DE1492060A1 - Verfahren zur Stabilisierung waessriger Pesinloesungen - Google Patents

Verfahren zur Stabilisierung waessriger Pesinloesungen

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DE1492060A1 DE19651492060 DE1492060A DE1492060A1 DE 1492060 A1 DE1492060 A1 DE 1492060A1 DE 19651492060 DE19651492060 DE 19651492060 DE 1492060 A DE1492060 A DE 1492060A DE 1492060 A1 DE1492060 A1 DE 1492060A1
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

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Description

  • Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen
    Die Instabilität der Enzyme führt bei Enzymzubereitungen
    zu z.T. großen Aktivitätsverlusten, besonders bei wäßrigen
    Enzymlösungen. Diese Qualitätsminderung gab Anlaß, bei der
    Herstellung therapeutisch anwendbarer Enzymzubereitungen
    Enzymüberdosierungen vorzunehmen, um Mindestaktivitäten
    deklarieren und garantieren zu können. Es ist daher ein
    allgemeines und betontes Anliegen, Enzymzubereitungen durch
    Zusatz von entsprechend wirksamen Substanzen zu stabili-
    sieren.
    In der Auslegeschrift 1 185 768 und der deutschen Patent-
    schrift 1 121 769 werden Verfahren zur Stabilisierung wäß-
    riger Trypsin- und Chymotryps@inlösungeri beschrieben. Schwe-
    Lel_'.'raie Aminoüäuren finden als Stabilisatoren unter Zusatz
    von wasserlöslichen Calciumsalzen in beiden Verfahren Ver-
    wendung. Auch die österreichisphe Patentschrift 23¢ 279
    beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung therapeutisch
    anwendbare.i#,.Plasminlösungen .unter Verwendung von Aminosäuren
    h
    als Stabilisatoren. Auch für@wgßrige Pepsinzubereitungen
    wurden stabilisierende Effekte der Aminosäuren und Peptide
    bzw. Peptone, peptische Hydrolyseprodukte von Edestin,
    Casein und Gelatine, beschrieben: A.Ss. Zyperowitsch,
    Ukrain. biochem. J. 29, 79-89 (1957) zitiert n. Chem. Zen-
    trälblatt 1957 S. 10519; A.L. Lossewa, Ukrain. biochem. J: 29,
    173-185 (1g57) zitiert n.Chem.- Zentralblatt 1958, S. 3924.
    Das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilisierung wäßriger
    Pepsinlösungen ist dadurch gekennzeichnet, daß-man der wäß-
    rigen Pepsinlösung 1 - 20 Gew.% eines Polyäthylenglykols mit
    einem mittleren Molekulargewicht,von ca. 400.-6000, eines-
    Polyvvinylpyrrolidons mit einem mittleren Molekulargewicht im
    Bereich von ca. 10000 - 40000 oder eines Gemisches aus einem
    solchen Polyäthylenglykol und einem solchen Polyvinylpyrroli-
    don zumischt. Vorzugsweise werden der wäßrigen Pepsinlösung
    5 - 10 Gew.% der genannten Stabilisatoren bzw. Stä.bilisatoren-
    mischung zugegeben. Beim Einsatz eines Gemisches aus einem
    Polyäthylenglykol und einem Polyvinylpyrrolidon werden die
    beiden Verbindungen vorzugsweise im Verhältnis 1:1 eingesetzt
    und der wäßrigen Pepsinlösung in einer Menge von 5 - 10 Gew.;b
    zugesetzt.
    Die Untersuchungen über die Stabilität der nach dem erfindungs-
    gemäßen Verfahren erhaltenen Lösungen wurden an Schweinepepsin-
    lösungen (pH 2,2 - 2,5) durchgeführt. Die Ausgangsaktivitäten
    lagen zwischen 7 und 8 Pepsineinheiten pro Gramm Lösung.
    Die proteolytische Wirksamkeit des Pepsins wird mit der
    Hämoglobin-Substrat-Methode bestimmt; hierbei handelt es sich
    um eine Modifikation der Methode nach Anson, ausführlich be-
    schrieben im "Wissenschaftlichen Beiblatt zur Materia Medica
    Nordmark Nr. 25, Seite 18 (1963). Die zu prüfenden Substanzen
    wurden in Konzentrationen von 1 - 20 Gew.%, vorzugsweise
    5 - 10 Gew.% angewandt. Die Untersuchungen wurden bei ver-
    schiedenen Temperaturen durchgeführt: + 2009 + 37 o und +-53 °C.
    'Zur Prüfung gelangten folgende Substanzen: Pektin, Dextrin,
    Dextran. Tylose, Gelatine, Mucin, Sorbit, Glycerin, poly-
    äthylengly'kole und f'olyvinylpyrrolidon. Die Verwendung von
    Folyäthylenglykolen. Folyvinylpyrrolidonen und Gemischen
    hieraus als Enzymstabilisatoren ist in der Literatur noch
    nicht beschrieben.
    Die Ergebnisse, der Untersuchungen sind in. den Tabellen 't .- 3
    für die verschiedenen Temperaturen aufgeführt. Die Audgang:s-
    aktivitäten werden hierbei gleich 100 Prozent gesetzt und
    die Aktivitätsabnahme pro angegebene Zeiträume in. :Prozenten
    der Ausgangsaktivitäten angegeben,.
    Tabelle 1
    Ergebnisse der Stabilitätsprüfung bei +20o C, nach einem Jahr
    Zubereitung Aktivität s- Anzahl der Anzahl der
    verlust in 5ö Meßreihen Einzelmessungen
    Gelatine 1 70 W/v 38 1 3
    Dextrin 10 W/v 37 1 3
    Tylose 1 % w/v 35 1 - 3
    Sorbit 20 l W/v 31 1 3
    Standard-
    Pepsinlsg. 38 3 9
    Glycerin
    28 f W/v 16 1 3
    Polyäthylenglykol
    (Mol.-Gew.ca.400)
    10 . % W/v 7 1 3
    Polyäthylenglykol
    (Mol.-Gew.ca.1000) _
    10 % W/v 8 1 3
    Polyäthyle:nglykol!
    (Mol.-Gew.ca.2000)
    10 % W/v 4 1 3
    Polyvinylpyrrolidin
    (PVP) (mittl.Mol.
    Gew.ca. 20000)
    10 % W/v 5 1 3
    PVP (mittl.Mol.-
    Gew.ca. 20000-Polyäthy-
    lenglykol(Mol.-Gew.ca.
    1000) (1:1) 5 % W/v 8 1 - 3
    PVP (mittl.Kol.-Gew.
    ca.20000-Polyäthy-
    lenglykol(Mol.-Gew.ca.
    1000) (1,:1)10 l W/v 6 1 3
    Tabelle 2
    Ergebnisse der Stabilitätsprüfung bei -37o nach 60 Tagen
    Zubereitung Aktivitäts- Anzahl der Anzahl der
    verlost in % 1lleßreihen Einzelmessiuic"ren
    'tandard-Pepsin-
    ösung 78 3 9
    Glycerin 28 VA 48 3 ß
    i-iu citi - 1V1`18
    5 % w/: 66 2 6
    10 - % wlv 6 0 2 E@
    2olyäthylenglykol
    (i.iol.-Gew. ca. 400 )
    5 ö vlv 58 4 12
    10 vjv 48 4 12
    Polyäthylenglykol
    (l.iol. -Gew..ca.1000) '
    5 i w/v 5 2 2 6
    Polyäthylenglykol
    (i iol.-Gew. ca.2000 )
    48 2 6
    5 i#, vlv
    Polyv.inylpyrroliditi
    (PVf) (mittl.Mo1.
    Gewo ca:20r)00 )
    5 j@ w /v 4-3 4 12
    10 s "/v 3 7 4 12
    Polyäthylenx;lykol
    (Hol. -Gcw: ca.1000 )
    10 pö vr%v 38 2 6
    holyäthylenglykol
    (11101. =Gew. ca. 2000 )
    1 ) ::; @llv 3c:; 2 6
    Tabelle 3 -
    Ergebnisse der Stabilitätsprüfung bei +53o 0 nach 15 Tagen
    Zubereitung Aktivitäts- Anzahl der Anzahl der
    verlust in % MeBrelhen Einzelmessungen
    tandard-
    epsinlsg. 84 6 18
    Iucin (NNR)
    5 % w/v 74 2 6
    10 % @@ 67 2 6
    Glycerin 28 % w/v 64 8 24
    olyäthylenglykol
    (Mol.-Gew.ca.400)
    5 % VA 68 2 6
    10 7 ö v #/v 68 3 9
    olyäthylenglykol
    (Mol.-Gew.ca.1000)
    1 % W/v 82 2 6
    5 i, /v 71 4 12
    10 j a 68 3 9
    olyäthylenglykol
    (I#Iol.-Gew. ca. 2000 )
    5# (o w/v 66 2 6
    1 o % fi 67 3 9
    olyäthylenglykol
    (PIol.-Gew. ca.5-6000
    1 % w %v 81 . 2 6
    w/v 72 2 6
    olyvinylpyrrolidin
    (PVP) (mitti.Mol.
    ew.ca.20000)
    wfv 77 2 b
    5 % i! 54 3 9
    1o % » 43 6 . 18
    orbit 20 go w/v -80 3 _ 9 .
    extrin 10 % wlv 86 3 9
    extran 10 % " 90 3
    Tylose 1 % " 86 3 s:Gelatine 1 , ö " 85 3 g
    Pektin 1 p " 88 2 _ . _ _ ., 6 ; .
    Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße .
    Verfahren.
    Beispiel 1
    22,6 g roher salzsaurer Schweinemagenextrakt mit 35 Pepsin-
    einheiten pro Gramm Extrakt werden mit den üblichen Konser-
    vierungsmitteln und Geschmackskorrigentien versetzt. 10 g
    Polyvinylpyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von
    ca. 20 000 werden in 20 m1 Wasser gelöst und zur obigen
    Pepsinlösung gegeben. Mit verdünnter Salzsäure wird der
    pH-Wert auf 2,2 - 2,5 eingestellt, dann mit Wasser ad -
    100.:m1 Endvolumen aufgefüllt.
    Beispiel 2
    Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 5 g6 des
    im Beispiel 1 verwendeten Polyvinylpyrrolidons hergestellt.
    Beispiel 3
    Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 10 gb eines
    Polyäthylenglykols mit einem Molgewicht von ca. 400 bzw.
    ca. 1000 bzw. ca. 2000 hergestellt.
    Beispiel 4
    Analog Beispiell wird die Pepsinzubereitung mit 5 % eines
    Polyäthylenglykols mit einem Molekulargewicht von ca. 400
    bzw. ca.=1000 bzw. ca. 2000 hergestellt. ;
    Beispiel 5
    20 g dialysierter-salzsaurer Schweinemagenextract (mit 38 PE/g)
    _ werden -analog- B41spiel 1 mit 5 bzw. 10 Gw:% des irbeispiel -1
    .verwendeten -Polyvinylpyrrolidons zubereitet.
    Beispiel 6
    20 g dialysierter salzsaurer Schweinimagenegtrakt (mit 38 PE/g)
    werden analdg Beispiel 1 mit 5 bzw. 10 Gew.% eines Polyäthylen-
    glykols mit einem Kolekulargewicht von ca. 400 bzw. ca. 1000
    bzw. ca. 2000 zubereitet.
    Beispiel 7
    Analog Beispiel 1 wird die Pepsinzubereitung mit 10 % eines
    1t1-Gemisches aus dem im Beispiel 1 verwendeten Polyvinyl-
    pyrrolidon und einem Polyäthylenglykol mit einem Molekular-,
    gewicht von ca. 1000 zubereitet.
    Beispiel 8
    Analog Beispiel 1 bis 7 werden Pepsinzubereitungen mit
    kristallisiertem Pepsin 1:10 000 bzw. 1:6 000, bzw. 1:3 000,
    bzw. getrockneter Schweinemagenegtrakt mit ca. 300 PE/g
    zubereitet.

Claims (1)

  1. Patentansprüche 1. Verfahren zur Stabilisieruhg.wäBriger Pepsinlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man der wäßrigen Pepsin- lösung 1.bis 20 Gew.% eines Polyäthylenglykols mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von ca. 400 bis ca. 6000, eines Polyvinylpyrrolidons mit einem mittleren Molekulargewieht im Bereich von ca. 10000 - 40000 oder eines,Qemisches aus einem solchen Polyä,thylenglykol und einem solchen Polyvinylpyrrolidon zumischt. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der wäßrigen Pepsinlösung 5 bis 10 Gew.% des Stabilisators bzr. Stabilisatorengemisches zumischt. 3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 - 2, dadurch gekenn- zeichnet, daB bei Verwendung eines Gemisches aus einem Polyäthylenglykol und einem Polyvinylpyrrolidon die Stabilisatoren im Verhältnis 1s1 und in einer Menge von 5 - 10 Gew.% eingesetzt werden.
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