DE2025917B2 - Verfahren zur Herstellung von N hochalpha-Acetyl-2-O-methyltyrosinoxytocins - Google Patents

Description

H — Cys — Tyr — He — GIn — Asn — Cys — Pro — Leu — GIyNH₂

in Dimethylformamid bei 0 bis +5"C einen aktiven Ester der Essigsäure oder das Anhydrid oder ein Halogenid dieser Säure einwirken läßt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Zubereitung eines neuen NVAzetyl^-O-methyltyrosin-oxytocins, das inhibierende Eigenschaften aufweist.

Bisher wurden in der Literatur zwei Analoge des Oxytocins beschrieben, die in vivo inhibierende Eigenschaften aufweisen: das !-Penizillamin-oxytocin und das N'-Karbamyl^-O-methyltyrosin-oxyiocin. Die Synthese dieser beiden Analoge ist sehr schwierig: bei dem ersten ist es unumgänglich notwendig, eine unnatürliche, schwierig zugängliche Aminosäure zu benutzen, bei dem zweiten Analogen ist insbesondere die letzte Synthesestufe — die oxydative Zyklisierung des Disuifhydrylderivats zu einem Disulfid — mit Schwierigkeiten verbunden. Darüber hinaus zeigten pharmakologische Untersuchungen mit den Penizillarninderivaten an Ratten, daß es bei deren Infusion zu einem Absinken des Blutdrucks kommt, was ein Hindernis für die klinische Anwendung bedeuten könnte. Im Vergleich mit den gemäß dieser Erfindung zubereiteten Substanzen sind ferner die vorerwähnten Analoga — was die Inhibition der uterotonischen Wirksamkeit des Oxytocins anbelangt — bei Versuchen in vivo um ungefähr das Dreifache weniger wirksam. In einigen Fällen wurde bei der Anwendung des N^a-Karbamyl-2-O-methyltyrosin-oxytucins bei Ratten eine Hämoglobinurie unbekannter Herkunft beobachtet.

Auf Grund der Forschungsarbeiten gelang es. ein neues Analogon des Naturhormons Oxytocin herzustellen, in dem beide freien funklionellen Gruppen substituiert sind: die «-Aminogruppe des Cysteins in der Stellung 1 ist mit einer Azetylgruppe azyliert, das Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe des Tyrosins in der Stellung 2 ist sodann durch eine Methylgruppe substituiert. Das gewonnene neue Analogen des Oxytocins, das N*-Azetyl-2-O-methyltyrosin-oxytocin, entspricht der Formel 1:

Me

Ac — Cys — Tyr — Ue — GIn — Asn — Cys — Pro — Leu — GIyNH₂

Diese Substanz zeigt sowohl in vitro, als auch in vivo sehr starke Inhibitionseigenschaften auf. die die Anwendung dieser Analogene des Oxytocins in der klinischen Praxis ermöglichen.

Ein Kennzeichen der Erfindung eines Verfahrens zur Zubereitung eines neuen N*-Azetyl-2-O-methyltyrosinoxytocins mit inhibierenden Eigenschaften der Formel I

Me

Ac — Cys — Tyr — lie — Gin — Asn — Cys — Pro — Leu besteht darin, daß auf das 2-O-Methyltyrosin-oxytocin der Formel II

GIyNH₂

Me

H — Cys — Tyr — He — GIn — Asn — Cys — Pro — Leu — GIyNH₂

(H)

im Dimethylformamid bei einer Temperatur von 0 bis 5°C mit einem aktiven Ester der Essigsäure, zweckmäßigerweise mit 5-Chlor-chinolyl-8-azetat, oder mit dem Anhydrid oder dem Halogenid dieser Säure eingewirkt wird.

Wie ersichtlich, kann dieses neue Analogen des Oxytozins durch eine einfache Synthese aus dem kommerziell zugänglichen Methyloxytocin (aus dem 2-O-Methyltyrosin-oxytocin) durch Einwirkung eines geeigneten Azylierungsmittels, vorzugsweise des S-Chlorchinolyl-e-azetats oder des Anhydrids oder des Halogenids der Essigsäure, zubereitet werden.

Das zubereitete neue N^a-Azetyl-2-O-methyltyrosin-oxytocin zeigte in Versuchen mit isolierten Rat-

tengebJrmttuero — bet den fUr die Bestimmung der Aktivität des Oxytocins Üblichen Standardbedingwngen: 0,5 mM Ca⁺⁺, 25⁰C, isometrische oder isotonische Kontraktionsregistrotion — keine uterotonische Aktivität.

Wenn diese Substanz (in einer 15- bis 30mal höheren Konzentration als das Qxytocin) 3 bis 4 Minuten vor der Oxytocindosis in die Nährlösung zugegeben wurde, wirkte sie wie ein Inhibitor. Gemäß der parallelen Verschiebung der Kurve der Oxytocinwirksarakeit in Anwesenheit dieser Substanz handelt es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um den kompetitiven Typ der Inhibition.

Auf einer Rattengebärmutter in vivo (estrus oder proestrus) bewirkten die Dosen von 50 μg des Analegons ein 5 bis IO Minuten andauerndes Anhalten der Kontraktiltätigkeit, welche durch die Infusion von Oxytocin (1 bis 21.E./St.) hervorgerufen wurde. Wurde das Analogon in der Infusion angewendet, kam es zu einer Verminderung des Gebärmuttertonus (und parallel damit aach zu einer Kontraktion) auf 50% bei einer Infusionsmenge, die ungefähr das Sieben- bis Zwölffache der Infusionsmenge des Oxytocins betrug: eine vollständige Inhibition des Oxytocins stellte sich bei einem Mengenverhältnis von 15:1 bis 20:1 ein.

Bei einmaliger Verabfolgung kommt es nach Verschwinden des Analogons zur totalen Restitution der Oxytocinwirkung (keine Tachyfylaxe). Auf die spontane Gebärmuttertätigkeit hat das Analogon keine Einwirkungen.

Im Hinblick auf die vorerwähnten Inhibitionseinwirkungen auf die Gebärmuti^r besitzt das N*-Azetyl-2-O-methyltyrosin-oxytucin ρ tentielle Anwendungsmöglichkeiten in der Geburtshilfe und dies insbesondere beim abortus imminens. beim partus praematurus imminens, bei tetania uteri und bei einer übermäßig starken Gebärmuttertätigkeit während der Entbindung.

Das erfindungsgemäß hergestellte neue N^a-Azetyl-2-O-methyltyrosin-oxytocin wurde pharmakologisch in folgenden Tests geprüft:

a) Rattengebärmutter in vitro.

b) Rattengebärmutter in vivo.

c) Milchdrüse,

d) Blutdruck.

a) Rattengebärmutter in vitro

Unter Bedingungen, welche für Bioassay von Oxytocin, d. h. bei Verwendung von östrogenisiertcn Gebärmüttern einer bei Konzentration von Calcium 0,5 mM, Magnesium 0,5 mM und bei Temperatur 3O⁰C üblicherweise benutzt werden, wirkte N*-AzetyI-2-O-methyltyrosin-oxytocin als Inhibitor des Oxytocins. Der Inhibierungseffekt macht sich mehr oder weniger parallel durch eine Verschiebung der Effektivitätskurve von Oxytocin im Gebiet höherer Konzentrationen bemerkbar. Für die Bestimmung der pA₂-Werte wurde die Temperatur noch weiter auf 19 bis 20° C erniedrigt, um die Tendenz von Gebärmutterstreifchen zu spontanen Kontraktionen und zur Reaktion »alles oder nichts« einzuschränken. Der Durchschnitt von zwölf pA₂-Werlbestimmungen betrug 7,03. Dagegen strebte man in Experimenten auf Streifchen aus trächtigen Gebärmuttern an sich den Bedingungen im lebendigen Organismus anzunähern, und deswegen wurde eine Lösung mit einer Konzentration von Calcium 1,5 mM, Magnesium 0,5 mM und bei einer Temperatur von 37" C verwendet. Unter diesen Bedingungen wiesen die Gebärmutterstreifchen in der Mehrheit spontane Aktivität

auf, Oxytocin erhöhte die Amplitude und Frequenz von Kontraktionen. Bei allen Versuchen auf GebärmUttern von Ratten in verschiedenen Trächiigkeitsstadien inhibierte das studierte Derivat die Wirkung von Oxytocin, und zwar auch in solchen Fällen, in

ίο welchen es eigene niedrige Aktivität aufwies. Das Ausmaß der Inhibierung schwankte in einzelnen Experimenten bei demselben Verhältnis des Inhibitors zu Oxytocin nur mäßig.

b) R&ttengebärmutter in vivo

Bei gleichzeitiger Infusion des studierten Derivats und des Oxytocins inhibierte das Derivat ausgeprägt Wirkungen von Oxytocin in Versuchen auf Ratten unter Einfluß von Ostrogenen. Auch in diesen Experimenten wurde bei einer Infusion des bloßen Derivats in einigen Fällen eine mäßige Erhöhung von Gebärmuttermotilität beobachtet, welche 30% der spontanen Aktivität nicht überschritt. Auf trächtigen Ratten inhibierte N^a-Azetyl-2-O-methyltyrosin-oxytocin den Wirkungen von Oxytocin. Messung der Wirkung bei trächtigen Ratten ist in bezug auf unregelmäßige Kontraktionen beträchtlich schwieriger und weniger genau als bei bstrogenisierten Ratten; allerdings kann man auch dann eindeutig feststellen, daß die Inhibierung von Oxytocin bei trächtigen Ratten von einem höheren Grad als bei den östrogenisierten war. Auch bei diesen Versuchen rief in einigen Fällen das studierte Derivat eine mäßige Erhöhung der Gebärmuttermotilität hervor, aber gleichzeitig inhibierte es die Wirkung der folgenden Dosis von Oxytocin.

c) Milchdrüse

Die Wirkungen auf die Milchdrüse sind nicht eindeutig. In sechs von acht Experimenten rief das studierte Derivat niedrige Kontraktionen, welche 20% der maximalen Wirkung von Oxytocin nicht überschritten, hervor, und inhibierte nur ganz schwach die Wirkung von Oxytocin. Nur in zwei Fällen rief es keine Kontraktion hervor und inhibierte ausgeprägt Oxytocin. Parallel mit diesen Versuchen wurde die Wirkung des Derivats in Lösung ohne Magnesium, aber sonst unter denselben Bedingungen auf Streifchen ans Milchdrüsen verfolgt. In Abwesenheit von Magnesium wirkte das Derivat als Inhibitor von Oxytocin in allen Fällen.

d) Blutdruck

Bis zur Dosis 50 _:ig 100 g Gewicht rief N"-Azetyl-2-O-methyUyrosin-oxytocin bei despinalisierten Ratten keine Änderung des sysmologischen Druckes hervor. Bei gleichzeitiger Dosierung mit Lysinvasopressin inhibiert es presorische Antworten. Die Inhibierungswirkung läuft schnell an und läßt mit der gegebenen Dosis proportionaler Geschwindigkeit

te nach.

Beispiel 1

Zu einer Lösung von 2-0-Methyltyrosin-oxytocin (100 mg) in Dimethylformamid (0,5 ml) wird 5-Chlorchinolyl-8-azetat (65,1 mg) zugesetzt. Nach 60stündigem Stehen bei 0°C wird die Lösung mit Äther (25 ml) verdünnt, die ausgeschiedene Substanz abnitriert und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 89,4 mg.

Diese Substanz wird nach Auflösung in einem Pyridiii-Azetat-Puffer f2m1) über eine CM-Sephadex-(tQO—270 mesh, 4,5 meq/gJ-Kolonne (1,4 χ 40 cm) filtriert, und dies wiederum mit einem Pyridin-Azetat-Puffer (pH = 6,5) und bei einer Laufgeschwindigkeit von 15 inl/St. Das das azylierte Peptid enthaltende Eluat wird nach Eindickung auf ein kleinrs Volumen gefriersubliraiert. Man gewinnt 61 mg einer Substanz, die nach Auflösung in 1 M-Essigsäure (2 ml) über eine Βίο-Gel P 4-Kolonne (1,2 χ 104 cm) mit 1 M-Essigsäure bei einer Laufgeschwindigkeit von S ml/St, filtriert wird. Die dem Monomer des azylierten Peptids entsprechenden Fraktionen (zu je 1,8 ml) werden vereinigt, auf ein kleines Volumen eingedickt und gefriersublimiert. Man gewinnt 57 mg (57%) des Produkts, (α) ο -87,0° (c, 0,316, 1 M-Essigsäure). Das Produkt ist sowohl elektrophoretisch als auch chromatographisch rein, R_F = 0,50(n-Butanol—Essigsäure—Wasser 4:1:1), 0,72 (n-Butanol—Pyridin—Essigsäure— Wasser 15:10:3:6), 0,29 (sek.Butano!-90% Ameisensäure—Wasser 75:13. 5:11, 5). Aminosäuren-Analyse (20stündige Hydrolyse mit 6M-HCL): Asp 1,00. Gin 1,00, Pro 0,92, GIy 0.96. Cys 1.1. He 0.92. Leu 1.00. Tyr 0,68. Tyr(Me) 0.28.

Die Probe (Ur die Elementaranalyse wird 24 Stunden beim I mm Hg ober P_aO₅ getrocknet, die Gewichtsabnahme wahrend dieses Trocknungsprozesses beträft 6,20%.

Analyse Wr C₄₀H₁₀N₁₂O₁₃Sa · 3H₂O (11 Ϊ7.2):

Berechnet ... C 49,45, H 6,68, N 15,05%;
gefunden .... C 49,50, H 6,96, N 14,43%.

Beispiel 2

Zu einer Lösung von 2-O-Methyltyrosin-oxytocin (II) (20 mg) in Dimethylformamid (0,1 ml) wird Azetanhydrid (6,0 mg) zugesetzt. Nach 60stündigem

is Stehen bei 0' C wird das Reaktionsgemisch mit Äther (10 ml) verdünnt, die abgeschiedene Substanz abfiltriert und getrocknet. Die Reinigung der Substanz erfolgt auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute beträgt 10 mg (50%). Das Produkt ist elektrophoretisch und chromatographisch mit der im Beispiel 1 gewonnenen Substanz identisch.

Aminosäuren-Analysc:Asp 1,09, GIn 1,05, Pro 1.05. GIy 1.00. Cys 0.92. He 0.9.*. Leu l,01.Tyr0.65. Tyrlmel 0.23.

Claims (1)

1. Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung dss N*-Amyl~2-O-roethyltyrasin-Qxytocins der Formel I

   Me

   Ac — Cys — Tyr — Ue — GIn — Asn — Cys — Pro — Uu — GIyNH₂ (I)

   gekennzeichnet dadurch, daß man auf das 2-O-Methyltyrosin-oxytocin der Formel II

   Me