CN102006783B - 通过酶去除游离硫醇来改善蛋白质底物的酶处理 - Google Patents

通过酶去除游离硫醇来改善蛋白质底物的酶处理 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用第一种酶(如，巯基氧化酶)处理蛋白质底物。所述第一种酶除去蛋白质底物中存在的酶抑制剂，如游离硫醇。除去底物中的抑制化合物使得第二种酶能有效地发挥酶作用，如通过酪氨酸酶对底物中存在的蛋白质进行蛋白质交联。

Description

通过酶去除游离硫醇来改善蛋白质底物的酶处理
发明领域
本发明涉及用第一种酶(如，巯基氧化酶)对蛋白质底物的酶处理。所述第一种酶除去了蛋白质底物中存在的酶抑制剂，如游离硫醇。除去底物中的抑制化合物使得第二种酶能有效地发挥酶作用，如通过酪氨酸酶对底物中存在的蛋白质进行蛋白质交联。 
发明背景 
WO02/14484和WO02/14595报道了从极毛杆菌科(Pseudomonadaceae)分离的酪氨酸酶，及其用于蛋白质交联，特别是作为羊毛纤维的蛋白质纤维的交联的用途。 
WO2006/084953报道了从木霉属(Trichoderma)可获得的酪氨酸酶，及其在使食品蛋白质交联中的用途。 
根据一般反应：2RSH+O2→RS-SR+H2O2，巯基氧化酶催化巯基氧化成二硫化物。 
多种巯基氧化酶是本领域已知的，例如：源自酵母的巯基氧化酶可从例如X-Zyme(Erv1p和Erv1p-X1)GmbH(Duesseldorf/德国)(http://www.x-zyme.com/de/products.html)购得；R.S.de la Motte和F.W.Wagner，Biochemistry 26(1987)7363-7371提供了一种来自黑曲霉(Aspergillus niger)的巯基氧化酶；US 4,087,328报道了从奶中制得的巯基氧化酶；US 4,632,905报道了获自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的巯基氧化酶；US 4,894,340报道了来自黑曲霉的巯基氧化酶；Hoober等，1996，Journal of Biological Chemistry 271，No.48，pp30510-30516提供了鸡蛋蛋白巯基氧化酶。 
巯基氧化酶在食品应用中的使用是已知的，例如，用于焙烤中：EP0321811B公开了巯基氧化酶可以用于强化面团，显然与葡萄糖氧化酶结 合。EP0705538B报道了牛和微生物巯基氧化酶已经用作酶添加剂，与半纤维素酶结合用于面团中。WO2006/046146指出巯基氧化酶可以用于硬质小麦粉焙烤产品的制备中。 
WO2007/093674报道了通过添加酪氨酸酶制备低配料肉制品的方法，并且涉及由酪氨酸酶改性的低配料肉制品。将酪氨酸酶用于改变低配料肉制品的质地或水结合特性，该低配料肉制品具有低含量的至少盐、磷酸盐或肉。 
Lantto等，LWT 389(2006)1117-1124报道了在猪肉中应用微生物转谷氨酰胺酶、蘑菇酪氨酸酶以及含有多酚氧化酶和转谷氨酰胺酶的苹果粉。它报道了所有酶制剂都能够改善未加热肉匀浆的凝胶硬度。添加的半胱氨酸对苹果粉处理的猪肉的硬度具有正面影响，但对蘑菇酪氨酸酶和微生物转谷氨酰胺酶处理的肉具有负面影响。 
发明概述 
本发明是基于以下的发现：天然存在于蛋白质底物(如，蛋白质食料)中的抑制剂(如，游离硫醇)引起一些酶(如，酪氨酸酶)的抑制，以及可能能够降低或消除这些抑制剂的第一种酶(如，巯基氧化酶)的使用使得受到抑制剂抑制的酶(如，酪氨酸酶)能有效地用于例如交联蛋白质底物中存在的蛋白质，这可以改善蛋白质底物的凝胶强度、保水性和/或改善其质地。 
在一个方面中，本发明涉及在用活性受到游离硫醇抑制的第二种酶处理之前或同时，用第一种酶(如，巯基氧化酶)处理蛋白质底物。第一种酶除去蛋白质底物中存在的酶抑制剂，如游离硫醇。去除底物中的抑制化合物使得第二种酶能更有效地作用，如通过酪氨酸酶对底物中存在的蛋白质进行蛋白质交联。 
在另一个方面中，本发明提供了制备交联蛋白质底物的方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够除去游离硫醇的第一种酶处理包含游离硫醇的蛋白质底物； 
b.用活性受到游离硫醇抑制的第二种酶处理蛋白质底物； 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联。 
在另一个方面中，本发明提供了含有第一种酶和第二种酶的酶系统，其中第一种酶是能够从蛋白质底物除去游离硫醇的酶，并且第二种酶是酪蛋白酶。 
本发明进一步提供了用于降低蛋白质底物中游离硫醇浓度的第一种酶，如巯基氧化酶的用途。 
在另一个方面中，本发明提供了改善其活性受到游离硫醇的存在抑制的第二种酶对包含游离硫醇的蛋白质底物的酶活性的方法，所述方法包括用能够除去游离硫醇的第一种酶处理蛋白质底物；其中在用第二种酶处理之前或同时进行第一种酶的处理，并且第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
在进一步的方面中，本发明提供了制备交联蛋白质产品的方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够降解或氧化游离硫醇的第一种酶处理蛋白质底物； 
b.用第二种酶处理蛋白质底物； 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联。 
以上的方法导致蛋白质交联的蛋白质产品的制备。 
蛋白质底物可以是蛋白质食料。 
蛋白质产品可以是蛋白质的蛋白质交联食料。 
本发明还提供了通过以上方法制得的交联蛋白质产品，并且在蛋白质底物是蛋白质食料的情况下，本发明还提供了食品，其包含蛋白质的蛋白质交联食品。 
本发明还提供了包含肌球蛋白的蛋白质食料或食品，其呈现出增强的保水性和/或提高的凝胶强度，并且其中蛋白质食品中存在的部分肌球蛋白的至少一部分是交联的。可以将该产品的保水性和凝胶强度与没有使用本发明方法制得的，或如在此另外限定的相似产品相比较。 
附图简述 
图1：用TrTyr2和TG酶处理的肉提取物。泳道含有以下的提取物/处理：1)火鸡/TG酶，2)火鸡/TrTyr2，3)火鸡/参照，4)鳕鱼/TG酶，5)鳕鱼/TrTyr2，6)鳕鱼/参照，7)牛肉/TG酶，8)牛肉/TrTyr2，9)牛肉/参照，10)猪肉/TG酶，11)猪肉/TrTyr2，12)猪肉/参照，13)鸡肉/TG酶，14)鸡肉/TrTyr2，15)鸡肉/参照，16)羊肉/TG酶，17)羊肉/TrTyr2，18)羊肉/参照。 
图2：对含有(泳道1-3)和不含(泳道4-6)STPP的缓冲液渗析的猪肉提取物。用TG酶(泳道1和4)、TrTyr2(泳道2和5)处理的提取物，或是参照(泳道3和6)。 
图3：在更多酶处理之前用巯基氧化酶处理的提取物的SDS-PAGE凝胶。“高SOX”表示用0.33U/ml的处理。低SOX表示0.033nkat/ml。a)猪肉提取物。泳道含有(第一种酶处理/第二种酶处理)：1)高巯基氧化酶/TG酶，2)高巯基氧化酶/TrTyr2，3)高巯基氧化酶/无处理，4)低巯基氧化酶/TG酶，5)低巯基氧化酶/TrTyr2，6)低巯基氧化酶/无处理，7)无处理/TG酶，8)无处理/TrTyr2，9)无处理/无处理。b)牛肉提取物。泳道含有(第一种酶处理/第二种酶处理)：1)高巯基氧化酶/TG酶，2)高巯基氧化酶/TrTyr2，3)高巯基氧化酶/无处理，4)低巯基氧化酶/TG酶，5)低巯基氧化酶/TrTyr2，6)低巯基氧化酶/无处理，7)无处理/TG酶，8)无处理/TrTyr2，9)无处理/无处理。 
图4说明了从不同肉提取物制得的凝胶的凝胶强度和WHC与蛋白质含量正相关。注意到该图只是描绘了参照样品(无酶处理)。从鳕鱼提取物制得的凝胶是不均一的，这使得凝胶强度测量产生了很大的变化。然而，始终低于其他凝胶的。 
图5：a：从蛋白质提取物产生的不同热诱导的凝胶的凝胶强度，其用水(参照；n＝3)，酪蛋白酶单独(TrTyr2；n＝2)，酪蛋白酶和巯基氧化酶同时(TrTyr2+巯基氧化酶；n＝1)或转谷氨酰胺酶(TG酶；n＝2)进行了处理。b：与描绘WHC的相似。误差棒表示标准偏差。 
发明详述 
在一个方面中，公开了制备交联蛋白质底物的方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够除去游离硫醇的第一种酶处理含有游离硫醇的蛋白质底物； 
b.用活性受到游离硫醇抑制的第二种酶处理蛋白质底物； 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联，并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
在进一步的方面中，公开了改善第二种酶对含有游离硫醇的蛋白质底物的酶活性的方法，第二种酶的活性受到游离硫醇的存在的抑制，所述方法包括用能够除去游离硫醇的第一种酶处理蛋白质底物；其中在用第二种酶处理之前或同时进行用第一种酶的处理，并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
本发明人已经发现了蛋白质底物中酪氨酸酶的抑制可能是由于蛋白质底物中存在的游离硫醇的存在引起的。本发明是基于至少部分除去蛋白质底物的游离硫醇含量，由此至少部分地减轻第二种酶(如，酪氨酸酶)的抑制。 
本发明特别涉及肉加工工业，其中认为酪氨酸酶是用于提高保水性、改善凝胶强度以及改善所加工肉制品的质地和口感的合适加工助剂。 
酶处理 
本发明提供了制备交联蛋白质底物的方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够除去游离硫醇的第一种酶处理含有游离硫醇的蛋白质底物； 
b.用活性受到游离硫醇抑制的第二种酶处理蛋白质底物； 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联，并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
本发明进一步提供了制备交联蛋白质产品(如，蛋白质交联的食料)的方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够降解或氧化游离硫醇的第一种酶处理蛋白质底物； 
b.用第二种酶处理蛋白质底物； 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联，以产生交联的蛋白质产品。 
本发明进一步提供了改善第二种酶对含有游离硫醇的蛋白质底物的酶活性的方法，第二种酶的活性受到游离硫醇的存在的抑制，所述方法包括用能够除去游离硫醇的第一种酶处理蛋白质底物；其中在用第二种酶处理之前或同时进行第一种酶的处理，并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
在一个实施方案中，如步骤a)中用第一种酶的处理导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少5％。 
在一个实施方案中，如步骤a)中用第一种酶的处理导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少1μM。 
在一个实施方案中，如步骤a)中用第一种酶的处理导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低，这种降低足以改善第二种酶交联底物(如，蛋白质食料)中存在的蛋白质(其可以是肌球蛋白)的能力。 
可以通过i)蛋白质底物中存在的蛋白质与ii)通过本发明的方法获得的本发明的交联蛋白质产品相比较的SDS-PAGE分析来测定交联蛋白质产品中存在的蛋白质交联。ii)与i)比较的SDS-PAGE中蛋白质平均大小的改善是蛋白质交联产品的表示。还原SDS-PAGE适于通过酪蛋白酶活性形成的蛋白质交联没有受到还原剂(二硫苏糖醇或巯基乙醇)的影响。 
在一个实施方案中，蛋白质食品包含肌球蛋白，并且在步骤a)和b)之后，处理过的(即，交联的)蛋白质食品中存在的肌球蛋白的交联程度是至少5％。 
以上的方法可以用于提高蛋白质底物(例如，食料)的凝胶强度或 保水性，或两者-使得在进行了步骤a)和b)之后，与蛋白质底物相比，蛋白质交联的蛋白质产品中的这些参数中的一个或多个得到了增强。 
第一种酶 
第一种酶通常选择作为能够减轻蛋白质底物(如，肉提取物，例如，猪肉提取物)内第二种酶抑制的酶。实施例提供了怎样进行这样的肉提取的方案。如实施例中所公开的，酪氨酸酶斑点试验可以用于测量酪氨酸酶抑制，及其减轻，使用游离的半胱氨酸作为对照抑制剂，或肉提取物，如根据实施例制备的猪肉提取物。 
从本发明的分析看，认为蛋白质底物中存在的抑制剂底物之一或关键抑制剂底物是游离硫醇，如游离半胱氨酸。因此，在这样的实施方案中，将能够从蛋白质底物中除去游离硫醇的酶在此称为“第一种酶”。 
应当认识到术语“除去游离硫醇”指的是降低(即，减少)蛋白质底物中存在的游离硫醇浓度，这可以使用第一种酶(其可能是氧化酶)来合适地进行。 
因此，应当认为术语“除去游离硫醇”不必需涉及缺乏任何游离硫醇的蛋白质底物/产品的制备，只要游离硫醇的浓度降低了。 
在一个实施方案中，术语“除去游离硫醇”或“降低游离硫醇的浓度”指的是“游离硫醇的氧化”。 
因此，本发明提供了第一种酶的用途，用于降低蛋白质底物(如，蛋白质食料)中游离硫醇的浓度。 
可以使用能够从蛋白质底物中除去游离硫醇的酶来进行从蛋白质底物中除去游离硫醇。可以使用游离硫醇耗尽试验来鉴定这样的酶。在一个实施方案中，游离硫醇耗尽试验使用了根据实施例制备的碎猪肉底物提取物。 
将一单位的酶活性定义为在pH7.4和30℃下，在磷酸盐缓冲液中1mM底物下，每分钟消耗1μmol游离硫醇基团(如，游离半胱氨酸或谷胱甘肽)的酶量。 
还可以以开特(用于催化活性的SI单位)来限定催化活性，其是在预定的底物浓度、温度和pH下，每秒钟转化1mol底物需要的酶量。 
因此，1nkat/g等于0.06单位/g的比酶活性，或1单位/g等于16.6nkat/g。 
从蛋白质底物中除去游离硫醇的一种方法是氧化游离硫醇成分或其部分-因此，在一个这样的实施方案中，第一种酶优选是氧化酶(氧化-还原酶)。 
在一个实施方案中，第一种酶是氧化酶，如呈现出以下一种或多种活性的酶：巯基氧化酶、漆酶(E.C.1.10.3.2)、谷胱甘肽氧化酶和二硫化物异构酶。 
在一个实施方案中，第一种酶呈现出选自EC 1.8.3.2和1.8.3.3的酶活性。 
在一个实施方案中，第一种酶是巯基氧化酶，或呈现出巯基氧化酶活性，即，E.C.1.8.3.2。 
在一个实施方案中，第一种酶是产生过氧化氢的酶，如碳水化合物氧化酶，如葡萄糖氧化酶或己糖氧化酶。在这样的实施方案中，发明人考虑了所产生的过氧化氢氧化了存在的游离硫醇，由此减轻了酪氨酸酶的抑制。 
术语巯基氧化酶(SOX)通过如国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB)的命名委员会所列出的酶分类E.C.1.8.3.2来限定，限定为根据等式：2RSH+O2→RSSR+H2O2将硫醇化合物转化成相应的二硫化物的酶。 
各种巯基氧化酶是本领域已知的，并且可以用于本发明的目的中。在一个实施方案中，巯基氧化酶可以分离自，或源自微生物来源，如真菌，如酵母或曲霉。EP0321881、EP0338452和EP0705538报道了微生物巯基氧化酶在焙烤应用中的用途。 
优选的巯基氧化酶可以源自黑曲霉，如de la Motte和Wagner Biochemistry 26(1987)7363-737中所述的巯基氧化酶。 
US4,632,905提供了来自酱油曲霉的巯基氧化酶，在此引入作为参 考。 
其他巯基氧化酶包括牛巯基氧化酶。 
曲霉SOX酶-NCBI登录号-在此将以下记录引入作为参考。 
1：CAB58940.unnamed protein p…[gi：6090366] 
2：EAU34803.FAD-linked sulfhy…[gi：114193103] 
3：XP_754731.FAD dependent sul…[gi：71000028] 
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10：EAW11880.FAD dependent sul…[gi：119401457] 
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25：EAA59967.hypothetical prot…[gi：40740777] 
酵母SOX-酶-NCBI登录号-在此将以下记录引入作为参考。 
1：EDN61625sulfhydryl oxidas…[gi：151943312] 
2：EDN61173sulfhydryl oxidas…[gi：151942827] 
3：P27882Mitochondrial FAD…[gi：2506175] 
4：Q12284FAD-linked sulfhy…[gi：2492823] 
5：1JRA_DChain D，Crystal…[gi：18158801] 
6：1JRA_CChain C，Crystal…[gi：18158800] 
7：1JRA_BChain B，Crystal…[gi：18158799] 
8：1JRA_AChain A，Crystal…[gi：18158798] 
9：1JR8_BChain B，Crystal…[gi：18158797] 
10：1JR8_AChain A，Crystal…[gi：18158796] 
11：P55789FAD-linked sulfhy…[gi：2492821] 
12：CAA92143unknown[Saccharo…[gi：1072405] 
13：AAB48659regulatory protei…[gi：172378] 
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15：P36046Intermembrane spa…[gi：90110034] 
16：CAB46757sulfhydryl oxidas…[gi：5441486] 
17：NP_011543Erv1p[Saccharomy…[gi：6681846] 
18：NP_015362Erv2p[Saccharomy…[gi：6325296] 
19：CAA97017ERV1[Saccharomyc…[gi：1945314] 
20：CAA97016ERV1[Saccharomyc…[gi：1945313] 
21：CAA48192ERV1[Saccharomyc…[gi：404218] 
22：CAA94987unknown[Saccharo…[gi：1314111] 
23：CAA43129regulatory protei…[gi：4305] 
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30：CAK38806unnamed protein p…[gi：134074512] 
31：XP_001397560hypothetical prot…[gi：145252094] 
32：AAA96390ERV1[Homo sapien…[gi：6136037] 
33：CAD25469PROTEIN OF THE ER…[gi：19069001] 
34：XP_001644445hypothetical prot…[gi：156842152] 
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42：XP_570522hypothetical prot…[gi：58266732] 
43：AAW43215conserved hypothe…[gi：57226755] 
EP0565172提供了合适的巯基氧化酶，在此引入作为参考，如SEQ ID NO1中所示。 
SEQ ID NO 1： 
>gi|134078459|emb|CAK40401.1|来自专利EP565172-A1的巯基氧化酶Sox-黑曲霉 
MAPKSLFYSLFSTISVALASSIPQTDYDVIVVGGGPAGLSVLSSLGRMRRKTVMFDSGEYRNGVTREMHD 
VLGFDGTPPAQFRGLARQQISKYNSTSVIDIKIDSITPVEDAAANSSYFRAVDANGTQYTSRKVVLGTGL 
VDVIPDVPGLREAWGKGIWWCPWCDGYEHRDEPLGILGGLPDVVGSVMETHTLYSDIIAFTNGTYTPANE 
VALAAKYPNWKQQLEAWNVGIDNRSIASIERLQDGDDHRDDTGRQYDIFRVHFTDGSSVVRNTFITNYPT 
AQRSTLPEELSLVMVDNKIDTTDYTGMRTSLSGVYAVGDCNSDGSTNVPHAMFSGKRAGVYVHVEMSREE 
SNAAISKRDFDRRALEKQTERMVGNEMEDLWKRVLENHHRRS 
已经报道了漆酶(EC 1.10.3.2)直接氧化SH基团(参考：Applied and Environmental Microbiology，2000年2月，p.524-528，Vol.66，No.2)。 因此，在一个实施方案中，第一种酶是漆酶，或呈现出漆酶活性。 
术语“漆酶活性”通过如国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB)的命名委员会所列出的酶分类E.C.1.10.3.2(漆酶)来限定；或酶分类EC 1.10.3.1(儿茶酚氧化酶)，酶分类EC 1.10.3.4(o-氨基酚氧化酶)，或酶分类EC 1.3.3.5(胆红素氧化酶)。 
各种漆酶是本领域已知的，例如，WO2007/054034A中公开的那些，其报道了来自天蓝色链霉菌的漆酶，特别是由WO2007/054034A的SEQ IDNO：2的1至343表示的漆酶，在此引入作为参考。在本发明的一个实施方案中，氧化酶是漆酶，如多孔属漆酶，如WO96/00290中所述的薄盖单孔云芝漆酶(也称为长绒毛栓菌漆酶)(来自Novo Nordisk Biotech.，Inc.)或毁丝霉属(Myceliophthera)漆酶，尤其是WO95/33836中所述的嗜热毁丝霉(Myceliophthera thermophila)漆酶(来自Novo Nordisk Biotech.，Inc.)。此外，漆酶可以是Scytalidium漆酶，如WO95/33837中所述的S.thermophilium漆酶(来自Novo Nordisk Biotech.，Inc.)或Pyricularia漆酶，如Pyricularia oryzae漆酶，其可以依据商品名SIGMA no.L5510购自SIGMA，或鬼伞属漆酶，如毛革盖菌(C.cinereus)漆酶，尤其是毛革盖菌IFO 30116漆酶，或丝核菌漆酶，如Rh.solani漆酶，尤其是WO95/07988所述的中性Rh.Solani漆酶(来自Novo Nordisk A/S)，其具有6.0至8.5的最佳pH。漆酶也可以源自真菌，如Collybia、Fomes、Lentinus、Pleurotus、曲霉、脉孢菌、普特斯阿属、射脉菌属(Phlebia)，例如，辐射脉菌属(P.radiata)(WO92/01046)，革盖菌属(Coriolus)，例如，毛革盖菌(JP2-238885)，或Botrytis。WO01/83770中描述了更多的漆酶。 
术语“谷胱甘肽氧化酶”(GOX)通过如国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB)的命名委员会所列出的酶分类E.C.1.8.3.3来限定，为催化2谷胱甘肽+O(2)＝氧化的谷胱甘肽+H(2)O(2)反应的酶，并且也可以催化半胱氨酸和几种其他硫醇的氧化。在一个实施方案中，可以通过测量在氧存在下缓冲液中谷胱甘肽消失来测定谷胱甘肽活性。在这样的实施方案中，一“GOX”单位是在30℃和pH7下，每分钟氧化1μmol 谷胱甘肽需要的酶含量。 
第一种酶的用量： 
在一个实施方案中，第一种酶具有至少0.01nkat/mg的比活性，如至少0.1nkat/mg，如至少1nkat/mg，如至少10nkat/mg，如至少50nkat/mg，如至少100nkat/mg，如至少200nkat/mg，如至少300nkat/mg。在一个实施方案中，第一种酶具有不高于500nkat/mg的比活性，如不高于300nkat/mg，如不高于100nkat/mg，如不高于10nkat/mg，如不高于5nkat/mg，如不高于1nkat/mg。 
在一个实施方案中，将第一种酶以0.00001mg/g至100mg/g蛋白质底物的量加入到蛋白质底物中，如0.01mg/g至10mg/g，如0.10mg/g至5mg/g。在一个实施方案中，每g蛋白质底物加入至少0.00001mg的第一种酶，如至少0.0001mg/g，如至少0.001mg/g，如至少0.01mg/g。在一个实施方案中，每g蛋白质底物加入至多10mg的第一种酶，如至多5mg/g，如至多1mg/g，如至多0.5mg/g，如至多0.2mg/g。 
在一个实施方案中，加入的第一种酶的量为0.01至1nkat/g蛋白质底物(或食品)，如0.02至0.5nkat/g。 
第二种酶 
除去蛋白质底物中的抑制化合物使得第二种酶可以更有效地发挥作用，如通过酪氨酸酶，使底物中存在的蛋白质更有效地交联。 
在一个实施方案中，第二种酶是催化作用受到游离硫醇的存在抑制的酶。在一个实施方案中，蛋白质底物中第二种酶(如，酪氨酸酶)的催化作用将导致蛋白质的交联。 
在一个实施方案中，术语“改善”限定为根据本发明处理的产品中第二种酶的催化活性与没用第一种酶处理的产品中第二种酶的催化活性相比较的增加。 
在一个实施方案中，术语“改善”限定为可测量参数(如，凝胶强度)的改变，这种改变将由制造商或消费者感知为改善。 
在一个实施方案中，术语“改善”限定为根据本发明处理的产品中的保水性与没用第一种酶处理的产品中的保水性相比较的改善。 
在另一个实施方案中，术语“改善”限定为根据本发明处理的产品中的交联与没用第一种酶处理的产品中的交联相比较的改善。 
在另一实施方案中，术语“改善”限定为根据本发明处理的产品中的质地与没用第一种酶处理的产品的质地相比较的改善。 
在一个实施方案中，酶活性导致蛋白质底物(如，肉)中存在的蛋白质的交联。适用于蛋白质底物(如，肉)中的蛋白质的交联的第二种酶的实例是酪氨酸酶。 
在一个实施方案中，第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
在一个实施方案中，第二种酶选自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶、半乳糖氧化酶、蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)、半乳糖脂酶和溶血磷脂酶。 
在一个实施方案中，第二种酶选自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶和蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)、半乳糖脂酶和溶血磷脂酶。在进一步的实施方案中，第二种酶选自脂肪氧合酶和蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)。在进一步的实施方案中，第二种酶是漆酶。更优选，酶是属于EC编号：1.14.18.1所述组的酪氨酸酶。 
在一个方面中，第二种酶是酪氨酸酶，其是通过如国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB)的命名委员会所列出的酶分类E.C.1.14.18.1来限定(也称为单苯基一氧化物酶)。 
酪氨酸酶属于酚氧化酶，其使用氧作为电子受体。传统上，基于底物特异性和对抑制剂的敏感性，可以将酪氨酸酶与其他酚氧化酶(即，漆酶)区分出来。然而，目前的差异是基于结构特征。酪氨酸酶和漆酶之间的主要结构差异在于酪氨酸酶具有双核铜位点，在其活性位点具有两个III型的铜，而漆酶在活性位点总共具有四个铜原子(I和M型铜，和一对III型铜)。酪氨酸酶将各种酚化合物氧化成相应的醌。醌是高度反应性的，并且可以进一步地进行非酶反应。酪氨酸酶的典型底物是酪氨酸(或蛋白质中的酪氨酸残基)，其首先羟基化成DOPA(二羟基苯 丙氨酸或蛋白质中的DOPA残基)，然后通过酶进一步氧化成多巴醌(或蛋白质中的多巴醌残基)。多巴醌可以与多种化学结构(如，其他多巴醌、硫醇和氨基)进行非酶反应。因此，酪氨酸在一个相同的蛋白质中具有两种酶活性，即，单酚单加氧酶活性(EC 1.14.18.1)和儿茶酚氧化酶活性(EC 1.10.3.1)，如下所示。 
酪氨酸酶的底物特异性相对宽泛，并且酶能够氧化多种多酚和芳香胺。然而，与漆酶(EC 1.10.3.2)相反，酪氨酸酶不氧化丁香醛连氮。至少蛋白质中的酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基与酪氨酸酶催化的活性多巴醌形成共价键。 
可以通过本领域公知的技术来测量酪氨酸酶活性。L-DOPA或L-酪氨酸可以用作底物，随后可以通过分光光度计监控多巴色素形成，或者可以通过以下的氧消耗来监控底物消耗。 
酪氨酸酶在自然界广泛分布，可以在动物、植物、真菌和细菌中找到。特别地，易于褐变的蔬菜和水果富含酪氨酸酶。目前仅有的可购得的酪氨酸酶源自蘑菇双孢菇(Agaricus bisporus)。本发明中所用的酪氨酸酶可以源自任何能够产生酪氨酸酶的动物、植物、真菌或微生物。根据本发明的一个实施方案，酪氨酸酶源自丝状真菌。例如，可以是获自里氏木霉(Trichoderma reesei)的胞外酪氨酸酶(WO2006/084953)，在此引入作为参考。 
酪氨酸酶催化如下的反应：L-酪氨酸+L-dopa+O(2)-->L-dopa+多巴醌+H(2)O。 
在一个实施方案中，酪氨酸酶分离自或源自真菌物种，如木霉属(Trichoderma)或肉座菌属(Hypocrea)。 
Selinheimo等，FEBS Lett.273，4322-4335(2006)，提供了来自木霉的酪氨酸酶，在此引入作为参考。 
在一个实施方案中，酪氨酸酶如SEQ ID NO 2中所述的，考虑了共同的和翻译后的修饰，如信号肽切割： 
SEQ ID NO 2 
>gi|118764455|emb|CAL90884.1|酪氨酸酶2[Hypocrea jecorina] 
MLLSASLSALALATVSLAQGTTHIPVTGVPVSPGAAVPLRQNINDLAKSGPQWDLYVQAMYNMSKMDSHD 
PYSFFQIAGIHGAPYIEYNKAGAKSGDGWLGYCPHGEDLFISWHRPYVLLFEQALVSVAKGIANSYPPSV 
RAKYQAAAASLRAPYWDWAADSSVPAVTVPQTLKINVPSGSSTKTVDYTNPLKTYYFPRMSLTGSYGEFT 
GGGNDHTVRCAASKQSYPATANSNLAARPYKSWIYDVLTNSQNFADFASTSGPGINVEQIHNAIHWDGAC 
GSQFLAPDYSGFDPLFFMHHAQVDRMWAFWEAIMPSSPLFTASYKGQSRFNSKSGSTITPDSPLQPFYQA 
NGKFHTSNTVKSIQGMGYSYQGIEYWQKSQAQIKSSVTTIINQLYGPNSGKKRNAPRDFLSDIVTDVENL 
IKTRYFAKISVNVTEVTVRPAEINVYVGGQKAGSLIVMKLPAEGTVNGGFTIDNPMQSILHGGLRNAVQA 
FTEDIEVEILSKDGQAIPLETVPSLSIDLEVANVTLPSALDQLPKYGQRSRHRAKAAQRGHRFAVPHIPP 
L 
全序列和信号肽加工的详细内容在WO06/084953中有描述，在此引入作为参考。 
一单位的酪氨酸酶活性-1nkat限定为在pH7和25℃下，每秒钟将1nmol L-DOPA转化成DOPA-醌的酶量。 
在一个实施方案中，第二种酶是如上限定的漆酶。 
在一个实施方案中，第二种酶是通过酶分类EC 1.13.11限定的脂肪氧合酶。脂肪氧合酶是一类含铁的双加氧酶，其催化含有顺式，顺式-1，4-戊二烯结构的脂质的过氧化氢化作用。主要产物是过氧氢脂肪酸，其通常快速还原成羟基衍生物。 
在一个实施方案中，第二种酶是半乳糖氧化酶。半乳糖氧化酶催化伯醇的立体特异性氧化，氧化成相应的醛。酶在生物学上最相关的底物是未知的，因为酶呈现出宽泛的底物特异性。在一个实施方案中，半乳糖是底物。 
在一个实施方案中，第二种酶是通过酶分类EC 1.4.3.13限定的溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)。赖氨酰氧化酶是胞外铜-依赖性酶，其催化各种胶原蛋白和弹性蛋白的前体中的肽酰赖氨酸残基的氧化性脱氨基作用。然后去氨基的赖氨酸能够形成醛交联。 
在一个实施方案中，第二种酶是通过酶分类E.C.3.1.1.26限定的 半乳糖脂酶。半乳糖脂酶至少能够水解1，2-二酰基-3-β-D-半乳糖基-sn-甘油。通常，半乳糖脂酶还能够水解2，3-二-O-酰基-1-O-(6-O-α-D-半乳糖基-β-D-半乳糖基)-D-甘油，以及磷脂酰胆碱和其他磷脂。然而，它们不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。 
在一个实施方案中，第二种酶是通过酶分类EC 3.1.1.5限定的溶血磷脂酶。溶血磷脂酶是催化溶血甘油磷脂中单个脂肪酸酯的水解，伴随甘油磷脂和脂肪酸的形成。 
第二种酶用量 
所用的第二种酶(如，酪氨酸酶)的用量可以是，例如，至少20，至少40，至少80，至少160，至少320或至少640nkat/g蛋白。我们发现100至500，如200-200，或250-350或(约)300nkat/g肉蛋白的量通常适于肉蛋白的交联。 
在一个实施方案中，第二种酶(如，酪氨酸酶)具有至少0.1nkat/mg的比活性，如至少1nkat/mg，如至少10nkat/mg，如至少100nkat/mg，如至少200nkat/mg，如至少250nkat/mg，如至少300nkat/mg。 
在一个实施方案中，第二种酶(如，酪氨酸酶)具有不高于1000nkat/mg的比活性，如不高于800nkat/mg，如不高于500nkat/mg。实施例中所用的酶(源自SEQ ID NO 2)具有约300nkat/mg的比活性。 
在一个实施方案中，将第二种酶以0.00001mg/g至100mg/g蛋白质底物的含量加入到蛋白质底物中，如0.01mg/g至10mg/g，如0.10mg/g至5mg/g。在一个实施方案中，加入至少0.00001mg/g蛋白质底物的第二种酶，如至少0.0001mg/g，如至少0.001mg/g，如至少0.01mg/g。在一个实施方案中，加入至多10mg/g蛋白质底物的第二种酶，如至多5mg/g，如至多1mg/g，如至多0.5mg/g，如至多0.2mg/g。 
在一个实施方案中，加入的第二种酶的量为0.001至10nkat/ml蛋白质底物(或食品)，如0.01nkat/ml至1nkat/ml，如0.02至0.5nkat/ml。 
酶及其制备 
可以从其天然来源分离第一种和第二种酶或通过合成或重组技术来制备。 
关于在此所涉及酶的氨基酸序列，以及关于在此公开或涉及的序列，认为序列可以是变体、同源物或片段—这些术语按照EP1704240B中限定的来使用。合适地，酶与在此公开或涉及的(成熟)序列具有至少70％的同源性，如至少80％，如至少90％，如至少95％，如至少98％同源或100％同源。 
通常，第一种和或第二种酶的表达是真核宿主，如天然的外源宿主细胞，导致共同的和翻译后修饰，如信号肽切割。 
EP1704240B提供了可以用于酶表达和制备的标准重组技术。 
游离硫醇 
硫醇含有-SH基团，其也称为硫醇基团。游离硫醇，是含有硫醇的化合物，如氨基酸，或具有低于1000g/mol分子量的短肽，如低于500g/mol，如低于350g/mol，如低于200g/mol。 
游离硫醇，通常存在于或形成于包括半胱氨酸、谷胱甘肽(优选半胱氨酸)的蛋白质中。 
在一个实施方案中，游离硫醇是含有-SH基团的(游离)氨基酸，如游离半胱氨酸—即，作为氨基酸单体而不是多肽链一部分存在的半胱氨酸。 
在一个实施方案中，“游离硫醇”是肽，其包含一个或多个硫醇基团，其中肽由2-8个氨基酸残基长的肽组成，如由2、3、4、5、6、7或8个氨基酸组成的肽，如二肽或三肽，如谷胱甘肽。合适地，在优选的实施方案中，肽包含一个或多个半胱氨酸残基。 
蛋白质底物中存在的游离硫醇的存在或浓度可以通过实施例中提供的游离硫醇试验来测定—请注意也可以使用用其他蛋白质底物的肉提取物的制备方案。 
在一个实施方案中，在用第一种酶处理之前，可以用第一种酶处理的蛋白质(食品)底物中的游离硫醇浓度为至少2μM，如至少3μM， 如至少4μM，如至少5μM，如至少6μM，如至少7μM，如至少8μM，如至少9μM，如至少10μM，如至少11μM，如至少12μM，如至少13μM，如至少14μM，如至少15μM，如至少16μM，如至少17μM。 
在一个实施方案中，在用第一种酶处理之前，可以用第一种酶处理的蛋白质(食品)底物中的游离硫醇浓度为至少5-25μM，如10-25μM，如15-20μM。 
在一个实施方案中，通过第一种酶的处理(如在步骤a之后)，蛋白质(食品)底物中的游离硫醇浓度降低至少5％，如至少10％，如至少20％，如至少30％，如至少40％，如至少50％，如至少60％，如至少70％，如至少80％。 
在一个实施方案中，用第一种酶处理后(如在步骤a之后)，蛋白质(食品)底物的游离硫醇浓度低于15μM，如低于10μM，如低于9μM，如低于8μM，如低于7μM，如低于6μM，如低于5μM，如低于4μM，如低于3μM。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物的游离硫醇浓度的降低(如在步骤a之后)为至少1μM，如至少2μM，至少3μM，至少4μM，至少5μM，至少6μM，至少7μM，至少8μM，至少9μM，至少10μM，至少11μM，至少12μM，至少13μM，至少14μM，至少15μM，如至少16μM。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物的游离硫醇浓度的降低足以增强第二种酶来交联食品底物中存在的蛋白质，如肌球蛋白。 
蛋白质底物 
蛋白质食品底物可以是食料或食品的形式，优选食料。优选，蛋白质(食品)底物包含肉或肉蛋白。 
在进一步的实施方案中，蛋白质底物是面粉、面团、谷物衍生的产品、奶、奶衍生的产品、乳制品、大豆蛋白、豆奶或植物衍生的产品。 
在一个实施方案中，蛋白质底物是食料。 
在一个实施方案中，蛋白质底物包含动物肉或由动物肉组成。 
在一个实施方案中，蛋白质底物，如肉底物，包含肌球蛋白。 
如在此所用的术语“蛋白质”指的是具有至少1％重量的蛋白质含量的底物或组合物，如至少2％，如至少3％，如至少4％，如至少5％，如至少10％重量，如至少10％重量，如至少20％重量，如至少30％重量，如至少40％重量，如至少50％重量。 
在优选的实施方案中，蛋白质底物或组合物包含蛋白质肌球蛋白，如蛋白质底物或组合物中存在的至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％的蛋白质是肌球蛋白。 
如在此所用的术语肌球蛋白指的是真核生物肌肉中发现的运动肌蛋白质，即肉中发现的主要蛋白。通过SDS-PAGE分析，将肌球蛋白限定为188kDa。因此，可以通过SDS-PAGE分析测定肌球蛋白的比例。 
术语“肉”指的是用作食物的动物肉，优选包含肌肉，任选与脂肪和结缔组织相连。在此使用的肉包括家畜、猎物、家禽、鱼和其他可食海洋动物的任何肉类。肉可以是，例如，猪肉、牛肉、羊肉、袋鼠、鸡肉、火鸡、鸵鸟、鱼肉、软体动物、鲨鱼和贝类等。“肉制品”指的是包含肉或肉蛋白作为基本成分的任何材料，如香肠、火腿、重建肉制品、碎鱼块等。 
在一个实施方案中，蛋白质底物是肉底物。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物含有动物肉，或源自动物肉，如哺乳动物、鸟类或鱼肉。 
在一个实施方案中，蛋白质食品来源获自哺乳动物(通常称为红肉)，如猪肉、羊肉、牛肉、山羊、马、袋鼠等。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物获自鸟类，如家禽，如鸡肉、火鸡、鸵鸟。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物含有鱼肉或源自鱼肉，如白鱼，鳕鱼，黑线鳕，绿青鳕等，软骨鱼，如鲨鱼，旗鱼，海水鱼，金枪鱼，鲭鱼，沙丁鱼，凤尾鱼，鲱鱼，鲑鱼，淡水鱼，鳟鱼等。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物含有或是，或包含，或源自选自猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉、火鸡、鳕鱼、袋鼠、鸵鸟、鲨鱼的肉。 
在一个实施方案中，蛋白质食品底物是或包含或源自猪肉、羊肉和鸡肉，最优选猪肉。 
术语猪肉指的是获自猪畜体的肉。术语牛肉指的是获自牛(公牛或母牛)畜体的肉。术语羊肉指的是获自绵羊的肉。 
适宜地，肉底物(或产品)可以含有至少20％，至少30％，至少40％或至少45wt％(湿)肉。肉底物(或产品)可以含有至多100wt％肉(湿)，如至多50％，至多60％，至多70％，至多80％和至多90％肉。例如，1份重建肉底物实际上可以含有至多100wt％肉。 
蛋白质底物通常含有水，如1wt％至95wt％水。肉(动物肌肉)通常含有约60-75％水，尽管肉来自不同的来源并且不同的底物可以含有不同含量的水。 
在一个实施方案中，将外源性的水加入到蛋白质底物中，例如，在本发明的方法步骤a)和/或b)之前或之中加入水。在肉底物的情况中，外源性的水是例如不是天然存在或源自获自动物的肉的水。在一个实施方案中，外源性水的量是蛋白质底物初重的1％至90％(即，在加入外源性水之前)，如10至80％。外源性的或添加的水的量可以至多90％，至多80％，至多70％，至多60％，至多50％，至多40％，至多30％，至多20％，至多10％。添加水的量可以为至少1％，如至少5％，如至少10％，如至少20％，如至少30％，如至少40％，如至少50％。 
在步骤a)和/或b)之前或之中加入到底物中的外源性水可以含有其他成分。 
认为可以通过本发明的方法将外源性的水掺入蛋白质底物中(如，肉底物)，以产生与蛋白质底物相比具有增强的含水量的制品(如，肉制品)。可以分离和除去没有掺入产品中的过量水。 
因此，认为根据本发明的方法可以用来增强肉制品的保水性。在这点上，在一个优选的实施方案中，通过根据本发明的酶处理来提高蛋白质底物的含水量。例如，从根据本发明的方法获得的肉制品的含水量高于酶处理之前的肉底物的含水量。合适地，在一个实施方案中，含水量的增加为至少1％，如至少5％，如至少10％，如至少15％，如至少20％。 
碎肉(底物)的颗粒大小取决于待制备的肉制品的类型。对于重建肉制品的制造，将肉切成可识别的小块，边缘通常为几厘米，而火腿和香肠中的肉通常是碾碎的、剁碎的和/或切碎的或另外均质的。通常，火腿含有粗碎肉，具有几毫米至至多一或几厘米的颗粒，而香肠含有细碎肉。 
肉蛋白(即，肉底物中存在的)可以是机械分离或回收肉的形式，和/或已经通过例如均质、切碎、碾磨、切割、液化等(总称为“粉碎”)机械破坏的肉。在一个实施方案中，蛋白质食品底物是肉浆、重建肉或乳化肉形式。 
在一个实施方案中，肉底物含有约1至约30％重量(“％w/w”)的动物蛋白，基于该蛋白质的干重。 
在一个实施方案中，基于食品的约100％w/w，肉底物含有约1％w/w至约30％w/w肌肉蛋白(肌球蛋白)，约30％w/w至约80％w/w水，至多约50％w/w脂肪。 
在一个实施方案中，任选在水的存在下，通过将肉粉碎来获得蛋白质底物，如肉底物。 
通常通过首先将肉细碎然后与水混合的方法来制备肉浆。然后将混合物离心或加入乳化剂，以将脂肪和肌红蛋白与肌肉分离。然后使产品静置成三层：肉、过量水和脂肪。然后分离出肉层，并直接用作食品(如鸡块、香肠、汉堡、重建肉等)制备中的食料，或存储(例如，通过冷冻)用于进一步的使用。 
机械分离的肉(MSM)，也称为机械回收肉(MRM)，是通过在高压下，将带有相连可食肉的动物(例如，牛肉、猪肉或鸡肉)骨通过筛网或相似装置以分离骨和可食肉组织所产生的浆糊状和面糊状的肉产品。由于BSE疾病的出现，使用机械分离的肉不太受欢迎，并且优选回收肉。 
回收肉指的是从骨头和其他畜体原料提取的残余碎肉，没有将骨和肉组织混合起来。这种肉在外观、质地和组成上与碎肉和手工产生的相似肉制品相当。通过刮、削或压来自骨头的肉，从骨头分离出肉，而没有破坏或碾碎骨头。 
“肉底物”包括肉。此外，可以包括“其他成分”，这些成分包括任何常规的添加剂，如NaCl、磷酸盐和/或水。此外，术语其他成分包括，例如，NaCl和磷酸盐以外的盐、香辛料、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、糖、甜味剂、树胶、粘合剂、增量剂、淀粉、糊精型碳水化合物、动物或植物脂肪和油、脂肪替代品和/或其他非肉成分，如大豆、酪蛋白和乳清、小麦蛋白和其他非肉蛋白等。 
在一个实施方案中，“肉底物”由肉和水组成或包含肉和水。肉底物可以是碎肉。 
肉制品 
术语“肉制品”指的是通过根据本发明的方法制得的产品，其中蛋白质底物是“肉底物”。因此，蛋白质交联的蛋白质产品可以是肉制品。 
在本发明的范围中，通过本发明的方法制得的产品可以是通过第二种酶(酪氨酸酶)的活性来粘合碎肉而制得的肉制品。将这样的肉制品称为重建的(再造的)。根据本发明，碎肉在酪氨酸酶处理之前或之中，用第一种酶进行处理。 
在一个实施方案中，所制得的肉制品可以是含有15-18wt％脂肪的减脂产品，或含有至多10wt％脂肪的低脂肉制品，或含有至多5wt％脂肪的瘦肉制品。优选，肉制品的脂肪含量不超过18wt％，优选不超过10wt％，最优选不超过5wt％，甚至不超过3wt％。 
在一个实施方案中，肉制品可以包含低于2.0wt％的盐，优选低于1.5wt％。通常将包含不超过1.2wt％盐的肉制品认为是低盐产品。因此，本发明的肉制品优选含有不超过1.2wt％的盐，并且根据本发明的一个实施方案，不超过1.0wt％。在这点上，“盐”指的是氯化钠(NaCl)。在一个实施方案中，肉底物和或产品基本上是无盐的-即，磷酸盐的浓度低于0.1wt％盐。 
在近年来，磷酸盐的添加有所增加，因为磷酸盐可以用于维持低盐产品的结构和保水性。目前，工业上通常将0.2wt％磷酸盐(以P2O5测量)加入到肉制品中，这对应于0.34wt％的焦磷酸三钠。本发明的肉底物和/ 或产品可以含有低于0.2wt％的磷酸盐，优选含有不超过0.1wt％添加的磷酸盐(以P2O5测量)。最优选，肉底物和/或产品是无磷酸盐的，即，没有添加磷酸盐。 
在一个实施方案中，肉底物和或产品基本上是无磷酸盐的-即，磷酸盐的浓度低于0.1wt％磷酸盐。 
食料 
如在此所用的术语“食料”指的是可食的组合物，其形成人或动物膳食的一部分。食料可以直接用作食物，或用于食品的制备中。优选，根据本发明的食料是蛋白质食料。 
在优选的实施方案中，食料是肉食料，即，包含肉的食料，如在此所提及的肉，如选自猪肉(猪)、牛肉、火鸡、鸡肉、羊肉或鱼肉的肉。优选，肉食料是猪肉和鸡肉，最优选猪肉。 
在一个实施方案中，肉食料是在此所述的肉底物，其可以通过继续在此所述的方法来制得。 
食品 
如在此所用的术语“食品”指的是可食组合物，其由一种或多种“食料”组成或包含一种或多种“食料”。通常，食品包含几种“食料”，将其组合并加工成由消费者直接购买(或食用)的食品。在这点上，在一个方面中，“食品”指的是加工过的食料。 
在一个实施方案中，蛋白质交联的蛋白质产品在此指的是(肉)食品，或随后用于肉食品的制备中。 
在非限制性的实例中，食品可以选自以下食品种类中的一种或多种： 
-熟肉-例如，火腿、腰肉、猪肩肉、培根、猪胸肉。 
-干&半干咸肉-发酵制品、干腌并用发酵剂发酵的，例如干香肠，意大利香肠，意大利辣香肠，干火腿 
-用于冷和热食用的乳化产品，例如，烟熏香肚、法兰克福香肠、午餐肉、肉饼( ) 
-鱼&海产品-虾、鲑鱼、重新形成的鱼制品、冷冻的冷包装鱼。 
-新鲜肉肌肉-完整的注入肉肌肉，例如，瘦肉、肩肉火腿、腌肉。 
-碾碎的/重建新鲜肉-重新形成的肉。通过冷-凝固凝胶或粘合剂制得的加浓切割肉，例如，生的、未烹调的胸排、牛排、烤肉、新鲜香肠、牛肉汉堡、肉丸、俄罗斯肉馅饺子(pelmeni)。 
-家禽制品-例如，鸡胸或火鸡胸或重新形成的家禽、鸡块、鸡肉香肠。 
-蒸馏产品-高压灭菌的肉制品，例如，肩肉火腿、午餐肉、乳化制品。 
-蔬菜&肉类似物-例如，蔬菜香肠、块、汉堡 
酶系统 
本发明利用第一种酶从蛋白质底物(组合物)中除去第二种酶的抑制剂。可以在第二种酶处理之前或之中进行第一种酶的处理。因此，本发明涉及一个酶系统，其中酶系统包括第一种酶和第二种酶，其中第一种酶能够从底物(如蛋白质底物)中除去第二种酶的抑制剂。 
在优选的实施方案中，本发明提供了包括第一种酶和第二种酶的酶系统，其中第一种酶是能够从蛋白质底物中除去游离硫醇的酶，而第二种酶是酪氨酸酶。 
在一个实施方案中，第一种酶和或第二种酶是分离形式的。 
术语“分离的”指的是从发现其的天然环境中分离出的酶。 
在一个实施方案中，第一种酶和或第二种酶是纯化形式的。 
优选使用纯化的第一种和/或酶，即，在加入本发明的组合物之前将酶纯化。优选使用SDS-PAGE和密度测定来测定酶纯度。纯化的酶为至少10％纯，如至少20％纯，如至少30％纯，如至少40％纯，如至少50％纯。然而，认为纯化的酶可以与其他蛋白质一起配制，例如，与蛋白质稳定剂(如BSA)或其他酶混合，因此，酶纯度的测定排除了在纯化后加入到酶中的蛋白质。对于相同区间内(1个罐系统)同时存在第一种 和第二种酶的酶系统而言，按照另一种酶不存在的情况来计算每种(第一种或第二种)酶的纯度。 
在一个实施方案中，第一种和第二种酶存在于相同的酶组合物中。 
然而，在一个实施方案中，(在使用前)将第一种酶与第一种酶分离。 
在这点上，酶系统可以是单罐(一个部分)系统或多罐(多个部分)(例如，两个罐)系统。 
因此，可以以试剂盒的形式来提供酶系统，所述试剂盒包括含有第一种酶的第一个罐(一个部分)和含有第二种酶的第二个罐(一个部分)。 
如上所用的术语罐或部分指的是单个区间，与其他罐/部分/或区间分离开来。 
酶系统(或单个罐)中存在的第一种酶的量可以为，例如，至少0.001mg/g，如至少0.01mg/g，如至少0.1mg/g，如至少1mg/g，如至少3mg/g，如至少5mg/g，如至少10mg/g。合适地，约15mg/g或更高的剂量是合适的，例如，至多25mg/g，50mg/g，至多100mg/g，至多200mg/g或甚至至多300mg/g。 
酶系统(或单个罐)中存在的第二种酶的量可以为，例如，至少0.001mg/g，如至少0.01mg/g，如至少0.1mg/g，如至少1mg/g，如至少3mg/g，如至少5mg/g，如至少10mg/g，如至少50mg/g，如至少100mg/g，如至少200mg/g，或甚至更高，如至多500mg/g，如至多400mg/g，或例如，至多25mg/g，50mg/g，至多100mg/g，至多200mg/g或甚至至多300mg/g。 
在一个实施方案中，酶系统是食品加工助剂的形式，用于蛋白质食品的酶处理。 
一个或多个酶系统可以有酶制剂中通常所用的任何其他配料，如食品酶组合物成分或载体-例如，可以含有增量剂，如麦芽糖糊精、基于碳水化合物的材料、基于硅胶的材料、蛋白质、蛋白质水解产物和/或其他基于蛋白质的材料，如BSA。 
在一个实施方案中，例如，10mg混合物可以含有0.015mg SOX，2mg 酪氨酸酶和7.985mg增量剂。或者，100mg混合可以含有0.015mg SOX，2mg酪氨酸酶和97.985mg增量剂。在第一种情况中，可以将10mg混合物加入到每克待处理的蛋白质中，在后一种情况中，可以将100mg混合物加入到每克待处理的蛋白质中。如果确定待处理肉制品的蛋白质含量为3％，在第一种情况中，可以将300mg混合物加入到1kg肉制品中，在后一种情况中，可以加入3000mg混合物/kg肉制品。 
我们注意到使用蛋白质作为增量剂将具有给酪氨酸酶增加更多底物的益处，导致更多的交联。 
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的酶系统用于具有增强的保水性的蛋白质食料的制备的用途；和/或 
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的酶系统用于具有增强的凝胶强度的蛋白质食料的制备的用途；和/或 
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的酶系统用于具有增强的质地或口感的蛋白质食料的制备的用途。 
凝胶形成-凝胶强度 
本发明的产品，如蛋白质交联的蛋白质产品，与蛋白质底物或没有使用处理步骤a)制得的比较产品相比较，具有改善的凝胶强度。在一个实施方案中，凝胶强度的改善为至少1g，如至少2g，至少3g，至少4g，至少5g。 
保水性 
本发明的产品，如蛋白质交联的蛋白质产品，与蛋白质底物或没有使用处理步骤a)制得的比较产品相比较，具有改善的保水性。在一个实施方案中，保水性改善至少1％，如至少5％，如至少10％，如至少20％。 
交联 
本发明产品(如，蛋白质交联的蛋白质产品)的蛋白质交联程度，与未处理的蛋白质底物相比，具有至少5％的蛋白质交联程度，如至少 10％，如至少20％，如至少30％，如至少40％，如至少50％，如至少60％，如至少70％，如至少80％，如至少90％。可以通过获自本发明产品的蛋白质提取物的SDS-PAGE的密度测定分析(可以使用还原条件)来获得与蛋白质底物相比的蛋白质交联程度。 
在一个实施方案中，产品中存在的肌球蛋白的蛋白质交联程度，与未处理的蛋白质底物相比，可以具有至少5％的蛋白质交联程度，如至少10％，如至少20％，如至少30％，如至少40％，如至少50％，如至少60％，如至少70％，如至少80％，如至少90％。 
酶组合物 
以各种纯度从动物、植物和微生物来源生产酶制剂。它们可以由完整的杀灭细胞、细胞的一部分或无细胞提取物组成。它们还可以含有载体、溶剂、防腐剂和抗氧化剂。酶制剂可以配制成液体、半液体或干固体制剂。传统上，已经在加工过程中将食品酶制剂直接加入到食品中。对于许多应用，制剂的成分保留在加工过的食品中。近年来，固定在固体支持物上的酶增进了重要性。固定化酶制剂可以是含有高度特异性的纯化酶的那些，至含有完整杀灭细胞或结构完整的活细胞的那些。对于一些酶促方法，酶和细胞的共同固定可能是有利的。不打算将固定化酶制剂变为食品成分。 
因此，在一个方面中，认为第一种酶和或第二种酶是固定的。然而，鉴于第二种酶的活性，优选第二种酶不是固定的，即，酶，可能是无活性的(例如，热灭活形式)，保留在食品中。 
更多的实施方案和方面 
实施方案1.含有第一种酶和第二种酶的酶系统，其中第一种酶是能够从蛋白质底物中除去游离硫醇的酶，而第二种酶是酪氨酸酶。 
实施方案2.根据实施方案1的酶系统，其中第一种酶和或第二种酶是分离或纯化形式的。 
实施方案3.根据之前任一个实施方案的酶系统，其中第一种酶是 氧化酶。 
实施方案4.根据实施方案1的酶系统，其中第一种酶具有EC编码1.8.3.2或1.8.3.3。 
实施方案5.根据实施方案1的酶系统，其中第一种酶是巯基氧化酶。 
实施方案6.根据实施方案1的酶系统，其中第一种酶是漆酶。 
实施方案7.根据实施方案1的酶系统，其中第一种酶是谷胱甘肽氧化酶。 
实施方案8.根据实施方案1的酶系统，其中第一种酶是二硫化物异构酶。 
实施方案9.根据实施方案1至8的酶系统，其中第一种酶和第二种酶存在于相同的酶组合物中。 
实施方案10.根据在前任一个实施方案的酶系统，其中在使用前将第一种酶与第二种酶分开。 
实施方案11.根据实施方案10的酶系统，其中酶系统以试剂盒的形式来提供，所述试剂盒包括含有第一种酶的第一个罐，和含有第二种酶的第二个罐。 
实施方案12.根据在前任一个实施方案的酶系统，其中在使用前，第一种酶以0.001至300mg/g的浓度存在于酶系统中。 
实施方案13.根据在前任一个实施方案的酶系统，其中在使用前，第二种酶以0.001至500mg/g的浓度存在于酶系统中。 
实施方案14.根据在前任一个实施方案的酶系统，其中酶系统是食品加工助剂的形式，用于蛋白质食品的酶处理。 
实施方案15.根据权利要求14的酶系统，其中酶系统包含更多的成分，如一种或多种食品酶组合物成分和/或载体。 
实施方案16.根据在前任一个实施方案的第一种酶的用途，用于降低蛋白质底物中游离硫醇的浓度。 
实施方案17.根据实施方案16的第一种酶的用途，其中蛋白质底物是蛋白质食料，其优选包含肌球蛋白。 
实施方案18.根据实施方案17的第一种酶的用途，其中蛋白质食品底物含有或源自动物肉，如哺乳动物、鸟或鱼肉。 
实施方案19.根据实施方案17的第一种酶的用途，其中蛋白质食品底物含有或源自选自猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉、火鸡、鳕鱼、袋鼠、鸵鸟、鲨鱼的肉。 
实施方案20.根据实施方案17的第一种酶的用途，其中蛋白质食品底物是猪肉、羊肉和鸡肉，最优选猪肉。 
实施方案21.根据实施方案16至20任一个的第一种酶的用途，其导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少5％。 
实施方案22.根据16至21任一个实施方案的第一种酶的用途，其导致蛋白质底物中的游离硫醇浓度降低至少1μM。 
实施方案23.根据16至22任一个实施方案的第一种酶的用途，其中蛋白质底物的游离硫醇浓度降低足以增强第二种酶交联底物中存在的蛋白质(如肌球蛋白)的能力。 
实施方案24.根据实施方案23的第一种酶的用途，其中第二种酶是如实施方案1-15任一个中所限定的。 
实施方案25.制备蛋白质交联食料的方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够降解或氧化游离硫醇的第一种酶处理蛋白质食料； 
b.用第二种酶处理蛋白质食料； 
其中在步骤b)之前，或同时进行步骤a)，并且步骤b)导致所述蛋白质食品中存在的蛋白质的交联。 
实施方案26.根据实施方案25的方法，其中能够降解或氧化游离硫醇的酶是根据实施方案1-15任一个中限定的第一种酶。 
实施方案27.根据实施方案25或26的方法，其中步骤a)包括根据实施方案16-24任一个的第一种酶的用途。 
实施方案28.根据实施方案25-27任一个的方法，其中步骤a)导致蛋白质食品底物的游离硫醇浓度降低至少5％。 
实施方案29.根据实施方案25-28任一个的方法，其中步骤a)导致蛋白质食品底物的游离硫醇浓度降低至少1μM。 
实施方案30.根据实施方案25-29任一个的方法，其中步骤a)导致蛋白质食品底物的游离硫醇浓度降低，这种降低足以增强第二种酶交联食品中存在的蛋白质(如肌球蛋白)的能力。 
实施方案31.根据实施方案25-30任一个的方法，其中第二种酶是如实施方案1-15任一个中所限定的。 
实施方案32.根据实施方案25-31任一个的方法，其中蛋白质食品是如实施方案17-20任一个中所限定的。 
实施方案33.根据实施方案25-32任一个的方法，其中蛋白质食料包含肌球蛋白，并且在步骤a)和b)之后，处理过的蛋白质食品中存在的肌球蛋白的蛋白质交联程度为至少5％。 
实施方案34.根据实施方案25-33任一个中的方法，其中在步骤a)和b)之后，与未处理的蛋白质食品相比，蛋白质食料的凝胶强度或保水性，或两者，得到了增强。 
实施方案35.通过实施方案25-34任一个制得的食料。 
实施方案36.根据实施方案35的蛋白质食料，其中所述食品中存在的游离硫醇的浓度不高于15μM，或不高于10μM，或不高于5μM。 
实施方案37.根据实施方案35至36的蛋白质，其中凝胶强度增强至少2g。 
实施方案38.根据实施方案35至37任一个的蛋白质食料，其中保水性增强至少5％，如至少10％。 
实施方案39.根据实施方案35至38任一个的蛋白质食料，其中总肌球蛋白的至少10％是交联的。 
实施方案40.根据实施方案35至39任一个的蛋白质食料，其中游离硫醇的浓度降低至少2μM。 
实施方案41.根据实施方案35至40任一个的蛋白质食料，其中蛋白质食料源自动物肉，如哺乳动物、鸟或鱼肉。 
实施方案42.根据实施方案35至41任一个的蛋白质食料，其中食品无人造添加剂，特别是如磷酸盐添加剂。 
实施方案43.包含根据实施方案35至42任一个的蛋白质食料的加工食品。 
实施方案44.根据实施方案43的加工食品，其中所述食品选自熟肉、干&半干咸肉产品、发酵制品、乳化制品、鱼&海产品、新鲜肉肌肉、碎/重建鲜肉、重新形成的肉、家禽制品、蒸馏制品、高压灭菌肉制品、素食&人造肉产品。 
实施方案45.根据实施方案1-15任一个的酶系统用于制备具有增强的保水性的蛋白质食料的用途。 
实施方案46.根据实施方案1-15任一个的酶系统用于制备具有增强的凝胶强度的蛋白质食料的用途。 
实施方案47.根据实施方案1-15任一个的酶系统用于制备具有增强的质地或口感的蛋白质食料的用途。 
方面1.交联蛋白质底物的制备方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够除去游离硫醇的第一种酶处理包含游离硫醇的蛋白质底物； 
b.用活性受到游离硫醇抑制的第二种酶处理蛋白质底物， 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联，并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
方面2.根据方面1的方法，其中第二种酶选自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶和蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)。 
方面3.根据方面2的方法，其中第二种酶选自脂肪氧合酶和蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)。 
方面4.根据方面1-3任一个的方法，其中第二种酶是漆酶。 
方面5.根据方面1-3任一个的方法，其中第二种酶是酪氨酸酶。 
方面6.根据方面1-5任一个的方法，其中第一种酶和/或第二种酶是分离或纯化形式的。 
方面7.根据方面1-6任一个的方法，其中第一种酶是氧化酶。 
方面8.根据方面1-6任一个的方法，其中第一种酶不是漆酶。 
方面9.根据方面1-6任一个的方法，其中第一种酶具有EC编码 1.8.3.2或1.8.3.3。 
方面10.根据方面1-6任一个的方法，其中第一种酶是巯基氧化酶。 
方面11.根据方面1-6任一个的方法，其中第一种酶是谷胱甘肽氧化酶。 
方面12.根据方面1-6任一个的方法，其中第一种酶是二硫化物异构酶。 
方面13.根据方面1-12任一个的方法，其中蛋白质底物是蛋白质食料，其优选包含肌球蛋白。 
方面14.根据方面13的方法，其中蛋白质食料含有或源自动物肉，如哺乳动物、鸟或鱼肉。 
方面15.根据方面14的方法，其中蛋白质食料含有或源自选自猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉、火鸡、鳕鱼、袋鼠、鸵鸟、鲨鱼的肉。 
方面16.根据方面15的方法，其中蛋白质食料选自猪肉、羊肉和鸡肉，最优选猪肉。 
方面17.根据方面1-16任一个的方法，其中第一种和第二种酶存在相同的酶组合物中。 
方面18.根据方面1-17任一个的方法，其中在使用前，使第一种酶与第二种酶分离。 
方面19.根据方面1-18任一个的方法，其中第一种酶和第二种酶以试剂盒的形式作为酶系统来提供，所述试剂盒包括含有第一种酶的第一个罐和含有第二种酶的第二个罐。 
方面20.根据方面19的方法，其中第一种酶在使用前在0.001至300mg/g的浓度下以酶系统的形式存在。 
方面21.根据方面19-20任一个的方法，其中第二种酶在使用前在0.001至500mg/g的浓度下以酶系统的形式存在。 
方面22.根据方面19-21任一个的方法，其中酶系统是食品加工助剂的形式，用于蛋白质食品的酶处理。 
方面23.根据方面22的方法，其中酶系统包含更多成分，如一种或多种食品酶组合物成分和/或载体。 
方面24.根据方面1-23任一个的方法，其中步骤a)中游离硫醇的除去导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少5％。 
方面25.根据方面1-24任一个的方法，其中步骤a)中游离硫醇的除去导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少1μM。 
方面26.如在前任一个方面中所限定的第一种酶的用途，用于降低蛋白质底物中游离硫醇的浓度。 
方面27.根据方面26的第一种酶的用途，其中蛋白质底物是蛋白质食料，其优选包含肌球蛋白。 
方面28.根据方面27的第一种酶的用途，其中蛋白质食料含有或源自动物肉，如哺乳动物、鸟或鱼肉。 
方面29.根据方面28的第一种酶的用途，其中蛋白质食料含有或源自选自猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉、火鸡、鳕鱼、袋鼠、鸵鸟、鲨鱼的肉。 
方面30.根据方面29的第一种酶的用途，其中蛋白质食料选自猪肉、羊肉和鸡肉，最优选猪肉。 
方面31.根据方面26至30任一个的第一种酶的用途，其导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少5％。 
方面32.根据方面26至31任一个的第一种酶的用途，其导致蛋白质底物的游离硫醇浓度降低至少1μM。 
33.根据方面26至32任一个的第一种酶的用途，其中蛋白质底物的游离硫醇浓度的降低足以增强第二种酶交联底物中存在的蛋白质(如，肌球蛋白)的能力。 
方面34.根据方面33的第一种酶的用途，其中第二种酶是1-25任一个方面中限定的。 
方面35.改善其活性受到游离硫醇的存在抑制的第二种酶对包含游离硫醇的蛋白质底物的酶活性的方法，所述方法包括用能够除去游离硫醇的第一种酶处理蛋白质底物；其中在用第二种酶处理之前或同时进行第一种酶的处理，并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶。 
方面36.根据方面35的方法，其中酶活性导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联。 
方面37.根据方面35-36任一个的方法，其中第一种酶是如方面1-26任一个中所限定的。 
方面38.根据方面35-37任一个的方法，其中第二种酶选自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶、半乳糖氧化酶、蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)、半乳糖脂酶和溶血磷脂酶。 
方面39.根据方面35-38任一个的方法，其中蛋白质底物是如方面1-26中任一个所限定的。 
方面40.蛋白质交联食料的制备方法，所述方法包括步骤： 
a.用能够降解或氧化游离硫醇的第一种酶处理蛋白质食料； 
b.用第二种酶处理蛋白质食料， 
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质底物中存在的蛋白质的交联。 
方面41.根据方面40的方法，其中能够降解或氧化游离硫醇的酶是1-25任一个方面中限定的。 
方面42.根据方面40或41的方法，其中步骤a)包含使用根据26-34任一个方面的第一种酶。 
方面43.根据方面40-42任一个的方法，其中步骤a)导致蛋白质食料的游离硫醇浓度降低至少5％。 
方面44.根据方面40-43任一个的方法，其中步骤a)导致蛋白质食料的游离硫醇浓度降低至少1μM。 
方面45.根据方面40-44任一个的方法，其中步骤a)导致蛋白质食料的游离硫醇浓度的降低，这种降低足以增强第二种酶交联食品底物中存在的蛋白质(如肌球蛋白)的能力。 
方面46.根据方面40-45任一个的方法，其中第二种酶是如方面1-25任一个中所限定的。 
方面47.根据方面40-46任一个的方法，其中蛋白质食品是如方面27-30任一个中所限定的。 
方面48.根据方面40-47任一个的方法，其中蛋白质食料包含肌球 蛋白，并且步骤a)和b)之后，处理过的蛋白质食品中存在的肌球蛋白的交联程度为至少5％。 
方面49.根据方面40-48任一个的方法，其中在步骤a)和b)后，与未处理的蛋白质食品相比，蛋白质食料的凝胶强度或保水性，或两者，得到了增强。 
方面50.通过方面40-49任一个制备的食料。 
方面51.根据方面50的蛋白质食料，其中所述食品中存在的游离硫醇的浓度不高于15μM，或不高于10μM，或不高于5μM。 
方面52.根据方面50至51的蛋白质，其中凝胶强度改善至少2g。 
方面53.根据方面50至52任一个的蛋白质食料，其中保水性改善至少5％，如至少10％。 
方面54.根据方面50至53任一个的蛋白质食料，其中总肌球蛋白的至少10％是交联的。 
方面55.根据方面50至54任一个的蛋白质食料，其中游离硫醇的浓度降低至少2μM。 
方面56.根据方面50至55任一个的蛋白质食料，其中蛋白质食料源自动物肉，如哺乳动物、鸟类或鱼类。 
方面57.根据方面50至56任一个的蛋白质食料，其中食品无人造添加剂，特别是如磷酸盐添加剂。 
方面58.包含根据方面50至57任一个的蛋白质食料的加工食品。 
方面59.根据方面58的加工食品，其中食品选自熟肉、干&半干咸肉产品、发酵制品、乳化制品、鱼&海产品、新鲜肉肌肉、碎/重建鲜肉、重新形成的肉、家禽制品、蒸馏制品、高压灭菌肉制品、素食&人造肉产品。 
方面60.根据方面1-25任一个的方法用于制备具有增强保水性的蛋白质食料的用途。 
方面61.根据方面1-25任一个的方法用于制备具有增强凝胶强度的蛋白质食料的用途。 
方面62.根据1-25任一个方面的方法用于制备具有增强质地或口 感的蛋白质食料的用途。 
实施例
实施例1 
材料和方法 
配料： 
来自猪肉(3-7％脂肪)、牛肉(9-12％脂肪)、羊肉(8-10％脂肪)、鸡肉(3-6％脂肪)、火鸡(3-7％脂肪)和鳕鱼(脂肪含量未知)的碎肉都在当地商店购买。焦磷酸三钠(STPP)，酪氨酸酶(TrTyr2；VTT，芬兰，1067nkat/ml，根据供应商)，TG酶(Activa MP；Ajinomoto；1666nkat/g，根据供应商)，巯基氧化酶(曲霉属/黑曲霉；325nkat/g；测量的活性) 
蛋白质提取： 
1.使用2％NaCl和0.3％STPP制得盐水 
2.将20g部分的肉置于250ml带有挡板的摇瓶中 
3.将60ml盐水加入到每个摇瓶中 
4.将摇瓶置于旋转摇床(Certomat R，Braun Int.)上；在室温和180rpm下120分钟 
5.将肉-盐水悬浮液在10000g和5℃下离心60分钟 
6.通过将上清液通过0.8mm网过滤来除去脂肪颗粒 
7.将肉-蛋白质提取物(上清液)存储在-18℃。 
凝胶过滤/渗析
在来自Pierce(Order nr：66810)的Slide-A-Lyzer渗析盒中进行渗析。在4℃下将渗析进行过夜，更换一次渗析缓冲液。 
游离硫醇浓度的测定
Ellmans试剂I：将3mM EDTA(0.558g)；0.2M Tris(12.14g)溶 解于大约400ml水中，并用HCl调节pH至8，并装满水至500ml。 
Ellmans试剂II：将DTNB(Sigma D-8130)8mG溶解于20ml EllmansI中，并避光保存，在1天内使用。 
为了除去结合蛋白质的硫醇和澄清样品：将肉提取物(0.5ml)和0.5％三氯醋酸(0.5ml)在eppendorf试管中混合。将该试管在10000g下离心5分钟。将0.3ml上清液转移至新的试管中，并用40μL 1M NaOH中和。 
分析：将100μL不含蛋白质的样品在微量滴定盘的孔中与170μlEllmans试剂II混合。使用平板震荡器混合该样品。将平板在微量滴定平板阅读器内(以保持避光)在室温下培养，并在加入Ellmans试剂II后2分钟精确测量Abs420。 
硫醇浓度的计算：
ε＝消光系数 
(2-硝基-5-硫代苯甲酸酯；NTB)＝13600M-1*cm-1
r＝孔的半径＝0.35cm 
v＝孔中的样品体积＝0.27mL 
光路＝l＝v/(ε*r2)＝0.27/(ε*0.352)＝0.70cm 
硫醇浓度(mol/L)＝Abs420/(l*ε)＝Abs420/(0.70*13600) 
所有测定重复两份进行。 
巯基氧化酶活性的测量： 
作为加入巯基氧化酶后二硫苏糖醇(DTT)浓度的下降来测量(根据以上的)。该活性被定义为每秒钟氧化的nmol DTT。 
蛋白质含量的确定
根据Kjeldahl方法(Ma T S & Zuazaga G.Micro-Kjeldahl determination of nitrogen.Ind.Eng.Chem.(Analytical Edition)14：280-2，1942)来测定百分比的总氮含量。通过将总氮％乘以因子6.25 来确定蛋白质含量(http://www.foodcomp.dk/fvdb_aboutfooddata_proximates.asp#Protein)。 
用于SDS-PAGE分析的样品制备/酶处理
在SDS-PAGE分析之前，如下进行蛋白质提取物的酶处理：添加赖氨酸酶至15.5nkat/ml提取物的终浓度(对应于0.015mg酪氨酸酶/ml提取物)并在40℃下培养60分钟。添加TG酶至2.5nkat/ml提取物的终浓度(对应于0.015mgTG酶/ml提取物)并在40℃下培养60分钟。添加巯基氧化酶至0.0033(低巯基氧化酶)或0.033(高巯基氧化酶)nkat/ml的终浓度。通常在其他酶处理之前或同时加入。如果在其他酶处理之前添加，则使用室温下60分钟的培养时间。 
SDS-Page分析： 
根据制造商的实验方案在Pre-Gast Novex Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad CA，USA)上进行SDS-PAGE。对于非还原SDS-PAGE，样品缓冲液中不加DTT。 
酪氨酸酶斑点试验和抑制测试
通过将11nkat酪氨酸酶加入到1ml脱脂奶中来确定酪氨酸酶活性的斑点试验。在5-10秒钟内形成红色表示酪氨酸酶活性高。为了测试酪氨酸酶抑制，在酪氨酸酶加入到奶中之前将抑制剂与酪氨酸酶混合，或在酪氨酸酶加入之前，将抑制剂加入到奶中。所测试的抑制剂为终浓度为1或0.1mM的游离半胱氨酸或在最终样品中稀释10倍的肉提取物。 
用于质地和WHC评定的肉蛋白凝胶的产生
根据以下方法产生热诱导的肉蛋白凝胶： 
1.将12g肉蛋白提取物置于50ml螺旋盖塑料离心管中 
2.酶处理：将180μL TrTyr2(1067nkat/ml)+180μL水、180μL 巯基氧化酶(1mg/ml)+180μL TrTyr2(1067nkat/ml)、180μL巯基氧化酶(1mg/ml)+180μL水或360μL水(参照)加入到肉蛋白质提取物中 
3.将样品在40℃下培养1小时 
4.通过在80℃下加热60分钟来产生凝胶 
5.将凝胶在5℃下储存过夜 
6.将凝胶在35℃下调合2小时 
7.使用质地分析仪(TI-XT2，Stable micro systems)在试管中对凝胶进行TPA分析，使用以下设定：预速度2mm/秒，测试速度5mm/秒，触发力：3g，移动距离3mm，压缩之间的时间5秒，测力计5kg，探子：P0.5(5mm硬橡胶) 
8.在凝胶中切十字，并将试管在4000rpm下离心(Hettich Rotina46)10分钟 
9.倒出上清液并称重 
如下计算保水性(WHC)： 
WHC = 1 - W R W Tot
WR是从凝胶释放出来的水重量，WTot是凝胶的总重。 
结果 
图1显示了产生的所有肉蛋白提取物的SDS-PAGE凝胶。用TG酶(特定提取物的第一个泳道)、酪氨酸酶(特定提取物的第二个泳道)和无酶(特定提取物的第三个泳道)处理每种提取物。约188kDa MW的条带是肌球蛋白。 
图2显示了来自猪肉的提取物的SDS-PAGE分析，该提取物在电泳之前进行了渗析。对于头三个泳道，将提取物相对盐水溶液进行渗析，盐水溶液与用于提取的盐水相似，除了不含STPP。对于泳道4-6，将提取物相对与用于提取的盐水溶液相同的盐水溶液进行渗析。如图1所示，用TG酶(泳道1和4)和TrTyr2(泳道2和5)处理提取物。 
表1列出了每种提取物中测量的蛋白质和游离硫醇浓度(两次测定的平均值)。结果显示不同提取物的蛋白质和游离硫醇含量都有很大差异。在蛋白质含量和游离硫醇浓度之间似乎不存在任何关联。还测定了用0.033nkat/ml巯基氧化酶处理60分钟后的猪肉和牛肉提取物的游离硫醇含量。 
表1：不同蛋白质提取物的蛋白质含量和游离硫醇浓度。 
活性斑点测试显示出降至约10μM浓度的游离半胱氨酸产生了明显的酪氨酸酶抑制。在添加底物之前，半胱氨酸和酶相互接触约1分钟。 
图3显示了猪肉(a)和牛肉(b)提取物的SDS-PAGE分析，在加入交联酶之前，用巯基氧化酶处理提取物来除去游离硫醇。 
图4说明了从不同肉提取物制得的凝胶的凝胶强度和WHC与蛋白质含量成正相关。注意到该图只是描绘了参照样品(无酶处理)。从鳕鱼提取物制得的凝胶不是均质的，在凝胶强度测量中产生了较大的变化。然而，一致地低于其他凝胶。 
图5a和b各自描绘了从用各种酶处理的不同蛋白质提取物热诱导凝胶的凝胶强度和WHC。用巯基氧化酶和TrTyr2处理时，对猪肉、鸡肉和羊肉形成的凝胶观察到对凝胶强度的明显积极作用。对于从牛肉和火鸡提取物制得的凝胶，用巯基氧化酶+酪氨酸酶的处理与单独的酪氨酸酶处理产生了相似的结果。由于非常不均匀的凝胶，省略了鳕鱼的凝胶强度结果。对于凝胶WHC观察到的趋势与凝胶强度相似，除了鸡肉凝胶的WHC与处理无关，并未改变。即使凝胶不是均质的，还是测量了鳕鱼的WHC。进行TG酶处理作为参照。 
重复使用猪肉提取物以及巯基氧化酶和酪氨酸酶组合的实验，获得了相似的结果。然而，用新的蛋白质提取物进行第二个实验，凝胶强度 和WHC都产生了不同的水平。因此，结果未包括在图5中。此外，用单独的巯基氧化酶进行样品。在这种情况下，与参照样品相比，没有观察到凝胶强度和WHC的差异。 
讨论 
酪氨酸酶处理对来自不同动物物种的肉蛋白提取物的作用不是相似的(图1)。更明显地，在猪肉提取物的酪氨酸酶处理中没有看到发生交联(比较泳道11-酪氨酸酶处理，泳道12-参照)，而在来自例如牛肉的提取物中，在酪氨酸酶处理时，观察到凝胶顶部中的HMW蛋白条带，表明蛋白交联(比较泳道8-酪氨酸酶处理，泳道9-参照)。伴随地，肌球蛋白条带(188kDa)的强度降低，这表明这种蛋白质的大部分是交联的。除了猪肉，酪氨酸酶处理在来自所有物种的提取物中产生了高MW蛋白质聚集。然而，交联活性的效率似乎各不相同。在鳕鱼提取物中，肌球蛋白条带完全消失，表明交联非常有效。而对于牛肉、火鸡、鸡肉和羊肉，存在不同程度的肌球蛋白条带衰减，表明不同程度的交联效率。 
TG酶，公知的蛋白交联酶，通常包括作为阳性参照(图1中的泳道1、4、7、13、16)。看到TG酶催化的交联在所有提取物中是有效的。在在此所述的结果中，TG酶的活性没有受到任何进一步处理的影响。 
肌球蛋白是动物界中非常保守的蛋白质，并因此认为肌球蛋白底物在不同肉样品之间是相等。 
我们已经鉴定了肉底物(如猪肉或鸡肉)中的低酪氨酸酶活性是由于不同提取物中酪氨酸酶抑制的存在引起的。通过两个简单的测试来证实了这个观点：1)在酪氨酸酶处理之前猪肉提取物的十倍稀释赋予了酶活性(观察到SDS-PAGE上的高MW条带和肌球蛋白衰减；结果未显示)。2)由于醌的形成，酪氨酸酶使奶变成红色。将这用作简单的酪氨酸酶活性斑点测试。如果在加入奶之前，将酪氨酸酶与猪肉提取物混合，没有观察到颜色形成。这两个测试都表明了提取物的抑制效果。 
此外，我们尝试增强从碎猪肉的蛋白质提取物制得的蛋白质凝胶的 质地，但是观察到为了获得质地增强，需要非常高酪氨酸酶浓度。该结果还支持酪氨酸酶受到猪肉提取物中一些成分的抑制。 
进行猪肉提取物的渗析(图2)。看到相对用于蛋白质提取的精确相同溶液的渗析赋予了酪氨酸酶活性(比较泳道5和6)。这表明源自低MW化合物的抑制。 
磷酸盐是酪氨酸酶的潜在抑制剂，因为它们可以与铜离子螯合，铜离子对于酪氨酸酶的催化活性是必需的。磷酸盐STPP以0.3％的水平存在于所有提取物中。然而，STPP是抑制原因是不太可能的，因为在渗析后仍然存在。此外，它存在来自所有物种的提取物，并且酪氨酸酶催化的交联也是有效的。然而，还是将猪肉提取物相对无STPP的溶液进行渗析。与以上提及的相一致，观察到没有进一步的酪氨酸酶交联功效(比较泳道2和5；不应当对条带强度的小差异得出结论，因为SDS样品溶液是粘性的，降低了吸移的精确性)。加入额外的铜也没有看到改善酪氨酸酶活性(结果未显示)。 
文献研究揭示了两种潜在的抑制剂，其可能在肉提取物中遇到。一种是具有总共超过4个双键的甘油三酯，另一种是游离半胱氨酸。 
首先，在提取前通过不同的程序来尝试从肉中除去潜在的抑制脂质。这些包括用溶剂洗涤(己烷、acetem、三丁精或水)和用脂酶处理。通常，来自这些实验的结果是非决定性的，并且决不是表示脂质是酪氨酸酶抑制的主要诱因。 
为了了解半胱氨酸的潜在抑制作用，用斑点测试酪氨酸酶活性，在试验培养基中含有或不含不同浓度的半胱氨酸。酪氨酸酶受到浓度超过10μM的半胱氨酸的明显抑制。随后，测量了不同蛋白质提取物中的游离硫醇(其包括游离半胱氨酸)含量(表1)。观察到来自猪肉的提取物中存在的游离硫醇的浓度最高，并且浓度(18.4μM)高出用半胱氨酸观察到的抑制限制很多。不知道在源自游离半胱氨酸的样品中存在的游离硫醇有多少。然而，通常可能是酪氨酸酶受到低MW游离硫醇的抑制，而不是单独的游离半胱氨酸。在来自鸡肉和羊肉的提取物中，游离硫醇浓度也高于半胱氨酸的抑制水平。来自鸡肉和羊肉提取物的这些样 品也出现了肌球蛋白条带的最小强度衰减(图1)，即，酪氨酸酶受到一定程度的抑制。鳕鱼提取物具有最低的游离硫醇含量，并且提取物的肌球蛋白条带的衰减也是最明显的。总而言之，这是游离硫醇引起酪氨酸酶抑制的强烈证据。 
在防止游离硫醇抑制作用的尝试中，用巯基氧化酶处理提取物，巯基氧化酶将游离硫醇氧化成二硫化物。在用巯基氧化酶(0.33或0.033nkat/ml)处理猪肉提取物后，酪氨酸酶不再受到抑制，正如图3a中所看到的高MW蛋白聚集物的形成和SDS-PAGE分析中肌球蛋白条带的实质性衰减(比较泳道2、5和8)。单独的巯基氧化酶没有引起任何可观察到的蛋白质交联(比较泳道3、6和9)。我们考虑了可能是巯基氧化酶在蛋白质之间产生了二硫化物交联，由于SDS样品缓冲液中还原剂DTT的存在，这在图3中的凝胶上观察不到。因此，在非还原条件(无DTT)下进行了SDS-PAGE分析。然而，观察到单独的巯基氧化酶没有交联作用(结果未显示)。对于牛肉提取物(图3b)，酪氨酸酶能够交联蛋白质，与提取物是否已经接受了巯基氧化酶处理无关。这表明巯基氧化酶本身对酪氨酸酶活性不具有消极作用。 
肉蛋白的交联可以增强肉制品的质地和感官特性。在较早的研究中，发现与如下的预期相反，单独的酪氨酸酶没有增强热诱导蛋白质凝胶的凝胶强度和WHC，特别是从猪肉提取物制得的凝胶。作为以上结果的延续，测试了蛋白质提取物中游离硫醇的除去是否可以加强酪氨酸酶催化的交联预期的功能性作用。看到了(图5)单独的酪氨酸酶可以改善从游离硫醇含量低的提取物(牛肉和火鸡)制得的热诱导蛋白质凝胶的强度和WHC。只有在酪氨酸酶作用之前，除去游离硫醇(通过巯基氧化酶)，从高硫醇含量的提取物(猪肉和鸡肉)产生的凝胶中的这样的改善才有可能。 
在不同的提取物之间，凝胶强度和WHC的水平存在非常明显的差异。这是提取物中不同蛋白质含量的结果(图4)。 
结论 
关于酪氨酸酶催化的交联，来自不同类型肉的蛋白质提取物显示出非常不同的特征。该差异与样品中的游离硫醇的不同水平相关，在酪氨酸酶处理之前用巯基氧化酶的处理消除了具有显著抑制的肉提取物(如来自猪肉的提取物)中的酪氨酸酶催化的交联的低效率。 
单独的酪氨酸酶可以改善从游离硫醇含量低的提取物(牛肉和火鸡)制得的热诱导蛋白质凝胶的强度和WHC。只有在酪氨酸酶作用之前，除去游离硫醇(通过巯基氧化酶)，从高硫醇含量的提取物(猪肉和鸡肉)产生的凝胶中的这样的改善才有可能。 
我们注意到大部分肉具有可检测的并且在许多情况下显著的游离硫醇含量，因此甚至在可能获得满意凝胶强度或保水性的肉中，使用巯基氧化酶使得可以降低酪氨酸酶的用量，和/或较短或更理想的酶培养时间。 
这个构思也适用于全肉产品中。这通过将不同的SOX和酪氨酸酶的组合加入到含有碎鸡肉的模式鸡肉香肠配方中显示出来。表明了当继SOX处理之后加入酪氨酸酶时，与对照产品相比，产品的硬度和保水性都得到了显著提高。当这两种酶中的任何一种单独使用时，情况就不是这样了。这种酪氨酸酶-SOX组合比供应商推荐剂量的转谷氨酰胺酶产生了明显更高的产品硬度和保水性(结果未显示)。 

Claims (12)

1.交联蛋白质食料的制备方法，其中蛋白质食料含有或源自哺乳动物或鸟肉，所述方法包括步骤：
a.用选自巯基氧化酶、谷胱甘肽氧化酶和二硫化物异构酶的第一种酶处理包含游离硫醇的蛋白质食料；
b.用选自酪氨酸酶、漆酶、脂肪氧合酶和蛋白质溶素6-氧化酶(赖氨酰氧化酶)的第二种酶处理蛋白质食料；
其中在步骤b)之前或同时进行步骤a)，并且其中步骤b)导致所述蛋白质食料中存在的蛋白质的交联并且其中第一种酶和第二种酶不是相同的酶，并且其中，与未经处理的蛋白质食品相比，步骤a)和b)之后的蛋白质食料的凝胶强度或保水性，或两者，得到了增强。
2.根据权利要求1的方法，其中第二种酶为酪氨酸酶。
3.根据权利要求1的方法，其中第一种酶是巯基氧化酶。
4.根据权利要求1或3的方法，其中第一种酶不是漆酶。
5.根据权利要求1-3任一项的方法，其中蛋白质食料包含肌球蛋白。
6.根据权利要求1-3任一项的方法，其中第一种和第二种酶存在于相同的酶组合物中。
7.根据权利要求1-3任一项的方法，其中第一种酶和第二种酶以试剂盒的形式作为酶系统来提供，所述试剂盒包括含有第一种酶的第一个罐和含有第二种酶的第二个罐。
8.根据权利要求7的方法，其中第一种酶在使用前在0.001与300mg/g之间的浓度下以酶系统的形式存在。
9.根据权利要求7的方法，其中第二种酶在使用前在0.001与500mg/g之间的浓度下以酶系统的形式存在。
10.根据权利要求1-9任一项的方法用于制备具有增强的保水性的蛋白质食料的用途。
11.根据权利要求1-9任一项的方法用于制备具有增强的凝胶强度的蛋白质食料的用途。
12.根据权利要求1-9任一项的方法用于制备具有增强的质地或口感的蛋白质食料的用途。
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