CN111197037A - 一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35及其编码基因与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种patatin like磷脂酶PNPLA3‑35及其编码基因与用途，所述的patatin like磷脂酶PNPLA3‑35的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该patatin like磷脂酶PNPLA3‑35对造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂以及β内酰胺类抗生素具有较好的降解效果，且在生物化工和生物医药领域有非常大的应用价值。

Description

一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35及其编码基因与用途
技术领域
本发明涉及生物化工和生物技术领域，特别涉及一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35及其编码基因与用途。
背景技术
在造纸行业中用于实际生产的废纸原料中会含有不同种类的废纸，因此废纸来源的多样性导致了胶黏物来源的复杂性，从而使胶黏物的组成也变得十分复杂如树脂酸、脂肪酸等，还包括纸张在加工和使用过程中所带入的压敏胶、印刷油墨、热熔胶、涂布黏合剂等物质以及在纸张抄造过程中添加的施胶剂、填料、干(湿)强剂等。
对于胶黏物这个复杂的体系，它所包含的组分十分复杂，研究将其主要分为两种：天然树脂与人工合成物。天然树脂如木材中的树脂酸、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯等，它们在制浆过程中会因为环境的变化而形成树脂障碍。人工合成物主要包括胶黏剂、涂布黏合剂、印刷油墨连结料、残余脱墨化学品等。
微细胶黏物会在在白水循环管道、烘缸以及压榨部形成黏性物质导致胶黏物的沉积，还会在筛浆机、输送管道内和流浆箱内等处出现结垢或堵塞管道，严重影响纸机的正常运行。微细胶黏物沉积在成形网处，堵塞网孔、造成浆料滤水困难、导致纸页断头、增加停机清洗时间和缩短其使用寿命。压榨部的微细胶黏物沉积主要是在压榨毛毯和压辊上，沉积在压榨毛毯上会增加净化和洗涤次数，缩短毛毯的使用寿命，同时也会增加化学药品的使用量：沉积在压辊上会影响纸页脱水，严重时导致纸页断头甚至停车。当能够被带出纸机的微细胶黏物积累到一定程度时，会沉积在纸页上产生孔洞、斑点和定量不均匀等纸病，此外残留在纸页中的胶黏物也会形成污点、透明点等降低纸页的质量或纸张物理强度，不利于纸张的印刷。因此，胶黏物的去除是亟待解决的问题。
β-内酰胺类抗生素是一类化学结构中含有β-内酰胺环的抗生素，具有杀菌活性强、毒性低、适应症广以及临床疗效好等优点，是现有抗生素中应用最为广泛的一类。全世界平均每年消费100000-200000t抗生素，其中β-内酰胺类抗生素占到50％-70％。在β-内酰胺类抗生素如青霉素、头孢菌素等发酵生产过程中，会产生大量含抗生素的废水废渣，如果处理不当而排入环境，会对环境造成污染。同时，抗生素在进入机体过程中，部分抗生素不能被机体完全吸收，会以原型或代谢产物的形式经由粪尿排出进入环境，对土壤和水体等造成污染，进而易诱导产生抗性菌和抗性基因，这些抗性菌和抗性基因可能通过直接或间接的方式进入人体，对人类健康构成威胁。因此，抗生素残留去除已成为抗生素行业可持续发展以及环境治理中亟待解决的重要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提出一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35及其编码基因与用途，该patatin like磷脂酶PNPLA3-35对造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂以及β内酰胺类抗生素具有较好的降解效果。
基于上述目的，本发明提供了一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35，所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35的核苷酸序列、含有所述的核苷酸序列的重组表达载体以及含有所述的重组表达载体的重组基因工程菌也在本发明的保护范围之内。
在本发明的一个实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
基于相同的发明构思，本发明还提供了一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35的制备方法，构建含有所述的核酸序列的重组表达载体，将所述的重组表达载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌，诱导培养，即得所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35。
基于相同的发明构思，本发明还提供了上述patatin like磷脂酶PNPLA3-35在降解造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂中的用途。
在本发明的一个实施例中，所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35用于降解聚己内酯(PCL)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、EVA树脂、聚氨酯(TPU)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、HAB-1背胶或胶黏物中的至少一种。
基于相同的发明构思，本发明还提供给了上述patatin like磷脂酶PNPLA3-35在降解β内酰胺类抗生素中的用途。
在本发明的一些实施例中，所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35对金属离子、有机溶剂或表面活性剂具有耐受性。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
本发明从酸性矿山废水的宏基因组文库中筛选并且克隆到一个patatin like磷脂酶基因PNPLA3-35，全长1185bp，其编码的patatin like磷脂酶共包含394个氨基酸。本发明的patatin like磷脂酶对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂有良好的耐受性。该patatin like磷脂酶PNPLA3-35对造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂以及β内酰胺类抗生素具有较好的降解效果，并且可以用于洗涤剂、化妆品和精细化工等领域。本发明patatin like磷脂酶PNPLA3-35的制备方法解决了现有技术中磷脂酶价格昂贵，生产技术受到制约等不足的问题。
附图说明
图1为本发明实施例的patatin like磷脂酶的SDS-PAGE电泳图；
图2为本发明实施例的patatin like磷脂酶不同pH缓冲液下的酶活力；
图3为本发明实施例的patatin like磷脂酶不同pH缓冲液下的稳定性；
图4为本发明实施例的patatin like磷脂酶不同温度下的酶活力；
图5为本发明实施例的patatin like磷脂酶不同温度下的酶活力；
图6为本发明实施例的Patain like磷脂酶PNPLA-35孵育过的头孢氨苄与未孵育的对照组；
图7为本发明实施例的Patain like磷脂酶PNPLA-35孵育过的青霉素与未孵育的对照组；
图8为本发明实施例的Patain like磷脂酶PNPLA-35孵育后反应液中脂肪酸浓度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
磷脂酶，在生物体内存在的可以水解甘油磷脂的一类酶。其中包括磷脂酶A1、A2、C和D，其催化甘油磷脂产生甘油和磷脂酸或者其它脂肪酸。其来源非常广泛，动物、植物、微生物中都有存在。磷脂酶作为生物催化剂多数可作用非天然底物，不需要辅助因子，是一种重要的催化剂。由于磷脂酶也有转脂的作用。其中一部分已知的磷脂酶能应用于油脂精炼、植物油脱胶和磷脂改性。因而在食品行业有很大的应用潜力。
研究发现磷脂酶己被证实可以控制胶黏物，大部分的胶黏物都含有大量的能将其基本结构组分连接在一起的酯键，而某些磷脂酶则能够催化这类酯键断裂，使胶黏物的粒子尺寸降低，使其分解成小分子的脂肪酸和醇类物质，胶黏物的酯键一经断裂，其基本组分在浆料系统中就很难重新聚合，从而达到了去除胶黏物的效果，同时也降低了胶黏物沉积在造纸设备表面的可能性，缓解了黏网、黏缸等问题。研究表明磷脂酶也具有水解聚酯类塑料和增塑剂的能力。因而磷脂酶在环境领域也有很大应用潜力。
本发明的patatin like磷脂酶PNPLA3-35的基因来源于酸性矿山废水的宏基因组文库。酸性矿山废水是一种pH极低微生物种类丰富且寡营养的极端酸性环境。本发明用宏基因组文库的方法筛选到patatin like磷脂酶PNPLA3-35，全长1185bp，其编码的patatinlike磷脂酶共包含394个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)。通过克隆编码patatin like磷脂酶PNPLA3-35的基因并将其连接表达载体pET30a载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)培养并诱导表达后得到了重组patatin like磷脂酶PNPLA3-35。patatin like磷脂酶PNPLA3-35可用于造纸行业中的纸浆脱胶、聚酯类塑料或增塑剂的降解以及β内酰胺类抗生素的降解，且在生物化工和生物医药领域有非常大的应用价值。
在本实施例中，可选的，编码所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本实施例中，可选的，一种重组表达载体含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，表达载体为pET30a载体。
在本实施例中，可选的，一种重组基因工程菌，含有所述的重组表达载体，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
基于相同的发明构思，本实施例还提供了一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35的制备方法，构建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组表达载体，将所述的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌，诱导培养，即得所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35。
试验结果表明，本实施例的patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有以下特性：(1)对长链对硝基苯酚的特异性差，对短链对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是对硝基苯酚丁酸酯。(2)最适反应pH值为7，在pH7-8之间酶活力稳定。(3)最适反应温度为60℃，在20-40℃之间酶活力稳定。(4)1mM或5mM的Mn2+和Ag+均对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的激活作用，在1mM时，相比对照酶活分别提高28.19％和22.43％，在5mM时，相对对照酶活分别提高19.30％和5.06％。1mM的Ca2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的激活作用，相对对照酶活提高14.59％，5mM的Ca2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有轻微的抑制作用，但影响不大。1mM的Ni2+、Ba2+、Co2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35的影响不大，基本可以保持90％以上的酶活。patatin like磷脂酶PNPLA3-35能够耐受1mM或5mM的Mn2+、Ag+和Ca2+，也能够耐受1mM的Ni2+、Ba2+、Co2+。(5)1mM的CTAB对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的激活作用，相比对照酶活提高64.47％。1mM的EDTA和SDS对patatinlike磷脂酶PNPLA3-35具有轻微的抑制作用，但影响不大。patatin like磷脂酶PNPLA3-35能够耐受1mM的CTAB、EDTA和SDS。
本实施例将patatin like磷脂酶PNPLA3-35用于降解青霉素和头孢氨苄等β内酰胺类抗生素，试验结果表明，patatin like磷脂酶PNPLA3-35对青霉素和头孢氨苄等β内酰胺类抗生素具有降解作用。将patatin like磷脂酶PNPLA3-35用于降解造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂，并以脂肪酸试剂盒测定其反应体系中脂肪酸的浓度。试验结果表明，patatin like磷脂酶PNPLA3-35处理纸浆胶黏物的实验组脂肪酸浓度最高，处理EVA的浓度次之，相应的，孵育后纸浆胶黏物的减少量最多，孵育后EVA的减少量次之，说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35对纸浆胶黏物和EVA具有较好的降解效果。patatin like磷脂酶PNPLA3-35处理PET和PBT的实验组脂肪酸浓度比较低，相应的，孵育后PET和PBT的减少量比较少，说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35对PET和PBT的降解效果较差。patatin like磷脂酶PNPLA3-35对于PCL、PC-110、TPU、PMMA和HAB-1背胶的降解效果相当，降解效果处于纸浆胶黏物和EVA的降解效果与PET和PBT的降解效果之间。说明patatinlike磷脂酶PNPLA3-35能够降解聚己内酯(PCL)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、EVA树脂、聚氨酯(TPU)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、HAB-1背胶或胶黏物中的至少一种。
下列实施例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
本发明的patatin like磷脂酶基因PNPLA3-35来自于酸性矿山废水的宏基因组文库。现该文库保存于中南大学资源及加工与生物工程学院生物冶金重点实验室。
实施例1：宏基因组文库的构建及patatin like磷脂酶的筛选
提取酸性矿山废水样品的基因组，经过琼脂糖凝胶电泳验证宏基因组DNA符合要求后，选用合适的内切酶将大片段的宏基因组DNA片段消化成长短不一的小片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化后用T4连接酶与PUC18质粒连接并转化大肠杆菌DH5α，用蓝白斑筛选的方法挑取阳性(白斑)克隆子转接到含有三丁酸甘油酯的LB平板上培养数天。观察有无水解圈，并且将能水解三丁酸甘油酯形成水解圈的亚克隆挑取扩大培养保存并且送样测序。
实施例2：patatin like磷脂酶PNPLA3-35基因开放阅读框的确定和密码子优化
用生物信息学手段对将实施例1中的测序结果进行注释，分析其开放阅读框的边界，其核苷酸序列全长1230bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，共409个氨基酸，对其进行稀有密码子的分析，分析结果表明核苷酸中含有大量的大肠杆菌的稀有密码子，很有可能会造成异源表达时表达量低或者不表达的瓶颈，因而针对大肠杆菌对其进行密码子优化。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。密码子优化后添加上游酶切位点Nde I和下游酶切位点Hind III，并且基因合成全长后连接克隆载体pUC57转化至大肠杆菌Top10菌株。
实施例3：patatin like磷脂酶PNPLA3-35表达载体的构建
3.1质粒提取与双酶切
将含有连接了PNPLA3-35序列的pUC57载体的Top10菌株和含有pET30a空载体的DH5α菌株接种至LB液体培养基中，于37℃摇床过夜培养后分别提取质粒。将pET30a空载体和连接了PNPLA3-35序列的pUC57重组载体质粒分别用Nde I和Hind III两种限制性内切酶进行双酶切，酶切体系为：Nde I和Hind III分别2μL，质粒300ng，buffer 3μL，以双蒸水补足至30μL。酶切后用琼脂糖凝胶电泳纯化回收PNPLA3-35目的条带和pET30a载体。
上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo Fisher公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用的为Omega公司的胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒为Omega公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
3.2连接
将经过双酶切的PNPLA3-35目的序列与pET30a载体按照摩尔比3:1的比例进行连接。连接使用的T4连接酶购买自Thermo Fisher公司。连接体系和酶量按照说明书推荐16℃过夜连接。
3.3转化克隆宿主、筛选及测序
分别取5μLPNPLA3-35与pET30a载体的连接产物于50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃、200rpm孵育培养1h。取一定量的菌液分别涂布于含100μL/mL氨苄青霉素、卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与PNPLA3-35目的基因大小相同的送生工生物公司测序。测序结果与PNPLA3-35原序列比对无误后方确定PNPLA3-35 patatin like磷脂酶序列插入到pET30a载体中，分别命名为PNPLA3-35-pET30a，可以继续接下来的实验。
实施例4：含有patatin like磷脂酶基因PNPLA3-35的大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达和纯化
4.1 PNPLA3-35-pET30a质粒提取与转化BL21(DE3)菌株
将含有PNPLA3-35-pET30a质粒的大肠杆菌DH5α菌株转接至LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，然后提取质粒PNPLA3-35-pET30a。
取上述得到的PNPLA3-35-pET30a质粒5μL分别与50ml BL21(DE3)感受态细胞混合冰浴30min，于42℃水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃200rpm培养1h。取100μL培养物涂布于含有终浓度为50μL/mL的氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，培养15h后挑选单菌，以菌落PCR和酶切验证，目的条带大小正确的即为含有PNPLA3-35-pET30a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。
4.2 patatin like磷脂酶PNPLA3-35蛋白诱导
将上述菌落PCR和酶切验证阳性的菌落转接至LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.7左右，加入IPTG使得其终浓度为0.5mM，于20℃、220rpm下诱导20小时。收集菌体，以PBS缓冲液清洗3次后，再以适量的PBS缓冲液重悬菌体。
4.3 patatin like磷脂酶PNPLA3-35蛋白纯化
用超声波破碎细胞悬液后12000g离心取上清，所得上清用镍离子亲和层析柱进行纯化得纯化的patatin like磷脂酶PNPLA3-35，纯化的蛋白大小约为45kD，符合理论预期。具体实施方案如下：含有10mM咪唑的PBS缓冲液，4℃过夜结合后，使用10mM的咪唑洗脱5个柱体积，30mM咪唑洗脱30个柱体积以除去与镍柱非特异性结合的杂蛋白，最后使用500mM咪唑分别洗脱共5个柱体积并收集。
4.4蛋白浓度测定与SDS-PAGE电泳
将纯化获得的酶蛋白采用Bradford法进行定量。设置空白对照，每组设置3个平行样，反应时间5min。以595nm下测定吸光值，根据绘制的标准曲线计算蛋白量。将收集液的洗脱液用BCA的方法测蛋白浓度后以蛋白浓度最高的洗脱液进行SDS-PAGE电泳得到目的蛋白条带。如图1所示，泳道1和泳道2有明显的目标条带，且条带大小约为45kD，结果表明，patatin like磷脂酶PNPLA3-35经大肠杆菌BL21(DE3)发酵后可以成功的表达。
实施例5：patatin like磷脂酶PNPLA3-35酶学性质的测定
5.1 patatin like磷脂酶PNPLA3-35酶活测定
纯化的patatin like磷脂酶活性测定采用对硝基苯酚(pNP)法
准备不同浓度的pNP溶液，设置梯度，依次加入Tris-HCl缓冲液和Na2CO3终止液，设置空白组，每组设置3个平行样，在405nm处用酶标仪读取相应的吸光值，并以pNP含量为纵坐标，以OD值为横坐标绘制标准曲线。
patatin like磷脂酶酶活性的测定采用pNP法：总体系500μL。先在各管中分别加入50mM的Tris-HCl缓冲液420μL，预热之前再分别加入10mM的pNP底物30μL，设定温度下预热处理2min后，即可加入50μL稀释好的patatin like磷脂酶(对照组加50μL的双蒸水)，反应5min后，加入50μL的0.1M Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm下读取吸光值(OD)。
一个酶活单位(U)定义为：一定条件下，每分钟分解p-NPCn(对硝基苯酚酯)生成1μmoL的pNP所需要的酶量。
5.2水解不同长度的对硝基苯酚酯
按照5.1的测定条件，比较patatin like磷脂酶PNPLA3-35作用不同长度的对硝基苯酚酯，结果表明patatin like磷脂酶PNPLA3-35对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C4，即对硝基苯酚丁酸酯。
5.3最适pH和pH稳定性
配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH具体配置方法如表1和表2所示。
表1磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲体系
Figure BDA0002360178860000091
表2 Tris-HCl缓冲体系的配置
Figure BDA0002360178860000092
分别以上述缓冲液，其他条件如5.1所示，以对硝基苯酚乙酸酯为底物，测定patatin like磷脂酶PNPLA3-35不同pH缓冲液下的酶活力。结果如图2所示。在所能检测的pH条件下，patatin like磷脂酶PNPLA3-35在pH7中活性最高，最适pH为7。
重组patatin like磷脂酶PNPLA3-35在不同pH的缓冲液(pH2-9)中分别处理1h、3h、6h、12h后，按照5.1中的条件测定酶活力以测试重组patatin like磷脂酶PNPLA3-35在不同pH下的稳定性。结果如图3所示，pH值在6-9时酶活力虽然有损失，但依然能保持较高的酶活力，尤其以在pH7-8时最稳定，能保持90％以上的酶活力。说明该酶具有良好的pH稳定性。
5.4最适反应温度与热稳定性测定
在最适pH的缓冲液中，于0–100℃下进行酶促反应，测定最适温度。结果如图4所示，温度在30-80℃时保持80％以上的酶活力，在60℃时酶活力最高，最适温度60℃。
将同样酶量的酶液置于设定的温度中处理1h，在最适pH及最适温度下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照，测定酶的稳定性。结果如图5所示，温度在20-40℃时酶活力虽然有损失，但依然能保持较高的酶活力，能保持80％以上的酶活力。说明该酶具有良好的温度稳定性。
5.5金属离子对重组patatin like磷脂酶PNPLA3-35酶活的影响
在反应体系中加入终浓度为1mM或5mM的Mg2+、Ni2+、Al3+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Ag+等金属离子，以未加金属离子的缓冲液反应体系作对照，分别在最适温度和最适pH下测定酶活力。结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002360178860000101
由表3可知，1mM或5mM的Mn2+和Ag+均对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的激活作用，在1mM时，相比对照酶活分别提高28.19％和22.43％，在5mM时，相对对照酶活分别提高19.30％和5.06％。1mM的Ca2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的激活作用，相对对照酶活提高14.59％，5mM的Ca2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有轻微的抑制作用，但影响不大。1mM的Ni2+、Ba2+、Co2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35的影响不大，基本可以保持90％以上的酶活，但5mM的Ni2+、Ba2+、Co2+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的抑制作用。1mM或5mM的Mg2+、Al3+、Cu2+、Zn2+、Fe3+对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的抑制作用。说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35能够耐受1mM或5mM的Mn2+、Ag+和Ca2+，也能够耐受1mM的Ni2+、Ba2+、Co2+。
5.6有机溶剂和表面活性剂对重组patatin like磷脂酶PNPLA3-35酶活的影响
在反应体系中分别加入终浓度为1mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和终浓度为0.5％的Triton X-100(聚氧乙烯辛基苯基醚)、Tween 80(吐温80)在最适温度和最适pH条件下，测定酶活，以不加有机溶剂和表面活性剂的反应体系作为对照。结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0002360178860000111
由表4可知，1mM的CTAB对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的激活作用，相比对照酶活提高64.47％。1mM的EDTA和SDS对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有轻微的抑制作用，但影响不大。0.5％的Triton X-100和Tween 80对patatin like磷脂酶PNPLA3-35具有明显的抑制作用。说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35能够耐受1mM的CTAB、EDTA和SDS。
实施例6：patatin like磷脂酶PNPLA3-35在纸浆胶黏物、聚酯类塑料和增塑剂和抗生素降解中的应用
6.1patatin like磷脂酶PNPLA3-35在β内酰胺类抗生素降解中的应用
将大肠杆菌DH5α接种至LB液体培养基中培养至对数期后，取5ml菌液与经高温高压灭菌并经冷却降温至40℃的100ml LB琼脂培养基混匀后制成含菌平板。将纯化得到的patatin like磷脂酶PNPLA3-35与50mg/ml的青霉素和头孢氨苄等β内酰胺类抗生素于30℃下孵育3h，同时以无菌清水与50mg/ml的抗生素于30℃条件下孵育3h为对照。各取10μL孵育产物滴到滤纸片上风干，并用镊子贴到已准备好的含菌平板上于37℃倒扣培养过夜观察抑菌圈如图6和图7所示。
由图6和图7可以观察到以清水孵育的青霉素和头孢氨苄等β内酰胺类抗生素的抑菌圈明显大于以patatin like磷脂酶PNPLA3-35孵育的抗生素的抑菌圈。则可以认为patatin like磷脂酶PNPLA3-35对某些β内酰胺类抗生素有降解作用。
6.2patatin like磷脂酶PNPLA3-35在纸浆胶黏物和聚酯类塑料及增塑剂降解中的应用
将聚己内酯(PCL)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、EVA树脂、聚氨酯(TPU)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、HAB-1背胶、现场纸浆胶黏物样品等聚酯类底物先称重并记录后与纯化得到的patatin like磷脂酶PNPLA3-35于30℃孵化24h后用游离脂肪酸测定试剂盒测定反应液中的脂肪酸浓度，并且将聚酯类底物分离、洗净、烘干后再次称重记录。结果如图8和表5所示。
表5反应前后底物的减少量
Figure BDA0002360178860000121
由图8和表5可以看出，patatin like磷脂酶PNPLA3-35处理纸浆胶黏物的实验组脂肪酸浓度最高，处理EVA的浓度次之，相应的，孵育后纸浆胶黏物的减少量最多，孵育后EVA的减少量次之，说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35对纸浆胶黏物和EVA具有较好的降解效果。patatin like磷脂酶PNPLA3-35处理PET和PBT的实验组脂肪酸浓度比较低，相应的，孵育后PET和PBT的减少量比较少，说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35对PET和PBT的降解效果较差。patatin like磷脂酶PNPLA3-35对于PCL、PC-110、TPU、PMMA和HAB-1背胶的降解效果相当，降解效果处于纸浆胶黏物和EVA的降解效果与PET和PBT的降解效果之间。说明patatin like磷脂酶PNPLA3-35能够降解聚己内酯(PCL)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、EVA树脂、聚氨酯(TPU)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、HAB-1背胶或胶黏物中的至少一种。
本发明从酸性矿山废水的宏基因组文库中筛选并且克隆到一个patatin like磷脂酶基因PNPLA3-35，全长1185bp，其编码的patatin like磷脂酶共包含394个氨基酸。本发明的patatin like磷脂酶对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂有良好的耐受性。该patatin like磷脂酶PNPLA3-35对造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂以及β内酰胺类抗生素具有较好的降解效果，并且可以用于洗涤剂、化妆品和精细化工等领域。本发明patatin like磷脂酶PNPLA3-35的制备方法解决了现有技术中磷脂酶价格昂贵，生产技术受到制约等不足的问题。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35及其编码基因与用途
<130> FI190378-ND
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtcaggtg catggcaatc agacaaacgc gttgcatgcg ctcaagggga ttttctggcc 60
gaaagatgca ccctgcccaa gccactctcc tgggcgaagg gtgcgtattc gaagtcgtcg 120
ggttcgatgc cgaggttggc ggcgatatgg tcgcgcagcg ccactccgcg ggtggagcgg 180
atatccaact catccgcatc tcttccctat cgcgcacttc tcgagcgcgc tacagtgcag 240
tctggacgtt gcggcatcaa aaacgcatgg gaggtgaaga tcagcatgac tattggcctg 300
gctcttggca gtggcgcggc ccgcggatgg gcgcatatag gggtaataaa cgcgctgaat 360
gatcaaggaa tcgtaccgga tatcgtttgt ggcacgtcca taggcgcgct ggtcggcgca 420
tcctatgttt ccaacaatct tgagaagctg gaagaatggg tgcgctcact gacaaggctt 480
gaaacggcca aattttttgc catcaacatg tcattgaatg gttttgtcaa taaagagcgg 540
ctacattatt ttctcaataa atatgtggca gatgatgact caaaaataga gggtatagtt 600
aacaaaaaat atgcatcggt agcaaccgac ttgcaaaccg gcagcgagat ctggttgacg 660
gacggttcaa ttctggatgc cgtcttttcg tccatatcca tgcccggcct ctttccggcg 720
gtcaagaaca acggcaggtg gctcatagat ggcggattgg tgaatcccgt ccccgtttcg 780
gtctgtcggg ctcttggcgc cgatgtggtt attgccgtaa cgttgaacga tgatatcgtt 840
ggaaaacatc ttcaaaataa caaaatcctg aaaacacagg atgcccgcgt taccggaaaa 900
atatcagacc tgatcacggc atataccgcc tcgatatttc cggcgacagg cgatgaggag 960
caaccaccca gcctctttga tgccatcgcc ggctcggtga atatcatgca ggacaggatc 1020
accaggagtc gcatggccgg agatcctccg gatatcctgc tttctccaag gctgtcccac 1080
attggcttac tggagtttta tcgcgccggt gaagccatca cggaggggaa aaaatgcgta 1140
cagagcatgt taccggaaat acagcgtgtg ttgggtatat cctga 1185
<210> 2
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Gly Ala Trp Gln Ser Asp Lys Arg Val Ala Cys Ala Gln Gly
1 5 10 15
Asp Phe Leu Ala Glu Arg Cys Thr Leu Pro Lys Pro Leu Ser Trp Ala
20 25 30
Lys Gly Ala Tyr Ser Lys Ser Ser Gly Ser Met Pro Arg Leu Ala Ala
35 40 45
Ile Trp Ser Arg Ser Ala Thr Pro Arg Val Glu Arg Ile Ser Asn Ser
50 55 60
Ser Ala Ser Leu Pro Tyr Arg Ala Leu Leu Glu Arg Ala Thr Val Gln
65 70 75 80
Ser Gly Arg Cys Gly Ile Lys Asn Ala Trp Glu Val Lys Ile Ser Met
85 90 95
Thr Ile Gly Leu Ala Leu Gly Ser Gly Ala Ala Arg Gly Trp Ala His
100 105 110
Ile Gly Val Ile Asn Ala Leu Asn Asp Gln Gly Ile Val Pro Asp Ile
115 120 125
Val Cys Gly Thr Ser Ile Gly Ala Leu Val Gly Ala Ser Tyr Val Ser
130 135 140
Asn Asn Leu Glu Lys Leu Glu Glu Trp Val Arg Ser Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Glu Thr Ala Lys Phe Phe Ala Ile Asn Met Ser Leu Asn Gly Phe Val
165 170 175
Asn Lys Glu Arg Leu His Tyr Phe Leu Asn Lys Tyr Val Ala Asp Asp
180 185 190
Asp Ser Lys Ile Glu Gly Ile Val Asn Lys Lys Tyr Ala Ser Val Ala
195 200 205
Thr Asp Leu Gln Thr Gly Ser Glu Ile Trp Leu Thr Asp Gly Ser Ile
210 215 220
Leu Asp Ala Val Phe Ser Ser Ile Ser Met Pro Gly Leu Phe Pro Ala
225 230 235 240
Val Lys Asn Asn Gly Arg Trp Leu Ile Asp Gly Gly Leu Val Asn Pro
245 250 255
Val Pro Val Ser Val Cys Arg Ala Leu Gly Ala Asp Val Val Ile Ala
260 265 270
Val Thr Leu Asn Asp Asp Ile Val Gly Lys His Leu Gln Asn Asn Lys
275 280 285
Ile Leu Lys Thr Gln Asp Ala Arg Val Thr Gly Lys Ile Ser Asp Leu
290 295 300
Ile Thr Ala Tyr Thr Ala Ser Ile Phe Pro Ala Thr Gly Asp Glu Glu
305 310 315 320
Gln Pro Pro Ser Leu Phe Asp Ala Ile Ala Gly Ser Val Asn Ile Met
325 330 335
Gln Asp Arg Ile Thr Arg Ser Arg Met Ala Gly Asp Pro Pro Asp Ile
340 345 350
Leu Leu Ser Pro Arg Leu Ser His Ile Gly Leu Leu Glu Phe Tyr Arg
355 360 365
Ala Gly Glu Ala Ile Thr Glu Gly Lys Lys Cys Val Gln Ser Met Leu
370 375 380
Pro Glu Ile Gln Arg Val Leu Gly Ile Ser
385 390

Claims (10)

1.一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35，其特征在于，所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的核苷酸序列。
5.一种重组基因工程菌，其特征在于，含有权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种patatin like磷脂酶PNPLA3-35的制备方法，其特征在于，构建含有如权利要求2所述的核酸序列的重组表达载体，将所述的重组表达载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌，诱导培养，即得所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35。
7.权利要求1所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35在降解造纸行业中的纸浆胶黏物、聚酯类塑料或增塑剂中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述patatin like磷脂酶PNPLA3-35用于降解聚己内酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、EVA树脂、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、HAB-1背胶或胶黏物中的至少一种。
9.权利要求1所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35在降解β内酰胺类抗生素中的用途。
10.根据权利要求1所述的patatin like磷脂酶PNPLA3-35，其特征在于，所述patatinlike磷脂酶PNPLA3-35对金属离子、有机溶剂或表面活性剂具有耐受性。
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WO1998018912A1 (en) * 1996-10-31 1998-05-07 Novo Nordisk A/S Novel phospholipase, production and use thereof
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