JPH09500014A

JPH09500014A - 菌類のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ

Info

Publication number: JPH09500014A
Application number: JP7502358A
Authority: JP
Inventors: エム．ヒョート，カーステン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-06-28
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 1997-01-07
Also published as: AU7068494A; US5879664A; US6346244B1; EP0708825A1; DK76893D0; WO1995000636A1

Abstract

(57)【要約】アスペルギルス(Aspergillus)属に属する菌類、特にＡ．オリザ又はＡ．ニガーから獲得できる菌類のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを開示する。更に、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの組換的製造を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】菌類のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ発明の分野本発明は活性の組換菌類タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、前記菌類タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含んで成る組成物、及びそれを利用する方法；前記菌類タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体、並びにこのDNA構築体を有するベクター及び細胞に関する。更に、本発明は、伝統的及び組換的DNA技術の両方の利用を介する菌類タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを調製する方法に関する。発明の背景タンパク質ジスルフィドレドックス剤（酸化還元剤）、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ類(PDI)及びチオレドキシン類(TRX)の様々な目的のための利用が最近知られている。タンパク質ジスルフィドレドックス剤は次の一般反応を触媒する：ここでＲ₁及びＲ₂は、同一のペプチドにおける又は２本のポリペプチドにおける同一又は異なるタンパク質を表わし、Enz_oxは酸化状態のジスルフィドレドックス剤であり、そしてEnz_redは還元状態のジスルフィドレドックス剤である。EC ５．３．４．１はタンパク質の−Ｓ−Ｓ−結合の転移を触媒することのできる酵素を称し、そしてEC １．６．４．４及びEC １．８．４．２はそれぞれ仲介因子としてのNAD（Ｐ）Ｈ及びグルタチオンとの反応を触媒する酵素の例である。このタイプの活性体はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、タンパク質ジスルフィドリダクターゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドトランスヒドロゲナーゼ及びスルフヒドリルオキシダーゼと命名されている。タンパク質のジスルフィド結合はシステイン残基間で形成され、そしてタンパク質の三次構造を安定化せしめる一般的機能を有する。これらは同一又は別々のポリペプチドのシステイン残基間で形成されることができる。ジスルフィド結合は多種多様のタンパク質、例えば酵素、構成タンパク質等の中に存在している。酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ等の如くの触媒性タンパク質であり、一方構成タンパク質はケラチン等の如くの骨格タンパク質でありうる。毛髪、羊毛、革、獣皮、食品、飼料（fodder）、よごれ及びヒト組織中のタンパク質はジスルフィド結合を含む。これらの材料の一部のPDI及びTRXの処理、並びにレドックスパートナーは既に述べられている。ヒト及び動物の毛のウェービング、ストレイトニング、リムービング及びソフトニングのためのTRXの利用はPigietら（EP 183506及びWO 8906122）により述べられている。Pigiet（US 4771036）は白内障の予防及び回復のためのTRXの利用も述べている。Schreiber（DE 2141763 及びDE 2141764）はヒトの毛髪の形態を変えるためのタンパク質ジスルフィドトランスヒドロゲナーゼの利用を述べている。Pigiet（EP 225156）は変性タンパク質のリフォルディングのためのTRXの利用を述べている。生物反応における金属で触媒される酸化的損傷を予防するためのTRXの利用がPigietら（EP 237189）により述べられている。 Toyoshimaら（EP 277563 及びEP 293793）は、特に組換的に製造されたタンパク質の再生に関連する、還元されたジスルフィド結合又は不自然に酸化されたジスルフィド結合を有するタンパク質の再生を触媒するためのPDIの利用を述べている。Brockway(EP 272281)、並びにKing and Brokway(EP 276547)はそれぞれヒトの毛髪の再構成のための及び羊毛の処理のためのPDIの利用を述べている。超高温滅菌したミルクの処理のためのスルフヒドリルオキシダーゼがUS 4,632,905 ，US 4,081,328及びUS 4,053,644に記載されている。Schreiber（DE 2,141,763 及びDE 2,141,764）はヒトの髪の形態を変えるためのタンパク質ジスルフィドトランスヒドロゲナーゼの利用を述べている。かかる酵素の利用は全て、タンパク質ジスルフィド結合の遊離のタンパク質スルフヒドリル基に至る還元及び／又はタンパク質のスルフヒドリル基のタンパク質ジスルフィド結合に至る酸化、及び／又は同一もしくは別々のポリペプチドのジスルフィド結合の転移に、そして時折り順序立ったこれらの過程の利用に関連する。タンパク質ジスルフィドレドックス剤は２種類の主な酵素群、即ち、チオレドキシンタイプ(TRX)及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼタイプ(PDI)に分類できる。これらは先に、TRX及び／又はPDIのタンパク質工学誘導体、化学修飾体及びハイブリドを得るために改変されうる (ENG)。 TRXはレドックス活性性ジスルフィド／ジチオールを有し、且つチオール−ジスルフィド変換反応を触媒する12−KDaのタンパク質である。(EdmanらNature 31 7：267-270，1985；Holmgren，Ann．Rev．Biochem．54：237-271，1985；Holmgr en，J．Biol．Chem．264：13963-13966，1989)。PDIは２つのサブユニットより成り、それぞれはTRXに相同性な２つのドメインより成る。 TRX及びPDIは数多くの起源から入手できる：PDI：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは主に哺乳動物源、例えばウシ（YamauchiらBiochem．Biophys．Res ．Commun．146：1485-1492，1987）、ニワトリ(ParkkonenらBiochem．J．256：1 005-1011，1988)、ヒト(RapilajaniemiらEMBO J.６：643-649,1987)，Mouse（Go ng、らNucleic Acids Res．16：1203，1988）、ウサギ（FliegelらJ．Biol．Che m．265：15496-15502，1990）及びラット（EdmanらNature 317：267-270，1985 ）から同定されている。実にPDIは酵母からも単離されている（Tachikawaら、J ．Biochem．110：306-313)。 TRX：チオレドキシンはバクテリオファージ、細菌、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（Wallace and Kusher，Gene 32：399-408，1984）及びバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）(Chenら、J．Biol Chem．262：8 787-8798，1987)並びに真核細胞から同定されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)の製造を、従来技術の方法により可能であったものよりも大量の酵素が製造されるように、且つ経済的な方法で製造されるように促進することが所望されるであろう。特定の用途にとって改良された特性を有する工学変異体(ENG)もかなり所望されており、そして標準の組換的DNA技術に基づき、下記の様々な方法により調製できる：１）１又は数個のアミノ酸変化を有するENGを獲得するための、TRX又はPDIをコードする遺伝子を改変する部位特異的又はランダム突然変異誘発の利用；２）PDIのサブユニットの二量化の阻害あるいは回避、それ故PDIモノマー量の増大；３）PDI又はTRXのNH₂−又はCOOH末端領域が欠けているPDI又はTRXの部分モノマーの生産；４）PDI，TRX及び／又はENGのハイブリドの作製；５）１）〜４）の生成物の化学的又は酵素的改変；６）１）〜５）の任意の組合せ。１）に従って製造されたENGはLundstromら（J．Biol．Chem．267：9047-9052 ，1992）に記載されており、そして３）と５）との組合せはPigiet（WO 8906122 ）に記載されている。 PDI及びTRXは、その天然起源とは別に、植物、動物、ヒト又は微生物PDI又はT RXをコードする組換DNAの、様々な宿主、例えば微生物における発現、それに続くこの宿主生物の抽出物又は上清液からのPDI又はTRXの精製により得られうる。これはENGについても当てはまる。天然起源からのTrxの調製は、Luthman and Ho lmgren(Biochem．121：6628-6633，1982)，Wada and Buchanan（「Thioredoxins , structure and function」（Gadal編）Editions du Centre National de la R echerche Scientifique），Porqueら（J．Biol．Chem．245：2362-2379，1970）及びLaurentら（J．Biol．Chem．239：3436-3445）により述べられており、そしてTRXの組換的製造はKrauseら（J．Biol．Chem．266：9494-9500）により述べられている。PDI又はスルフヒドリルオキシダーゼは、Lambert and Freedman（Bio chem J．213：225-234，1983）、Starnesら（US 4632905）及びHammerら（US 48 94340）による天然起源から、並びにとりわけYamauchiら（Biochem．Biophys．R es．Commun．146：1485-1492，1987）による組換技術によって調製されている。最後に、ENGの組換的製造がLundstromら（J．Biol．Chem．267：9047-9052，199 2）により述べられている。発明の概要本発明者は、糸状菌類から菌類タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNA配列をクローニングし、そして同種又は別種の生物、特に微生物、そして好ましくは菌類おけるかかるDNA配列から活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの発現を獲得することに成功した。従って、第一の観点において、本発明は糸状菌類、特にアスペルギルス（Aspe rgillus）属に属する菌類から獲得できる活性タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、そして特にＡ．オリザ（A．oryzae）又はＡ．ニガー（A．niger）から獲得できるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連し、ここでこの酵素はアスペルギルス・オリザIFO 4177又はアスペルギルス・ニガーA524に由来する精製タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応性である。単離酵素の配列から、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは58−61及び 393−396位において２個の−Cys−Ｘ−Ｙ−Cys−サブユニットを有することがわかりうる。本発明は従って、少なくとも一方のサブユニットがそのままとなっている本発明の酵素の活性なトランケート形態も含んで成る。その例は添付のSEQ ID No.３の残基20〜100、残基330〜450、又は残基360〜430に対応するアミノ酸配列を有する酵素、又は課題の本発明の酵素の対応の配列でありうる。この観点のもとで、本発明は特に添付のSEQ ID No.３に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基１−131，１−141，１−143，１−163，１−174又は１−281を含んで成るタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素に関する。更に、特異的な酵素は、以下の配列Leu-Ile-Arg-Glu-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Val-Asn-Lys-Hi s-Leu ；で延長されている添付のSEQ ID No.３に示すアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基１−115を含んで成るタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素；並びに添付のSEQ ID No.３に示すアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基１−511を含んで成り、511のアミノ酸残基がGluからAlaに変更されている酵素である。本明細書において、「由来する」なる語はIFO 4177又はA524株により生産されたタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを意味するのみならず、これらの株から単離されたDNA配列、例えばSEQ ID No.１及びSEQ ID No.２によりコードされるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、又はそれに相同性の配列であってタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有し、且つこのDNA配列により形質転換された宿主生物において生産されるポリペプチドをコードする配列をも意味する。従って、本発明はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素に関連し、ここでこの酵素はアスペルギルス・オリザIFO 4177に由来する精製されたタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して生起された抗体と免疫学的に反応性である。本明細書において、「相同性」なる語は、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素をコードするDNAのそれと同一のプローブと一定の特殊な条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドを意味する（その条件は、例えば、5XのSSCの中で予備浸漬し、そして5XのSSC，5XのDenhardt溶液、50mM のリン酸ナトリウム、pH6.8及び50μｇの変性した音波処理済みの牛胸腺DNAの溶液の中で約40℃で１ｈプレハイブリダイズし、次いで50μCiの32−Ｐ−dCTPラベル化プローブの添加された同一の溶液の中でハイブリダイゼーションさせ、次いで2XのSSC，0.2％のSDSで40℃で30分にわたり３回洗浄することである）。より詳しくは、この語は上記のDNAの改変、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのアミノ酸配列とは異なる配列はもたらさないが、そのDNA構築体を導入する宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換、又は異なるアミノ酸配列をもたらしめ、そしてそれ故、可能性として、天然酵素とは異なる特性を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ突然変異体をもたらしめうる異なるタンパク質構造をもたらしめるヌクレオチド置換を含むことを意図している。可能な改変のその他の例は、配列への１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、配列のいづれかの末端への１もしくは複数のヌクレオチドの付加、又は配列の末端もしくは配列内への１もしくは複数のヌクレオチドの欠失である。本明細書において、活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなる語は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのそれと類似の活性を有する酵素、即ち、反応Ｉを触媒できる酵素を意味することを意図する。この活性は還元したBowman− Birkダイズマメインヒビターの酸化的リフォルディングに基づくアッセイで決定されうる（例えば、以下の材料と方法の欄に記載）。本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼについて利用している「組換」なる語は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNA配列で形質転換された細胞により生産されることを意味するつもりである。即ち、組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは親生物又は別の生物のいづれかにより生産されうる。更なる観点において、本発明は上記で定義している本発明の活性の組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関する。かかるDNA構築体はイントロン（その例は添付のSEQ ID No.１に示す）及び／又は本発明の成熟タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする部分に対して天然の調節因子（その例は添付のSEQ ID No.２にある）を含んで成りうる。更なる別の観点において、本発明は本発明のDNA構築体を有する組換発現ベクター、本発明のこのDNA構築体又はこの発現ベクターのいづれかを有する細胞、及び本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの製造のための方法に関連し、これにおいては上記の本発明の細胞をこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの製造を誘導する条件下で培養し、そして次にこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをこの培養物から回収する。最後に、本発明は本発明の活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含んで成る組成物及び様々な用途におけるその利用の方法に関する。表及び図面の簡単な説明本発明を添付の表及び図面において更に説明し、ここで表１は公開された真核系PDIアミノ酸配列の整合を示す：ウシ（Bos taurus）（YamauchiらBiochem．Biophys．Res．Commun．146：1485-1492，1987）、ニワトリ（Gallus gallus）(ParkkonenらBiochem．J．256：1005-1011，1988)、ヒト (Homo sapiens)(RapilajaniemiらEMBO J．６：643-649，1987)、マウス（Mus mu sculus）(Gong、らNucleic Acids Res．16：1203，1988)、ウサギ（Oryctolagus cuniculus）（FliegelらJ．Biol．Chem．265：15496-15502，1990）、ラット（ Rattus norvegicus）（EdmanらNature 317：267-270，1985）、及び酵母（Sacch aromyces cerevisiae）（Tachikawa et al.，J．Biochem．110：306-313）。表２はPDIアミノ酸配列の整合を示す：アルファルファ（Medicago sativa）(S horrosh and Dixon，Plant．Mol．Bio．19：319-32 1，1992)、Ａ．オリザ（本発明）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）(Tachika waらJ．Biochem．110：306-313)、ウシ（Bos taurus）（YamauchiらBiochem．Bi ophys．Res．Commun．146：1485-1492，1987）、ラット（Rattus norvegicus）（EdmanらNature 317：267-270，1985）及びマウス（Mus musculus）（Gong、ら Nucleic Acids Res．16：1203，1988）。図１は実施例１に更に記載の発現プラスミドpCaHj431，pCaHj432，pCaHj433及びpCaHj434の構築を示す。発明の詳細な説明Ａ．オリザの株から単離した本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのアミノ酸配列を別の起源のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのそれと整合させ、そしてサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のそれ（Gen Bank Acc. No．M62815）と約38％の同一性及びアルファルファのそれ（Ge ne Bank Acc．No．11499）と約30％の同一性を有することが示された。このような相同性は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ間である種の進化的関係があり、そして本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが別のクラスのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを代表しうることを示唆するものと解釈される。本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNAは他の生物、例えば動物、特に哺乳動物、昆虫、植物、又は微生物から単離されうる。本明細書において、特に注目の起源は、細菌及び菌類、例えば酵母及び糸状菌類である。上記の通り、単離された酵素の配列は、本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが58−61及び393−396位において２つの− Cys−Ｘ−Ｘ−Cys−サブユニットを有することを示す。従って、本発明は少なくとも一方のサブユニットがそのままである本発明の酵素の活性のトランケート形態も含んで成る。この例は、添付のSEQ ID No.３のうちの残基20−100、残基330−450又は残基360−430に対応するアミノ酸配列を有する酵素、又は課題の酵素の対応の配列でありうる。この観点のもとで、本発明は特に、添付のSEQ ID No.３に示すアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基１−131(SEQ ID No.10)，１−141(SEQ ID No.９)，１−143( SEQ ID No.８)，１−163(SEQ ID No.７)，１−174(SEQ ID No.６)，１−281(SEQ ID No.５)又は25−225(SEQ ID No.12)を含んで成るタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素、又はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示すその変異体／誘導体に関する。更に特別の酵素は下記の配列：Leu-Ile-Arg-Gl u-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Val-Asn-Lys-His-Leu（SEQ ID No.11）；で延長された添付のSEQ ID No.３に示すアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基１−115を含んで成るタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素；及び添付のSEQ ID N o.３に示すアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基１−511を含んで成る酵素であり、ここで511位のアミノ酸残基はGluからAlaへと変わっている（SEQ ID No.４）。上記の組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする本発明のDNA構築体のDNA配列は好ましくは添付のSEQ ID No.１(ゲノムDNA)又はSEQ ID No.２（ cDNA）に示すものである。１又は複数のコドンで相違するが、この組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする前記配列の類似体も本発明の範囲に属する。本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのトランケート形態をコードする類似のDNA配列も本発明の一部である。従って、DN A配列はSEQ ID No.１又は好ましくはSEQ ID No.２に由来しうる。本発明のDNA構築体のDNA配列は公知の方法により単離できうる。即ち、このDN A配列は、例えばこの配列を有するものと予測される生物からcDNA又はゲノムライブラリーを樹立し、そして慣用の手順により陽性クローンをスクリーニングすることにより単離できる。かかる手順の例は、標準の技術に従うSEQ ID No.３に示す完全アミノ酸配列もしくはそのサブ配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーション（Sambrookら、1989を参照のこと）、及び／又は上記のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を発現するクローンの選択、及び／又はSEQ ID No.３に示すアミノ酸配列、特にそのうちのSEQ ID N o.８に示しているアミノ酸残基１−143を含んで成るタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して生起された抗体と反応するタンパク質を生産するクローンの選択である。 cDNA又はゲノムライブラリーから本発明のDNA構築体を単離する好適な方法は、SEQ ID No.３のアミノ酸残基１−515を含んで成る本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのアミノ酸配列に基づいて調製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の利用による。例えば、このPCRは米国特許第4,683,202号又はR．K．Saikiら（1988）に記載の技術を用いて実施していてよい。他方、本発明のDNA構築体のDNA配列は樹立された標準の方法、例えばBeaucage and Caruthers（1981）に記載のホスホアミジット法により、又はMatthesら（1 984）に記載の方法により合成的に調製できうる。ホスホアミジット法によると、オリゴヌクレオチドを例えば自動DNA合成装置で合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、そして適当なベクターの中でクローニングする。最後に、このDNA構築体はゲノムと合成との複合型、合成とcDNAとの複合型、又はゲノムとcDNAの複合型起源であって、合成、ゲノム又はcDNA起源のフラグメントを標準の技術に従って（適宜）ライゲートすることにより調製されたものであってよく、そのフラグメントは組換DNA分子全体のうちの様々な部分に対応する。本発明の酵素のトランケート形態をコードするDNA構築体は対応の方法で天然的に作られうる。本発明のDNA構築体をもつ組換発現ベクターは組換DNA手順に簡単にかけることのできうる任意のベクターであってよく、そしてこのベクターの選択は往々にしてそれを導入する宿主細胞に依存するであろう。即ち、このベクターは自己複製式ベクター、即ち、染色体外物質として存在するベクター（その複製は染色体の複製とは独立している）、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体であってよい。他方、このベクターは、宿主細胞に導入したときに宿主細胞のゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであってよい。このベクターにおいて、DNA配列は適当なプロモーター配列に作動連結されているべきである。このプロモーターは任意のDNA配列であって、選択した宿主細胞において転写活性を示すものであってよく、そしてそれは宿主細胞にとって内因性又は外因性のいづれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。本発明のDNA構築体の転写を誘導するのに適当なプロモーターの例は、特に細菌宿主においては、Ｅ．コリのlacオペロン、ストレプトマイセス・コエリカラー(Stre ptomyces coelicolor)アガロース遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacill us amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、バチルス・スブチリスのxylA及びxylB遺伝子のプロモーター等であってよい。菌類宿主における転写のために有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロティナーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ．オリザアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザトリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ニドゥランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターである。本発明の発現ベクターは適当な転写ターミネーターを含んで成ってよく、そして真核細胞においては、本発明の組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNA配列に作動連結されているポリアデニル化配列を含んで成ってよい。終止及びポリアデニル化配列は適切にはプロモーターと同一の起源に由来しうる。このベクターはベクターが注目の宿主細胞において複製できるようにするDNA 配列を更に含んで成りうる。かかる配列の例はプラスミドpUC19，pACYC177，pUB 110，pE194，pAMB１及びpIJ702の複製起点である。このベクターの選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞の欠陥を補う遺伝子、例えばＢ．スブチリスもしくはＢ．リシェニホルミス由来のdal遣伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を授ける遺伝子も含んで成りうる。アスペルギルス選択マーカーの例には、amdS，argB，niaD、及びヒグロマイシン耐性を供するマーカーのsCが含まれる。更に、この選択は例えばWO 91/17243に記載の如く、同時形質転換によって成し遂げられうる。細胞内発現はある観点、例えば宿主細胞として一定の細菌を利用する場合には有利でありうるが、一般には発現は細胞外的であることが好ましい。本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、又はSEQ ID No.３〜12に示すアミノ酸配列を含んで成るそのトランケート形態は、発現されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを培養培地に分泌させるプレ領域を更に含んで成りうる。所望するなら、このプレ領域は本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼにとって天然であるか、又は別のプレ領域もしくはシグナル配列で置換されていてよく、それは対応のプレ領域をコードするDNA配列の置換により簡単に成し遂げられる。本発明のDNA構築体、プロモーター、ターミネター及びその他の因子をそれぞれライゲートするのに、並びにそれらを複製にとって必須の情報を含む適当なベクターに挿入するのに用いられる手順は当業者に公知である（例えば、Sambrook ら（1989）を参照のこと）。上記した本発明のDNA構築体又は発現ベクターのいづれかを含んで成る本発明の細胞は本発明のポリペプチドの組換的製造において宿主細胞として好適に利用される。この細胞は宿主の染色体の中にこのDNA構築体を組込むことにより簡単に本発明のDNA構築体により形質転換されうる。この組込みが一般に好都合であること考えられ、なぜならDNA配列は細胞の中に安定的に維持され易いからである。宿主の染色体へのDNA構築体の組込みは相同的又は異種的組換等による慣用の方法に従って実施されうる。他方、この細胞は別のタイプの宿主細胞に関して上記した通りにして、発現ベクターにより形質転換されうる。本発明の細胞は高等生物の細胞、例えば哺乳類、鳥類、昆虫又は植物の細胞であってよいが、好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は菌類（酵母を含む）の細胞である。適当な細菌の例は、グラム陽性菌、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リシェニホルミス、バチルス・レンタス(Baci1lus lentus)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（ Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス(Bacillus lautus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・サーリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、又はストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividan s)もしくはストレプトマイセス・ミュリナス（Streptomyces murines）、あるいはグラム陰性菌、例えばＥ．コリである。細菌の形質転換は例えばプロトプラスト形質転換、又は公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行ってよい。酵母細胞は好適にはサッカロマイセス又はシゾサッカロマイセス(Schizosacch aromyces)の種から選ばれ、例えばサッカロマイセス・セレビジエである。菌状菌類は好都合にはアスペルギルスの種に属し、例えばアスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーである。他方、フサリウム（Fusarium）の種、例えばＦ．オキシスポルム（F．oxysporum）を宿主細胞として利用できる。菌類細胞はプロトプラスト形成及びプロプラストの形質転換、それに続く公知の方法での細胞壁の再生を包括する方法により形質転換できうる。アスペルギルス宿主細胞の形質転換にとって適当な手順はEP 238,023号に記載されている。フサリウム種を形質転換するのに適当な方法はMalardierら、1989に記載されている。更なる別の観点において、本発明は本発明の組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを製造する方法に関連し、この方法は、上記の宿主細胞を、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの製造を誘導する条件のもとで培養し、そしてその細胞及び／又は培養培地からこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを回収することを含んで成る。これらの細胞を培養するのに用いる培地は、注目の宿主細胞を増殖させ、そして本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの発現を獲得するのに適当な任意の慣用の培地であってよい。適当な培地は商業的供給者から入手できるものであるか、又は公開の処方（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）に従って調製されうるものである。得られるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、細胞の崩壊の後に必要とされるならば遠心もしくは濾過によりその培地から細胞を分離させ、塩、例えば硫酸アンモニウムによりその上清液もしくは濾液のタンパク質性成分を沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等による精製により、培地から回収できうる。むろん、本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、注目の糸状菌類の天然宿主又は親生物を培養し、次いでこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを伝統的な方法でその培養培地から回収することによって精製することも可能である。本発明は本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含んで成る組成物にも関する。この組成物は適切にはグラム当り0.01〜200mgの酵素タンパク質、好ましくはグラム当り0.01〜20mgの酵素タンパク質、特にグラム当り0.01〜２ mgの酵素タンパク質、あるいはグラム当り0.02〜0.2mgの酵素タンパク質、又はグラム当り0.01〜0.2mgの酵素タンパク質を含みうる。本発明の組成物は当業界に公知のその他の成分、例えば賦形剤、安定剤、充填剤、界面活性剤等を含みうる。本発明の組成物は任意の慣用の形態、例えば粉末、ペースト、液体又は顆粒形態において処方されうる。この酵素は酵素安定剤の添加により液体の中で安定化されうる。通常、本発明の組成物の溶液のpHは５〜10であり、そしてある状況においては7.0〜8.5である。その他の酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ又はリパーゼを、独立に、又は組合せ添加剤として、本発明の組成物の中に含ませてよい。本発明の組成物は骨格タンパク質、特に毛髪、皮膚及び羊毛のトリートメントもしくは分解、獣皮の脱毛及びソフトニング、布帛のトリートメント及びクローニング、洗剤への添加剤、食品及び飼料の増粘及びゲル化、ベーカリー又はパスタ製品のグルテンの強化のために、並びに目の痛みの緩和のための医薬として利用できうる。本発明を以下の実施例において更に説明するが、それらは本発明を限定するものではない。材料と方法株アスペルギルス・オリザIFO 4177：日本国，大阪府，淀川区十三反町２丁目 17−25の大阪発酵研究所より入手アスペルギルス・ニガーA524（ATCC 16882）アスペルギルス・ニガーTSA1 Ｅ．コリ DH₅αF PDI活性の決定 PDIはJamesら、Cell 67：581-589，1991に記載のインスリン還元アッセイを利用してアッセイした。プラスミド pUC19，pMT1560，pTOC90 実施例実施例１アスペルギルス・オリザ及びアスペルギルス・ニガーのPDIをコードする遺伝子のクローニング１．１ PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドのデザイン様々な生物由来のPDIは活性部位残基付近で特に非常に相同性である。図１において、以下の７つのPDI遣伝子生成物を整合させた：ウシ（Bos taurus）PDI（ YamauchiらBiochem．Biophys．Res．Commun．146：1485-1492，1987）、ニワトリ（Gallus gallus）PDI（ParkkonenらBiochem．J．256：1005-1011，1988）、H uman（Homo sapiens）PDI（Rapilajaniemi et al．EMBO J．６：643-649，1987 ）、マウス（Mus musculus）PDI（Gong et al.，Nucleic Acids Res．16：1203 ，1988）、ウサギ（Oryctolagus cuniculus）PDI（Fliegel et al.，J．Biol．C hem．265：15496-15502,1990）、ラット（Rattus norvegicus）PDI（EdmanらNat ure317：267-270，1985）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）PDI（Tachikawa らJ．Biochem．110：306-313）。各サブユニットは２つの活性中心を含み(Freedmanら、Cell 57：1069-1072，1 989)、そしてこれらの活性中心のまわりにおける相同性は極めて強かった。Ｎ− 末端に最も近い活性中心の共通アミノ酸配列は整合から−APWCGHCK−と決定され、そしてペプチド−WCGH CK−をコードし、そして５′末端においてEcoRＩ部位で延長されているオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した：Ｃ−末端に最も近い活性中心の共通アミノ酸配列は−YAPWCGHCK−と決定され、そしてアンチセンスにおけるペプチド−YAPWCGをコードし、且つ５′末端においてBamHＩ部位で延長されているオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。これらのオリゴデオキシリボヌクレオチド（プライマー4762及び4763）を、Ａ．オリザ及びＡ．ニガー由来のゲノムDNAからPDIをコードする遺伝フラグメントを増幅するPCR反応においてプライマーとして用いた。１．２ PDIをコードする遺伝子のフラグメントの増幅及びクローニングゲノムDNAをYeltonら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：1470-1474，1984)に記載の通りにして、アスペルギルス・オリザIFO 4177及びアスペルギルス・ニガーA524から調製した。 PCR反応混合物は、Clontech laboratories Inc.により供給され、且つ記載の通りに希釈してあるTaq DNAポリメラーゼバッファー、250μＭづつのdATP，dCTP ，dGTP及びdTTP，100pmolづつのプライマー4762及び4763、並びにＡ．ニガー又はＡ．オリザのいづれかのゲノムDNA 0.5μｇを含む。全反応容量は0.1mlとし、そして0.05mlのパラフィン油をかぶせておいた。以下のプログラムをCetus Perkin Elmer熱サイクラーでランさせた：１サイクル：94℃で２min．（温度が94℃に達したら、Clontech laboratories I nc.より供給された2.5ＵのTaq DNAポリメラーゼを加えた）。 10サイクル：94℃で１min.、50℃で１min.、そして72℃で２min.。 30サイクル：94℃で１min.、55℃で１min.、そして72℃で２min.。１サイクル：72℃で５min.。この反応混合物をアガロースゲルに載せ、そしてＡ．オリザ及びＡ．ニガーDN Aは両者共約1.1kbのフラグメントをもたらした。これらのフラグメントをEcoRＩ及びBamHＩで消化し、そしてpUC19(Yanisch-Pe rronら、Gene 33：103-119，1985)にライゲートさせた。そのライゲート混合物をＥ．コリ DH₅αF'（Woodcockら、Nucleic Acids Res．（1989）17：3469-3478 ）に形質転換させた。組換プラスミドをSequenase（商標）キット(United Stete s Biochemical)及びＭ13万能プライマーを用い、その製造者の仕様に従って配列分析にかけた。この分析ハ、Ａ．オリザ及びＡ．ニガーの両ケースにおいて、他のPDI遺伝子と相同な配列が増幅及びクローニングされたことを確証せしめた。１．３Ａ．オリザPDIをコードする遺伝子のゲノムクローニングＡ．オリザ由来のゲノムDNAをNew England Biolabs Inc.より供給された下記の制限酵素により消化した： HindIII，BamHＩ，BamHＩ＋HindIII，EcoRＩ，EcoRＩ＋HindIII，SalＩ，SalＩ＋HindIII，BglII，BglII＋HindIII，pstＩ及びpSTＩ＋HindIII。消化後、その反応混合物を１％のアガロースゲルで泳動させ、そしてImmobilon Ｎ（商標）膜 (Millipore Corporation)にその製造者の仕様に従ってブロットした。この膜を、BamHＩ−EcoRＩフラグメントとして単離され、且つ³²Ｐで放射ラベルした、クローニング済みのＡ．オリザPCR生成物でプローブした。ストリンジェンシー洗浄の後、その膜をオートラジオグラフィーにかけた。Ａ．ニガー由来のゲノムDNAを以下の制限酵素で消化した：BglII，BamHＩ，Ba mHＩ＋BglII，EcoRＩ，EcoRＩ＋BglII，SalＩ，SalＩ＋BglII，HindIII，HindII I＋BglII，PstＩ及びPstＩ＋BglII。サザンブロットを、Ａ．オリザについて記載の通りにして、プローブとしてＡ．ニガーPCR生成物のみを用いて、作った。１．４ゲノムＡ．オリザライブラリーの構築サザン分析は、Ａ．オリザPDI遺伝子が6.8kbのBglIIフラグメント上に位置していることを示した。ゲノムＡ．オリザDNAをBglIIで消化し、そして５kb〜8.5k bに範囲するフラグメントをアガロースゲルから単離した。そのサブクローニング及びサザン分析は、Ａ．オリザPDI遺伝子が2.3kbのBamHＩ，HindIIIフラグメントの上に位置していることを示した。ゲノムオリザDNAをBamHＩ及びHindIIIで消化し、そして1.9〜３kbに範囲するフラグメントをアガロースゲルから単離した。このフラグメント混合物を、BamHＩ及びHindIIIで消化しておいたpUC19にライゲートさせた。このライゲーション混合物をＥ．コリ DH₅αF'を形質転換するのに用いた。形質転換したＥ．コリを、アンピシリン選択を利用しながら10枚のアガープレートの上にまいた。１．５Ａ．オリザゲノムライブラリーのスクリーニングこれらのライブラリーをGergenら（Nacleic Acids Res．７：2115-2136，1979 ）に記載のフィルターコロニーハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニングした。サザンブロットのために用いたプローブもコロニーハイブリダイゼーションのために用いた。陽性クローンを単離し、そしてPDIフラグメントの配列からデザインした配列決定用プライマーを用いる配列分析により確認した。所望のフラグメントを含むプラスミドのうちの一つをpCaHj425と命名した。１．６遣伝子の配列遺伝子は、Applied Biosystemsより供給されたTaq Dye Deoxy(商標)ターミネーターサイクル配列決定用キットを用い、その製造者の仕様に従って配列決定した。配列の反応物をApplied Biosystems373A DNAシーケンサーに泳動させ、そしてそのデーターをApplied Biosystemsより供給されたMacintoshコンピュータープログラムSeq Edバージョン1.0を用いて評価した。Ａ．オリザ遺伝子の配列を添付のSEQ ID N0.１に示す。実施例２に記載の通りにして獲得した精製PDIのアミノ酸組成は、SEQ ID No. １に示すDNA配列から推定した組成に従う。他のPDI遣伝子との相同性及び共通スプライシング配列から、SEQ ID No.２に示すcDNA配列が考えられた。誘導されたタンパク質配列をSEQ ID No.３に示す。実施例２Ａ．オリザPDI遺伝子のトランケート形態の発現２．１発現プラスミドの構築Ａ．オリザのPDI遺伝子を、停止コドンを導入することによって様々な位置でトランケートした。これは、５′末端にBamHＩ部位を有する５′PCRプライマーと、HindIII部位をそれぞれが有する８種のトランケート体に対応する８種の３ ′プライマーとを用いるPDI遺伝子のPCR増幅により行った。５′プライマーの配列は下記の通りである：８種の３′プライマーの配列は下記の通りである：プライマー5215は、PDI遺伝子アミノ酸１−115の、配列Leu-Ile-Arg-Glu-Leu- Leu-Gln-Glu-Leu-Val-Asn-Lys-His-Leuによる延長と、それに停止コドンが続くことを誘導した。プライマー5397はアミノ酸131の後に停止コドンを導入した。プライマー5895はアミノ酸141の後に停止コドンを導入した。プライマー5399はアミノ酸143の後に停止コドンを導入した。プライマー5894はアミノ酸163の後に停止コドンを導入した。プライマー5893はアミノ酸174の後に停止コドンを導入した。プライマー6314はアミノ酸281の後に停止コドンを導入した。プライマー5204はアミノ酸511の後に突然変異E511A（置換を意味する）及び停止コドンを導入した。発現プラスミドを、プライマー5205と、5215，5397，5895，5399，5894，5893 ，6314又は5204のいづれかとの組合せ、及び鋳型としてのpCaHj425を用い、標準のPCR条件を利用して、PCR増幅により構築した。作製したPCRフラグメントはBam HＩ及びHindIIIで消化し、そして同じ酵素で消化したpMT1560(例えばPCT/DK94/0 0138)に挿入した（図３参照）。構築したプラスミドはpCaHj 432（プライマー52 15由来）、pCaHj 433（プライマー５３９７由来）、pCaHj 441（プライマー5895 由来）、pCaHj 434（プライマー５３９９由来）、pCaHj 440（プライマー5894由来）、pCaHj 439（プライマー５８９３由来）、pCaHj 445（プライマー6314由来）及びpCaHj 431（プライマー５２０４由来）と命名した。２．２Ａ．オリザIFO 177の形質転換各プラスミドpCaHj 432，pCaHj 433，pCaHj 441，pCaHj 434，pCaHj 440，pCa Hj 439，pCaHj 445及びpCaHj 431をＡ．オリザIFO4177に、公開EP特許出願第238 ,023号に記載の手順に従ってamdS選択プラスミドpToC 90（WO 91/17243に記載）と一緒の同時形質転換により形質転換させた。各プラスミドのいくつかの形質転換体を評価した。２．３Ａ．ニガーのTSA １の形質転換各プラスミドpCaHj 441，pCaHj 434，pCaHj 440及びpCaHj 439をＡ．オリザと同じ手順により、Ａ．ニガーTSA １に形質転換した。各プラスミドのいくつかの形質転換体を評価した。実施例３アスペルギルス・オリザPDI トランケート体の発酵精製及び特性決定３．１Ａ．オリザIFO 4177形質転換体粗トランケートPDI調製品を、YPM培地（１リットル：５ｇのDifco酵母抽出物、10ｇのDifcoペプチドン、20ｇのマルトース）を含む振盪フラスコの中でのＡ．オリザ又はＡ．ニガーのpCaHj 432，pCaHj 433，pCaHj 441，pCaHj 434，pCaH j 440，pCaHj 439，pCaHj 445又はpCaHj 431形質転換体の発酵により獲得した。その上清液を濾過により回収した。このPDI トランケート体遺伝子生成物をPha rmacia LKB Biotechnology AB Uppsala，Swedenからの１mlのHiTrap Q（商標）アニオン交換体を用い、その製造者の仕様に従って部分精製した。画分を集め、そしてジスルフィドイソメラーゼ活性の測定及びSDS PAGEにより分析した。 pCaHj 434形質転換体は、未形質転換株の上清液にはない約14kD（SDS PAGE）のタンパク質を分泌した。イオン交換によるこのタンパク質の富化には、ジスルフィドイソメラーゼ活性の上昇が伴った。約14kDのバンドをSDS Pageゲルからブロットし、そしてApplied Biosystems 473Aタンパク質シーケンサーを用いてＮ −末端アミノ酸配列決定した。７個のアミノ酸の配列がThr-Ala-Glu-Ala-Pro-Se r-Aspとして決定された。この配列はＡ．オリザのタンパク質配列の残基24−30 に相当する。アミノ酸配列から予測されるトランケート体のサイズは従って13.2 kDであった。これにより、予測のサイズを有し、且つ触媒的に活性であるpCaHj 434遺伝子生成物が上清液に分泌されることが考えられうる。 pCaHj 441形質転換体はpCaHj 434形質転換体と同じサイズのタンパク質を分泌した。また、このタンパク質のトランケート体の富化にはジスルフィドイソメラーゼ活性の上昇が伴い、pCaHj 441遺伝子生成物が触媒的に活性な分泌されたタンパク質であることを実証した。 pCaHj 440形質転換体は未形質転換株にはない約16kDのタンパク質を分泌した。予測のサイズは、pCaHj 43生成物と同じＮ−末端配列と仮定して、15.7kDである。イオン交換によるタンパク質の富化にはジスルフィドイソメラーゼ活性の上昇が伴い、これもpCaHj 440遺伝子生成物が触媒的に活性な分泌されたタンパク質であることを実証する。 pCaHj 445形質転換休は未形質転換株にはない約30kDのタンパク質を分泌した。予測のサイズは、pCaHj 434生成物と同じＮ−末端配列と仮定して28.6kDである。イオン交換によるタンパク質の富化にはジスルフィドイソメラーゼ活性の上昇が伴い、これもpCaHj 440遺伝子生成物が触媒的に活性な分泌されたタンパク質であることを実証する。３．２Ａ．ニガーTSA １形質転換体 pCaHj 441，pCaHj 434，pCaHj 440及びpCaHj 439の形質転換体を対応のＡ．オリザ形質転換体と同じようにして評価したが、ただしＡ．ニガーにより分泌されたタンパク質のＮ−末端アミノ配列は決定しなかった。他の全ての観点において、Ａ．ニガー形質転換体とＡ．オリザ形質転換とでは同じ結果が得られた。しかしながら、トランケート体の発酵収量は、一般にＡ．ニガーがＡ．オリザ−よりも低かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/52 ＡＢＬ 8828−4ＢＣ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/38 8828−4Ｂ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 8828−4Ｂ 1/21 1/19 9152−4Ｂ 9/90 1/21 9549−4ＢＡ２３Ｌ 1/04 9/90 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/58 ＡＢＬ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:685） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．糸状菌類により生産可能な、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素。２．前記糸状菌類がアスペルギルス属に属する、請求項１記載の酵素。３．前記アスペルギルスがＡ．オリザ又はＡ．ニガーである、請求項２記載の酵素。４．Ａ．オリザIFO 4577又はＡ．ニガー524 (ATCC 16882)に由来する精製されたタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応性である、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示す酵素。５．Ａ．オリザIFO 4177に由来する精製されたタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応性である請求項４記載の酵素。６．SEQ ID No.３に示すアミノ酸配列を有する請求項５記載の酵素。７．オリジナルの酵素のアミノ酸配列（SEQ ID No.３）のうちの残基１−131( SEQ ID No.10)，１−141(SEQ ID No.９)，１−143(SEQ ID No.８)，１−163(SEQ ID No.７)，１−174(SEQ ID No.６)，１−281(SEQ ID No.５)又は25−224(SEQ ID No.12)に対応するアミノ酸を含んで成る、請求項１〜６のいづれか１項記載の酵素のトランケート形態となっている、活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素。８．配列Leu-Ile-Arg-Glu-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Val-Asn-Lys-His-Leuで延長された残基１−115(SEQ ID No.11)に対応するアミノ酸、又はAla残基で延長された残基１−510に対応するアミノ酸を含んで成る、請求項１〜６のいづれか１項記載の酵素のトランケート形態となっている、活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素。９．Ala残基で延長された残基１−514に対応するアミノ酸を含んで成る、請求項１〜６のいづれか１項記載の酵素のトランケート形態となっている、活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素。 10．請求項１〜９に記載のいづれかの酵素と比較したときに、アミノ酸配列において、少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％の相同性を示すことを特徴とする、活性のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素。 11．糸状菌類により生産可能なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNA構築体。 12．前記糸状菌類がアスペルギルス属に属する、請求項11記載のDNA構築体。 13．前記アスペルギルスがアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザである、請求項12記載のDNA構築体。 14．請求項１〜10のいづれか１項記載の組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体。 15．前記DNA配列が糸状菌類に由来する、請求項11〜14のいづれか１項記載のD NA構築体。 16．前記DNA配列がアスペルギルス属の種、特にＡ．オリザ又はＡ．ニガーの株に由来する、請求項15記載のDNA構築体。 17．前記DNAが、添付のSEQ ID No.１又は２に示すタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするDNAのそれと同一のプローブとハイブリダイズし、且つタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を示すポリペプチドをコードする、請求項11〜16のいづれか１項記載のDNA構築体。 18．前記DNA配列が添付のSEQ ID No.１又はSEQ ID No.２に示すものである、請求項11〜17のいづれか１項記載のDNA構築体。 19．前記DNA配列が、請求項12又は13記載のDNA配列に対し、遺伝子コードの結果として、縮重している、請求項11〜18のいづれか１項記載のDNA構築体。 20．請求項11〜19のいづれか１項記載のDNA構築体を含んで成る組換発現ベクター。 21．前記DNA構築体がプロモーター配列及び任意的に分泌シグナルをコードする配列と作動連結している、請求項20記載のベクター。 22．請求項11〜19のいづれか１項記載のDNA構築体又は請求項20もしくは21記載のベクターを含んで成る細胞。 23．微生物細胞である、請求項22記載の細胞。 24．細菌細胞又は菌類細胞である、請求項23記載の細胞。 25．前記菌類細胞がグラム陽性菌の細胞、例えばバチルスもしくはストレプトマイセス属の細胞、又はグラム陰性菌の細胞、例えばエッシェリヒア属の細胞であり、そして前記菌類細胞が酵母細胞、例えばサッカロマイセス属の細胞、又は糸状菌類の細胞、例えばアスペルギルスもしくはフサリウム属の細胞である、請求項24記載の細胞。 26．アスペルギルスの種の株、特にＡ．オリザ又はＡ．ニガーの株由来の細胞を、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの製造を誘導する条件のもとで培養し、そして次にこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをこの培養物から回収することによる、請求項１〜10のいづれか１項記載のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素を製造する方法。 27．請求項18〜22のいづれか１項記載の細胞を、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの製造を誘導する条件のもとで培養し、そして次にこのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをこの培養物から回収することによる、請求項１〜７のいづれか１項記載のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素を製造する方法。 28．組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素をプロ酵素の形態で発現させ、そしてこの細胞を、このタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのこのプロ酵素を成熟酵素へと変換することのできるタンパク質分解酵素の存在下で培養する、請求項27記載の方法。 29．請求項１〜10のいづれか１項記載の組換タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素を含んで成る組成物。 30．無塵顆粒、安定化液体又は保護酵素の形態の、請求項29記載の組成物。 31．0.01〜200mgの酵素タンパク質／ｇを含む、請求項29又は27記載の組成物。 32．0.01〜20mgの酵素タンパク質／ｇを含む、請求項31記載の組成物。 33．0.01〜２mgの酵素タンパク質／ｇを含む、請求項31記載の組成物。 34．0.02〜0.2mgの酵素タンパク質／ｇを含む、請求項31記載の組成物。 35．0.01〜0.2mgの酵素タンパク質／ｇを含む、請求項31記載の組成物。 36．別の酵素、例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ及び／又はセルラーゼを更に含んで成る、請求項29〜35のいづれか１項記載の組成物。 37．薬理組成物である、請求項29〜36のいづれか１項記載の組成物。 38．骨格タンパク質を処理するための方法であって、請求項29〜36のいづれか１項記載の組成物をこの骨格タンパク質に適用することを含んで成る方法。 39．前記骨格タンパク質がヒトの毛髪もしくは皮膚；又は動物の毛髪もしくは皮膚である、請求項38記載の方法。 40．前記方法が、前記毛髪をウェービング、ストレートニング、リムービング、分解もしくはソフトニングする；又は前記皮膚をソフトニング及び／もしくは回復させることを含む、請求項39記載の方法。 41．革の脱毛及び／又は柔軟化のための方法であって、請求項29〜36の組成物のいづれかをこの革に適用することを含む方法。 42．布帛をクローニングするための方法であって、請求項29〜36の組成物のいづれかをこの布帛に適用することを含む方法。 43．洗浄剤による処理を含む、請求項42記載の方法。 44．食品及び／又は飼料製品を増粘及び／又はゲル化するための方法であって、請求項29〜36の組成物のいづれかをこの食品又はまぐさに適用することを含む方法。 45．ベーカリー又はパスタ製品中のグルテンの強化のための方法であって、請求項29〜36の組成物のいづれかをこのベーカリー又はパスタ製品の製造工程に適用することを含む方法。 46．目の症状、例えば白内障の処置のための方法であって、請求項37記載の組成物を目に適用することを含む方法。