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Verfahren zur Gewinnung reiner, pyrogenfreier Streptokinase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung reiner, pyrogenfreier Streptokinase, eines Enzyms der Streptokokken.
Streptokinase ist ein Stoffwechselprodukt bestimmter haemolytischer Streptokokken mit fibrinolyti- scher und zellauflösender Wirkung. Daneben werden von den Bakterien auch Desoxyribonucleasen, Strep- tolysin 0, Hyaluronidase, Proteasen und Peptidasen gebildet. Nachdem man die Eigenschaften der Strep- tokinase erkannt hatte, versuchte man, sich die Wirkung in der Klinik zunutze zu machen und gab sie lo- kal in Form ihrer Lösungen zur Beseitigung oder Verhinderung fibrinöser Abscheidungen in der Pleurahöhle, zur Wundreinigung usw. Durch Streptokinase werden vor allem die Fibrinbarrieren, die den Zutritt der
Antibiotika und der humoralen Infektabwehr zum Erkrankungsherd erschweren, ausgeräumt.
Es stellte sich heraus, dass durch intramuskuläre und auch buccale Verabreichung von Streptokinase-Präparaten eine gün- stige Wirkung auf die Heilung entzündlicher Prozesse ausgeübt wird, insbesondere bei solchen, bei denen eine Thrombose bestimmter Venen die Ursache war. Meistens enthalten aber die bisher isolierten Strep- tokinase-Präparate auch wesentliche Mengen der fiebererzeugenden Pyrogene und der noch in kleinen Do- sen wirksamen Enzyme Streptodornase, Streptolysin 0 und Hyaluronidase. Der intravenösen Applikation von Streptokinase standen bisher die zahlreichen Nebenerscheinungen (Schüttelfrost, starker Temperatur- anstieg, Blutdruckabfall) entgegen. Es hat deshalb an Versuchen nicht gefehlt, die Streptokinase von diesen Nebenerscheinungen erzeugenden Substanzen zu reinigen.
Ein Verfahren zur Gewinnung reiner, pyrogenfreier Streptokinase ist aber bisher noch nicht bekanntgeworden.
Es wurde bereits versucht, die Streptokinase, die durch Züchtung von Streptokokken hergestellt wird, aus dem Kulturfiltrat zu gewinnen. Die Isolierung gelingt aber-insbesondere bei grösseren Ansätzen - nur mit schlechter Ausbeute. Auf der präparativen Elektrophorese, mit der nur kleine Mengen aufgetrennt werden können, kann eine industrielle Produktion nicht aufgebaut werden. Die Säulenchromatographie ist zur Zeit für grosstechnische Herstellung noch nicht geeignet.
Es wurde nun ein Verfahren gefunden, nach dem grosse Mengen reiner, pyrogenfreier Streptokinase aus den Kulturfiltraten der Streptokokken gewonnen werden können. die die erwähnten Nachteile der bisherigen Präparate nicht besitzt und intravenös gut verträglich ist. Es beruht darauf, dass die Streptokinase durch Fällung mit Calciumphosphat, Methanol und Ammonsulfat von Nebenprodukten gereinigt wird, wobei Methanol und Calciumphosphat auch in umgekehrter Reihenfolge angewendet werden können.
Man geht dabei so vor, dass man Kulturfiltrate von Streptokokkenkulturen nach an sich bekannter Entfernung des unerwünschten Streptolysins durch Calciumphosphatbehandlung bei den Eiweisskonzentrationen von 0,05 bis 5, 000/0, vorzugsweise von 0,2 bis 1, 0%. mit Methanol fällt, wobei der Salzgehalt der Lösung - ausgedrückt durch die spezifische elektrische Leitfähigkeit - zwischen 50 0-1 und 200 ' liegt, der PH-Wert der zu fällenden Lösungen zwischen 4,0 und 7, 5 - vorzugsweise zwischen 5,0 und 6, 0-liegt, die Methanolkonzentration zwischen 15 und 35'li, vorzugsweise 25-300/0, beträgt, der Fällungsvorgang bei einer Temperatur von 00 bis-15 C,
vorzugsweise bei 0 bis-5 C, erfolgt, aus der auf diese Weise gewonnenen Streptokinaselösung bei PH 5,0-8, 0-vorzugsweise von PH 6, 5 bis 7, 5 - unter mechanischem Rühren mit gesättigter Ammonsulfatlösung bei einer Temperatur von 1 bis 30 C, vorzugsweise von
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1falls in ein Trockenpräparat überführt, während die Hyaluronidase und die Streptodornase in der Mutter- lauge verbleiben.
Im einzelnen wird bei dem erfindungsgemässen Verfahren zweckmässig so vorgegangen, dass man die
Kulturfiltrate, die zunächst z. B. durch Ultrafiltration angereichert werden, durch Calciumphosphatbe- handlung vorreinigt, um Streptolysin zu entfernen, entsprechend dem von Herbert und Todd (Biochem.
J. 35 [1941], S. 1124) angegebenen Verfahren. Bei dem nun folgenden Schritt der Methanolfällung ist es notwendig, den Salzgehalt der zur Fällung verwendeten Lösungen hoch zu halten, d. h., dass ihre Leit- fähigkeit nicht über zul betragen soll. Liegt nämlich eine geringere Leitfähigkeit vor, so ist mit einer spezifischen Ausfällung hochaktiven Materials nicht zu rechnen. Man erhält vielmehr dann Fällungen, die sich in ihrer Reinheit nur wenig vom Ausgangsmaterial unterscheiden. Diese Verhältnisse werden in der
Fig. 1 dargestellt. Auf der Abszisse sind die Methanol-Konzentrationen angegeben, auf der Ordinate die Christ.-Einh. Streptokinase pro mg Trockensubstanz.
Es ist zu ersehen, dass bei hohem Salzgehalt, in diesem Fall 97 und einem PH-Wert der Lösung von 5,5 eine mit dem Methanolgehalt bis zu einem
Grenzwert zunehmende Reinheit der Fällungen auftritt, wogegen bei einer Leitfähigkeit von 1000 ss- und einem pH-Wert der Lösung von 5,5 der Gehalt an Christ.-Einh. Streptokinase pro mg Trockensubstanz in allen Fällungen der gleiche bleibt.
Eine weitere für die optimale Fällung mit Methanol wichtige Grösse ist der pH-Wert der Lösung. Je nachdem, ob die Lösung sich mehr im sauren oder im alkalischen Bereich befindet, ist das Maximum der
Reinigung bei einer andern Methanol-Konzentration zu finden. Auch hinsichtlich des Reinigungseffektes und der Ausbeute bestehen erhebliche Unterschiede. Aus der Fig. 2, in der wiederum auf der Abszisse die
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Methanol liegt, die Reinheit aber bei den folgenden Methanolkonzentrationen wieder abnimmt. Beim pH-Wert 4, 6 liegt das Optimum bei 20%. Allerdings ist die Reinigung als nicht besonders gut zu bezeichnen. Anders sehen die Verhältnisse beim pH-Wert 5,5 aus. Hier liegt das Optimum der Fällung bei 20-25%, wobei eine Reinigung um das 4fache erzielt werden kann.
Bei steigendem pH-Wert verschiebt sich nun das Optimum der spezifischen Fällung immer mehr zu höheren Methanolkonzentrationen, beim pH-Wert 7,0 liegt das Maximum zwischen 25-30% und beim pH-Wert 8 zwischen 45 und 50%. Es ist zwar 'bemerkenswert, dass die Reinigung beim pH-Wert 8 sich den beim pH-Wert 5,5 gewonnenen Werten nähert, doch ist-wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht-hier die Ausbeute auf Grund der hohen Methanolkonzentration und der zahlreichen, immer etwas streptokinasehaltigen Vorfällungen unbefriedigend.
Tabelle
Ausbeute an Streptokinaseeinheiten bei der Methanolfraktionierung von Rohstreptokinase
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<tb>
<tb> pH-Wert <SEP> der <SEP> Fällung <SEP> spezifische <SEP> Methanolfrak-Ausbeute
<tb> elektrische <SEP> tionierungsbereich
<tb> Leitfähigkeit
<tb> 3,0 <SEP> 97 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 15% <SEP> 30%
<tb> 4, <SEP> 6 <SEP> 97 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 30% <SEP> 45%
<tb> 5,5 <SEP> 97 <SEP> 0-1 <SEP> 15 <SEP> - <SEP> 35% <SEP> BO% <SEP>
<tb> 7,0 <SEP> 97 <SEP> ! <SEP> 3- <SEP> 25-35% <SEP> 25% <SEP>
<tb> 8, <SEP> 0 <SEP> 97 <SEP> 0-1 <SEP> 45-55% <SEP> 15% <SEP>
<tb>
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Von entscheidender Bedeutung ist auch die bei der Fällung herrschende Temperatur, die unter 00 liegen muss, vorzugsweise aber -3 bis -50 betragen muss.
Liegt sie bei 00, ist mit einer zu starken Inaktivierung zu-rechnen, liegt sie unter-50, werden zu viel unspezifische Eiweisse mitgefällt. Wie bereits erwähnt, ist die Ausbeute bei der Fällung in Gegenwart verschiedener PH-Werte unterschiedlich.
Aus dem Vorhergehenden ergibt sich, dass die Fällung mit Methanol dann optimal ist, wenn bei einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit zwischen 50 R-l und 200 n-i, einem PH zwischen 4,0-7, 5 - vorzugsweise zwischen 5,0 und 6, 0-15-35% Methanol-vorzugsweise aber 25-30%-und einer Temperatur von 0 bis-15 C, vorzugsweise von 0 bis -50c, erhalten wurde. Nach der Methanolfällung schliesst sich in dem erfindungsgemässen Verfahren eine Ammonsulfatfällung an. Zunächst wird eine Vorfraktion, die hauptsächlich aus unspezifischen Eiweissverbindungen besteht, abgetrennt und durch Erhöhung der Ammonsulfatsättigung die Streptokinase ausgefällt. In der Mutterlauge verbleiben die nach der Methanolfällung noch vorhandenen Restmengen Streptodornase und Hyaluronidase.
Es ist überraschend, dass durch Ammonsulfatfraktionierung eine Reinigung zu erreichen war, da in Vorversuchen mit Kulturrohfiltraten mit Ammonsulfat keine Erhöhung der biologischen Aktivität erzielt werden konnte. Vielmehr ist die Ammonsulfatfällung erst dann erfolgreich, wenn sie auf ein vorgereinigtes Produkt angewendet wird.
Die erfindungsgemäss hergestellten Streptokinase-Präparate besitzen in der Tiselius-ElektrophoreseApparatur der Firma Beckman Instruments Inc., Fullerton, California (Phosphatpuffer PH 7, 5 ; li = 0, 15 und 20C) eine Beweglichkeit von-u x 105 cmz sec.-1 volt-1 m 3, 8 und in der Ultrazentrifuge der Firma
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können gegebenenfalls auf bekannte Weise in Trockenpräparate umgearbeitet werden. Der Streptokinasegehalt dieser Präparate beträgt etwa 450 Einh./Gamma Stickstoff. Sie enthalten weniger als 2 Einh.
Hyaluronidase, weniger als 10 Einh. Streptodornase und weniger als 5 Einh. Streptolysin/100 000 Einh.
Streptokinase.
Das erfindungsgemäss gewonnene Material wurde in der Klinik auf seine Wirksamkeit und Verträglichkeit bei Patienten, die an Thrombosen des arteriellen oder venösen Kreislaufes litten, angewendet. Es konnten unbedenklich 300000 Einh. pro die appliziert werden, wobei die Infusion der Streptokinase in physiologischer Glucoselösung während einer Zeitdauer von 4-5 h erfolgte. Die Verträglichkeit war gut. Nebenerscheinungen, wie Temperatursteigerungen, Schüttelfröste und Blutdruckabfälle, konnten nicht beobachtet werden. Der Nachweis der Pyrogenfreiheit wird nach Title 42 - Public Health, Chapter I- Public Health Service - Federal Register, Vol. 25 [1960], June 30, pp 6134/6135, vorgenommen.
Die Prüfung erfolgt an Kaninchen durch Messung der Körpertemperatur vor der intravenösen Injektion der zu untersuchenden Streptokinaselösung und nachher stündlich bis zu 6 h. Die Körpertemperatur der Kaninchen wird mit einem thermoelektrischen Messinstrument bestimmt, dessen Messgenauigkeit : k 0, 050 beträgt. Für die Prüfung werden gesunde Kaninchen von etwa 1, 8 bis 2,2 kg Körpergewicht ausgesucht. Sie werden in gleichmässig temperierten, ruhigen Ställen in Einzelkäfigen gehalten. Tiere, deren Körpertemperaturen vor der Injektion unter 38, 50 und über 39, 50 liegen, werden für die Prüfung nicht verwendet. Auch werden Tiere mit Temperaturschwankungen von mehr als t 0, 3 für die Prüfung nicht herangezogen. Die Streptokinaselösung wird 5 Kaninchen in die Ohrvene injiziert.
Die nach dem beanspruchten Verfahren hergestellten Streptokinase-Präparate wurden dieser Prüfung unterzogen und sind frei von Pyrogenen.
Die Fermentbestimmungen wurden nach den folgenden Vorschriften ausgeführt :
Streptokinase : Christensen, L. R., J. Clin. Invest. 28 [1949], S. 163
Streptodornase : M. Kunitz, J. Gen. Physiol. 33 [1950], S. 363
Streptolysin 0 : Minimum Requirements : Streptokinase-Streptodornase Abs. 3,
21. National Institutes of Health [May 1, 1951]
Hyaluronidase : Dorfman, A. und M.L.Ott, J.Biol.Chem. 172 [1948], S. 367
Beispiel : 1000 l streptokinasehaltiges Kulturfiltrat von streptokinasebildenden Streptokokken mit einem Streptokinasegehalt von 30 Einh./Gamma Stickstoff und 12 000 Einh. Hyaluronidase, 15 000 Einh.
Streptodornase und 9 000 Einh. Streptolysin 0 pro 100 000 Einh. Streptokinase werden auf 15 l, z. B. durch Ultrafiltration, eingeengt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 5,5, wozu eine der bekannten Säuren - z. B. Essigsäure - dienen kann, beträgt die spezifische elektrische Leitfähigkeit der Lösung etwa 60 0-1. Darauf wird die Lösung auf -1 bis -40c abgekühlt und bis zu einer Konzentration von 300to mit Methanol versetzt.
Der durch Zentrifugation gewonnene Rückstand wird in Aqua desto gelöst, die Lösung mit 1 n Calcium- acetatlösung (25 ml/l Lösung) versetzt und mit einer Lösung von sekundärem Natriumphosphat ein PH- Wert von 7,3 eingestellt. Dabei bildet sich ein Calciumphosphat-Niederschlag, der-durch Zentrifugation von der Lösung getrennt wird. Der Überstand wird bei PH 7,5 unter mechanischem Rühren mit gesättigter
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Ammonsulfatlösung auf 29, 5% Sättigung gebracht, das entstandene Präzipitat abgeschleudert und der Ammonsulfatgehalt des Überstandes wieder unter mechanischem Rühren auf 42% Sättigung erhöht.
Der Niederschlag, der in einer Kühlzentrifuge isoliert wird, besteht aus Streptokinase mit einem Gehalt von 450 Einh./Gamma Stickstoff und ist frei von Pyrogenen sowie von Hyaluronidase, Streptodornase und Streptolysin 0 (weniger als 2 Einh. Hyaluronidase, weniger als 10 Einh. Streptodornase und weniger als 5 Einh. Streptolysin 0 pro 100 000 Einh. Streptokinase). Die Anreicherung durch das erfindungsgemässe Verfahren beträgt - auf Stickstoff bezogen - das 15fache.