CZ20032163A3

CZ20032163A3 - Exprese rekombinantní proteinázy K z Tritirachium album v kvasinkách

Info

Publication number: CZ20032163A3
Application number: CZ20032163A
Authority: CZ
Inventors: Muellerárainer; Thalhoferájohann@Peter; Geipeláfrank; Glaserástephan; Hoelkeáwerner; Schoenáhelmut; Kirschbaumáthomas
Original assignee: F@Hoffmann@Laárocheáag
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2004-05-12
Also published as: EP1360283B1; ES2280516T3; DE10105911A1; CA2435606A1; CA2435606C; DK1360283T3; ATE353960T1; DE50209478D1; JP2004517643A; WO2002064760A3; CN100549169C; CZ304969B6; US20040166560A1; WO2002064760A2; US7368274B2; EP1360283A2; CN1592785A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby rekombinantní proteinázy K v rozpustné a aktivní formě v ekonomicky relevantním množství.

Dosavadní stav techniky

Proteináza K (E.C. 3.4.21.64, také známá pod označením endopeptidáza K) je extracelulární endopeptidáza, která je syntetizována vláknitou houbou Tritirachium album Limber. Je to člen skupiny serinových proteáz s typickou katalytickou triádou Asp³⁹-His⁶⁹-Ser²²⁴ (Jany, K.D. et al., 1986, FEBS Letters, sv. 199(2),139-144). Protože sekvence polypeptidového řetězce dlouhá 279 aminokyselin (Gunkel, F.A. a Gassen, H.G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1), 185-194) a trojrozměrná struktura (Betzel, C. et al., 1988, Eur. J. Biochem., sv. 178(1), 155-71) má vysoký stupeň homologie s bakteriálními subtilisiny, proteináza K je zařazena jako člen subtilisinové rodiny (Pahler, A. et al., 1984, EMBO J. , sv. 3(6),1311-1314, Jany, K.D. a Mayer, B., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv.

366(5), 485-492). Proteináza K byla pojmenována na základě své schopnosti hydrolyzovat nativní keratin, a tak umožnit růst vláknitým houbám na keratinu jako jediném zdroji uhlíku a dusíku (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J. Biochem., sv.

• Φ φ φφ · φφφ • · φφφ φφφφ • φφφ φ φφφ φφφφφ • ΦΦΦ φφ Φ· ·· ·· ·

47(1), 91-97.' Proteináza Κ má specifickou aktivitu vyšší než

U/mg a je tak jednou z nejúčinnějších známých endopeptidáz (Betzel, C. et al., 1986, FEBS Lett., sv. 197(1-2), 105-110), a nespecificky hydrolyzuje nativní a denaturované proteiny.

Proteináza K z Tritirachium album Limber je translatována ve svém přirozeném hostiteli jako preproprotein. Sekvence cDNA genu, který kóduje proteinázu K, byla dekódována v roce 1989 autory Gunkel, F.A. A Gassen, H.G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1), 185-194. Podle toho je gen pro prepro-proteinázu

K složen ze dvou exonů a kóduje signální sekvenci dlouhou 15 aminokyselin, prosekvenci dlouhou 90 aminokyselin a zralou proteinázu K dlouhou 279 aminokyselin. Intron o velikosti 63 bp je lokalizován v úseku prosekvence. Prepeptid je odštěpen během translokace do endoplazmatického retikula (ER) . V současnosti je známo velmi málo o dalším zpracování nutném pro to, aby vznikla zralá proteináza K štěpením propeptidu.

Takže zralá proteináza K se skládá z 279 aminokyselin. Kompaktní struktura je stabilizována dvěma disulfidovými můstky a dvěma navázanými ionty vápníku. To vysvětluje, proč má proteináza K ve srovnání s dalšími subtilisiny mnohem vyšší stabilitu vůči extrémním hodnotám pH, vysokým teplotám, chaotropním látkám a detergentům (Dolashka, P. et al., 1992,

Int. J Pept. Protein. Res.., sv. 40 (5), 465-471). Proteináza K je charakterizována vysokou termostabilitou (až do 65 °C,

Bajorath et al., 1988, Eur. J. Biochem., sv. 176, 441-447) a širokým rozsahem pH (pH 7,5-12,0, Ebeling, W. et al. , 1974.

Eur. J Biochem., sv. 47(1), 91-97). Její aktivita je zvýšena v přítomnosti denaturačních látek, jako je například urea nebo SDS (Hilz, H. et al., 1975, J. Biochem., sv. 56(1), 103-108,

Jany, K.D a Mayer, B., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv.

366(5), 485-492).

Výše uvedené vlastnosti činí proteinázu K obzvláště vhodnou pro biotechnologické aplikace, ve kterých je požadována nespecifická degradace proteinu. Speciálními příklady je izolace nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) ze surových extraktů a příprava vzorku pro analýzu DNA (Goldenberger, D. et al., 1995, PCR Methods Appl., sv. 4(6), 368-370, patent Spojených Států č. 5 187 083, patent Spojených Států č. 5 346 999). Další aplikace jsou v oboru analýzy proteinů, jako například objasňování struktury.

Proteináza K je získávána komerčně ve velkém množství fermentaci vláknité houby Tritirachium album Limber (např. CBS 348.55, Merck, kmen č. 2429 nebo kmen ATCC 22563). Nicméně v tomto způsobu je produkce proteinázy K potlačována glukózou nebo volnými aminokyselinami. Protože média obsahující protein také indukují expresi proteáz, je nutné použít proteiny, jako je například BSA, sušené mléko nebo sojová mouka, jako jediný zdroj dusíku. Sekrece proteázy začne, jakmile je dosaženo stacionární růstové fáze (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J Biochem., sv. 47(1), 91-97).

Protože Trltlrachium album Limber je následkem toho nevhodná pro fermentaci ve velkém měřítku, a navíc je obtížné ji geneticky manipulovat, byly prováděny různé pokusy, jak dosáhnout nadměrné exprese rekombinantní proteinázy K v dalších hostitelských buňkách. Nicméně v těchto experimentech nebyla zaznamenána žádná významná aktivita kvůli nedostatku exprese, tvorbě inaktivních inkluzních tělísek nebo problémům s renaturací (Gunkel, F.A. a Gasseri, H.G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1),185-194, Samal, B.B. et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., sv. 379, 95-104).

Tritirachium album Limber je pomalu rostoucí vláknitá houba, která sekretuje do média pouze malá množství proteáz.

Má nevýhodu pomalejšího buněčného cyklu ve srovnání • · · · · · • · · s kvasinkami a nižší optickou denzitu, který může být dosaženo ve fermentoru. Kromě toho je známo, že T. Album také vytváří jiné proteázy kromě proteinázy K, které mohou kontaminovat preparát (Samal, B.B. et al., 1991, Enzyme Microb. Technol., sv. 13, 66-7 0) .

Ačkoli v principu je možné exprimovat proteinázu K v E. coli, není exprimována v rozpustné formě, ale v takzvaných inkluzních tělískách, ze kterých musí být enzym následovně solubilizován a do určitého stupně renaturován. Nevýhodou tohoto způsobu je, že je během solubilizace a renaturace ztraceno mnoho proteinu.

Proto předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob přípravy rekombinantní proteinázy K v ekonomicky relevantním množství.

Překvapivě se ukázalo, že je možné exprimovat a sekretovat rekombinantní proteinázu K jakožto zymogenní prekurzor v rozpustné formě v kvasinkách, které jsou autokatalyticky aktivovány, za vzniku aktivní proteinázy K. Další předmětem vynálezu je purifikace aktivní proteinázy K ze supernatantu média.

Proto se předkládaný vynález týká způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K obsahujícího kroky:

a) transformace hostitelské buňky vektorem obsahujícím DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, který je fúzován v protisměru od kódující sekvence se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje signální peptid a je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku,

b) exprese zymogenního prekurzorů proteinázy K

c) sekrece a autokatalytická aktivace proteinázy K

d) izolace a purifikace proteinázy K,

• · · ·

· · ·

Způsob je charakteristický kvasinková buňka a protein tímto expresním hostitelem.

tím, že hostitelská buňka je je sekretován v rozpustné formě

Ve zvláštním provedení způsobu podle vynálezu je hostitelská buňka vybrána z následující skupiny: druh Pichia, druh Hansenula, jako je například Hansenula polymorpha, druh Saccharomyces, druh Schizosaccharomyces, druh Yarrowia, jako je například Yarrowia lipolytica, druh Kluyveromyces a druh Aspergillus. Podle vynálezu je obzvláště výhodné, když je jako hostitelská buňka použita Pichia pastoris.

Kromě toho bylo prokázáno, že je pro způsob podle vynálezu výhodné, když hostitelská buňka je transformována DNA kódující zymogenní prekurzor a proteináza K je autokatalyticky aktivována později během sekrece do kultivačního média nebo ihned po sekreci.

Když je jako hostitelská buňka použita Pichia pastoris, gen kódující zymogenní prekurzor proteinázy K je výhodně klonován do následujících vektorů: pPICZ, pPICZa, pGAPZ, pGAPZa, pPICZaA a pPIC9K. V tomto případě jsou obzvláště výhodné vektory pPICZaA a pPIC9K. Podle vynálezu je obzvláště výhodný vektor pPICZaA. Výše uvedené vektory jsou komerčně dostupné (Invitrogen).

Kromě toho ve způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K podle vynálezu je výhodné, že exprese proteinázy K nebo zymogenní prekurzor proteinázy K je indukován methanolem (vektory pPIC). Další způsob je indukce exprese glyceraldehydfosfátem (vektory pGAP).

Ve způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K podle vynálezu je sekrece proteinu výhodně iniciována N-koncovou fúzí signálního peptidu α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. To například znamená, že výše uvedené α-značené vektory mají • · • · • · ·

999 9 nukleotidovou sekvenci pro signální peptid cc-faktoru ze

Saccharomyces cerevisiae. Během translace je pak tvořen fúzni protein, který se skládá ze signálního peptidů na N-konci a cílového proteinu. Další možný signální peptid by byla přirozená signální sekvence pro proteinázu K.

Kromě toho bylo prokázáno, že je pro výrobu rekombinantni proteinázy K obzvláště výhodné transformovat hostitelskou buňku Píchla pastoris expresními vektory pPICZaA a pPIC9K, které obsahují DNA kódující zymogenní prekurzor a že tento gen je pod kontrolou A0X1 promotoru a volitelně A0X1 terminátoru.

Předkládaný vynález se také týká vektoru obsahujícího DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, který je fúzován v protisměru od kódující sekvence se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje vhodný signální peptid a kde kódující gen je pod kontrolou vhodného promotoru a volitelně terminátoru pro hostitelskou buňku a kde tento vektor je vhodný k transformaci této hostitelské buňky. Hostitelská buňka podle vynálezu je kvasinka.

Proto se vynález také týká rekombinantního vektoru, který obsahuje jednu nebo více kopií rekombinantni DNA definované výše. Vektor je výhodně plazmid, který má silný promotor pro hostitelskou buňku a vhodný signální peptid pro hostitelskou buňku pro sekreci proteinů. Navíc je také možné fúzovat nativní signální peptid prepro-proteinázy K k N-konci propeptidu, jak bylo ukázáno v sekv. id. č. 21 (signální sekvence 1 až 15 (15 aminokyselin), prosekvence 16 až 104 (90 aminokyselin), sekvence zralé proteinázy K 106 až 384 (279 aminokyselin)). Ke vzniku expresního vektoru jsou použity metody, které jsou odborníkovi známy a jsou popsány například v práci Sambrook et al., 1989.

9

Ί

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je hostitelská buňka transformovaná jedním z vektorů uvedených výše, přičemž hostitelská buňka je kvasinka. Hostitelská buňka je výhodně vybraná z následující skupiny: druh Pichia, druh Hansenula, jako je například Hansenula polymorpha, druh Saccharomyces, druh Schizosaccharomyces, druh Yarrowia , jako je například Yarrowia lipolytica, druh Kluyveromyces a druh Aspergillus. Jako hostitelská buňka je obzvláště výhodná Pichia pastoris. Obzvláště je výhodné, když je do genomu začleněno několik vektorů (každý s jednou kopií genu ppK).

Kromě toho se předkládaný vynález týká způsobu purifikace proteinázy K. Aby byla purifikována proteáza, jsou kvasinky odstraněny v prvním kroku mikrofiltrací nebo centrifugací. Výsledný čirý roztok obsahuje proteázu. To je následováno změnou pufru pomocí ultrafiltrace, aby se produkt navázal ke kationtovému iontoměniči, jako je například SP-Sepharose nebo SP-Sephadex (Pharmacia) nebo SP-Toyopearl (Tosoh Korporace). Po eluci je znovu provedena změna pufru pomocí ultrafiltrace a navázání k aniontovému iontoměniči, jako je například DEAESepharose nebo Q-Sepharose (Pharmacia) nebo DEAE-Fraktogel (Merck). Po další eluci je čistá proteáza přenesena pomocí ultrafiltrace do stabilního systému pufrů (Protein Purification, Principles and Practice, Robert K. Scopes, Springer Verlag, 1982). Nicméně odborník může použít další metody purifikace, které jsou součástí stavu techniky.

Způsob podle vynálezu překvapivě umožňuje přípravu rekombinantní proteinázy K, kdy je enzym tvořen heterologní hostitelskou buňkou v rozpustné a aktivní formě. Exprese proteinázy K s následnou sekrecí enzymu do kultivačního média je obzvláště výhodná, protože zabrání tomu, aby proteináza K vyvíjela silně toxický účinek v cytosolu hostitelské buňky. Kromě toho to zajistí správnou formaci dvou disulfidových ·· ···· ·· ···· můstků, která nemůže nastat snadno v redukčním prostředí cytosolu. Proto důležitou výhodou způsobu podle vynálezu je to, že poskytuje přístup pro rozpustnou a aktivní produkcu rekombinantní proteinázy K. Je velmi překvapivé a nevysvětlitelné, že povrchové proteiny hostitelských buněk podle vynálezu nejsou hydrolyzovány sekretovanou proteinázou K. Takováto očekávaná hydrolýza povrchových proteinů proteinázou K by interferovala s životním cyklem hostitelské buňky.

Proteináza K je získávána způsobem podle vynálezu, je homogenní a z tohoto důvodu obzvláště vhodná pro analytické a diagnostické použití. Zymogenní prekurzor proteinázy K podle vynálezu může volitelně obsahovat další N-koncové modifikace a obzvláště sekvence, které usnadní purifikaci cílového proteinu (afinitní značky). Kromě toho zymogenní prekurzor může obsahovat sekvence, které zvýší účinnost translace, které zvýší účinnost svinutí a/nebo také sekvence, které mají za následek sekreci cílového proteinu do kultivačního média (přirozené presekvence a další signální peptidy).

Proteináza K podle vynálezu označuje zejména sekvenci podle autorů Gassen et al., 1989, uvedenou v sekv. id. č. 1, a také další varianty proteinázy K z Tritirachium album Limber, jako je například aminokyselinová sekvence popsaná autory Ch. Betzel et al. (Biochemistry 40, 2001, 3080-3088) a obzvláště proteináza T (Samal, B.B. et al., 1989, Gene, sv. 85(2), 329-333, Samal, B.B. et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., sv. 379, 95-104) a proteináza R (Samal, B.B. et al., Microbiol., sv. 4(10), 1789-1792, patent Spojených

278 062) a další varianty produkované rekombinantními prostředky (jak bylo popsáno například ve WO 96/28 556). sekv. id. č. 1 obsahuje prosekvenci (1 až 90, 90 aminokyselin) a sekvenci zralé proteinázy K (91 až 368, 279

1990, Mol Států č ·· ··*· ·· ···· • · · ·<

aminokyselin) . Aminokyselinová sekvence proteinázy K popsaná autory Betzel et al. (Biochemistry 40, 2001, 3080-3088) má konkrétně aspartát místo serinového zbytku v poloze 207 aktivní proteázy.

Pro-proteináza K podle vynálezu znamená obzvláště proteinázu K, jejíž N-konec je připojen k její prosekvenci podle sekv. id. č. 1. V případě subtilisinu E, který je blízce příbuzný proteináze K a jejím variantám, má prosekvence důležitý vliv na svinutí a tvorbu aktivní proteázy (Ikemura,

H. et al., 1987, Biol. Chem., Konkrétně je předpokládáno, že sv. 262(16), 7859-7864).

prosekvence působí jako intramolekulární chaperon (Inouye, M., 1991, Enzyme, sv. 45,

314-321). Po svinutí je zpracována za vzniku zralé subtilisinové proteázy autokatalytickým štěpením propeptidu (Ikemura, H. a Inouye, M., 1988, J. Biol. Chem., sv. 263(26), 12959-12963). Tento postup se vyskytuje v případě subtilisinu E (Samal, B.B. et al., 1989, Gene, sv. 85(2), 329-333, Volkov, A. a Jordán, F., 1996, J Mol. Biol., sv. 262, 595-599), subtilisinu BPN' (Eder, J. et al., 1993, Biochemistry, sv. 32, 18-26), papainu (Vernet, T. et al., 1991, J. Biol. Chem., sv. 266(32), 21451-21457) a thermolysinu (Marie-Claire, C., 1998,

J. Biol. Chem., sv. 273(10), 5697-5701).

Zdá se, že pro funkci chaperonu jsou nutné pouze určité jádrové úseky prosekvence, které jsou obvykle hydrofobní, protože mutace rozsáhlých oblastí nemají žádný vliv na aktivitu (Kobayashi, T. a Inouye.M., 1992, J. Mol. Biol., sv. 226, 931-933) . Kromě toho je známo, že mezi různými subtilisinovými variantami mohou být vyměňovány propeptidy. Tak například subtilisin BPN' také rozpoznává prosekvenci subtilisinu E (Hu, Z. et al., 1996, J. Biol. Chem., sv.

271(7), 3375-3384).

·· ····

Proto se předkládaný vynález týká prosekvence podle sekv.

id. č. 1 dlouhé 90 aminokyselin, a také dalších variant, které usnadňují svinutí. To se také týká propeptidu, který je přidáván exogenně pro svinutí zralé proteinázy K a má funkce popsané výše.

Proto je důležitou výhodou způsobu podle vynálezu, že rekombinantní proteináza K je sekretována expresním hostitelem do kultivačního média v rozpustné a aktivní formě. Navíc expresní hostitel použitý ve způsobu podle vynálezu není postižen nebo jinak poškozen velmi aktivní a nespecifickou proteázou, tj. konkrétně pokračuje růst bez problémů a není pozorována zvýšená buněčná lýza. Kromě toho je snadnější manipulace s expresním hostitelem podle vynálezu ve srovnání s Tritirachium album a je charakterizován vyšším tempem růstu.

Popis obrázků

Obrázek 1

Expresní plazmid pPICPK-1. Sekvence kódující zymogenní proformu proteinázy K klonovaná do výchozího vektoru pPICZaA (Invitrogen).

Obrázek 2

Expresní plazmid pPICPK-2. Sekvence kódující zymogenní proformu proteinázy K klonovaná do výchozího vektoru pPIC9K (Invitrogen).

φφ φφφφ ·· ···· φ φ · · · · φφ φ φ · φ φ φφφ φ φφφφφ φ · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza genu

Gen pro zralou proteinázu K z Tritirachium album Limber bez signální sekvence a bez intronu byl vytvořen pomocí genové syntézy. Sekvence (bez nativního signálního peptidů) autorů Gunkel a Gassen, 1989, dlouhá 368 aminokyselin, byla použita jako templát. Sekvence nukleové kyseliny s optimalizovanými kodony pro expresi v E. coli, a také ve kvasinkách, byla získána retranslací aminokyselinové sekvence. Aminokyselinová sekvence je uvedena v sekv. id. č. 1 a nukleotidová sekvence je uvedena v sekv. id. č. 2.

Pro účely genové syntézy byl gen rozdělen na 18 fragmentů sense (přímých) a reverzních, komplementárních protilehlých oligonukleotidů, ve střídavé sekvenci (sekv. id. č. 3 až 20) . Úsek o velikosti alespoň 15 bp byl připojen k 5' konci a ke 3' konci, které pokaždé přečnívaly sousedící oligonukleotidy. Místa rozpoznávání pro restrikční endonukleázy byla připojena k 5' a 3' koncům syntetického genu vně kódujícího úseku pro následné klonování do expresních vektorů. Oligonukleotid uvedený v sekv. id. č. 3, který obsahuje místo štěpení EcoRI, byl použit jako 5' primer pro klonování genu pro-proteinázy K. sekv. id. č. 20 ukazuje 3' primer obsahující místo štěpení HindlII. 3' primer obsahuje další stop kodon po přirozeném stop kodonu pro zajištění terminace translace.

Oligonukleotidy byly spojeny pomocí PCR reakce a výsledný gen byl amplifikován. Za tímto účelem byl gen nejdříve ·» ··♦ · ·· ··· · rozdělen do tří fragmentů, každý po 6 oligonukleotidech, a tyto tři fragmenty byly spojeny dohromady v druhém cyklu PCR.

Fragment 1 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 3 až 8, fragment 2 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 9 až 14 a fragment 3 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 16 až 20.

Byly použity následující PCR parametry:

PCR reakce 1 (vytvoření tří fragmentů)

5 minut	95	°C	hot start	(začátek s vysokou
			teplotou)
2 minuty	95	°C Ί
2 minuty	42	°C t	30 cyklů
1,5 minuty	72	°C _!
7 minut	72	°C	závěrečné	prodlužování
PCR reakce 2	(vazba fragmentů	za vzniku	celkového genu)
5 minut	95	°C	hot start
1,5 minuty	95	°c Ί
2 minuty	48	°c t	6 cyklů (bez koncových primerů)
2 minuty	72	°c J

Přidání koncových primerů

1,5 minuty 1,5 minuty 2 minuty 7 minut °C 60 °C 72 °C 72 °C cyklů (s koncovými primery) závěrečné prodlužování ·· ···* *· «···

Příklad 2

Klonování syntetického fragmentu proteinázy K z genové syntézy

PCR směs byla aplikována na agarózový gel a PCR fragment přibližně o velikosti 1130 bp byl izolován z agarózového gelu (Geneclean II Kit od firmy Bio 101, lne., CA USA). Fragment byl štěpen po dobu 1 hodiny ve 37 °C s EcoRI a HindlII restrikčními endonukleázami (Roche Diagnostics GmbH, Německo). Současně byl štěpen plazmid pUC18 (Roche Diagnostics GmbH, Německo) po dobu 1 hodiny ve 37 °C s EcoRI a HindlII restrikčními endonukleázami, směs byla oddělena elektroforézou v agarózovém gelu a byl izolován vektorový fragment o velikosti 2635 bp. Následně byly PCR fragment a vektorový fragment spolu ligovány s použitím T4 DNA ligázy. Za tímto účelem bylo napipetováno 1 μΐ (20 ng) vektorového fragmentu a 3 μΐ (100 ng) PCR fragmentu, 1 μΐ 10 x pufru pro ligázu (Maniatis et al., 1989, B.27), 1 μΐ T4 DNA ligázy, 4 μΐ sterilní redestilované H₂O, opatrně smíchány a inkubovány přes noc v 16 °C.

Klonovaný gen byl vyšetřen restrikční analýzou a několikanásobným sekvencováním obou vláken.

Příklad 3

Konstrukce vektoru

Syntetický gen musel být nejdříve znovu izolován z piazmidu pUC. Za tímto čelem byl nejdříve inkubován 1 μρ ···· • · plazmidové DNA s restrikční endonukleázou HindlII (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce a pak byla restrikční endonukleáza inaktivována zahříváním na 65 °C po dobu 20 minut. Poté byly výsledné DNA přesahy vyplněny s polymerázou (Klenow) podle instrukcí výrobce (Roche Diagnostics GmbH) a Klenowova polymeráza pak byla inaktivována inkubací v 75 °C po dobu 10 minut. Konečně byl vektorový fragment, který byl nyní linearizován z výše uvedeného pUC plazmidu, štěpen restrikční endonukleázou EcoRI (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce, reakční směs byla nanesena na 1% agarózový gel a fragmenty byly odděleny podle velikosti aplikací proudu (100 V/150 mA). Fragment o velikosti přibližně 1120 bp obsahující gen pro-proteinázy K (ppk gen) byl izolován z agarózového gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).

Vektor pPICZaA (Invitrogen) byl štěpen restrikční endonukleázou Asp7181 (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce a restrikční endonukleáza byla inaktivována zahříváním inkubační směsi na 65 °C po dobu 20 minut. Poté byly výsledné DNA přesahy vyplněny Klenowovou polymerázou podle instrukcí výrobce (Roche Diagnostics GmbH) a Klenowova polymeráza pak byla inaktivována inkubací v 75 °C po dobu 10 minut. Konečně byl vektorový fragment, který byl nyní linearizován z pPICZaA, štěpen restrikční endonukleázou EcoRI (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce, reakční směs byla nanesena na 1% agarózový gel a fragmenty byly odděleny podle velikosti aplikací proudu (100 V/150 mA). Vektorový fragment o velikosti přibližně 3550 bp byl izolován z agarózového gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).

Fragmenty získané tímto způsobem byly ligovány dohromady standardními metodami (Sambrook et al. 1989). V tomto vektoru je ppk gen pod kontrolou AOX-1 promotoru (promotor pro • · alkoholoxidázu 1 z Pichia pastoris, indukovatelný methanolem) a je klonován s použitím této klonovací strategii do správného čtecího rámce za signální peptid α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. Genový fragment vložený tímto způsobem pak byl zkontrolován na bezchybnou sekvenci pomocí restrikční analýzy a sekvencováním. Výsledný expresní vektor, který obsahuje ppk gen, který kóduje pro-proteinázu K byl nazván pPICPK-1 (viz obr. 1).

Následně byl ppk gen také klonován do pPIC9K (Invitrogen). Za tímto účelem byl vektor pPICPK-1 štěpen podle instrukcí výrobce restrikčními endonukleázami Pmel a Notl (Roche Diagnostics GmbH), fragmenty z restrikční směsi byly odděleny podle velikosti v 1% agarózovém gelu a fragment o velikosti přibližně 1960 bp obsahující 3' část úseku AOX1 promotoru, sekvenci pro signální peptid z oc-faktoru a ppk gen byl izolován z gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen). Současně vektor pPIC9K byl štěpen restrikčními endonukleázami Pmel a Notl (Roche Diagnostics GmbH) podle instrukcí výrobce, fragmenty z restrikční směsi byly odděleny podle velikosti v 1% agarózovém gelu a vektorový fragment o velikosti přibližně 8450 bp byl izolován z gelu (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen).

Pak byly fragmenty získané tímto způsobem ligovány dohromady standardními metodami (Sambrook et al. 1989). V tomto vektoru je ppk gen také pod kontrolou AOXl-promotoru (promotor pro alkoholoxidázu 1 z Pichia pastoris, indukovatelný methanolem). Vektor pPIC9K se liší od vektoru pPICZaA selekčním markérem a třemi možnostmi jeho integrace do genomu Pichia odborníkovi známými v závislosti na linearizaci vektoru před transformací, zatímco integrace pPICZaA do místa AOX1 je fixní. Vložený genový fragment pak byl zkontrolován na bezchybnou sekvenci pomocí restrikční analýzy a sekvencováním.

·· ···· • · • · · • ····

Výsledný expresní vektor, který obsahuje ppk gen, který kóduje pro-proteinázu K, byl nazván pPICPK-2 (viz obr. 2).

Příklad 4

Transformace pPICPK-1 v Pichia pastoris

Aby se transformoval pPICPK-1 do Pichia pastoris X-33 s následnou integrací do genomu, byl vektor nejdříve linearizován Pmel (Roche Diagnostics GmbH). Transformace byla prováděna · elektroporací s použitím přístroje Gen Pulser II (Biorad).

Za tímto účelem bylo 5 ml média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) inokulováno kolonií kmene divokého typu Pichia pastoris a inkubováno přes noc ve 30 °C za třepání. Kultura rostoucí přes noc pak byla opět inokulována v poměru 1:2000 ve 200 ml čerstvého média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) a inkubována přes noc ve 30 °C za třepání, dokud OD₆oo nedosáhla hodnot 1,3 - 1,5. Buňky byly stočeny (1500 x g/5 minut) a pelet byl resuspendován ve 200 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C). Buňky byly znovu stočeny (1500 x g/5 minut) a resuspendovány ve 100 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C) . Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 10 ml ledově chladného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 0,5 ml ledově chladného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Buňky získané tímto způsobem byly udržovány na ledu a použity ihned pro transformaci.

Přibližně 1 pg linearizované DNA vektoru pPICPK-1 byl přidán k 80 μΐ buněk a celá směs byla přenesena do ledově chladné (0 °C) elektroporační kyvety a inkubovány dalších 5 • · · · minut na ledu. Pak byla kyveta přenesena do přístroje Gen Pulser II (Biorad) a transformace byla prováděna při 1 kV, 1 kQ a 25 gF. Po elektroporaci byl ke směsi přidán 1 ml 1 M sorbitolu (ICN) a následně 100 -150 μΐ bylo naneseno na misky s agarem YPDS (podle katalogu firmy Invitrogen) obsahujícím 100 μς/ιηΐ Zeocin® (Invitrogen) . Misky pak byly inkubovány po dobu 2-4 dnů ve 30 °C.

Destičky s mřížkou naplněné minimálním médiem s dextrózou byly inokulovány klony a klony byly analyzovány dále.

Klony, které vyrostly, byly vybrány, resuspendovány ve 20 μΐ sterilní vody a lyžovány 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) (1 hodina, 37 °C) a vyšetřeny přímo pomocí PCR na správnou integraci ppk expresní kazety.

Klony, které integrovaly kompletní expresní kazetu během transformace do genomu, pak byly použity v expresních experimentech.

Příklad 5

Transformace pPICPK-2 v Pichia pastoris

Aby se transformoval pICPK-2 do Pichia pastoris GS115 s následnou integrací do genomu, byl vektor nejdříve linearizován pro variantu I s Pmel (Roche Diagnostics GmbH), aby se integroval do místa AOX1 a linearizován se Sáli (Roche Diagnostics GmbH) pro variantu II, aby se integroval do místa His4. Transformace byla prováděna elektroporaci s použitím přístroje Gen Pulser (Biorad).

»· ··· · • · · · · ί !

• · · · .. ·· ·· ··

Pro tento účel bylo 5 ml média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) inokulováno kolonií kmene divokého typu Pichia pastoris GS115 a inkubováno přes noc ve 30 °C za třepání. Kultura rostoucí přes noc pak byla opět inokulována v poměru 1:2000 ve 200 ml čerstvého média YPD (podle katalogu firmy Invitrogen) a inkubována přes noc ve 30 °C za třepání, dokud OD₆oo nedosáhla hodnot 1,3 - 1,5. Buňky byly stočeny (1500 x g/5 minut) a pelet byl resuspendován ve 200 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C) . Buňky byly znovu stočeny (1500 x g/5 minut) a resuspendovány ve 100 ml ledově chladné sterilní vody (0 °C) . Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 10 ml ledově chladného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN) . Buňky byly znovu stočeny a resuspendovány v 0,5 ml ledově chladného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Buňky získané tímto způsobem byly udržovány na ledu a použity ihned pro transformaci.

Přibližně 1 pg linearizované DNA vektoru pPICPK-2 byl přidán k 80 μΐ buněk a celá směs byla přenesena do ledově chladné (0 °C) elektroporační kyvety a inkubovány dalších 5 minut na ledu. Pak byla kyveta přenesena do přístroje Gen Pulser II (Biorad) a transformace byla prováděna při 1 kV, 1 kQ a 25 μΡ. Po elektroporaci byl ke směsi přidán 1 ml 1 M sorbitolu (ICN) a následně 100 -150 μΐ bylo naneseno na misky s agarem MM (minimální médium podle katalogu firmy Invitrogen) bez histidinu. Misky pak byly inkubovány po dobu 2-4 dnů v 30 °C. Klony Pichia pastoris GS 115, které mají defektní H.is4 gen způsobený mutací (histidinoldehydrogenáza) mohou na těchto miskách růst pouze tehdy, když integrovaly vektor pPICPK-2, který má funkční His4 gen jako inzert a mohou tedy kompenzovat deficit v biosyntéze histidinu.

Destičky s mřížkou naplněné minimálním médiem s dextrózou byly inokulovány klony a klony byly analyzovány dále. Klony, které vyrostly, byly vybrány, resuspendovány ve 20 μΐ sterilní

♦ · * · · · • · · · · · vody a lyžovány 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) (1 hodina, 37 °C) a vyšetřeny přímo pomocí PCR na správnou integraci ppk expresní kazety.

Příklad 6

Exprese proteinázy K ml média BMGY (podle katalogu firmy Invitrogen) bylo inokulováno pozitivními klony a inkubováno přes noc ve 30 °C za třepání. Pak byla určena optická denzita v 600 nm a 10 ml BMMY média (podle katalogu firmy Invitrogen) bylo inokulováno tak, aby bylo dosaženo Οϋβοο rovnající se 1. Médium BMMY (podle katalogu firmy Invitrogen) obsahuje methanol (Mallinckrodt Baker B.Vj, který indukuje expresi proteinázy K prostřednictvím AOX1 promotoru.

Třepací baňka byla inkubována ve 30 °C za třepání, vzorky byly odebírány každých 24 hodin, byla určena OD₆₀o, test aktivity byl prováděn na expresi proteinázy K a pokaždé byl opět podáván 0,5 % methanol (Mallinckrodt Baker B.V) pro další indukci. Expresní experimenty běžely 168 hodin.

• · ···· ·· ···· • · • · ·

• · • · · · ·*

Přiklad 7

Test aktivity sekretované rekombinantní proteinázy K

Pro test aktivity rekombinantní proteinázy K je vyžadováno CaCl₂ x 2H₂O (Merck ID-No. 102382), DMSO (Merck, ID-No. 109678), substrát Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Roche Diagnostics ID-No. 0716766) a Tris báze (Roche Diagnostics ID-No. 0153265).

Složení roztoků bylo, jak následuje:

Roztok 1: 50 mmol/1 Tris-Báze, 10 mmol/1 CaCl₂, pH 8,2

Roztok 2: 125 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA rozpuštěn v 1 ml DMSO

Buňky byly stočeny (5 minut 10000 rpm stolní centrifuga Eppendorf) a supernatant byl naředěn v poměru 1:500 v roztoku

1.

ml roztoku 1 byly pipetovány do kyvety a bylo přidáno 0,02 ml roztoku 2. Oba roztoky byly smíchány a inkubovány při teplotě reakce 25 °C. Reakce byla započata přidáním 0,05 ml naředěného supernatantu, jak uvedeno výše a opět promíchána, byla měřena změna absorbance ve 405 nm a byla měřena ΔΑ/minuta v lineárním úseku. Pro výpočet pak byl použit následující vzorec:

2,07 aktivita

ΔΑ/minuta [U/ml roztoku vzorku] ε x 1 x 0,05

2,07 = objem vzorku ε₄₀5 = 10,4 [mmol'¹ x 1 x cm^-1] = optická délka kyvety 0,05 = objem přidaného vzorku • · · · «· · ·

- Ιχίζ],

Seznam sekvencí <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Tritirachium album Limber

<400> 1 Ala Pro Ala Val Glu Gin Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
1	5	¹⁰	15
Arg Gly Glu Met 20	Val	Ala Asn Lys. Tyr Ile Val Lys Phe. Lys 25 30	Glu Gly
Ser Ala Leu Ser 35	Ala	Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser 40 45	Gly Lys
Pro Asp His Val ⁵⁰ r»’.'	Tyr	Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala 55 60	Thr Leu
Asp Glu Asn Met 65'	Val	Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val 70 75	Glu Tyr 80
Ile Glu Gin Asp	Ala 85	Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gin Thr 90	Asn Ala 95
Pro Trp Gly Leu 100	Ala	Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr 105 110	Ser Thr
Tyr Tyr Tyr Asp 115	Glu	Ser Ala.Gly Gin Gly Ser Cys Val Tyr 120 125	Val Ile
Asp Thr Gly Ile 130	Glu	Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg 135 140	Ala Gin
Met Val Lys Thr 145	Tyr	Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly'Asn Gly 150 155	His Gly 160
Thr His Cys Ala	Gly 165	Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val 170	Ala Lys 175

• fcfcfc • fcfcfc

Lys Thr	Gin Leu 180	Phe	Gly Val Lys Val Leu. Asp Asp Asn Gly	Ser Gly
185	190
Gin Tyr	Ser Thr 195	Ile	Ile Ala Gly Met Asp .20.0	Phe Val Ala Ser 205	Asp Lys
Asn Asn 210	Arg Asn	Cys	Pro Lys Gly Val Val 215	Ala Ser Leu Ser 220	Leu Gly
.Gly Gly 225	Tyr Ser	Ser	Ser Val Asií Ser Ala 230	Ala Ala Arg Leu 235	Gin Ser 240
Ser Gly	Val Met	Val 245	Ala Val Ala Ala Gly 250	Asn Asn Asn Ala	Asp Ala 255
Arg Asn	Tyr Ser 260	Pro	Ala Ser Glu Pro Ser 265	Val Cys Thr Val 270	Gly Ala
Ser Asp	Arg Tyr 275	Asp	Arg Arg Ser Ser Phe • 280	Ser Asn Tyr Gly 285	Ser Val
Leu Asp 290	Ile.Phe	Gly	Pro Gly Thr Ser Ile 295	Leu Ser Thr Trp 300	Ile'Gly
Gly Ser 305	Thr Arg	Ser	Ile Ser Gly Thr Ser 310	Met Ala Thr Pro 315	His Val 320
Ala Gly	Leu Ala	Ala 325	Tyr Leu Met Thr Leu 330	Gly Lys Thr Thr	Ala Ala 335
Ser Ala	Cys Arg 340	Ty_r	Ile Ala Asp Thr Ala 345	Asn Lys Gly Asp 350	Leu Ser
Asn Ile Pro Phe Gly 355 Ala <210> 2 <211> 1124 <212> DNA <213> Tritirachium	Thr Val Asn Leu Leu 360 album Limber	Ala Tyr Asn Asn 365	Tyr Gin

<400> 2 gaattcgctc ctgccgttga gcagcgctcc gaggctgctc ctctgafccga ggcccgcggc 60 gagatggttg ccaacaagta catčgtcaag ttcaaggagg gtagcgctct ttccgctctg 120 gatgctgcca tggagaagat ctctggcaag cccgaccacg tctacaagaa cgtcttcagc 180 ggtttcgctg cgaccctgga cgagaacafcg gttcgggttc tccgcgccca ccccgatgtt 240 gagtacatcg agcaggatgc tgttgtcacc atcaacgctg cgcagaccaa cgctccctgg 300 ggcctggctc gcafcctccag caccagcccc ggtacctcfca cctactacfca tgacgaatct 360 gccggccaag gctcctgcgt ctacgtgatc gacaccggta tcgaggcatc gcaccccgag 420 ttcgagggtc gtgcccagat ggtcaagacc tactactact ccagtcgcga cggtaacggt 480 cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct acggtgtcgc caagaagacc 540 ··* * « · • « * • · · · · cágctgttcg gtgtcaaggt cctggatgac aacggcagtg gccagtactc caccatcatc 600. gccggtatgg acttcgttgc cagcgacaag aacaaocgca actgccccaa aggtgtcgtt 660 gcctccttat ccctgggcgg tggttactcc tcctcegtga acagcgccgc.tgcccgcctc.720. cagagctctg gtgtcatggt cgccgtcgct gccggtaaca acaacgctga'cgcccgcáac 780’ tactcccctg cttcfcgagcc ctcggtctgc accgtcggtg cttctgaccg ctacgaccgc 840 cgctccagct tctccaacta cggcagcgtt.ttggacatct tcggccctgg taccagcatc 900' ctctcc.acct ggatcggcgg. cagcacccgc tccatctctg gtacctccat ggctačtccc 960 cacgttgccg -gtctcgctgc ctacctcatg áctcttggaa agacfcaccgc cgccagcgct 1020 tgccgataca ttgccgacac cgccaacaag ggcgactfcaa gcaacattcc cttcggcact 1080 .gfccaacfctgc ttgcctacaa caactaccag gcttaatgaa gctt ·· 1124 <210> 3 <211> 79 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 3 cgcgaattcg ctcctgccgt tgagcagcgc tccgaggčtg ctcctctgat cgaggcccgc 60 ' ggcgagatgg ttgccaaca . - 79 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 4 atcttctcca tggcagcatc cagagcggaa agagcgctac cctccttgaa cttgacgatg 60 tacttgttgg caaccatct.c 80 <210> 5 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 5 tgccatggag aagatctctg gcaagcccga ccacgtctac aagaacgtct tcagcggttt 60 cgctgcgacc ctggacgaga 80 ·· ··♦· • 0 · <210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 6 .· tgctcgatgt actcaacatc ggggtgggcg cggagaaccc gaaccatgtt ctcgtccagg 60 gtcg .·.··.. ⁶⁴ <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 7 . , tgagtacatc gagcaggatg ctgttgtcac catcaacgct gcgcagaccg ctgcgcagác 60 caacg - . 65 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 8 agtaggtaga ggtaccgggg ctggtgctgg agatgcgagc caggccccag ggagcgttgg 60 tctgcgcagc 70 <210> 9 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 9 gtacctctac ctactactat gacgáatctg ccggccaagg ctcctgcgtc tacgtgatcg acaccggtat cgaggcatcg

9999 «· ···· <210> 10 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 10 ttaccgtcgc gactggagta gtagtaggtc ttgaccatct gggcacgacc ctcgaactcg 60 gggtgcgatg cctcgatacc g _ai <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 11 ccagtcgcga' cggtaacggt čacggcaccc acfcgcgctgg taccgttggc tcccgtacct 60 acggtgtcgc caagaaga 78 <210> 12 <211> 73 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 12 atggtggagt actggccact gccgttgtca tccaggacct tgacaccgaa cagctgggtc 60 ttcttggcga cac 73 <210> 13 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <4 00> 13 ggccagtáct ccaccatcat cgccggtatg gacttcgttg ccagcgacaa gaacaaccgc 60 aactgcccca aaggtgtcgt t .81 φ « · φφφφ φ · φ φφ ···· ·· ··♦·

Φ·Φ· <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 14 gctctggagg cgggcagcgg cgctgttcac ggaggaggag taaccaccgc ccagggataa 60 ggaggcaacg acacctttgg g . '81 <210> 15 <211> 82 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 15 gcccgcctcc agagctctgg tgtcatggtc gccgtcgctg ccggtaacaa caacgctgac 60 gcccgcaact actcccctgc tt 82 <210> 16 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 16 .

gttggagaag ctggagcggc ggtcgtagcg gtcagaagca cčgacggtgc agaccgaggg 60 ctcagaagca ggggagtagt 80 <210> 17 <211> 83 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 17 ctccagcttc tccaactacg gcagcgtttt ggacatcttc ggccctggta ccagcatcct 60 ctccacctgg atcggcggca gca 83 • 00 ··♦· • 0

0 0

000· <210> 18 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <4O0> .18 . · tcatgaggta ggcagcgaga ccggcaacgt ggggagtagc čatggaggta ccagagatgg 60 agcgggtgct gccgccgatc c -81 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 19 ctgcctacct catgacctta ggaaagacca ccgccgccag cgcttgccgt tacatcgccg 60 acaccgccaa caagggcgac t 81 <210> 20 <211> 87 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 20 - · atataagctt. ctattaagcc -tggtagttgt tgtaggctaa caggttgacg gtgccgaagg 60 gaatgttgct taagtcgcčc ťtgttgg 87 <210> 21 <211> 384 <212> PRT <213> Tritirachium album Limber

0

000«

00·· •0 ··♦·

<400> 21
Met '1	Arg Leu	Ser	Val Leu Leu Ser Leu Leu	Pro Leu Ala	Leu	Gly 15	Ala
5	10.
Pro	Ala Val	Glu 20	Gin Arg	Ser Glu Ala Ala 25	Pro Leu Ile	Glu 30	Ala	Arg
Gly	Glu Met ' 35	Val	Ala Asn	Lys Tyr Ile Val 40	Lys Phe Lys 45	Glu	Gly	Ser
Ala	Leu Ser 50	Ala	Leu Asp	Ala Ala Met Glu 55	Lys Ile Ser 60	Gly	Lys	Pro
Asp 65	His Val	Tyr	Lys Asn 70	Val Phe Ser Gly	Phe Ala Ala 75	Thr	Leu	Asp 80
Glu	Asn Met	Val	Arg Val 85	Leu Arg Ala His 90	Pro Asp Val	Glu	Tyr 95	Ile
Glu	Gin Asp	Ala 100	Val Val	Thr Ile Asn Ala 105	Ala Gin Thr	Asn 110	Ala	Pro
Trp Gly Leu 115	Ala	Arg Ile	Ser Ser Thr Ser' 120	Pro Gly Thr. 125	Ser	Thř	Tyr
Tyr	Tyr Asp 130	Glu	Ser Ala	Gly Gin Gly Ser 135	Cys Val Tyr 140	Val	Ile	Asp
Thr 145	Gly Ile	Glu	Ala Ser 150	His Pro Glu Phe	Glu Gly Arg 155	Ala	Gin	Met 160
Val	Lys Thr	_Tyr	Tyr Tyr 165	Ser Ser Arg Asp 170	Gly Asn Gly	His	Gly 175	Thr
His	Cys Ala	Gly 180	Thr Val	Gly Ser Arg Thr 185	Tyr Gly Val	Ala 190	Lys	Lys
Thr	Gin Leu 195	Phe	Gly Val	Lys Val Leu Asp 200	Asp Asn Gly ' 205	Ser	Gly	Gin
Tyr	Ser Thr 210	Ile	Ile Ala	Gly Met Asp Phe 215	Val Ala Ser • 220	Asp	Lys.	Asn

·· ·♦·· • · · • ···· ···» ·<

Asn 225	Arg Asn	Cys Pro Lys 230	Gly	Val	Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly
235	240
Gly Tyr Ser	Ser Ser Val 245	Asn	Ser	Ala Ala Ala Arg Leu Gin 250	Ser Ser 255
Gly	Val Mět	Val Ala Val 260	Ala	Ala	Gly Asn Asn Asn Ala Asp 265 270	Ala Arg
Asn	Tyr Ser 275	Pro Ala Ser	Glu	pro 280	Ser val Cys Thr Val Gly 285	Ala Ser
Asp	Arg Tyr 290	Asp Arg Arg	Ser 295	Ser	Phe Ser Asn Tyr Gly Ser 300	Val Leu
Asp 305	Ile Phe	Gly Pro Gly 310	Thr	Ser	Ile Leu Ser Thr Trp Ile 315 -	Gly Gly 320
Ser	Thr Arg	Ser Ile Ser 325	Gly	Thr	Ser Met Ala Thr Pro His 330	Val Ala 335
Gly	Leu Ala	Ala Tyr Leu 340	Met	Thr	Leu Gly Lys Thr Thr Ala 345 . 350	Ala Ser
Ala	Cys Arg Tyr Ile Ala 355	Asp	Thr 360	Ala Asn Lys Gly Asp Leu 365 .	Ser Asn
Ile	Pro Phě Gly Thr Val 370	Asn 375	Leu	Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr .380	Gin Ala

♦ ♦ · • ·

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY ·· ·

-Ί/( (>j

1. Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

a) transformace hostitelské buňky vektorem obsahujícím DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, který je fúzován v protisměru od kódující sekvence se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje signální peptid a je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku,

b) exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K

c) sekrece a autokatalytická aktivace proteinázy K přičemž hostitelská buňka je kvasinková buňka a protein je sekretován v rozpustné formě tímto expresním hostitelem.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je vybraná z následující skupiny: Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp. , Yarrowia sp. , Kluyveromyces sp. A Aspergillus sp.

3. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je Pichia pastoris.

4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že gen, který kóduje zymogenní prekurzor proteinázy K, je klonován do jednoho z následujících vektorů pPICZ, pPICZa, pGAPZ, pGAPZa, pPICZaA a pPIC9K.

• · · • · · · • · ···· • · ·

5. Způsob podle nároku 3 nebo 4 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je transformovaná jedním z následujících vektorů: pPICPK-1 a pPICPK-2.

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že exprese zymogenního prekurzoru proteinázy K je indukována methanolem.

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že sekrece proteinu je iniciována N-koncovou fúzí signálního peptidu.

8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že sekrece proteinu je iniciována N-koncovou fúzí signálního peptidu z α-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že hostitelská buňka Pichia pastoris je transformovaná expresním vektorem pPICZaA, který obsahuje DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K a gen je pod kontrolou A0X1 promotoru.

10. Vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K, přičemž tato DNA je fúzována v protisměru od kódující sekvence se sekvencí ve čtecím rámci, která kóduje vhodný signální peptid a kódující gen je pod kontrolou promotoru vhodného pro hostitelskou buňku a tento vektor je vhodný pro transformaci kvasinky.

• φφφ* φ φ

11. Vektor podle nároku 10, který je vhodný pro transformaci

Pichia pastoris.

12. Vektor obsahující DNA podle nároku 10 nebo 11 kódující zymogenní prekurzor proteinázy K vybraný z následující skupiny: pPICZ, pPICZa, pGAPZ, pGAPZa, pPICZaA a pPIC9K.

13. Vektor podle vektor je pPICZaA. kteréhokoliv z nároků 10 až 12, přičemž 14. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, přičemž vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K je pPICPK-1 nebo pPICPK-2.

15. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle kteréhokoliv z nároků 10 až 14, přičemž hostitelská buňka je kvasinka.

16. Hostitelská buňka podle nároku 15, přičemž hostitelská buňka je vybraná z následující skupiny: Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. , Schizosaccharomyces sp. , Yarrowia sp., Kluyveromyces sp. A Aspergillus sp.

17. Hostitelská buňka podle nároku 15 nebo 16, kde hostitelská buňka je Pichia pastoris.

ΙΜ» θ' ·