CN102159598A - 酶催化的聚丙烯酸酯水解方法和用于此的酯酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法。根据所述方法，提供至少一种聚丙烯酸酯，与选自作用于酯键的酶(EC 3.1)的至少一种酶一起温育，直至聚丙烯酸酯中含有的酯基团部分或完全水解断裂，和任选地分离由此获得的经修饰的聚合物。本发明还涉及所使用的酶及其突变体，编码酶的核酸，包括核酸的载体，包括载体的微生物，以及酶、载体或微生物用于执行酶催化的聚丙烯酸酯水解方法的用途。本申请还涉及可以通过该方法获得的聚合物反应产物，和用于生产酯酶的方法。

Description

酶催化的聚丙烯酸酯水解方法和用于此的酯酶

技术领域

本发明涉及用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法，所使用的酶及其突变体，编码酶的核酸，包括核酸的载体，包括载体的微生物，酶、载体或微生物用于执行酶催化的聚丙烯酸酯水解方法的用途。本申请进一步涉及可通过该方法获得的聚合物反应产物和用于生产酯酶的方法。

现有技术

聚丙烯酸酯(polyacrylic acid esters，polyacrylates)是具有众多用途的化合物。对于来自均聚物的聚丙烯酸酯，可能的用途是相当有限的，而在来自共聚物的聚丙烯酸酯的情况下，通过选择待使用的共聚单体(例如甲基丙烯酸酯、苯乙烯、丙烯腈、乙酸乙烯酯、氯乙烯、二氯乙烯和丁二烯)，可以在多个方面对聚丙烯酸酯的性质施加影响，并且因此提供最广泛多样的可能用途。

用于断裂聚丙烯酸酯的化学方法，例如碱皂化法(US 3,926,891)，是本领域技术人员已知的。美国专利申请2004/0082023 A1描述了使用酶例如脂肪酶或酯酶对具有羧基基团的聚合物进行酶促酯化的方法。聚丙烯酸酯未被明确地提及为可能的聚合物，也不存在该方法在聚丙烯酸酯的酶催化的酯断裂中的适用性的任何提及。

O′Sullivan和Birkinshaw描述了通过来自猪肝的酯酶尝试水解聚(正丁基氰基丙烯酸酯)纳米颗粒(O′Sullivan，Birkinshaw，PolymerDegradation and Stability 78：7-15，2002)。Belucci等人报道了使用脂肪酶小心去除油画表面的丙烯酸树脂涂层(Belluci等人，Study inConservation 44：278-281，1999)。

大量酯酶是本领域技术人员已知的。例如，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)的酯酶在Peterson等人，J.Biotechnol.89：11-25(2001)，Valinger等人，J.Biotechnol.129：98-108(2007)，Ivancic等人，J.Biotechnol.129：109-122(2007)和Reiter等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.54：778-785(2000)中描述。关于这些酯酶用于断裂聚合物底物的适宜性以前从未有过描述。

本发明的技术问题因此是，提供用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法和适用于此的酶、其核酸、含有核酸的载体或含有载体的微生物、和可通过该方法获得的反应产物。

发明概述

令人惊讶地，上述问题通过在用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法中使用酯酶，特别是选自羧酸酯酶、三酰基脂肪酶和角质酶的酶，并且通过提供相应酯酶和编码其的核酸而得到解决。

附图描述

图1显示EstB的结构模型。被鉴定为覆盖进入催化活性中心的通路的2个环被突出显示且用箭头指出。突出显示且同样用箭头指出的氨基酸残基代表活性中心的亲核丝氨酸。

图2显示根据SEQ ID NO：2的EstC的结构模型，其中苯丙氨酸138由丙氨酸替换(Phe138Ala；与图5中的突变体1K22对应)。显示多肽链的主链。箭头标记的在位置138中的氨基酸苯丙氨酸以空间填充模式(space-fillingmodel)表示，图中在Phe138下以空间填充模式给出的氨基酸相应于属于催化活性中心的氨基酸Ser112、Asp242和His275。

图3显示根据SEQ ID NO：2的EstC的结构模型，其中亮氨酸193由丙氨酸替换(Leu193Ala；与图5中的突变体2K20对应)。显示多肽链的主链。箭头标记的在位置193中的氨基酸亮氨酸以空间填充模式表示，图中在Leu193上以空间填充模式给出的氨基酸相应于属于催化活性中心的氨基酸Ser112、Asp242和His275。

图4显示根据SEQ ID NO：2的EstC的结构模型，其中苯丙氨酸138由丙氨酸替换、亮氨酸193由丙氨酸替换且苏氨酸188由丝氨酸替换(Phe138Ala、Leu193Ala、Thr188Ser；与图5中的突变体B48对应)。显示多肽链的主链。氨基酸Phe138、Thr188和Leu193以空间填充模式表示，并用箭头标出。以空间填充模式给出的其他氨基酸相应于属于催化活性中心的氨基酸Ser112、Asp242和His275。

图5总结了活性突变体和活性。结果通过pH-迁移试验用酯酶C(图5a)和酯酶B(图5b)及其各种功能突变体获得。下述符号用于活性：+++＝非常高活性的，++＝活性的，+＝弱活性的，o＝无活性的。

在获得这些数据时，EstB及其突变体未就乙酸α-萘基酯进行测试，然而，本发明人有数据可以用于显示所有3种EstB变体对该底物具有活性。

图6显示，在加入酯酶生产菌株NJ70(等价于1000单位EstB_NJ70)的粗裂解物后酶催化的PBA的酯断裂，与在变性后加入粗裂解物后的化学酯断裂相比较。

图7显示用底物PBA对EstB酯酶(野生型和突变体)的自动滴定(autotitration)。研究了Sokalan(＝聚丙烯酸)的可能抑制作用。

图8显示作为pH的函数的酶催化的酯断裂。所有测量用1000单位的EstB_NJ70(用p-NPB确定)和750μl PBA执行。

图9显示酶催化的酯断裂的温度依赖性。所有自动滴定用1000单位的EstB_NJ70(用p-NPB确定)和750μl PBA执行。

图10显示以溶液EstB_NJ70或固定化的EstB_NJ70进行的酯断裂反应的过程。显示用4.66mmol PBA自动滴定未固定或固定在Eupergit上的EstB_NJ70的结果。

图11显示不同链长的聚丙烯酸甲基酯的断裂，其中变性后的酶用作对照。

发明详述

I.一般术语的解释

在本发明的范围内，除非另有说明，否则术语“酯酶”一般指催化酯键水解的酶。

“作用于酯键的酶”意指根据EC分类法类别3.1的酶。“羧酸酯水解酶”意指根据EC分类法类别3.1.1的酶。“羧酸酯酶”、“三酰基甘油脂肪酶”或“角质酶”意指EC类别3.1.1.1、3.1.1.3和/或3.1.1.74的酶。

“家族VIII的酯酶”由Petersen等人，J Biotechnol 89：11-25(2001)以及Arpigny和Jaeger，Biochem J 343：177-183(1999)中给出的定义覆盖。因此，家族VIII的酯酶的特征在于，活性位点具有Ser-X-X-Lys基序(其中X代表任何氨基酸)，并且因此与C型的β-内酰胺酶的活性位点具有相似性，需要时，可以通过Petersen等人(同上引文)中描述的酯酶活性测定法之一来检测酯酶活性。

在本发明的范围内，C型酯酶应理解为这样的酶，其在氨基酸水平上与根据SEQ ID NO：2的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的EstC(Reiter等人，Appl Microbiol Biotechnol 54：778-785(2000))具有至少50％同一性，并且此外，在氨基酸水平上与来自巴西橡胶(Hevea brasiliensis)的羟基腈裂解酶(Hasslacher M等人，J Biol Chem 271：5884-5891(1996)，GenBank登记号AAC49184)，SEQ ID NO：58，和/或来自木薯(Manihot esculenta)的羟基腈裂解酶(Hughes等人，Arch Biochem Biophys 311：96-502(1994)，Swiss-Prot登记号P52705)，SEQ ID NO：59，具有至少20％同一性。

在本发明的范围内，聚丙烯酸酯的“酶催化的水解”也涵盖包括部分自分解的反应。在“部分自分解”中，自分解地断裂0-90mol.％、0-50mol.％、0-25mol.％、0-20mol.％，特别是0-15mol.％、0-10mol.％、0-5mol.％或0-1mol.％比例的酯基团。

卤素指氟、氯、溴或碘。

环或环结构意指一级结构中一个连续氨基酸的区段，该区段在蛋白质的三级结构中形成环状的结构元件。

聚丙烯酸酯的水解或针对聚丙烯酸酯的水解活性意指，聚丙烯酸酯的酯键的部分或完全水解。

表述“约”意指，给出的值任选地具有不超过25％的向上或向下偏差，特别是不超过10％的上或下偏差，或不超过5％的上或下偏差。

除非另有说明，否则平均分子量意指重量平均分子量。

交替共聚物应理解为由2种单体A和B组成的共聚物，其中这些单体为严格交替顺序(AB)_n。随机共聚物意指这样的共聚物，其中单体(例如A和B)随机掺入在共聚合过程中形成的大分子中，即以纯粹随机的次序掺入。梯度共聚物是其中沿着共聚物链存在单体结构单元(例如，结构单元A和B)的梯度分布的共聚物。嵌段聚合物是其分子由线性连接的嵌段组成的聚合物。嵌段应理解为聚合物分子的区段，该区段包含数个相同的重复单元，并且具有与相邻区段(嵌段)不同的至少一个组成或构型特征。嵌段直接地或经由非属于嵌段的一个部分的结构单元连接在一起。嵌段共聚物是由一种以上单体组成的嵌段聚合物，并且可以例如通过通式-A_k-B_l-A_m-B_n-描述由2种单体A和B构成的嵌段共聚物，其中k、l、m和n代表在这些个嵌段中的重复单元的数目。接枝共聚物是根据接枝共聚合方法生产的聚合物，其结构具有这样的特征--它们在主链上具有侧链，且侧链的长度使得这些侧链可以被视为聚合物。主链和侧链可以是化学上相同的或不同的。

醇衍生物应理解为衍生自醇的分子，例如其中一个或多个羟基由其他官能团替换的醇，所述其他官能团例如氨基基团或巯基基团。

当执行根据本发明的方法后最初存在的(即，基本上可断裂的)酯基团未被断裂时，发生“部分”酯断裂。例如，部分断裂可以涉及最初包含的酯基团的0.1-99.9％，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％，或至多99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80％，例如1-95、2-90、3-85、4-80、5-75、6-70、7-65、8-60、9-55、10-50、11-45、12-40、13-35、14-30、15-25或16-20％。断裂可以区域非特异性地发生，即在聚合物分子中基本上随机分布，或可以区域特异性地发生，即非随机分布的，在分子的一个或多个特定区域中，例如在分子的一个或多个末端区域中，占优势。

“根据SEQ ID NO：X的酯酶的突变体”或“衍生自SEQ ID NO：X的突变体”意指，从这个SEQ ID NO：X开始，通过采取本文描述的至少一种突变或本文描述的突变的至少一种组合而产生的突变体。

下述缩写被使用：

DG：2，4-二甲基戊二酸-二甲基酯

DB：2，4-二甲基戊二酸-二丁基酯

PMA：聚丙烯酸甲酯

PBA：聚丙烯酸丁酯

α-N：乙酸α-萘基酯

p-NPA：对硝基苯基乙酸酯

p-NPB：对硝基苯基丁酸酯

II.发明目的

本发明的第一个目的涉及用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法，其中制备至少一种聚丙烯酸酯，使该至少一种聚丙烯酸酯与至少一种酶一起温育，所述酶选自作用于酯键的酶(EC 3.1)，直至聚丙烯酸酯中含有的酯基团已部分或完全水解断裂，以及任选地分离所得到的经修饰的聚合物。在这种方法中，聚丙烯酸酯可以是均聚物或来自2种或更多种不同单体的共聚物。

根据进一步的实施方案，酶选自羧酸酯水解酶(EC 3.1.1)。根据特别优选的实施方案，羧酸酯水解酶选自羧酸酯酶(E.C 3.1.1.1)、三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)和角质酶(EC 3.1.1.74)。

根据进一步的实施方案，聚丙烯酸酯是均聚物或共聚物。共聚物的例子是交替共聚物、统计共聚物、梯度共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。共聚物的单体可以是例如本文公开的所有单体。

根据该方法的一个优选实施方案，聚合物包括通式I的单体结构单元

R¹R²C＝CR³-COOR⁴    (I)，

其中

R¹、R²和R³可以是相同或不同的，并且选自H、直链C₁-C₂₀烃基残基和支链C₃-C₂₀烃基残基，并且R⁴选自H、直链C₁-C₂₀或C₁-C₆烃基残基、支链C₃-C₂₀或C₃-C₆烃基残基和环状C₃-C₂₀或C₅-C₇烃基残基，所述烃基残基任选被一个或多个相同或不同基团取代，所述基团选自羟基、氨基、环氧基(epoxide)和卤素原子，

并且在聚合物中，在至少一个式I的单体结构单元中，R⁴选自直链C₁-C₂₀或C₁-C₆烃基残基、支链C₃-C₂₀或C₃-C₆烃基残基和环状C₃-C₂₀或C₅-C₇烃基残基，所述烃基残基任选被一个或多个相同或不同基团取代，所述基团选自羟基、氨基、环氧基、硫醇基团(thiol groups)和卤素原子。

直链C₁-C₂₀烃基残基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基残基。支链C₃-C₂₀烃基残基包括例如异丙基、异丁基、异戊基、2，2-二甲基丙基、异己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、异庚基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2，3-三甲基丁基、异辛基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2，3-三甲基戊基、2，2，4-三甲基戊基、2，2，5-三甲基戊基和异壬基残基。C₃-C₂₀环烷基残基的例子是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基、环十三烷基、环十四烷基、环十五烷基、环十六烷基、环十七烷基、环十八烷基、环十九烷基和环二十烷基残基。取代烃基残基的非限制性例子是羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基、羟己基、羟庚基、羟辛基、羟壬基和羟癸基残基。如果存在几个羟基基团，那么通式(I)的聚合物因此可以是多元醇。根据进一步的非限制性例子，烃基残基选自碳水化合物，因此特别地多羟基醛和多羟基酮，其可以为单体、寡聚物或多聚物的形式。相同或不同单体可以存在于一个聚丙烯酸酯中，并且寡聚物或多聚物可以包含相同或不同单体。碳水化合物是本领域技术人员已知的，并且多羟基醛的非限制性例子包括苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖；多羟基酮的非限制性例子包括二羟丙酮、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、果糖、山梨糖、甘露庚酮糖。

根据一个进一步的实施方案，根据本发明的方法的特征在于，除式I的单体外，聚丙烯酸酯还以0-15mol.％的摩尔比例含有至少一种与其不同的另外单体组分，优选选自N-乙烯基甲酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、衣康酸、衣康酸酯、乙烯基膦酸、乙烯基磺酸、乙烯基醇、N-乙烯基咪唑、N-乙烯基甲酰胺、苯乙烯、马来酸、马来酸酯、乙烯、丙烯丙烯酰胺和取代的丙烯酰胺，其中取代基选自直链C₁-C₂₀或C₁-C₆烃基残基、支链C₃-C₂₀或C₃-C₆烃基残基和环状C₃-C₂₀或C₅-C₇烃基残基，所述烃基残基任选被一个或多个相同或不同基团取代，所述基团选自羟基、氨基、环氧基、硫醇基团和卤素原子。

在该方法的一个实施方案中，聚丙烯酸酯的丙烯酸基团在水解前完全或基本上完全被酯化。

在根据本发明的方法中，聚丙烯酸酯的平均分子量为多达约3000000，例如约1000直到约3000000，特别是直到约200000、150000、100000或50000。聚丙烯酸酯优选选自平均分子量为约20000-约3000000，特别是约30000-约50000，特别是约40000的聚丙烯酸甲基酯、和平均分子量为约20000-约3000000，特别是约90000-约110000，特别是约99000的聚丙烯酸丁基酯。

在根据本发明的方法的进一步实施方案中，温育在pH 5-14发生，优选7-12、8.5-11.5，特别是在pH 9-11，或在pH 7-9。

根据本发明方法的进一步实施方案，酶在溶液中，特别是在水性、有机或水-有机、有机-水或有机溶液中。在本发明的范围内，有机-水或水-有机溶液不仅包括完全可混溶的组分的均相溶液(例如水和有机溶剂)，还包括二相系统或多相系统，例如油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液等。然后，酶优选完全或主要在水相中，聚丙烯酸酯优选完全或主要在有机相中。根据具体实施方案，水性组分与有机组分或水相与有机相的体积比是约75∶25至25∶75，例如约60∶40至约40∶60、约55∶45至约45∶55，特别是约50∶50。

根据特定实施方案，酶以非固定化形式存在。

根据本发明方法的一个进一步实施方案，酶以固定化形式存在。固定化酶的例子是在微球体或扁平形载体上共价或非共价结合的酶。用于酶固定的合适方法是本领域技术人员已知的，并且例如在下述中描述：S.Fukui，A.Tanaka，″Enzymes″，in：Ullmann′s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第5版，Wiley-VCH，New York，Berlin，1985；J.E.Prenosil，O.M.Kut，I.J.Dunn，E.Heinzle，″ImmobilizedBiocatalysts″，in：Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，VCH，New York，Berlin，2003，第503-554页；J.F.Kennedy，J.M.S.Cabral，in：H.J.Rehm，G.Reed(编辑)，Biotechnology：Acomprehensive treatise in 8 volumes；第7a卷，第349-404页；VCH，Weinheim，1987。酶的非共价结合可以例如这样达到：用生物素标记酶且固定在提供有抗生物素蛋白或链霉亲和素的载体上；将组氨酸标签掺入酶的氨基酸序列内来标记酶且固定在提供有镍螯合物的载体上；通过针对酶的抗体固定酶(优选选择结合表位，以使得抗体和结合表位之间的结合不损害或基本上不损害底物分子对于活性位点的接近)；由酶和外源蛋白质制备融合蛋白和通过针对该外源蛋白质的抗体固定蛋白质。与上面类似，以固定化形式存在的酶可以是二相系统或多相系统的组成成分。例如，在固体载体(例如，微球体)上固定的酶可以被视为二相系统中存在于液相(水或有机溶剂)中的固相，或固定在固体载体上的酶可以作为固相存在于已经的二相或多相液体系统(例如油包水乳液或水包油乳液)中。

根据一个进一步的实施方案，本发明方法在生物反应器中执行。

在根据本发明方法的一个进一步实施方案中，酶是酯酶，选自家族VIII的酯酶、C型酯酶、根据SEQ ID NO：5的角质酶或由其衍生的角质酶、和根据SEQ ID NO：6的三酰基甘油脂肪酶或由其衍生的三酰基甘油脂肪酶。在一个具体实施方案中，VIII型酯酶是根据SEQ ID NO：1的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(ATCC 10248)的酯酶B，在另一个具体实施方案中，C型酯酶是根据SEQ ID NO：2的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(ATCC 10248)的酯酶C。本发明还涉及上述酯酶的功能突变体。

根据本发明方法的进一步实施方案，酯酶是相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2就聚丙烯酸酯水解而言具有可比的或增加的活性的、根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的酯酶的功能突变体，和/或是相对于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2具有增加的稳定性的、根据SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的酯酶的功能突变体，例如针对有机溶剂的影响或就由温度升高引起的变性而言具有增加的稳定性。

根据本发明方法的进一步实施方案，与根据SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的酯酶比较，突变体展示就聚丙烯酸甲酯和/或聚丙烯酸丁酯而言增加的水解活性。水解活性可以例如通过滴定测定法进行定量测定，其中酯断裂在溶液中发生，并且通过加入NaOH(或另一种pH矫正剂)补偿由释放的酸基团引起的pH下降。当例如与根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的相应酯酶比较，突变体造成反应平衡的更快速建立(即，在更短时间内必须加入相同量的NaOH)和/或使平衡朝向更完全的水解移动(即，必须加入更多NaOH)时，发生增加的水解活性。水解活性可以另外在pH迁移试验中进行半定量测定，其中使酶突变体或生产酶突变体的微生物与含有聚丙烯酸酯的底物(这可以例如提供在琼脂培养基中或在滤膜上)一起温育，并且通过同样存在的pH指示剂的变色，测定由于释放的酸基团引起的pH下降。如果与根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的相应酯酶比较，突变体造成至低pH值的更快速改变、或造成至较低pH值的更强烈改变(在含酶位点周围更大的变色晕圈)，那么存在增加的水解活性。

根据进一步实施方案，根据本发明的方法的特征在于

(a)酯酶是根据SEQ ID NO：1的酯酶的突变体，在氨基酸残基Ser17、Gly132、Trp134、Arg155、Glu251、Ala311和Glu316中的一个或多个上具有至少一个突变，例如1、2、3、4、5、6或7个突变；或

(b)酯酶是根据SEQ ID NO：2的酯酶的突变体，在氨基酸残基Phe138、Val150、Leu160、Thr188和Leu193中的一个或多个上具有至少一个突变，例如1、2、3、4或5个突变。

在进一步的实施方案中，根据本发明的方法的特征在于酯酶衍生自SEQ ID NO：1且包含

a)突变Ser17Leu、Gly132Ser、Glu251Gly、Ala31Val和Glu316Lys中的至少一个，例如1、2、3、4或5个突变，和/或

b)突变Pro8Leu、Gly132Ser、Trp134Arg、Arg155Cys、Glu251Gly、Ala311Val和Glu316Lys中的至少一个，例如1、2、3、4、5、6或7个突变。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的方法的特征在于酯酶衍生自SEQ ID NO：1且包含

(a)突变Ser17Leu、Gly132Ser、Glu251Gly、Ala31Val和Glu316Lys；或

(b)突变Pro8Leu、Gly132Ser、Trp134Arg、Arg155Cys、Glu251Gly、Ala311Val和Glu316Lys。

根据SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的酯酶代表具体实施方案。

在进一步的具体实施方案中，根据本发明的方法的特征在于酯酶衍生自SEQ ID NO：2，并且包含下述突变或突变组合之一(即，下文列出的单突变或多重突变之一)：

(a)Phe138Ala

(b)Phe138Ala、Thr188Ser

(c)Phe138Ala、Leu160Ala、Thr188Ser

(d)Leu193Ala

(e)Leu193Ala、Phe138Ala、Thr188Ser、

Val150Ala

(f)Leu193Ala、Phe138Ala、Thr188Ser

(g)Leu193Ala、Phe138Ala、Thr188Ser、

Leu160Ala、Val150Ala

(h)Val150Ala

(i)Val150Ala、Thr188Ser

(j)Leu193Ala、Phe138Val

(k)Leu193Ala、Phe138Val、Thr188Ser、

Val150Ala

(l)Leu193Ala、Thr188Ser

(m)Leu193Ala、Phe138Val、Thr188Ser

(n)Leu193Ala、Phe138Val、Thr188Ser、

Leu160Ala

(o)Phe138Val、Val150Ala、Thr188Ser

(p)Phe138Val

(q)Phe138Val、Thr188Ser

根据本发明的方法的进一步实施方案，酯酶是VIII型酯酶或C型酯酶的缺失突变体。优选地，酯酶具有环缩短。在根据SEQ ID NO：1的酯酶(唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的EstB)的情况下，用于环缩短的合适区域是例如区域Glu246至Arg258和Gly312至323。环缩短可以通过去除一个或多个氨基酸来实现，并且在去除几个氨基酸的情况下，可以去除在SEQ ID NO：1中的一个或多个相邻或非相邻氨基酸。在SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38下给出的氨基酸序列的缺失突变体代表具体实施方案。

本发明的另一个目的涉及先前提及的功能酯酶突变体。

本发明的另一个目的涉及核酸，

a)其编码功能酯酶突变体，或

b)其是与a)互补的核酸，和/或

c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸，特别是具有至少80％序列同一性，并且编码水解聚丙烯酸酯的家族VIII酯酶的突变体或C型酯酶的突变体的那些核酸。

本发明的另一个目的涉及包含上述核酸的载体。根据一个具体实施方案，核酸与启动子可操作地连接。

本发明的另一个目的涉及包含至少一种上述载体的微生物。

本发明的另一个目的涉及生产一种上述功能酯酶突变体的方法，其中

a)培养能够表达该酯酶的宿主生物，例如含有至少一种上述载体的上述微生物；

b)任选地诱导酯酶的表达，和

c)任选地从宿主生物和/或培养基中分离酯酶。

本发明的另一个目的涉及上述酯酶之一、上述载体之一、或上述微生物之一用于执行上述酯水解方法之一的用途，或用于所述聚丙烯酸酯的相应转酯的用途。

本发明的另一个目的涉及可通过上述方法之一获得的聚合物反应产物。

III.关于实施本发明的其他信息

1.用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法

根据本发明的方法涉及酶催化的聚丙烯酸酯水解，这在本发明上下文中也称为酶促酯断裂(或简称为：酯断裂)。

在本发明方法的范围内，可以考虑到至少一种聚丙烯酸酯的制备及其与至少一种酯酶的温育。制备优选在溶液中发生，所述溶液可以是水溶液、有机溶液(包含一种或多种有机溶剂)或水-有机溶液(具有包含一种或多种有机溶剂的有机溶剂组分)。可以使用的有机溶剂包括例如醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇，芳族烃例如苯和甲苯，醚例如二甲醚、二乙醚、1，2-二甲氧基乙烷和四氢呋喃。水溶液或水-有机溶液是优选的。在水-有机溶液中，有机溶液或有机溶剂组分的总和可以占1-80体积％的体积比例，优选10-60体积％，且特别是约40体积％。在本发明的范围内，水-有机溶液或有机-水溶液可以是均相溶液，或二相或多相系统(例如，水包油、油包水、水包油包水乳液)。为了允许酶和聚丙烯酸酯之间容易接触，溶液优选是非凝胶样的。溶液优选具有小于4000mPa＊s的粘度，特别小于2000mPa＊s、小于1000mPa＊s、小于500mPa＊s、小于400mPa＊s、小于200mPa＊s、小于100mPa＊s、小于50mPa＊s、小于25mPa＊s、小于10mPa＊s、小于5mPa＊s或小于2.5mPa＊s。水溶液或水-有机溶液的水性组分可以是缓冲液。缓冲液的pH优选调整至发生酶催化的酯断裂的pH。如果根据本发明的方法在生物反应器中执行，微生物在其中生产至少一种酯酶，所述酯酶断裂至少一种聚丙烯酸酯，那么pH优选调整至适于微生物培养的值。本领域技术人员熟悉合适pH值的确定。用于在根据本发明的方法中使用的合适缓冲液也是本领域技术人员已知的，并且包括例如PBS、Tris-HCl缓冲液、三乙醇胺盐酸盐/NaOH缓冲液、二乙醇胺/HCl缓冲液、硼酸钠/HCl缓冲液、甘氨酸/NaOH缓冲液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、Na₂HPO₄/NaOH缓冲液、2-(环己基氨基)乙磺酸/NaOH缓冲液和3-(环己基氨基)-1-丙磺酸/NaOH缓冲液。其他缓冲系统是本领域技术人员已知的，并且例如描述在Harris和Angal(编辑)，Protein purification methods-a practicalapproach，IRL Press at Oxford University Press，第1版(再版)1990中。

根据本发明的方法可以在所用的酯酶具有活性的所有温度执行，例如在5℃-85℃，优选10℃-50℃，特别优选20℃-40℃。本领域技术人员熟知酶就其稳定性和/或其催化活性而言具有最适温度，该最适温度可能还可以根据使用的溶剂或溶剂混合物而改变，并且本领域技术人员可以测定使用的每种酯酶的最适温度或最适温度范围。如果根据本发明的方法使用生产至少一种酯酶的微生物执行，其中所述酯酶可以用于聚丙烯酸酯的水解断裂，那么当选择方法温度时，微生物的温度需求也可以由本领域技术人员加以考虑。

制备的聚丙烯酸酯可以是完全酯化的(即，每个丙烯酸基团都由醇或醇衍生物酯化)或部分酯化的(即，在聚丙烯酸酯的分子中仍存在游离丙烯酸基团)。根据优选实施方案，制备的一种或多种聚丙烯酸酯是完全或基本上完全酯化的。当聚丙烯酸的至少75％，特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％丙烯酸基团已酯化时，酯化是基本上完全的。因此，基本上完全酯化的聚丙烯酸酯具有例如75％-100％、75％-99％、75％-98％、75％-97％、75％-96％、75％-95％、85％-100％、85％-99％、85％-98％、85％-97％、85％-96％、85％-95％、90％-100％、90％-99％、90％-98％、90％-97％、90％-96％、90％-95％、95％-100％、95％-99％、95％-98％、95％-97％或95％-96％的酯化程度。

根据本发明的方法可以以分批方式或连续地进行。在分批方式中，制备至少一种聚丙烯酸酯和至少一种酯酶，执行温育，在选择的时间点从反应容器中排出反应混合物并且任选送往进一步加工(例如反应产物的分离或至少一种酯酶的回收)。排出可以在酯断裂完成后(即，在聚丙烯酸酯一方和聚丙烯酸或部分酯化的聚丙烯酸另一方之间建立平衡后)或在不完全酯断裂后发生。用于排出相应批的合适时间点可以由本领域技术人员通过各种方法确定，例如通过预先取样和分析，或通过基于随着酯断裂进程而改变的合适参数例如溶液的pH或粘度来连续监控反应过程。还可以任选地在预定反应时间结束时排出该批。在分批方式中，在最初提供至少一种聚丙烯酸酯和至少一种酯酶后，在最终排出反应混合物前，聚丙烯酸酯和/或酯酶的单次或多次再添加可以彼此独立地发生。在连续方式中，在最初提供至少一种聚丙烯酸酯和至少一种酯酶后，在规定的时间点排出反应混合物的部分，并且保留在反应容器中的反应混合物通过加入聚丙烯酸酯和/或酯酶进行补充。该时间点可以是定期的，或可以依赖于对反应过程的测量而选择。至少一种聚丙烯酸酯和/或至少一种酯酶的连续添加也是可以的。与之独立地，反应混合物的连续排出也是可以的。本领域技术人员已知如何优化各方法变量(例如，添加或排出的量和时间点)，以便获得所需反应产物。连续操作可以进行不同的时间长度，例如数小时、数天、数周、数月或数年，并且可以中断或暂停，例如用于清洁、检查或维护。

如果想分离由于酯断裂而获得的改变的聚合物，那么可以通过本领域通常采用的方法实现，例如通过色谱法、透析、化学沉淀、溶剂萃取、或蒸发反应混合物中含有的溶剂。如果待再度利用至少一种酯酶，那么可以通过本领域通常采用的方法分离之，优选该分离在以可能会损害酶的方法分离该改变的聚合物前进行。例如可以通过亲和纯化借助于酯酶结合分子(例如抗体)、透析或沉淀(例如用硫酸铵)，分离酯酶。根据进一步的实施方案，至少一种酯酶以固定化形式存在。各种固定方法是本领域技术人员已知的，并且例如描述在：S.Fukui，A.Tanaka，″Enzymes″，in：Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第5版，Wiley-VCH，New York，Berlin，1985；J.E.Prenosil，O.M.Kut，I.J.Dunn，E.Heinzle，″Immobilized Biocatalysts″，in：Ullmann′s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第6版，VCH，New York，Berlin，2003，第503-554页；J.F.Kennedy，J.M.S.Cabral，in：H.J.Rehm，G.Reed(编辑)，Biotechnology：A comprehensive treatise in 8 volumes；第7a卷，第349-404页；VCH，Weinheim，1987。酶的非共价结合可以例如这样达到：用生物素标记酶且固定在提供有抗生物素蛋白或链霉亲和素的载体上；将组氨酸标签掺入酶的氨基酸序列内来标记酶且固定在提供有镍螯合物的载体上；通过针对酶的抗体来固定酶(优选选择结合表位，以使得抗体和结合表位之间的结合不损害或基本上不损害底物分子对于活性位点的接近)；由酶和外源蛋白质生产融合蛋白和通过针对外源蛋白质的抗体固定蛋白质；或通过吸附性粘着在微球体(珠)或载体材料上。由于固定化，酯酶分子在反应容器中保持静止(例如，在反应容器的壁上或在反应容器中存在的表面上)，并且在排出反应混合物的过程中，仅聚丙烯酸酯和/或通过酯断裂修饰的聚合物被排出。可替代地，在吸附于微球体的情况下，酯酶分子可以自由漂浮在反应溶液中，并且可以与聚丙烯酸酯分子相互作用，但可以通过各种方法(例如，滤器或使用流化床反应器)阻止其与聚丙烯酸酯分子和/或聚丙烯酸分子一起离开反应容器。也可以将微球体与聚丙烯酸酯分子和/或聚丙烯酸分子一起排出，之后例如通过离心或过滤进行分离。

可以实施根据本发明的方法，直至聚丙烯酸酯中含有的酯基团已经部分或完全水解断裂，在完全水解的情况下，将获得聚丙烯酸。优选在部分水解后排出。在这种情况下，最初供应的聚丙烯酸酯仍含有酯基团，这将赋予在反应过程中改变的该聚合物某些性质。经修饰的聚合物随后可以用于其它目的，例如作为起始物质用于进一步的化学修饰。

2.酶

在根据本发明的方法中，可以使用一般的酯酶，且特别是根据″Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology″的分类法属于EC类别3.1的作用于酯键的酶。EC类别的分类见于″Enzyme Nomenclature″(1992年由Academic Press for theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology″出版，ISBN0-12-227164-5)以及后续增补，或见于因特网http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/icbn/index.html#6。优选实施方案是羧酸酯水解酶(E.C.3.1.1)，特别是羧酸酯酶(E.C.3.1.1.1)、三酰基甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)和角质酶(E.C.3.1.1.74)。

对于根据本发明的方法，还可以使用具体公开的酯酶的“功能突变体”(也称为“功能酯酶突变体”、“酯酶突变体”或“突变体”)，其中功能突变体，任选在从生产其的微生物中分离后，自身是本发明的目的。在本发明的范围内，功能突变体是不同于具体公开的酯酶的多肽，例如与根据SEQID NO：1至SEQ ID NO：38的酯酶小于100％相同(例如，40％至小于100％、50％至小于100％、60％至小于100％、75％至小于100％、85％至小于100％、90％至小于100％、95％至小于100％或99％至小于100％)，但仍具有所需酶活性。所需酶活性可以例如通过对聚丙烯酸酯例如聚丙烯酸甲酯或聚丙烯酸丁酯的断裂进行检测。如果功能突变体具有作为参考的酯酶的至少10％断裂活性(这可以例如以单位时间内底物的转换进行确定)，特别是至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％所述断裂活性，那么所需酶活性被视为存在。如果功能突变体具有比作为参考的酯酶更高的断裂活性，例如多达所讨论的酯酶的断裂活性的105％、110％、120％、150％、200％或200％以上，那么所需酶活性当然也特别存在。此外，如果功能突变体能够断裂新底物，即，不被作为参考的酯酶断裂的聚丙烯酸酯，或在可比的反应条件(例如，温度、pH、溶剂或溶剂组成、盐浓度、底物浓度、酶浓度)下不被作为参考的酯酶断裂的聚丙烯酸酯，那么所需酶活性也是存在的。

根据本发明，“功能突变体”意指特别是改变的蛋白质，其在上述具体序列的至少一个序列位置中具有与具体所述的氨基酸不同的氨基酸，但仍具有所需酶活性。“功能突变体”因此包括可通过一个或多个，例如1-50、1-40、1-30、或1-20，即例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸的添加、置换、缺失和/或倒位而获得的改变的蛋白质，其中所述改变可以在任何序列位置发生，条件是它们导致具有根据本发明的性质谱的功能突变体。当突变体和未改变的多肽之间在反应模式上性质一致，即，例如酶学参数(例如底物亲和力、转换数)相同，但在数量上存在不同程度时，功能突变体也是尤其存在的。氨基酸残基的合适置换的例子如下：

在上文含义中的“功能突变体”也可以是所述酯酶的前体以及酯酶的功能衍生物和盐。术语“盐”意指根据本发明的蛋白质分子的羧基基团的盐以及氨基基团的酸加成盐。羧基基团的盐可以以本身已知的方式进行制备，并且包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，和与有机碱，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等的盐。酸加成盐，例如与矿物酸例如盐酸或硫酸的盐，或与有机酸例如乙酸和草酸的盐，也涵盖在本发明中。本发明中所述的酯酶或根据本发明的功能酯酶突变体的“功能衍生物”也可以通过已知技术在官能氨基酸侧基上或在其N或C末端上进行制备。这类衍生物包括例如羧酸基团的脂族酯，羧酸基团的酰胺(可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得)；游离氨基基团的N-酰基衍生物(通过与酰基基团反应制备)；或游离羟基的O-酰基衍生物(通过与酰基基团反应制备)。

“功能突变体”自然也包括可从其他生物获得的酯酶和天然存在的变体。例如，可以通过序列比较发现同源序列区域，并且基于本发明的具体指导，可以确定功能突变体。生物的例子是伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)、B.thailandensis、洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cenocepacia)、B.aurantiaca、越南伯克霍尔德氏菌(B.vietnamensis)、B.dolosa、B.multivorans、B.ambifaria)、标桩菌属(Stigmatella)(例如橙色标桩囊菌(S.aurantiaca))、链霉菌属(Streptomyces)(例如生二素链霉菌(S.ambofaciens)、天蓝色链霉素(S.coelicolor))、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)(例如红色糖多孢菌(S.erythraea))、分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae))。

“功能突变体”此外也可以是融合蛋白，具有上述酯酶多肽序列或由其衍生的功能突变体之一、以及功能性N或C末端连接的至少一个在功能上与其不同的另外异源序列(即，这些融合蛋白的部分相互无实质性功能损害)。这类异源序列的非限制性例子是例如酶、蛋白质A和免疫球蛋白，蛋白质A和免疫球蛋白融合物可以用于例如将功能突变体非共价固定在载体(例如微球体)上。

此外，功能突变体的生产方法是本领域技术人员已知的。用于修饰基因和因此用于修饰由其编码的蛋白质的方法长久以来已是本领域技术人员熟悉的，例如定点诱变，其中对基因的单个或几个核苷酸进行靶向改变(Trower MK(编辑)1996；In vitro mutagenesis protocols.HumanaPress，New Jersey)；饱和诱变，其中可以在基因的任何位点上替换或添加任何期望氨基酸的密码子(Kegler-Ebo DM，Docktor CM，DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res 22：1593；Barettino D，Feigenbutz M，Valcárel R，Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22：541；Barik S(1995)Mol Biotechnol 3：1)；易错聚合酶链反应(易错PCR)，其中核苷酸序列通过缺陷性操作DNA聚合酶进行突变(Eckert KA，Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18：3739)；在增变菌株中传代基因，在该菌株中存在核苷酸序列增加的突变率，例如由于缺陷DNA修复机制(GreenerA，Callahan M，Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesistechnique using an E.coli mutator strain.In：Trower MK(编辑)In vitromutagenesis protocols.Humana Press，New Jersey)；或DNA改组，其中形成紧密相关的基因的合并物，消化该基因合并物，将片段用作聚合酶链反应的模板，其中通过反复链分离和再次合并，最终产生全长镶嵌基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370：389；Stemmer WPC(1994)Proc NatlAcad Sci USA 91：10747)。依赖于使用的技术，本领域技术人员可以将完全随机或更定向的突变插入基因内或非编码核酸区域内(这例如对于调节表达是重要的)，并且随后建立基因库。为此所需的分子生物学方法是本领域技术人员已知的，并且例如在Sambrook和Russell，Molecular Cloning.第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001中描述。

使用所谓的定向进化(尤其在Reetz MT和Jaeger K-E(1999)，TopicsCurr Chem 200：31；Zhao H，Moore JC，Volkov AA，Arnold FH(1999)，Methods for optimizing industrial enzymes by directedevolution，in：Demain AL，Davies JE(编辑)Manual of industrialmicrobiology and biotechnology.American Society for Microbiology中描述)，本领域技术人员也可以以靶向方式大规模地生产功能突变体。在这点上，在第一个步骤中，首先产生相应蛋白质的基因库，例如采用上文提及的方法。基因库以合适方式表达，例如通过细菌或通过噬菌体展示系统。此外，通过选择合适的表达载体用于控制蛋白质在宿主中的定位的方法也是本领域技术人员已知的，例如作为细胞内蛋白质定位在细胞质中，通过添加上膜锚着点上而作为膜蛋白质，或通过加上信号肽以及信号肽酶的识别位点而作为细胞外蛋白质。随后在第二个步骤中，选择或筛选表达具有所需性质的蛋白质的克隆。在选择过程中，可以由于蛋白质赋予宿主生物存活优势(例如使得某些底物能够被利用的酶，或在特定温度下的生长)，而仅有表达具有所需性质的蛋白质的克隆存活。在筛选过程中，如果所有克隆都存活，则可以利用合适测定法确定哪个克隆表达具有所需性质的蛋白质。本领域技术人员已知可以如何适当地设置测定试验以用于特定目的。例如，当搜索具有特定结合性质的蛋白质时，可以筛选这样的宿主生物，其在表面上表达所讨论的蛋白质且附着于包被有结合配偶体的基质(与不表达功能蛋白质的宿主生物形成对比)；当搜索具有催化性质的功能突变体时，宿主生物可以例如在具有含底物培养基的微量滴定板中或在含底物的琼脂平板上进行培养，并且功能突变体的存在(任选在裂解宿主生物以允许与培养基接触后)可以通过例如底物反应后的显色反应指示。在此方面，可以使用自动化系统(例如，移液机器人用于微量滴定板，筛选机器人、用于在琼脂平板上鉴定菌落的图像识别系统)，以使得高流通量筛选成为可能。表达具有在很大程度上与所需性质相应的性质的功能突变体的宿主生物的相关基因可以接受另一轮突变。另一方面，突变和选择或筛选步骤可以反复重复，直至存在的功能突变体具有足够程度的所需性质。

尽管许多突变在蛋白质序列内的插入更可能导致功能丧失而不是所需功能的获得或改善，但是使用重复性操作，可以实现对具有所需性质的蛋白质的靶向筛选。在该重复性操作的范围内，可以从参考蛋白质例如野生型蛋白质开始，基于其核苷酸序列制备具有突变的基因文库。为此，选择核苷酸水平的突变率，使得在突变核酸表达后，在翻译的肽或蛋白质中仅仅相对少数的氨基酸，例如1-3个氨基酸，已突变。筛选所获得的突变肽或蛋白质，得到具有所需性质的代表(例如，对于一种或多种底物的更高催化活性，扩展的或改变的底物谱，在增加或改变的温度或pH值下或在特定溶剂中改善的稳定性)。基于发现的具有所需性质(这可能仅是轻微的)的肽或蛋白质的序列，构建第二个基因文库，其中再一次引入相对小的突变率，并且再次就所需性质筛选由其翻译的蛋白质。构建突变基因文库和就所需性质筛选基因表达的肽或蛋白质的这个循环可以根据需要重复多次。一方面，因为每个循环使用的低突变率，避免了由于氨基酸序列中太多突变而造成的基本上所有蛋白质都丧失功能；另一方面，通过突变和选择的反复重复，可以积累有利的突变并且由此最终存在成功制备具有所需的极大改善性质的蛋白质的良好前景。此外，通过对具有改善性质的突变体的序列分析，技术人员可以获得指示肽或蛋白质的哪些序列位置或序列区域对于所需性质是重要的序列信息。基于这种信息，本领域技术人员可以有意识地在这些位点上或在这些区域中放入突变，并且相应获得具有所需性质的更加靶向的突变体。关于产生具有所需性质的蛋白质的文献的例子也可以参见Zhao和Arnold，Protein Engineering 12：47-53(1999)或May等人，Nature Biotechnology 18：317-320(2000)中的描述，由其中也可以看出产生突变的相关方法。

根据本发明，其他“功能突变体”包括具体公开的酯酶的同源物。例如根据Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法计算，该同源物与具体公开序列之一可以具有至少40％或至少50％、或至少60％，例如至少75％或特别是至少85％，例如90％、95％或99％同源性。根据本发明的同源多肽的同源性百分比尤其是指，相对于本文具体描述的氨基酸序列之一的总长度，氨基酸残基的同一性百分比。

根据本发明，如果未给出其他信息，那么“衍生的”氨基酸序列意指与起始序列具有至少80％或至少90％，特别是约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的序列。例如，本发明涉及衍生自此处公开的所有氨基酸序列的氨基酸序列。

2个序列之间的“同一性”或“同源性”意指在每种情况下在全序列长度上的氨基酸残基的同一性，例如同一性可以使用来自Informax公司(美国)的Vector NTI Suite 7.1软件，使用clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2)：151-1)，通过比较计算，其中设置下述参数的：

多重比对参数：

配对比对参数：

需要时，这些值可以由本领域技术人员就待比较的具体序列加以进一步改变。

在可以蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的功能突变体包含上述类型蛋白质的去糖基化或糖基化形式以及可通过改变糖基化模式而获得的修饰形式。

根据本发明描述的酯酶或其功能突变体的同源物可以通过筛选突变体例如截短突变体的组合库加以鉴定。例如，肽变体库可以通过在核酸水平上的组合诱变产生，例如通过酶促连接合成的寡核苷酸混合物而产生。存在可以用于由简并寡核苷酸序列产生潜在同源物库的许多方法。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中执行，并且合成的基因随后可以连接到合适的表达载体内。一组简并基因的使用使得能够在一个混合物中提供编码所需的一组潜在蛋白质序列的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.3：323；Itakura等人(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。

在构成本发明基础的研究的范围内，本发明人惊奇地发现聚丙烯酸酯即聚合物底物的酯键可以被酯酶断裂。可以使用来自各种生物的酯酶，并且下述可以被提及作为非限制性例子：伯克霍尔德氏菌属(例如，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、B.th ailandensis、洋葱伯克霍尔德氏菌、B.aurantiaca、越南伯克霍尔德氏菌、B.dolosa、B.multivorans、B.ambifaria)、标桩菌属(例如橙色标桩囊菌)、链霉菌属(例如生二素链霉菌、天蓝色链霉素)、糖多孢菌属(例如红色糖多孢菌)、分枝杆菌属(例如耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌)。

对于执行根据本发明的方法优选的酯酶是EC类别3.1中作用于酯键的酶，特别是羧酸酯水解酶(EC 3.1.1)。羧酸酯酶、三酰基甘油脂肪酶和角质酶是特别优选的。家族VIII的酯酶(特别是根据SEQ ID NO：1的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的酯酶B及其功能突变体)和C型酯酶(特别是根据SEQ ID NO：2的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的酯酶C及其功能突变体)代表进一步的优选实施方案。可使用的酯酶的其他非限制性例子是根据SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36的序列，基于其又可以产生或衍生出功能突变体。

在本发明的范围内，因此还生产了已知酯酶的功能突变体，该突变体也可以在根据本发明的方法中使用，并且此外-任选在从生产功能突变体的微生物中分离后-其自身也属于本发明的部分。

这些功能突变体特别涉及相对于已知野生型具有改变的氨基酸序列的酯酶，其中新酯酶由该改变的序列提供，其中任选地聚合物底物对催化活性位点的接近是可以的或得到促进，和/或酯酶的稳定性得到增加，例如在特定pH值下或在多种溶剂或溶剂混合物中的稳定性得到增加，由此，本发明涵盖例如这样的酯酶的功能突变体，其中阻止或阻碍底物接近活性位点的结构元件，例如环，被改变或去除。在根据SEQ ID NO：1的酯酶(来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的EstB)的情况下，用于环缩短的合适区域是例如区域Glu246-Arg 258和Gly312-323。在这种情况下，环缩短可以通过去除一个或多个氨基酸来执行，并且在去除几个氨基酸的情况下，再一次可以去除SEQ ID NO：1中相邻或非相邻位置的一个或多个氨基酸。本发明进一步涉及酯酶的功能突变体，其中进入催化活性位点(也称为活性中心)的通路，例如可以是隧道、漏斗、构槽或裂隙形状，使得酯酶更易接近周围的分子。这可以例如通过如下方式实现：去除作为催化活性位点的进入通路的组成成分的具有大侧链的氨基酸，或用具有较小侧链的氨基酸替换之(例如，用甘氨酸替换丙氨酸，用丙氨酸或甘氨酸替换缬氨酸，用缬氨酸替换亮氨酸等)。由此，聚丙烯酸酯(具有大空间填充的大分子)的部分区域对于催化中心的空间接近成为可能或得到促进。鉴于聚丙烯酸酯的电荷携带(可以因仍存在游离羧基基团而具有负电荷)，这也可以通过用中性或碱性氨基酸交换在活性位点进入区域中的酸性氨基酸来实现。就可以例如由于碱性基团置换酯的醇组分而具有正电荷的聚丙烯酸酯而言，可以相应地通过用较少碱性，任选中性，或酸性氨基酸交换催化活性位点的进入区域中的碱性氨基酸，而实现或促进对催化活性位点的接近。例如，用具有较小侧链的氨基酸交换后应改善对于活性位点的接近的适宜氨基酸，在SEQ ID NO：1的情况下，是Tyr181、Trp348和Trp149。对于SEQ IDNO：2，例如Leu163、Val213和Pro168是用于此的可能氨基酸，并且特别在Pro168的情况下，交换成Ala或Gly还可以增加相关环的柔性，从而使得可以允许更大的底物。本发明进一步涉及具有增加稳定性的酯酶的功能突变体，例如增加的pH、温度或溶剂稳定性。这种增加的稳定性可以例如通过氨基酸交换来达到，其中伴随该交换，蛋白质分子内的分子内相互作用首次变为可能或得到强化，由此使得蛋白质分子的不稳定环被更好地固定，或使得蛋白质结构域个体获得更佳的内聚力。

相应地，本发明的具体实施方案是根据SEQ ID NO：1的EstB的功能突变体，其中通过或多或少完全缺失环形成氨基酸而去除或缩短了位于催化活性位点上方的环。图1显示了根据SEQ ID NO：1的EstB的分子模型，其中鉴定了2个环位于EstB的催化活性位点和外部环境之间。

相应地，本发明的再一具体实施方案是根据SEQ ID NO：2的EstC的功能突变体。在本发明的范围内，使用了EstC的结构模型，基于此产生了功能突变体。在此方面，本发明人鉴定了排列在催化活性位点进入通路上的蛋白质区域。接下来，通过定点诱变，有意识地改变SEQ ID NO：2的单个或几个氨基酸，以便加宽通路和提供对大的聚合物底物的更佳接近。Phe138(即，在氨基酸位置138上的苯丙氨酸)被鉴定为排列在活性位点进入通路上的氨基酸(图2)。由图2可以看出，Phe138的侧链位于催化活性位点的Ser112、Asp242和His275氨基酸与蛋白质的外部环境之间。考虑到丙氨酸的较小侧链基团，用丙氨酸替换Phe138(Phe138Ala)，从而促进大尺寸底物分子例如聚丙烯酸酯对于催化活性位点的接近(与图5中的突变1K22对应)。因为疏水性氨基酸由另一个疏水性氨基酸替换，位置138上的蛋白质表面的理化性质基本上保持相同。根据本发明，Leu193被鉴定为阻碍接近催化活性位点的另一个氨基酸(图4)，并且在一个实施方案中，由丙氨酸替换(与图5中的突变2K20对应)。可以提及的另一个例子是Thr188，其位于催化活性位点进入通路的边缘，并仍可以一定程度地影响底物分子的进入(图4)。根据一个实施方案，Thr188由丝氨酸替换，例如在三重突变Phe138Ala、Leu193Ala，Thr188Ser中(图4)。本发明涵盖这些突变或图5中所示突变的任何组合。同样在与EstC同源的蛋白质的情况下，本领域技术人员也能够使用上述操作确定用于氨基酸交换的合适位置。例如，使用来自Sybly(St.Louis，MO，美国)的″Tripos″软件，可以将此处公开的EstC结构和具有相似3D结构的酯酶叠置，随后确定合适位置，因此本发明并不限于此处具体公开的蛋白质和突变。

3.核酸

本发明还涉及上述功能酯酶突变体的编码核酸序列，例如特别是根据SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：57的核酸序列。

根据本发明的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以以本身已知的方式，自核苷酸结构单元通过化学合成而生产，例如通过片段缩合重叠的互补双螺旋核酸结构单元个体。寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，第896-897页)进行。合成的寡核苷酸的增添、和使用DNA聚合物的Klenow片段的缺口填平、以及连接反应和一般克隆方法在Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述。

根据本发明，除非另有说明，否则“衍生的”核酸序列意指与起始序列具有至少80％或至少90％，特别是约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的序列。本发明涉及例如衍生自此处公开的核酸序列的所有核酸序列。

2个核酸之间的“同一性”指，在每种情况下在核酸全长上的核苷酸同一性，特别是使用来自Informax公司(美国)的Vector NTI Suite 7.1软件使用clustal方法通过比较(参见上文)确定的同一性。

本发明还涉及编码上述酯酶及其功能突变体之一的核酸序列，其可以例如使用人工核苷酸类似物获得。

本发明涉及编码根据本发明的酯酶或其酶学活性片段的分离的核酸分子，也涉及可以例如用作杂交探针或引物用于鉴定或扩增根据本发明的编码核酸的核酸片段。

根据本发明的核酸分子可以另外包含来自编码基因区的3′和/或5′-末端的非翻译序列。

“分离的”核酸分子与存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子分离，并且如果它通过重组技术生产，那么还可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或如果它用化学方法合成，那么还可以基本上不含化学前体或其他化学品。

根据本发明的核酸分子可以借助于标准分子生物学技术以及本发明提供的序列信息进行分离。例如，使用具体公开的全序列之一或其片段作为杂交探针和标准杂交技术(如例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A laboratory manual.第2版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989中所述)，cDNA可以从合适cDNA库中分离。此外，包含根据本发明的序列之一或其区段的核酸分子可以使用基于该序列制备的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应而分离。由此扩增的核酸可以克隆到合适载体内，并且可以通过DNA序列分析进行表征。根据本发明的寡核苷酸另外可以通过标准合成方法进行生产，例如用自动DNA合成仪。

本发明进一步包括与具体描述的核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。

基于根据本发明的核苷酸序列，可以产生探针和引物，该探针和引物可以用于鉴定和/或克隆在其他细胞类型和生物中的同源序列。此类探针或引物通常包含核苷酸序列区域，该区域在严格条件下与根据本发明的核酸序列的有义链或相应反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交。

根据本发明的其他核酸序列可以衍生自根据本发明的酯酶的编码序列，并且与之相差单核苷酸或几个核苷酸的一个或多个，例如1-50、1-40、1-30、或1-20，即例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个，添加、置换、插入或缺失，但仍编码具有所需酶活性的酯酶。

本发明还涉及这样的核酸序列，与具体描述的序列比较，其包含所谓的沉默突变，或已根据具体的原始生物或宿主生物的密码子使用而进行了改变，并涉及其天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。还涉及可通过保守核苷酸置换(即，所讨论的氨基酸用相同电荷、大小、极性和/或可溶性的氨基酸替换)获得的序列。

本发明还涉及由于序列多态性而自具体公开的核酸衍生的分子。这些遗传多态性可以由于天然变异而存在于群体内的个体之间。这些天然变异通常在基因的核苷酸序列中造成约1-5％的变异。

此外，本发明还包含与上述编码序列杂交或与之互补的核酸序列。这些多核苷酸可以通过检查基因组或cDNA文库来发现，并可以任选地借助于PCR用合适引物由其扩增，并且随后例如用合适探针分离。另一种可能方案是用根据本发明的多核苷酸或载体转化合适微生物，扩增微生物和由此扩增多核苷酸，并随后分离之。此外，根据本发明的多核苷酸还可以用化学方法合成。

能够与多核苷酸“杂交”的性质意指，多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与几乎互补序列结合的能力，而在这些条件下非互补配偶体之间的非特异性结合不发生。为此，序列应70-100％，特别是90-100％，例如95％、96％、97％、98％或99％互补。互补序列能够彼此特异性结合的该性质可以用于例如RNA或DNA印迹中或PCR或RT-PCR中的引物结合中。通常，对此，使用寡核苷酸，长度从30个碱基对开始。“在严格条件下”意指，例如在RNA印迹中，在50-70℃、优选60-65℃，使用洗涤溶液，例如具有0.1％SDS的0.1x SSC缓冲液(20x SSC：3M NaCl，0.3M Na-柠檬酸盐，pH7.0)，用于洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核苷酸。如上所述，仅高度互补的核酸仍保持彼此结合。严格条件的建立是本领域技术人员已知的，并且例如在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。

4.表达构建体和载体

本发明进一步涉及在调节核酸序列的遗传控制下含有编码根据本发明的酯酶或功能突变体的核酸序列的表达构建体；和包含至少一个所述表达构建体的载体。

优选地，根据本发明的所述构建体包含位于相应编码序列的5′-上游的启动子和位于相应编码序列的3′-下游的终止子序列和任选地其他常见调节元件(在每种情况下均与编码序列可操作地连接)。“可操作地连接”意指启动子、编码序列、终止子和任选地其他调节元件以这样的方式顺次排列，从而使得调节元件各自在编码序列的表达中可以实现其预期功能。可操作地连接的序列的例子是靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等。其他调节元件包含选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。

除人工调节序列外，天然调节序列仍可以存在于实际结构基因前面。通过遗传改变，这种天然调节可以被关闭，并且基因的表达可以得到增加或减少。然而，基因构建体也可以具有更简单的结构，即在结构基因前不插入另外调节信号，并且不去除天然启动子以及其调节作用。相反地，可以使天然调节序列突变，从而使得不再存在任何调节作用，并且基因表达得到增加或下降。核酸序列可以以一个或多个拷贝包含在基因构建体中。

可用启动子的例子是：cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、λ-PR-或λ-PL启动子，其有利地应用在革兰氏阴性菌中；以及革兰氏阳性启动子amy和SPO2，酵母启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH，或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not或遍在蛋白或菜豆蛋白启动子。诱导型启动子例如光和特别地温度诱导型启动子例如P_rP_l-启动子的使用是特别优选的。原则上所有天然启动子与其调节序列都可以使用。此外，也可以有利地使用合成启动子。

上述调节序列应允许核酸序列以及蛋白质的靶向表达。这可以意味着，例如依赖于宿主生物，基因仅在诱导后表达或超表达，或它可以立即表达和/或超表达。

调节序列或因子可以优选对表达具有正面影响，并且因此促使其增加或减少。因此，调节元件的增强作用可以有利地在转录水平上发生，例如通过使用强转录信号例如启动子和/或“增强子”。此外，翻译的增强也是可以的，例如通过改善mRNA的稳定性。

可以通过使合适启动子与合适编码核苷酸序列和终止子或多腺苷酸化信号融合，生产表达盒。常见的重组和克隆技术可以用于此，如例如在下述中描述的：T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)。

为了在合适宿主生物中表达，可以将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异性载体内，从而使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。载体是本领域技术人员众所周知的，并且可以例如从″Cloning Vectors″(Pouwels P.H.等人，编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中知晓。载体应理解为，除质粒外，还包括本领域技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体，病毒例如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，质粒，粘粒，和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或可以随染色体复制。

作为合适表达载体的例子，可以提及：

通常的融合表达载体，例如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白或蛋白A融合到重组靶蛋白质上。

非融合蛋白表达载体，例如pTrc(Amann等人，(1988)Gene69：301-315)和pET 11d(Studier等人Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。

用于在酵母酿酒(S.cerevisiae)中表达的酵母表达载体，例如pYepSec1(Baldari等人，(1987)EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适合于在其他真菌例如丝状真菌中使用的载体和载体构建方法包括在下述文献中详细描述的那些：van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)″Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi，in：AppliedMolecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等人，编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge。

可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包含pAc系列(Smith等人，(1983)Mol.Cell Biol.，3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

植物表达载体，例如在下述文献中详细描述的那些：Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)″New plant binaryvectors with selectable markers located proximal to the left border″，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)″BinaryAgrobacterium vectors for plant transformation″，Nucl.Acids Res.12：8711-8721。

哺乳动物表达载体，例如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6：187-195)。

用于原核和真核细胞的其他合适表达系统在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular  Cloning：A  laboratorymanual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16和17章中描述。

5.重组宿主生物

借助于根据本发明的载体，可以生产重组生物，其已例如转化了根据本发明的至少一个载体，并且可以用于生产根据本发明的结构域或多肽。有利地，将上文描述的根据本发明的重组构建体插入合适宿主系统内且表达。优选地，使用本领域技术人员已知的常见克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、化学转化、逆转录病毒转染等，以造成所述核酸在特定表达系统中的表达。合适系统例如在Current Protocols inMolecular Biology，F.Ausubel等人，Eds.，Wiley Interscience，New York1997或Sambrook等人Molecular Cloning：A laboratory manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。

作为宿主生物，原则上可以表达根据本发明的核酸、其等位基因变体、其衍生物(编码功能突变体或其衍生物)的所有生物都是合适的。宿主生物是例如细菌、真菌、酵母、植物或动物细胞。优选生物是细菌，例如埃希氏杆菌属(Escherichia)细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或伯克霍尔德氏菌属的那些细菌，真核微生物，例如酿酒酵母、曲霉菌属(Aspergillus)，来自动物或植物的高等真核细胞，例如Sf9、CHO或HEK293细胞；并且在本发明的范围内，来自高等真核生命形式例如动物或植物的细胞个体或已聚集或生长成细胞簇聚物的所述细胞也称为微生物。

对成功转化的生物的选择可以借助于也包含在载体或表达盒中的标记基因来实现。标记基因的例子是有关抗生素抗性的基因和有关催化显色反应从而导致转化细胞的染色或发荧光的酶的基因。随后可以通过自动细胞分选进行选择。被携带相应抗生素抗性基因(例如G418或潮霉素)的载体成功转化的微生物可以用含有相应抗生素的培养基或培养营养素进行选择。在细胞表面上呈现的标记蛋白质可以借助于亲和层析用于选择。

本发明进一步涉及重组生产本发明的酯酶或其功能性酶学活性片段的方法，包括培养生产酯酶的重组宿主生物，任选诱导酯酶表达和从培养物中分离酯酶。如果需要，也可以以这种方式以工业规模生产一种或多种酯酶。

重组宿主可以通过已知方法进行培养和发酵。细菌可以例如在TB或LB培养基中并且在20-40℃和pH 6-9生长。合适培养条件在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A laboratorymanual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中详细描述。

随后，如果酯酶不分泌到培养基中，那么可以裂解细胞并且通过已知蛋白质分离技术从裂解物中获得该产物。细胞可以任选通过下述方式破坏：高频超声，高压，例如在弗氏压碎器(弗氏细胞压碎器)中，渗透裂解(osmolysis)，利用去污剂、裂解酶或有机溶剂的作用，借助于匀浆器，或通过列出方法中的几种的组合。

酯酶可以用已知层析方法纯化，例如分子筛层析(凝胶过滤)、例如Q-琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析，以及使用其他通常方法例如超滤、结晶化、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适方法例如在Cooper，F.G.，Biochemical Procedures，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中描述。

特别合适的是使用利于分离重组酯酶的载体系统或寡核苷酸；这些可以通过规定的核苷酸序列加长cDNA且因此编码改变的多肽或融合蛋白，其中所述核苷酸序列可以例如简化纯化。这类合适的修饰是例如充当锚的所谓的“标签”，例如称为六组氨酸锚的修饰，或可以由抗体识别为抗原的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。这些锚可以用于使肽附着于固体载体例如聚合物基质，所述基质可以例如在层析柱中用作填充物，或可以在微量滴定板或某些其他载体上使用。

同时，这些锚也可以用于酯酶的识别。对于酯酶的识别，还可以采用通常标记，例如荧光染料、与底物反应后形成可检测反应产物的酶标记，或放射性标记，其可以单独地或与锚组合用于衍生化酯酶。

6.反应器

根据本发明的方法可以在本领域通常的反应器中、以各种规模，例如以实验室规模(几毫升至若干升)或工业规模(数升至数千立方米)实施。如果酯酶以分离的、或多或少纯化的酶形式使用，那么可以使用化学反应器。如果根据本发明使用的酯酶由微生物产生并且任选地释放至反应介质中由此使得酯酶断裂可以在那里发生，那么可以使用生物反应器(发酵罐)，其中，除了提供适用于酯断裂的方法条件，还必须提供合适酯酶生产微生物的生活条件(例如，提供合适的营养培养基和pH，合适温度、供应氧或其他气体、抗生素等)。生物反应器因此适合于通过全细胞系统制备酯酶，在其中培养活微生物(例如原核细胞例如细菌或古细菌，或真核细胞例如酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞)。本领域技术人员熟悉反应器使用的各个方面，例如化学或生物技术方法从实验室规模到大规模工业生产的扩大和方法变量的最佳化，并且可以任选参考相关技术文献(关于生物技术方法，例如Crueger and Crueger，Biotechnologie-Lehrbuch derangewandten Mikrobiologie [Biotechnology-textbook of appliedmicrobiology]，第2版，R.Oldenbourg Verlag，Munich，Vienna，1984)。

7.反应产物

本发明还涉及通过根据本发明的方法获得的反应产物。反应产物可以与本发明方法中使用的反应混合物存在于一起，或可以部分或充分纯化。合适的纯化程度可以按需要且根据进一步用途由本领域技术人员常规地确定，并且包括例如化学纯或分析纯。用于纯化的合适方法是本领域技术人员已知的，并且包含例如沉淀和层析方法。

依赖于先前酯断裂的程度，获得的反应产物可以包含聚丙烯酸或部分酯化的聚丙烯酸，该反应产物可以用于例如油漆和涂料中，例如墙漆、涂料(例如用于金属表面，特别是汽车工业中)以及颜料和清漆。在造纸工业(例如用于影响可印刷性、外观或光泽)、胶粘剂和密封剂、纺织工业(例如作为粘合剂用于色素着色或印制过程)或皮革工业(例如使得皮革表面疏水)中存在其他应用。进一步的用途包括生产纺织品和玻璃纤维，用于地板、车或鞋抛光，用于水凝水泥、灰浆或混凝土的添加剂。聚丙烯酸酯也用于植物保护以及肥料扩散中以及用作离子交换器的基质。关于聚甲基丙烯酸酯(即聚(甲基丙烯酸甲酯))的应用特别包括所谓的丙烯酸玻璃以及用于石油工业的添加剂，用于分散体的增稠剂、和用于化妆品工业中。聚甲基丙烯酸酯也用作牙科中的假体，用作手术中的骨水泥和用作控释型片剂中的药物赋形剂。

用根据本发明的方法，特别可以制备区域特异性修饰的聚合物。惊奇地发现，对于以这种方式选择性修饰的聚合物，与化学方法比较，通过使用仅引起聚合物分子的末端酯基团水解断裂而不引起聚合物分子内更深的酯基团水解断裂的酶，可以相对简单地生产。

本发明现在将参考下述非限制性实施例更详细地说明。

实验部分

实施例1：EstC基因库的产生

用来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的突变型EstC(SEQ ID NO：51)产生基因文库，以便获得EstC的功能突变体。通过随机诱变将突变引入EstC内，其中，质粒pMSP1.17根据方案在易错PCR中用作模板，并且使用GeneMorphII随机诱变试剂盒(Stratagene)，将序列错误引入PCR扩增的EstC基因内。Lit：Instruction Manual GeneMorph

II RandomMutagenesis Kit(Cat#200550)。接下来，用Promega Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统根据方案纯化PCR扩增的基因，并且在来自Fermentas的缓冲液R中用限制性酶NdeI和HindIII切割。独立于此，用相同限制性酶消化作为载体-DNA的质粒pMS470A8(Balzer等人，Nucleic AcidsResearch，1992，第20卷，No.8，1851-1858)，并且在限制性酶的热灭活(80℃，20分钟)后，用来自Fermentas的1μl小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)在37℃脱磷酸化1小时。将总DNA应用于琼脂糖凝胶上，切下相应的载体部分，并且用来自Promega的Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统根据方案纯化。随后用来自Fermentas的T4DNA连接酶，将载体-DNA和所产生的插入片段在20℃连接1小时。随后用来自Promega的Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统纯化连接产物，脱盐，通过电穿孔(2.5kV)在80μl中以质粒DNA各2μl借助来自BioRad的Micropulser^TM转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞内。在电休克后，立即向细胞加入1ml SOC培养基中，并且在Eppendorf″Thermomixer comfort″中以37℃和550rpm复苏35分钟。根据″Current Protocols in Molecular Biology″1.8.4产生感受态细胞。在LB-Amp板(100μg/ml)上选择转化的克隆，在上述选择板上划线培养10个转化体，并且利用来自Qiagen的QIAprep

Spin Miniprep试剂盒制备质粒。用上述限制性酶消化分离的质粒，并且通过琼脂糖凝胶电泳证实正确大小的插入片段的存在。此外，通过测序确定突变率。

实施例2：通过定点诱变生产突变型EstC变体

定点诱变使用了来自Stratagene的″QuickChange Multi-Site-directedKit″(目录号#200514和#100515)，该试剂盒提供了一种可以用于同时在高达5个位点上定点诱变质粒DNA的快速而可靠方法。使用双链DNA模板，每个单位点的突变需要单个诱变寡核苷酸。使用了根据QuickChangeMulti-Site-directed Kit方案中的建议设计且由Invitrogen合成的下述诱变寡核苷酸引物，其中产生的突变在括号中显示：

SEQ ID NO：39：

(Phe138Val)  5’-gctgctcttgtatatcttgctgcggtcatgcctgc-3’

SEQ ID NO：40：

(Phe138Ala)  5’-gctgctcttgtatatcttgctgcggccatgcctgc-3’

SEQ ID NO：41：

(Glu154Ala)  5’-gtaagagcaccagcaaaccatggcgaaatgctggc-3’

SEQ ID NO：42：

(Leu163Ala)  5’-ctggcctcggcgatctgcgccagccct-3’

SEQ ID NO：43：

(Leu189Ala)  5’-cggcctatctcgccacggcgaagca-3’

SEQ ID NO：44：

(Leu189AlaLeu193Ala)  5’-gccacggcgaagcaggcggcgttcgaggatgttga-3’

SEQ ID NO：45：

(Leu193Ala)  5’-gcaggcggcgttcgaggatgttgac-3’

SEQ ID NO：46：

(Val150Ala)  5’-gtacctggtcttgattacgcgagagctcct-3’

SEQ ID NO：47：

(Thr188Ser)  5’-gcctatctcgcctcgctgaagcagg-3’

SEQ ID NO：48：

(Leu160Ala)  5’-cgaaatggcggcctcgctgatctgc-3’

SEQ ID NO：50：

(Thr188AlaLeu189AlaLeu193Ala)  5’-tatctcgcctcggcgaagcaggcggcgttcgagga-3’

对于定点诱变，采用用于DNA小量制备的通常方案(来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit)产生双链DNA模板。随后，根据下面的方案，制备通过PCR合成突变链的反应混合物，按在该方案中显示的次序将各组分加入反应容器中，并且随后混合：

实验反应：

2.5μl 10xQuikChange多反应缓冲液

2.0μl ds-DNA模板：pMS470[EstC](50ng)

1.0μl dNTP-混合物

1.0μl QuikChange多酶混合物

xμl诱变引物(当使用1-3种引物时，加入每种引物各约100ng，当使用4-5种引物时，加入每种引物各约50ng)

xμl重蒸H₂O用于25μl的终体积

对照反应：

2.5μl 10xQuikChange多反应缓冲液

18.5μl重蒸H₂O

1.0μl(50ng/μl)QuikChange多对照模板

1.0μl QuikChange多对照引物混合物(每引物100ng/μl)

1.0μl dNTP-混合物

1.0μl QuikChange多酶混合物

使用下表1中给出的参数执行反应，对于对照反应，使用8分钟的时间用于链合成：

表1：

随后将1μl限制性酶DpnI分别加入相应扩增反应的各反应混合物中。通过以移液管吸取且排放数次，将每一反应混合物都小心且彻底地混合。接下来，在微量离心机中离心反应混合物1分钟，并且随后立即在37℃温育1小时，以便消化亲本(未突变的)双链DNA。

接下来，在用Promega Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统根据方案纯化后，获得纯化的PCR片段，并且在缓冲液R(Fermentas)中用限制性酶NdeI和HindIII消化，并且通过实施例1中所述操作，连接到也用限制性酶NdeI和HindIII切割的载体pMS470Δ8内。

根据制造商的说明书(Stratagene)执行XL10-Gold Ultra感受态细胞的转化。

对于每个转化反应，根据表2中的信息将合适体积铺到LB_amp板上。对于诱变的对照，将细胞铺到已用80μg/ml X-gal和20mM IPTG制备的LB_amp板上。

表2

反应类型	在板上的体积
		实验诱变	1μl、10μl和100μl
诱变对照	10μl

随后转化板在37℃温育过夜。

来自诱变对照转化的预期菌落数目是50-800个菌落。超过50％来自诱变对照转化的菌落应具有所有3个突变，并且在含IPTG-和X-gal的琼脂板上应显示为蓝色菌落。来自实验诱变转化的预期菌落数目是10-1000个菌落。在已达到菌落的预期数目后，在LB_amp-IPTG板(0.2mM IPTG)上划线培养约150个转化体，并且在37℃温育过夜。

实施例3：通过过滤测定法检测活性

就断裂具有酯键的底物的能力，研究了在实施例2中制备的EstC突变体。为此，在每种情况下，将相应质粒转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)内。首先用乙酸α-萘基酯测试了具有相同突变的10个菌落。

a)用Fast Blue B针对萘醇酯的断裂的颜色试验

为此，以设定模式在LB-amp-IPTG板(100μg/ml氨苄青霉素，0.2mMIPTG)上划线培养这些菌落和阳性对照EstC、EstB和阴性对照大肠杆菌BL21[pMS470Δ8]，并且温育过夜。随后用无菌滤纸(Whatman，目录号1001-085)从琼脂板上移下细胞菌落，滤纸在37℃干燥10分钟。在室温用500μl Bug Buster(Novagen)将细菌细胞消化25分钟，并且随后用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)平衡滤膜10分钟。对于用乙酸α-萘基酯的测试，5ml缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.0)与100μl底物溶液(在丙酮中的10mg/ml乙酸α-萘基酯)和100μl染料溶液(在H₂O中的10mg/ml Fast BlueB盐)在玻璃培养皿中混合，浸泡滤膜。紫红色显色的形成指示酯酶的活性。

b)pH迁移试验

在每种情况下，对底物乙酸α-萘酯最具活性的克隆，在底物聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚丁基丙烯酸酯(PBA)以及2，4-二甲基戊二酸-二甲酯(DG)和2，4-二甲基戊二酸-二丁酯(DB)上进行测试。为此，如上所述，使菌落在琼脂板上生长，并且如实施例3a中所述，转移到滤纸上。

对于底物溶液的制备，首先制备筛选溶液，这包含400μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.0)、800μL aqua dest.，500μL DMSO、750μL酚红(10g/l)和400μL NaOH(0.1M)。对于用DG和/或DB的pH迁移试验，在每种情况下使200μl这些底物溶解于9.5ml筛选溶液中，并且用由此制备的1ml底物溶液浸渍上文制备的滤膜。对于用底物PMA和/或PBA的pH迁移试验，在每种情况下将这些底物吸加到干膜上，用1ml筛选溶液浸渍具有裂解的细胞菌落的上文制备的滤膜，并且将滤膜放在具有底物的膜上。在RT温育后，测定由酯断裂后酸性基团的形成引起的从红色到黄色的变色。变色可以在约20分钟后进行检测。

使用的菌落的活性显示于图5中，使用下述符号：

+++：非常高活性的

++：活性的

+：弱活性的

o：无活性的

实施例4：制备含酯酶的粗细菌裂解物

为了生产含酯酶的粗细菌裂解物，首先用细菌菌落接种在100ml锥形瓶中含有100μg/ml氨苄青霉素(下文：LB_amp)的30ml LB培养基作为预培养物，在摇床上在37℃以180rev/分钟培养过夜。随后对于主培养物，用预培养物的等分试样接种500ml培养基[2xTY(10g/L酵母提取物、16g/L胰蛋白胨、5g/L NaCl)]至OD₆₀₀0.1，并且在30℃培养直至达到OD₆₀₀0.5-0.8。随后用0.1mM IPTG诱导表达，并且在28℃温育16小时。细菌培养物随后在4℃在1000-ml离心管中以4000rev/分钟(＝3062xg)离心30分钟，并且每种情况下将沉淀物悬浮于20ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7)中。使用Branson Sonifier 250，将占空因数设在50％，将电力控制设在水平5，通过5分钟超声处理、随后1分钟暂停、再5分钟超声处理，裂解细胞。获得的裂解产物以40000rev/分钟(＝117734xg)离心1小时，使用具有0.2μm孔径的膜进行无菌过滤，并且贮存于-20℃直至使用。

实施例5：酶活性的标准化

如实施例4中制备的粗裂解物在光度测定试验中用于断裂对硝基苯基丁酸酯(p-NPB)(此外，技术人员基于其技术知识能够开发基于其他合适底物，例如对硝基苯基乙酸酯p-NPA，的测定试验)。在用于测定对于对硝基苯基酯的酯酶活性的该试验中，980μl缓冲液(1M Tris缓冲液，pH7.0)与10μl酶溶液(或用1M Tris缓冲液pH 7.0稀释的酶溶液)在比色杯中混合。反应用10μl底物溶液(在DMSO中的400mM对硝基苯基酯)开始，并且在Beckmann UV分光光度计中在405nm波长下监控对硝基苯酚的增加。

ε＝(对硝基苯酚)11.86mM^-1cm^-1(在pH 7.0确定的)

用于计算活性的公式：

1单位(U)酯酶相应于在该试验中导致1μmol/分钟转换的量。

实施例6：检测酶催化的断裂

为了区分酶催化的底物断裂和化学底物断裂，根据实施例4制备菌株NJ70(含有来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的酯酶B的功能突变体，EstB_NJ70，根据SEQ ID NO：4)的粗裂解物。作为底物溶液，将750μl PBA溶液(CAS No.：9003-49-0，Sigma Aldrich，在甲苯中25-30重量％)(等价于1.75mmol单体酯基团)加入35ml母混合物(340ml 0.9％NaCl、220ml甲苯、70ml Emulgen(在H₂O中的10％溶液，pH 7，Emulgen 913，Batch2265，Kao Chemicals，Osaka Japan，可替代地可以使用来自Aldrich的Tergitol NP-9)中，用10mM NaOH溶液将溶液的pH调整至10。随后加入500μl粗裂解物(根据实施例5中建立的标准，等价于1000单位)，并且通过加入10mM NaOH补偿因酯键断裂过程中释放的酸性基团导致的pH下降。对于化学自分解的测定，在独立测定试验中，加入500μl粗裂解物，其中的酶通过在80℃煮沸30分钟而变性。结果显示于图6中。在加入活性酶后，由于释放的酸性基团，需要10mM NaOH的大量添加，以使pH维持在10(在图6中具有菱形符号的曲线)。相比之下，添加变性后的酶后，仅有通过化学自分解的轻微酯断裂(在图6中具有三角形的曲线)。紧接在添加具有变性后的酶的粗裂解物后的pH矫正剂(NaOH)消耗的突然增加，可以通过粗裂解物具有7的pH来加以解释。

实施例7：聚丙烯酸对酶催化的断裂的抑制

相应试验在水溶液中类似于实施例6进行，其中酸性基团通过所用底物聚丁基丙烯酸酯(PBA)的酯键的酶催化断裂而形成。这些酸性基团导致pH的下降，这通过加入10mM NaOH补偿。加入的NaOH量因此反映反应过程。所有测量都在35ml反应混合物中在pH＝9.0和37℃温度执行。使用了350单位酯酶EstB_NJ70(SEQ ID NO：4)和750μl PBA溶液(相应于1.75mmol单体酯基团)。10mM NaOH用作滴定溶液。

为了确定可能的产物抑制，在平行测定试验中，在测量开始时，加入850μl 20％Sokalan溶液(Sokalan PA：15(聚丙烯酸，Mw 1200，pH 8.0)，这等价于1.74mmol单体丙烯酸单位。如由图2中所示结果可见，使用的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的酶(SEQ ID NO：1；图7中的WT)及其功能突变体EstB_N27(SEQ ID NO：3)或EstB_NJ70(SEQ ID NO：4)不受Sokalan抑制或仅受Sokalan轻微抑制。

实施例8：酶催化的酯断裂对pH的依赖性

类似于实施例6，研究了随着pH的变化，酶催化的酯断裂。如实施例4中所述，制备菌株NJ70(表达功能突变体NJ70，即SEQ ID NO：4)的粗裂解物，并且将等价于1000单位的量加入底物溶液中，所述底物溶液已调整至在5-11范围内的各pH值。为了检测在更高pH值下(在约pH～9.0到pH11.0的范围内)的可能化学自水解，粗裂解物直到10分钟后才加入，并且在任何情况下在加入前都没有观察到pH矫正剂(NaOH)的显著消耗。由图8中所示结果可以看出，酯断裂在pH 5至pH 11范围中发生。

实施例9：酶催化的酯断裂的温度依赖性

如实施例6，在恒定pH 9，研究了酶催化的酯断裂的温度依赖性。如实施例4中所述，制备菌株NJ70的粗裂解物，并且在每种情况下将等价于1000单位的量加入底物溶液中，并且在于10℃-50℃范围的各种温度下自动滴定。作为化学自水解的对照，具有pH 9的底物溶液在所述温度下温育10分钟。在不存在pH改变的情况下(不消耗pH矫正剂)，得出结论：不存在自水解。由图9中呈现的数据可见看出，最适温度在20℃至40℃，特别是在30℃。

实施例10：固定化酯酶的酶活性

35ml母混合物(340mL 0.9％NaCl溶液、220mL甲苯和70mL Tergitol(在H₂O中10％))含有2ml PBA溶液(Sigma Aldrich，Mw 99000，在甲苯中25-30重量％)(等价于4.66mmol单体酯基团)，调整至pH 9，并且保持在37℃。使3.6ml含有EstB_NJ70的粗裂解物与0.5g Eupergit C250L(Aldrich)和30ml 0.5M K₂HPO₄缓冲液(pH 9.5)一起在室温旋转48小时。随后吸出上清液，并且用0.1M Tris缓冲液(pH 7.0)洗涤该基质材料。

根据Bradford的蛋白质测定，显示86％的蛋白质已与载体结合。50单位EstB_NJ70、50单位固定在Eupergit上的EstB_NJ70、50单位固定在Eupergit上且变性的EstB_NJ70、或相应量不含固定化酶的Eupergit，各自加入35ml上述反应混合物中。通过加入10mM NaOH补偿pH。如图10中所示，添加2种对照(不含EstB_NJ70或含变性EstB_NJ70的Eupergit)时，观察到酸性基团的轻微释放。相比之下，EstB_NJ70或固定化EstB_NJ70的添加导致了大得多的酸性基团释放，其中在EstB_NJ70情况下反应过程相应于饱和曲线，具有相当高的初始反应速度且后来减慢，而在固定化EstB_NJ70的情况下反应过程具有最初较慢的速度，但随后在测量期间中保持恒定。

实施例11：对于短链和长链底物的酯断裂

在每种情况下，将35ml实施例10中所述的反应混合物调整至pH 9.0和温度37℃。随后在每种情况下，加入350单位在图11中所述的酯酶和具有分子量30000的短链PMA(Sigma Aldrich)(图11中的PMAshort)或具有分子量40000的长链PMA(图11中的PMAlong)，在两种情况下都等价于1.75mmol单体酯基团。反应进行到直至平衡建立(图6)或所述时间段(图11)。由于酯断裂引起的pH下降通过加入10mM NaOH补偿，在图11中，由NaOH的消耗计算了水解的酯基团的百分比。由图11可以看出，短链和长链PMA都被酶促断裂。在变性后的酶的情况下(图11中的NJ70_den)，矫正剂(NaOH)消耗的变化可以通过相应组分在反应混合物中的加入而加以解释，因为反应混合物不具有任何缓冲能力，从而使得即使微小量的具有不同pH的溶液都会影响总体pH。

特此明确参考本说明书中引用的出版物的公开内容。

对SEQ ID NOs和所使用的菌株名称的综述

SEQ ID NO：1

来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的EstB的蛋白质序列(野生型)

SEQ ID NO：2

来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的EstC的蛋白质序列(野生型)

SEQ ID NO：3

突变的蛋白质序列(内部名：N27；EstB_N27)，其中，相对于野生型EstB(SEQ ID NO：1)，进行了下述氨基酸交换：

Ser17Leu；Gly132Ser；Glu251Gly；Ala311Val；Glu316Lys

SEQ ID NO：4

突变的蛋白质序列(内部名：NJ70；NJ_70；EstB_NJ70)，其中，相对于野生型EstB(SEQ ID NO：1)，进行了下述氨基酸交换：

Pro8Leu；Gly132Ser；Trp134Arg；Arg155Cys；Glu251Gly；Ala311Val；Glu316Lys

SEQ ID NO：5

来自特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶

SEQ ID NO：6

来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B

SEQ ID NO：7

来自Burkholderia ambifaria的酯酶(内部名：A0TF86_9BURK@1)

SEQ ID NO：8

来自洋葱伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：Q1BK05_BURCA@1)

SEQ ID NO：9

来自洋葱伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A2W245_9BURK@1)

SEQ ID NO：10

来自洋葱伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A0U6R7_9BURK@1)

SEQ ID NO：11

来自洋葱伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A0B440_BURCH@1)

SEQ ID NO：12

来自Burkholderia cepacia的酯酶(内部名：Q0B5R9_BURCM@1)

SEQ ID NO：13

来自Burkholderia dolosa的酯酶(内部名：A2WH69_9BURK@1)

SEQ ID NO：14

来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：ZP_00928253@1)

SEQ ID NO：15

来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：Q629M1_BURMA@1)

SEQ ID NO：16

来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A5XMR0_BURMA@1)

SEQ ID NO：17

来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A3MH33_BURM7@1)

SEQ ID NO：18

来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A1UXM8_BURMS@1)

SEQ ID NO：19

来自Burgholderia multivorans的酯酶(内部名：A0UE35_9BURK@1)

SEQ ID NO：20

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：ZP_0131527(3)1)

SEQ ID NO：21

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：ZP_01209854@1)

SEQ ID NO：22

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：ZP_00893464@1)

SEQ ID NO：23

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：Q3JIF4_BURP1@1)

SEQ ID NO：24

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A4LP64_BURPS@1)

SEQ ID NO：25

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A3PA33_BURP0@1)

SEQ ID NO：26

来自类鼻疽伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A3NPJ8_BURP6@1)

SEQ ID NO：27

来自伯克霍尔德氏菌属物种的酯酶(内部名：Q39BM9_BURS3@1)

SEQ ID NO：28

来自Burkholderria thailandensis的酯酶(内部名：Q2T2Q0_BURTA@1)

SEQ ID NO：29

来自越南伯克霍尔德氏菌的酯酶(内部名：A4JKI4_BURVG@1)

SEQ ID NO：30

来自耻垢分枝杆菌的酯酶(内部名：A0R6Y0_MYCS2@1)

SEQ ID NO：31

来自红色糖多孢菌的酯酶(内部名：A4FPB3_SACEN@1)

SEQ ID NO：32

来自红色糖多孢菌的酯酶(内部名：A4FDC0_SACEN@1)

SEQ ID NO：33

来自红色糖多孢菌的酯酶(内部名：A4F6M6_SACEN@1)

SEQ ID NO：34

来自橙色标桩囊菌的酯酶(内部名：Q096X7_STIAU@1)

SEQ ID NO：35

来自生二素链霉菌的酯酶(内部名：A3KIK7_STRAM@1)

SEQ ID NO：36

来自天蓝色链霉素的酯酶(内部名：NP_630279@1)

SEQ ID NO：37

命名为EstB_Short4(或EstB_N27_Short4)的EstB_N27缺失突变体，其中来自SEQ ID NO：3(EstB_N27)的氨基酸317-319(RGP)被去除

SEQ ID NO：38

命名为EstB_Short5(或EstB_N27_Short5)的EstB_N27缺失突变体，其中来自SEQ ID NO：3(EstB_N27)的氨基酸248-255(PLPGGHGA)由较短序列SLGTT替换

SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：49：

根据实施例2的PCR引物

SEQ ID NO：50

EstB(根据SEQ ID NO：1)的核酸序列

SEQ ID NO：51

EstC(根据SEQ ID NO：2)的核酸序列

SEQ ID NO：52

角质酶(根据SEQ ID NO：5)的核酸序列

SEQ ID NO：53

脂肪酶B(根据SEQ ID NO：6)的核酸序列

SEQ ID NO：54

EstB_N27(根据SEQ ID NO：3)的核酸序列

SEQ ID NO：55

EstB_NJ70(根据SEQ ID NO：4)的核酸序列

SEQ ID NO：56

EstB_N27_Short 4(根据SEQ ID NO：37)的核酸序列

SEQ ID NO：57

EstB_N27_Short 5(根据SEQ ID NO：38)的核酸序列

SEQ ID NO：58

来自巴西橡胶的羟基腈裂解酶(GenBank号AAC49184)

SEQ ID NO：59

来自木薯的羟基腈裂解酶(SwissProt No.P52705)

Claims (24)

1.用于酶催化的聚丙烯酸酯水解的方法，其中

a)制备至少一种聚丙烯酸酯，

b)将该至少一种聚丙烯酸酯与至少一种酶一起温育，以水解断裂所述聚丙烯酸酯中含有的酯基团，其中所述酶选自作用于酯键的酶(EC 3.1)；和任选地

c)分离该经修饰的聚合物。

2.如权利要求1的方法，其特征在于，所述酶选自羧酸酯水解酶(EC3.1.1)，特别是羧酸酯酶(E.C.3.1.1.1)、三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)和角质酶(3.1.1.74)。

3.如权利要求1或2的方法，其特征在于，所述聚丙烯酸酯是均聚物或共聚物。

4.如前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述聚丙烯酸酯是交替共聚物、统计共聚物、梯度共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。

5.如前述权利要求之一的方法，其特征在于所述聚合物包括通式I的单体结构单元

R¹R²C＝CR³-COOR⁴    (I)

其中

R¹、R²和R³可以相同或不同，并且选自H、直链C₁-C₂₀烃基残基和支链C₃-C₂₀烃基残基，并且R⁴选自H、直链C₁-C₂₀烃基残基、支链C₃-C₂₀烃基残基和环状C₃-C₂₀烃基残基，所述烃基残基任选地被一个或多个选自羟基、氨基、环氧基、硫醇基团和卤素原子的相同或不同基团取代，

并且在所述聚合物中，在至少一个式I的单体结构单元中，R⁴不代表H。

6.如权利要求5的方法，其特征在于，除式I的单体外，所述聚丙烯酸酯还含有0-15mol.％摩尔比例的与式I单体不同的至少一种其它单体组分，优选选自N-乙烯基甲酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、衣康酸、衣康酸酯、乙烯基膦酸、乙烯基磺酸、乙烯基醇、N-乙烯基咪唑、N-乙烯基甲酰胺、苯乙烯、马来酸、马来酸酯、乙烯和/或丙烯、和丙烯酰胺及取代的丙烯酰胺，其中取代基选自直链C₁-C₂₀烃基残基、支链C₃-C₂₀烃基残基和环状C₃-C₂₀烃基残基，所述烃基残基任选地被一个或多个选自羟基、氨基、环氧基、硫醇基团和卤素原子的相同或不同基团取代。

7.如前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述酶选自家族VIII的酯酶、C型酯酶、根据SEQ ID NO：5的角质酶或由其衍生的角质酶、和根据SEQ ID NO：6的三酰基甘油脂肪酶或由其衍生的三酰基甘油脂肪酶。

8.如前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述酶选自根据SEQ IDNO：1(来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的酯酶B)的蛋白质、SEQ ID NO：2(来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的酯酶C)的蛋白质、或由其衍生的功能突变体。

9.如权利要求8的方法，其特征在于，所述酶是相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2就聚丙烯酸酯水解而言具有可比的或增加的活性的根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的酯酶的突变体，和/或相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有增加的稳定性的根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的酯酶的突变体。

10.如权利要求8和9之一的方法，其特征在于，与根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的酯酶比较，所述突变体显示针对聚丙烯酸甲酯和/或聚丙烯酸丁酯的增加水解活性。

11.如权利要求8-10之一的方法，其特征在于

(a)根据SEQ ID NO：1的酯酶的突变体在氨基酸残基Ser17、Gly132、Trp134、Arg155、Glu251、Ala311和Glu316中的一个或多个上具有至少一个突变；或

(b)根据SEQ ID NO：2的酯酶的突变体在氨基酸残基Phe138、Val150、Leu160、Thr188和Leu193中的一个或多个上具有至少一个突变。

12.如权利要求8-11之一的方法，其特征在于，所述突变体衍生自SEQID NO：1且

(a)包含突变Ser17Leu、Gly132Ser、Glu251Gly、Ala31Val和Glu316Lys中的至少一个；和/或

(b)包含突变Pro8Leu、Gly132Ser、Trp134Arg、Arg155Cys、Glu251Gly、Ala311Val和Glu316Lys中的至少一个。

13.如权利要求8-10之一的方法，其特征在于，所述突变体衍生自SEQID NO：2，并且包含下述突变或突变组合之一：

(a)Phe138Ala

(b)Phe138Ala，Thr188Ser

(c)Phe138Ala，Leu160Ala，Thr188Ser

(d)Leu193Ala

(e)Leu193Ala，Phe138Ala，Thr188Ser，Val150Ala

(f)Leu193Ala，Phe138Ala，Thr188Ser

(g)Leu193Ala，Phe138Ala，Thr188Ser，Leu160Ala，Val150Ala

(h)Val150Ala

(i)Val150Ala，Thr188Ser

(j)Leu193Ala，Phe138Val

(k)Leu193Ala，Phe138Val，Thr188Ser，Val150Ala

(l)Leu193Ala，Thr188Ser

(m)Leu193Ala，Phe138Val，Thr188Ser

(n)Leu193Ala，Phe138Val，Thr188Ser，Leu160Ala

(o)Phe138Val，Val150Ala，Thr188Ser

(p)Phe138Val

(q)Phe138Val，Thr188Ser

14.如权利要求7的方法，其特征在于，所述突变体是家族VIII酯酶或C型酯酶的缺失突变体。

15.如权利要求14的方法，其特征在于所述缺失突变体具有至少一个环缩短。

16.如权利要求15的方法，其特征在于所述缺失突变体具有选自SEQID NO：37和SEQ ID NO：38的氨基酸序列。

17.根据权利要求8-16之一中定义的功能酯酶突变体。

18.核酸，其

a)编码如权利要求17的酯酶突变体，或

b)是与a)互补的核酸，或

c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸，特别是具有至少80％序列同一性，并且编码水解聚丙烯酸酯的家族VIII酯酶突变体或C型酯酶突变体的核酸。

19.载体，其包含如权利要求18的核酸。

20.如权利要求19的载体，其特征在于所述核酸与启动子可操作地连接。

21.微生物，其包含至少一个如权利要求19或20的载体。

22.生产如权利要求17的酯酶的方法，其特征在于

a)培养如权利要求21的能够表达所述酯酶的宿主生物，

b)任选地诱导所述酯酶表达，和

c)任选地从所述宿主生物和/或所述培养基中分离所述酯酶。

23.根据权利要求7-17之一中定义的酯酶、如权利要求19或20的载体、或如权利要求21的微生物用于执行如权利要求1-16之一的方法的用途。

24.可通过如权利要求1-16之一的方法获得的聚合物反应产物。

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