-
Verfahren zur Herstellung haltbarer Thrombinpräparate von gesteigerter
Wirksamkeit Hochwirksame Thrombinpräparate stellen heute ohne Zweifel die besten
lokalen Hämostyptika dar und sind für manche Zwecke der Therapie unentbehrlich geworden.
Zur Herstellung dieser Präparate ist man auf die Verarbeitung von menschlichem und
tierischem Blut angewiesen, und die mäßigen Ausbeuten machen das Thrombin zu einem
kostspieligen Präparat. Überdies wird die Wirkung des Thrombins in manchen Fällen
durch therapeutisch zugeführte (Heparin u. dgl.) oder im Blut vorhandene Antithrombine
(z. B. Icterus-Antithrombine) gehemmt.
-
Es wurde nun gefunden, daß man die Wirksamkeit von in an sich bekannter
`weise gewonnenen Thrombinpräparaten um das 'Mehrfache steigern und gleichzeitig
die Haltbarkeit erhöhen kann, wenn man sie in wäßriger Lösung mit in 9-Stellung
basisch substituierten Acridinverbindungen, z. B. 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat,
2 =Äthoxy-9-@p-(y-diäthylaminoß-oxypropylamino) ]-phenylaminoacridin-trihydrochlorid,
3-Nitro-9-(y-diäthylamino-ß-oxypropylamino)-acridin-dihydrochlorid, 2-Äthoxy-9-äthylamino-acridin-hy
drochlorid, 2-Äthoxy-9-aminoacridin-chlormethylat, 2-Äthoxv-9-(p-oxyphenyl-äthylamino)-acridin-glykolat,
2 .Äthoxy-9-(r'-phenyl-2', 3'-dimethylpyrazolonyl-(q.'))-aminoacridin-hydrochlorid
umsetzt.
-
Offenbar reagieren dabei die basischen Acridinderivate mit den sauren
Gruppen des Thrombins unter Bildung von Komplexen mit gesteigerter Wirksamkeit
und
wesentlich geringerer Empfindlichkeit gegenüber den erwähnten Antithrombinen.
-
Wie weiter gefunden wurde, läßt sich die blutstillende Wirkung der
nach vorliegendem Verfahren erhältlichen Thrombinpräparate noch weiter dadurch steigern,
daß man ihnen bekannte Acceleratoren der Thrombinwirkung, wie Protamine, Gelatine,
Stärke, Thrombozytenextrakte oder synthetische Polymere, z. B. Polyvinylpyrrolidon,
ferner Pektin oder Pektinderivate, Alginate oder deren Derivate, zusetzt.
-
Die Wirkungssteigerung, die sich beispielsweise durch Umsetzung des
Thrombins mit den obengenannten Acridinderivaten erzielen läßt, zeigt folgender
Versuch. Versuch i Es wurde die Gerinnungszeit bestimmt, die bei der Einwirkung
verschiedener Mengen eines Thrombinpräparates einmal ohne und zum anderen nach Umsetzung
mit 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat auf Plasma erhalten wird. Bei 37° wurden
o,2 ccm Oxalat-_ plasma von Rindern, das durch Adsorption mit Bariumsulfat von Prothrombin
befreit worden ist, mit einer Mischung des betreffenden Thrombinpräparates, in o,2
ccm Wasser gelöst, und o,i ccm Wasser bzw. o,= ccm einer o,i°/oigen Lösung von 2-Äthoxy-6,
9-diaminoacridinlactat vermischt und mit der Stoppuhr die Gerinnungszeit gemessen.
| Menge Thrombin- Gerinnungszeit in Sekunden |
| präparat ohne Acridin- [nach Umsetzung mit |
| in Mikrogramm verbindung Acridinverbindung |
| 800 4 sofort |
| 400 4 - |
| 200 5,5 - |
| ioo 7,5 4,5 |
| 50 12 6 |
| 25 19,5 8,5 |
| 12,5 33 To |
Eine ähnliche Abkürzung der Gerinnungszeit erhält man, wenn statt 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat
beispielsweise die folgenden Acridinderivate verwendet werden: 2 Äthoxy-9-[p-(y-diäthylamino-ß-oxypropylamino)]-phenylaminoacridin-trihydrochlorid,
3-Nitrö-9-(-y-diäthylamino-ß-oxypropylamino)-acridin-dihydrochlorid, 2-2lthoxy-9-äthylamino-acridin-hydrochlorid,
2-Äthoxy-9-aminoacridin-chlormethylat, 2-Äthoxy-9-(p-oxyphenyl-äthylamino)-acridin-glykolat,2-Äthoxy-9-(i'-phenyl-2',
3'-dimethylpyrazolonyl-(4'))-aminoacridin-hydrochlorid.
-
Nach der angeführten Versuchsanordnung läßt sich von einem Fachmann
ohne weiteres für jedes angewandte Thrombinpräparat die optimale Menge der verschieden
genannten Acridinderivate feststellen. Es ist selbstverständlich, daß ein Effekt
nicht auf dieses optimale Verhältnis beschränkt ist, sondern ein brauchbarer Effekt
eine Variation der Menge nach oben und unten zuläßt. In diesem Sinne sei, ausdrücklich
hervorgehoben, daß die in den Ausführungsbeispielen angegebenen Mengenverhältnisse
nur beispielhaft sein sollen, ohne die Anwendbarkeit auf die angegebenen Mengenverhältnisse
zu beschränken.
-
Bei Anwendung von Nativblut werden gleichartige Ergebnisse erzielt.
Es ergibt sich, daß man eine etwa vier- bis fünffache Steigerung der Thrombüzwirkung
erreichen kann.
-
Die durch Umsetzung von Thrombin mit Acridinverbindungen entstehenden
Präparate sind neben ihrer gesteigerten Wirksamkeit noch dadurch ausgezeichnet,
daß sie, wie schon erwähnt, wesentlich verminderte Empfindlichkeit gegenüber Antithrombinen
besitzen.
-
Der folgende Versuch zeigt die Ausschaltung der Heparinwirkung durch
die Thrombin-Acridin-Umsetzungsprodukte. Versuch 2 Es wurde entsprechend der Methodik
von Versuch i die Gerinnungszeit bestimmt, die bei der Einwirkung eines Thrombinpräparates
einmal ohne und einmal nach Umsetzung mit 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat auf
heparinisiertes Blutplasma erhalten wird. Bei 37° wurden o,2 ccm Oxalatplasma von
Rindern, das durch Adsorption mit Bariumsulfat von Prothrombin befreit worden ist,
und o,i ccm einer o,ooi5°/oigen Heparinlösung (entsprechend 1,5 Mikrogramm Heparin)
mit o,2 ccm einer Mischung von i ccm Thrombinlösung und o,5 ccm Wasser bzw. 0,5
ccm einer wäßrigen Lösung von 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat (o,i- und o,oi%ig)
vereinigt und die Gerinnungszeit mit der Stoppuhr gemessen.
| Gerinnungszeit in Sekunden |
| nach Zugabe einer nach Zugabe von |
| ohne Acridin- o,io/oigen o,oia/Qiger |
| verbindung Acridinlösung |
| Acridinlösung |
| 22 I sofort I 14,3 |
Eine gleiche Wirkung zeigen auch die übrigen in Versuch i genannten Acridinderivate.
-
Die durch Umsetzung der Thrombinpräparate mit den Acridinverbindungen
erhaltenen Lösungen zeigen gegenüber den reinen Thrombinlösungen auch eine erhöhte
Haltbarkeit. Für die therapeutische Verwendung empfiehlt es sich aber, die Präparate
in an sich bekannter Weise, z. B. durch Gefriertrocknung, in Trockenpräparate überzuführen,
aus denen dann unmittelbar vor der Anwendung durch Zugabe der entsprechenden Menge
Wasser die Lösungen frisch zu bereiten sind. Die Trockenpräparate sind praktisch
unbegrenzt haltbar. Beispiel i 11 einer Thrombinlösung, die in an sich bekannter
Weise aus Oxalatplasma von Rindern gewonnen wurde und 2o g Trockensubstanz enthält,
wird mit einer Lösung von 0,4 g 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat in io ccm Wasser
versetzt, neutralisiert, gegebenenfalls klar zentrifugiert und in an sich bekannter
U'eise
der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält 20,4 g eines lockeren Trockenpulvers,
das in Wasser klar löslich und, in Ampullen abgefüllt, bei Zi;nmertemperatur unbegrenzt
haltbar ist. Durch Auflösung von o,i g dieses Produktes in 5 ccm Wasser erhält man
eine für die therapeutische Verwendung brauchbare Lösung von optimaler Wirksamkeit.
An Stelle von 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat können gleiche :Mengen der Präparate
2-Äthoxy-9-[p-(y-diäthylaminoß-oxypropylamino) ]-phenylaminoacridin-trihydrochlorid
oder 3-Nitro-9-(-y-diäthylamino-ß-oxypropylamino)-acridin-dihydrochlorid verwendet
werden. Beispiel 2 11 der in Beispiel i verwendeten Thrombinlösung wird mit
einer Lösung von o,2 g 2-Äthoxy-9-äthylamino-acridin-hydrochlorid in io ccm Wasser
versetzt und wie in Beispiel i weiterverarbeitet. Statt der angeführten Verbindung
kann auch 2-Äthoxy-9-aminoacridin-chlormethylat verwendet werden. Beispiel 3 11
der oben verwendeten Thrombinlösung wird mit einer Lösung von o,ig 2-Äthoxy-9 ,(p-oxyphenyl-äthylamino)-acridinglykolat
oder 2-Athoxy-9-(i'-phenyl-2', 3'-dimethylpyrazolonyl-(4'))-aminoacridin-hydrochlorid
in io ccm Wasser versetzt und wie in Beispiel i auf Trockenpräparat verarbeitet.
Man erhält ein haltbares Trockenprodukt, von dem o,i g in 5 ccm Wasser gelöst eine
ausgezeichnete blutstillende Wirkung ergeben. Beispiel 4 In einem nach Beispiel
i verarbeiteten Thrombinansatz werden vor dem Einfrieren 20 g Stärke homogen verteilt.
Man erhält so ein Trockenpräparat, das in trockener Form auf die blutenden Flächen
aufgebracht, eine besonders gute hämostyptische Wirkung zeigt. Beispiel 5 Zu einem
nach Beispiel 2 verarbeiteten Thrombinansatz werden Zoo ccm einer io%igen neutralisierten
Pektinlösung zugefügt. Nach der wie oben durchgeführten Gefriertrocknung erhält
man ein Thrombinpräparat von ausgezeichneter blutstillender Wirkung. Beispiel 6
Zu einem nach Beispie13 hergestellten Ansatz werden ioo ccm einer io°/oigen Polyvinylpyrrolidonlösung
zugefügt und wie üblich weiterverarbeitet. Beispiel 7 Zoo mg des nach Beispiel i
erhaltenen Endproduktes werden in 5 ccm 3%iger Gelatinelösung gelöst. Man erhält
so ein Thrombinpräparat, das beim Aufsprühen auf Wundflächen eine besonders gute
blutstillende Wirkung zeigt. Beispiel 8 11 Thrombinlösung, wie sie in Beispiel
i verwendet wurde, wird im Vakuum bei 5 bis io° Innentemperatur auf die Hälfte eingeengt.
Dann werden 5oo ccm 6°/oige Gelatinelösung und eine Lösung von 0,4 g 2-Äthoxy-9-äthylamino-acridin-hydrochlorid
in 2o ccm Wasser zugesetzt und das Ganze in bekannter Weise gefriergetrocknet.
-
Man erhält etwa 5o g eines lockeren Trockenpulvers, das beim Aufstreuen
auf Wundflächen eine ausgezeichnete blutstillende Wirkung zeigt.