CZ304969B6 - Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K, vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K a kvasinková hostitelská buňka transformovaná tímto vektorem - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K zahrnující kroky: a) transformace hostitelské buňky vektorem obsahujícím DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, který je fúzován v místě před kódující sekvencí se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje signální peptid a je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku, b) exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K a c) sekrece a autokatalytické aktivace proteinázy K, kde hostitelskou buňkou je kvasinková buňka vybraná z Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. a Schizosaccharomyces sp. a protein je sekretován v rozpustné formě tímto expresním hostitelem. Vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, přičemž tato DNA je fúzována v místě před kódující sekvencí se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje vhodný signální peptid a kódující gen je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku a tento vektor je vhodný pro transformaci výše uvedených kvasinkových buněk. Kvasinková hostitelská buňka transformovaná tímto vektorem.

Description

Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K, vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K a kvasinková hostitelská buňka transformovaná tímto vektorem

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K v rozpustné a aktivní formě v ekonomicky relevantním množství, vektoru obsahujícího DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K a kvasinkové hostitelské buňky transformované tímto vektorem.

Dosavadní stav techniky

Proteináza K (E. C. 3.4.21.64, také známá pod označením endopeptidáza K) je extracelulámí endopeptidáza, která je syntetizována vláknitou houbou Tritirachium album Limber. Je to člen skupiny serinových proteáz s typickou katalytickou triádou Asp³⁹-His⁶⁹-Ser²²⁴ (Jany, K. D. et al., 1986, FEBS Letters, sv. 199(2), 139-144). Protože sekvence polypeptidového řetězce dlouhá 279 aminokyselin (Gunkel, F. A. a Gassen; H. G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1), 185-194) a trojrozměrná struktura (Betzel, C. et al., 1988, Eur. J. Biochem., sv. 178(1), 155-71) má vysoký stupeň homologie s bakteriálními substilisíny, je proteináza K zařazena jako člen subtilisinové rodiny (Pahler, A. et al., 1984, EMBO J., sv. 3(6),1311-1314, Jany, K. D. a Mayer, B., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv. 366(5), 485-492). Proteináza K byla pojmenována na základě své schopnosti hydrolyzovat nativní keratin, a tak umožnit růst vláknitým houbám na keratinu jako jediném zdroji uhlíku a dusíku (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J. Biochem., sv. 47(1), 91-97. Proteináza K má specifickou aktivitu vyšší než 30 U/mg a je tak jednou z nej účinnějších známých endopeptidáz (Betzel, C. et al., 1986, FEBS Lett., sv. 197(1-2), 105-110), a nespecificky hydrolyzuje nativní a denaturované proteiny.

Proteináza K z Tritirachium album Limber je translatována ve svém přirozeném hostiteli jako preproprotein. Sekvence cDNA genu, který kóduje proteinázu K, byla dekódována v roce 1989 autory Gunkel, F. A. A Gassen, H. G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1), 185-194. Podle toho je gen pro prepro-proteinázu K složen ze dvou exonů a kóduje signální sekvenci dlouhou 15 aminokyselin, prosekvenci dlouhou 90 aminokyselin a zralou proteinázu K dlouhou 279 aminokyselin. Intron o velikosti 63 bp je lokalizován v úseku prosekvence. Prepeptid je odštěpen během translokace do endoplazmatického retikula (ER). V současnosti je známo velmi málo o dalším zpracování nutném pro to, aby vznikla zralá proteináza K štěpením propeptidu.

Takže zralá proteináza K se skládá z 279 aminokyselin. Kompaktní struktura je stabilizována dvěma disulfidovými můstky a dvěma navázanými ionty vápníku. To vysvětluje, proč má proteináza K ve srovnání s dalšími subtilisiny mnohem vyšší stabilitu vůči extrémním hodnotám pH, vysokým teplotám, chaotropním látkám a detergentům (Dolashka, P. et al., 1992, Int. J. Pept. Protein. Res., sv. 40(5), 465—171). Proteináza K je charakterizována vysokou termostabilitou (až do 65 °C, Bajorath et al., 1988, Eur. J. Biochem., sv. 176, 441—447) a širokým rozsahem pH (pH 7,5-12,0, Ebeling, W. et al., 1974. Eur. J. Biochem., sv. 47(1), 91-97). Její aktivita je zvýšena v přítomnosti denaturačních látek, jako je například močovina nebo SDS (Hilz, H. et al., 1975, J. Biochem., sv. 56(1), 103-108, Jany, K. D. a Mayer, B., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv. 366(5), 485-192).

Výše uvedené vlastnosti činí proteinázu K obzvláště vhodnou pro biotechnologické aplikace, ve kteiých je požadována nespecifická degradace proteinu. Speciálními příklady je izolace nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) ze surových extraktů a příprava vzorku pro analýzu DNA (Goldenberg, D. et al., 1995, PCR Methods Appl,, sv. 4(6), 368—370, patent Spojených Států US 5 187 083, patent Spojených Států US 5 346 999). Další aplikace jsou v oboru analýzy proteinů, jako například objasňování struktury.

-1 CZ 304969 B6

Proteináza K je získávána komerčně ve velkém množství fermentaci vláknité houby Tritirachium album Limber (např. CBS 348.55, Merck, kmen č. 2429 nebo kmen ATCC 22563). Nicméně v tomto způsobu je produkce proteinázy K potlačována glukózou nebo volnými aminokyselinami. Protože média obsahující protein také indukují expresi proteáz, je nutné použít proteiny, jako je například BSA, sušené mléko nebo sojová mouka, jako jediný zdroj dusíku. Sekrece proteázy začne, jakmile je dosaženo stacionární růstové fáze (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J Biochem., sv. 47(1), 91-97).

Protože Tritirachium album Limber je následkem toho nevhodná pro fermentaci ve velkém měřítku, a navíc je obtížné ji geneticky manipulovat, byly prováděny různé pokusy, jak dosáhnout nadměrné exprese rekombinantní proteinázy K v dalších hostitelských buňkách. Nicméně v těchto experimentech nebyla zaznamenána žádná významná aktivita kvůli nedostatku exprese, tvorbě inaktivních inkluzních tělísek nebo problémům s renaturací (Gunkel, F. A. a Gasseri, H.

G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1),185-194, Samal, Β. B. et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., sv. 379,95-104).

Tritirachium album Limber je pomalu rostoucí vláknitá houba, která sekretuje do média pouze malá množství proteáz. Má nevýhodu pomalejšího buněčného cyklu ve srovnání s kvasinkami a nižší optickou denzitou, které může být dosaženo ve fermentoru. Kromě toho je známo, že T. Album také vytváří jiné proteázy kromě proteinázy K, které mohou kontaminovat preparát (Samal, Β. B. et al., 1991, Enzyme Microb. Technol., sv. 13, 66-70).

Ačkoli v principu je možné exprimovat proteinázu K v E. coli, není exprimována v rozpustné formě, ale v takzvaných inkluzních tělískách, ze kterých musí být enzym následovně solubilizován a do určitého stupně renaturován. Nevýhodou tohoto způsobu je, že je během solubilizace a renaturace ztraceno mnoho proteinu.

Proto předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob přípravy rekombinantní proteinázy K v ekonomicky relevantním množství.

Překvapivě se ukázalo, že je možné exprimovat a sekretovat rekombinantní proteinázu K jakožto zymogenní prekurzor v rozpustné formě v kvasinkách, které jsou autokatalyticky aktivovány, za vzniku aktivní proteinázy K. Aktivní proteináza K může být přitom purifikována ze supematantu média.

Podstata vynálezu

Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je způsob přípravy rekombinantní proteinázy K zahrnující kroky:

a) transformace hostitelské buňky vektorem obsahujícím DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, který je fúzován v místě před kódující sekvenci se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje signální peptid aje pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku,

b) exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K a

c) sekrece a autokatalytické aktivace proteinázy K, přičemž hostitelskou buňkou je kvasinková buňka ze skupiny zahrnující Pichia sp., Hensenula sp., Saccharomyces sp. a Schizosaccharomyces sp. a protein je sekretován rozpustné formě tímto expresním hostitelem.

Přednostní provedení tohoto aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména ii) způsob podle provedení i) kde hostitelskou buňkou je Pichia Pastoris·, iii) způsob podle provedení i) nebo ii), kde exprese zymogenního prekurzoru proteinázy Kje indukována methanolem;

-2CZ 304969 B6 iv) způsob podle kteréhokoliv z provedení i) až iii), kde sekrece proteinu je iniciována Nkoncové fúzovaným signálním peptidem; a

v) způsob podle kteréhokoliv z provedení i) až iv), kde sekrece proteinu je iniciována N-koncově fúzovaným signálním peptidem α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae.

Dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu vi) je vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, přičemž tato DNA je fúzována v místě před kódující sekvencí se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje vhodný signální peptid a kódující gen je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku a tento vektor je vhodný pro transformaci kvasinkových buněk, kde kvasinkové buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. a Schizosaccharomyces sp.

V přednostním provedení tohoto aspektu vynálezu (provedení vii) je tento vektor vhodný pro transformaci Pichia pastoris.

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu viii) je hostitelská buňka vybraná ze skupiny kvasinek zahrnující Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. a Schizosaccharomyces sp., transformovaná vektorem podle kteréhokoliv z provedení vi) a vii).

V přednostním provedení tohoto aspektu vynálezu (provedení ix) je touto hostitelskou buňkou Pichia pastoris.

V dalším popisu je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.

Předkládaný vynález se tedy týká způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K obsahující kroky:

a) transformace hostitelské buňky vektorem obsahujícím DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, který je fúzován v protisměru od kódující protisměru od kódující sekvence se sekvenci ve čtecím rámci, která kóduje signální peptid a je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku,

b) exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K,

c) sekrece a autokatalytická aktivace proteinázy K a

d) izolace a purifikace proteinázy K.

Způsob je charakteristický tím, že hostitelská buňka je kvasinková buňka a protein je sekretován v rozpustné formě tímto expresním hostitelem.

Ve zvláštním provedení způsobu podle vynálezu je hostitelská buňka vybrána z následující skupiny: druh Pichia, druh Hansenula, jako je například Hansenula polymorpha, druh Saccharomyces, druh Schizosaccharomyces, druh Yarrowia, jako je například Yarrowia lipolytica, druh Kluyveromyces a druh Aspergillus. Podle vynálezu je obzvláště výhodné, když je jako hostitelská buňka použita Pichia pastoris.

Kromě toho bylo prokázáno, že je pro způsob podle vynálezu výhodné, když hostitelská buňka je transformována DNA kódující zymogenním prekurzorem a proteinázy K je autokatalyticky aktivována později během sekrece do kultivačního média nebo ihned po sekreci.

Když je jako hostitelská buňka použita Pichia pastoris, gen kódující zymogenní prekurzor proteinázy Kje výhodně klonován do následujících vektorů: pPICZ, pPICZa, pGAPZ, pGAPZa, pPICZaA a pPIC9K. V tomto případě jsou obzvláště výhodné vektory pPICZaA a pPIC9K. Pod-3 CZ 304969 B6 le vynálezu je obzvláště výhodný vektor pPICZaA. Výše uvedené vektory jsou komerčně dostupné (Invitrogen).

Kromě toho ve způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K podle vynálezu je výhodné, že exprese proteinázy K nebo zymogenní prekurzor proteinázy K je indukován methanolem (vektory pPIC). Další způsob je indukce exprese glyceraldehydfosfátem (vektory pGAP).

Ve způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K podle vynálezu je sekrece proteinu výhodně iniciována N-koncově fúzovaným signálním peptidem α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. To například znamená, že výše uvedené α-značené vektory mají nukleotidovou sekvenci pro signální peptid α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. Během translace je pak tvořen fúzní protein, který se skládá ze signálního peptidu na N-konci a cílového proteinu. Další možný signální peptid by byla přirozená signální sekvence pro proteinázu K.

Kromě toho bylo prokázáno, že je pro výrobu rekombinantní proteinázy K obzvláště výhodné transformovat hostitelskou buňku Pichia pastoris expresními vektory pPICZaA a pPIC9K, které obsahují DNA kódující zymogenní prekurzor a že tento gen je pod kontrolou AOX1 promotoru a volitelně AOX1 terminátoru.

Předkládaný vynález se také týká vektoru obsahujícího DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, kterýje fúzován v protisměru od kódující sekvence se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje vhodný signální peptid, a kde kódující gen je pod kontrolou vhodného promotoru a volitelně terminátoru pro hostitelskou buňku, a kde je tento vektor vhodný k transformaci této hostitelské buňky. Hostitelská buňka podle vynálezu je kvasinka.

Proto se vynález také týká rekombinantního vektoru, který obsahuje jednu nebo více kopií rekombinantní DNA definované výše. Vektor je výhodně plazmid, který má silný promotor pro hostitelskou buňku a vhodný signální peptid pro hostitelskou buňku pro sekreci proteinů. Navíc je také možné fúzovat nativní signální peptid prepro-proteinázy K k N-konci propeptidu, jak bylo ukázáno v sekv. id. č. 21 (signální sekvence 1 až 15 (15 aminokyselin), prosekvence 16 až 104 (90 aminokyselin), sekvence zralé proteinázy K 106 až 384 (279 aminokyselin)). Ke vzniku expresního vektoru jsou použity metody, které jsou odborníkovi známy a jsou popsány například v práci Sambrook et al., 1989.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je hostitelská buňka transformovaná jedním z vektorů uvedených výše, přičemž hostitelská buňka je kvasinka. Hostitelská buňka je výhodně vybraná z následující skupiny: druh Pichia, druh Hansenula, jako je například Hansenula polymorpha, druh Saccharomyces, druh Schizosaccharomyces, druh Yarrowia, jako je například Yarrowia lipolytica, druh Kluyveromyces a druh Aspergillus. Jako hostitelská buňka je obzvláště výhodná Pichia pastoris. Obzvláště je výhodné, když je do genomu začleněno několik vektorů (každý sjednou kopií genu ppK).

Kromě toho se předkládaný vynález týká způsobu purifikace proteinázy K. Aby byla purifikována proteáza, jsou kvasinky odstraněny v prvním kroku mikrofiltrací nebo centrifugaci. Výsledný čirý roztok obsahuje proteázu. To je následováno změnou pufru pomocí ultrafiltrace, aby se produkt navázal ke kationtovému iontoměniči, jako je například SP-Sepharose nebo SP-Sephadex (Pharmacia) nebo SP-Toyopearl (Tosoh Korporace). Po eluci je znovu provedena změna pufru pomocí ultrafiltrace a navázání k aniontovému iontoměniči, jako je například DEAE-Sepharose nebo Q-Sepharose (Pharmacia) nebo DEAE-Fraktogel (Merck). Po další eluci je čistá proteáza přenesena pomocí ultrafiltrace do stabilního systému pufrů (Protein Purification, Principles and Practice, Robert K. Scopes, Springer Verlag, 1982). Nicméně odborník může použít další metody purifikace, které jsou součástí stavu techniky.

Způsob podle vynálezu překvapivě umožňuje přípravu rekombinantní proteinázy K, kdy je enzym tvořen heterologní hostitelskou buňkou v rozpustné a aktivní formě. Exprese proteinázy

-4CZ 304969 B6

K s následnou sekrecí enzymu do kultivačního média je obzvláště výhodná, protože zabrání tomu, aby proteináza K vyvíjela silně toxický účinek v cytosolu hostitelské buňky. Kromě toho to zajistí správnou farmacii dvou disulfidových můstků, která nemůže nastat snadno v redukčním prostředí cytosolu. Proto důležitou výhodou způsobu podle vynálezu je to, že poskytuje přístup pro rozpustnou a aktivní produkci rekombinantní proteinázy K. Je velmi překvapivé a nevysvětlitelné, že povrchové proteiny hostitelských buněk podle vynálezu nejsou hydrolyzovány sekretovanou proteinázou K. Takováto očekávaná hydrolýza povrchových proteinů proteinázou Kby interferovala s životním cyklem hostitelské buňky.

Proteináza K je získávána způsobem podle vynálezu, je homogenní a z tohoto důvodu obzvláště vhodná pro analytické a diagnostické použití. Zymogenní prekurzor proteinázy K podle vynálezu může volitelně obsahovat další N-koncové modifikace a obzvláště sekvence, které usnadní purifikaci cílového proteinu (afinitní značky). Kromě toho zymogenní prekurzor může obsahovat sekvence, které zvýší účinnost translace, které zvýší účinnost svinutí a/nebo také sekvence, které mají za následek sekreci cílového proteinu do kultivačního média (přirozené presekvence a další signální peptidy).

Proteináza K podle vynálezu označuje zejména sekvenci podle autorů Gassen et al., 1989, uvedenou v sekv. id. ě. 1, a také další varianty proteinázy K z Tritirachium album Limber, jako je například aminokyselinová sekvence popsaná autory Ch. Betzel et al. (Biochemistry 40, 2001, 3080-3088) a obzvláště proteináza T (Samal, Β. B. et al., 1989, Gene, sv. 85(2), 329-333, Samal, Β. B. et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., sv. 379, 95-104) a proteináza R (Samal, Β. B. et al., 1990, Mol Microbiol., sv. 4(1), 1789-1792, patent Spojených Států US 5 278 062) a další varianty produkované rekombinantními prostředky (jak bylo popsáno například ve WO 96/28 556). sekv. id. č. 1 obsahuje prosekvenci (1 až 90, 90 aminokyselin) a sekvenci zralé proteinázy K (91 až 368, 279 aminokyselin). Aminokyselinová sekvence proteinázy K popsaná autory Betzel et al. (Biochemistry 40, 2001, 3080-3088) má konkrétně aspartát místo serinového zbytku v poloze 207 aktivní proteázy.

Pro-proteináza K podle vynálezu znamená obzvláště proteinázu K, jejíž N-konec je připojen kjejí prosekvenci podle sekv. id. č. 1. V případě subtilisinu E, kterýje blízce příbuzný proteináze K a jejím variantám, má prosekvence důležitý vliv na svinutí a tvorbu aktivní proteázy (Ikemura,

H. et al., 1987, Biol. Chem., sv. 262(16), 7859-7864). Konkrétně je předpokládáno, že prosekvence působí jako intramolekulámí chaperon (Inouye, M., 1991, Enzyme, sv. 45, 314-321). Po svinutí je zpracována za vzniku zralé substilisinové proteázy autokatalytickým štěpením propeptidu (Ikemura, H. a Inouye, M., 1988, J. Biol. Chem., sv. 263(26), 12959-12963). Tento postup se vyskytuje v případě subtilisinu E (Samal, Β. B. et al., 1989, Gene, sv. 85(2), 329-333, Volkov, A. a Jordán, F., 1996, J. Mol. Biol., sv. 262, 595-599), subtilisinu BPN' (Eder, J. et al., 1993, Biochemistiy, sv. 32, 18-26), papainu (Vemet, T. et al., 1991, J. Biol. Chem., sv. 266(32), 21451-21457) a thermolysinu (Marie-Claire, C., 1998, J. Biol. Chem., sv. 273(10), 5697-5701).

Zdá se, že pro funkci chaperonu jsou nutné pouze určité jádrové úseky prosekvence, které jsou obvykle hydrofobní, protože mutace rozsáhlých oblastí nemají žádný vliv na aktivitu (Kobayashi, T. a Inouye. M., 1992, J. Mol. Biol., sv. 226, 931-933). Kromě toho je známo, že mezi různými subtilisinovými variantami mohou být vyměňovány propeptidy. Tak například subtilisin BPN' také rozpoznává prosekvenci subtilisinu E (Hu, Z. et al., 1996, J. Biol. Chem., sv. 271(7), 3375— 3384).

Proto se předkládaný vynález týká prosekvence podle sekv. id. č. 1 dlouhé 90 aminokyselin, a také dalších variant, které usnadňují svinutí. To se také týká propeptidu, kterýje přidáván exogenně pro svinutí zralé proteinázy K a má funkce popsané výše.

Proto je důležitou výhodnou způsobu podle vynálezu, že rekombinantní proteináza Kje sekretována expresním hostitelem do kultivačního média v rozpustné a aktivní formě. Navíc expresní hostitel použitý ve způsobu podle vynálezu není postižen nebo jinak poškozen velmi aktivní a

-5CZ 304969 B6 nespecifickou proteázou, tj. konkrétně pokračuje růst bez problémů a není pozorována zvýšená buněčná lýza. Kromě toho je snadnější manipulace s expresním hostitelem podle vynálezu ve srovnání s Tritirachium album aje charakterizován vyšším tempem růstu.

Objasnění výkresů

Obrázek 1

Expresní plazmid pPICPK-1. Sekvence kódující zymogenní proformu proteinázy K klonovaná do výchozího vektoru pPICZaA (Invitrogen),

Obrázek 2

Expresní plazmid pPICPK-2. Sekvence kódující zymogenní proformu proteinázy K klonovaná do výchozího vektoru pPIC9K (Invitrogen).

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Syntéza genu

Gen pro zralou proteinázou K z Tritirachium album Limber bez signální sekvence a bez intronu byl vytvořen pomocí genové syntézy. Sekvence (bez nativního signálního peptidů) autorů Gunkel a Gassen, 1989, dlouhá 368 aminokyselin, byla použita jako templát. Sekvence nukleové kyseliny s optimalizovanými kodony pro expresi v E. coli, a také ve kvasinkách, byla získána retranslací aminokyselinové sekvence. Aminokyselinová sekvence je uvedena v sekv. id. č. 1 a nukleotidová sekvence je uvedena v sekv. id. č. 2.

Pro účely genové syntézy byl gen rozdělen na 18 fragmentů sense (přímých) a reverzních, komplementárních, protilehlých oligonukleotidů, ve střídavé sekvencí (sekv. id. č. 3 až 20). Usek o velikosti alespoň 15 bp byl připojen k 5' konci a ke 3' konci, které pokaždé přečnívaly sousedící oligonukleotidy. Místa rozpoznávání pro restrikční endonukleázy byla připojena k 5' a 3' koncům syntetického genu vně kódujícího úseku pro následné klonování do expresních vektorů. Oligonukleotid uvedený v sekv. id. č. 3, který obsahuje místo štěpení EcoRI, byl použit jako 5' primer pro klonování genu pro-proteinázy K. sekv. id. č. 20 ukazuje 3' primer obsahující místo štěpení HindlII. 3' primer obsahuje další stop kodon po přirozeném stop kodonu pro zajištění terminace translace.

Oligonukleotidy byly spojeny pomocí PCR reakce a výsledný gen byl amplifikován. Za tímto účelem byl gen nejdříve rozdělen do tří fragmentů, každý po 6 oligonukleotidech, a tyto tři fragmenty byly spojeny dohromady v druhém cyklu PCR.

Fragment 1 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 3 až 8, fragment 2 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 9 až 14 a fragment 3 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 16 až 20.

-6CZ 304969 B6

Byly použity následující PCR parametry: PCR reakce 1 (vytvoření tří fragmentů)

5 minut	95 °C	hot start (začátek s vysokou teplotou)
2 minuty	95 °C '
2 minuty	42 °C	> 30 cyklů
1,5 minuty	72 °C
7 minut	72 °C	závěrečné prodlužování

PCR reakce 2 (vazba fragmentů za vzniku celkového genu)

5 minut	95 °C
1,5 minuty	95 °C '
2 minuty	48 °C	►	6 cyklů (bez koncových primerů)
2 minuty	72 °C
Přidání koncových primerů
1,5 minuty	95 °C '
1,5 minuty	60 °C	►	25 cyklů (s koncovými primery)
2 minuty	72 °C
7 minut	72 °C		závěrečné prodlužování
Příklad 2

Klonování syntetického fragmentu proteinázy K z genové syntézy

PCR směs byla aplikována na agarózový gel a PCR fragment přibližně o velikosti 1130 bp byl izolován z agarózového gelu (Geneclean II Kit od firmy Bio 101, lne., CA USA). Fragment byl štěpen po dobu 1 hodiny ve 37 °C s EcoRI a HindlII restrikčními endonukleázami (Roche Diagnostic sGmbEI, Německo). Současně byl štěpen plazmid pUC18 (Roche Diagnostics GmbEI, Německo) po dobu 1 hodiny ve 37 °C s EcoRI a HindlII restrikčními endonukleázami, směs byla oddělena elektroforézou v agarózovém gelu a byl izolován vektorový fragment o velikosti 2635 bp. Následně byly PCR fragment a vektorový fragment spolu ligovány s použitím T4 DNA ligázy. Za tímto účelem bylo napipetováno 1 μΐ (20 ng) vektorového fragmentu a 3 μΐ (100 ng) PCR fragmentu, 1 μΐ lOx pufru pro ligázu (Maniatis et al., 1989, B.27), 1 μΐ T4 DNA ligázy, 4 μΐ sterilní redestilované H₂O, opatrně smíchány a inkubovány přes noc v 16 °C.

Klonovaný gen byl vyšetřen restrikční analýzou a několikanásobným sekvencováním obou vláken.

Příklad 3

Konstrukce vektoru

Syntetický gen musel být nejdříve znovu izolován z plazmidu pUC. Za tímto účelem byl nejdříve inkubován 1 pg plazmidové DNA s restrikční endonukleázou HindlII (Roche Diagnostic GmbH) podle instrukcí výrobce a pak byla restrikční endonukleáza inaktivována zahříváním na 65 °C po dobu 20 minut. Poté byly výsledné DNA přesahy vyplněny polymerázou (Klenow) podle instrukcí výrobce (Roche Diagnostics GmbH) a Klenowova polymeráza pak byla inaktivována inkubací v 75 °C po dobu 10 minut. Konečně byl vektorový fragment, který byl nyní linearizován z výše uvedeného pUC plazmidu, štěpen restrikční endonukleázou EcoRI (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce, reakční směs byla nanesena na 1% agarózový gel a fragmenty byly odděleny podle velikosti aplikací proudu (100 V/150 mA). Fragment o velikosti přibližně

-7CZ 304969 B6

1120 bp obsahující gen pro-proteinázy K (ppk gen) byl izolován z agarózového gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Quiagen).

Vektor pPICZaA (Invitrogen) byl štěpen restrikční endonukleázou Asp7181 (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce a restrikční endonukleáza byla inaktivována zahříváním inkubační směsi na 65 °C po dobu 20 minut. Poté byly výsledné DNA přesahy vyplněny Klenowovou polymerázou podle instrukcí výrobce (Roche Diagnostics GmbH) a Klenowova polymeráza pak byla inaktivována inkubací v 75 °C po dobu 10 minut. Konečně byl vektorový fragment, který byl nyní linearizován z pPICZaA, štěpen restrikční endonukleázou EcoRI (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce, reakční směs byla nanesena na 1% agarózový gel a fragmenty byly odděleny podle velikosti aplikací proudu (100 V/150 mA). Vektorový fragment o velikosti přibližně 3550 bp byl izolován z agarózového gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).

Fragmenty získané tímto způsobem byly ligovány dohromady standardními metodami (Sambrook et al. 1989). V tomto vektoru je ppk gen pod kontrolou AOX-1 promotoru (promotor pro alkoholoxidázu 1 z Pichia pastoris, indukovatelný methanolem) a je klonován s použitím této klonovací strategii do správného čtecího rámce za signální peptid α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. Genový fragment vložený tímto způsobem pak byl zkontrolován na bezchybnou sekvenci pomocí restrikční analýzy a sekvencováním. Výsledný expresní vektor, který obsahuje ppk gen, který kóduje pro-proteinázu K byl nazván pPICPK-1 (viz obr. 1).

Následně byl ppk gen také klonován do pPIC9K (Invitrogen). Za tímto účelem byl vektor pPICPK-1 štěpen podle instrukcí výrobce restrikčními endonukleázami Pmel a Notl (Roche Diagnostics GmbH), fragmenty z restrikční směsi byly odděleny podle velikosti v 1% agarózovém gelu a fragment o velikosti přibližně 1960 bp obsahující 3‘ část úseku AOX1 promotoru, sekvenci pro signální peptid z α-faktoru a ppk gen byl izolován z gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen). Současně vektor pPICK9K byl štěpen restrikčními endonukleázami Pmel a Notl (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce, fragmenty z restrikční směsi byly odděleny podle velikosti v 1% agarózovém gelu a vektorový fragment o velikosti přibližně 8450 bp byl izolován z gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).

Pak byly fragmenty získané tímto způsobem ligovány dohromady standardními metodami (Sambrook et al. 1989). V tomto vektoru je ppk gen také pod kontrolou AOX1-promotoru (promotor pro alkoholoxidázu 1 z Pichia pastoris, indukovatelný methanolem). Vektor pPIC9K se liší od vektoru pPICZaA selekčním markérem a třemi možnostmi jeho inteligence do genomu Pichia odborníkovi známými v závislosti na linearizaci vektoru před transformací, zatímco integrace pPICZaA do místa AOX1 je fixní. Vložený genový fragment pak byl zkontrolován na bezchybnou sekvenci pomocí restrikční analýzy a sekvencováním.

Výsledný expresní vektor, který obsahuje ppk gen, který kóduje pro-proteinázu K, byl nazván pPICPK-2 (viz obr. 2).

Příklad 4

Transformace pPICPK-1 v Pichia pastoris

Aby se transformoval pPICPK-1 do Pichia pastoris X-33 s následnou integrací do genomu, byl vektor nejdříve linearizován Pmel (Roche Diagnostics GmbH). Transformace byla prováděna elektroporací s použitím přístroje Gen Pulser II (Biorad).

Za tímto účelem bylo 5 ml média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) inokulováno kolonií kmene divokého typu Pichia pastoris a inkubováno přes noc ve 30 °C za třepání. Kultura rostoucí přes noc pak byla opět inokulována v poměru 1:2000 ve 200 ml čerstvého média YPD (podle

-8CZ 304969 B6 katalogu firmy Invitrogen) a inkubována přes noc ve 30 °C třepání, dokud OD₆oo nedosáhla hodnot 1,3 až 1,5. Buňky byly stočeny (1500 g/5 minut) a peleta byla resupendována ve 20 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C). Buňky byly znovu stočeny (1500 g/5 minut) a resuspendovány ve 100 ml ledově chladné sterilní vody (0°C. Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 10 ml ledově chladného (0 °C) 1M sorbitolu (ICN). Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 0,5 ml ledově chladného (0 °C) 1M sorbitolu (ICN). Buňky získané tímto způsobem byly udržovány na ledu a použity ihned pro transformaci.

Přibližně 1 pg linearizované DNA vektoru pPICK-1 byl přidán k 80 μΐ buněk a celá směs byla přenesena do ledově chladné (0 °C) elektroporační kyvety a inkubovány dalších 5 minut na ledu. Pak byla kyveta přenesena do přístroje Gen Pulser II (Biorad) a transformace byla prováděna při 1 kV, 1 kQ a 25 pF. Po elektroporaci byl ke směsi přidán 1 ml 1M sorbitolu (ICN) a následně 100 až 150 μΐ bylo naneseno na misky s agarem YPDS (podle katalogu firmy Invitrogen) obsahujícím 100 pg/ml Zeocin® (Invitrogen). Misky pak byly inkubovány po dobu 2 až 4 dnů ve 30 °C.

Destičky s mřížkou naplněné minimálním médiem s dextrózou byly inokulovány klony a klony byly analyzovány dále.

Klony, které vyrostly, byly vybrány, resuspendovány ve 20 μΐ sterilní vody a lyžovány 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) (1 hodina, 37 °C) a vyšetřeny přímo pomocí PCR na správnou integraci ppk expresní kazety.

Klony, které integrovaly kompletní expresní kazetu během transformace do genomu, pak byly použity v expresních experimentech.

Příklad 5

Transformace pPICPK-2 v Pichia pastoris

Aby se transformoval pPICPK-2 do Pichia pastoris GS 115 s následnou integrací do genomu, byl vektor nejdříve linearizován pro variantu I s Pmel (Roche Diagnostics GmbH), aby se integroval do místa AOX1 a linearizován se Sáli (Roche Diagnostics GmbH) pro variantu II, aby se integroval do místa His4. Transformace byla prováděna elektroporaci s použitím přístroje Gen Pulser (Biorad).

Pro tento účel bylo 5 ml média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) inokulováno kolonií kmene divokého typu Pichia pastoris GS114 a inkubováno přes noc ve 30 °C za třepání. Kultura rostoucí přes noc pak byla opět inokulována v poměru 1:2000 ve 200 ml čerstvého média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) a inkubována přes noc ve 30 °C třepání, dokud OD₆₀o nedosáhla hodnot 1,3 až 1,5. Buňky byly stočeny (1500 g/5 minut) a pelet byl resuspendován ve 200 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C). Buňky byly znovu stočeny (1500 g/5 minut) a resuspendovány ve 100 ml ledově chladné sterilní vody (0°C). Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 10 ml ledově chladného (0 °C) 1M sorbitolu (ICN). Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 0,5 ml ledově chladného (0 °C) 1M sorbitolu (ICN). Buňky získané tímto způsobem byly udržovány na ledu a použity ihned pro transformaci.

Přibližně 1 pg linearizované DNA vektoru pPICK-2 byl přidán k 80 μΐ buněk a celá směs byla přenesena do ledově chladné (0 °C) elektroporační kyvety a inkubovány dalších 5 minut na ledu. Pak byla kyveta přenesena do přístroje Gen Pulser II (Biorad) a transformace byla prováděna při 1 kV, 1 kQ a 25 pF. Po elektroporaci byl ke směsi přidán 1 ml 1M sorbitolu (ICN) a následně 100 až 150 μΐ bylo naneseno na misky s agarem MM (minimální médium podle katalogu firmy Invitrogen) bez histidinu. Misky pak byly inkubovány po dobu 2 až 4 dnů ve 30 °C. Klony Pichia pastoris GS 115, které mají defektní His4 gen způsobený mutací (histidinoldehydrogenáza) mo-9CZ 304969 B6 hou na těchto miskách růst pouze tehdy, když integrovaly vektor pPICPK-2, který má funkční His4 gen jako inzert a mohou tedy kompenzovat deficit v biosyntéze histidinu.

Destičky s mřížkou naplněné minimálním médiem s dextrózou byly inokulovány klony a klony byly analyzovány dále. Klony, které vyrostly, byly vybrány, resuspendovány ve 20 μΐ sterilní vody a lyžovány 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) (1 hodina, 37 °C) a vyšetřeny přímo pomocí PCR na správnou integraci ppk expresní kazety.

Klony, které integrovaly kompletní expresní kazetu během transformace do genomu, pak byly použity v expresních experimentech.

Příklad 6

Exprese proteinázy K ml média BMGY (podle katalogu firmy Invitrogen) bylo inokulováno pozitivními klony a inkubováno přes noc ve 30 °C za třepání. Pak byla určena optická denzita vóOOnm a 10 ml BMMY média (podle katalogu firmy Invitrogen) bylo inokulováno tak, aby bylo dosaženo OD₆oo rovnající se 1. Médium BBMY (podle katalogu firmy Invitrogen) obsahuje methanol (Mallinckrodt Baker B.V), který indukuje expresi proteinázy K prostřednictvím AOX1 promotoru.

Třepací baňka byla inkubována ve 30 °C za třepání, vzorky byly odebírány každých 24 hodin, byla určena OD₆oo, test aktivity byl prováděn na expresi proteinázy K a pokaždé byl opět podáván 0,5% methanol (Mallinckrodt Baker B.V) po další indukci. Expresní experimenty běžely 168 hodin.

Příklad 7

Test aktivity sekretované rekombinantní proteinázy K

Pro test aktivity rekombinantní proteinázy Kje vyžadováno CaCl₂ x 2H₂O (Merck ID-No. 102382), DMSO (Merck, ID-No. 109678), substrát Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Roche Diagnostics ID-No. 0716766) a Tris báze (Roche Diagnostics ID-No. 0153265).

Složení roztoků bylo, jak následuje:

Roztok 1: 50 mmol/1 Tris-Báze, 10 mmol/1 CaCl₂, pH 8,2

Roztok 2: 125 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA rozpuštěn v 1 ml DMSO

Buňky byly stočeny (5 minut 10 000 rpm stolní centrifuga Eppendorf) a supematant byl naředěn v poměru 1:500 v roztoku 1.

ml roztoku 1 byly pipeto vány do kyvety a bylo přidáno 0,02 ml roztoku 2. Oba roztoky byly smíchány a inkubovány při teplotě reakce 25 °C. Reakce byla započata přidáním 0,05 ml naředěného supematantu, jak uvedeno výše a opět promíchána, byla měřena změna absorbance ve 405 nm a byla měřena AA/minuta v lineárním úseku. Pro výpočet pak byl použit následující vzorec:

2,07 aktivita =-AA/minuta [U/ml roztoku vzorku] ε x 1 x 0,05

-10CZ 304969 B6

2,07 = objem vzorku ε₄₀₅ = 10,4 [mmol“¹ x 1 x cm“¹] 1 = optická délka kyvety 0,05 = objem přidaného vzorku

Seznam sekvencí:

<210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Tritirachium album Limfcer

<400> 1 Ala Pro 1

Ala

Val

Glu 5

Gin

Arg

Ser

Glu

Ala 10

Ala

Pro

Leu

Ile

Glu 15

Ala

Arg

Gly

Glu

Met 20

Val

Ala

Asn

Lys

Tyr 25

Ile

Val

Lys

Phe

Lys 30

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu 35

Ser

Ala

Leu

Asp

Ala 40

Ala

Met

Glu

Lys

Ile 45

Ser

Gly

Lys

Pro

Asp 50

His

Val

Tyr

Lys

Asn 55

Val

Phe

Ser

Gly

Phe 60

Ala

Ala

Thr

Leu

Asp 65

Glu

Asn

Met

Val

Arg 70

Val

Leu

Arg

Ala

His 75

Pro

Asp

Val

Glu

Tyr 80

Ile

Glu

Gin

Asp

Ala 85

val

Val

Thr

ile

Asn 90

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn 95

Ala

Pro

Trp

Gly

Leu 100

Ala

Arg

Ile

Ser

Ser 105

Thr

Ser

Pro

Gly

Thr 110

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Tyr 115

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly 120

Gin

Gly

Ser

Cys

Val 125

Tyr

Val

Ile

Asp

Thr 130

Gly

Ile

Glu

Ala

Ser 13S

His

Pro

Glu

Phe

Glu 140

Gly

Arg

Ala

Gin

Met 145

Val

Lys

Thr

Tyr

Tyr 150

Tyr

Ser

Ser

Arg

Asp 155

Gly

Asn

Gly

His

Gly 160

Thr

His

Cys

Ala

Gly 165

Thr

Val

Gly

Ser

Arg 170

Thr

Tyr

Gly

Val

Ala 175

Lys

- 11 CZ 304969 B6

Lys Thr Gin Leu Phe 180	Gly	Val	Lys	Val Leu 185	Asp Asp Asn Gly 190	Ser Gly
Gin Tyr Ser Thr Ile	Ile	Ala	Gly	Met Asp	Phe Val Ala Ser	Asp Lys
195			200		205
Aen Asn Arg Aen Cys	Pro	Lys	Gly	Val Val	Ala Ser Leu Ser	Leu Gly
210		215			220
Gly Gly Tyr Ser Ser	Ser	Val	Asn	Ser Ala	Ala Ala Arg Leu	Gin Ser
225	230				235	240
Ser Gly Val Met Val	Ala	Val	Ala	Ala Gly	Aen Asn Asn Ala	Asp Ala
245				250		255
Arg Asn Tyr Ser Pro	Ala	Ser	Glu	Pro Ser	Val Cys Thr Val	Gly Ala
260				265	270
Ser Asp Arg Tyr Asp	Arg	Arg	Ser	Ser Phe	Ser Asn Tyr Gly	Ser Val
275			280		285
Leu Asp Ile Phe Gly	Pro	Gly	Thr	Ser Ile	Leu Ser Thr Trp	Ile Gly
290		295			300
Gly Ser Thr Arg Ser	Ile	Ser	Gly	Thr Ser	Met Ala Thr Pro	His Val
305	310				315	320
Ala Gly Leu Ala Ala	Tyr	Leu	Met	Thr Leu	Gly Lys Thr Thr	Ala Ala
325				330		335
Ser Ala Cys Arg Tyr	Ile	Ala	Asp	Thr Ala	Asn Lys Gly Asp	Leu Ser
340				345	350
Aen Ile Pro Phe Gly	Thr	Val	Asn	Leu Leu	Ala Tyr Asn Asn	Tyr Gin
355			360		365
Ala
<210> 2
<211> 1124
<212> DNA
<213> Tritirachium	album	Limbe r-

<400> 2 gaattcgctc ctgccgttga gcagcgctcc gaggctgctc ctctgatcga ggcccgcggc 60 gagatggttg ccaacaagta catcgtcaag ttcaaggagg gtagcgctct ttccgctctg 120 gatgctgcca tggagaagat ctctggcaag cccgaccacg tctacaagaa cgccttcagc 180 ggtttcgctg cgaccctgga cgagaacatg gttcgggttc tccgcgccca ccccgatgtt 240 gagtacatcg agcaggatgc tgttgtcacc atcaacgctg cgcagaccaa cgctccctgg 300 ggcctggctc gcatctccag caceagcccc ggtacctcta cctactacta tgacgaatct 360 gccggccaag gctcctgcgt ctacgtgatc gacaccggta tcgaggcatc gcaccccgag 420 ttcgagggtc gtgcccagat ggtcaagacc tactactact ccagtcgcga cggtaacggt 480 cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct acggtgtcgc caagaagacc 540

- 12CZ 304969 B6 cágctgttcg gtgtcaaggt cctggatgac aacggcagtg gccagtactc caccatcatc 600 gccggtatgg acttcgttgc cagcgacaag aacaaccgca actgccccaa aggtgtcgtt 660 gcctccttat ccctgggcgg tggttactcc tcctccgtgá acagcgccgc tgcccgcctc 720 cagagctctg gtgtcatggt cgccgtcgct gccggtaaca acaacgctga cgcccgcaac 780 tactcccctg cttctgagcc ctcggtctgc accgtcggtg cttctgaccg ctacgaccgc 840 cgctccagct tctccaacta cggcagcgtt ttggacatct tcggccctgg taccagcatc 900 ctctccacct ggatcggcgg cagcacccgc tccatctctg gtacctccat ggctactccc 960 cacgttgccg gtctcgctgc ctacctcatg actcttggaa agactaccgc cgccagcgct 1020 tgccgataca ttgcegacac cgccaacaag ggcgacttaa gcaacattcc cttcggcact 1080 gtcaacttgc ttgcctacaa caactaccag gcttaatgaa gett 1124 <210> 3 <211> 79 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 3 cgcgaattcg ctcctgccgt tgagcagcgc tccgaggctg ctcctctgat cgaggcccgc 60 ggcgagatgg ttgccaaca 79 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400 4 atcttctcca tggcagcatc cagagcggaa agagcgctac cctccttgaa cttgacgatg 60 tacttgttgg caaccatctc 80

<210>	5
<211>	80
<212>	DNA
<21 3>	Syntetická sekvence
<220>
<22 3>	Popis syntetické sekvenc
<400>	5

tgccatggag aagatctctg gcaagcccga ccacgtctac aagaacgtct tcagcggttt 60 cgctgcgacc ctggacgaga 80

- 13 CZ 304969 B6 <210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 6.

tgctcgatgt actcaacatc ggggtgggcg cggagaaccc gaaccatgtt ctcgtccagg 60 gtcg 64 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: Amer <400> 7 tgagtacatc gagcaggatg ctgttgtcac catcaacgct gcgcagaccg ctgcgcagac 60 caacg 65 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 8 agtaggtaga ggtaccgggg ctggtgctgg agatgcgagc caggccccag ggagcgttgg 60 tctgcgcagc 70 <210> 9 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <r400> 9 gtacctctac ctactactat gacgaatctg ccggccaagg ctcctgcgtc tacgtgatcg 60 acaccggtat cgaggcatcg 80

-14CZ 304969 B6 <210> 10 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 10 ttaccgtcgc gactggagta gtagtaggtc ttgaccatct gggcacgacc ctcgaactcg 60 gggtgcgatg cctcgatacc g 81 <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 11 ccagtcgcga cggtaacggt cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct 60 acggtgtcgc caagaaga 78 <210> 12 <211> 73 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 12 atggtggagt actggceact gccgttgfcca fcccaggacct tgacaccgaa cagctgggtc 60 ttcttggcga cac 73 <210> 13 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 13 ggccagtáct ccaccatcat cgccggtatg gacttcgttg ccagcgacaa gaacaaccgc 50 aactgcccca aaggtgtcgt t .81

-15CZ 304969 B6 <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 14 gctctggagg cgggcagcgg cgctgttcac ggaggaggag taaccaccgc ccagggataa 60 ggaggcaacg acacctttgg g 81 <210> 15 <211> 82 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 15 gcccgcctcc agagctctgg tgtcatggtc gccgtcgctg ccggtaacaa caacgctgac 60 gcccgcaact actcccctgc tt 82 <210> 16 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 16 gttggagaag ctggagcggc ggtcgtagcg gtcagaagca ccgacggtgc agaccgaggg 60 ctcagaagca ggggagtagt 80 <210> 17 <211> 83 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 17 ctccagcttc tccaactacg gcagcgtttt ggacatcttc ggccctggta ccagcatcct 60 ctccacctgg atcggcggca gca 83

- 16CZ 304969 B6 <210> 18 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 18 tcatgaggta ggcagcgaga ccggcaacgt ggggagtagc catggaggta ccagagatgg 60 agcgggtgct gccgccgatc c 81 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 19 ctgcctacct catgacctta ggaaagacca ccgccgccag cgcttgccgt tacatcgccg 60 acaccgccaa caagggcgac t 81 <210> 20 <211> 87 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 20 atataagctt. ctattaagcc -tggtagttgt tgtaggctaa caggttgacg gtgccgaagg 60 gaatgttgct taagtcgccc ttgttgg 87 <210> 21 <211> 384 <212> PRT <213> Tritirachium album Limber

-17CZ 304969 B6

<400> 21

Met 1

Arg

Leu

Ser

Val 5

Leu

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Pro

Leu

Ala

Leu

Gly 15

Ala

Pro

Ala

Val

Glu 20

Gin

Arg

Ser

Glu

Ala 25

Ala

Pro

Leu

Ile

Glu 30

Ala

Arg

Gly

Glu

Mefc 35

Val

Ala

Asn

Lys

Tyr 40

Ile

Val

Lys

Phe

Lys 45

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu 50

Ser

Ala

Leu

Asp

Ala 55

Ala

Met

Glu

Lys

Ile 60

Ser

Gly

Lys

Pro

Asp 65

His

Val

Tyr

Lys

Asn 70

Val

Phe

Ser

Gly

Phe 75

Ala

Ala

Thr

Leu

Asp 80

Glu

Asn

Met

Val

Arg 85

Val

Leu

Arg

Ala

His 90

Pro

Asp

Val

Glu

Tyr 95

Ile

Glu

Gin

Asp

Ala 100

Val

Val

Thr

Ile

Asn 105

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn 110

Ala

Pro

Trp

Gly

Leu 115

Ala

Arg

Ile

Ser

Ser 120

Thr

Ser

Pro

Gly

Thr 125

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Tyr 130

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly 135

Gin

Gly

Ser

Cys

Val 140

Tyr

Val

Ile

Asp

Thr 145

Gly

Ile

Glu

Ala

Ser 150

His

Pro

Glu

Phe

Glu 155

Gly

Arg

Ala

Gin

Met 160

Val

Lys

Thr

Tyr

Tyr 165

Tyr

Ser

Ser

Arg Asp 170

Gly

Asn

Gly

His

Gly 175

Thr

His

Cys

Ala

Gly 180

Thr

Val

Gly

Ser

Arg 185

Thr

Tvr

Gly

Val

Ala 190

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu 195

Phe

Gly

Val

Lys

Val 200

Leu

Asp

Asp

Asn

Gly 205

Ser

Gly

Gin

Tyr

Ser 210

Thr

Ile

Ile

Ala

Gly 215

Met

Asp

Phe

Val

Ala 220

Ser

Asp

Lys

Asn

- 18CZ 304969 B6

Asn Arg 225

Αβη

Cys

Pro

Lys 230

Gly

Val

Val

Ala

Ser 235

Leu

Ser

Leu

Gly

Gly 240

Gly Tyr

Ser

Ser

Ser 245

val

Asn

Ser

Ala

Ala 250

Ala

Arg

Leu

Gin

Ser 255

Ser

Gly

Val

Met

Val 260

Ala

Val

Ala

Ala

Gly 265

Asn

Asn

Asn

Ala

Asp 270

Ala

Arg

Asn

Tyr

Ser 275

Pro

Ala

Ser

Glu

Pro 280

Ser

Val

Cys

Thr

Val 285

Gly

Ala

Ser

Asp

Arg 290

Tyr

Asp

Arg

Arg

Ser 295

Ser

Phe

Ser

Asn

Tyr 300

Gly

Ser

Val

Leu

Asp 305

Ile

Phe

Gly

Pro

Oly 310

Thr

Ser

Ile

Leu

Ser 315

Thr

Trp

Ile

Gly Gly 320

Ser

Thr

Arg

Ser

Ile 325

8er

Gly

Thr

Ser

Met 330

Ala

Thr

Pro

His

Val 335

Ala

Gly

Leu

Ala

Ala 340

Tyr

Leu

Met

Thr

Leu 345

Gly Lys

Thr

Thr

Ala 350

Ala

Ser

Ala

Cys

Arg 355

Tyr

Ile

Ala

Asp

Thr 360

Ala

Asn

Lys

Gly Asp 365

Leu

Ser

Asn

Ile

Pro 370

Phe

Gly

Thr

Val

Asn 375

Leu

Leu

Ala

Tyr

Asn 380

Aan

Tyr

Gin

Ala

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K zahrnující kroky:

   10 a) transformace hostitelské buňky vektorem obsahujícím DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, kteiý je fúzován v místě před kódující sekvenci se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje signální peptid aje pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku,

   b) exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K a

   c) sekrece a autokatalytické aktivace proteinázy K,

   15 vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka vybraná ze skupiny zahrnující Pichia sp., Hansenula sp., Saccharotnyces sp. a Schizosaccharomyces sp. a protein je sekretován v rozpustné formě tímto expresním hostitelem.
2. 2. Způsob podle nároku 1.. vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je Pichia pas20 toris.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K je indukována methanolem.

   25
4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že sekrece proteinu je iniciována N—koncově fúzovaným signálním peptidem.

   - 19CZ 304969 B6
5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že sekrece proteinu je iniciována N-koncově fúzovaným signálním peptidem α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae.

   5
6. 6. Vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, přičemž tato DNA je fúzována v místě před kódující sekvencí se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje vhodný signální peptid a kódující gen je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku a tento vektor je vhodný pro transformaci kvasinkových buněk, kde kvasinkové buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. a Schizosaccharomyces sp.
7. 7. Vektor podle nároku 6, který je vhodný pro transformaci Pichia pastoris.
8. 8. Hostitelská buňka vybraná ze skupiny kvasinek zahrnující Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. a Schizosaccharomyces sp., transformovaná vektorem podle kteréhokoliv z náro15 ků6a7.
9. 9. Hostitelská buňka podle nároku 8, kterou je Pichia pastoris.