CZ20032165A3 - Rekombinantní proteináza K - Google Patents
Rekombinantní proteináza K Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032165A3 CZ20032165A3 CZ20032165A CZ20032165A CZ20032165A3 CZ 20032165 A3 CZ20032165 A3 CZ 20032165A3 CZ 20032165 A CZ20032165 A CZ 20032165A CZ 20032165 A CZ20032165 A CZ 20032165A CZ 20032165 A3 CZ20032165 A3 CZ 20032165A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- proteinase
- zymogenic
- přítomnost
- recombinant
- buffer
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims description 17
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 title claims description 8
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims abstract description 148
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 36
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 31
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 5
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 4
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 4
- GWIKYPMLNBTJHR-UHFFFAOYSA-M thiosulfonate group Chemical group S(=S)(=O)[O-] GWIKYPMLNBTJHR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 claims description 2
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 11
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Natural products OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- NRTLIYOWLVMQBO-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-1,3-dimethyl-N-(1,1,3-trimethyl-1,3-dihydro-2-benzofuran-4-yl)pyrazole-4-carboxamide Chemical compound C=12C(C)OC(C)(C)C2=CC=CC=1NC(=O)C=1C(C)=NN(C)C=1Cl NRTLIYOWLVMQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241001523956 Parengyodontium album Species 0.000 description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 8
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 6
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 6
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 6
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 101100409044 Chlorobaculum tepidum (strain ATCC 49652 / DSM 12025 / NBRC 103806 / TLS) ppk1 gene Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XQGIRPGAVLFKBJ-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Lys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O XQGIRPGAVLFKBJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidaz Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 2,2'-dithiodiethanol Chemical compound OCCSSCCO KYNFOMQIXZUKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CWEAKSWWKHGTRJ-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CWEAKSWWKHGTRJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N Ala-Met-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RMAWDDRDTRSZIR-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RMAWDDRDTRSZIR-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- RWWPBOUMKFBHAL-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Cys Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RWWPBOUMKFBHAL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OTUQSEPIIVBYEM-IHRRRGAJSA-N Arg-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OTUQSEPIIVBYEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N Arg-Thr-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- AOJYORNRFWWEIV-IHRRRGAJSA-N Arg-Tyr-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AOJYORNRFWWEIV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ACRYGQFHAQHDSF-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ACRYGQFHAQHDSF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LTZIRYMWOJHRCH-GUDRVLHUSA-N Asn-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LTZIRYMWOJHRCH-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 1
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 108700036009 EC 3.4.21.64 Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N Glu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N Gly-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNILDNVBIARMRK-XVYDVKMFSA-N His-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N QNILDNVBIARMRK-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VSZALHITQINTGC-GHCJXIJMSA-N Ile-Ala-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N VSZALHITQINTGC-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N Ile-Asp-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 1
- JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KTFHTMHHKXUYPW-ZPFDUUQYSA-N Leu-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KTFHTMHHKXUYPW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- HAUUXTXKJNVIFY-ONGXEEELSA-N Lys-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAUUXTXKJNVIFY-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- AZOFEHCPMBRNFD-BZSNNMDCSA-N Lys-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 AZOFEHCPMBRNFD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N Lys-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N Lys-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N Phe-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BKOKTRCZXRIQPX-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BKOKTRCZXRIQPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BYIROAKULFFTEK-CIUDSAMLSA-N Ser-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BYIROAKULFFTEK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N Ser-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- PAXANSWUSVPFNK-IUKAMOBKSA-N Thr-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N PAXANSWUSVPFNK-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- GMXIJHCBTZDAPD-QPHKQPEJSA-N Thr-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GMXIJHCBTZDAPD-QPHKQPEJSA-N 0.000 description 1
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N Thr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- RPVDDQYNBOVWLR-HOCLYGCPSA-N Trp-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPVDDQYNBOVWLR-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DAOREBHZAKCOEN-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O DAOREBHZAKCOEN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 101150003160 X gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010084758 arginyl-tyrosyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- -1 lac Chemical compound 0.000 description 1
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010057952 lysyl-phenylalanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010056508 proteinase R Proteins 0.000 description 1
- 108010056534 proteinase T Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000012905 visible particle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21064—Peptidase K (3.4.21.64)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Rekombinantní proteináza Κ
| Oblast techniky | |||
| Předkládaný | vynález se týká | přípravy | rekombinantní |
| proteinázy K z | Tritirachium album | Limber a | odpovídáj ících |
| způsobů exprese, | in vitro renaturace | a aktivace | rekombinantní |
proteinázy Κ.
Dosavadní stav techniky
Proteináza K (E.C. 3.4.21.64, také známá jako endopeptidáza K) je extracelulární endopeptidáza, která je syntetizována vláknitou houbou Tritirachium album Limber. Je členem skupiny serinových proteáz s typickou katalytickou triádou Asp39-His69-Ser224 (Jany, K.D. et al., 1986, FEBS Letters, sv. 199(2),139-144). Protože sekvence polypeptidového řetězce dlouhá 279 aminokyselin (Gunkel, F.A. a Gassen, H.G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1), 185-194) a trojrozměrná struktura (Betzel, C. et al., 1988, Eur. J. Biochem., sv. 178(1), 155-71) má vysoký stupeň homologie s bakteriálními subtilisiny, proteináza K je zařazena jako člen subtilisinové rodiny (Pahler, A. et al., 1984, EMBO J., sv. 3(6),1311-1314, Jany, K.D. a Mayer, B., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv.
366(5), 485-492). Proteináza K byla pojmenována na základě své schopnosti hydrolyzovat nativní keratin, a tak umožnit růst vláknitým houbám na keratinu jako jediném zdroji uhlíku a dusíku (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J. Biochem., sv.
47(1), 91-97, Roelcke a Uhlenbruch, 1069, Z.Med. Mikrobiol.
Immunol., sv. 155(2), 156-170). Proteináza K má specifickou aktivitu vyšší než 30 U/mg a je tak jedna z nejúčinněj ších známých endopeptidáz (Betzel, C. et al., 1986, FEBS Lett., sv.
hydrolyzuje nativní a Femfert, U, 1976, Hoppe
197(1-2), 105-110) a nespecificky denaturované proteiny (Kraus, E. a Seylers Z. Physiol. Chem., sv. 357(7):937-947).
Proteináza K z Tritirachium album Limber je translatována ve svém přirozeném hostiteli jako preproprotein. Sekvence cDNA genu, který kóduje proteinázu K, byla dekódována v roce 1989 autory Gunkel, F.A. A Gassen, H.G., 1989, Eur. J. Biochem., sv. 179(1), 185-194. Podle toho je gen pro prepro-proteinázu
K složen ze dvou exonů a kóduje signální sekvenci dlouhou 15 aminokyselin, prosekvenci dlouhou 90 aminokyselin a zralou proteinázu K dlouhou 279 aminokyselin. Intron o velikosti 63 bp je lokalizován v úseku prosekvence. Prepeptid je odštěpen (ER) během translokace do endoplazmatického retikula současnosti je známo velmi málo o dalším zpracování tak, aby vznikla zralá proteináza K štěpením propeptidu.
Proto se tedy aminokyselin. Stabilní zralá proteináza K skládá z 279 struktura je stabilizována dvěma disulfidovými můstky a dvěma navázanými ionty vápníku. To vysvětluje, proč má proteináza K ve srovnání s dalšími subtilisiny mnohem vyšší stabilitu vůči extrémním hodnotám pH, vysokým teplotám, chaotropním látkám a detergentům (Dolashka, P. et al., 1992, Int. J Pept. Protein. Res., sv. 40(5), 465471). Proteináza K je charakterizována vysokou termostabilitou (až do 65 °C, Bajorath et al., 1988, Eur. J. Biochem., sv.
176, 441-447) a širokým rozsahem pH (pH 7,5-12,0, Ebeling, W.
et al., 1974. Eur. J Biochem.
47(1), 91-97). Její aktivita je zvýšena v přítomnosti denaturačních látek, jako je například urea nebo SDS (Hilz, H. et al., 1975, J. Biochem., sv. 56(1), 103-108, Jany, K.D a Mayer, B., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv. 366(5), 485-492).
• · · · • · ··· ···· ··· · · · · · · · · «····· · · ·· ·· ·
Výše uvedené vlastnosti činí proteinázu K obzvláště vhodnou pro biotechnologické aplikace, ve kterých je požadována nespecifická degradace proteinu. Speciálními příklady je izolace nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) ze surových extraktů a příprava vzorku pro analýzu DNA (Goldenberger, D. et al., 1995, PCR Methods Appl. , sv. 4(6), 368-370, patent Spojených Států č. 5 187 083, patent Spojených Států č. 5 346 999). Další aplikace jsou v oboru analýzy proteinů, jako například objasňování struktury.
Proteináza K je získávána komerčně ve velkém množství fermentaci vláknité houby Tritirachium album Limber (např. CBS 348.55, Merck, kmen č. 2429 nebo kmen ATCC 22563). Produkce glukózou nebo volnými obsahující protein také proteinázy K aminokyselinami.
je potlačena Protože média indukují expresi proteáz, je nutné použít proteiny, jako je například BSA, sušené mléko nebo sojová mouka jako jediný zdroj dusíku. Sekrece proteázy začne, jakmile je dosaženo stacionární růstové fáze (Ebeling, W. et al., 1974, Eur. J Biochem., sv. 47(1), 91-97).
Protože Tritirachium album Limber je následkem toho nevhodná pro fermentaci ve velkém měřítku a navíc je obtížné ji geneticky manipulovat, byly prováděny různé pokusy, jak dosáhnout nadměrné exprese rekombinantní proteinázy K v dalších hostitelských buňkách. Nicméně v těchto experimentech nebyla zaznamenána žádná významná aktivita kvůli nedostatku exprese, tvorbě inaktivních inkluzních tělísek nebo problémům s renaturací (Gunkel, F.A. a Gasseri, H.G., 1989,
Eur. J. Biochem., sv. 179(1),185-194, Samal, B.B. et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., sv. 379, 95-104).
Navíc Tritirachium album Limber je pomalu rostoucí vláknitá houba, která sekretuje do média pouze malá množství proteáz. Dlouhé fermentační období jeden až dva týdny je • · · · nevýhodné. Kromě toho je známo, že T. Album také vytváří jiné proteázy kromě proteinázy K, které mohou kontaminovat preparát (Samal, B.B. et al., 1991, Enzyme Microb. Technol., sv. 13,
66-70) .
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob ekonomické produkce rekombinantní proteinázy K a inaktivních zymogenních prekurzorů proteinázy K, které mohou být aktivované autokatalyticky.
Cíle bylo dosaženo poskytnutím způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K, ve kterém je inaktivní zymogenní proforma proteinázy K vytvářena v nerozpustné formě v inkluzních tělískách a zymogenní proforma proteinázy K je naturována a zymogenní proforma zpracována, tj. aktivována v následných krocích. Způsoby naturace a aktivace proteinázy K jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K charakterizovanému tím, že zymogenní proforma je svinuta in vitro naturací a je konvertována autokatalytickým štěpením do aktivní formy. Předkládaný vynález se konkrétně týká způsobu přípravy rekombinantní proteinázy K, ve kterém zymogenní prekurzor proteinázy K je konvertován oxidačním svinutím z izolovaných a solubilizovaných inkluzních tělísek do nativní struktury, tj . je naturován, a následně je získána aktivní proteináza K z nativně svinutého zymogenu autokatalytickým štěpením přidáním detergentů.
Proto se předkládaný vynález týká způsobu získání rekombinantní proteinázy K transformací hostitelské buňky DNA kódující zymogenní proformu proteinázy K, charakterizovaného kroky následujícího postupu:
a) Kultivace hostitelské buňky v podmínkách, které mají za následek expresi DNA kódující zymogenní proformu proteinázy K tak, že zymogenní prekurzor proteinázy K je vytvářen v hostitelské buňce ve formě nerozpustných inkluzních tělísek.
b) Izolace inkluzních tělísek, solubilizace enzymu a naturace zymogenního prekurzoru proteinázy K v podmínkách, ve kterých je vytvářena proteázová část zymogenního prekurzoru proteinázy K.
c) Aktivace proteinázy K odstraněním propeptidu a další purifikace.
DNA kódující zymogenní proformu proteinázy K odpovídá DNA uvedené v sekv. id. č. 2 nebo DNA, která jí odpovídá v rozsahu degenerace genetického kódu. sekv. id. č. 2 zahrnuje DNA sekvenci, která kóduje proteinázu K a propeptid. Kromě toho DNA může mít optimalizované kodony pro expresi v konkrétním hostiteli. Způsoby optimalizace kodonů jsou odborníkům známy a jsou popsány v příkladu 1. Předkládaný vynález se tedy týká způsobů, ve kterých je hostitelská buňka transformována DNA, která je vybrána z výše uvedené skupiny.
Proteináza K je získávána způsobem podle vynálezu, je homogenní a z tohoto důvodu obzvláště vhodná pro analytické a diagnostické použití. Zymogenní proforma proteinázy K podle vynálezu může volitelně obsahovat další N-koncové modifikace a obzvláště sekvence, které usnadní purifikaci cílového proteinu (afinitní značky), sekvence, které zvýší účinnost translace, sekvence, které zvýší účinnost svinutí nebo sekvence, které mají za následek sekreci cílového proteinu do kultivačního média (přirozené presekvence a další signální peptidy).
• · ·· · ···· • ·«· · ··· ····· »····· «· ·· ·· ·
Proteináza K podle vynálezu znamená sekvenci podle autorů Gassen et al. , 1989, uvedenou v sekv. id. č. 1, a také další varianty proteinázy K z Tritírachíum album Limber, jako je například aminokyselinová sekvence popsaná autory Ch. Betzel et al. (Biochemistry 40, 2001, 3080-3088) a obzvláště proteináza T (Samal, B.B. et al., 1989, Gene, sv. 85(2), 329333, Samal, B.B. et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., sv proteináza R (Samal, B.B.
et al., 1990,
379, Mol.
Států
4(10), 1789-1792, patent Spojených obsahuje signální sekvenci prosekvenci (16 až 105, 90
95-104) a Microbiol., sv. č. 5 278 062) a další varianty produkované rekombinantními prostředky (jak bylo popsáno například ve WO 96/28 556). Sekvence uvedená v sekv. id. č.
(1 až 15, 15 aminokyselin), aminokyselin) a sekvenci zralé proteinázy K (106 až 384, 279 aminokyselin). Aminokyselinová sekvence popsaná autory Betzel et al. (Biochemistry 40, 2001, 3080-3088) aspartát místo serinového zbytku v poloze proteázy.
Pro-proteináza K podle vynálezu znamená obzvláště proteinázu K, jejíž N-konec je připojen k její prosekvenci. V případě blízce příbuzného subtilisinu E a dalších variant je známo, že prosekvence má důležitý vliv na svinutí a tvorbu aktivní proteázy (Ikemura, H. et al., 1987, Biol. Chem., sv. 262(16), 7859-7864). Konkrétně je předpokládáno, že prosekvence působí jako intramolekulární chaperon (Inouye, M., 1991, Enzyme, sv. 45, 314-321) . Po svinutí je zpracována za vzniku zralé subtilisinové proteázy autokatalytickým štěpením propeptidu (Ikemura, H. a Inouye, M., 1988, J. Biol. Chem., sv. 263(26), 12959-12963). Tento postup se vyskytuje v případě subtilisinu E (Samal, B.B. et al., 1989, Gene, sv. 85(2), 3291996, J Mol. Biol., sv. 262, (Eder,
333, Volkov, A. a Jordán, F.
595-599) subtilisinu
BPN'
J.
et má konkrétně
207 aktivní
1993, • ·
Biochemistry, sv. 32, 18-26), papainu (Vernet, T. et al.,
1991, J. Biol. Chem., sv. 266(32), 21451-21457) a thermolysinu (Marie-Claire, C., 1998, J. Biol. Chem., sv. 273(10), 56975701).
Jestliže je přidán exogenně, propeptid může také působit intermolekulárně v poloze trans jako chaperon na svinutí denaturované zralé subtilisinové proteázy (Ohta, Y. et al. , 1991, Mol. Microbiol., sv. 5(6), 1507-1510, Hu, Z. et al.,
1996, J. Biol. Chem., sv. 271(7), 3375-3384). Propeptid se váže k aktivnímu centru subtilisinu (Jain, S.C. et al., 1998, J Mol, Biol., sv. 284, 137-144) a působí jako specifický inhibitor (Kojima, S. et al. , 1998, J Mol. Biol., sv. 277, 1007-1013, Li, Y. et al·., 1995, J Biol. Chem., sv. 270, 2512725132, Ohta, Y., 1991, Mol. Microbiol., sv. 5(6), 1507-1510). Tento účinek je použit podle vynálezu, aby se během naturace zabránilo autoproteolýze svinujících se meziproduktů citlivých k proteolýze již svinutou aktivní proteinázou K.
Zdá se, že pro funkci chaperonu jsou nutné pouze určité obvykle hydrofobní jádrové úseky prosekvence, protože mutace rozsáhlých oblastí nemají žádný vliv na aktivitu (Kobayashi, T. a Inouye.M., 1992, J. Mol. Biol., sv. 226, 931-933) . Kromě toho je známo, že mezi různými subtilisinovými variantami mohou být vyměňovány propeptidy. Tak například subtilisin BPN' také rozpoznává prosekvenci subtilisinu E (Hu, Z. et al., 1996, J. Biol. Chem., sv. 271(7), 3375-3384).
Inkluzní tělíska jsou mikroskopicky viditelné částice, které tvoří nerozpustné a inaktivní proteinové agregáty, které jsou často vytvářeny v cytoplasmě hostitelské buňky, když jsou nadměrně exprimovány heterologní proteiny, a obsahují velmi čistý cílový protein. Způsoby výroby a purifikace takových inkluzních tělísek jsou popsány například v práci autorů Creighton, T.E., 1978, Prog. Biophys. Mol. Biol., sv. 33(3), • · · · • ·
231-297, Marston, F.A., 1986, Biochem. J. , sv. 240(1), 1-12,
Rudolph, R. , 1997. Folding proteins v: Creighton, T.E. (ed.)
Protein Function: A practical approach. Oxford. University Press, 57-99, Fink, A.L., 1998, Fold. Des., sv. 3(1), R9-23, a EP 0 114 506.
Pro izolaci inkluzních tělísek jsou hostitelské buňky po fermentaci lyžovány obvyklými metodami, např. ultrazvukem, vysokotlakou disperzí nebo pomocí lysozymů. Lýza se výhodně provádí ve
Nerozpustná purifikována až mírně kyselém pufru. mohou být separována a výhodně centrifugací nebo vodném neutrálním inkluzní tělíska různými metodami, filtrací s několika kroky promývání (Rudolph, R. , 1997.
Folding Proteins v: Creighton, T.E: (ed.) Protein Function: A practical Approach. Oxford University Press, 57-99).
Inkluzní tělíska získaná tímto způsobem jsou pak známým způsobem solubilizována. Za tímto účelem jsou výhodně použita denaturační činidla v koncentraci, která je vhodná inkluzních tělísek, obzvláště hydrochlorid další guanidiniové soli a/nebo urea. Aby se k rozpuštění guanidina a kompletně monomerizovaly proteiny inkluzních tělísek, je také výhodné přidat redukční činidla, jako je například dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE) nebo 2merkaptoethanol během solubilizace, aby se rozrušily možné disulfidové můstky redukcí. Vynález se také týká proteinázy K, ve které cysteiny nejsou redukovány, ale jsou derivatizovány, obzvláště s GSSG, za vzniku smíšených disulfidů nebo thiokyanátů (EP 0 393 725).
Proto podle vynálezu jsou inkluzní tělíska solubilizována denaturačními činidly a redukčními činidly. Jako denaturační činidlo je výhodný 6 až 8M guanidiniumhydrochlorid nebo 8 až 10M urea a jako redukční činidlo je výhodný 50 až 200mM DTT (dithiothreitol) nebo DTE (dithioerythritol).
• · 4
Proto se předkládaný vynález týká prosekvence podle sekv.
id. č. 1 dlouhé 90 aminokyselin (aminokyseliny 16 až 105), a také dalších variant, které usnadňují svinutí. To se také týká propeptidu, který je přidáván exogenně pro svinutí zralé proteinázy K a má funkce popsané výše.
Dalším předmětem vynálezu je rekombinantní vektor, který obsahuje jednu nebo více kopií rekombinantní DNA definované výše. Základní vektor je výhodné plazmid výhodně obsahující více kopií počátku replikace, ale je také možné použít virové vektory. Výběr expresního vektoru závisí na vybrané hostitelské buňce. Pro konstrukci expresního vektoru a pro transformaci hostitelské buňky tímto vektorem jsou použity metody, které jsou odborníkům známy a jsou popsány například v práci Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning (viz níže). Vhodným vektorem pro expresi v E. coli je například expresní vektor pKKT5 nebo pKK177, pKK223, pUC, pET vektory (Novagen), a také pQE vektory (Qiagen). Expresní plazmid pKKT5 je vytvořen z pKK177-3 (Kopetzki et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 216:149155) výměnou tac promotoru za T5 promotor z pDS (Bujard et al. , 1987, Methods Enzymol. 155:416-433). Místo štěpení restrikční endonukleázou EcoRI v sekvenci T5 promotoru bylo odstraněno dvěma bodovými mutacemi.
Kromě toho je kódující DNA ve vektoru podle vynálezu pod kontrolou výhodně silného regulovatelného promotoru. Je výhodný promotor, který může být indukován IPTG, jako je například lac, iacUV5, tac nebo T5 promotor. T5 promotor je obzvláště výhodný.
Hostitelská buňka podle vynálezu znamená kteroukoliv hostitelskou buňku, ve které se mohou proteiny tvořit jako inkluzní tělíska. To je obvykle mikroorganismus, např. prokaryota. Jsou výhodné prokaryotické buňky a obzvláště Escherichia coli. Obzvláště jsou upřednostňovány následující kmeny: E. coli K12 kmeny JM83, JM105, UT5600, RRiA15, DH5a,
C600, TG1, NM522, M15 nebo E. coli B deriváty BL21, HB101, obzvláště výhodný je E. coli M15.
Odpovídající hostitelské buňky jsou podle vynálezu transformovány rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje rekombinantní zymogenní proteinázu K podle sekv. id. č. 2 nebo nukleovou kyselinou, která je derivována z DNA optimalizací kodonů nebo DNA, která je derivována z DNA v rozsahu degenerace genetického kódu. Hostitelské buňky E.
výhodně transformovány rekombinantní nukleovou s optimalizovanými kodony kódující rekombinantní proteinázu K, která byla optimalizována pro v Escherichia coli. Proto se předkládaný vynález také týká vhodného vektoru, který je například vybraný z výše uvedených vektorů a obsahuje rekombinantní nukleovou kyselinu, která má optimalizované kodony pro E. coli a kóduje rekombinantní proteinázu K nebo rekombinantní zymogenní proteinázu K. Dalším předmětem vynálezu je hostitelská buňka, která je například vybraná z výše uvedených hostitelských buněk, které byly transformovány výše uvedeným vektorem.
coli jsou kyselinou zymogenní expresi
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob naturace denaturované zymogenní proteinázy K, ve kterém je denaturovaná zymogenní proteináza K přenesena do pufru, který podporuje svinutí, kterýžto svinovací pufr je charakterizován následujícími vlastnostmi:
• A) pH hodnota pufru je v rozsahu 7,5 až 10,5 • B) přítomnost látek s nízkou molekulovou hmotností, které napomáhají svinutí • C) přítomnost oxidačně redukčního „shuffle („přeskupovacího) systému • · ·· · · · · · • · · · · ·«· ·»·· * 9 · 9 9 9 9 · · · • ar··· « · · 9 9 9 · • D) přítomnost komplexačního činidla v substechiometrické koncentraci relativně k iontům Ca2+, a kde způsob je prováděn při teplotě mezi 0 °C a 37 °C.
Výhodně je během naturace přítomna nízká koncentrace denaturačního činidla. Denaturační činidla mohou být například přítomna, protože jsou ještě v reakčním roztoku díky předchozí solubilizaci inkluzních tělísek. Koncentrace denaturačních činidel, jako je například guanidiniumhydrochlorid, by měla být nižší než 50 mM.
Naturací se podle vynálezu rozumí způsob, ve kterém je denaturovaný, v podstatě inaktivní protein konvertován do konformace, ve které má protein požadovanou aktivitu po autokatalytickém štěpení a aktivaci. To je dosaženo přenesením solubilizovaných inkluzních tělísek do svinovacího pufru při snižování koncentrace denaturačního činidla. Podmínky musí být vybrány tak, aby při tomto postupu protein zůstal v roztoku. To může být výhodně prováděno rychlým ředěním nebo dialýzou proti svinovacímu pufru.
Je výhodné, když má svinovací pufr pH 8 až 9. Obzvláště výhodné pufrovací látky jsou pufr Tris/HCl a bicinový pufr.
Způsob naturace podle vynálezu je výhodně prováděn při teplotě mezi 0 °C a 25 °C.
Svinovací činidla s nízkou molekulovou hmotností ve svinovacím pufru jsou výhodně vybrána z následující skupiny sloučenin s nízkou molekulovou hmotností. Mohou být přidána samotná, a také ve směsi, a mohou být přítomny další látky, které napomáhají svinutí:
- L-arginin v koncentraci 0,5 až 2,0 M
- Tris v koncentraci 0,5 M až 2,0 M
- triethanolamin v koncentraci 0,5 M až 2,0 M • ·
- cc-cyklodextrin v koncentraci 60 mM až 120 mM
Látky s nízkou molekulovou hmotností, které napomáhají svinutí, jsou popsány například v patentu Spojených Států č. 5 593 865, Rudolph, R. , 1997, Folding Proteins. v: Creighton, T.E. (ed.) Protein Function: A practical Approach. Oxford University Press, 57-99 nebo De Bernardez Clark, E. et al., 1999, Methods. Enzymol., sv. 309, 217-236.
Výše uvedený oxidačně redukční „shuffle systém je výhodně smíšený disulfid nebo thiosulfonát.
Systémy jsou například vhodné jako oxidačně redukční „shuffle systémy, které se skládají z thiolové složky v oxidované a redukované formě. To umožňuje tvorbu disulfidových můstků ve svinovaném polypeptidovém řetězci během naturace řízením redukčního potenciálu a na druhé straně umožňuje „reshuffling („přeskupení) chybných disulfidových můstků ve svinovaném polypeptidovém řetězci nebo mezi svinovanými polypeptidovými řetězci (Rudolph, R. , 1997, viz výše). Výhodné thiolové složky jsou například:
- glutathion v redukované (GSH) a oxidované formě (GSSH)
- cystein a cystin
- cysteamin a cystamin
- 2-merkaptoethanol a 2-hydroxyethyldisulfid
Ve způsobu naturace podle vynálezu jsou Ca2+ ionty výhodně přítomny v koncentraci 1 až 20 mM. Například CaCl2 může být přidán v množství 1 až 20 mM. Ca2+ ionty se mohou vázat k vazebným místům pro vápník svinované proteinázy K.
Přítomnost komplexačního činidla, výhodně EDTA, ve substechiometrické koncentraci relativně k Ca2+, zabrání oxidaci redukčního činidla atmosférickým kyslíkem a chrání volné SH skupiny.
* · ·
Naturace je výhodně prováděna v nízké teplotě, tj. pod 20 °C, výhodně 10 °C až 20 °C. Ve způsobu podle vynálezu je naturace obvykle ukončena po době přibližně 24 hodin až 48 hodin.
Předkládaný vynález se také týká svinovacího pufru, který je charakterizován následujícími vlastnostmi:
• A) pH hodnota pufru je v rozsahu 7,5 až 10,5 • B) přítomnost látek s nízkou molekulovou hmotností, které napomáhají svinutí » C) přítomnost oxidačně redukčního „shuffle (přeskupovacího) systému • D) přítomnost komplexačního činidla v substechiometrické koncentraci relativně k Ca2+ iontům.
Je obzvláště výhodné, když má svinovací pufr pH 8 až 9, a/nebo když oxidačně redukční shuffle systém je smíšený disulfid nebo thiosulfonát.
Dalším předmětem vynálezu je způsob aktivace naturovaného zymogenního prekurzor proteinázy K. Po svinovacím postupu podle vynálezu je vytvořen inaktivní komplex z nativní proteinázy K a inhibičního propeptidu. Z tohoto komplexu může být uvolňována aktivní proteináza K. Je výhodné přidání detergentů, obzvláště výhodný je SDS v koncentraci 0,1 až 2 % (hmotnost/objem).
Výhody způsobu popsaného v tomto textu pro výrobu rekombinantní proteinázy K jsou:
1. Schopnost využít potenciálu vysoké exprese a rychlou a jednoduchou kultivaci Escherichia coli nebo jiných vhodných mikroorganismů.
2. Možnost geneticky manipulovat rekombinantní DNA.
3. Nekomplikovaná purifikace po naturaci.
• · • Λ · · · · · · · • ««· · · · · ···· • · · ···· ·· · ·····» · · ♦ · · * *
4. Nepřítomnost eukaryotických nečistot, když jsou jako hostitelská buňka vybrána prokaryota.
Byl by také představitelný způsob, ve kterém nukleové kyseliny, které kódují zralou proteinázu K a nukleové kyseliny, které kódují propeptid nebo proproteinázu K jsou exprimovány odděleně v hostitelských buňkách a jsou pak normálně přeneseny do svinovacího pufru pro naturaci zralé proteinázy K.
Popis obrázků
Obrázek 1:
Schématické znázornění PCR reakce pro produkci fragmentů proteinázy K, které mají N-koncové BamHI místo štěpení a alternativní místo štěpení enterokinázou pro fúzi s N-koncovou afinitní značkou.
Obrázek 2:
Závislost výtěžku naturace na teplotě.
Obrázek 3:
Závislost výtěžku naturace na pH.
Obrázek 4:
Závislost výtěžku naturace na oxidačně redukčním potenciálu.
• · · · · » « · · ·
Obrázek 5:
| Závislost | výtěžku | naturace | na | koncentraci | argininu. |
| Obrázek 6: Závislost | výtěžku | naturace | na | koncentraci | Tris. |
| Obrázek 7: Závislost | výtěžku | naturace | na | koncentraci | cc-cyklodextrinu. |
| Obrázek 8: Závislost | výtěžku | naturace | na | koncentraci | triethanolaminu. |
| Obrázek 9: Závislost | výtěžku | naturace | na | koncentraci | urey. |
Obrázek 10:
SDS polyakrylamidový gel naturace pro-proteinázy K.
Obrázek 11:
Chromatografie s převráceným poměrem fází naturované proteinázy K.
Obrázek 12:
Renaturovaná a opracovaná proteináza K byla analyzována analytickou ultracentrifugací. Centrifugace byla prováděna ve 12 000 rpm, 20 °C po dobu 63 hodin. Data (o) mohla být • · • « ·· · · · · · » «* · · ♦ · · · · · · · «····· · · · · ·· * přizpůsobena homogennímu druhu majícímu zjevnou molekulovou hmotnost 29 až 490 Da. Nebyla pozorována žádná systematická odchylka mezi přizpůsobenými a změřenými daty (spodní graf).
Obrázek 13:
Stanovení hodnoty Km naturované proteinázy K.
Obrázek 14:
Charakter degradace proteinů krevního séra naturovanou proteinázou K.
Obrázek 15:
Purifikace naturované proteinázy K gelovou filtrací.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza genu, který kóduje zralou formu proteinázy K.
Gen pro zralou proteinázu K z Tritirachium album Limber bez signální sekvence a bez intronu byl vytvořen pomocí genové syntézy. Sekvence autorů Gunkel, F.A. a Gassen, H.G., 1989,
Eur. J. Biochem., sv. 179 (1), 185-194, dlouhá 837 bp (aminokyseliny 106 až 384 podle SwissProt P06873) byla použita jako templát. Vužití kodonů optimalizovaného pro Escherichia coli bylo použito jako základ pro retranslaci aminokyselinové sekvence, aby byo dosaženo optimální exprese (Andersson,
S.G.E. a Kurland, C.G., 1990, Microbiol. Rev., sv. 54(2),198210, Kane, J.F. Curr. Opin. Biotechnol., sv. 6, ss. 494-500). Aminokyselinová sekvence je uvedena v sekv. id. č. 1 a nukleotidová sekvence je uvedena v sekv. id. č. 2.
Pro účely genové syntézy byl gen rozdělen na 18 fragmentů sense a reverzních, komplementárních portilehlých oligonukleotidů ve střídavé sekvenci (sekv. id. č. 3 až 20) . Úsek o velikosti alespoň 15 bp byl připojen k 5' konci a ke 3' konci, které pokaždé přečnívaly sousedící oligonukleotidy. Místa rozpoznávání pro restrikční endonukleázy byla připojena k 5' a 3' koncům syntetického genu vně kódujícího úseku pro následné klonování do expresních vektorů. Oligonukleotid uvedený v sekv. id. č. 3, který obsahuje místo štěpení EcoRI, byl použit jako 5' primer pro klonování pro-proteinu X genu bez N-koncové afinitní značky, sekv. id. č. 20 ukazuje 3' primer obsahující místo štěpení HindlII. 3' primer obsahuje další stop kodon po přirozeném stop kodonu pro zajištění terminace translace. Oligonukleotid s místem štěpení BamHI uvedený v sekv. id. č. 23 nebo oligonukleotid s místem štěpení BamHI a místem štěpení enterokinázou uvedený v sekv. id. č. 24 byl použit jak 5' primer ke klonování proproteinu X genu s Nkoncovými afinitními značkami a alternativním místem štěpení enterokinázou, jak bylo popsáno v příkladu 3.
Oligonukleotidy byly spojeny pomocí PCR reakce a výsledný gen byl amplifikován. Za tímto účelem byl gen nejdříve rozdělen do tří fragmentů, každý po 6 oligonukleotidech, a tyto tři fragmenty byly spojeny dohromady v druhém cyklu PCR. Fragment 1 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 3 až 8, fragment 2 je složen z oligonukleotidů ukázaných • · · · • · · v sekv. id. č. 9 až 14 a fragment 3 je složen z oligonukleotidů ukázaných v sekv. id. č. 16 až 20.
Byly použity následující PCR parametry:
PCR reakce 1 (vytvoření tří fragmentů)
| 5 minut | 95 | °C | hot start |
| 2 minuty | 95 | °c 3 | |
| 2 minuty | 42 | °c y | 30 cyklů |
| 1,5 minuty | 72 | °c J | |
| 7 minut | 72 | °c | závěrečné prodlužování |
| PCR reakce 2 | (vazba fragmentů | za vzniku celkového genu) |
| 5 minut | 95 °C | hot start |
| 1,5 minuty | 95 °C Ί | |
| 2 minuty | 48 °c r | 6 cyklů (bez koncových primerů |
| 2 minuty | 72 °C J |
| Přidání koncových | primerů | ||
| 1,5 minuty | 95 | °C 1 | |
| 1,5 minuty | 60 | °C 7 | 25 cyklů (s koncovými primery) |
| 2 minuty | 72 | °c j | |
| 7 minut | 72 | °c | závěrečné prodlužování |
• · • ·
Příklad 2
Klonování syntetického fragmentu proteinázy K z genové syntézy
PCR směs byla aplikována na agarózový gel a PCR fragment přibližně o velikosti 1130 bp byl izolován z agarózového gelu (Geneclean II Kit od firmy Bio 101, lne., CA USA). Fragment byl štěpen po dobu 1 hodiny ve 37 °C s EcoRI a HindlII restrikčními endonukleázami (Roche Diagnostics GmbH, Německo) . Současně byl štěpen plazmid pUC18 (Roche Diagnostics GmbH, Německo) po dobu 1 hodiny ve 37 °C s EcoRI a HindlII restrikčními endonukleázami, směs byla oddělena elektroforézou v agarózovém gelu a byl izolován vektorový fragment o velikosti 2635 bp. Následně byly PCR fragment a vektorový fragment spolu ligovány s použitím T4 DNA ligázy. Za tímto účelem bylo napipetováno 1 μΐ (20 ng) vektorového fragmentu a 3 μΐ (1 00 ng) PCR fragmentu, 1 μΐ 10 x pufru pro ligázu (Maniatis, T., Fritsch, E.F: a Sambrook, T., 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual. 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), 1 μΐ T4 DNA ligázy, 4 μΐ sterilní redestilované H2O, opatrně smíchány a inkubovány přes noc v 16 °C.
Klonovaný gen byl vyšetřen restrikční analýzou a několikanásobným sekvencováním obou vláken. Sekvence je uvedena v sekv. id. č. 2.
a) Konstrukce pPK-1 expresního plazmidu
Aby se exprimovala proteináza K, byl strukturální gen klonován do pKKT5 expresního vektoru takovým způsobem, aby byl strukturální gen vložen do správné orientace pod kontrolou « · · · • » vhodného promotoru, výhodně promotoru, který může být indukován IPTG, jako je například lac, lacUV5, tac nebo T5 promotor, obzvláště výhodně T5 promotor. Za tímto účelem byl strukturální gen pro proteinázu K štěpen z plazmidu pUC18 pomocí EcoRI elektroforézou a HindlII, restrikční směs byla oddělena v agarózovém gelu a fragment o velikosti přibližně 1130 bp byl izolován z agarózového gelu. Současně byl expresní plazmid pKKT5 štěpen EcoRI a HindlII, restrikční směs byla oddělena elektroforézou v agarózovém gelu a vektorový fragment o velikosti přibližně 2,5 kb byl izolován z agarózového gelu. Fragmenty získané tímto způsobem byly ligovány dohromady, jak bylo popsáno výše. Správná inzerce genu byla zkontrolována sekvencováním.
b) Transformace expresního plazmidu pPK-1 do různých expresních kmenů E. coli
Expresní vektor byl transformován do různých expresních kmenů, které byly dříve transformovány plazmidem pREP4 a/nebo pUBS520. Plazmid pREP4 obsahuje gen pro represor láci, který by měl zajistit kompletní supresi exprese před indukcí. Plazmid pUBS520 (Brinkmann, U. et al., 1989, Gene, sv. 85(1), 109-114) také obsahuje láci represor a navíc gen dnaY, který kóduje tRNA, která je nutná pro translaci unikátních argininových kodonů AGA a AGG v E. coli. Kompetentní buňky z různých kmenů E. coli byly připraveny podle způsobu autorů Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol., sv. 166, 557-580. 100 μΐ buněk připravených tímto způsobem bylo smícháno s 20 ng izolované DNA z plazmidu pPK-1. Po 30 minutách inkubace na ledu byly zahřátý tepelným šokem (90 sekund ve 42 °C) , a pak inkubovány po dobu 2 minut na ledu. Následně byly buňky přeneseny do 1 ml média SOC a inkubovány po dobu 1 hodiny ve 37 °C za třepání kvůli expresi fenotypu. Alikvoty této • · ·· ttt· ···· · · · · ·· transformační směsi byly naneseny na LB misky obsahující ampicilin jako selekční markér a inkubovány po dobu 15 hodin ve 37 °C. Výhodné kmeny jsou E. coli K12 kmeny JM83, JM105,
UT5600, RR1Á15, DH5a, C600, TG1, NM522, M15 nebo E. coli deriváty BL21, HB101, obzvláště je výhodný E. coli M15.
Příklad 3
Klonování N-koncové afinitní značky
Aby se vložena N-koncová afinitní značka, bylo místo štěpení BamHI vloženo před 5' koncem genu pro pro-proteinázu K. To bylo dosaženo pomocí PCR s použitím produktu získaného v příkladu 1 jako templátu a oligonukleotidů popsaných v sekv. id. č. 20, 23 a 24 jako primerů. Primer popsaný v sekv. id. č. 23 obsahuje místo štěpení BamHI v protisměru od 5' úseku proproteinázy K, primer popsaný v sekv. id. č. 24 dodatečně obsahuje místo štěpení enterokinázou přímo před prvním kodonem prosekvence. sekv. id. č. 20 ukazuje 3' primer, který byl také použit v příkladu 1 s místem štěpení HindlII. Výsledné PCR produkty byly izolovány jak bylo popsáno výše, štěpeny s BamHI a HindlII a purifikovány elektroforézou v agarózovém gelu.
sekvenci uvedenou v sekv. id sekvenci uvedenou v sekv.
Afinitní značka byla vložena pomocí syntetické spojovací sekvence složené ze dvou komplementárních oligonukleotidů takovým způsobem, že místo štěpení EcoRI bylo vytvořeno na 5' konci a místo štěpení BamHI bylo vytvořeno na 3' konci bez dalšího restrikčního štěpení. Pro His značku mělo sense vlákno . č. 21 a antisense vlákno mělo id. č.
kódovala hexa-His značku s N-koncovým motivem RGS. Místo štěpení BamHI mezi spojovací sekvencí a pro-proteinázou K je
22. Spojovací sekvence • * translatováno do spojovací sekvence Gly-Ser. Aby spojovací sekvence nasedla, byly dva oligonukleotidy (sekv. id. č. 21 a 22) zahřívány po dobu 5 minut na 95 °C v ekvimolárním množství (každý 50 pmol/μΐ) a pak ochlazeny rychlostí 2 °C za minutu na teplotu místnosti. V důsledku toho by nasednutí komplementárních oligonukleotidů mělo být co nejúplnější.
Spojovací sekvence byla ligována s PCR produktem štěpeným BamHI/HindlII (Rapid Ligation Kit from Roche Diagnostics GmbH, Německo) a purifikována elektroforézou v agarózovém gelu (QIAquick gel extraction Kit od firmy Qiagen, Německo). Výsledný ligační produkt byl ligován do expresního vektoru analogicky k příkladu 2b prostřednictvím EcoRI a HindlII přečnívajících konců a transformován odpovídajícím způsobem do expresních kmenů.
Tento modulový systém umožňuje to, že různé afinitní značky, které jsou kódovány syntetickou spojovací sekvencí, jsou fúzovány ke strukturálnímu genu pro-proteinázy K. Místo štěpení enterokinázou může být alternativně vloženo mezi značku a propeptid vhodnou selekcí odpovídajícího 5' primeru, jestliže je žádoucí následné odstranění značky.
Kromě toho určitý úsek genu proteinázy K, jako je například zralá proteináza K nebo propeptid, mohou být amplifikovány vhodnou selekcí překrývajících se primerů (obr. 1).
úseků PCR ♦ * » · • · ·« ·* • » · · » · · * · ·· ··· · · # · • · · · · «·« « » · ·
Přiklad 4
Exprese proteinázy K v Escherichia colí
Protože proteináza K je velmi aktivní nespecifická proteáza, je výhodné ji exprimovat v inaktivní formě, výhodně jako inkluzní tělíska.
Aby se exprimoval gen, který kóduje proteinázu K, byly 3 ml LBamp média inokulovány klony obsahujícími plazmid a inkubovány ve 37 °C v třepačce.
LB médium: 10 g tryptonu g kvasinkového extraktu g NaCl doplnit do konečného objemu 1 1 destilovanou
H2O, upravit na pH 7,0 s NaOH přidat antibiotika (100 gg/ml ampicilin) přímo před inokulací
Buňky byly indukovány 1 mM IPTG v optické denzitš 0,5 v 550 nm a inkubovány po dobu 4 hodin ve 37 °C v třepačce. Pak byla určena optická denzita individuálních expresních klonů, 3/ml alikvot odpovídající OD550 byl odstraněn a buňky byly stočeny (10 minut 6000 rpm, 4 °C) . Buňky byly resuspendovány ve 400 μΐ TE pufru, lyžovány ultrazvukem a frakce rozpustného proteinu byla oddělena od frakce nerozpustného proteinu centrifugací (10 minut, 14 000 rpm, 4 °C).
TE pufr: 50 mM Tris/HCl mM EDTA pH 8,0 (při teplotě místnosti) ·
*444 ···«
4 4 4 4 4 ·
444 4 » · »44 « 444 ««· • »4 »44« 44 •444 44 ·4 44 44
Aplikační pufr obsahující SDS a β-merkaptoethanol byl přidán ke všem frakcím a proteiny byly denaturovány zahříváním (5 minut 95 °C). Pak byly analyzovány alikvoty po 10 μΐ pomocí
12,5% analytického SDS gelu (Laemmli, U.K., 1970, Nátuře, sv.
227 (259), 680-685) . Velmi silná exprese ve formě nerozpustných proteinových agregátů (inkluzní tělíska) byla pozorována pro klony zralé proteinázy K, a také pro klony pro-proteinázy Κ. V souladu s tím nebyla měřena žádná aktivita proteinázy K.
Příklad 5
Izolace inkluzních tělísek
Inkluzní tělíska byla připravena známými metodami (Rudolph, R. , 1997, viz výše).
Co se týče buněčné lýzy, 10 g vlhké biomasy bylo pokaždé resuspendováno v 50 ml 100 mM Tris/HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA.
Poté bylo přidáno 15 mg lysozymu, inkubováno po dobu 60 minut ve 4 °C a buňky byly následně lyžovány vysokým tlakem (Gaulinův přístroj pro buněčnou lýzu). DNA byla štěpena po dobu 30 minut při teplotě místnosti přidáním 3 mM MgCl2 a 10 μg/ml Dnase k surovému extraktu. Nerozpustné buněčné složky, které obsahují inkluzní tělíska, byly odděleny centrifugaci (30 minut, 20 000 g) a promyty jednou promývacím pufrem 1 a třikrát promývacím pufrem 2.
Promývací pufr 1: 100 mM Tris/HCl mM EDTA % (objem/objem) Triton X-100 *··· ·· *··· · ··· · · * · • · · · · 9 * * · • · · · · · · · * » · · • · · ··»· ·· · ···« ·» ·· ·· ·· ·
O,5 M NaCl pH 7,0 (teplota místnosti)
Promývací pufr 2: 100 mM Tris/HCl mM EDTA pH 7,0 (teplota místnosti)
Pelet z posledního kroku promytí představuje surová inkluzní tělíska, která již obsahují vysoce čistý cílový protein.
Přiklad 6
Solubilizace inkluzních tělísek
a) Solubilizace při redukci cysteiny g surových inkluzních tělísek byl suspendován v 10 ml solubilizačního pufru a inkubován po dobu 2 hodin při teplotě místnosti za jemného míchání.
Solubilizační pufr: 100 mM Tris/HCl
6,0 M guanidiniumhydrochlorid
100 mM DTT pH 8,0 (teplota místnosti)
Solubilizát byl titrován na pH 3 s 25 % HCI a dvakrát dialyzován po dobu 4 hodin při teplotě místnosti proti 500 ml 6 M guanidiniumhydrochloridu, pH 3, a pak přes noc ve 4 °C proti 1000 ml guanidiniumhydrochloridu, pH 7. Koncentrace proteinu byla určena Bradfordovou metodou (Bradford, 1976) • · · • Φ ···· φφ • Φ·· · · ·« ·· φφφφ
·· s použitím vypočteného extinkčního koeficientu ve 280 nm a byla mezi 10 a 20 mg/ml. Počet volných cysteinů byl určen podle Ellmanovy metody. V souladu se sekvencí bylo zjištěno 5 mol volných cysteinů na jeden mol proteinázy K. Čistota solubilizovaných inkluzních tělísek byla určena 12,5 % SDS
PAGE a kvantifikace pásů po barvení modří Coomassie.
b) Solubilizace s derivatizací cysteinů za vzniku smíšených disulfidů s použitím glutathionu.
g surových inkluzních tělísek byl suspendován v 10 ml solubilizačního pufru.
Solubilizační pufr: 100 mM Tris/HCl
6,0 M guanidiniumhydrochlorid mM DTT pH 8,0 (teplota místnosti)
Po 15 minutách inkubace při teplotě místnosti za jemného míchání, během kterého bylo vytvořeno katalytické množství redukovaných cysteinů způsobené malým množstvím DTT, bylo přidáno 100 mM GSSG, pH bylo upraveno na 8,0 a směs byla inkubována další 2 hodiny při teplotě místnosti za jemného míchání.
Další ošetření bylo stejné, jak bylo popsáno v bodě a).
• · ··· · · · • ··· · · · · · · <
• ·· ···· ·· ···· ·· · · · · · ·
Příklad 7
Optimalizace naturace pro-proteinázy K
Různé parametry byly měněny, aby se optimalizoval výtěžek svinování a zpracování pro-proteinázy K ze solubilizátů připravených v příkladu 6a). Pro všechny preparáty byl uvedený svinovací pufr filtrován, odplyněn, naplněn N2 a inkubován v požadované teplotě. Oxidačně redukční shuffle systém nebyl přidán až krátce před začátkem svinovací reakce a pH bylo znovu upraveno. Svinutí bylo iniciováno přidáním solubilizovaných inkluzních tělísek za rychlého míchání. Objem svinovacích směsí byl 1,8 ml ve 2 ml skleněných zkumavkách se šroubovacím uzávěrem. Výtěžek byl analyzován testem aktivity s použitím chromogenního substrátu Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA od firmy Bachem Company (Heidelberg). 100 mM Tris/HCl, 5 mM CaCl2, pH 8,5, ve 25 °C, byl použit jako testovací pufr. Koncentrace peptidu v testu byla 2 mM z 200 mM zásobního roztoku v DMSO. Aby se aktivoval renaturát, bylo ke vzorku přidáno 0,1% SDS (viz příklad 8) . Absorbance ve 410 nm byla měřena po dobu 20 minut a aktivita byla vypočtena ze sklonu této křivky.
Následující parametry byly měněny:
a) Teplota a čas
Svinovací pufr obsahující 100 mM Tris, 1,0 mM L-arginin, 10 mM CaCl2 byl ekvilibrován při různých teplotách. Po přidání 3 mM GSH a 1 mM GSSG bylo pH znovu upraveno při odpovídající teplotě. Reakce byla započata přidáním 50 μg/ml pro-proteinázy K. Po 12 hodinách, 36 hodinách a 60 hodinách byly alikvoty odstraněny a testovány na aktivitu. Výsledky jsou ukázány na obrázku 2.
b) pH hodnota
Univerzální pufr obsahující 50 mM citrát, 50 mM MES, SO mM bicin, 500 mM arginin, 2 mM CaCl2 a 1 mM EDTA byl inkubován v 15 °C a bylo přidáno 3 mM GSH a 1 mM GSSG. PH bylo znovu upraveno v rozsahu mezi pH 4,0 a pH 12,0 a svinovací reakce byla započata přidáním 50 μg/ml pro-proteinázy K inkluzních tělísek. Aktivita měřená po 18 hodinách, 3 dnech a 5 dnech je ukázána na obrázku 3.
c) Oxidačně redukční potenciál
Různé oxidačně redukční potenciály byly nastaveny v renaturačním pufru obsahujícím 1,0 M L-arginin, 100 mM bicin, 2 mM CaCl2 a 10 mM CaCl2 mícháním různých poměrů oxidovaného a redukovaného glutathionu. Koncentrace proteinu ve svinovací směsi byla 50 μg/ml. Svinutí bylo prováděno v 15 °C. Koncentrace GSH a GSSG jsou ukázány v tabulce 1, měření jsou ukázána na obrázku 4.
d) Aditivní rozpouštědla, která podporují svinutí
Různé látky byly zkoumány na svou schopnost zvýšit výtěžek svinutí proteinázy K. Za tímto účelem byly připraveny roztoky obsahující látky v různých koncentracích a smíchány s 2 mM CaCl2, 1 mM EDTA a 100 mM bicinem. PH bylo upraveno na pH 8,75 při teplotě svinutí 15 °C.
Koncentrace proteinu byla 50 pg/ml. Obrázek 5 ukazuje relativní výtěžky aktivní proteinázy K ve vztahu ke koncentraci vybraného aditivního pufru.
Tabulka 1
Koncentrace GSH a GSSG v různých oxidačně redukčních potenciálech.
• · · · • · · · • ·
| Oxidačně redukční potenciál (log(cGSH2/cGSSG) [M] | c(GSH) [mM] | c(GSSG) [mM] |
| - 00 | 0 | 2,500 |
| - 6,000 | 0,050 | 2,475 |
| - 5,500 | 0,088 | 2,456 |
| - 5,000 | 0, 156 | 2,422 |
| - 4,500 | 0,273 | 2,363 |
| - 4,000 | 0,476 | 2,262 |
| - 3,500 | 0,814 | 2,093 |
| - 3,000 | 1,351 | 1,825 |
| - 2,500 | 2,130 | 1,435 |
| - 2,000 | 3,090 | 0, 955 |
| - 1,500 | 3, 992 | 0,504 |
| - 1,000 | 4,580 | 0.210 |
| - 0,500 | 4,851 | 0,074 |
| 0,000 | 4,951 | 0,025 |
| t 0,500 | 4,984 | 7,856e-3 |
| + 1,000 | 4,995 | 2,495e-3 |
| t 00 | 5,000 | 0 |
• · ··« ···· • ··· · ··· ···· ······ ·· ·· ·· ·
Příklad 8
Aktivace naturované pro-proteinázy K
Po naturaci pro-proteinázy způsobem podle vynálezu bylo zjištěno, že nemá žádnou aktivitu nebo pouze velmi slabou aktivitu. Chromatografické metody a SDS-PAGE ukázaly, že zralá proteináza K je už přítomná, ale je stále spojena v komplexu s propeptidem. Může být oddělena způsobem, který je v tomto textu nazýván aktivací a je také předmětem vynálezu.
V tomto příkladu bylo ke svinovací směsi přidáno SDS v koncentraci 2 % (objem/objem), a pak jsou svinovací aditivum a SDS odstraněny dialýzou. Alternativně mohl také být SDS přidán po odstranění aditiva dialýzou. Ve všech případech byla detekována plná aktivita proteinázy K.
Příklad 9
Charakterizace svinutého produktu
Proteináza K naturovaná a aktivovaná způsobem podle vynálezu byla dále charakterizována různými metodami.
a) Analýza čistoty a stanovení molekulové hmotnosti elektroforézou v SDS polyakrylamidovém gelu
Alikvoty z různých kroků naturačního postupu a konečného produktu, svinuté a aktivované rekombinantní proteinázy K, byly aplikovány na 12,5 % SDS polyakrylamidový gel. Každý vzorek obsahoval 10 mM DTT nebo 1 % (obj em/obj em) 2• · merkaptoethanol. Rekombinantni proteináza K připravená způsobem podle vynálezu neobsahovala žádnou významnou kontaminaci a pohybovala se totožně s originální proteinázou
K ve shodě se zjevnou molekulovou hmotností přibližně 30 kD (viz obrázek 11).
b) Analýza čistoty s použitím RP-HPLC
Svinutá a aktivovaná proteináza K a originální proteináza K z T. Album a inkluzní tělíska s pro-proteinázou K byly analyzovány pomocí HPLC s převráceným poměrem fází. Byla použita kolona Vydac C4 mající rozměry 15 cm x průměr 4,6 cm, vzorky byly eluovány acetonitrilovým gradientem od 0 % do 80 % v 0,1 % TFA. Svinutý produkt projevuje pohyblivost, která je totožná s originální proteinázou K použitou jako standard (viz obrázek 12).
c) Analytická ultracentrifugace
Aby se analyzovalo, zda je renaturovaná a zpracovaná proteináza K přítomná v monomerní formě bez propeptidu, byl protein zkoumán analytickou ultracentrifugací. Bylo zjištěno, že molekulová hmotnost je 29 490 D a odpovídá hmotnosti monomerní zralé proteinázy K v mezích dovolené chyby tohoto způsobu (viz obrázek 13). To tudíž prokázalo, že propeptid byl kvantitativně štěpen aktivací proteinázy K.
d) N-koncová sekvenční analýza
Aby se ověřilo, zda byl propeptid štěpen ve správném místě štěpení, byla naturovaná a aktivovaná rekombinantni proteináza K podrobena sekvenační analýze. Za tímto účelem byl svinutý produkt vysolen prostřednictvím RP-HPLC, jak bylo popsáno • · · v příkladu 9b) a prvních 6 zbytků N-koncovým sekvencováním. Výsledek s originálním N-koncem zralé proteinázy K bylo zkontrolováno (AAQTNA) souhlasí
e) Aktivita a hodnota Km
Hodnota Km svinuté a aktivované proteinázy K byla srovnávána s hodnotou originální proteinázy K. Tetrapeptid Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA byl použit jako substrát. Test byl prováděn ve 2,0 ml 50 mM Tris, pH 8,5, obsahujícím 1 mM CaCl2 ve 25 °C. Hydrolýza peptidu byla monitorována spektroskopicky ve 410 nm. Byl zjištěna hodnota Km 0,16 mM pro rekombinantní proteinázu K, která odpovídala velmi dobře Km hodnotě originální proteinázy K (viz obrázek 14).
f) Typ degradace proteinů krevního séra
V dalším testu, který charakterizoval aktivitu, byl zkoumán profil štěpení proteinů krevního séra. Za tímto účelem bylo štěpeno definované množství proteinů krevního séra 1 μg rekombinantní proteinázy K nebo stejným množstvím originální proteinázy K. Profil štěpení byl analyzován pomocí RP-HPLC v podmínkách totožných s podmínkami, jak byly popsány v příkladu 9b) . Obrázek 15 ukazuje, že rekombinantní a originální proteináza K má za následek stejný typ degradace.
Příklad 10
Purifikace svinutého produktu kyselinou, promyty a obsahujícího 10 mM DTT,
Rekombinantní pro-proteináza K naturovaná způsobem podle vynálezu byla purifikována gelovou filtrací. Jak bylo popsáno v obrázku 11, koncentrovaný naturační roztok byl oddělen na Superdex 75 pg po naturaci v prvním běhu bez předchozí aktivace a v druhém běhu s předchozí aktivací s použitím 0,15 % (hmotnost/objem) SDS (30 minut, 4 °C) . Jako mobilní pufr byl použit 100 mM Tris/HCl,150 mM NaCl pH 8,75 (4 °C) . Aplikační objem byl 10 ml při objemu kolony 1200 ml a rychlostí průtoku 5 ml/minuta. Po dokončení aplikace byly sbírány frakce po 14 ml. Alikvoty frakcí byly precipitovány trichloroctovu nabrány do vzorku Laemmliho pufru Vzorky byly aplikovány na 12,5 % SDS polyakrylamidový gel, který byl po provedení obarven Coomassie modří R250.
V prvním běhu bez aktivace byla pozorována nezpracovaná rekombinantní pro-proteináza K v prvním vrcholu, který se pravděpodobně pohyboval ve formě mikroagregátů ve vyloučeném objemu. Ve druhém vrcholu byla pozorována zpracovaná rekombinantní proteináza K, která se eluovala společně s propeptidem, který byl nekovalentně vázán a působil jako inhibitor. Jako výsledek nebyla zjištěna žádná aktivita bez předchozí aktivace. Pouze po přidání SDS k frakcím projevoval druhý vrchol významnou aktivitu proteinázy K (neukázáno).
Druhý běh, ve kterém byla svinutá rekombinantní proteináza K dříve aktivována SDS, vykazoval pouze jeden vrchol, který se eluoval po stejném objemu jako proteináza K ve stejných podmínkách (neukázáno). Na SDS gelu lze vidět v tomto vrcholu • · · · • · čistou zralou rekombinantní proteinázu K bez propeptidu. Předpokládá se, že všechny nečistoty a propeptid už byly štěpeny v použité směsi aktivovanou rekombinantní proteinázou K. Jak bylo očekáváno, vrcholové frakce proteinázy K projevovaly aktivitu bez další aktivace SDS. Ukazuje se, že rekombinantní proteináza K purifikovaná tímto způsobem, je téměř 100% čistá na SDS gelu a vykazuje stejnou migraci jako originální proteináza K (obrázek 16).
I
Seznam sekvencí <210> 1 <211> 384 <212> PRT <213> Tritirachium album limber <400> 1
| Met 1 | Arg' | Leu | Ser | Val 5 | Leu | Leu | Ser | Leu | Leu 10 | Pro | Leu | Ala | Leu | Gly 15 | Ala |
| Pro | Ala | Val | Glu 20 | Gin | Arg | Ser | Glu | Ala 25 | Ala | Pro | Leu | Ile | Glu 30 | Ala | Arg |
| Gly | Glu | Met 35 | Val | Ala | Asn | Lys | Tyr 40 | Ile | Val | Lys | Phe | Lys . 45 | Glu | Gly | Ser |
| Ala | Leu 50 | Ser | Ala | Leu | Asp | Ala 55 | Ala | Met | Glu | Lys | Ile 60 | Ser | Gly | Lys | Pro |
| Asp 65 | His | Val | Tyr | Lys | Asn 70 | Val | Phe | Ser | Gly | Phe 75 | Ala. | Ala | Thr | Leu | Ásp 80 |
| Glu | Asn | Met | Val | Arg 85 | Val | Leu | Arg | Ala | His 90 | Pro | Asp | Val | Glu | Tyr 95 | Ile |
| Glu | Gin | Asp | Ala 100 | Val | Val | Thr | Ile | Asn 105 | Ala | Ala | Gin | Thr | Asn 110 | Ala | Pro |
| Trp | Gly | Leu 115 | Ala | Arg | Ile | Ser | Ser 12 0 | Thr | Ser | Pro | Gly | Thr 125 | Ser | Thr | Tyr |
| Tyr | Tyr 130 | Asp | Glu | Ser | Ala | Gly 135 | Gin | Gly | Ser | cys | Val 140 | Tyr | Val | Ile | Asp |
| Thr 145 | Gly | Ile | Glu | Ala | Ser 150 | His | Pro | Glu | Phe | Glu 155 | Gly | Arg | Ala | Gin | M.et 160 |
| Val | Lys | Thr | Tyr | Tyr 165 | Tyr | Ser | Ser | Arg | Asp 170 | Gly | Asn | Gly | His | Gly 175 | Thr |
• · · · • · · · • · · · *
| His Cys | Ala Gly 180- | Thr Val Gly Ser | Arg Thr 185 | Tyr | Gly | Val Ala Lys 190 | Lys |
| Thr Gin | Leu Phe 195 | Gly Val Lys Val '200 | Leu Asp | Asp | Asn | Gly Ser Gly •205 | Gin |
| Tyr Ser 210' | Thr Ile | Ile Ala Gly Met 215 | Asp Phe | Val | Ala 220 | Ser Asp Lys | Asn |
| Asn' Arg 225 | Asn Cys | Přo Lys Gly Val 230 | Val Ala | Ser 235 | Leu | Ser Leu Gly Gly .240 | |
| Gly Tyr- | Ser Ser | Ser Val Asn Ser 245 | Ala'Ala 250 | Ala | Arg | Leu Gin Ser 255 | Ser |
| Gly Val | Met Val 260 | Ala Val Ala Ala | Gly Asn 265 | Asn | Asn | Ala Asp Ala 270 ' | Arg |
| Asn Tyr' | Ser .Pro 275 | Ala Ser Glu Pro .280 | Ser Val | Cys | Thr | Val Gly Ala 285 | Ser |
| Asp Arg Tyr Asp 290 | Arg Arg Ser Ser 295 | Phe Ser | Asn | Tyr 300 | Gly Ser Val | Leu | |
| Asp Ile 305 | Phe Gly | Pro Gly Thr Ser 310 | Ile Leu | Ser 315 | Thr | Trp Ile Gly | Gly 320 |
| Ser Thr | Arg Ser | Ile Ser Gly Thr 325 | Ser Met 330 | Ala | Thr | Pro His Val 335 | Ala |
| Gly Leu | Ala Ala 340 | Tyr Leu Met Thr | Leu Gly 345 | Lys | Thr | Thr Ala Ala 350 | Ser |
| Ala Cys | Arg Tyr 355 | Ile Ala Asp Thr • 360 | Ala Asn | Lys | Gly Asp Leu Ser 365 | Asn | |
| Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala 370 375 <210> 2 <211> 1116 <212> DNA <213> Tritirachium album limber | Tyr | Asn 380 | Asn Tyr Gin | Ala |
<400> 2 atggctcctg ccgttgagca gcgctccgag gctgctcctc tgatcgaggc ccgcggcgag 60 atggttgcca acaagtacat cgtcaagttc aaggagggta gcgctctttc cgctctggat 120 gctgccafcgg agaagatctc tggcaagccc gaccacgtct acaagaacgt cttcagcggt 180 ttcgctgcga ccctggacga gaacatggtt cgggttctcc gcgcccaccc cgatgttgag 240 tacatcgagc. aggatgctgt tgtcaccatc aacgctgcgc agaccaacgc tccctggggc 300 ctggctcgca tctccagcac. cagccccggt acctctacct actactatga cgaatctgcc 360 ggccaaggct cctgcgtcta cgtgatcgac accggtatcg aggcatcgca ccccgagttc 420 • · gagggtcgtg ggcacccact ctgttcggtg ggtatggact tccttatccc agctctggtg tcccctgctt tccagcttct tccacctgga gttgccggtc cgatacattg aacttgcttg .cccagatggt gcgctggtac tcaaggtcct tcgttgccag tgggcggtgg tcatggtcgc cfcgagccctc ccaactacgg· tcggcggcag tcgctgccta ccgacaócgc cctacaacaa caagacctac cgttggctcc ggatgácaac cgacaagaac ttactcctcc cgtcgctgcc ggtctgcacc cagcgttttg cacccgctčc cctcatgact caacaagggc ctaccaggct tactactcca cgtac.ctacg ggcagtgg.cc aaccgcaact tccgtgaaca ggtaacaaca gtcggtgctt gacatcttcg atctctggta cttggaaaga gacttaagca taatga gfccgcgacgg gtgtcgcca.a agtactccac gčcccaaagg· gcgccgctgc acgctgacgc ctgaccgcta gccctggtác cctccatggc ctaccgccgc acattccctt.
.taacggtcac gaagacccag caťcatcgcc tgtcgttgcc ccgcctccag ccgcaactac cgaccgccgc cagcatcctc tactccccac cagcgcttgc cggcactgtc
480
540 £00
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1116 <210> 3 <211> 83 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 3 atatgaattc atggctcctg cčgttgagca gcgctccgag gctgctcctc tgatcgaggc 60 ccgcggcgag atggttgcca aca 83 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 4 atcttctcca tggcagcatc cagagcggaa agagcgctac cctccttgaa cttgacgaCg 60' tacttgttgg caaccatcfcc 80 <210> 5 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 5 tgccatggag aagatctctg gcaagcccga ccacgtctac aagaacgtct tcagcggttť 60 cgctgcgacc ctggacgaga ' 80 • · • · · · • · · ·
<210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer ;<400> 6 ' tgctcgatgt. actcaac.atč ggggťgggcg cggagaaccc gaaccatgtt ctcgtccagg 60 gtcg ' 64 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer . . . . . ! <400> 7 .
tgagtacatc gagcaggatg ctgttgtcac catcaácgct gcgcagaccg ctgcgcagac 60 caacg 65 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 8 . .
agtaggtaga ggtaccgggg ctggtgctgg. agatgcgagc caggccccag· ggagcgttgg 60 tcfcgcgcagc - 70 <210> 9 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 9 gtacctctac ctactactat gacgaatctg ccggccaagg ctcctgcgfcc tacgtgatcg 60 acaccggtat cgaggcatcg 80 • · « · ♦ • · · · · <210> 10 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 10 ttaccgtcgc gactggagta gtagtaggtc ttgaccatct gggcacgacc ctcgaactcg 60 gggtgcgatg cctcgatacc g 81 <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 11 ccagtcgcga cggtaacggt csicggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct 60 acggtgtcgc caagaaga 78 <210> 12 <211> 73 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence:primer <400> 12 · atggtggagt actggccact gccgttgtca tccaggacct tgacaccgaa.cagctgggtc 60 • ttcttggcga cac .73
| <210> | 13 |
| <271> | 81 |
| <212> | DNA |
| <213> | Syntetická sekvence |
| <220> | |
| <223> | Popis syntetické sekvence |
| <400> | 13 |
ggccagtáct ccaccatcat cgccggtatg gacttcgttg ccagcgacaa gaacaaccgc 60 aactgcccca aaggtgtcgt t 81 • · · · <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 14 gctctggagg cgggcagcgg cgctgttcac ggaggaggag taaccaccgc ccagggataa 60 SSaggcaacg acacctttgg g .81 <210> 15 <211> 82 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> is gcccgcctcc agagctctgg tgtcatggtc gccgtcgctg ccggtaacaa caacgctgac 60 gcccgcaact actcccctgc tt . 82 ..
<210> 16 <211> 80 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 16.
gttggagaag ctggagcggc ggtcgtagcg gtcagaagca ccgacggtgc agaccgaggg 60 .ctcagaagca ggggagtagt .· . 80 <210> 17 <211> 83 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 17 ctccagcttc tccaactacg gcagcgtttt ggacatcttc ggccctggta ccagcatcct 60 ctccacctgg atcggcggca gca 83 ···· · · • ♦ · · · · · • ·· · · * · · ··· · · · · ····· <210> 18 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
c223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 18 .tcatgaggta ggcagcgaga ccggcaacgt ggggagtagc čatggaggta ccagagatgg 60 agcgggtgct gccgccgatc c 81 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 19 ctgcctacct catgacctta ggaaagacca ccgccgccag cgcttgccgt tacatcgccg 60 · acaccgccaa caagggcgac t 81 <210> 20 <211> 87 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 20 . .. .
atataagctt ctattaagcc tggtagttgt. tgtaggctaa caggttgacg gtgccgaagg 60 gaatgttgct taagtcgccc ttgttgg 87 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 21 aattcatgag aggatcgcat cagcatcágc atčagg • · <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 22 gatccctgat gctgatgctg atgcgatcct ctcatg 36 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 23 gcggátccgc tcctgccgtt gagcagcgc 29 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Syntetická sekvence <220>
<223> Popis syntetické sekvence: primer <400> 24 gcggatccga tgacgatgac aaagctcctg ccgttgagca gcgc
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob naturace denaturované zymogenní proteinázy Kvyznačující se tím, že denaturovaná zymogenní proteináza K je přenesena do svinovacího pufru, kterýžto svinovací pufr je charakterizován následujícími vlastnostmi:A) pH hodnota pufru je v rozsahu 7,5 až 10,5B) přítomnost látek s nízkou molekulovou hmotností, které napomáhají svinutíC) přítomnost oxidačně redukčního přeskupovacího systémuD) přítomnost komplexačního činidla v substechiometrické koncentraci relativně k iontům Ca2+, které jsou přítomny, a kde způsob je prováděn při teplotě mezi 0 °C a 37 °C.
- 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že oxidačně redukční shuffle systém se skládá ze smíšených disulfidů nebo thiosulfonátů.
3. vyzná Způsob č u j í c í podle kteréhokoliv se tím, že pufr má pH z nároků hodnotu pH 1 nebo 2 8 až pH 9. 4 . Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 vyzná č u j ící se tím, že způsob je prováděn při teplotě mezi 0 °C a 25 °C 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyzná č u j ící se tím, že během naturace jsou denaturační činidla přítomna v koncentraci nižší než 50 mM. podle kteréhokoliv z nároků44 4 - 4 4 4444 • 4 4 ♦ * ·4 444 · 4 · · 4
- 6. Způsob vyznačuj ící hmotností, látky s nízkou1 až 5 molekulovou se t i m, ze které napomáhají svinutí, z následující skupiny sloučenin s nízkou molekulovou hmotností a mohou být přidány samotné nebo jako směsi:jsou vybrány- L-arginin v koncentraci 0,5 až 2,0 M- Tris v koncentraci 0,5 M až 2,0 M- triethanolamin v koncentraci 0,5 M až 2,0 M- α-cyklodextrin v koncentraci 60 mM až 120 mM.
- 7. Způsob podle kteréhokoliv vyznačující se tím, že Ca2+ v koncentraci 1 až 20 mM.z nároků 1 až 6 ionty jsou přítomny
- 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků vyznačující se tím, že denaturovaná proteináza K je přenesena do svinovacího pufru, snížena koncentrace denaturačních činidel, která přítomna.1 až 7 zymogenní přičemž je mohou být
- 9. Svinovací pufr vyznačující se tím, že má následující vlastnosti:A) pH hodnota pufru je v rozsahu 7,5 až 10,5B) přítomnost látek s nízkou molekulovou hmotností, které napomáhají svinutíC) přítomnost oxidačně redukčního přeskupovacího systému ·· * • · • « · · » • · · · · • ··· · «·· «·»* • · « · · · · * · · ···· ·· ·« ·* ·· *D) přítomnost komplexačního činidla v substechiometrické koncentraci relativně k Ca2+ iontům, které jsou přítomny.
- 10. Svinovací pufr podle nároku 9 vyznačující se tím, že pufr má pH 8 až pH 9 a oxidačně redukční přeskupovacího systém se skládá ze smíšených disulfidů nebo thiosulfonátů.
- 11. Způsob aktivace naturovaného zymogenního prekurzoru proteinázy K vyznačující se tím, že aktivní proteináza K je uvolňována z inaktivního komplexu, který tvoří nativní proteináza K a inhibiční propeptid, pro který je charakteristické, že je uvolňován přidáním detergentů.
- 12. Způsob aktivace naturovaného zymogenního prekurzoru proteinázy K vyznačující se tím, že jako detergent bylo přidáno SDS v koncentraci 0,1 až 2 % (hmotnost/objem).
- 13. Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K vyznačující se tím, že zymogenní proforma proteinázy K je svinuta in vitro naturací a je konvertována na aktivní formu autokatalytickým štěpením.
- 14. Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K podle nároku 13 vyznačující se tím, že zymogenní prekurzor proteinázy K z izolovaných a solubilizovaných inkluzních tělísek je konvertován oxidačním svinutím do nativní struktury, tj . je naturován, a pak je aktivní proteináza K získána z nativně svinutého zymogenu autokatalytickým štěpením ·· φφφφ φφ ΦΦΦΦ φ φ · « * * • · · · φ φ φφφ » · · φ φφ φφφφ «φ φφφφ φφ ·Φ φφ · · přidáním detergentů, přičemž zymogenní prekurzor je naturován způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.
- 15. Způsob přípravy rekombinantni proteinázy K podle nároku 14 vyznačující se tím, že inkluzní tělíska jsou solubilizována denaturačními činidly a redukčními činidly.
- 16. Způsob přípravy rekombinantni proteinázy K podle nároku 15 vyznačující se tím, že jako denaturační činidla jsou přidána 6 až 8 M guanidiniumhydrochlorid nebo 8 až 10 M urea a jako redukční činidla jsou přidána 50 až 200 mM DTT nebo DTE.
- 17. Způsob přípravy rekombinantni proteinázyK transformací hostitelské buňky rekombinantni nukleovou kyselinou, která kóduje zymogenní prekurzor proteinázy K, vyznačující se tím, že- hostitelská buňka je pěstována takovým způsobem, že zymogenní proteináza K je tvořena v hostitelské buňce ve formě inkluzních tělísek, inkluzní tělíska jsou pak izolována a zymogenní prekurzor proteinázy K je solubilizován, zymogenní prekurzor proteinázy K je pak naturován způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 a- naturovaná zymogenní proteináza K je aktivována způsobem podle nároku 11 nebo 12.
- 18. Způsob přípravy rekombinantní proteinázy kteréhokoliv z nároků 13 až 17 vyznačující se hostitelská buňka je prokaryotická buňka.• · · · • · • · · · • ·K podle tím, že
- 19. Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K podle kteréhokoliv z nároků 11-18 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je Escherichia coli.
- 20. Rekombinantní nukleová kyselina s optimalizovanými kodony kódující rekombinantní zymogenní proteinázu K, která byla optimalizována pro expresi v Escherichia coli.
- 21. Vektor obsahující rekombinantní nukleovou kyselinu podle nároku 20.
- 22. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10105912A DE10105912A1 (de) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | Rekombinante Proteinase K |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032165A3 true CZ20032165A3 (cs) | 2004-10-13 |
Family
ID=7673417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20032165A CZ20032165A3 (cs) | 2001-02-09 | 2002-02-08 | Rekombinantní proteináza K |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070099283A1 (cs) |
| EP (1) | EP1360284B1 (cs) |
| JP (1) | JP2004525631A (cs) |
| AT (1) | ATE401393T1 (cs) |
| CA (1) | CA2435753A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20032165A3 (cs) |
| DE (2) | DE10105912A1 (cs) |
| WO (1) | WO2002072634A2 (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7153666B2 (en) | 2003-07-17 | 2006-12-26 | General Atomics | Methods and compositions for determination of glycated proteins |
| AU2007277201B2 (en) * | 2006-07-25 | 2014-01-09 | Diazyme Laboratories, Inc. | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| US7943385B2 (en) | 2006-07-25 | 2011-05-17 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| CA2858359C (en) * | 2006-11-01 | 2018-04-03 | Ventana Medical Systems, Inc. | Haptens, hapten conjugates, compositions thereof and method for their preparation and use |
| WO2008115428A2 (en) * | 2007-03-16 | 2008-09-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | A scaleable manufacturing process for cysteine endoprotease b, isoform 2 |
| US7682789B2 (en) * | 2007-05-04 | 2010-03-23 | Ventana Medical Systems, Inc. | Method for quantifying biomolecules conjugated to a nanoparticle |
| EP2167963B1 (en) | 2007-05-23 | 2019-04-17 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymeric carriers for immunohistochemistry and in situ hybridization |
| WO2009140343A1 (en) * | 2008-05-13 | 2009-11-19 | General Atomics | Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin |
| US8703490B2 (en) | 2008-06-05 | 2014-04-22 | Ventana Medical Systems, Inc. | Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes |
| USPP22463P3 (en) * | 2010-02-16 | 2012-01-17 | Menachem Bornstein | Gypsophila plant named ‘Pearl Blossom’ |
| EP2423217A1 (en) | 2010-08-23 | 2012-02-29 | Forschungsverbund Berlin E.V. | Peptide and protein affinity tag from mistic protein |
| CN112592931A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-02 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 一种生产重组蛋白酶k的方法 |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
| US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
| DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| US5453363A (en) * | 1985-10-23 | 1995-09-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes |
| JP2731407B2 (ja) * | 1987-04-03 | 1998-03-25 | アムジエン・インコーポレーテツド | 新規なプロテアーゼ酵素 |
| DE3835350A1 (de) * | 1988-10-17 | 1990-04-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern |
| DE3903581A1 (de) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogenaktivator-derivat |
| US5191063A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
| US5606031A (en) * | 1990-04-06 | 1997-02-25 | Lile; Jack | Production and purification of biologically active recombinant neurotrophic protein in bacteria |
| US5144006A (en) * | 1991-06-13 | 1992-09-01 | The Rockefeller University | Oxidative folding of peptide and protein substrates using hydrocarbon sulfoxides |
| US5792623A (en) * | 1992-04-06 | 1998-08-11 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent |
| DE4225427A1 (de) * | 1992-07-31 | 1994-02-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Gewinnung rekombinanter, biologisch aktiver, eukaryontischer alkalischer Phosphatase |
| DE69432744T2 (de) * | 1993-02-04 | 2004-03-25 | Borean Pharma A/S | Verbessertes verfahren zur rückfaltung der proteine |
| US5747654A (en) * | 1993-06-14 | 1998-05-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity |
| JPH0748398A (ja) * | 1993-08-03 | 1995-02-21 | Nippon Oil Co Ltd | 変性蛋白質の再生方法及び変性蛋白質再生剤 |
| US5550262A (en) * | 1994-11-14 | 1996-08-27 | Cephalon, Inc. | Multicatalytic protease inhibitors |
| IL117350A0 (en) * | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6342585B1 (en) * | 1996-06-11 | 2002-01-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Method of activating denatured protein |
| EP0941334B1 (en) * | 1996-11-06 | 2004-06-02 | THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Protease-activatable pseudomonas exotoxin a-like proproteins |
| US20030207402A1 (en) * | 1997-08-22 | 2003-11-06 | Erhard Kopetzki | Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use |
| AU2354800A (en) * | 1998-12-10 | 2000-06-26 | Genetic Vectors, Inc. | Method of protein removal |
| US7351549B2 (en) * | 2000-01-24 | 2008-04-01 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Method for the manufacture of recombinant trypsin |
| US7001724B1 (en) * | 2000-11-28 | 2006-02-21 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases |
| CA2430661C (en) * | 2000-12-15 | 2010-10-19 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Purified active hcv ns2/3 protease |
| US7214484B2 (en) * | 2002-12-17 | 2007-05-08 | Sigma-Aldrich Co. | Compositions and methods for nucleic acid extraction from biological samples |
-
2001
- 2001-02-09 DE DE10105912A patent/DE10105912A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-08 DE DE50212510T patent/DE50212510D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-08 AT AT02750504T patent/ATE401393T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-08 CA CA002435753A patent/CA2435753A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-08 WO PCT/EP2002/001322 patent/WO2002072634A2/de active IP Right Grant
- 2002-02-08 CZ CZ20032165A patent/CZ20032165A3/cs unknown
- 2002-02-08 JP JP2002571547A patent/JP2004525631A/ja active Pending
- 2002-02-08 US US10/467,532 patent/US20070099283A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-08 EP EP02750504A patent/EP1360284B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE10105912A1 (de) | 2002-08-14 |
| WO2002072634A2 (de) | 2002-09-19 |
| EP1360284A2 (de) | 2003-11-12 |
| DE50212510D1 (de) | 2008-08-28 |
| WO2002072634A3 (de) | 2003-03-13 |
| US20070099283A1 (en) | 2007-05-03 |
| JP2004525631A (ja) | 2004-08-26 |
| ATE401393T1 (de) | 2008-08-15 |
| EP1360284B1 (de) | 2008-07-16 |
| CA2435753A1 (en) | 2002-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eisele et al. | The first characterized asparaginase from a basidiomycete, Flammulina velutipes | |
| Ponniah et al. | The production of soluble and correctly folded recombinant bovine β-lactoglobulin variants A and B in Escherichia coli for NMR studies | |
| Lagedroste et al. | Substrate specificity of the secreted nisin leader peptidase NisP | |
| CZ20032165A3 (cs) | Rekombinantní proteináza K | |
| CA2435606C (en) | Expression of recombinant proteinase k from tritirachium album in yeast | |
| US20160083713A1 (en) | Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases | |
| WO2012104099A1 (en) | Process for the production of recombinant trypsin | |
| JP2002527062A (ja) | 活性なβ−ＮＧＦを得るための方法 | |
| Wallner et al. | Lab scale and medium scale production of recombinant allergens in Escherichia coli | |
| Ribó et al. | Purification of engineered human pancreatic ribonuclease | |
| Malik et al. | A novel fusion protein system for the production of native human pepsinogen in the bacterial periplasm | |
| Tan et al. | Purification and refolding optimization of recombinant bovine enterokinase light chain overexpressed in Escherichia coli | |
| Choudhury et al. | Production and recovery of recombinant propapain with high yield | |
| KR20220005566A (ko) | 에이에스엑스 특이성 단백질 리가제 및 그의 용도 | |
| JP2003512050A (ja) | 組換え成熟型リソフスタフィンの発現 | |
| Eisele et al. | Heterologous expression, refolding and characterization of a salt activated subtilase from Pleurotus ostreatus | |
| Weik et al. | Recombinant expression of alliin lyase from garlic (Allium sativum) in bacteria and yeasts | |
| Loferer et al. | Expression, purification and functional properties of a soluble form of Bradyrhizobium japonicum TlpA, a thioredoxin‐like protein | |
| Austin | Novel approach to obtain biologically active recombinant heterodimeric proteins in Escherichia coli | |
| JP3172968B2 (ja) | Ｉｌ―１６の多量体形態、それらを生産するための方法及びそれらの使用 | |
| Seddi et al. | Expression of a soluble and activatable form of bovine procarboxypeptidase A in Escherichia coli | |
| Koyama et al. | A novel procedure for the preparation of biologically active recombinant peptides using a cyanylation reaction | |
| RU2495934C2 (ru) | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА | |
| Dee et al. | Recombinant prosegment peptide acts as a folding catalyst and inhibitor of native pepsin | |
| Hahm et al. | Refolding and purification of yeast carboxypeptidase Y expressed as inclusion bodies in Escherichia coli |