CN105408476A - 凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种液态或干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物和一种分离目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法。
Description
技术领域
本发明涉及液态或干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物和一种分离目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法。
背景技术
乳凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)使奶发生酶促凝结是干酪制造中最重要的过程之一。酶促乳凝结是两阶段工艺:第一阶段,在此阶段,蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻击κ-酪蛋白,导致酪蛋白胶束结构的亚稳态,和第二阶段,在此阶段,奶随后凝结并且形成凝结物。
凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)(哺乳动物胃的乳凝固酶)是属于一个肽酶大类的天冬氨酸蛋白酶。
商业上相关的乳凝固酶产品通常是液态组合物,且在所属领域中描述了用于使产品中的乳凝固酶稳定的多种不同方法,例如为了提高酶的储存稳定性。
举例来说,EP2333056A1(DSM,申请日12.04.2007)描述了甲酸酯、乙酸酯、乳酸酯、丙酸酯、苹果酸酯、富马酸酯或丙二醇可以增加液态组合物/产品中的天冬氨酸蛋白酶的稳定性。
WO2012/127005A1(DSM)描述了一种稳定的液态凝乳酶组合物,其包含浓度为2-100g/kg的无机盐和防腐剂,例如甲酸酯、乙酸酯、乳酸酯、丙酸酯、苹果酸酯、苯甲酸酯、山梨酸酯或富马酸酯、乙二醇(乙二醇)、丙二醇(丙二醇)、甘油、赤藓糖醇、木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、肌醇或半乳糖醇。
聚乙二醇(PEG)是环氧乙烷的聚合物,其可替代性地被称为聚氧乙烯(POE)。PEG是以例如300g/mol到10,000,000g/mol的广范围分子量市售的。
US5139943(Genencor,1992年8月18日公开)描述了使用PEG通过所谓的液液两相系统回收由微生物生产的凝乳酶,其中将PEG和无机盐添加到发酵基质/啤酒中以便形成液液(水性)两相系统,然后从PEG相中回收/分离凝乳酶。在工作实施例中,描述了使用约4-5%wt/volPEG8000和约10%wt/vol硫酸钠盐以便能够获得液液(水性)两相系统。
US7998705B2(Fujifilm,2011年8月16日公开)描述了使用PEG增加高盐溶液(例如细胞培养肉汤)在离子交换色谱树脂上的动态结合能力,从而能够纯化目的蛋白质。作为目的蛋白质的实例,提及了牛球蛋白、牛血清白蛋白和溶菌酶,但是没有明确提及乳凝固酶(例如凝乳酶)。在工作实施例(参见例如实施例1)中描述了通过使用约6%w/v的PEG(优选地PEG4600)获得最佳的蛋白质回收,例如,使用仅0.5%PEG对蛋白质回收/分离几乎没有积极影响。
如所属领域中已知的,术语聚乙二醇化作用(PEGylation)涉及聚乙二醇(PEG)结构与另一个更大分子(例如治疗蛋白质)共价偶联的行为(所述更大分子于是被称为经过聚乙二醇化)。通过增加分子的分子量,聚乙二醇化作用可以赋予优于未改性形式的若干显著的药理学优点,例如改善的药物溶解度、降低的给药频率。
US2011/0008846A1(Qiagen)描述工业用酶的聚乙二醇化作用,且在一长串提及的合适工业用酶内提及粗制凝乳酶(凝乳酶)作为合适工业用酶的一个实例。工作实施例仅涉及聚合酶的聚乙二醇化,即,没有工作实施例涉及粗制凝乳酶(凝乳酶)的聚乙二醇化。
本文中可能相关的是,应注意以上引用的现有技术参考文献都没有描述 PEG可以增加天冬氨酸蛋白酶乳凝固酶(例如凝乳酶)的稳定性。
DE1492060A1(Nordmark-WerkeGmbH,1969年公开)公开了一种通过以1-20wt%(相当于10000ppm到200000ppm)的浓度添加分子量为400-6000的PEG来制造胃蛋白酶组合物的方法。
发明内容
本发明打算解决的一个问题是提供一种新颖的凝乳性天冬氨酸蛋白酶(例如凝乳酶)组合物,其中所述天冬氨酸蛋白酶具有增加的稳定性和/或活性。
本发明打算解决的另一个问题是提供一种用于分离天冬氨酸蛋白酶(例如凝乳酶)的新颖方法,其中所述方法可以使分离的天冬氨酸蛋白酶组合物具有增加的活性。
解决方案是基于诸位发明人已经确定,通过将PEG或类似的经取代聚氧乙烯(例如Brij35)添加到凝乳酶中,可以显著提高凝乳酶的物理稳定性。
本文图1显示PEG和Brij35的结构。
如本文的工作实施例中所论述,通过色谱法纯化重组生产的牛凝乳酶(Chr.HansenA/S)和骆驼凝乳酶(M,Chr.HansenA/S),其中在从柱上洗脱之前添加PEG8000和Brij35,或者将PEG8000和Brij35添加到洗脱缓冲液中。
相比在未添加PEG/Brij35的情况下纯化的对照样品,含有PEG8000或Brij35 的样品的比活性增加了1.5到2倍(参见本文工作实施例2中的论述和本文图2)。
凝乳酶的显著增加的比活性的效果令诸位发明人吃惊,尤其因为其可以在 蛋白质分离后立即看到。
这种立即的观察到的增加的比活性不能如下解释:PEG/Brij35仅例如通过减少可能的长期储存沉淀问题来增加酶的长期储存稳定性,因为在根据本文中的工作实施例中所用的纯化方案/方法分离蛋白质之后,没有立即出现酶的显著沉淀,即,在未添加PEG/Brij35的对照实验中,在蛋白质分离之后也没有立即出现酶的显著沉淀。
不希望受限于理论,认为PEG/Brij35对凝乳酶提供增加的构象稳定性,并且这可以解释在本文工作实施例中所观察到的立即观察到的增加的比活性。
不希望受限于理论,认为在现有技术中还没有描述或建议PEG或在结构上 类似的聚合物可以增加天冬氨酸蛋白酶乳凝固酶(例如凝乳酶)的稳定性,尤其是还没有描述可以增加构象稳定性。
本文图3中说明了酶的构象稳定性。
如所属领域中已知的,构象的损失等于酶活性的损失。
在本文的工作实施例中,还证明了添加PEG可以增加液态和/或粒状凝乳酶 组合物的长期储存稳定性。
不希望受限于理论,情况可能是,对于天冬氨酸蛋白酶乳凝固酶(例如凝乳酶)来说,结构构象的损失可以导致在例如长期储存期间在例如液态制剂中酶的沉淀增加。
因此,情况可能是,PEG帮助减少乳凝固酶在储存期间的沉淀,例如因为PEG对酶提供构象稳定性。
聚乙二醇(PEG)是环氧乙烷的聚合物,且可被替代性地称为聚氧乙烯(POE),PEG的基于结构的IUPAC命名为聚(氧乙烯)。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,Brij35可被称为经取代聚氧乙烯,其中取代基可被视作本文图1中所示的“C12”结构。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,例如聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯等聚合物可被视为在结构上和功能上与PEG/Brij35有关。
如所属领域中已知的,聚合物可以是杂聚物或共聚物,其是衍生自两种(或更多种)单体物质的聚合物,与之相反的是均聚物,其中仅使用一种单体。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,衍生自单体物质环氧乙烷、乙烯聚吡咯烷酮、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯腈、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中的两种(或更多种)的共聚物在本篇上下文中可被视为在结构上和功能上有关的。
不希望受限于理论,认为没有明显的技术原因让人不相信在结构上和功能上与PEG/Brij35有关的这些聚合物能实现凝乳性天冬氨酸蛋白酶稳定性在本文中的相关改善。
在本文的相关工作实施例中使用了PEG8000和Brij35,其分别具有8000g/mol和1225g/mol的平均分子质量。
在本篇上下文中,认为分子质量(或者被称为分子量(MW))为200g/mol到50,000g/mol的本文中相关聚合物将是合适的。
在本篇上下文中,认为重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为n=5到n=1250的本文中相关聚合物将是合适的。
作为一个实例,在图1中可以见到Brij35具有n=23。
如所属领域中已知的,n=1250的PEG具有约50,000g/mol的MW,且PEG8000具有约8,000g/mol的MW和n=200。
图6显示另一种本文中相关聚合物聚山梨酸酯20的一个实例,其包含总计20个环氧乙烷单体。
在本文的工作实施例4中证明了添加聚山梨酸酯20增加了所测试的液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物的稳定性。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,聚山梨酸酯20是就本文第一方面的特征(c)来说,重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为20的聚合物。
举例来说,使用图6的命名法,聚山梨酸酯20可以例如具有w、x、y和z=5,即各自具有n=5的4组单体。
因此,如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,此类聚山梨酸酯20聚合物在本篇上下文中将是就本文第一方面的特征(c)来说,具有n=5×4=20的聚合物。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,在本篇上下文中相关的是所述聚合物中存在的本文中相关单体(例如环氧乙烷)的数量。
举例来说,所述聚合物中存在的本文中相关单体(例如环氧乙烷)的总数对于例如该聚合物的本文中相关分子质量是重要的。
因此,如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,与本文第一方面的特征(c)有关的术语“重复单体”涉及所述聚合物中存在的本文中相关单体(例如环氧乙烷)的总数。
如所属领域中已知的,凝乳性天冬氨酸蛋白酶可被视为在结构上相对类似的。
如所属领域中已知的,从不同的哺乳动物或真菌物种(例如牛、骆驼、羊、猪或毛霉)获得的不同天然野生型凝乳性天冬氨酸蛋白酶多肽序列具有相对较高的三级结构相似性。
在本文图4中提供来自于不同的哺乳动物物种(奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼和猪)的本文中相关的不同凝乳性凝乳酶序列的比对,如图4中可以见到,所述序列具有紧密的序列关系且已知具有非常高的三级结构相似性。
在本文图5中提供来自于不同哺乳动物或真菌物种的本文中相关的市售的不同凝乳性天冬氨酸蛋白酶序列(骆驼凝乳酶、奶牛凝乳酶、奶牛胃蛋白酶、真菌毛霉胃蛋白酶和真菌内座壳属(Endothia)胃蛋白酶)的比对。
可以说图5的5种不同序列并不是高度相同,但是如本领域技术人员已知的,所有这5种不同的凝乳性天冬氨酸蛋白酶已知都具有较高的三级结构相似性。
如上文所论述的和在本文工作实施例中所示的,对于牛凝乳酶和骆驼凝乳酶已经证明了本文中相关的提高/增加的稳定性。
不希望受限于理论,认为没有明显的技术原因使人不相信本文中相关的提高/增加的稳定性效果相关于一般性的凝乳性天冬氨酸蛋白酶——如上文所论述的,已知所述天冬氨酸蛋白酶具有较高的三级结构相似性,并且如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,这种三级结构相似性使得以下情况显得合理:本文描述的提高稳定性的聚合物-酶相互作用将是在结构上类似的本文中相关的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的一般性的类效果。
因此,本发明的第一方面涉及一种液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含:
(i):强度为25IMCU/g所述组合物到30000IMCU/g所述组合物的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
(ii):浓度为1ppm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
(iii)浓度为1g/kg到350g/kg的盐;
且其中所述组合物的pH为2到8;
且其中所述聚合物是具有以下特征(a)、(b)和(c)的聚合物:
(a):所述聚合物是选自由以下各项组成的单体群组的至少一种单体的聚合物:环氧乙烷、乙烯聚吡咯烷酮、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯腈、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯;和
(b):所述聚合物是分子质量为200g/mol到50,000g/mol的聚合物;和
(c):所述聚合物是重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为n=5到n=1250的聚合物;和
(D):任选地,具有以上特征(a)、(b)和(c)的所述聚合物可以是经取代聚合物,所述经取代聚合物包含不同于特征(a)的单体的一种或多种取代基化合物,且如果所述聚合物是经取代聚合物,那么所述经取代聚合物的分子质量在特征(b)的范围,且所述一种或多种取代基化合物的分子质量小于所述经取代聚合物的聚合物部分的分子质量。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,在第一和/或方面的项目(i)中的术语“IMCU/g所述组合物”涉及每克所述组合物中的IMCU酶活性。
这对于与第一方面的项目(iii)有关的术语“g/kg”同样适用,即,其涉及每千克所述组合物中的盐克数。
优选地,第一方面的液态组合物的总重量为10g到10000kg。
如本领域技术人员在本篇上下文中已知的,重量为1kg的第一方面的本文中相关的液态组合物将大约具有1升的体积。
如上文所论述的,Brij35可被称为经取代聚氧乙烯,其中取代基可被视作本文图1中所示的“C12”结构,且Brij35具有约1225g/mol的平均分子质量。
因此,Brij35可被视为具有第一方面的任选特征(D)的经取代聚合物的一个实例,其中取代基化合物是如本文图1所示的“C12”结构,且所述经取代聚合物的分子质量是1225g/mol,且所述取代基化合物(“C12”结构)的分子质量显著小于聚合物部分(具有n=23的环氧乙烷聚合物)的分子质量。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,具有特征(a)、(b)和(c)的聚合物部分被认为是最重要的,而任选地特征(D)的可能的一种或多种取代基化合物则可被视为重要性次之。
如上文所论述的,图6中显示另一种本文中相关的聚合物聚山梨酸酯20的一个实例,其包含总计20个环氧乙烷单体。
和Brij35一样,聚山梨酸酯20(或者称为Tween20)在本篇上下文中被理解为经取代聚合物。在聚山梨酸酯20中,取代基化合物/基团是山梨聚糖和月桂酸酯基团,且所述取代基化合物的分子质量显著小于聚合物部分(即20个环氧乙烷单体)的分子质量。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,通用术语“聚合物”在聚合物可以经取代或未经取代的意义上涵盖更具体的术语“经取代聚合物”。
如上文所论述的,在US5139943中使用约4-5%w/volPEG8000以便能够获得液液(水性)两相系统,且在US7998705B2中使用约6%w/v的PEG以便得到在离子交换色谱树脂上显著增加的动态结合能力。
在第一方面的组合物中仅使用1ppm到10000ppmw/w(即0.0001%到1.0%w/w)的本文描述的聚合物(例如PEG),即,用量显著小于在以上论述的现有 技术参考文献中所需要的用量。
因此且不希望受限于理论,可以说与以上描述的现有技术中的用量相比,使乳凝固酶获得本文描述的增加的构象稳定性效果,需要使用显著更少用量的本文中相关聚合物(例如PEG)。
本文中相关聚合物(例如PEG)可以被描述为加工助剂。
本文中的第一方面涉及一种液态组合物,然而,凝乳性天冬氨酸蛋白酶(例如凝乳酶)也可作为干燥粒状的组合物/产品商业化。
因此,本发明的第二方面涉及一种干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含:
(i):强度为25IMCU/g所述组合物到30000IMCU/g所述组合物的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
(ii):浓度为1ppm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
(iii):盐;
且其中悬浮在水中的所述组合物的pH为2到8;
且其中所述聚合物是具有第一方面的特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
如上文所论述的,聚乙二醇化作用涉及聚乙二醇(PEG)结构与另一个更大分子(例如治疗蛋白质)共价偶联的行为(所述更大分子于是被称为经过聚乙二醇化)。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,本发明的本质不涉及聚乙二醇化作用。
因此且如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,本文中描述的液态和/或干燥的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物优选地不是这样一种组合物,其中聚合物与凝乳性天冬氨酸蛋白酶共价偶联。
如本文中所论述的,本文所描述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物的一个优点在于其在储存时更稳定。
因此,本发明的第三方面涉及一种用于储存凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(a):提供第一方面或第二方面或其任何本文中相关的实施方案的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物;和
(b):将所述组合物在-10℃到50℃的温度下储存90天到2000天的时期。
本文中描述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物可以根据本领域技术使用,例如用于制造目的食品或饲料产品(例如基于奶的目的产品,其例如可以是干酪产品)。
因此,本发明的第四方面涉及一种用于制造食品或饲料产品的方法,其包括将有效量的第一方面或第二方面或其任何本文中相关的实施方案中任一者的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物添加到一种或多种食物或饲料成分中,和执行进一步的制造步骤以获得食品或饲料产品。
如上文所论述的,通过使用本文中所描述的本文中相关聚合物,可以分离/纯化具有增加的比活性的凝乳性天冬氨酸蛋白酶样品。
因此,本发明的第五方面涉及一种用于从包含目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的水性介质中分离此类目的酶的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(i):获得由包括天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的水性样品;
(ii):将浓度为1ppm到10000ppm的聚合物添加到步骤(i)的水性样品中以得到含有聚合物的样品;以及
(iii):从步骤(ii)的含有聚合物的样品分离所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
其中所述聚合物是具有第一方面的特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
如上文所论述的,在US5139943中使用约4-5%w/volPEG8000以便能够获得液液(水性)两相系统,且在US7998705B2中使用约6%w/v的PEG以便得到在离子交换色谱树脂上显著增加的动态结合能力。
在第五方面的方法中,仅使用1ppm到10000ppmw/w(即0.0001%到1.0%)的本文描述的聚合物(例如PEG),即,用量显著小于在以上论述的现有技术参考文献中所需要的用量。
定义
本文中相关术语的所有定义都与本领域技术人员关于本文中的相关技术背景所理解的一致。
术语“乳凝固酶”是指具有乳凝固酶活性的酶,即活性的乳凝固酶。凝乳活性(C)可以用每毫升的国际凝乳单位(IMCU)或每克的IMCU表示。本领域技术人员知晓如何确定本文中相关的乳凝固酶活性。在本文中的工作实施例1中提供用于确定乳凝固酶活性和乳凝固酶比活性的标准方法的一个实例。如所属领域中已知的,凝固比活性(IMCU/mg总蛋白质)是通过用凝固活性(IMCU/ml)除以总蛋白质含量(mg总蛋白质/ml)来确定的。
术语“ppm”是指百万分率。如所属领域中已知的,单位“ppm”可用于质量分数,且术语ppm在本文中与质量分数(w/w)相关使用。举例来说,相对于例如本文中相关的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,例如浓度为500ppm(w/w)的本文中相关聚合物涉及所述聚合物在每克样品组合物中以百万分之一克的500倍存在,其相当于0.05%w/w。换句话说,1ppm(w/w)相当于0.0001%(w/w),而10000ppm(w/w)相当于1%(w/w)。
术语“序列同一性”涉及两个氨基酸序列之间的相关性。
对于本发明而言,两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度是根据本领域技术确定,并且优选地使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定,所述Needleman-Wunsch算法在优选3.0.0版本或更高版本的EMBOSS程序包的Needle程序中实施(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等人,2000,TrendsGenet.16:276-277)。使用的任选参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)被用作同一性百分比且如下计算:
(相同残基×100)/(比对长度–比对中的空位总数)。
术语“变异体”意思是在一个或多个(若干)位置处包括变化(即取代、插入和/或缺失)的具有乳凝固酶活性的肽。取代意思是用不同的氨基酸置换占据某个位置的氨基酸;缺失意思是去除占据某个位置的氨基酸;且插入意思是在占据某个位置的氨基酸邻近处添加1-3个氨基酸。
氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸,举例来说,用例如D-丙氨酸的例如特定D-异构体(或D-形式)进行取代在理论上是可行的。
以下仅以实例的方式描述了本发明的实施方案。
附图说明
图1:PEG和Brij35的结构。
图2:显示与未添加PEG8000或Brij35的对照实验相比,将0.1%PEG8000或Brij35添加到洗脱缓冲液中的结果。更多细节请参见例如本文中的工作实施例2。图2A显示骆驼凝乳酶的数据,且图2B显示牛凝乳酶的数据。
图3:说明酶的构象稳定性。
图4:来自于不同哺乳动物物种(奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼和猪)的本文中相关的不同凝乳性凝乳酶序列的比对。图4的所有序列都是公开可获得的。
图5:来自于不同哺乳动物或真菌物种的本文中相关的市售不同凝乳性天冬氨酸蛋白酶序列(骆驼凝乳酶、奶牛凝乳酶、奶牛胃蛋白酶、真菌毛霉胃蛋白酶和真菌内座壳属胃蛋白酶)的比对。图5的所有序列都是公开可获得的。
图6:另一种本文中相关的聚合物聚山梨酸酯20的结构,所述聚山梨酸酯20包含总计20个环氧乙烷单体。
具体实施方式
凝乳性天冬氨酸蛋白酶
以下本文中相关的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的具体实施方案/实例的论述对于本文中所论述的本发明的所有方面都是相关的。
在一个优选实施方案中,凝乳性天冬氨酸蛋白酶是选自由以下各项组成的群组的乳凝固酶:凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。
优选的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是在例如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中描述的单峰驼凝乳酶。其在本文中可被替代性地称为骆驼凝乳酶,并且在本文图5中显示公开已知的成熟多肽氨基酸序列。
如所属领域中已知的,对于本领域技术人员来说,制造目的酶的变异体(即氨基酸修饰)而不显著改变酶的特征是常规工作。
因此,在一个优选实施方案中,凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含如本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼(Cameliusdromedarius)凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
优选的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是牛凝乳酶。其在本文中可被替代性地称为奶牛凝乳酶,并且在本文图5中显示公开已知的成熟多肽氨基酸序列。
因此,在一个优选实施方案中,凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛凝乳酶(被称为“奶牛凝乳酶”)或牛凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
优选的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是牛胃蛋白酶。其在本文中可被替代性地称为奶牛胃蛋白酶,并且在本文图5中显示公开已知的成熟多肽氨基酸序列。
因此,在一个优选实施方案中,凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛胃蛋白酶(被称为“奶牛胃蛋白酶”)或牛胃蛋白酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛胃蛋白酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
优选的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是毛霉胃蛋白酶(参见例如EP0805866B1(Harboe等人,Chr.HansenA/S,丹麦))。本文图5中显示公开已知的成熟多肽氨基酸序列。
因此,在一个优选实施方案中,凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含如本文图5中所示的多肽氨基酸序列的毛霉胃蛋白酶(被称为“毛霉”)或毛霉胃蛋白酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的毛霉胃蛋白酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
优选的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是内座壳属胃蛋白酶。本文图5中显示公开已知的成熟多肽氨基酸序列。
因此,在一个优选实施方案中,凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的毛霉胃蛋白酶(被称为“内座壳属”)或内座壳属胃蛋白酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的内座壳属胃蛋白酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
聚合物
如上文所论述的,第一方面的液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物的聚合物、第二方面的干燥的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物的聚合物和/或第五方面的用于分离目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法的聚合物是具有以下特征(a)、(b)和(c)或任选地(D)的聚合物:
(a):所述聚合物是选自由以下各项组成的单体群组的至少一种单体的聚合物:环氧乙烷、乙烯聚吡咯烷酮、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯腈、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯;和
(b):所述聚合物是分子质量为200g/mol到50,000g/mol的聚合物;和
(c):所述聚合物是重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为n=5到n=1250的聚合物;和
(D):任选地,具有以上特征(a)、(b)和(c)的所述聚合物可以是经取代聚合物,所述经取代聚合物包含不同于特征(a)的单体的一种或多种取代基化合物,且如果所述聚合物是经取代聚合物,那么所述经取代聚合物的分子质量在特征(b)的范围,且所述一种或多种取代基化合物的分子质量小于所述经取代聚合物的聚合物部分的分子质量。
以下本文中相关的聚合物的具体实施方案/实例的论述对于本文中所论述的本发明的所有方面都是相关的。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,特征(a)的至少两种或更多种单体的聚合物在所属领域中可被称为杂聚物或共聚物,所述杂聚物或共聚物是衍生自两种(或更多种)单体物质的聚合物,与之相反的是均聚物,其中仅使用一种单体,即特征(a)的仅一种单体的聚合物在所属领域中可被称为均聚物。
就特征(a)来说,聚合物可优选是选自特征(a)群组的两种不同单体的聚合物。
优选地,聚合物是均聚物。
就任选特征(D)来说,一种或多种取代基化合物的分子质量优选以至少2倍低于经取代聚合物的聚合物部分的分子质量,更优选地取代基化合物的分子质量以至少4倍低于经取代聚合物的聚合物部分的分子质量。
本文中优选的经取代聚合物是Brij35,其具有如本文图1中所示的结构。
取代基化合物可以例如是C1-C25烷基(例如C1-C25经取代烷基)、C1-C25烯基(例如C1-C25经取代烯基),其中烷基和/或烯基可以例如是直链、环状或支链的。
如所属领域中已知的,聚合物可以例如也包含Cl、Br和类似的取代基化合物,即,例如Cl、Br也可以是本文中的取代基化合物的实例。
优选地,聚合物是分子质量为750g/mol到30,000g/mol的聚合物,例如分子质量为2000g/mol到20,000g/mol的聚合物,或例如分子质量为5000g/mol到15,000g/mol的聚合物。
如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,优选的分子质量可能取决于聚合物的具体类型和其是否是经取代聚合物(例如,类似于Brij35)。
优选地,聚合物是重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为n=20到n=500的聚合物,例如重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为n=100到n=300的聚合物。
和分子质量一样且如本领域技术人员在本篇上下文中所理解的,优选的“n”数值可能取决于聚合物的具体类型和其是否是经取代聚合物(例如,类似于Brij35)。
在本篇上下文中,对于本领域技术人员来说,确定特定的本文中相关的目的聚合物的最佳分子质量和/或“n”数值以便获得与例如特定的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶(例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶)有关的本文中所描述的稳定性提高,可被视为常规工作。
优选地,聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚山梨酸酯或Brij35。
当聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯时,聚合物优选地是分子质量为1500g/mol到40000g/mol的聚合物,例如分子质量为2000g/mol到30000g/mol的聚合物,或例如分子质量为5000g/mol到15000g/mol的聚合物。
优选地,聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚山梨酸酯20或Brij35。
就PEG来说,聚合物优选地是分子质量为1500g/mol到40000g/mol的聚合物,例如分子质量为2000g/mol到30000g/mol的聚合物,或更优选地分子质量为5000g/mol到15000g/mol的聚合物。
第一方面和/或第二方面-液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物和/或干燥的凝
乳性天冬氨酸蛋白酶组合物
如上文所论述的,本发明的第一方面涉及一种液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含:
(i):强度为25IMCU/g所述组合物到30000IMCU/g所述组合物的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
(ii):浓度为1ppm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
(iii)浓度为1g/kg到350g/kg的盐;
且其中所述组合物的pH为2到8;
且其中所述聚合物是具有[如本文中所描述的]以下特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
如上文所论述的,本发明的第二方面涉及一种干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含:
(i):强度为25IMCU/g所述组合物到30000IMCU/g所述组合物的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
(ii):浓度为1ppm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
(iii):盐;
且其中悬浮在水中的所述组合物的pH为2到8;
且其中所述聚合物是具有[如本文中所描述的]特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
对于液态组合物和干燥组合物两者,上文描述了凝乳性天冬氨酸蛋白酶的优选实例/实施方案。
对于液态组合物和干燥组合物两者,上文描述了聚合物的优选实例/实施方案。
对于液态组合物和干燥组合物两者,项目(i)中的酶强度优选地是100IMCU/g组合物到10000IMCU/g组合物的强度,更优选地500IMCU/g组合物到6000IMCU/g组合物的强度。
对于液态组合物和干燥组合物两者,项目(ii)中的聚合物浓度优选地为1ppm到5000ppm(w/w)的浓度。
对于液态组合物和干燥组合物两者,项目(ii)中的聚合物浓度优选地为1ppm到3000ppm(w/w)的浓度。
对于液态组合物和干燥组合物两者,项目(ii)中的聚合物浓度优选地为10ppm到5000ppm(w/w)的浓度,更优选地为50ppm到4000ppm(w/w)的浓度,且甚至更优选地为100ppm到3000ppm(w/w)的浓度。
可相关的是项目(ii)中的聚合物浓度为160ppm到5000ppm(w/w),例如175ppm到4000ppm(w/w)的浓度。
可相关的是项目(ii)中的聚合物浓度为5ppm到145ppm(w/w),例如10ppm到130ppm(w/w)的浓度。
对于液态组合物,项目(iii)中的盐优选地处于10g/kg到300g/kg的浓度,更优选地处于25g/kg到250g/kg的浓度。
如本领域技术人员已知的,对于干燥组合物,项目(iii)中的盐浓度可以相对较高,例如50%(w/w)到99.9%(w/w)或例如80%(w/w)到99%(w/w)。
对于液态组合物和干燥组合物两者,盐优选地是无机盐,优选地其中无机盐选自由NaCl、KCl、Na2SO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4或NaH2PO4或其组合组成的群组。
最优选地,盐是NaCl。
液态组合物和干燥组合物两者都可以包含其它添加剂/化合物,例如防腐剂。
如本领域技术人员已知的,防腐剂通常可以按足以防止产品保存期限期间的微生物生长的浓度添加。
防腐剂的实例可以是例如弱有机酸,例如甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、苯甲酸盐、山梨酸盐或富马酸盐。对羟基苯甲酸酯(对羟基苯酸盐的烷基酯)也可用作防腐剂。甘油或丙二醇也已被描述成防腐剂。
对于液态组合物和干燥组合物两者,优选地pH为3到7,更优选地pH为4到6.5,且甚至更优选地pH为5到6。
优选地,液态组合物是水性组合物,例如水溶液。如本文中所使用,水性组合物或水溶液涵盖任何包含水的组合物或溶液,例如至少20wt%的水,例如至少40wt%的水。优选地,根据本发明的组合物包含至少50wt%、60wt%、70wt%或80wt%的水。更优选地,本发明的组合物包含至少85wt%、90wt%或95wt%的水。
如本文的工作实施例2中所论述且可在本文图2中见到,通过使用如本文中所述的聚合物,可以获得具有显著增加的酶比活性的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物。
在本文图2A中可见到,通过使用如本文中所述的聚合物,可以获得骆驼酶组合物,其中酶的比活性高于350IMCU/mg总蛋白质,且在比较实验(即不添加聚合物)中,酶的比活性仅为约200IMCU/mg总蛋白质。
在本文图2B中可见到,通过使用如本文中所述的聚合物,可以获得牛酶组合物,其中酶的比活性高于150IMCU/mg总蛋白质,且在比较实验(即不添加聚合物)中,酶的比活性仅为约125IMCU/mg总蛋白质。
因此,在一个优选实施方案中,对于液态组合物和干燥组合物两者,
-凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于300IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于350IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或
-凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于150IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于165IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛凝乳酶(被称为“奶牛凝乳酶”)或牛凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
优选地,如本文中所述的液态组合物的总重量为10g到10000kg,例如100g到3000kg。
优选地,如本文中所述的干燥粒状组合物的总重量为0.25g到200kg,例如0.5g到50kg。
优选地,所述组合物是如本文中所述的液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物。
第三方面-储存方法
如上文所论述的,本发明的第三方面涉及一种用于储存凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(a):提供第一方面或第二方面或其任何本文中相关的实施方案的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物;和
(b):将所述组合物在-10℃到50℃的温度下储存90天到2000天的时期。
优选地,步骤(b)中的储存温度为4℃到38℃的温度。
优选地,步骤(b)的储存期为180天到500天的时期。
第四方面-用于制造食品或饲料产品的方法
如上文所论述的,如本文中所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物可以根据本领域技术使用,例如用于制造基于奶的目的产品(例如干酪产品)。
如上文所论述的,本发明的第四方面涉及一种用于制造食品或饲料产品的方法,其包括将有效量的第一方面或第二方面或其任何本文中相关的实施方案中任一者的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物添加到一种或多种食物或饲料成分中,和执行进一步的制造步骤以获得食品或饲料产品。
优选地,食品或饲料产品是基于奶的产品,且其中所述方法包括将有效量的如本文中所述的分离的凝乳酶多肽变异体添加到奶中,和执行进一步的制造步骤以获得基于奶的产品。
所述奶可以例如是绵羊奶、山羊奶、水牛奶、牦牛奶、美洲驼(lama)奶、骆驼奶或奶牛奶。
所述基于奶的产品可以例如是发酵奶产品、夸克奶酪或干酪。
可优选地,第四方面或其本文中的相关实施方案的用于制造食品或饲料产品的方法是这样一种方法,其中已经根据第三方面的用于储存凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法首先储存了凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,且随后根据第四方面的用于制造食品或饲料产品的方法将所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物添加到一种或多种食物或饲料成分中。
第五方面-用于分离凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法
如上文所论述的,本发明的第五方面涉及一种用于从包含目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的水性介质中分离此类目的酶的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(i):获得由包括所述天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的水性样品;
(ii):将浓度为1ppm到10000ppm的聚合物添加到步骤(i)的水性样品中以得到含有聚合物的样品;以及
(iii):从步骤(ii)的含有聚合物的样品分离所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
其中所述聚合物是具有第一方面的特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
对于第五方面的方法,上文描述了凝乳性天冬氨酸蛋白酶的优选实例/实施方案。
对于第五方面的方法,上文描述了聚合物的优选实例/实施方案。
优选地,聚合物在步骤(ii)中以10ppm到5000ppm(w/w)的聚合物浓度,更优选地100ppm到4000ppm(w/w)的浓度,且甚至更优选地300ppm到3000ppm(w/w)的浓度添加。
步骤(iii)中的术语“分离”应理解成本领域技术人员在本篇上下文中所理解的那样,即,与步骤(i)的由包括天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的水性样品相比,步骤(iii)中获得的分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的分离程度更高(即纯度更高)。
举例来说,在步骤(iii)中获得的分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的纯度可以例如是总蛋白质的至少60%w/w(即分离的组合物中的总蛋白质的60%w/w是分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶)。其甚至还可以更加被纯化,即总蛋白质的至少90%w/w。
优选地,聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或Brij35。
当聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯时,聚合物优选地是分子质量为1500g/mol到40000g/mol的聚合物,例如分子质量为2000g/mol到30000g/mol的聚合物,或例如分子质量为5000g/mol到15000g/mol的聚合物。
优选地,聚合物是聚乙二醇(PEG)或Brij35。
就PEG来说,聚合物可优选地是分子质量为1500g/mol到40000g/mol的聚合物,例如分子质量为2000g/mol到30000g/mol的聚合物,或更优选地分子质量为5000g/mol到15000g/mol的聚合物。
在一个优选实施方案中,在步骤(iii)中分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是这样一种酶,其中:
-所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于300IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于350IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或
-所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于150IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于165IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛凝乳酶(被称为“奶牛凝乳酶”)或牛凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
步骤(i)的由包括天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的水性样品可以通过在生产宿主细胞(例如真核生产宿主细胞)中重组生产凝乳性天冬氨酸蛋白酶来获得。
如所属领域中已知的,在例如目的酶的进一步下游纯化之前,人们通常去除/分离发酵基质中的生产宿主细胞和其它不想要的物质(通过例如离心和/或过滤),即,为了得到包含目的酶但不含过多不想要的组分(例如生产宿主细胞)的样品。如所属领域中已知的,这有时候可被称为未纯化的第一滤液,此术语可在本文中使用并且其可以是步骤(i)的由包括天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的本文中相关水性样品的一个实例。
WO02/36752A2(Chr.Hansen)描述一种使用曲霉(Aspergillus)细胞(优选地黑曲霉(Aspergillusniger))作为生产宿主细胞来生产单峰驼凝乳酶(骆驼凝乳酶)的重组方法。
因此,优选地,重组生产宿主细胞是曲霉细胞(优选地黑曲霉)。
来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的毛霉胃蛋白酶可以优选地通过使用米黑根毛霉作为生产宿主细胞来生产。
优选地,第五方面的方法涉及一种方法,条件是所述方法不是这样一种方法,其中将PEG和无机盐添加到步骤(i)的水性样品中以便形成液液(水性)两相系统,然后从PEG相回收/分离天冬氨酸蛋白酶。
如上文所论述的,US5139943描述一种可视为基于使用此类液液(水性)两相系统的方法。
在一个优选实施方案中,第五方面的方法是这样一种方法,其中分离步骤(iii)包括以下步骤:
(A):将步骤(ii)的含有聚合物的样品施加到固相上,所述固相包含固体底基质,所述固体底基质含有包含疏水部分的配体,以便使目的天冬氨酸蛋白酶被吸附到所述配体上;和
(B):从所述固相上洗脱所述目的天冬氨酸蛋白酶以便回收所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得经过纯化的分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶。
在一个优选实施方案中,第五方面的方法是这样一种方法,其中第一方面的步骤(i)到(iii)包括:
(i):将第五方面的步骤(i)的由包括天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的水性样品施加到固相上,所述固相包含固体底基质,所述固体底基质含有包含疏水部分的配体,以便使目的天冬氨酸蛋白酶被吸附到所述配体上;
(ii):第五方面的步骤(ii)中的聚合物的添加是添加到洗脱缓冲液中;以及
(iii):第五方面的分离步骤(iii)包括从所述固相上洗脱目的天冬氨酸蛋白酶以便回收所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得经过纯化的分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶。
以上的两个优选实施方案可被视为涉及色谱(例如柱色谱)分离程序。因为此种色谱法对于本领域技术人员是众所周知的,所以无需在本文中详细地描述色谱程序本身。
术语“固体底基质”是指固体骨架材料,其含有允许配体共价连接到所述骨架材料上的反应性官能性。此术语在本文中也被称为固体载体基质。
如所属领域中已知的,骨架材料可以是无机的,例如硅石,或有机的。作为实例,本文中有用的有机骨架材料包括纤维素和其衍生物、琼脂糖、右旋糖酐、聚合物(例如聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、共聚物)。
如所属领域中已知的,固体底基质的一个实例可以是所谓的树脂,如所属领域中已知的,此术语可以关于离子交换色谱(IEC)使用。
如所属领域中已知的,固体底基质可以优选地是粒子,例如固体底基质可以包括粒度小于750μm的粒子或粒度小于100μm的粒子。
固体载体基质的允许配体基团共价连接的反应性官能团在所属领域中是众所周知的,并且包括例如羟基、羧基、巯基(thiol)和氨基。
如本文中所使用,术语“配体”是指疏水部分(或者称为基团)和用于将配体共价连接到固体底基质上的间隔臂。间隔臂可以是能够将所选基团/部分共价连接到固体底基质上的任何基团或取代基。此类间隔臂在所属领域中是众所周知的,并且包括例如亚烷基、芳族基、烷基芳族基、酰胺基、氨基、脲基、氨基甲酸酯基。
包含目的酶的水性负载介质与本文中所述的配体在允许目的酶结合/吸附到配体的条件下接触。本领域技术人员知晓如何调节条件(例如,调节pH例如在3-10的范围,包括4-8的范围,和/或调节流动速率)以便使目的酶被恰当吸附到目的配体上。
因此,此步骤是本领域技术人员所执行的常规步骤,并且本领域技术人员知晓许多不同的本文中相关配体(参见例如综述文章:Yang等人,JournalofChromatographyA,1218(2011)8813-8825)。
本领域技术人员知晓许多本文中相关的纯化/分离技术,其中例如通过使用选自由色谱法、柱色谱、床吸附、膨胀床吸附(EBA)、成批吸附、膜吸附和离子交换色谱(IEC)组成的群组的至少一种纯化技术,将包含目的酶的本文中相关介质施加到固相上,所述固相包含固体底基质,所述固体底基质含有本文中相关配体,以便使目的酶被吸附到配体上。
使用膨胀床吸附(EBA)纯化技术在本文中可能是优选的。
所有这些纯化技术对于本领域技术人员都是非常熟知的,因此对于本领域技术人员来说,恰当地将目的酶结合到具体的适合的所用配体上和恰当地执行洗脱步骤从而获得纯化/分离的目的酶是常规工作。
换句话说,对于本领域技术人员来说,确定合适溶剂、缓冲液等以便使目的酶恰当吸附到配体上和恰当洗脱目的酶从而获得纯化/分离的目的酶是常规工作。
因此,不认为在本文中非常详细地描述这些步骤是有必要的。
如所属领域中已知的,术语“色谱”涉及一种物理分离方法,其中欲分离的组分分布在两相之间,一个相被称为固定的(固定相),而另一个相(流动相)以一定方向移动。
如所属领域中已知的,术语“柱色谱”涉及一种分离技术,其中固定床处于管内。
如所属领域中已知的,术语“膨胀床吸附(EBA)”涉及一种使得粘性液体和微粒液体的加工成为可能的制备色谱技术。
EBA中的蛋白质结合原则与经典柱色谱相同,并且可以使用普通离子交换、疏水性相互作用和亲和色谱配体。当经典柱色谱使用由填充床制造的固相时,EBA使用流化态的粒子。EBA树脂含有不同尺寸和密度的粒子,在膨胀时产生粒度的梯度,并且当床处于其膨胀状态时,形成局部回路。例如完整细胞或细胞碎片等粒子可能堵塞填充床柱,但是容易通过流化床。因此可以对破裂细胞的粗制培养肉汤或浆料使用EBA,从而避免当使用填充床时可能需要的例如离心和过滤等初始清理步骤。
术语“床吸附”、“成批吸附”和“膜吸附”在本篇上下文中都是由本领域技术人员熟知且清楚了解的。
如所属领域中已知的,配体的疏水部分可以例如是脂族基或芳族基。
脂族基可以例如是具有不同长度的烷基,例如C2到C40烷基或C4到C30烷基;
具有不同长度的烯基,例如C2到C40烯基或C4到C30烯基;或例如
具有不同长度的炔基,例如C2到C40炔基或C4到C40炔基。
芳族基可以例如是苯基或苄基。
在一个优选实施方案中,配体的疏水部分是苄基。
在本文中的一个优选实施方案中,配体还包含正电性部分,即配体包含疏水部分和正电性部分。
如所属领域中已知的,配体的正电性部分可以例如是氨基或例如季铵基。
优选地,疏水部分是苄基,并且正电性部分是氨基,即配体是苄胺。
实施例
实施例1:凝乳比活性的测定
4.1凝固活性的测定
使用REMCAT方法测定凝乳活性,REMCAT方法是由国际乳业联盟开发的标准方法(IDF方法)。
凝乳活性是利用每升0.5g的氯化钠溶液(pH≈6.5)从低热低脂奶粉制备的标准奶底物发生可见絮凝所需要的时间测定的。将乳凝固酶样品的凝固时间与具有已知凝乳活性且基于IDF标准110B与所述样品具有相同酶组成的参考标准物相比较。样品和参考标准物在相同的化学和物理条件下测量。使用84mM乙酸pH5.5缓冲液将变异体样品调节到大约3IMCU/ml。此后,将200μl酶添加到放置在水浴中的玻璃试管中的10ml预加热奶(32℃)中,所述水浴能够维持恒定搅拌下32℃±1℃的恒定温度。
根据以下公式,相对于与样品具有相同酶组成的标准物,以每ml的国际凝乳单位(IMCU)计算乳凝固酶的总凝乳活性(强度):
S标准:粗制凝乳酶的国际参考标准物的凝乳活性。
T标准:对于标准稀释液获得的以秒计的凝固时间。
D样品:样品的稀释系数。
D标准:标准物的稀释系数。
T样品:从添加酶到絮凝时为止,对于被稀释粗制凝乳酶样品获得的以秒计的凝固时间
4.2总蛋白质含量的测定
遵照制造商的说明书,使用购自于ThermoScientific的PierceBCA蛋白质分析试剂盒测定总蛋白质含量。
4.3凝固比活性的计算
通过用凝固活性(IMCU/ml)除以总蛋白质含量(mg总蛋白质/ml)来确定凝固比活性(IMCU/mg总蛋白质)。
实施例2:将PEG或Brij-35添加到洗脱缓冲液中
牛凝乳酶或骆驼凝乳酶在黑曲霉中重组表达(大致如WO02/36752A2中所述)。
通过固相提取方法,利用共价结合于琼脂糖的苄胺配体(类似于WO01/58924A2中所述的苄胺配体)纯化酶。
用购自于UpfrontChromatography,丹麦的Fastline1300装填配备有25μmPE滤器和2ml孔体积的96孔滤板。
用树脂装填孔以得到所有孔中6-8mm的床高度。用5ml的20mM丙二酸钠pH5.7平衡所有孔中的树脂。
通过混合3ml上清液与0.5ml2M丙二酸钠pH5.7来调节来自于培养的上清液。然后通过8μm滤器过滤3.5ml样品以去除粒子,并将样品装载到平板的96个单独孔中。装载之后,用5ml的20mM丙二酸盐、500mMNaCl缓冲液pH5.7洗涤树脂,并使得运行至树脂几乎干燥。用20mM丙二酸pH2.5、100mMNaCl、5%甘油的500μl等分试样洗脱树脂,并收集在小瓶中。
在一些实验中,将PEG-8000或Brij-35添加到洗脱缓冲液中,达到0.05-0.25w/w%的最终浓度。
在其它实验中,在酶结合于树脂之前,将PEG-8000或Brij-35添加到样品中,达到0.05-0.25w/w%的最终浓度。
在对照实验中,没有添加PEG-8000或Brij-35。
收集后,立即将1.5M丙二酸二钠添加到洗出液中以将pH调节到5.4-5.8。
在分离后1天内,分析样品的蛋白质浓度和凝乳活性。
使用购自于ThermoScientific的PierceBCA蛋白质分析试剂盒分析所收集级分中的蛋白质浓度。
结果:
图2显示与未添加PEG8000或Brij35的对照实验相比,将0.1%PEG8000或Brij35添加到洗脱缓冲液中的结果。
如图2中可看出,与未添加PEG/Brij35的情况下纯化的对照样品相比,含 有PEG8000或Brij35的样品具有两倍的增加的比活性。
在其中酶结合于树脂之前将PEG-8000或Brij-35添加到样品中的实验中获得类似的阳性结果。
类似于图2,通过添加0.05w/w%PEG-8000或Brij-35或通过添加0.25w/w%PEG-8000或Brij-35也获得了阳性结果。
结论:
结果证实,与未添加PEG/Brij35的情况下纯化的对照样品相比,在添加 PEG8000或Brij35的情况下纯化的样品具有两倍的增加的比活性。
认为洗出液/样品含有PEG8000/Brij35。
实施例3:将PEG添加到制剂中(在纯化后)
获得液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含强度为约1100IMCU/g的凝乳性天冬氨酸蛋白酶。
针对牛凝乳酶、骆驼凝乳酶和毛霉胃蛋白酶获得组合物(即3种不同的组合物)。
向每一种组合物中添加PEG8000,达到0.015%w/w(150ppmw/w)的含量。
对照组合物是未添加PEG8000情况下的组合物。
将组合物在5℃和37℃储存6个月,并定期分析凝乳活性。
结果证实了,在被测试的液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物储存6个月后, 添加PEG增加了长期储存稳定性——即这些组合物具有更高的IMCU/g活性。
实施例4:将PEG或聚山梨酸酯20添加到制剂中(在纯化后)
使工业酶的液态制剂经受来自于单元操作例如泵吸、搅拌和膜过滤的物理力。在运输期间,部分填充的液态制剂的晃动也会产生物理力。剪应力和酶对于水-空气界面的暴露增加可以诱导变性和伴随的酶活性损失。
可以通过在具有高的液面上空间比样品体积比率的试管中反复振荡样品来测试酶或蛋白质样品的物理稳定性。通过在旋转装置中将填充入10ml管中的2ml样品翻转1小时来研究不同的天冬氨酸蛋白酶对于振荡的稳定性。对于每一溶液,在竖直翻转1小时后测量相对凝乳活性,并与具有完全相同组成的未翻转对照物进行对比。结果表示为“保留活性”,其是通过用翻转样品的活性除以未翻转对照样品的活性来获得的。
结果:
发现以0.015%(150ppm)的浓度添加的PEG8000针对所有被测试天冬氨酸蛋白酶的振荡都具有显著的保护效果(表x)。对于牛凝乳酶和骆驼凝乳酶,PEG800的保护效果是最显著的,在未添加PEG8000的情况下,这两种酶的活性损失分别是11%和35%。当PEG8000添加到牛凝乳酶和骆驼凝乳酶样品中时,在振荡样品后没有活性损失。在不含PEG的骆驼凝乳酶样品中,在振荡后观察到白色沉淀。在添加有PEG的骆驼凝乳酶样品中,在振荡后没有沉淀。这表示活性损失是因为变性后的蛋白质聚集,而不是因为酶被表面吸附到试管表面上。对于毛霉胃蛋白酶,在物理稳定性上存在弱的保护效果。
将PEG8000对于骆驼凝乳酶的振荡稳定性的影响与表面活性剂大豆卵磷脂、聚山梨酸酯20和单硬脂酸甘油酯比较。从表y可以看到,聚山梨酸酯20的效果与PEG8000的效果类似。添加有大豆卵磷脂或单硬脂酸甘油酯的骆驼凝乳酶样品中的保留活性与未处理的对照样品(无添加)类似。这表示在此实施例中看到的针对振荡的稳定效果不是因为表面活性剂防止了表面吸附,而是因为与PEG8000和聚山梨酸酯20中所含的聚氧乙烯结构单元有关的一种特征。
表x:经历振荡的天冬氨酸蛋白酶样品的保留活性
表y:经历振荡的骆驼凝乳酶样品的保留活性
化合物 | 保留活性 |
无添加 | 76(7)% |
PEG(0.015%) | 98(1)% |
大豆卵磷脂(0.015%) | 73(0)% |
大豆卵磷脂(0.075%) | 69(2)% |
聚山梨酸酯20(0.015%) | 100(0)% |
聚山梨酸酯20(0.075%) | 100(1)% |
单硬脂酸甘油酯(0.015%) | 75(3)% |
单硬脂酸甘油酯(0.075%) | 71(3)% |
结论:
结果证明,PEG8000对天冬氨酸蛋白酶针对由振荡液态样品所产生的物理力具有稳定效果。此外,显示含有聚氧乙烯结构单元的其它化合物例如聚山梨酸酯20具有类似的稳定效果。
参考文献
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4:US7998705B2(Fujifilm,2011年8月16日公开)
5:US2011/0008846A1(Qiagen)
Claims (19)
1.一种液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含:
(i):强度为25IMCU/g所述组合物到30000IMCU/g所述组合物的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
(ii):浓度为1ppm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
(iii)浓度为1g/kg到350g/kg的盐;
且其中所述组合物的pH为2到8;
且其中所述聚合物是具有以下特征(a)、(b)和(c)的聚合物:
(a):所述聚合物是选自由以下各项组成的单体群组的至少一种单体的聚合物:环氧乙烷、乙烯聚吡咯烷酮、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯腈、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯;和
(b):所述聚合物是分子质量为200g/mol到50000g/mol的聚合物;和
(c):所述聚合物是重复单体/单元数(所谓的“n”数值)为n=5到n=1250的聚合物;和
(D):任选地,具有以上特征(a)、(b)和(c)的所述聚合物可以是经取代聚合物,所述经取代聚合物包含不同于特征(a)的单体的一种或多种取代基化合物,且如果所述聚合物是经取代聚合物,那么所述经取代聚合物的分子质量在特征(b)的范围,且所述一种或多种取代基化合物的分子质量小于所述经取代聚合物的聚合物部分的分子质量。
2.根据权利要求1所述的液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其中项目(ii)中的聚合物浓度为1ppm到5000ppm(w/w)的浓度。
3.根据权利要求2所述的液态凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其中项目(ii)中的聚合物浓度为1ppm到3000ppm(w/w)的浓度。
4.一种干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其包含:
(i):强度为25IMCU/g所述组合物到30000IMCU/g所述组合物的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
(ii):浓度为1ppm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
(iii):盐;
且其中悬浮在水中的所述组合物的pH为2到8;
且其中所述聚合物是具有权利要求1的特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
5.根据权利要求4所述的干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其中项目(ii)中的聚合物浓度为1ppm到5000ppm(w/w)的浓度。
6.根据权利要求5所述的干燥粒状的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,其中项目(ii)中的聚合物浓度为1ppm到3000ppm(w/w)的浓度。
7.一种储存凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(a):提供根据权利要求1到6中任一项所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物;和
(b):将所述组合物在-10℃到50℃的温度下储存90天到2000天的时期。
8.一种制造食品或饲料产品的方法,其包括将有效量的根据权利要求1到6中任一项所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物添加到一种或多种食物或饲料成分中,和执行进一步的制造步骤以获得所述食品或饲料产品,并且
其中所述产品是基于奶的产品,且其中所述方法包括将有效量的根据权利要求1到6中任一项所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物添加到奶中,和执行进一步的制造步骤以获得所述基于奶的产品;并且
其中所述奶是绵羊奶、山羊奶、水牛奶、牦牛奶、美洲驼奶、骆驼奶或奶牛奶;并且
其中所述基于奶的产品是发酵奶产品、夸克奶酪或干酪。
9.根据权利要求8所述的方法,其中凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物已经根据权利要求7所述的储存凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法被首先储存,且之后被添加到根据权利要求8的一种或多种食物或饲料成分中。
10.一种用于从包含目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的水性介质中分离此类目的酶的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(i):获得由包括所述天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的水性样品;
(ii):将浓度为1ppm到10000ppm的聚合物添加到步骤(i)的水性样品中以得到含有聚合物的样品;以及
(iii):从步骤(ii)的含有聚合物的样品分离所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶;
其中所述聚合物是具有权利要求1的特征(a)、(b)和(c)以及任选地(D)的聚合物。
11.根据权利要求10所述的方法,条件是所述方法不是这样一种方法,其中将PEG和无机盐添加到步骤(i)的水性样品中以便形成液液(水性)两相系统,然后从PEG相回收/分离所述天冬氨酸蛋白酶。
12.根据权利要求10所述的方法,其中所述分离步骤(iii)包括以下步骤:
(A):将步骤(ii)的含有聚合物的样品施加到固相上,所述固相包含固体底基质,所述固体底基质含有包含疏水部分的配体,以便使所述目的天冬氨酸蛋白酶被吸附到所述配体上;和
(B):从所述固相上洗脱所述目的天冬氨酸蛋白酶以便回收所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得经过纯化的分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶。
13.根据权利要求10所述的方法,其中权利要求10的步骤(i)到(iii)包括:
(i):将权利要求10的步骤(i)的由包括所述天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的所述水性样品施加到固相上,所述固相包含固体底基质,所述固体底基质含有包含疏水部分的配体,以便使所述目的天冬氨酸蛋白酶被吸附到所述配体上;
(ii):权利要求10的步骤(ii)中的所述聚合物的添加是添加到洗脱缓冲液中;以及
(iii):权利要求10的分离步骤(iii)包括从所述固相上洗脱所述目的天冬氨酸蛋白酶以便回收所述天冬氨酸蛋白酶,从而获得经过纯化的分离的目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶。
14.根据权利要求1到6中任一项所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物或根据权利要求10到13中任一项所述的用于分离凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,
其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼(Cameliusdromedarius)凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或
其中凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛胃蛋白酶(被称为“奶牛胃蛋白酶”)或牛胃蛋白酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛胃蛋白酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
15.根据权利要求1到6中任一项或权利要求14所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物或根据权利要求10到14中任一项所述的用于分离凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚山梨酸酯或Brij35。
16.根据权利要求15所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物或根据权利要求15所述的用于分离凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚山梨酸酯20或Brij35,且其中PEG的分子质量为5000g/mol到15000g/mol。
17.根据权利要求1到6中任一项或权利要求14到16中任一项所述的凝乳性天冬氨酸蛋白酶组合物,
其中项目(i)中的酶强度为100IMCU/g所述组合物到10000IMCU/g所述组合物的强度;并且
其中项目(ii)中的聚合物浓度为100ppm到3000ppm(w/w)的浓度;并且
其中所述盐选自NaCl、KCl、Na2SO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4或NaH2PO4或其组合的群组;和
-其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于300IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或
-其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于150IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛凝乳酶(被称为“奶牛凝乳酶”)或牛凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;并且
其中如果所述组合物是液态组合物,那么所述液态组合物的总重量为10g到10000kg;并且
其中如果所述组合物是干燥粒状的组合物,那么所述干燥粒状的组合物的总重量为0.5g到50kg。
18.根据权利要求10到16中任一项所述的用于分离凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,
其中所述聚合物在步骤(ii)中以100ppm到4000ppm(w/w)的聚合物浓度被添加;并且
其中在步骤(iii)中获得的分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的纯度为总蛋白质的至少60%w/w(即分离的组合物中的总蛋白质的60%w/w是分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶);并且
其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或Brij35;并且
其中当所述聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯时,所述聚合物是分子质量为2000g/mol到30000g/mol的聚合物;并且
其中在步骤(iii)中分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是这样一种酶,其中:
-所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于300IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于350IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或
-所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于150IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于165IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛凝乳酶(被称为“奶牛凝乳酶”)或牛凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;并且
其中步骤(i)的由包括所述天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的所述水性样品是通过在生产宿主细胞(例如真核生产宿主细胞,例如曲霉(Aspergillus)细胞)中重组生产所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶来获得的;并且
其中所述用于分离目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法是通过利用选自由以下各项组成的群组的至少一种纯化技术来执行的:色谱法、柱色谱、床吸附、膨胀床吸附(EBA)、成批吸附、膜吸附和离子交换色谱(IEC)。
19.根据权利要求12到16中任一项或权利要求18所述的用于分离凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法,
其中所述聚合物在步骤(ii)中以100ppm到4000ppm(w/w)的聚合物浓度被添加;并且
其中在步骤(iii)中获得的分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的纯度为总蛋白质的至少60%w/w(即分离的组合物中的总蛋白质的60%w/w是分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶);并且
其中所述聚合物是分子质量为5000g/mol到15000g/mol的聚乙二醇(PEG),或Brij35;并且
其中在步骤(iii)中分离的凝乳性天冬氨酸蛋白酶是这样一种酶,其中:
-所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于300IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于350IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或
-所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于150IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,更优选地凝乳性天冬氨酸蛋白酶的比活性高于165IMCU/mg总凝乳性天冬氨酸蛋白酶蛋白,其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛凝乳酶(被称为“奶牛凝乳酶”)或牛凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;并且
其中步骤(i)的由包括所述天冬氨酸蛋白酶的许多组分组成的所述水性样品是通过在生产宿主细胞(例如真核生产宿主细胞,例如曲霉细胞)中重组生产所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶来获得的;并且
其中所述用于分离目的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的方法是通过利用选自由以下各项组成的群组的至少一种纯化技术来执行的:色谱法、柱色谱、床吸附、膨胀床吸附(EBA)、成批吸附、膜吸附和离子交换色谱(IEC);并且
其中所述配体的所述疏水部分是苄基;并且
其中所述凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的单峰驼凝乳酶(被称为“骆驼凝乳酶”)或单峰驼凝乳酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的骆驼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列;或其中凝乳性天冬氨酸蛋白酶是包含本文图5中所示的多肽氨基酸序列的牛胃蛋白酶(被称为“奶牛胃蛋白酶”)或牛胃蛋白酶的变异体,其中所述变异体包含与本文图5中所示的牛胃蛋白酶多肽氨基酸序列具有至少90%(优选地至少95%,更优选地至少99%)序列同一性的多肽序列。
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