Proteinase (etwa 8o'/0) durch Erhöhen der Acetonkonzentration (auf etwa 70%) abgeschieden und in üblicher Weise gewonnen. Sie enthält noch eine kleine Menge der Carboxy-Polypeptidase. Durch Wiederholung des Verfahrens kann die Trennung weitergetrieben werden.
Für die analytische Bestimmung kann man b,-i der Proteinase das Verflüssigungsv ermögen gegenüber Gelatine und bei der Carboxy-Polypeptidase das Abbauvermögen von halogen-acylierten Aminosäuren, wie Chloracetyltyrosin oder Chloracetylphenylalanin, benutzen, beispielsweise durch Messen der frei werdenden Aminogruppen nach dem Verfahren von van Slvke.
2. io Gewichtsteile Pankreastrypsin werden mit etwa ioo Gewichtsteilen 5ovoluniprozentigen Acetons i Stunde ' behandelt. Man scheidet den unlöslichen Teil dann durch Filtration oder Zentrifugieren ab. Er enthält etwa 8o 0% der Carboxy-Polypeptidase neben geringen Mengen Proteinase. Letztere ,wird aus den Mutterlaugen durch Zusatz der gleichen Menge Aceton mit etwa 8oa/oiger Ausbeute abgeschieden. 3: Eine wäßrige Pankreastrypsinlösung wird mit 1,2 Raumteilen n-Propylalkoliol gefällt. Die Fällung enthält etwa ; 5 % der Carboxy-Po lypeptidase; aus der davon abgetrennten Mutterlauge wird durch Zusatz der doppelten Menge n-Propylalkoliol die Proteinase in einer Ausbeute von etwa 8o 0/0 gewonnen, vermischt mit einer kleinen Menge C arboxv-I'olypeptidase.
Eine 5%ige wäßrige Pankreatinlösung wird mit i,i Raumteilen Ätlivlalkoliol versetzt. Die entstehende Fällung wird abfiltriert. Sie enthält etwa 70 % der Carboxy-Polypeptidase und etwa 25 % der Proteinase. Aus dem Filtrat wird durch Erhöhung der Alkoholkonzentration auf etwa 70 % die Proteinase in einer Ausbeute von etwa 75 0/0 gewonnen. Sie enthält noch etwas Carboxy-Polypeptidase.
In den vorstehenden Beispielen können Aceton, Äthylalkohol und Propylalkohol -durch andere wasserlösliche Fällungsmitter oder Extraktionsmittel ersetzt werden. Die Gewinnung des in Lösung gebliebenen Enzyms kann statt durch Fällung auch durch Zerstäubungstrocknung oder andere Verfahren geschehen.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Trennung von Proteinasen und Carboxy-Polypeptidasen des Pankreas, dadurch gekennzeichnet, daß man Gemische der beiden Enzyme einer fraktionierten Behandlung mit als Enzymfällungsmitteln bekannten organischen, wasserlöslichen Lösungsmitteln, wie Aceton oder Alkoholen, unterwirft.