JP4177922B2 - コンセンサスフィターゼ - Google Patents
コンセンサスフィターゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4177922B2 JP4177922B2 JP20906398A JP20906398A JP4177922B2 JP 4177922 B2 JP4177922 B2 JP 4177922B2 JP 20906398 A JP20906398 A JP 20906398A JP 20906398 A JP20906398 A JP 20906398A JP 4177922 B2 JP4177922 B2 JP 4177922B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phytase
- amino acid
- consensus
- protein
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
Description
【０００１】
【従来の技術】
フィターゼ（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼ；ＥＣ３．１．３．８）は、フィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸エステル）をｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸とに加水分解する酵素であり、有用な飼料添加物であることが知られている。
【０００２】
フィターゼは、１９０７年に米のふすま中で最初に記載され〔Suzuki et al., Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907)〕、アスペルギルス属の一種からのフィターゼは、１９１１年に記載された〔Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (1911)〕。フィターゼは、小麦のふすま、植物の種子、動物の腸、および微生物にも認められている〔Howsen and Davis, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382 (1983)；Lambrechts et al., Biotech. Lett. 14, 61-66 (1992)；Shieh and Ware, Appl. Microbiol., 16, 1348-1351 (1968)〕。
【０００３】
Aspergillus niger（ficuum）由来のフィターゼのクローニングおよび発現は、Gene, 127, 87-94 (1993)にVan Hartingsveldtらによって、また欧州特許公開第４２０ ３５８号明細書にも記載され、Aspergillus niger var. awamori由来のフィターゼのクローニングおよび発現は、Gene, 133, 55-62 (1993)にPiddingtonらによって記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
改良された特性を有するフィターゼのクローニング、発現および精製は、欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書に記載されている。しかし、特にその熱安定性に関して、更に改良されたフィターゼに対する需要が依然として存在することから、下記の方法を提供することが本発明の目的であるが、この方法は、フィターゼに限らず適用できる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、コンセンサスタンパク質を製造する方法であって、そのような方法は、下記の段階：
（ａ）公知の任意の標準的アラインメント（alignment）プログラムにより、定義されたタンパク質群の少なくとも３、好ましくは４のアミノ酸配列をアライン（align）させる段階と；
（ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるアミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれらの進化的類似度について比較する一方、対応する位置のアミノ酸の決定に用いられるアミノ酸の最小の類似度を定義するようなプログラムによって提供される類似度の程度を、より緊縮でない数に設定し、対応する位置で２のみの同一なアミノ酸から、コンセンサスタンパク質のためのアミノ酸を該プログラムが決定できるような方法でパラメータを設定するが、比較されるアミノ酸配列のうちに、残余の配列に対するよりもはるかに高い程度の類似度を相互に示す配列があるならば、これらの配列を、コンセンサスタンパク質のコンセンサス配列についての本方法と同じ方法で定義されたように決定されたそれらのコンセンサス配列によって表すか、またはそのような配列の数で１を除した票の重み（vote weight）を、これらの配列のそれぞれに割り当てる段階と；
（ｃ）定義された位置に共通のアミノ酸が該プログラムによって決定されない場合、比較に用いたすべての配列の任意のアミノ酸、好ましくはそのようなすべての配列で最高頻度のアミノ酸を選択するか、または実施例２に示した考慮に基づいてアミノ酸を選択する段階と；
（ｄ）コンセンサス配列を定義してあるのであれば、そのような配列を、好ましくは発現を行う生物のコドン頻度表を用いることによって、ＤＮＡ配列へと逆翻訳する段階と；
（ｅ）公知の方法により該ＤＮＡ配列を合成し、適切な発現ベクターに組み込んでか、またはそれ自体により、適切な宿主細胞を形質転換させるために用いる段階と；
（ｆ）形質転換された宿主細胞を適切な培養条件下で増殖させ、コンセンサスタンパク質を公知の方法によって該宿主細胞またはその培地から単離する段階と
を含む方法に関する。
【０００６】
本方法の好適な実施態様では、段階（ｂ）は、下記のとおりに定義することもできる。：
（ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるアミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれらの進化的類似度について比較する一方、そのようなプログラムによって提供される類似度の程度を、出来る限り最低の値に設定し、比較に用いた配列の少なくとも半数について最も類似するアミノ酸を、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列中の対応する位置について選択する段階。
【０００７】
この方法全体の好適な実施態様は、高度に相同である多数の配列からある配列を選択し、このタンパク質群のコンセンサス配列とは明らかに異なるアミノ酸残基のみを、中程度の緊縮条件下で算出して置き換えるが、中程度の緊縮条件下で本方法がアミノ酸を決定できないアラインメントのすべての位置で、好適な配列のアミノ酸を対象とする方法において認められる。
【０００８】
定義された位置のアミノ酸をそれらの進化的類似度について比較するのに用いるプログラムが、「ＰＲＥＴＴＹ」というプログラムであるような方法を提供することは、本発明の更なる目的である。定義されたタンパク質群が、フィターゼ群である、特に該フィターゼが、真菌起源のものであるような方法を提供することは、より詳細に、本発明の目的である。
【０００９】
宿主細胞が真核生物、特に真菌、好ましくはAspergillus属または酵母、好ましくはSaccharomyces属またはHansenula属起源のものであるような方法を提供することが、更に本発明の目的である。
【００１０】
そのような方法によって得ることができる、または得られたコンセンサスタンパク質、詳細には図５〜図７に示したアミノ酸配列を有するコンセンサスタンパク質、またはその変異型もしくは突然変異タンパク質を提供することも、本発明の目的である。「変異型」とは、本発明の文脈では、図５〜図７に示したアミノ酸配列を有するコンセンサスタンパク質であって、一ヶ所またはそれ以上の位置においてアミノ酸が欠失、付加、または一つもしくはそれ以上の他のアミノ酸で置換されている（ただし、得られる配列は、酵素活性（種類および特異的活性）、熱安定性、一定のpH範囲内での活性（pH安定性）のようなその基本的特性が有意に変えられていないタンパク質をもたらす）コンセンサスタンパク質を意味する。「有意に」とは、本文脈では、当業者が、変異型の特性は、図５〜図７のアミノ酸配列自体を有するコンセンサスタンパク質のそれとはなおも異なるが、非自明ではないとすると思われることを意味する。
【００１１】
突然変異タンパク質とは、本発明の文脈では、図５〜図７に示したコンセンサスタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸が置換され、それにより、更に改良された特性、例えば活性を有するコンセンサスタンパク質が得られることを意味する。そのような突然変異タンパク質は、欧州特許公開第９７８１０１７５．６号明細書に示された教示、例えばＱ５０Ｌ、Ｑ５０Ｔ、Ｑ５０Ｇ、Ｑ５０Ｌ−Ｙ５１Ｎ、Ｑ５０Ｔ−Ｙ５１ＮまたはＱ５０Ｌ−Ｑ５１Ｎに基づいて定義かつ調製することができる。「Ｑ５０Ｌ」とは、本文脈では、アミノ酸配列の第５０位で、アミノ酸Ｑがアミノ酸Ｌに置き換えられていることを意味する。
【００１２】
加えて、上記に定義されたコンセンサスタンパク質を含む食品、飼料または医薬組成物も、本発明の目的である。
【００１３】
本文脈で、「そのように定義されたタンパク質群の少なくとも３、好ましくは４のアミノ酸配列」とは、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列を生成するためのアラインメントおよび比較に、３、４、５、６ないし１２、２０、５０またはそれ以上の配列を用いることができることを意味する。「定義されたタンパク質群の配列」とは、αヘリックス、β−シートおよび−ターンが同位置にあるために、このような構造が、当業者が称するように、スーパーインポーザブルであるような、三次元構造にそのような配列が折りたたまれることを意味する。その上、これらの配列により、同じ型の生物学的活性、例えば定義された酵素クラス、例えばフィターゼの活性を示すようタンパク質が特徴付けられる。当業界では公知のとおり、そのような配列の一つの三次元構造は、そのような群の他の配列の構造のモデリングを可能とする。これをどのように実施できるかの一例は、本願の参考実施例に示す。本発明の文脈での「進化的類似度」とは、アミノ酸をそれらの構造的類似度について分類することによって、一つのアミノ酸をもう一つのアミノ酸に、全体的構造に対する影響は最少のまま置換することを可能とするスキームを意味し、それは例えば、当業界に公知の「ＰＲＥＴＴＹ」のようなプログラムによってなされるとおりである。語句「そのようなプログラムによって提供される類似度の程度を．．．より緊縮ではない数に設定する」とは、本発明の文脈では、本発明の実施に用いるプログラムでの類似度の程度を決定するパラメータの値を、このプログラムが、アミノ酸配列全体の位置の最大値に対する共通のアミノ酸を定義するのを可能とするような方法で選択することを意味し、例えばプログラムＰＲＥＴＴＹの場合、ＴＨＲＥＳＨＯＬＤに対しては２または３の値を、ＰＬＵＲＡＬＩＴＹに対しては２という値を選択することができる。更に、「そのような配列の数で１を除した票の重み」とは、本発明の文脈では、コンセンサス配列の決定に用いられる他の配列より高度の類似度を有する配列の群を定義する配列のみが、この群のすべての配列の数で１を除したものに等しい係数でそのような決定に寄与することを意味する。
【００１４】
前述のとおり、該プログラムが最も類似するアミノ酸を選択するのを可能としないのであれば、最も頻度の高いアミノ酸を選択し、これが不可能であるならば、当業者は、例えば以下に論じられているように、タンパク質の熱安定性を改良する特性が当業界に知られている、比較に用いたすべての配列からアミノ酸を選択するであろう。
【００１５】
Janecek, S. (1993), Process Biochem. 28, 435-44またはFersht, A.R. & Serrano, L. (1993), Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75-83. Alber, T. (1989), Annu. Rev. Biochem. 58, 765-798またはMatthews, B.W. (1987), Biochemistry 26, 6885-6888. Matthews, B.W. (1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17-21.
【００１６】
酵素の安定性は、多くの工業的応用には決定的な因子である。したがって、酵素の安定性、好ましくは熱安定性を、合理的であるか（van den Burg et al., 1998）または非合理的（Akanuma et al., 1998）な手段によって、改良するために多くの試みがなされており、多少の成果を示したものもある。タンパク質の熱安定性に影響する力は、ペプチド鎖の適正な折りたたみに寄与するそれと同じである〔疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合、塩橋、配座歪み（Matthews, 1993）〕。その上、Matthewsら（１９８７）が示したとおり、折りたたまれていない状態の自由エネルギーも、タンパク質の安定性に影響する。タンパク質の安定性を高めることは、好都合な相互作用の数および強度を増加させ、不都合な相互作用の数および強度を減少させることを意味する。ジスルフィド結合を導入して（Sauer et al., 1986）グリシンをアラニン残基で置換するか、またはプロリン含量を増加させて、折りたたまれていない状態の自由エネルギーを減少させる（Margarit et al., 1992；Matthews, 1987a）ことが可能になっている。その他のグループは、タンパク質の安定性のための追加の水素結合または塩橋の重要性に着目したか（Blaber et al., 1993）、またはタンパク質内部のキャビティを満たして、埋められた疎水性表面積およびファンデルワールス相互作用を増大させることを試みた（Karpusas et al., 1989）。更に、二次構造の要素、特にαヘリックスの、例えばらせんのキャッピングの改善による安定化も研究された（Munoz & Serrano, 1995）。
【００１７】
しかしながら、タンパク質の安定性、好ましくは熱安定性を増大させると考えられるアミノ酸置換を特定するための、迅速かつ有望な戦略は皆無である。共通して、タンパク質の三次元構造については、アミノ酸置換がタンパク質の折りたたまれた状態を安定化する可能性のある、分子内の位置を見出す必要がある。この問題を回避する替わりの方法は、好熱性もしくは高度好熱性生物中に相同タンパク質を求めるか、またはランダム突然変異誘発法による、安定性を増大させるアミノ酸置換を探すかのいずれかである。この後者の可能性は、１０3〜１０4回の突然変異においてのみ成功するにすぎず、迅速なスクリーニングが可能である酵素に限定される（Arase et al., 1993；Risse et al., 1992）。これらすべての取組み法に対して、成功は可変的かつ予測不能であり、成功するとしても、熱安定性の増大は、ほとんど常に、きわめてわずかなものであった。
【００１８】
ここで、本発明者らは、タンパク質の熱安定性を改良する替わりの方法を提示する。Imanakaら（１９８６）は、相同タンパク質の比較により、タンパク質の安定性を増大させた最初の研究者の一員であった。彼等は、好熱性生物からのプロテアーゼと中温生物の相同なそれとの比較により、中温生物のプロテアーゼの安定性を増大させた。Serranoら（１９９３）は、２種類の相同な中温生物のＲＮアーゼのアミノ酸配列の比較により、より熱安定なＲＮアーゼを構築した。彼等は、この二者間で異なるすべての残基を個別に突然変異させ、複数の突然変異体で安定性を増大させる突然変異を組み合わせた。Pantolianoら（１９８９）、および特にSteipeら（１９９４）は、相同タンパク質のアラインメントのすべての位置で最高頻度のアミノ酸が、タンパク質の安定性に最も寄与すると示唆した。Steipeら（１９９４）は、免疫グロブリンの可変ドメインについてこれを証明したが、Pantolianoら（１９８９）は、より高い安定性を求めて改良するために選択した酵素の配列が単一分岐性であるズブチリシンの一次配列中の位置を探した。彼等の取組みの結果、ズブチリシンのＴmを１．８℃上昇させる置換Ｍ５０Ｆが得られた。
【００１９】
Steipeら（１９９４）は、免疫グロブリンの可変ドメインで、このドメインの一定の位置の最高頻度のアミノ酸残基を決定する統計的方法を用いるだけで、安定化突然変異を６０％以上の成功率で予測できることを証明した。この方法は、抗体の可変ドメインの安定化ばかりでなく、他のタンパク質のドメインについても有用な結果をもたらすであろうことも示唆された。しかし、この方法が、タンパク質全体に拡大できる可能性があることは、決して言及されなかった。その上、別個の位置のアミノ酸残基の頻度を計算するのに用いたプログラムに関して、あるいは本事例のように採点マトリックスを用いたか否かに関しては、何も述べられていない。
【００２０】
したがって、いわゆるコンセンサスタンパク質のほとんど全位置についてアミノ酸残基を計算し、原核または真核生物の発現系で発現させ得る完全な遺伝子をこの配列から合成する方法を含む、コンセンサスタンパク質を製造する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００２１】
本発明のＤＮＡ配列は、当業界に公知のタンパク質、例えばフィターゼをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列から出発して構築することができる〔配列情報については、上記の参考文献、例えば欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書、またはGenbank（Intelligenetics, California, 米国）、European Bioinformatics Institute（Hinston Hall, Cambridge, 英国）、ＮＢＲＦ（Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, 米国）およびVecbase（University of Wisonsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, 米国）のような配列データベースを参照。またはin vitro突然変異誘発の方法による数字に開示されている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）。Hurchinson およびEdgell〔J. Virol. 8, 181 (1971)〕が最初に概略を述べたように、そのような「位置指定突然変異誘発」のために広く用いられる戦略は、突然変異を導入すべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域への、所望のヌクレオチド置換体を有する合成オリゴヌクレオチドのアニーリングを包含する〔総説についてはSmith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985)を、改良された方法についてはStanssen et al., Nucl. Acid Res., 17, 4441-4454 (1989)の参考文献２〜６を参照〕。所与のＤＮＡ配列を突然変異させる、本発明の実施にも好適であるもう一つの可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによる突然変異誘発である。出発材料としてのＤＮＡは、当業界に公知である、例えばSambrookら（Molecular Cloning）に記載された方法によって、それぞれの株から単離することができる。株の情報については、例えば欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書、または下記に示した寄託機関を参照。Aspergillus niger〔ＡＴＣＣ９１４２〕、Myceliophthora thermophila〔ＡＴＣＣ４８１０２〕、Talaromyces thermophilus〔ＡＴＣＣ２０１８６〕およびAspergillus fumigatus〔ＡＴＣＣ３４６２５〕は、ブダペスト条約の規定により、下記の寄託番号でアメリカンタイプカルチャーセルコレクションに再寄託されている：それぞれ、ＡＴＣＣ７４３３７、ＡＴＣＣ７４３４０、ＡＴＣＣ７４３３８およびＡＴＣＣ７４３３９。しかし、本発明によるコンセンサスタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば欧州特許公開第７４７ ４８３号明細書に記載されているような合成法により、または当業界で公知の方法によっても調製することができることは理解される。
【００２２】
本発明の完全なＤＮＡ配列が得られたならば、当業界に公知である、例えばSambrookら〔前掲〕に記載された方法によって、それらをベクターに組み込んで、コードされたポリペプチドを適切な宿主系で過剰発現させることができる。しかし、当業者には、該ＤＮＡ配列自体を本発明の適切な宿主系を形質転換するのに用いて、コードされたポリペプチドを過剰発現させることができることも公知である。適切な宿主系は、例えば、Aspergillus属、例えばAspergillus niger〔ＡＴＣＣ９１４２〕もしくはAspergillus ficuum〔ＮＲＲＬ３１３５〕、またはTrichoderma属、例えばTrichoderma reeseiのような真菌、あるいはSaccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae、またはPichia属、例えばPichia pastoris、またはHansenula属、例えばHansenula polymorpha〔ＤＳＭ５２１５〕のような酵母、あるいは例えばPenら、Bio/Technology 11, 811-814 (1994)が記載したような植物である。当業者には、そのような微生物は、寄託機関、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）もしくはDeutche Sammlung feur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）、または雑誌「Industrial Property」〔（1991）１、２９〜４０ページ〕に列挙された他の寄託機関から入手できることが公知である。用い得る細菌は、例えば、E. coli、例えばBacillus subtilisのようなBacillus属、またはStreptomyces属、例えばStreptomyces lividansである〔例えばFEMS Microbiol. Letters, 114, 121 (1993)のAnneおよびMallaertを参照〕。用い得ると思われるE. coliは、E. coli Ｋ１２株、例えばＭ１５〔J. Bacteriol. 120, 466-474 (1974)にVillarejoらがＤＺ２９１として記載〕、ＨＢ１０１〔ＡＴＣＣ No.３３６９４〕またはE. coli ＳＧ１３００９〔Gottesman et al., J. Bacteriol. 148, 265-273 (1981)〕である。
【００２３】
真菌での発現に用い得るベクターは、当業界には公知であり、例えば欧州特許公開第４２０ ３５８号明細書に、あるいはCullenら〔Bio/Technology 5, 369-376 (1987)〕、Ward〔Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York (1991)〕、Upshallら〔Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)〕、Gwynneら〔Bio/Technology 5, 71-79 (1987)〕、またはPuntら〔J. Biotechnol. 17, 19-34 (1991)〕によって、酵母についてはSreekrishnaら〔J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)；Biochemistry 28, 4117-4125 (1989)〕、またはHitzemannら〔Nature 293, 717-722 (1981)〕によって、あるいは欧州特許公開第１８３ ０７０、１８３ ０７１、２４８ ２２７および２６３ ３１１号明細書に記載されている。E. coliでの発現に用い得る適切なベクターは、例えば、Sambrookら〔前掲〕、またはFiersら〔Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium, Soc. Franc. de Microbiol., Paris, (Durand et al., eds.), pp.680-697〕、もしくはBujardら〔Methods in Enzymology, eds. Wu and Grossmann, Academic Press, Inc. Vol. 155, 416-433 (1987)〕、およびSteuberら〔Immunological Methods, eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152 (1990)〕によって言及されている。Bacillusでの発現に用い得るベクターは、当業界に公知であり、例えば、欧州特許公開第４０５ ３７０号明細書に、YansuraおよびHennerによってProcd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)に、Meth. Enzymol. 185, 199-228 (1990)、または欧州特許公開特許第２０７ ４５９号明細書に記載されている。H. polymorphaでの発現に用い得るベクターは、当業界に公知であり、例えばGellissen et al., Biotechnology 9, 291-295 (1991)に記載されている。
【００２４】
そのようなベクターは、調節要素、例えばプロモーターを既に保有しているか、または本発明のＤＮＡ配列は、そのような要素を含むように操作することができるかのいずれかである。用い得る適切なプロモーター要素は、当業界に公知であり、例えば、Trichoderma reeseiに対してはｃｂｈ１〔Haarki et al., Biotechnology 7, 596-600 (1989)〕またはｐｋｉ１〔Schindler et al., Gene 130, 271-275 (1993)〕プロモーターであり、Aspergillus oryzaeに対してはａｍｙプロモーター〔Christensen et al., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987)；Christensen et al., Biotechnology 6, 1419-1422 (1988)；Tada et al., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)〕であり、Aspergillus nigerに対してはｇｌａＡ〔Cullen et al., Bio/Technology 5, 369-376 (1987)；Gwynne et al., Bio/Technology 5, 713-719 (1987)；Ward, Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 83-106 (1991)〕、ａｌｃＡ〔Gwynne et al., Bio/Technology 5, 718-719 (1987)〕、ｓｕｃ１〔Boddy et al., Curr. Genet. 24, 60-66 (1993)〕、ａｐｈＡ〔MacRae et al., Gene 71, 339-348 (1988)；MacRae et al., Gene 132, 193-198 (1993)〕、ｔｐｉＡ〔McKnight et al., Cell 46, 143-147 (1986)；Upshall et al., Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)〕、ｇｐｄＡ〔Punt et al., Gene 69, 49-57 (1988)；Punt et al., J. Biotechnol. 17, 19-37 (1991)〕およびｐｋｉＡ〔de Graaf et al., Curr. Genet. 22, 21-27 (1992)〕プロモーターである。酵母での発現に用い得る適切なプロモーター要素は、当業界に公知であり、例えばｐｈｏ５プロモーター〔Vogel et al., Mol. Cell. Biol. 2050-2057 (1989)；Rudolf and Hinnen, Proc. Natl. Acal. Sci., 84, 1340-1344 (1987)〕であるか、またはSaccharomycesでの発現にはｇａｐプロモーターであり、Pichia pastorisに対しては、例えばａｏｘ１プロモーター〔Koutz et al. Yeast 5, 167-177 (1989)；Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)〕、またはH. polymorphaについてはＦＭＤプロモーター〔Hollenberg et al., 欧州特許公開第０ ２９９ １０８号明細書〕もしくはＭＯＸプロモーター〔Ledeboer et al., Nucleic Acids Res. 13, 3063-3082 (1985)〕である。
【００２５】
したがって、本発明のＤＮＡ配列を含む、好ましくは細菌または真菌または酵母宿主での該ＤＮＡ配列の発現のためのベクター、およびこれにより形質転換された細菌または真菌または酵母宿主も、本発明の目的である。
【００２６】
Hansenula属でのタンパク質、好ましくは本発明のコンセンサスフィターゼのようなフィターゼの高度な発現を可能とする系であって、そのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列のコドンが、発現に用いられる生物、例えば本事例でのような酵母のコドン頻度表に基づいて選択され（例えば実施例３を参照）、場合により、シグナル配列のためのコドンが、実施例３での特定の事例について記載されたような方式で選択されている系を提供することも本発明の目的である。これは、コドン頻度表が、定義されたタンパク質群のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に用いられるコドンに基づいて作成されることを意味する。そうして、シグナル配列のＤＮＡ配列の設定のためのコドンが、発現に用いられる宿主細胞のコドン頻度表から選択され、それによって、両頻度表の同等の頻度のコドンが常に用いられる。
【００２７】
そのようなＤＮＡ配列を、適切な培地中の適切な宿主細胞で発現させたら、コードされるタンパク質を、該タンパク質が培地中に分泌される場合は培地から、またはそのようなタンパク質が細胞内に存在する場合は、タンパク質精製の分野でに公知であるか、もしくはフィターゼの場合は例えば欧州特許公開第４２０ ３５８号明細書に記載された方法によって、宿主生物から単離することができる。したがって、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、上記のように形質転換された細菌または宿主細胞を適切な培養条件下で培養し、それからポリペプチドを回収することを特徴とする方法、そしてそのような方法によって製造されたポリペプチド、または本発明のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドも、本発明の目的である。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、一度得られれば、それらを農業において有用としているその特性について特徴付けることができるが、それには、当業界に公知であり、例えばSimonsら〔Br. J. Nutr., 64, 525-540 (1990)〕、Scheonerら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991)〕、Vogt〔Arch. Gefluegelk. 56, 93-98 (1992)〕、Jongbloedら〔J. Anim. Sci. 70, 1159-1168 (1992)〕、Perneyら〔Poultry Sci. 72, 2106-2114 (1993)〕、Farrellら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278-283 (1993)〕、Brozら〔Br. Poultry Sci. 35, 273-280 (1994)〕およびDuengelhoefら〔Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10 (1994)〕が記載したアッセイも用いることができる。
【００２９】
一般に、本発明のポリペプチドは、特定の応用分野に限定されることなく、例えばフィターゼの場合は、フィチン酸のようなイノシトールポリリン酸エステルのイノシトールと無機リン酸への変換に用いることができる。
【００３０】
その上、本発明のポリペプチドは、医薬組成物または複合食品もしくは飼料の製造方法であって、このような組成物の成分を本発明の１種類またはそれ以上のポリペプチドと混合する方法に用いることができる。したがって、本発明の１種類またはそれ以上のポリペプチドを含む複合食品もしくは飼料または医薬組成物も、本発明の目的である。当業者は、それらの製造法に精通している。そのような医薬組成物または複合食品もしくは飼料は、そのような目的に一般的に用いられ、当業界の技術水準に公知である添加物または成分を更に含むことができる。
【００３１】
更に、動物の厩肥中のフィチン酸の濃度を低下させる方法であって、飼料に含まれるフィチン酸をイノシトールと無機リン酸とに変換するのに充分な量のこのような飼料組成物を動物に摂取させることを特徴とする方法を提供することも、本発明の目的である。
【００３２】
本発明をより詳しく説明する前に、表、および添付の図の説明を以下に記載する。
【００３３】
表１：用いた真菌フィターゼのアミノ酸配列の票の重み。真菌フィターゼのコンセンサス配列を算出するのに用いた票の重みを示す。
【００３４】
表２：真菌フィターゼの相同性。アラインメントに用いたフィターゼのアミノ酸配列を、標準的パラメータを用いたプログラムＧＡＰ（ＧＣＧプログラムパッケージ、９；Deveruxら、1984）によって比較した。比較は、非常に多様なシグナルペプチドを欠くアラインメント（図１〜図４の凡例を参照）にも用いた配列の一部に限定した。対角線の上下の数は、それぞれアミノ酸の同一度および類似度を表す。
【００３５】
表３：算出に用いたフィターゼに対する真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列の相同性。すべてのフィターゼのアミノ酸配列を、プログラムＧＡＰ（ＧＣＧプログラムパッケージ、９．０）を用いて真菌コンセンサスフィターゼの配列と比較した。やはり、比較は、アラインメントに用いた配列の一部に限定した。
【００３６】
表４：真菌コンセンサスフィターゼへの単一突然変異の導入に用いたプライマー。各突然変異の導入には、所望の突然変異を有する２種類のプライマーが必要であった（実施例８を参照）。変化させたトリプレットを太字で強調してある。
【００３７】
表５：最適温度と、真菌コンセンサスフィターゼ、ならびにA. fumigatus、A. niger、A. nidulansおよびM. thermophila由来のフィターゼのＴm値。最適温度は、図８から採った。Ｔm値は、実施例１０に記載し、図１２に示したように、示差走査熱量測定によって決定した。
【００３８】
図１〜図４：公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出。文字は、一文字コードでのアミノ酸残基を表す。下記の配列をアラインメントに用いた：Aspergilus terreus ９Ａ−１からのｐｈｙＡ（Mitchell et al., 1997；アミノ酸（ａａ）２７から）、Aspergillus terreus ｃｂｓ１１６．４６からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus niger var. awamoriからのｐｈｙＡ（Piddington et al., 1993；ａａ２７から）、Aspergillus niger Ｔ２１３からのｐｈｙＡ；ａａ２７から、Aspergillus niger ＮＲＲＬ３１３５株からのｐｈｙＡ（van Hartingsveldt et al., 1993；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ１３０７３からのｐｈｙＡ（Pasamontes et al., 1997b；ａａ２５から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２７２２からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ５８１２８からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ２６９０６からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２２３９からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ３０から）、Aspergillus nidulansからのｐｈｙＡ（Pasamontes et al., 1997a；ａａ２５から）、Talaromyces thermophilusからのｐｈｙＡ（Pasamontes et al., 1997a；ａａ２４から）、およびMyceliophthora thermophilaからのｐｈｙＡ（Mitchell et al., 1997；ａａ１９から）。アラインメントは、プログラムＰＩＬＥＵＰを用いて算出した。ギャップの位置は、手動で精緻化した。所与の位置におけるアラインメント中の、大文字のアミノ酸残基は、コンセンサス残基を確立するアミノ酸の連携（coalition）に属する。太字で、算出したコンセンサス配列の下に、最終的に構築された真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列（Ｆｃｐ）を示す。算出したコンセンサス配列中のギャップは、実施例２に述べた原則に従って、手動で充填した。
【００３９】
図５〜図７：真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列。算出したアミノ酸配列（図１〜図４）を、プログラムＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（Devereux et al., 1984）、および高度に発現される酵母遺伝子のコドン頻度表（ＧＣＧプログラムパッケージ、９．０）を用いてＤＮＡ配列へと変換した。A. terreus ｃｂｓからのフィターゼのシグナルペプチドをＮ末端に融合させた。太字の塩基は、遺伝子を生成するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を表す。それぞれのオリゴヌクレオチドの名称を配列の上下に記す。下線を付した塩基は、遺伝子の開始および停止コドンを表す。斜体で書いた塩基は、導入される二つのＥｃｏＲＩ部位を示す。
【００４０】
図８：コンセンサス配列を算出するのに用いた真菌コンセンサスフィターゼおよびその他のフィターゼの最適温度。最適温度の決定には、３７〜８５℃の一連の温度でフィターゼ標準アッセイを実施した。用いたフィターゼは、実施例５に従って精製した。▽；真菌コンセンサスフィターゼ、▼；A. fumigatus １３０７３フィターゼ、□A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ、◯；A. nidulansフィターゼ、■；A. terreus ９Ａ−１フィターゼ、●；A. terreus ｃｂｓフィターゼ。
【００４１】
図９：真菌コンセンサスフィターゼならびに突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０ＧのpH依存活性特性。フィターゼ活性は、異なるpH値の適切な緩衝液での標準的アッセイ（実施例９を参照）を用いて決定した。プロットａ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（▽）、Ｑ５０Ｔ（▼）およびＱ５０Ｇ（◯）に対する真菌コンセンサスフィターゼ（●）の比較を活性の％で示す。プロットｂ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（●）およびＱ５０Ｔ（▽）に対する真菌コンセンサスフィターゼ（◯）の比較を、H. polymorphaで発現させた精製酵素の比活性を用いて示す。
【００４２】
図１０：真菌コンセンサスフィターゼの突然変異体Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｌと比較した、突然変異体Ｑ５０ＬおよびＹ５１ＮならびにＱ５０ＴおよびＹ５１ＮのpH依存活性特性。フィターゼ活性は、異なるpH値の適切な緩衝液での標準的アッセイ（実施例９を参照）を用いて決定した。グラフａ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（◯）に対する突然変異Ｙ５１Ｎ（●）の影響を示す。グラフｂ）は、突然変異体Ｑ５０Ｔ（◯）に対する同じ突然変異（●）の影響を示す。
【００４３】
図１１：真菌コンセンサスフィターゼならびにその突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｇの基質特異性。棒は、様々な公知の天然および合成リン酸化化合物とともにフィチン酸（１００％）を用いた活性と比較した相対活性を表す。
【００４４】
図１２：真菌コンセンサスフィターゼおよびその突然変異体Ｑ５０Ｔの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）。タンパク質の試料を、約５０〜６０mg/mlに濃縮し、１０mM酢酸ナトリウム（pH５．０）に対して徹底的に透析した。１０℃/分の一定した加熱速度を９０℃まで適用した。コンセンサスフィターゼＱ５０ＴのＤＳＣ（上のグラフ）は、７８．９℃の融解温度を生じたが、これは、真菌コンセンサスフィターゼの融点（７８．１℃、下のグラフ）とほぼ同一である。
【００４５】
【実施例】
参考例
A. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの相同性のモデリング
A. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼのアミノ酸配列を、Ｘ線結晶学によって三次元構造を決定しておいたA. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼの配列と比較した（図１〜図４を参照）。
【００４６】
A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ、A. fumigatusフィターゼおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの多重アミノ酸配列アラインメントを、プログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（ウィスコンシンパッケージバージョン８、１９９４年９月のためのプログラムメニュー、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 米国 53711）で計算した。A. fumigatusフィターゼおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの三次元モデルは、A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼの構造を鋳型として用い、それぞれA. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼのアミノ酸の配列アラインメントに従って、A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼのアミノ酸を交換することによって構築した。モデルの構築およびエネルギー最適化は、プログラムＭｏｌｏｃ（Gerber and Mueller, 1995）を用いることによって実施した。新たな挿入／欠失以外そして、活性部位から離れたループ領域では、Ｃ−α位を固定したままにした。
【００４７】
外部ループでは、初めの結晶構造に対するモデル化した構造の僅かな差のみを認めることができた。更に、Pseudomonas sp.の細菌のフィターゼ、および決定された限りでA. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ（Cosgrove, 1980）によってフィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸）の分解経路で主として生じる、異なる基質分子を、各フィターゼの構造の活性部位のキャビティ内に、構築し、形成した。これらの基質をそれぞれ、ヒスチジン酸ホスファターゼについて提唱された仮説的な結合モード（Van Etten, 1982）に配向させた。切断され易いリン酸基を、触媒作用に必須の第５９位ヒスチジンへと配向させて、共有結合リン酸化酵素の中間体を形成させた。切断後に第３３９位アスパラギン酸によってプロトン化される基質リン酸エステル結合の酸素を、プロトン供与体へと配向させた。基質の残りの構造部分はもとより、周囲の活性部位残基の配座弛緩も、プログラムＭｏｌｏｃによるエネルギー最適化によって実施した。
【００４８】
構造モデルに基づき、活性部位のキャビティ内を指し示す残基を特定した。これらの位置の半数以上（６０％）が、これら３種類のフィターゼ間で同一であったが、ほとんどの位置は保存されていた（図１〜図４）。この所見は、追加の４種類のフィターゼの配列に拡張できると思われる（A. nidulans、A. terreus９Ａ１株、Talaromyces thermophilus、Myceliophthora thermophila）。
【００４９】
実施例１
真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメント
標準的パラメータ（ギャップ形成ペナルティー１２、ギャップ拡大ペナルティー４）を有する配列分析パッケージリリース９．０（Devereux et al., 1984）からのプログラムＰＩＬＥＵＰを用いて、アラインメントを計算した。ギャップの位置は、テキストエディターを用いて精緻化した。シグナル配列なしの下記の配列（図１〜図４を参照）を用いて、下記のアミノ酸（ａａ）から出発してアラインメントを実施した：
【００５０】
Aspergillus terreus ９Ａ−１、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（Mitchell et al., 1997）、
Aspergillus terreus ｃｂｓ１１６．４６、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus niger var. awamori、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（Piddington et al., 1993）、
Aspergillus niger Ｔ２１３、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子、
Aspergillus niger ＮＲＲＬ３１３５、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（van Hartingsveldt et al., 1993）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ１３０７３、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子（Pasamontes et al., 1997）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２７２２、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ５８１２８、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ２６９０６、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子(van Loon et al., 1997)、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２２３９、ａａ３０からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus nidulans、ａａ２５からのｐｈｙＡ遺伝子（Roche Nr.R1288、Pasamontes at al., 1997a）、
Talaromyces thermophilus ＡＴＣＣ２０１８６、ａａ２４からのｐｈｙＡ遺伝子（Pasamontes et al., 1997a）、
Myceliophthora thermophila、ａａ１９からのｐｈｙＡ遺伝子（Mitchell et al., 1997）。
【００５１】
表２は、上記のフィターゼ配列の相同性を示す。
【００５２】
実施例２
真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列の計算
実施例１の精緻化したアラインメントをインプットとして用い、配列分析パッケージリリース９．０（Devereux et al., 1984）からのプログラムＰＲＥＴＴＹによって、コンセンサス配列を計算した。ＰＲＥＴＴＹは、配列を、それらのカラムをアラインさせて印刷し、アラインメントのためのコンセンサス配列を示すことができる。アラインさせたフィターゼのアミノ酸配列間の類似度を考慮する票の重みを、すべての配列に割り当てた。一つの配列サブグループ（同種であるが異なる株）からのすべてのフィターゼ、例えばA. fumigatusからのすべてのフィターゼのアミノ酸配列の、選出に対する結びついた影響力が１に設定されるように票の重みを設定したが、これは、各配列が、株の配列数で１を除した値で寄与することを意味する（表１を参照）。この手段によって、非常に類似したアミノ酸配列、例えばA. fumigatusの異なる株からのフィターゼのアミノ酸配列が、計算されるコンセンサス配列に大きな影響を及ぼすのを防ぐことができた。
【００５３】
プログラムＰＲＥＴＴＹは、下記のパラメータで開始させた：それ未満ではコンセンサスがない票数を定義する相対多数（plurality）を２．０に設定した。閾値は、それ未満ではあるアミノ酸残基が残基の連携（coalition）のための有効票とならない可能性がある評点マトリックスの値を決定し、２に設定した。ＰＲＥＴＴＹは、ペプチドについてのPretty Pep. Cmpというコンセンサス評点マトリックスを用いた。
【００５４】
アラインメントの１０ヶ所の位置（第４６、６６、８２、１３８、１６２、２３６、２７６、２７９、２８０、３０８位；図１〜図４）に対しては、プログラムがコンセンサス残基を決定できず、下記の規則に従って手動で満たした：最高頻度の残基が存在するならば、この残基を選択し（第１３８、２３６、２８０位）；化学的に類似するか、または等価である優勢な残基群が出現したならば、最高頻度のか、もしくはそれが得られないならばこの群の一つの残基を選択した（第４６、６６、８２、１６２、２７６、３０８位）。優勢な残基も優勢な群も存在しないならば、タンパク質の安定性に対する影響に関する一般的な仮定に従って、出現する残基の一つを選択した（第２７９位）。その他の８ヶ所（第１３２、１７０、２０４、２１１、２７５、３１７、３８４、４４７；図１〜図４）は、プログラムが選択したアミノ酸残基ではなく、通常は、プログラムが選択した残基と同じ頻度で出現するアミノ酸で満たされた。殆どの場合、この補正によって、３種類のA. niger配列の僅かな過小評価（票の重みの合計：０．９９）は除去された。
【００５５】
表３は、計算に用いたフィターゼ配列に対する計算された真菌のコンセンサスフィターゼアミノ酸配列の相同性を示す。
【００５６】
実施例３
真菌のコンセンサスフィターゼアミノ酸配列のＤＮＡ配列への変換
A. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの初めの２６アミノ酸残基をシグナルペプチドとして用い、したがって、すべてのコンセンサスフィターゼのＮ末端と融合させた。この伸長のために、本発明者らは、対応するＤＮＡ配列を算出する特別の方法を用いた。Purvisら（１９８７）は、遺伝子への稀有コドンの組込みは、タンパク質の折りたたみの効率に影響を有すると提唱した。したがって、少なくとも、真菌コンセンサスフィターゼに用いた、タンパク質の分泌に非常に重要であるが、S. cerevisiaeのコドン使用へと転換されるA. terreus ｃｂｓ１１６．４６のシグナル配列中の稀有コドンの分布を、S. cerevisiaeでの発現のために生成される新たなシグナル配列中に移転した。タンパク質の残りの部分については、本発明者らは、ＧＣＧプログラムパッケージから得られた高度に発現されるS. cerevisiae遺伝子のコドン頻度表を用いて、算出されたアミノ酸配列をＤＮＡ配列へと翻訳した。
【００５７】
得られたｆｃｐ遺伝子の配列を図５〜図７に示す。
【００５８】
実施例４
真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子の構築およびクローニング
真菌コンセンサスフィターゼの算出されたＤＮＡ配列を、センスおよびアンチセンス鎖の配列を交互に用いて、８５bpのオリゴヌクレオチドへと分割した。オリゴヌクレオチドはすべて、対向する鎖のその前および後のオリゴヌクレオチドと２０bpずつ重複する。Microsynth, Balgach （スイス国）から購入し、ＰＡＧＥで精製した形態で得られた全プライマーの位置を図５〜図７に示す。
【００５９】
３回のＰＣＲ反応で、合成されたオリゴヌクレオチドを遺伝子全体へと構成した。ＰＣＲには、Boehringer Mannheim（Boehringer Mannheim, Mannheim, ドイツ国）からのHigh Fidelity Kit、およびAMS Biotechnology (Europe) Ltd. （Lugano, スイス国）からのサーモサイクラー（thermocycler）The Protokol（登録商標）を用いた。
【００６０】
オリゴヌクレオチドＣＰ−１〜ＣＰ−１０（ミックス１、図５〜図７）を、各オリゴヌクレオチドあたり０．２pmol/μlの濃度に混合した。ＣＰ−９〜ＣＰ−２２を用いて、第二のオリゴヌクレオチド混合物（ミックス２）を調製した（各オリゴヌクレオチドあたり０．２pmol/μl）。加えて、４種類の短いプライマーをＰＣＲ反応に用いた：
【００６１】
【表１】
【００６２】
ＰＣＲ反応ａ：
ミックス１を１０μl（各オリゴヌクレオチド２．０pmol）
ヌクレオチド２μl（各ヌクレオチド１０mM）
プライマーＣＰ−ａ２μl（１０pmol/μl）
プライマーＣＰ−ｃ２μl（１０pmol/μl）
ＰＣＲ緩衝液１０．０μl
ポリメラーゼ混合物０．７５μl
Ｈ2Ｏ７３．２５μl
【００６３】
ＰＣＲ反応ｂ：
ミックス２を１０μl（各オリゴヌクレオチド２．０pmol）
ヌクレオチド２μl（各ヌクレオチド１０mM）
プライマーＣＰ−ｂ２μl（１０pmol/μl）
プライマーＣＰ−ｅ２μl（１０pmol/μl）
ＰＣＲ緩衝液１０．０μl
ポリメラーゼ混合物０．７５μl（２．６Ｕ）
Ｈ2Ｏ７３．２５μl
【００６４】
ＰＣＲ反応ａおよびｂのための反応条件：
段階１：４５℃で２分
段階２：７２℃で３０秒
段階３：９４℃で３０秒
段階４：５２℃で３０秒
段階５：７２℃で１分
段階３〜５は、４０回反復した。
【００６５】
ＰＣＲ生成物（６７０および９０５bp）を、アガロースゲル電気泳動（０．９％アガロース）とその後のゲル抽出（ＱＩＡＥＸ IIゲル抽出キット、Qiagen, Hilden, ドイツ国）とによって精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応ｃに用いた。
【００６６】
ＰＣＲ反応ｃ：
反応ａのＰＣＲ生成物６μl（≒５０ng）
反応ｂのＰＣＲ生成物６μl（≒５０ng）
プライマーＣＰ−ａ２μl（１０pmol/μl）
プライマーＣＰ−ｅ２μl（１０pmol/μl）
ＰＣＲ緩衝液１０．０μl
ポリメラーゼ混合物０．７５μl（２．６Ｕ）
Ｈ2Ｏ７３．２５μl
【００６７】
ＰＣＲ反応ｃのための反応条件：
段階１：９４℃で２分
段階２：９４℃で３０秒
段階３：５５℃で３０秒
段階４：７２℃で１分
段階２〜４は、３１回反復した。
【００６８】
得られたＰＣＲ生成物（１．４kb）を、上記のとおり精製し；EcoRIで消化し；EcoRIで消化し、脱リン酸化したpBsk(-)ベクター（Stratagene, La Jolla, CA, 米国）に連結した。連結混合物１μlを用いて、E. coliXL-１コンピテント細胞（Stratagene, La Jolla, CA, 米国）を形質転換した。標準的操作はすべて、Sambrookら（１９８７）が記載したとおりに実施した。構築された真菌コンセンサスフィターゼの遺伝子（ｆｃｐ）は、配列決定（プラスミドpBsk-fcp）によって確認した。
【００６９】
実施例５
Saccharomyces cerevisiaeでの真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）およびその変異体の発現、ならびに培養上清からのそれらの精製
Saccharomyces cerevisiaeの発現ベクターであるpYES2（Invitrogen, San Diego, CA, 米国）の発現カセットのEcoRI部位に連結したか、またはJanesら（１９９０）が記載したような短縮ＧＡＰＦＬ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）プロモーターとｐｈｏ５ターミネーターとの間でサブクローニングしたプラスミドpBsk-fcpから、真菌のコンセンサスフィターゼ遺伝子を単離した。遺伝子が正しく配向されていることを、ＰＣＲによって確認した。S. cerevisiaeの株、例えばＩＮＶＳｃＩ（Invitrogen, San Diego, CA, 米国）の形質転換を、Hinnen ら（１９７８）に従って実施した。ＧＡＰＦＬプロモーターの制御下でフィターゼ遺伝子を宿す単一コロニーを採集し、選別培地（ＳＤウラシル、Sherman et al., 1986）５ml中、３０℃で、激しく撹拌しながら（２５０rpm）１日培養した。次いで、この予備培養物を、ＹＰＤ培地（Sherman et al., 1986）５００mlに加え、同じ条件下で増殖させた。gal１プロモーターの導入は、メーカーの指示に従って実施した。インキュベーションの４日後に、細胞ブロスを遠心分離（７，０００rpm、ＧＳ３ローター、１５分、５℃）して細胞を除去し、上清を、Amicon8400という細胞（ＰＭ３０膜）およびウルトラフリー１５遠心濾過装置（Biomax-30K, Millipore, Bedford, MA, 米国）を用いた限外濾過により濃縮した。濃縮液（１０ml）を、溶離緩衝液として働く１０mM酢酸ナトリウム、pH５．０を用いた４０mlのSephadex G25 Superfineカラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, ドイツ国）で脱塩した。脱塩した試料を、２M（ＮＨ4）2ＳＯ4に溶かし、１mlのブチルセファロース４高速流動疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, ドイツ国）に直接装荷し、１０mM酢酸ナトリウム、pH５．０への（ＮＨ4）2ＳＯ4の２Mから０Mまでの線形勾配で溶出させた。フィターゼを通過液に溶出させ、濃縮し、１２０mlのSephacrylＳ−３００ゲル浸透クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, ドイツ国）に装荷した。真菌コンセンサスフィターゼおよび真菌コンセンサスフィターゼ７は、均質な対称ピークとして溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約９５％の純度であると示された。
【００７０】
実施例６
Hansenula polymorphaでの真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子ｆｃｐおよびその変異体の発現
H. polymorphaの形質転換に用いるフィターゼ発現ベクターを、コンセンサスフィターゼまたは変異体をコードするpBsk-fcpのEcoRIフラグメントをH. polymorpha発現ベクターpFPMT121の多重クローニング部位に挿入することによって構築したが、これは、ｕｒａ３選別マーカーおよびFMDプロモーターに基づく。ｆｃｐ遺伝子の５′末端をFMDプロモーターに、３′末端をMOXターミネーターに融合させた（Gellissen et at., 1996；欧州特許公開第０２９９ １０８Ｂ号明細書）。得られた発現ベクターを、pFPMTfcpおよびpBsk-fcp7と称した。
【００７１】
構築したプラスミドをE. coli内で増殖させた。当業界の標準的水準の操作を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。Gelissenら（１９９６）に記載されたとおりのコンピテント細胞の製造、および酵母の形質転換のための操作を用いて、発現プラスミドをオロチジン−５′−リン酸脱炭酸酵素（ｕｒａ３）を欠くH. polymorpha 株ＲＰ１１へと形質転換した。形質転換混合物を、グルコース２％および寒天１．８％を含むＹＮＢ（０．１４w/v％のDifco ＹＮＢおよび硫酸アンモニウム０．５％）に塗布し、３７℃でインキュベートした。４〜５日後に、それぞれの形質転換コロニーを採集し、上記の液体培地で３７℃で２日間増殖させた。次いで、この培養体のアリコートを用いて、グルコース２％を含有するＹＮＢ培地を有する新鮮なバイアルに接種した。選択培地で更に７回継代した後、発現ベクターは、酵母ゲノムに多量体の形態で組み込まれた。次いで、非選択液体培地（ＹＰＤ、グルコース２％、酵母抽出物１０ｇおよびペプトン２０ｇ）３ml中で更に２回培養することによって、有糸分裂的に安定した形質転換体が得られた。遺伝的に均質な組換え株を得るために、最後の安定化培養からのアリコートを選択プレートに塗布した。グルコースに代えてグリセリン２％を含有するＹＮＢでのフィターゼ発現の分析のために、一つのコロニーを単離して、ｆｍｄプロモーターを抑制解除した。真菌コンセンサスフィターゼの精製は、実施例５に記載のとおり実施した。
【００７２】
実施例７
Aspergillus nigerでの真菌コンセンサス遺伝子ｆｃｐおよびその変異体の発現ｆｃｐ遺伝子のプラスミドpBsk-fcp、またはｆｃｐ遺伝子の変異体の対応するプラスミドを鋳型として用いて、この遺伝子の開始コドンの上流にBspHI部位、および停止コドンの下流にEcoRV部位を導入した。Expand（登録商標）という高忠実度（High Fidelity）ＰＣＲキット（Boehringer Mannheim, Mannheim, ドイツ国）を、下記のプライマーとともに用いた：
【００７３】
プライマーＡｓｐ−１：
【００７４】
【表２】
【００７５】
ｆｃｐおよびｆｃｐ７のクローニングのためのプライマーＡｓｐ−２：
【００７６】
【表３】
【００７７】
提供者が記載したとおりに、反応を実施した。ＰＣＲで増幅したｆｃｐ遺伝子は、プライマーAsp-1によって導入された新たなBspHIという部位を開始コドンに有しており、このため、第二のアミノ酸残基であるグリシンがセリンで置換されていた。次いで、ＤＮＡフラグメントをBspHIおよびEcoRVで消化し、Aspergillus nigerのグルコアミラーゼプロモーター（ｇｌａＡ）の下流のNcoI部位、およびAspergillus nidulansトリプトファンＣターミネーター（ｔｒｐＣ）の上流のEcoRV部位に連結させた（Mullaney et al., 1985）。このクローニング段階の後、遺伝子を配列決定して、ＰＣＲによって導入された可能性がある欠陥を検出した。得られた発現プラスミドは、欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書の実施例９に記載されたように、pGLACベクターに基本的に相当し、Neurospora crassaのオロチジン−５′−リン酸脱炭酸酵素遺伝子（ｐｙｒ４）を選別マーカーとして含有していた。Aspergillus nigerの形質転換、およびコンセンサスフィターゼ遺伝子の発現を、欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書に記載されたとおりに実施した。真菌コンセンサスフィターゼを、実施例５に記載したとおりに精製した。
【００７８】
実施例８
真菌コンセンサスフィターゼの突然変異タンパク質の構築
A. niger、S. cerevisiaeまたはH. polymorphaにおける発現のための突然変異タンパク質を構築するために、真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子を含む対応する発現プラスミドを、位置指定突然変異誘発のための鋳型として用いた。突然変異は、Stratagene（La Jolla, CA, 米国）からの「quick exchange（登録商標）位置指定突然変異誘発キット」を用い、メーカーのプロトコルに従い、そして対応するプライマーを用いて導入した。実現したすべての突然変異、および対応するプライマーを表４に示した。望みの突然変異を有するクローンは、当業界に公知のＤＮＡ配列分析によって確認した。突然変異したフィターゼは、完全な遺伝子の配列決定によって確認した。
【００７９】
実施例９
コンセンサスフィターゼおよびその変異体のフィターゼ活性と最適温度の決定
フィターゼ活性は、基本的にはMitchellら（１９９７）が記載したとおりに決定した。活性は、フィチン酸０．５％（≒５mM）、酢酸ナトリウム２００mM、pH５．０を含有するアッセイ混合物中で測定した。３７℃で１５分のインキュベーション後、等量の１５％トリクロロ酢酸の添加によって反応を停止させた。放出されたリン酸塩は、アッセイ混合物１００μlをＨ2Ｏ ９００μl、ならびに０．６M Ｈ2ＳＯ4 １ml、アスコルビン酸２％およびモリブデン酸アンモニウム０．５％と混合することによって定量した。リン酸カリウムの標準溶液を参照として用いた。酵素活性１単位は、３７℃で毎分１μmolのリン酸塩を放出する酵素の量として定義した。タンパク質濃度は、Paceら（１９９５）に従って算出した２８０nmでの酵素の吸光係数を用いて決定した：真菌コンセンサスフィターゼ；１．１０１；真菌コンセンサスフィターゼ７；１．０６８。
【００８０】
pH最適曲線の場合は、精製した酵素を１０mM酢酸ナトリウム、pH５．０で希釈した。インキュベーションは、希釈したタンパク質のアリコートを、一連の異なる緩衝液（０．４Mグリシン／ＨＣｌ、pH２．５；０．４M酢酸／ＮａＯＨ、pH３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５；０．４Mイミダゾール／ＨＣｌ、pH６．０、６．５；０．４Mトリス／ＨＣｌ、pH７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中の等量の１％フィチン酸（≒１０mM）と混合することによって開始した。対照実験によって、混合段階によって、pHは僅かに影響されるにすぎないことが示された。インキュベーションは、上記のとおり、３７℃で１５分間実施した。
【００８１】
フィターゼの基質特異性を決定するため、アッセイ混合物中のフィチン酸を、５mM濃度のそれぞれのリン酸化合物と置き換えた。活性試験は、上記のとおり実施した。
【００８２】
最適温度を決定するため、酵素（１００μl）および基質溶液（１００μl）を、所与の温度で５分間プレインキュベーションした。基質溶液の酵素への添加によって、反応を開始させた。１５分のインキュベーションの後、トリクロロ酢酸で反応を停止させ、放出されたリン酸塩の量を測定した。
【００８３】
本来の真菌コンセンサスフィターゼの最適pHは、pH６．０〜６．５前後であった（７０U/mg）。Ｑ５０Ｔ突然変異の導入によって、最適pHは、pH６．０へと移動した（１３０U/mg）が、同じ位置でのロイシンとの置換により、pH５．５前後で最大活性が得られた（２１２U/mg）。Ｑ５０Ｇの交換では、pH６．０以上で活性の最適pHが得られた（図９を参照）。第５１位のチロシンをアスパラギンと交換したところ、pH５．０以下で活性の増大が得られた（図１０を参照）。特にＱ５０Ｌの突然変異によって、真菌コンセンサスフィターゼのフィチン酸に対する特異性が、劇的に増大した（図１１を参照）。
【００８４】
真菌コンセンサスフィターゼの最適温度（７０℃）は、コンセンサス配列を算出するのに用いた野生型フィターゼの最適温度（４５〜５５℃）より１５〜２５°高かった（表５および図８を参照）。
【００８５】
実施例１０
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による融点の決定
真菌コンセンサスフィターゼの展開温度を決定するために、Bruggerら（１９９７）が以前に発表したように示差走査熱量測定を行った。５０〜６０mg/mlの均質なフィターゼの溶液を試験に用いた。１０℃/分の一定した加熱速度を９０℃まで適用した。
【００８６】
測定した融点により、真菌コンセンサスフィターゼの野生型フィターゼと比較して、熱安定性が非常に改良されたことが明瞭に示された（表５および図１２を参照）。図１２は、真菌コンセンサスフィターゼ、およびその突然変異体Ｑ５０Ｌの融解プロフィールを示す。その共通する融点は、７８〜７９℃であると測定された。
【００８７】
参考文献
van den Burg, B., Vriend, G., Veltman, O.R., Venema & G., Eijsink, V.G.H. (1998), Engineering an enzyme to resist boiling （耐煮沸酵素の操作）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95, 2056-2060.
Akanuma, S., Yamagishi, A., Tanaka, N. & Oshima, T. (1998), Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution （B. subtilisの３−イソプロピルマレート脱水素酵素の熱安定性の実験的進化による連続的増大）, Prot. Sci. 7, 698-705.
Matthews, B.W. (1993), Structural and genetic analysis of protein stability （タンパク質の安定性の構造的および遺伝学的解析）, Annu. Rev. Biochem. 62, 139-160.
Serrano, L., Day, A.G. & Fersht, A.R. (1993), Step-wise mutation of barnase to binase. A procedure for engineering increased stability of proteins and an experimental analysis of the evolution of protein stability （バルナーゼからビナーゼへの段階的突然変異。タンパク質の安定性の上昇の操作と、タンパク質の安定性の進化の実験的解析とのための一手順）, J. Mol. Biol. 233, 305-312.
Matthews, B.W. (1987a), Genetic and structural analysis of the protein stability problem （タンパク質の安定性の問題の遺伝学的および構造的解析）,
Biochemistry 26, 6885-6888.
Sauer, R., Hehir, K., Stearman, R., Weiss, M., Jeitler-Nilsson, A., Suchanek, E. & Pabo, C. (1986), An engineered intersubunit disulfide enhances the stability and DNA binding of the N-terminal domain of λ-repressor（操作されたサブユニット間ジスルフィドは、λリプレッサーのＮ末端ドメインの安定性およびＤＮＡ結合を強化する）, Biochemistry 25, 5992-5999.
Margarit, I., Campagnoli, S., Frigerio, F., Grandi, G., Fillipis, V.D. & Fontana, A. (1992), Cumulative stabilizing effects of glycine to alanine substitutions in Bacillus subtilis neutral protease（Bacillus subtilis中性プロテアーゼにおけるグリシンからアラニンへの置換の累積的安定化作用）, Prot. Eng. 5, 543-550.
Matthews, B.W., Nicholson, H. & Becktel, W. (1987), Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding（折りたたまれていない状態のエントロピーを減少させる位置指定突然変異からの増大したタンパク質熱安定性）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 6663-6667.
Blaber, M., Lindstrom, J.D., Gassner, N., Xu, J., Heinz, D.W. & Matthews, B.W. (1993), Energetic cost and structural consequences of burying a hydroxyl group within the core of a protein determined from Ala->Ser and Val->Thr substitutions in T4 Lysozyme（Ｔ４リゾチームにおけるAla→SerおよびVal→Thr置換から決定された、タンパク質コア内のヒドロキシル基の埋設のエネルギーコストおよび構造的結果）, Biochemistry 32, 11363-11373.
Karpusas, M., Baase, W.A., Matsumura, M. & Matthews, B.W. (1989), Hydrophobic packing in T4 Lysozyme probed by cavity-filling mutants（キャビティ充填性突然変異体によって検証されたＴ４リゾチームにおける疎水性パッキング）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 8237-8241.
Munoz, V. & Serrano, L. (1995), Helix design, prediction and stability（らせんのデザイン、予測および安定性）, Curr. Opin. Biotechnol. 6, 382-386.
Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. & Okada, H. (1993), Stabilization of xylanase by random mutagenesis（ランダム突然変異によるキシラナーゼの安定化）, FEBS Lett. 316, 123-127.
Risse, B., Stempfer, G., Rudolph, R., Schumacher, G. & Jaenicke, R. (1992), Characterization of the stability effect of point mutations of pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum: protection of the native state by modulating coenzyme binding and subunit interaction（Lactobacillus plantarumからのピルビン酸オキシダーゼの点突然変異の安定化作用の特徴：補酵素結合およびサブユニット相互作用の調節による未変性状態の保護）, Prot. Sci. 1, 1710-1718.
Imanaka, T., Shibazaki, M. & Takagi, M. (1986), A new way of enhancing the thermostability of proteases（プロテアーゼの熱安定性を増大させる新たな方法）, Nature 324, 695-697.
Pantoliano, M.W., Landner, R.C., Brian, P.N., Rollence, M.L., Wood, J.F. & Poulos, T.L. (1987), Protein engineering of subtilisin BPN': enhanced stabilization through the introduction of two cysteines to form a disulfide bond（ズブチリシンＢＰＮ’のタンパク質操作：ジスルフィド結合を形成するための２システインの導入による安定性の増大）, Biochemistry 26, 2077-2082.
Steipe, B., Schiller, B., Plueckthun, A. & Steinbach, S. (1994), Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain（配列統計学は、タンパク質のドメインでの安定化突然変異を確実に予測する）, J. Mol. Biol. 240, 188-192.
Mitchell, D.B., Vogel, K., Weimann, B.J., Pasamontes, L. & van Loon, A.P.G.M. (1997), The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila（ヒスチジン酸性ホスファターゼのフィターゼサブファミリー：真菌であるAspergillus terreusおよびMyceliophthora thermophilaからの２種類の新規フィターゼの遺伝子の単離）, Microbiology 143, 235-252.
van Loon, A.P.G.M., Simoes-Nunes, C., Wyss, M., Tomschy, A., Hug, D., Vogel, K. & Pasamontes, L. (1997), A heat resistant phytase of Aspergillus fumigatus with superior performance in animal experiments. Phytase optimization and natural variability（動物実験で優れた性能を有するAspergillus fumigatusの耐熱性フィターゼ。フィターゼの最適化および自然変異性）, In Proceedings book of the workshop on plant phytate and phytases, Kluwer Academic Press.
Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Tessier, M. & van Loon, A.P.G.M. (1997), Cloning, purification and characterization of a heat stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus（真菌であるAspergillus fumigatusからの熱安定性フィターゼのクローニング、精製および特徴）, Appl. Environ. Microbiol. 63, 1696-1700.
Pasamontes, L., Haiker, M., Henriquez-Huecas, M., Mitchell, D.B. & van Loon, A.P.G.M. (1997a), Cloning of the phytases from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus（Emericella nidulansおよび好熱性真菌Talaromyces thermophilusからのフィターゼのクローニング）, Biochim. Biophys. Acta 1353, 217-223.
Piddington, C.S., Houston, C.S., Paloheimo, M., Cantrell, M., Miettinen-Oinonen, A., Nevalainen, H. & Ramsbosek, J. (1993), The cloning and sequencing of the genes encoding phytase (phy) and pH 2.5-optimum acid phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori（Aspergillus niger var. awamoriからのフィターゼ（ｐｈｙ）、およびpH２．５が最適の酸性ホスファターゼ（ａｐｈ）をコードする遺伝子のクローニングと配列決定）, Gene 133, 55-62.
van Hartingsveldt, W., van Zeiji, C.M.F., Harteveld, G.M., Gouka, R.J., Suykerbuyk, M.E.G., Luiten, R.G.M., van Paridon, P.A., Selten, G.C.M., Veenstra, A.E., van Gorcom, R.F.M. & van den Hondel, C.A.M.J.J. (1993), Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger（Aspergillus nigerのフィターゼコード遺伝子（phyA）のクローニング、特徴および過剰発現）, Gene 127, 87-94.
Gerber, P. and Mueller, K. (1995), Moloc molecular modeling software（Moloc分子モデル化ソフトウエア）, J. Comput. Aided Mol. Des. 9, 251-268.
Van Etten, R.L. (1982), Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase（ヒト前立腺の酸性ホスファターゼ：ヒスチジンホスファターゼ）, Ann. NY Acad. Sci. 390, 27-50.
Cosgrove, D.J. (1980), Inositol phosphates - their chemistry, biochemistry and physiology: studies in organic chemistry, chapter 4（イノシトールリン酸−それらの化学、生化学および生理学：有機化学の研究、第４章）, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New York.
Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, O. (1984), A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX（ＶＡＸのための配列解析プログラムの包括的セット）, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Purvis, I.J., Bettany, A.J.E., Santiago, T.C., Coggins, J.R., Duncan, K., Eason, R. & Brown, A.J.P. (1987), The effieciency of folding of some proteins is increased by controlled rates of translation in vivo（ある種のタンパク質の折りたたみの効率は、in vivoにおける翻訳速度の制御によって上昇する）, J. Mol. Biol. 193, 413-417.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed（分子クローニング：研究室向けマニュアル、第２版）., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Janes, M., Meyhack, B., Zimmermann, W. & Hinnem, A. (1990), The influence of GAP promoter variants on hirudine production, average plasmid copy number and cell growth in Saccharomyces cerevisiae（Saccharomyces cerevisiaeにおけるヒルジン生産、平均プラスミドコピー数および細胞増殖に対するＧＡＰプロモーター変異体の影響）, Curr. Genet. 18, 97-103.
Hinnen, A., Hicks, J.B. & Fink, G.R. (1978), Transformation of yeast（酵母における形質転換）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,1929-1933.
Sheman, J.P., Finck, G.R. & Hicks, J.B. (1986), Laboratory course manual for methods in yeast genetics（酵母の遺伝学の方法のための研究室向けコースマニュアル）, Cold Spring Harbor University.
Gellissen, G., Piontek, M., Dahlems, U., Jenzelewski, V., Gavagan, J.E., DiCosimo, R., Anton, D.I. & Janowicz, Z.A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst : coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene（生物触媒としての組換えHansenulla polymorpha：ホウレンソウグリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）およびS. cerevisiaeのカタラーゼＴ（ＣＴＴ１遺伝子の同時発現）, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54.
Mullaney, E.J., Hamer, J.E., Roberti, K.A., Yelton, M.M. & Timberlake, W.E. (1985), Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans（Aspergillus nidulansからのｔｒｐＣ遺伝子の一次構造）, Mol. Gen. Genet. 199, 37-46.
Pace, N.C., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. (1985), How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein（タンパク質のモル吸収係数を測定かつ予測する方法。 Prot. Sci. 4, 2411-2423.
Brugger, R., Mascarello, F., Augem, S., van Loon, A.P.G.M. & Wyss, M. (1997), Thermal denaturation of fungal phytases and pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry（示差走査熱量測定によって調べた真菌フィターゼとpH２．５の酸性ホスファターゼの熱変性）, In Proceedings book on the workshop on plant phytate and phytase, Kluwer Academic Press.
【００８８】
【表４】
【００８９】
【表５】
【００９０】
【表６】
【００９１】
【表７】
【００９２】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図２】図１の続きであり、公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図３】図２の続きであり、公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図４】図３の続きであり、公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図５】真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列を示す。
【図６】図５の続きであり、真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列を示す。
【図７】図６の続きであり、真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列を示す。
【図８】コンセンサス配列を算出するのに用いた真菌コンセンサスフィターゼおよびその他のフィターゼの最適温度を示す。
【図９】真菌コンセンサスフィターゼならびに突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０ＧのｐＨ依存活性特性を示す。
【図１０】真菌コンセンサスフィターゼの突然変異体Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｌと比較した、突然変異体Ｑ５０ＬおよびＹ５１Ｎ、ならびにＱ５０ＴおよびＹ５１ＮのｐＨ依存活性特性を示す。
【図１１】真菌コンセンサスフィターゼならびにその突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｇの基質特異性を示す。
【図１２】真菌コンセンサスフィターゼおよびその突然変異体Ｑ５０Ｔの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示す。
【従来の技術】
フィターゼ（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼ；ＥＣ３．１．３．８）は、フィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸エステル）をｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸とに加水分解する酵素であり、有用な飼料添加物であることが知られている。
【０００２】
フィターゼは、１９０７年に米のふすま中で最初に記載され〔Suzuki et al., Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Univ. 7, 495 (1907)〕、アスペルギルス属の一種からのフィターゼは、１９１１年に記載された〔Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10, 183-186 (1911)〕。フィターゼは、小麦のふすま、植物の種子、動物の腸、および微生物にも認められている〔Howsen and Davis, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382 (1983)；Lambrechts et al., Biotech. Lett. 14, 61-66 (1992)；Shieh and Ware, Appl. Microbiol., 16, 1348-1351 (1968)〕。
【０００３】
Aspergillus niger（ficuum）由来のフィターゼのクローニングおよび発現は、Gene, 127, 87-94 (1993)にVan Hartingsveldtらによって、また欧州特許公開第４２０ ３５８号明細書にも記載され、Aspergillus niger var. awamori由来のフィターゼのクローニングおよび発現は、Gene, 133, 55-62 (1993)にPiddingtonらによって記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
改良された特性を有するフィターゼのクローニング、発現および精製は、欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書に記載されている。しかし、特にその熱安定性に関して、更に改良されたフィターゼに対する需要が依然として存在することから、下記の方法を提供することが本発明の目的であるが、この方法は、フィターゼに限らず適用できる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、コンセンサスタンパク質を製造する方法であって、そのような方法は、下記の段階：
（ａ）公知の任意の標準的アラインメント（alignment）プログラムにより、定義されたタンパク質群の少なくとも３、好ましくは４のアミノ酸配列をアライン（align）させる段階と；
（ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるアミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれらの進化的類似度について比較する一方、対応する位置のアミノ酸の決定に用いられるアミノ酸の最小の類似度を定義するようなプログラムによって提供される類似度の程度を、より緊縮でない数に設定し、対応する位置で２のみの同一なアミノ酸から、コンセンサスタンパク質のためのアミノ酸を該プログラムが決定できるような方法でパラメータを設定するが、比較されるアミノ酸配列のうちに、残余の配列に対するよりもはるかに高い程度の類似度を相互に示す配列があるならば、これらの配列を、コンセンサスタンパク質のコンセンサス配列についての本方法と同じ方法で定義されたように決定されたそれらのコンセンサス配列によって表すか、またはそのような配列の数で１を除した票の重み（vote weight）を、これらの配列のそれぞれに割り当てる段階と；
（ｃ）定義された位置に共通のアミノ酸が該プログラムによって決定されない場合、比較に用いたすべての配列の任意のアミノ酸、好ましくはそのようなすべての配列で最高頻度のアミノ酸を選択するか、または実施例２に示した考慮に基づいてアミノ酸を選択する段階と；
（ｄ）コンセンサス配列を定義してあるのであれば、そのような配列を、好ましくは発現を行う生物のコドン頻度表を用いることによって、ＤＮＡ配列へと逆翻訳する段階と；
（ｅ）公知の方法により該ＤＮＡ配列を合成し、適切な発現ベクターに組み込んでか、またはそれ自体により、適切な宿主細胞を形質転換させるために用いる段階と；
（ｆ）形質転換された宿主細胞を適切な培養条件下で増殖させ、コンセンサスタンパク質を公知の方法によって該宿主細胞またはその培地から単離する段階と
を含む方法に関する。
【０００６】
本方法の好適な実施態様では、段階（ｂ）は、下記のとおりに定義することもできる。：
（ｂ）そのようなアラインメントにより同位置にあるアミノ酸を、公知の任意の標準的プログラムによりそれらの進化的類似度について比較する一方、そのようなプログラムによって提供される類似度の程度を、出来る限り最低の値に設定し、比較に用いた配列の少なくとも半数について最も類似するアミノ酸を、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列中の対応する位置について選択する段階。
【０００７】
この方法全体の好適な実施態様は、高度に相同である多数の配列からある配列を選択し、このタンパク質群のコンセンサス配列とは明らかに異なるアミノ酸残基のみを、中程度の緊縮条件下で算出して置き換えるが、中程度の緊縮条件下で本方法がアミノ酸を決定できないアラインメントのすべての位置で、好適な配列のアミノ酸を対象とする方法において認められる。
【０００８】
定義された位置のアミノ酸をそれらの進化的類似度について比較するのに用いるプログラムが、「ＰＲＥＴＴＹ」というプログラムであるような方法を提供することは、本発明の更なる目的である。定義されたタンパク質群が、フィターゼ群である、特に該フィターゼが、真菌起源のものであるような方法を提供することは、より詳細に、本発明の目的である。
【０００９】
宿主細胞が真核生物、特に真菌、好ましくはAspergillus属または酵母、好ましくはSaccharomyces属またはHansenula属起源のものであるような方法を提供することが、更に本発明の目的である。
【００１０】
そのような方法によって得ることができる、または得られたコンセンサスタンパク質、詳細には図５〜図７に示したアミノ酸配列を有するコンセンサスタンパク質、またはその変異型もしくは突然変異タンパク質を提供することも、本発明の目的である。「変異型」とは、本発明の文脈では、図５〜図７に示したアミノ酸配列を有するコンセンサスタンパク質であって、一ヶ所またはそれ以上の位置においてアミノ酸が欠失、付加、または一つもしくはそれ以上の他のアミノ酸で置換されている（ただし、得られる配列は、酵素活性（種類および特異的活性）、熱安定性、一定のpH範囲内での活性（pH安定性）のようなその基本的特性が有意に変えられていないタンパク質をもたらす）コンセンサスタンパク質を意味する。「有意に」とは、本文脈では、当業者が、変異型の特性は、図５〜図７のアミノ酸配列自体を有するコンセンサスタンパク質のそれとはなおも異なるが、非自明ではないとすると思われることを意味する。
【００１１】
突然変異タンパク質とは、本発明の文脈では、図５〜図７に示したコンセンサスタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸が置換され、それにより、更に改良された特性、例えば活性を有するコンセンサスタンパク質が得られることを意味する。そのような突然変異タンパク質は、欧州特許公開第９７８１０１７５．６号明細書に示された教示、例えばＱ５０Ｌ、Ｑ５０Ｔ、Ｑ５０Ｇ、Ｑ５０Ｌ−Ｙ５１Ｎ、Ｑ５０Ｔ−Ｙ５１ＮまたはＱ５０Ｌ−Ｑ５１Ｎに基づいて定義かつ調製することができる。「Ｑ５０Ｌ」とは、本文脈では、アミノ酸配列の第５０位で、アミノ酸Ｑがアミノ酸Ｌに置き換えられていることを意味する。
【００１２】
加えて、上記に定義されたコンセンサスタンパク質を含む食品、飼料または医薬組成物も、本発明の目的である。
【００１３】
本文脈で、「そのように定義されたタンパク質群の少なくとも３、好ましくは４のアミノ酸配列」とは、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列を生成するためのアラインメントおよび比較に、３、４、５、６ないし１２、２０、５０またはそれ以上の配列を用いることができることを意味する。「定義されたタンパク質群の配列」とは、αヘリックス、β−シートおよび−ターンが同位置にあるために、このような構造が、当業者が称するように、スーパーインポーザブルであるような、三次元構造にそのような配列が折りたたまれることを意味する。その上、これらの配列により、同じ型の生物学的活性、例えば定義された酵素クラス、例えばフィターゼの活性を示すようタンパク質が特徴付けられる。当業界では公知のとおり、そのような配列の一つの三次元構造は、そのような群の他の配列の構造のモデリングを可能とする。これをどのように実施できるかの一例は、本願の参考実施例に示す。本発明の文脈での「進化的類似度」とは、アミノ酸をそれらの構造的類似度について分類することによって、一つのアミノ酸をもう一つのアミノ酸に、全体的構造に対する影響は最少のまま置換することを可能とするスキームを意味し、それは例えば、当業界に公知の「ＰＲＥＴＴＹ」のようなプログラムによってなされるとおりである。語句「そのようなプログラムによって提供される類似度の程度を．．．より緊縮ではない数に設定する」とは、本発明の文脈では、本発明の実施に用いるプログラムでの類似度の程度を決定するパラメータの値を、このプログラムが、アミノ酸配列全体の位置の最大値に対する共通のアミノ酸を定義するのを可能とするような方法で選択することを意味し、例えばプログラムＰＲＥＴＴＹの場合、ＴＨＲＥＳＨＯＬＤに対しては２または３の値を、ＰＬＵＲＡＬＩＴＹに対しては２という値を選択することができる。更に、「そのような配列の数で１を除した票の重み」とは、本発明の文脈では、コンセンサス配列の決定に用いられる他の配列より高度の類似度を有する配列の群を定義する配列のみが、この群のすべての配列の数で１を除したものに等しい係数でそのような決定に寄与することを意味する。
【００１４】
前述のとおり、該プログラムが最も類似するアミノ酸を選択するのを可能としないのであれば、最も頻度の高いアミノ酸を選択し、これが不可能であるならば、当業者は、例えば以下に論じられているように、タンパク質の熱安定性を改良する特性が当業界に知られている、比較に用いたすべての配列からアミノ酸を選択するであろう。
【００１５】
Janecek, S. (1993), Process Biochem. 28, 435-44またはFersht, A.R. & Serrano, L. (1993), Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 75-83. Alber, T. (1989), Annu. Rev. Biochem. 58, 765-798またはMatthews, B.W. (1987), Biochemistry 26, 6885-6888. Matthews, B.W. (1991), Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 17-21.
【００１６】
酵素の安定性は、多くの工業的応用には決定的な因子である。したがって、酵素の安定性、好ましくは熱安定性を、合理的であるか（van den Burg et al., 1998）または非合理的（Akanuma et al., 1998）な手段によって、改良するために多くの試みがなされており、多少の成果を示したものもある。タンパク質の熱安定性に影響する力は、ペプチド鎖の適正な折りたたみに寄与するそれと同じである〔疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合、塩橋、配座歪み（Matthews, 1993）〕。その上、Matthewsら（１９８７）が示したとおり、折りたたまれていない状態の自由エネルギーも、タンパク質の安定性に影響する。タンパク質の安定性を高めることは、好都合な相互作用の数および強度を増加させ、不都合な相互作用の数および強度を減少させることを意味する。ジスルフィド結合を導入して（Sauer et al., 1986）グリシンをアラニン残基で置換するか、またはプロリン含量を増加させて、折りたたまれていない状態の自由エネルギーを減少させる（Margarit et al., 1992；Matthews, 1987a）ことが可能になっている。その他のグループは、タンパク質の安定性のための追加の水素結合または塩橋の重要性に着目したか（Blaber et al., 1993）、またはタンパク質内部のキャビティを満たして、埋められた疎水性表面積およびファンデルワールス相互作用を増大させることを試みた（Karpusas et al., 1989）。更に、二次構造の要素、特にαヘリックスの、例えばらせんのキャッピングの改善による安定化も研究された（Munoz & Serrano, 1995）。
【００１７】
しかしながら、タンパク質の安定性、好ましくは熱安定性を増大させると考えられるアミノ酸置換を特定するための、迅速かつ有望な戦略は皆無である。共通して、タンパク質の三次元構造については、アミノ酸置換がタンパク質の折りたたまれた状態を安定化する可能性のある、分子内の位置を見出す必要がある。この問題を回避する替わりの方法は、好熱性もしくは高度好熱性生物中に相同タンパク質を求めるか、またはランダム突然変異誘発法による、安定性を増大させるアミノ酸置換を探すかのいずれかである。この後者の可能性は、１０3〜１０4回の突然変異においてのみ成功するにすぎず、迅速なスクリーニングが可能である酵素に限定される（Arase et al., 1993；Risse et al., 1992）。これらすべての取組み法に対して、成功は可変的かつ予測不能であり、成功するとしても、熱安定性の増大は、ほとんど常に、きわめてわずかなものであった。
【００１８】
ここで、本発明者らは、タンパク質の熱安定性を改良する替わりの方法を提示する。Imanakaら（１９８６）は、相同タンパク質の比較により、タンパク質の安定性を増大させた最初の研究者の一員であった。彼等は、好熱性生物からのプロテアーゼと中温生物の相同なそれとの比較により、中温生物のプロテアーゼの安定性を増大させた。Serranoら（１９９３）は、２種類の相同な中温生物のＲＮアーゼのアミノ酸配列の比較により、より熱安定なＲＮアーゼを構築した。彼等は、この二者間で異なるすべての残基を個別に突然変異させ、複数の突然変異体で安定性を増大させる突然変異を組み合わせた。Pantolianoら（１９８９）、および特にSteipeら（１９９４）は、相同タンパク質のアラインメントのすべての位置で最高頻度のアミノ酸が、タンパク質の安定性に最も寄与すると示唆した。Steipeら（１９９４）は、免疫グロブリンの可変ドメインについてこれを証明したが、Pantolianoら（１９８９）は、より高い安定性を求めて改良するために選択した酵素の配列が単一分岐性であるズブチリシンの一次配列中の位置を探した。彼等の取組みの結果、ズブチリシンのＴmを１．８℃上昇させる置換Ｍ５０Ｆが得られた。
【００１９】
Steipeら（１９９４）は、免疫グロブリンの可変ドメインで、このドメインの一定の位置の最高頻度のアミノ酸残基を決定する統計的方法を用いるだけで、安定化突然変異を６０％以上の成功率で予測できることを証明した。この方法は、抗体の可変ドメインの安定化ばかりでなく、他のタンパク質のドメインについても有用な結果をもたらすであろうことも示唆された。しかし、この方法が、タンパク質全体に拡大できる可能性があることは、決して言及されなかった。その上、別個の位置のアミノ酸残基の頻度を計算するのに用いたプログラムに関して、あるいは本事例のように採点マトリックスを用いたか否かに関しては、何も述べられていない。
【００２０】
したがって、いわゆるコンセンサスタンパク質のほとんど全位置についてアミノ酸残基を計算し、原核または真核生物の発現系で発現させ得る完全な遺伝子をこの配列から合成する方法を含む、コンセンサスタンパク質を製造する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００２１】
本発明のＤＮＡ配列は、当業界に公知のタンパク質、例えばフィターゼをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列から出発して構築することができる〔配列情報については、上記の参考文献、例えば欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書、またはGenbank（Intelligenetics, California, 米国）、European Bioinformatics Institute（Hinston Hall, Cambridge, 英国）、ＮＢＲＦ（Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, 米国）およびVecbase（University of Wisonsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, 米国）のような配列データベースを参照。またはin vitro突然変異誘発の方法による数字に開示されている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）。Hurchinson およびEdgell〔J. Virol. 8, 181 (1971)〕が最初に概略を述べたように、そのような「位置指定突然変異誘発」のために広く用いられる戦略は、突然変異を導入すべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域への、所望のヌクレオチド置換体を有する合成オリゴヌクレオチドのアニーリングを包含する〔総説についてはSmith, Annu. Rev. Genet. 19, 423 (1985)を、改良された方法についてはStanssen et al., Nucl. Acid Res., 17, 4441-4454 (1989)の参考文献２〜６を参照〕。所与のＤＮＡ配列を突然変異させる、本発明の実施にも好適であるもう一つの可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによる突然変異誘発である。出発材料としてのＤＮＡは、当業界に公知である、例えばSambrookら（Molecular Cloning）に記載された方法によって、それぞれの株から単離することができる。株の情報については、例えば欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書、または下記に示した寄託機関を参照。Aspergillus niger〔ＡＴＣＣ９１４２〕、Myceliophthora thermophila〔ＡＴＣＣ４８１０２〕、Talaromyces thermophilus〔ＡＴＣＣ２０１８６〕およびAspergillus fumigatus〔ＡＴＣＣ３４６２５〕は、ブダペスト条約の規定により、下記の寄託番号でアメリカンタイプカルチャーセルコレクションに再寄託されている：それぞれ、ＡＴＣＣ７４３３７、ＡＴＣＣ７４３４０、ＡＴＣＣ７４３３８およびＡＴＣＣ７４３３９。しかし、本発明によるコンセンサスタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば欧州特許公開第７４７ ４８３号明細書に記載されているような合成法により、または当業界で公知の方法によっても調製することができることは理解される。
【００２２】
本発明の完全なＤＮＡ配列が得られたならば、当業界に公知である、例えばSambrookら〔前掲〕に記載された方法によって、それらをベクターに組み込んで、コードされたポリペプチドを適切な宿主系で過剰発現させることができる。しかし、当業者には、該ＤＮＡ配列自体を本発明の適切な宿主系を形質転換するのに用いて、コードされたポリペプチドを過剰発現させることができることも公知である。適切な宿主系は、例えば、Aspergillus属、例えばAspergillus niger〔ＡＴＣＣ９１４２〕もしくはAspergillus ficuum〔ＮＲＲＬ３１３５〕、またはTrichoderma属、例えばTrichoderma reeseiのような真菌、あるいはSaccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae、またはPichia属、例えばPichia pastoris、またはHansenula属、例えばHansenula polymorpha〔ＤＳＭ５２１５〕のような酵母、あるいは例えばPenら、Bio/Technology 11, 811-814 (1994)が記載したような植物である。当業者には、そのような微生物は、寄託機関、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）もしくはDeutche Sammlung feur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭ）、または雑誌「Industrial Property」〔（1991）１、２９〜４０ページ〕に列挙された他の寄託機関から入手できることが公知である。用い得る細菌は、例えば、E. coli、例えばBacillus subtilisのようなBacillus属、またはStreptomyces属、例えばStreptomyces lividansである〔例えばFEMS Microbiol. Letters, 114, 121 (1993)のAnneおよびMallaertを参照〕。用い得ると思われるE. coliは、E. coli Ｋ１２株、例えばＭ１５〔J. Bacteriol. 120, 466-474 (1974)にVillarejoらがＤＺ２９１として記載〕、ＨＢ１０１〔ＡＴＣＣ No.３３６９４〕またはE. coli ＳＧ１３００９〔Gottesman et al., J. Bacteriol. 148, 265-273 (1981)〕である。
【００２３】
真菌での発現に用い得るベクターは、当業界には公知であり、例えば欧州特許公開第４２０ ３５８号明細書に、あるいはCullenら〔Bio/Technology 5, 369-376 (1987)〕、Ward〔Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York (1991)〕、Upshallら〔Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)〕、Gwynneら〔Bio/Technology 5, 71-79 (1987)〕、またはPuntら〔J. Biotechnol. 17, 19-34 (1991)〕によって、酵母についてはSreekrishnaら〔J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)；Biochemistry 28, 4117-4125 (1989)〕、またはHitzemannら〔Nature 293, 717-722 (1981)〕によって、あるいは欧州特許公開第１８３ ０７０、１８３ ０７１、２４８ ２２７および２６３ ３１１号明細書に記載されている。E. coliでの発現に用い得る適切なベクターは、例えば、Sambrookら〔前掲〕、またはFiersら〔Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium, Soc. Franc. de Microbiol., Paris, (Durand et al., eds.), pp.680-697〕、もしくはBujardら〔Methods in Enzymology, eds. Wu and Grossmann, Academic Press, Inc. Vol. 155, 416-433 (1987)〕、およびSteuberら〔Immunological Methods, eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152 (1990)〕によって言及されている。Bacillusでの発現に用い得るベクターは、当業界に公知であり、例えば、欧州特許公開第４０５ ３７０号明細書に、YansuraおよびHennerによってProcd. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)に、Meth. Enzymol. 185, 199-228 (1990)、または欧州特許公開特許第２０７ ４５９号明細書に記載されている。H. polymorphaでの発現に用い得るベクターは、当業界に公知であり、例えばGellissen et al., Biotechnology 9, 291-295 (1991)に記載されている。
【００２４】
そのようなベクターは、調節要素、例えばプロモーターを既に保有しているか、または本発明のＤＮＡ配列は、そのような要素を含むように操作することができるかのいずれかである。用い得る適切なプロモーター要素は、当業界に公知であり、例えば、Trichoderma reeseiに対してはｃｂｈ１〔Haarki et al., Biotechnology 7, 596-600 (1989)〕またはｐｋｉ１〔Schindler et al., Gene 130, 271-275 (1993)〕プロモーターであり、Aspergillus oryzaeに対してはａｍｙプロモーター〔Christensen et al., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987)；Christensen et al., Biotechnology 6, 1419-1422 (1988)；Tada et al., Mol. Gen. Genet. 229, 301 (1991)〕であり、Aspergillus nigerに対してはｇｌａＡ〔Cullen et al., Bio/Technology 5, 369-376 (1987)；Gwynne et al., Bio/Technology 5, 713-719 (1987)；Ward, Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 83-106 (1991)〕、ａｌｃＡ〔Gwynne et al., Bio/Technology 5, 718-719 (1987)〕、ｓｕｃ１〔Boddy et al., Curr. Genet. 24, 60-66 (1993)〕、ａｐｈＡ〔MacRae et al., Gene 71, 339-348 (1988)；MacRae et al., Gene 132, 193-198 (1993)〕、ｔｐｉＡ〔McKnight et al., Cell 46, 143-147 (1986)；Upshall et al., Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)〕、ｇｐｄＡ〔Punt et al., Gene 69, 49-57 (1988)；Punt et al., J. Biotechnol. 17, 19-37 (1991)〕およびｐｋｉＡ〔de Graaf et al., Curr. Genet. 22, 21-27 (1992)〕プロモーターである。酵母での発現に用い得る適切なプロモーター要素は、当業界に公知であり、例えばｐｈｏ５プロモーター〔Vogel et al., Mol. Cell. Biol. 2050-2057 (1989)；Rudolf and Hinnen, Proc. Natl. Acal. Sci., 84, 1340-1344 (1987)〕であるか、またはSaccharomycesでの発現にはｇａｐプロモーターであり、Pichia pastorisに対しては、例えばａｏｘ１プロモーター〔Koutz et al. Yeast 5, 167-177 (1989)；Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)〕、またはH. polymorphaについてはＦＭＤプロモーター〔Hollenberg et al., 欧州特許公開第０ ２９９ １０８号明細書〕もしくはＭＯＸプロモーター〔Ledeboer et al., Nucleic Acids Res. 13, 3063-3082 (1985)〕である。
【００２５】
したがって、本発明のＤＮＡ配列を含む、好ましくは細菌または真菌または酵母宿主での該ＤＮＡ配列の発現のためのベクター、およびこれにより形質転換された細菌または真菌または酵母宿主も、本発明の目的である。
【００２６】
Hansenula属でのタンパク質、好ましくは本発明のコンセンサスフィターゼのようなフィターゼの高度な発現を可能とする系であって、そのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列のコドンが、発現に用いられる生物、例えば本事例でのような酵母のコドン頻度表に基づいて選択され（例えば実施例３を参照）、場合により、シグナル配列のためのコドンが、実施例３での特定の事例について記載されたような方式で選択されている系を提供することも本発明の目的である。これは、コドン頻度表が、定義されたタンパク質群のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に用いられるコドンに基づいて作成されることを意味する。そうして、シグナル配列のＤＮＡ配列の設定のためのコドンが、発現に用いられる宿主細胞のコドン頻度表から選択され、それによって、両頻度表の同等の頻度のコドンが常に用いられる。
【００２７】
そのようなＤＮＡ配列を、適切な培地中の適切な宿主細胞で発現させたら、コードされるタンパク質を、該タンパク質が培地中に分泌される場合は培地から、またはそのようなタンパク質が細胞内に存在する場合は、タンパク質精製の分野でに公知であるか、もしくはフィターゼの場合は例えば欧州特許公開第４２０ ３５８号明細書に記載された方法によって、宿主生物から単離することができる。したがって、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、上記のように形質転換された細菌または宿主細胞を適切な培養条件下で培養し、それからポリペプチドを回収することを特徴とする方法、そしてそのような方法によって製造されたポリペプチド、または本発明のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドも、本発明の目的である。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、一度得られれば、それらを農業において有用としているその特性について特徴付けることができるが、それには、当業界に公知であり、例えばSimonsら〔Br. J. Nutr., 64, 525-540 (1990)〕、Scheonerら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991)〕、Vogt〔Arch. Gefluegelk. 56, 93-98 (1992)〕、Jongbloedら〔J. Anim. Sci. 70, 1159-1168 (1992)〕、Perneyら〔Poultry Sci. 72, 2106-2114 (1993)〕、Farrellら〔J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69, 278-283 (1993)〕、Brozら〔Br. Poultry Sci. 35, 273-280 (1994)〕およびDuengelhoefら〔Animal Feed Sci. Technol. 49, 1-10 (1994)〕が記載したアッセイも用いることができる。
【００２９】
一般に、本発明のポリペプチドは、特定の応用分野に限定されることなく、例えばフィターゼの場合は、フィチン酸のようなイノシトールポリリン酸エステルのイノシトールと無機リン酸への変換に用いることができる。
【００３０】
その上、本発明のポリペプチドは、医薬組成物または複合食品もしくは飼料の製造方法であって、このような組成物の成分を本発明の１種類またはそれ以上のポリペプチドと混合する方法に用いることができる。したがって、本発明の１種類またはそれ以上のポリペプチドを含む複合食品もしくは飼料または医薬組成物も、本発明の目的である。当業者は、それらの製造法に精通している。そのような医薬組成物または複合食品もしくは飼料は、そのような目的に一般的に用いられ、当業界の技術水準に公知である添加物または成分を更に含むことができる。
【００３１】
更に、動物の厩肥中のフィチン酸の濃度を低下させる方法であって、飼料に含まれるフィチン酸をイノシトールと無機リン酸とに変換するのに充分な量のこのような飼料組成物を動物に摂取させることを特徴とする方法を提供することも、本発明の目的である。
【００３２】
本発明をより詳しく説明する前に、表、および添付の図の説明を以下に記載する。
【００３３】
表１：用いた真菌フィターゼのアミノ酸配列の票の重み。真菌フィターゼのコンセンサス配列を算出するのに用いた票の重みを示す。
【００３４】
表２：真菌フィターゼの相同性。アラインメントに用いたフィターゼのアミノ酸配列を、標準的パラメータを用いたプログラムＧＡＰ（ＧＣＧプログラムパッケージ、９；Deveruxら、1984）によって比較した。比較は、非常に多様なシグナルペプチドを欠くアラインメント（図１〜図４の凡例を参照）にも用いた配列の一部に限定した。対角線の上下の数は、それぞれアミノ酸の同一度および類似度を表す。
【００３５】
表３：算出に用いたフィターゼに対する真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列の相同性。すべてのフィターゼのアミノ酸配列を、プログラムＧＡＰ（ＧＣＧプログラムパッケージ、９．０）を用いて真菌コンセンサスフィターゼの配列と比較した。やはり、比較は、アラインメントに用いた配列の一部に限定した。
【００３６】
表４：真菌コンセンサスフィターゼへの単一突然変異の導入に用いたプライマー。各突然変異の導入には、所望の突然変異を有する２種類のプライマーが必要であった（実施例８を参照）。変化させたトリプレットを太字で強調してある。
【００３７】
表５：最適温度と、真菌コンセンサスフィターゼ、ならびにA. fumigatus、A. niger、A. nidulansおよびM. thermophila由来のフィターゼのＴm値。最適温度は、図８から採った。Ｔm値は、実施例１０に記載し、図１２に示したように、示差走査熱量測定によって決定した。
【００３８】
図１〜図４：公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出。文字は、一文字コードでのアミノ酸残基を表す。下記の配列をアラインメントに用いた：Aspergilus terreus ９Ａ−１からのｐｈｙＡ（Mitchell et al., 1997；アミノ酸（ａａ）２７から）、Aspergillus terreus ｃｂｓ１１６．４６からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus niger var. awamoriからのｐｈｙＡ（Piddington et al., 1993；ａａ２７から）、Aspergillus niger Ｔ２１３からのｐｈｙＡ；ａａ２７から、Aspergillus niger ＮＲＲＬ３１３５株からのｐｈｙＡ（van Hartingsveldt et al., 1993；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ１３０７３からのｐｈｙＡ（Pasamontes et al., 1997b；ａａ２５から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２７２２からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ５８１２８からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ２６９０６からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ２７から）、Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２２３９からのｐｈｙＡ（van Loon et al., 1997；ａａ３０から）、Aspergillus nidulansからのｐｈｙＡ（Pasamontes et al., 1997a；ａａ２５から）、Talaromyces thermophilusからのｐｈｙＡ（Pasamontes et al., 1997a；ａａ２４から）、およびMyceliophthora thermophilaからのｐｈｙＡ（Mitchell et al., 1997；ａａ１９から）。アラインメントは、プログラムＰＩＬＥＵＰを用いて算出した。ギャップの位置は、手動で精緻化した。所与の位置におけるアラインメント中の、大文字のアミノ酸残基は、コンセンサス残基を確立するアミノ酸の連携（coalition）に属する。太字で、算出したコンセンサス配列の下に、最終的に構築された真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列（Ｆｃｐ）を示す。算出したコンセンサス配列中のギャップは、実施例２に述べた原則に従って、手動で充填した。
【００３９】
図５〜図７：真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列。算出したアミノ酸配列（図１〜図４）を、プログラムＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（Devereux et al., 1984）、および高度に発現される酵母遺伝子のコドン頻度表（ＧＣＧプログラムパッケージ、９．０）を用いてＤＮＡ配列へと変換した。A. terreus ｃｂｓからのフィターゼのシグナルペプチドをＮ末端に融合させた。太字の塩基は、遺伝子を生成するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を表す。それぞれのオリゴヌクレオチドの名称を配列の上下に記す。下線を付した塩基は、遺伝子の開始および停止コドンを表す。斜体で書いた塩基は、導入される二つのＥｃｏＲＩ部位を示す。
【００４０】
図８：コンセンサス配列を算出するのに用いた真菌コンセンサスフィターゼおよびその他のフィターゼの最適温度。最適温度の決定には、３７〜８５℃の一連の温度でフィターゼ標準アッセイを実施した。用いたフィターゼは、実施例５に従って精製した。▽；真菌コンセンサスフィターゼ、▼；A. fumigatus １３０７３フィターゼ、□A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ、◯；A. nidulansフィターゼ、■；A. terreus ９Ａ−１フィターゼ、●；A. terreus ｃｂｓフィターゼ。
【００４１】
図９：真菌コンセンサスフィターゼならびに突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０ＧのpH依存活性特性。フィターゼ活性は、異なるpH値の適切な緩衝液での標準的アッセイ（実施例９を参照）を用いて決定した。プロットａ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（▽）、Ｑ５０Ｔ（▼）およびＱ５０Ｇ（◯）に対する真菌コンセンサスフィターゼ（●）の比較を活性の％で示す。プロットｂ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（●）およびＱ５０Ｔ（▽）に対する真菌コンセンサスフィターゼ（◯）の比較を、H. polymorphaで発現させた精製酵素の比活性を用いて示す。
【００４２】
図１０：真菌コンセンサスフィターゼの突然変異体Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｌと比較した、突然変異体Ｑ５０ＬおよびＹ５１ＮならびにＱ５０ＴおよびＹ５１ＮのpH依存活性特性。フィターゼ活性は、異なるpH値の適切な緩衝液での標準的アッセイ（実施例９を参照）を用いて決定した。グラフａ）は、突然変異体Ｑ５０Ｌ（◯）に対する突然変異Ｙ５１Ｎ（●）の影響を示す。グラフｂ）は、突然変異体Ｑ５０Ｔ（◯）に対する同じ突然変異（●）の影響を示す。
【００４３】
図１１：真菌コンセンサスフィターゼならびにその突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｇの基質特異性。棒は、様々な公知の天然および合成リン酸化化合物とともにフィチン酸（１００％）を用いた活性と比較した相対活性を表す。
【００４４】
図１２：真菌コンセンサスフィターゼおよびその突然変異体Ｑ５０Ｔの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）。タンパク質の試料を、約５０〜６０mg/mlに濃縮し、１０mM酢酸ナトリウム（pH５．０）に対して徹底的に透析した。１０℃/分の一定した加熱速度を９０℃まで適用した。コンセンサスフィターゼＱ５０ＴのＤＳＣ（上のグラフ）は、７８．９℃の融解温度を生じたが、これは、真菌コンセンサスフィターゼの融点（７８．１℃、下のグラフ）とほぼ同一である。
【００４５】
【実施例】
参考例
A. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの相同性のモデリング
A. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼのアミノ酸配列を、Ｘ線結晶学によって三次元構造を決定しておいたA. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼの配列と比較した（図１〜図４を参照）。
【００４６】
A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ、A. fumigatusフィターゼおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの多重アミノ酸配列アラインメントを、プログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（ウィスコンシンパッケージバージョン８、１９９４年９月のためのプログラムメニュー、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, 米国 53711）で計算した。A. fumigatusフィターゼおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの三次元モデルは、A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼの構造を鋳型として用い、それぞれA. fumigatusおよびA. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼのアミノ酸の配列アラインメントに従って、A. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼのアミノ酸を交換することによって構築した。モデルの構築およびエネルギー最適化は、プログラムＭｏｌｏｃ（Gerber and Mueller, 1995）を用いることによって実施した。新たな挿入／欠失以外そして、活性部位から離れたループ領域では、Ｃ−α位を固定したままにした。
【００４７】
外部ループでは、初めの結晶構造に対するモデル化した構造の僅かな差のみを認めることができた。更に、Pseudomonas sp.の細菌のフィターゼ、および決定された限りでA. niger ＮＲＲＬ３１３５フィターゼ（Cosgrove, 1980）によってフィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸）の分解経路で主として生じる、異なる基質分子を、各フィターゼの構造の活性部位のキャビティ内に、構築し、形成した。これらの基質をそれぞれ、ヒスチジン酸ホスファターゼについて提唱された仮説的な結合モード（Van Etten, 1982）に配向させた。切断され易いリン酸基を、触媒作用に必須の第５９位ヒスチジンへと配向させて、共有結合リン酸化酵素の中間体を形成させた。切断後に第３３９位アスパラギン酸によってプロトン化される基質リン酸エステル結合の酸素を、プロトン供与体へと配向させた。基質の残りの構造部分はもとより、周囲の活性部位残基の配座弛緩も、プログラムＭｏｌｏｃによるエネルギー最適化によって実施した。
【００４８】
構造モデルに基づき、活性部位のキャビティ内を指し示す残基を特定した。これらの位置の半数以上（６０％）が、これら３種類のフィターゼ間で同一であったが、ほとんどの位置は保存されていた（図１〜図４）。この所見は、追加の４種類のフィターゼの配列に拡張できると思われる（A. nidulans、A. terreus９Ａ１株、Talaromyces thermophilus、Myceliophthora thermophila）。
【００４９】
実施例１
真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメント
標準的パラメータ（ギャップ形成ペナルティー１２、ギャップ拡大ペナルティー４）を有する配列分析パッケージリリース９．０（Devereux et al., 1984）からのプログラムＰＩＬＥＵＰを用いて、アラインメントを計算した。ギャップの位置は、テキストエディターを用いて精緻化した。シグナル配列なしの下記の配列（図１〜図４を参照）を用いて、下記のアミノ酸（ａａ）から出発してアラインメントを実施した：
【００５０】
Aspergillus terreus ９Ａ−１、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（Mitchell et al., 1997）、
Aspergillus terreus ｃｂｓ１１６．４６、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus niger var. awamori、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（Piddington et al., 1993）、
Aspergillus niger Ｔ２１３、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子、
Aspergillus niger ＮＲＲＬ３１３５、ａａ２７からのｐｈｙＡ遺伝子（van Hartingsveldt et al., 1993）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ１３０７３、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子（Pasamontes et al., 1997）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２７２２、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ５８１２８、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ２６９０６、ａａ２６からのｐｈｙＡ遺伝子(van Loon et al., 1997)、
Aspergillus fumigatus ＡＴＣＣ３２２３９、ａａ３０からのｐｈｙＡ遺伝子（van Loon et al., 1997）、
Aspergillus nidulans、ａａ２５からのｐｈｙＡ遺伝子（Roche Nr.R1288、Pasamontes at al., 1997a）、
Talaromyces thermophilus ＡＴＣＣ２０１８６、ａａ２４からのｐｈｙＡ遺伝子（Pasamontes et al., 1997a）、
Myceliophthora thermophila、ａａ１９からのｐｈｙＡ遺伝子（Mitchell et al., 1997）。
【００５１】
表２は、上記のフィターゼ配列の相同性を示す。
【００５２】
実施例２
真菌コンセンサスフィターゼのアミノ酸配列の計算
実施例１の精緻化したアラインメントをインプットとして用い、配列分析パッケージリリース９．０（Devereux et al., 1984）からのプログラムＰＲＥＴＴＹによって、コンセンサス配列を計算した。ＰＲＥＴＴＹは、配列を、それらのカラムをアラインさせて印刷し、アラインメントのためのコンセンサス配列を示すことができる。アラインさせたフィターゼのアミノ酸配列間の類似度を考慮する票の重みを、すべての配列に割り当てた。一つの配列サブグループ（同種であるが異なる株）からのすべてのフィターゼ、例えばA. fumigatusからのすべてのフィターゼのアミノ酸配列の、選出に対する結びついた影響力が１に設定されるように票の重みを設定したが、これは、各配列が、株の配列数で１を除した値で寄与することを意味する（表１を参照）。この手段によって、非常に類似したアミノ酸配列、例えばA. fumigatusの異なる株からのフィターゼのアミノ酸配列が、計算されるコンセンサス配列に大きな影響を及ぼすのを防ぐことができた。
【００５３】
プログラムＰＲＥＴＴＹは、下記のパラメータで開始させた：それ未満ではコンセンサスがない票数を定義する相対多数（plurality）を２．０に設定した。閾値は、それ未満ではあるアミノ酸残基が残基の連携（coalition）のための有効票とならない可能性がある評点マトリックスの値を決定し、２に設定した。ＰＲＥＴＴＹは、ペプチドについてのPretty Pep. Cmpというコンセンサス評点マトリックスを用いた。
【００５４】
アラインメントの１０ヶ所の位置（第４６、６６、８２、１３８、１６２、２３６、２７６、２７９、２８０、３０８位；図１〜図４）に対しては、プログラムがコンセンサス残基を決定できず、下記の規則に従って手動で満たした：最高頻度の残基が存在するならば、この残基を選択し（第１３８、２３６、２８０位）；化学的に類似するか、または等価である優勢な残基群が出現したならば、最高頻度のか、もしくはそれが得られないならばこの群の一つの残基を選択した（第４６、６６、８２、１６２、２７６、３０８位）。優勢な残基も優勢な群も存在しないならば、タンパク質の安定性に対する影響に関する一般的な仮定に従って、出現する残基の一つを選択した（第２７９位）。その他の８ヶ所（第１３２、１７０、２０４、２１１、２７５、３１７、３８４、４４７；図１〜図４）は、プログラムが選択したアミノ酸残基ではなく、通常は、プログラムが選択した残基と同じ頻度で出現するアミノ酸で満たされた。殆どの場合、この補正によって、３種類のA. niger配列の僅かな過小評価（票の重みの合計：０．９９）は除去された。
【００５５】
表３は、計算に用いたフィターゼ配列に対する計算された真菌のコンセンサスフィターゼアミノ酸配列の相同性を示す。
【００５６】
実施例３
真菌のコンセンサスフィターゼアミノ酸配列のＤＮＡ配列への変換
A. terreus ｃｂｓ１１６．４６フィターゼの初めの２６アミノ酸残基をシグナルペプチドとして用い、したがって、すべてのコンセンサスフィターゼのＮ末端と融合させた。この伸長のために、本発明者らは、対応するＤＮＡ配列を算出する特別の方法を用いた。Purvisら（１９８７）は、遺伝子への稀有コドンの組込みは、タンパク質の折りたたみの効率に影響を有すると提唱した。したがって、少なくとも、真菌コンセンサスフィターゼに用いた、タンパク質の分泌に非常に重要であるが、S. cerevisiaeのコドン使用へと転換されるA. terreus ｃｂｓ１１６．４６のシグナル配列中の稀有コドンの分布を、S. cerevisiaeでの発現のために生成される新たなシグナル配列中に移転した。タンパク質の残りの部分については、本発明者らは、ＧＣＧプログラムパッケージから得られた高度に発現されるS. cerevisiae遺伝子のコドン頻度表を用いて、算出されたアミノ酸配列をＤＮＡ配列へと翻訳した。
【００５７】
得られたｆｃｐ遺伝子の配列を図５〜図７に示す。
【００５８】
実施例４
真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子の構築およびクローニング
真菌コンセンサスフィターゼの算出されたＤＮＡ配列を、センスおよびアンチセンス鎖の配列を交互に用いて、８５bpのオリゴヌクレオチドへと分割した。オリゴヌクレオチドはすべて、対向する鎖のその前および後のオリゴヌクレオチドと２０bpずつ重複する。Microsynth, Balgach （スイス国）から購入し、ＰＡＧＥで精製した形態で得られた全プライマーの位置を図５〜図７に示す。
【００５９】
３回のＰＣＲ反応で、合成されたオリゴヌクレオチドを遺伝子全体へと構成した。ＰＣＲには、Boehringer Mannheim（Boehringer Mannheim, Mannheim, ドイツ国）からのHigh Fidelity Kit、およびAMS Biotechnology (Europe) Ltd. （Lugano, スイス国）からのサーモサイクラー（thermocycler）The Protokol（登録商標）を用いた。
【００６０】
オリゴヌクレオチドＣＰ−１〜ＣＰ−１０（ミックス１、図５〜図７）を、各オリゴヌクレオチドあたり０．２pmol/μlの濃度に混合した。ＣＰ−９〜ＣＰ−２２を用いて、第二のオリゴヌクレオチド混合物（ミックス２）を調製した（各オリゴヌクレオチドあたり０．２pmol/μl）。加えて、４種類の短いプライマーをＰＣＲ反応に用いた：
【００６１】
【表１】
ＰＣＲ反応ａ：
ミックス１を１０μl（各オリゴヌクレオチド２．０pmol）
ヌクレオチド２μl（各ヌクレオチド１０mM）
プライマーＣＰ−ａ２μl（１０pmol/μl）
プライマーＣＰ−ｃ２μl（１０pmol/μl）
ＰＣＲ緩衝液１０．０μl
ポリメラーゼ混合物０．７５μl
Ｈ2Ｏ７３．２５μl
【００６３】
ＰＣＲ反応ｂ：
ミックス２を１０μl（各オリゴヌクレオチド２．０pmol）
ヌクレオチド２μl（各ヌクレオチド１０mM）
プライマーＣＰ−ｂ２μl（１０pmol/μl）
プライマーＣＰ−ｅ２μl（１０pmol/μl）
ＰＣＲ緩衝液１０．０μl
ポリメラーゼ混合物０．７５μl（２．６Ｕ）
Ｈ2Ｏ７３．２５μl
【００６４】
ＰＣＲ反応ａおよびｂのための反応条件：
段階１：４５℃で２分
段階２：７２℃で３０秒
段階３：９４℃で３０秒
段階４：５２℃で３０秒
段階５：７２℃で１分
段階３〜５は、４０回反復した。
【００６５】
ＰＣＲ生成物（６７０および９０５bp）を、アガロースゲル電気泳動（０．９％アガロース）とその後のゲル抽出（ＱＩＡＥＸ IIゲル抽出キット、Qiagen, Hilden, ドイツ国）とによって精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応ｃに用いた。
【００６６】
ＰＣＲ反応ｃ：
反応ａのＰＣＲ生成物６μl（≒５０ng）
反応ｂのＰＣＲ生成物６μl（≒５０ng）
プライマーＣＰ−ａ２μl（１０pmol/μl）
プライマーＣＰ−ｅ２μl（１０pmol/μl）
ＰＣＲ緩衝液１０．０μl
ポリメラーゼ混合物０．７５μl（２．６Ｕ）
Ｈ2Ｏ７３．２５μl
【００６７】
ＰＣＲ反応ｃのための反応条件：
段階１：９４℃で２分
段階２：９４℃で３０秒
段階３：５５℃で３０秒
段階４：７２℃で１分
段階２〜４は、３１回反復した。
【００６８】
得られたＰＣＲ生成物（１．４kb）を、上記のとおり精製し；EcoRIで消化し；EcoRIで消化し、脱リン酸化したpBsk(-)ベクター（Stratagene, La Jolla, CA, 米国）に連結した。連結混合物１μlを用いて、E. coliXL-１コンピテント細胞（Stratagene, La Jolla, CA, 米国）を形質転換した。標準的操作はすべて、Sambrookら（１９８７）が記載したとおりに実施した。構築された真菌コンセンサスフィターゼの遺伝子（ｆｃｐ）は、配列決定（プラスミドpBsk-fcp）によって確認した。
【００６９】
実施例５
Saccharomyces cerevisiaeでの真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）およびその変異体の発現、ならびに培養上清からのそれらの精製
Saccharomyces cerevisiaeの発現ベクターであるpYES2（Invitrogen, San Diego, CA, 米国）の発現カセットのEcoRI部位に連結したか、またはJanesら（１９９０）が記載したような短縮ＧＡＰＦＬ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）プロモーターとｐｈｏ５ターミネーターとの間でサブクローニングしたプラスミドpBsk-fcpから、真菌のコンセンサスフィターゼ遺伝子を単離した。遺伝子が正しく配向されていることを、ＰＣＲによって確認した。S. cerevisiaeの株、例えばＩＮＶＳｃＩ（Invitrogen, San Diego, CA, 米国）の形質転換を、Hinnen ら（１９７８）に従って実施した。ＧＡＰＦＬプロモーターの制御下でフィターゼ遺伝子を宿す単一コロニーを採集し、選別培地（ＳＤウラシル、Sherman et al., 1986）５ml中、３０℃で、激しく撹拌しながら（２５０rpm）１日培養した。次いで、この予備培養物を、ＹＰＤ培地（Sherman et al., 1986）５００mlに加え、同じ条件下で増殖させた。gal１プロモーターの導入は、メーカーの指示に従って実施した。インキュベーションの４日後に、細胞ブロスを遠心分離（７，０００rpm、ＧＳ３ローター、１５分、５℃）して細胞を除去し、上清を、Amicon8400という細胞（ＰＭ３０膜）およびウルトラフリー１５遠心濾過装置（Biomax-30K, Millipore, Bedford, MA, 米国）を用いた限外濾過により濃縮した。濃縮液（１０ml）を、溶離緩衝液として働く１０mM酢酸ナトリウム、pH５．０を用いた４０mlのSephadex G25 Superfineカラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, ドイツ国）で脱塩した。脱塩した試料を、２M（ＮＨ4）2ＳＯ4に溶かし、１mlのブチルセファロース４高速流動疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, ドイツ国）に直接装荷し、１０mM酢酸ナトリウム、pH５．０への（ＮＨ4）2ＳＯ4の２Mから０Mまでの線形勾配で溶出させた。フィターゼを通過液に溶出させ、濃縮し、１２０mlのSephacrylＳ−３００ゲル浸透クロマトグラフィーカラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, ドイツ国）に装荷した。真菌コンセンサスフィターゼおよび真菌コンセンサスフィターゼ７は、均質な対称ピークとして溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約９５％の純度であると示された。
【００７０】
実施例６
Hansenula polymorphaでの真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子ｆｃｐおよびその変異体の発現
H. polymorphaの形質転換に用いるフィターゼ発現ベクターを、コンセンサスフィターゼまたは変異体をコードするpBsk-fcpのEcoRIフラグメントをH. polymorpha発現ベクターpFPMT121の多重クローニング部位に挿入することによって構築したが、これは、ｕｒａ３選別マーカーおよびFMDプロモーターに基づく。ｆｃｐ遺伝子の５′末端をFMDプロモーターに、３′末端をMOXターミネーターに融合させた（Gellissen et at., 1996；欧州特許公開第０２９９ １０８Ｂ号明細書）。得られた発現ベクターを、pFPMTfcpおよびpBsk-fcp7と称した。
【００７１】
構築したプラスミドをE. coli内で増殖させた。当業界の標準的水準の操作を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。Gelissenら（１９９６）に記載されたとおりのコンピテント細胞の製造、および酵母の形質転換のための操作を用いて、発現プラスミドをオロチジン−５′−リン酸脱炭酸酵素（ｕｒａ３）を欠くH. polymorpha 株ＲＰ１１へと形質転換した。形質転換混合物を、グルコース２％および寒天１．８％を含むＹＮＢ（０．１４w/v％のDifco ＹＮＢおよび硫酸アンモニウム０．５％）に塗布し、３７℃でインキュベートした。４〜５日後に、それぞれの形質転換コロニーを採集し、上記の液体培地で３７℃で２日間増殖させた。次いで、この培養体のアリコートを用いて、グルコース２％を含有するＹＮＢ培地を有する新鮮なバイアルに接種した。選択培地で更に７回継代した後、発現ベクターは、酵母ゲノムに多量体の形態で組み込まれた。次いで、非選択液体培地（ＹＰＤ、グルコース２％、酵母抽出物１０ｇおよびペプトン２０ｇ）３ml中で更に２回培養することによって、有糸分裂的に安定した形質転換体が得られた。遺伝的に均質な組換え株を得るために、最後の安定化培養からのアリコートを選択プレートに塗布した。グルコースに代えてグリセリン２％を含有するＹＮＢでのフィターゼ発現の分析のために、一つのコロニーを単離して、ｆｍｄプロモーターを抑制解除した。真菌コンセンサスフィターゼの精製は、実施例５に記載のとおり実施した。
【００７２】
実施例７
Aspergillus nigerでの真菌コンセンサス遺伝子ｆｃｐおよびその変異体の発現ｆｃｐ遺伝子のプラスミドpBsk-fcp、またはｆｃｐ遺伝子の変異体の対応するプラスミドを鋳型として用いて、この遺伝子の開始コドンの上流にBspHI部位、および停止コドンの下流にEcoRV部位を導入した。Expand（登録商標）という高忠実度（High Fidelity）ＰＣＲキット（Boehringer Mannheim, Mannheim, ドイツ国）を、下記のプライマーとともに用いた：
【００７３】
プライマーＡｓｐ−１：
【００７４】
【表２】
ｆｃｐおよびｆｃｐ７のクローニングのためのプライマーＡｓｐ−２：
【００７６】
【表３】
提供者が記載したとおりに、反応を実施した。ＰＣＲで増幅したｆｃｐ遺伝子は、プライマーAsp-1によって導入された新たなBspHIという部位を開始コドンに有しており、このため、第二のアミノ酸残基であるグリシンがセリンで置換されていた。次いで、ＤＮＡフラグメントをBspHIおよびEcoRVで消化し、Aspergillus nigerのグルコアミラーゼプロモーター（ｇｌａＡ）の下流のNcoI部位、およびAspergillus nidulansトリプトファンＣターミネーター（ｔｒｐＣ）の上流のEcoRV部位に連結させた（Mullaney et al., 1985）。このクローニング段階の後、遺伝子を配列決定して、ＰＣＲによって導入された可能性がある欠陥を検出した。得られた発現プラスミドは、欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書の実施例９に記載されたように、pGLACベクターに基本的に相当し、Neurospora crassaのオロチジン−５′−リン酸脱炭酸酵素遺伝子（ｐｙｒ４）を選別マーカーとして含有していた。Aspergillus nigerの形質転換、およびコンセンサスフィターゼ遺伝子の発現を、欧州特許公開第６８４ ３１３号明細書に記載されたとおりに実施した。真菌コンセンサスフィターゼを、実施例５に記載したとおりに精製した。
【００７８】
実施例８
真菌コンセンサスフィターゼの突然変異タンパク質の構築
A. niger、S. cerevisiaeまたはH. polymorphaにおける発現のための突然変異タンパク質を構築するために、真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子を含む対応する発現プラスミドを、位置指定突然変異誘発のための鋳型として用いた。突然変異は、Stratagene（La Jolla, CA, 米国）からの「quick exchange（登録商標）位置指定突然変異誘発キット」を用い、メーカーのプロトコルに従い、そして対応するプライマーを用いて導入した。実現したすべての突然変異、および対応するプライマーを表４に示した。望みの突然変異を有するクローンは、当業界に公知のＤＮＡ配列分析によって確認した。突然変異したフィターゼは、完全な遺伝子の配列決定によって確認した。
【００７９】
実施例９
コンセンサスフィターゼおよびその変異体のフィターゼ活性と最適温度の決定
フィターゼ活性は、基本的にはMitchellら（１９９７）が記載したとおりに決定した。活性は、フィチン酸０．５％（≒５mM）、酢酸ナトリウム２００mM、pH５．０を含有するアッセイ混合物中で測定した。３７℃で１５分のインキュベーション後、等量の１５％トリクロロ酢酸の添加によって反応を停止させた。放出されたリン酸塩は、アッセイ混合物１００μlをＨ2Ｏ ９００μl、ならびに０．６M Ｈ2ＳＯ4 １ml、アスコルビン酸２％およびモリブデン酸アンモニウム０．５％と混合することによって定量した。リン酸カリウムの標準溶液を参照として用いた。酵素活性１単位は、３７℃で毎分１μmolのリン酸塩を放出する酵素の量として定義した。タンパク質濃度は、Paceら（１９９５）に従って算出した２８０nmでの酵素の吸光係数を用いて決定した：真菌コンセンサスフィターゼ；１．１０１；真菌コンセンサスフィターゼ７；１．０６８。
【００８０】
pH最適曲線の場合は、精製した酵素を１０mM酢酸ナトリウム、pH５．０で希釈した。インキュベーションは、希釈したタンパク質のアリコートを、一連の異なる緩衝液（０．４Mグリシン／ＨＣｌ、pH２．５；０．４M酢酸／ＮａＯＨ、pH３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５；０．４Mイミダゾール／ＨＣｌ、pH６．０、６．５；０．４Mトリス／ＨＣｌ、pH７．０、７．５、８．０、８．５、９．０）中の等量の１％フィチン酸（≒１０mM）と混合することによって開始した。対照実験によって、混合段階によって、pHは僅かに影響されるにすぎないことが示された。インキュベーションは、上記のとおり、３７℃で１５分間実施した。
【００８１】
フィターゼの基質特異性を決定するため、アッセイ混合物中のフィチン酸を、５mM濃度のそれぞれのリン酸化合物と置き換えた。活性試験は、上記のとおり実施した。
【００８２】
最適温度を決定するため、酵素（１００μl）および基質溶液（１００μl）を、所与の温度で５分間プレインキュベーションした。基質溶液の酵素への添加によって、反応を開始させた。１５分のインキュベーションの後、トリクロロ酢酸で反応を停止させ、放出されたリン酸塩の量を測定した。
【００８３】
本来の真菌コンセンサスフィターゼの最適pHは、pH６．０〜６．５前後であった（７０U/mg）。Ｑ５０Ｔ突然変異の導入によって、最適pHは、pH６．０へと移動した（１３０U/mg）が、同じ位置でのロイシンとの置換により、pH５．５前後で最大活性が得られた（２１２U/mg）。Ｑ５０Ｇの交換では、pH６．０以上で活性の最適pHが得られた（図９を参照）。第５１位のチロシンをアスパラギンと交換したところ、pH５．０以下で活性の増大が得られた（図１０を参照）。特にＱ５０Ｌの突然変異によって、真菌コンセンサスフィターゼのフィチン酸に対する特異性が、劇的に増大した（図１１を参照）。
【００８４】
真菌コンセンサスフィターゼの最適温度（７０℃）は、コンセンサス配列を算出するのに用いた野生型フィターゼの最適温度（４５〜５５℃）より１５〜２５°高かった（表５および図８を参照）。
【００８５】
実施例１０
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による融点の決定
真菌コンセンサスフィターゼの展開温度を決定するために、Bruggerら（１９９７）が以前に発表したように示差走査熱量測定を行った。５０〜６０mg/mlの均質なフィターゼの溶液を試験に用いた。１０℃/分の一定した加熱速度を９０℃まで適用した。
【００８６】
測定した融点により、真菌コンセンサスフィターゼの野生型フィターゼと比較して、熱安定性が非常に改良されたことが明瞭に示された（表５および図１２を参照）。図１２は、真菌コンセンサスフィターゼ、およびその突然変異体Ｑ５０Ｌの融解プロフィールを示す。その共通する融点は、７８〜７９℃であると測定された。
【００８７】
参考文献
van den Burg, B., Vriend, G., Veltman, O.R., Venema & G., Eijsink, V.G.H. (1998), Engineering an enzyme to resist boiling （耐煮沸酵素の操作）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95, 2056-2060.
Akanuma, S., Yamagishi, A., Tanaka, N. & Oshima, T. (1998), Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution （B. subtilisの３−イソプロピルマレート脱水素酵素の熱安定性の実験的進化による連続的増大）, Prot. Sci. 7, 698-705.
Matthews, B.W. (1993), Structural and genetic analysis of protein stability （タンパク質の安定性の構造的および遺伝学的解析）, Annu. Rev. Biochem. 62, 139-160.
Serrano, L., Day, A.G. & Fersht, A.R. (1993), Step-wise mutation of barnase to binase. A procedure for engineering increased stability of proteins and an experimental analysis of the evolution of protein stability （バルナーゼからビナーゼへの段階的突然変異。タンパク質の安定性の上昇の操作と、タンパク質の安定性の進化の実験的解析とのための一手順）, J. Mol. Biol. 233, 305-312.
Matthews, B.W. (1987a), Genetic and structural analysis of the protein stability problem （タンパク質の安定性の問題の遺伝学的および構造的解析）,
Biochemistry 26, 6885-6888.
Sauer, R., Hehir, K., Stearman, R., Weiss, M., Jeitler-Nilsson, A., Suchanek, E. & Pabo, C. (1986), An engineered intersubunit disulfide enhances the stability and DNA binding of the N-terminal domain of λ-repressor（操作されたサブユニット間ジスルフィドは、λリプレッサーのＮ末端ドメインの安定性およびＤＮＡ結合を強化する）, Biochemistry 25, 5992-5999.
Margarit, I., Campagnoli, S., Frigerio, F., Grandi, G., Fillipis, V.D. & Fontana, A. (1992), Cumulative stabilizing effects of glycine to alanine substitutions in Bacillus subtilis neutral protease（Bacillus subtilis中性プロテアーゼにおけるグリシンからアラニンへの置換の累積的安定化作用）, Prot. Eng. 5, 543-550.
Matthews, B.W., Nicholson, H. & Becktel, W. (1987), Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding（折りたたまれていない状態のエントロピーを減少させる位置指定突然変異からの増大したタンパク質熱安定性）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 6663-6667.
Blaber, M., Lindstrom, J.D., Gassner, N., Xu, J., Heinz, D.W. & Matthews, B.W. (1993), Energetic cost and structural consequences of burying a hydroxyl group within the core of a protein determined from Ala->Ser and Val->Thr substitutions in T4 Lysozyme（Ｔ４リゾチームにおけるAla→SerおよびVal→Thr置換から決定された、タンパク質コア内のヒドロキシル基の埋設のエネルギーコストおよび構造的結果）, Biochemistry 32, 11363-11373.
Karpusas, M., Baase, W.A., Matsumura, M. & Matthews, B.W. (1989), Hydrophobic packing in T4 Lysozyme probed by cavity-filling mutants（キャビティ充填性突然変異体によって検証されたＴ４リゾチームにおける疎水性パッキング）, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 8237-8241.
Munoz, V. & Serrano, L. (1995), Helix design, prediction and stability（らせんのデザイン、予測および安定性）, Curr. Opin. Biotechnol. 6, 382-386.
Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. & Okada, H. (1993), Stabilization of xylanase by random mutagenesis（ランダム突然変異によるキシラナーゼの安定化）, FEBS Lett. 316, 123-127.
Risse, B., Stempfer, G., Rudolph, R., Schumacher, G. & Jaenicke, R. (1992), Characterization of the stability effect of point mutations of pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum: protection of the native state by modulating coenzyme binding and subunit interaction（Lactobacillus plantarumからのピルビン酸オキシダーゼの点突然変異の安定化作用の特徴：補酵素結合およびサブユニット相互作用の調節による未変性状態の保護）, Prot. Sci. 1, 1710-1718.
Imanaka, T., Shibazaki, M. & Takagi, M. (1986), A new way of enhancing the thermostability of proteases（プロテアーゼの熱安定性を増大させる新たな方法）, Nature 324, 695-697.
Pantoliano, M.W., Landner, R.C., Brian, P.N., Rollence, M.L., Wood, J.F. & Poulos, T.L. (1987), Protein engineering of subtilisin BPN': enhanced stabilization through the introduction of two cysteines to form a disulfide bond（ズブチリシンＢＰＮ’のタンパク質操作：ジスルフィド結合を形成するための２システインの導入による安定性の増大）, Biochemistry 26, 2077-2082.
Steipe, B., Schiller, B., Plueckthun, A. & Steinbach, S. (1994), Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain（配列統計学は、タンパク質のドメインでの安定化突然変異を確実に予測する）, J. Mol. Biol. 240, 188-192.
Mitchell, D.B., Vogel, K., Weimann, B.J., Pasamontes, L. & van Loon, A.P.G.M. (1997), The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila（ヒスチジン酸性ホスファターゼのフィターゼサブファミリー：真菌であるAspergillus terreusおよびMyceliophthora thermophilaからの２種類の新規フィターゼの遺伝子の単離）, Microbiology 143, 235-252.
van Loon, A.P.G.M., Simoes-Nunes, C., Wyss, M., Tomschy, A., Hug, D., Vogel, K. & Pasamontes, L. (1997), A heat resistant phytase of Aspergillus fumigatus with superior performance in animal experiments. Phytase optimization and natural variability（動物実験で優れた性能を有するAspergillus fumigatusの耐熱性フィターゼ。フィターゼの最適化および自然変異性）, In Proceedings book of the workshop on plant phytate and phytases, Kluwer Academic Press.
Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Tessier, M. & van Loon, A.P.G.M. (1997), Cloning, purification and characterization of a heat stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus（真菌であるAspergillus fumigatusからの熱安定性フィターゼのクローニング、精製および特徴）, Appl. Environ. Microbiol. 63, 1696-1700.
Pasamontes, L., Haiker, M., Henriquez-Huecas, M., Mitchell, D.B. & van Loon, A.P.G.M. (1997a), Cloning of the phytases from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus（Emericella nidulansおよび好熱性真菌Talaromyces thermophilusからのフィターゼのクローニング）, Biochim. Biophys. Acta 1353, 217-223.
Piddington, C.S., Houston, C.S., Paloheimo, M., Cantrell, M., Miettinen-Oinonen, A., Nevalainen, H. & Ramsbosek, J. (1993), The cloning and sequencing of the genes encoding phytase (phy) and pH 2.5-optimum acid phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori（Aspergillus niger var. awamoriからのフィターゼ（ｐｈｙ）、およびpH２．５が最適の酸性ホスファターゼ（ａｐｈ）をコードする遺伝子のクローニングと配列決定）, Gene 133, 55-62.
van Hartingsveldt, W., van Zeiji, C.M.F., Harteveld, G.M., Gouka, R.J., Suykerbuyk, M.E.G., Luiten, R.G.M., van Paridon, P.A., Selten, G.C.M., Veenstra, A.E., van Gorcom, R.F.M. & van den Hondel, C.A.M.J.J. (1993), Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger（Aspergillus nigerのフィターゼコード遺伝子（phyA）のクローニング、特徴および過剰発現）, Gene 127, 87-94.
Gerber, P. and Mueller, K. (1995), Moloc molecular modeling software（Moloc分子モデル化ソフトウエア）, J. Comput. Aided Mol. Des. 9, 251-268.
Van Etten, R.L. (1982), Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase（ヒト前立腺の酸性ホスファターゼ：ヒスチジンホスファターゼ）, Ann. NY Acad. Sci. 390, 27-50.
Cosgrove, D.J. (1980), Inositol phosphates - their chemistry, biochemistry and physiology: studies in organic chemistry, chapter 4（イノシトールリン酸−それらの化学、生化学および生理学：有機化学の研究、第４章）, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New York.
Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, O. (1984), A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX（ＶＡＸのための配列解析プログラムの包括的セット）, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Purvis, I.J., Bettany, A.J.E., Santiago, T.C., Coggins, J.R., Duncan, K., Eason, R. & Brown, A.J.P. (1987), The effieciency of folding of some proteins is increased by controlled rates of translation in vivo（ある種のタンパク質の折りたたみの効率は、in vivoにおける翻訳速度の制御によって上昇する）, J. Mol. Biol. 193, 413-417.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed（分子クローニング：研究室向けマニュアル、第２版）., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Janes, M., Meyhack, B., Zimmermann, W. & Hinnem, A. (1990), The influence of GAP promoter variants on hirudine production, average plasmid copy number and cell growth in Saccharomyces cerevisiae（Saccharomyces cerevisiaeにおけるヒルジン生産、平均プラスミドコピー数および細胞増殖に対するＧＡＰプロモーター変異体の影響）, Curr. Genet. 18, 97-103.
Hinnen, A., Hicks, J.B. & Fink, G.R. (1978), Transformation of yeast（酵母における形質転換）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,1929-1933.
Sheman, J.P., Finck, G.R. & Hicks, J.B. (1986), Laboratory course manual for methods in yeast genetics（酵母の遺伝学の方法のための研究室向けコースマニュアル）, Cold Spring Harbor University.
Gellissen, G., Piontek, M., Dahlems, U., Jenzelewski, V., Gavagan, J.E., DiCosimo, R., Anton, D.I. & Janowicz, Z.A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst : coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene（生物触媒としての組換えHansenulla polymorpha：ホウレンソウグリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）およびS. cerevisiaeのカタラーゼＴ（ＣＴＴ１遺伝子の同時発現）, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54.
Mullaney, E.J., Hamer, J.E., Roberti, K.A., Yelton, M.M. & Timberlake, W.E. (1985), Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans（Aspergillus nidulansからのｔｒｐＣ遺伝子の一次構造）, Mol. Gen. Genet. 199, 37-46.
Pace, N.C., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. (1985), How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein（タンパク質のモル吸収係数を測定かつ予測する方法。 Prot. Sci. 4, 2411-2423.
Brugger, R., Mascarello, F., Augem, S., van Loon, A.P.G.M. & Wyss, M. (1997), Thermal denaturation of fungal phytases and pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry（示差走査熱量測定によって調べた真菌フィターゼとpH２．５の酸性ホスファターゼの熱変性）, In Proceedings book on the workshop on plant phytate and phytase, Kluwer Academic Press.
【００８８】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図２】図１の続きであり、公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図３】図２の続きであり、公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図４】図３の続きであり、公知のほとんどすべての真菌フィターゼのアミノ酸配列のアラインメントからのコンセンサスフィターゼ配列の算出を示す。
【図５】真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列を示す。
【図６】図５の続きであり、真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列を示す。
【図７】図６の続きであり、真菌コンセンサスフィターゼ遺伝子（ｆｃｐ）と遺伝子構築のために合成したプライマーのＤＮＡ配列を示す。
【図８】コンセンサス配列を算出するのに用いた真菌コンセンサスフィターゼおよびその他のフィターゼの最適温度を示す。
【図９】真菌コンセンサスフィターゼならびに突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０ＧのｐＨ依存活性特性を示す。
【図１０】真菌コンセンサスフィターゼの突然変異体Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｌと比較した、突然変異体Ｑ５０ＬおよびＹ５１Ｎ、ならびにＱ５０ＴおよびＹ５１ＮのｐＨ依存活性特性を示す。
【図１１】真菌コンセンサスフィターゼならびにその突然変異体Ｑ５０Ｌ、Ｑ５０ＴおよびＱ５０Ｇの基質特異性を示す。
【図１２】真菌コンセンサスフィターゼおよびその突然変異体Ｑ５０Ｔの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示す。
Claims (2)
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質からなる真菌コンセンサスフィターゼ。
（ａ）配列番号３１に示したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３１に示したアミノ酸配列において、一ヶ所または数ヶ所の位置においてアミノ酸が欠失、付加、または、一つもしくは数個の他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵素活性の種類および特異的活性、熱安定性、ｐＨ安定性が有意に変えられていないタンパク質 - 請求項１記載の真菌コンセンサスフィターゼを含む、食品、飼料または医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97112688.3 | 1997-07-24 | ||
| EP97112688 | 1997-07-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11146791A JPH11146791A (ja) | 1999-06-02 |
| JP4177922B2 true JP4177922B2 (ja) | 2008-11-05 |
Family
ID=8227106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20906398A Expired - Lifetime JP4177922B2 (ja) | 1997-07-24 | 1998-07-24 | コンセンサスフィターゼ |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6153418A (ja) |
| EP (2) | EP0897985B1 (ja) |
| JP (1) | JP4177922B2 (ja) |
| KR (1) | KR100562603B1 (ja) |
| CN (2) | CN1526815A (ja) |
| BR (1) | BR9802576B1 (ja) |
| CA (1) | CA2238613C (ja) |
| DE (1) | DE69826944T2 (ja) |
| DK (1) | DK0897985T3 (ja) |
| ES (1) | ES2230639T3 (ja) |
| NO (1) | NO323106B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ330940A (ja) |
| TW (1) | TW577921B (ja) |
Families Citing this family (103)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6699704B1 (en) | 1994-04-25 | 2004-03-02 | Roche Vitamins Inc. | Heat tolerant phytases |
| CA2231948C (en) | 1997-03-25 | 2010-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified phytases |
| NZ330940A (en) | 1997-07-24 | 2000-02-28 | F | Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes |
| US7078035B2 (en) | 1997-08-13 | 2006-07-18 | Diversa Corporation | Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US6720014B1 (en) | 1997-08-13 | 2004-04-13 | Diversa Corporation | Phytase-containing foodstuffs and methods of making and using them |
| US6183740B1 (en) | 1997-08-13 | 2001-02-06 | Diversa Corporation | Recombinant bacterial phytases and uses thereof |
| US7432097B2 (en) | 1997-08-13 | 2008-10-07 | Verenium Corporation | Phytases, nucleic acids encoding them and methods of making and using them |
| US6855365B2 (en) | 1997-08-13 | 2005-02-15 | Diversa Corporation | Recombinant bacterial phytases and uses thereof |
| JP2002508942A (ja) * | 1998-03-23 | 2002-03-26 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 飼料調製物及び植物発現における熱安定性フィターゼ |
| KR20010042138A (ko) * | 1998-03-23 | 2001-05-25 | 피아 스타르 | 피타제 변이체 |
| US6514495B1 (en) | 1998-03-23 | 2003-02-04 | Novozymes A/S | Phytase varinats |
| US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| EP0969089A1 (en) * | 1998-06-29 | 2000-01-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Phytase formulation |
| US6610519B1 (en) | 1998-10-02 | 2003-08-26 | Novozymes A/S | Solid phytase composition stabilized with lactic acid provided by corn steep liquor |
| DE60030412T2 (de) * | 1999-01-22 | 2007-08-30 | Novozymes A/S | Verbesserte phytasen |
| US6720174B1 (en) | 1999-01-28 | 2004-04-13 | Novozymes A/S | Phytases |
| CN100347303C (zh) | 1999-03-31 | 2007-11-07 | 康乃尔研究基金会有限公司 | 具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶 |
| US6303766B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-10-16 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Soybean phytase and nucleic acid encoding the same |
| DE60036815T2 (de) | 1999-10-01 | 2008-07-31 | Novozymes A/S | Enzymgranulat |
| DK1092764T3 (da) | 1999-10-11 | 2010-04-26 | Dsm Ip Assets Bv | Kontinuerlig fermentering |
| US6841370B1 (en) | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| US6960462B2 (en) | 2000-02-08 | 2005-11-01 | Dsm Ip Assets B.V | Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed |
| US6855548B2 (en) | 2000-02-08 | 2005-02-15 | F. Hoffman-La Roche Ag | Use of acid-stable proteases in animal feed |
| DE10126970A1 (de) * | 2001-06-01 | 2002-12-05 | Krueger Gmbh & Co Kg | Phytasehaltige Zusammensetzung |
| CN1821412A (zh) | 2001-08-27 | 2006-08-23 | 辛根塔参与股份公司 | 自加工的植物及植物部分 |
| EP1438417B1 (en) * | 2001-10-26 | 2014-05-14 | Danisco US Inc. | Phytase enzymes, nucleic acid sequences encoding phytase enzymes and vectors and host cells incorporating same |
| EP1450627B1 (en) | 2001-10-31 | 2012-09-05 | Phytex, Llc | Use of phytase containing animal food |
| ES2282221T3 (es) | 2001-12-27 | 2007-10-16 | Georgia-Pacific France | Hoja de papel gofrada. |
| TW200305430A (en) | 2001-12-28 | 2003-11-01 | Syngenta Participations Ag | Thermotolerant phytase for animal feed |
| MY139056A (en) | 2001-12-28 | 2009-08-28 | Ab Enzymes Gmbh | Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed |
| ATE533839T1 (de) | 2002-02-08 | 2011-12-15 | Novozymes As | Phytasenvarianten |
| US7238378B2 (en) | 2002-02-08 | 2007-07-03 | Novozymes A/S | Phytase variants |
| DE10233047A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-26 | Amaxa Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Polypeptids und nach diesem Verfahren hergestelltes künstliches Protein |
| DE10233082A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-03-04 | Amaxa Gmbh | Fluoreszierendes Protein |
| US7309505B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve Aspergillus phytases |
| US20040063184A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| WO2004072221A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Novozymes A/S | Proteases |
| US20040253696A1 (en) | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| AU2004247802B2 (en) | 2003-06-19 | 2010-08-05 | Novozymes A/S | Proteases |
| EP1639107B1 (en) | 2003-06-19 | 2013-08-14 | Novozymes A/S | Improved proteases and methods for producing them |
| US7892808B2 (en) | 2003-10-10 | 2011-02-22 | Norozymes A/S | Protease variants |
| DE602005007182D1 (de) * | 2004-01-30 | 2008-07-10 | Basf Se | Stabilisierte phytase enthaltende granulate |
| RU2381813C2 (ru) | 2004-03-22 | 2010-02-20 | Зольвай Фармасьютиклз Гмбх | Пероральные фармацевтические композиции на основе продуктов, содержащих липазы, прежде всего панкреатин, и пав |
| ATE541034T1 (de) | 2004-06-21 | 2012-01-15 | Novozymes As | Nocardiopsis-proteasen |
| PL1804592T3 (pl) | 2004-09-27 | 2010-04-30 | Novozymes As | Granulki z enzymem |
| WO2006081841A1 (en) * | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Bic-Violex Sa | Razor handle having converging side surfaces |
| US7658922B2 (en) | 2005-06-24 | 2010-02-09 | Ab Enzymes Gmbh | Monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, methods and kits for detecting phytase |
| JP5140586B2 (ja) | 2005-07-29 | 2013-02-06 | アボット プロダクツ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 滅菌パンクレアチン粉末の製法 |
| US11266607B2 (en) | 2005-08-15 | 2022-03-08 | AbbVie Pharmaceuticals GmbH | Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores |
| US9198871B2 (en) | 2005-08-15 | 2015-12-01 | Abbott Products Gmbh | Delayed release pancreatin compositions |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| ES2531434T3 (es) | 2006-04-04 | 2015-03-16 | Novozymes A/S | Variantes de fitasa |
| US10072256B2 (en) | 2006-05-22 | 2018-09-11 | Abbott Products Gmbh | Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample |
| WO2007149699A2 (en) | 2006-06-21 | 2007-12-27 | Novozymes North America, Inc. | Desizing and scouring process |
| BRPI0714241A2 (pt) | 2006-07-13 | 2013-03-12 | Dsm Ip Assets Bv | uso de uma amilase bacteriana, mÉtodos para preparar uma composiÇço, para aumentar o produÇço de leite de animais da subfamÍlia bovinae, para aumentar a espessura de gordura no dorso de animais da sbufamÍlia bovinae, para aumenantar o ganho de peso e/ou proporÇço de conversço de raÇço de animais da subfamÍlia bovinae, e para melhorar a digestibilidade aparente e/ou desaparecimento de mÁteria seca de gÊneros alimentÍcios em animais da subfamÍlia bovinae, e, uso de uma amilase bacteriana, mÉtodos para preparar uma composiÇço, para aumentar o produÇço de leite de animais da subfamÍlia bovinae, para aumentar a espessura de gordura no dorso de animais da subfamÍlia bovinae, para aumentar o ganho de peso e/ou proporÇço de conversço de raÇço de animais da subfamÍlia bovinae, e para melhorar a digestibilidade aparente e/ou desaparecimento de matÉria seca de gÊneros alimenticÍcios em animais da subfamÍlia bovinae, e, composiÇço |
| EP2069486A2 (en) | 2006-08-03 | 2009-06-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| WO2008017659A1 (en) | 2006-08-07 | 2008-02-14 | Novozymes A/S | Enzyme granules for animal feed |
| WO2008017661A1 (en) | 2006-08-07 | 2008-02-14 | Novozymes A/S | Enzyme granules for animal feed |
| JP5643083B2 (ja) * | 2007-03-26 | 2014-12-17 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ハフニア・フィターゼ |
| ES2526646T3 (es) | 2007-04-09 | 2015-01-14 | Novozymes A/S | Tratamiento enzimático para el desengrasado de pieles y pellejos |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
| EP2116136A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | Novel phytases |
| US7561972B1 (en) | 2008-06-06 | 2009-07-14 | Dna Twopointo, Inc. | Synthetic nucleic acids for expression of encoded proteins |
| US8126653B2 (en) * | 2008-07-31 | 2012-02-28 | Dna Twopointo, Inc. | Synthetic nucleic acids for expression of encoded proteins |
| US8401798B2 (en) * | 2008-06-06 | 2013-03-19 | Dna Twopointo, Inc. | Systems and methods for constructing frequency lookup tables for expression systems |
| US7561973B1 (en) | 2008-07-31 | 2009-07-14 | Dna Twopointo, Inc. | Methods for determining properties that affect an expression property value of polynucleotides in an expression system |
| CN102083991A (zh) | 2008-06-23 | 2011-06-01 | 诺维信公司 | 生产发酵产物的方法 |
| BRPI0919314A2 (pt) | 2008-09-26 | 2015-08-11 | Novozymes As | Fitase, métodos para produzir um variante de fitase e um produto de fermentacao, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, e para o tratamento de proteínas vegetais, sequência isolada de ácidos nucleicos, construto de acido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, microorganismo transgênico, ou produtos, ou elementos destes, composição, processo para reduzir níveis de fitato em extrume de animal, e, uso da fitase. |
| WO2010094773A2 (en) | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Novozymes A/S | A brewing method |
| US8529608B2 (en) | 2009-04-28 | 2013-09-10 | Osteomed Llc | Bone plate with a transfixation screw hole |
| KR101817253B1 (ko) | 2009-05-21 | 2018-01-10 | 신젠타 파티서페이션즈 아게 | 피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법 |
| WO2011000924A1 (en) | 2009-07-03 | 2011-01-06 | Abbott Products Gmbh | Spray-dried amylase, pharmaceutical preparations comprising the same and use |
| CN102753680B (zh) | 2009-12-11 | 2015-05-13 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
| CA2794113A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Novozymes A/S | Thermostable phytase variants |
| US8889395B2 (en) | 2010-03-30 | 2014-11-18 | Novozymes A/S | Crystal metabolite recovery |
| US20130084358A1 (en) | 2010-06-11 | 2013-04-04 | Novozymes A/S | Method To Reduce Biogenic Amine Content in Food |
| WO2012025462A1 (en) | 2010-08-26 | 2012-03-01 | Dsm Ip Assets B.V. | Phytase in ready-to-drink soft drinks |
| CN109022518A (zh) | 2011-07-22 | 2018-12-18 | 诺维信北美公司 | 用于预处理纤维素材料和改进其水解的方法 |
| IN2014CN04408A (ja) | 2011-11-17 | 2015-09-04 | Dsm Ip Assets Bv | |
| US9951364B2 (en) | 2013-09-11 | 2018-04-24 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| EP2910640B1 (en) | 2014-02-25 | 2018-12-05 | Biopract GmbH | A method for improving substrate degradation in agricultural biogas plants |
| US10980249B2 (en) | 2014-06-27 | 2021-04-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for improving the nutritional value of animal feed |
| BR112017016718A2 (pt) | 2015-02-10 | 2018-06-19 | Dsm Ip Assets Bv | um método para melhorar a digestibilidade de ração e o desempenho de crescimento |
| JP6957797B2 (ja) | 2015-02-12 | 2021-11-02 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．Ｄｓｍ Ｉｐ Ａｓｓｅｔｓ Ｂ．Ｖ． | ウシ亜科動物における飼料消化率を向上させるための方法 |
| US10597645B2 (en) | 2015-12-22 | 2020-03-24 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
| EP3420078B1 (en) | 2016-02-23 | 2022-05-25 | Da Volterra | Beta-lactamase variants |
| US10988749B2 (en) | 2016-02-23 | 2021-04-27 | Da Volterra | Beta-lactamase variants |
| WO2019055455A1 (en) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Novozymes A/S | MIXTURES OF ENZYMES AND METHODS FOR IMPROVING THE NUTRITIONAL QUALITY OF ANIMAL FEED |
| EP3701037A1 (en) | 2017-10-23 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Processes for reducing lactic acid in a biofuel fermentation system |
| US11365403B2 (en) | 2017-10-25 | 2022-06-21 | Da Volterra | Beta-lactamase variants |
| BR112020024347A2 (pt) | 2018-05-31 | 2021-02-23 | Novozymes A/S | processos para aumentar o crescimento e a produtividade de levedura |
| BR112021004826A2 (pt) | 2018-09-17 | 2021-06-08 | Dsm Ip Assets B.V. | composições de ração animal e usos das mesmas |
| US20220015394A1 (en) | 2018-12-05 | 2022-01-20 | Novozymes A/S | Use of An Enzyme Granule |
| BR112021014873A2 (pt) | 2019-01-31 | 2021-10-05 | Novozymes A/S | Polipeptídeo, combinação de enzimas, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, e, processo de produção de um produto de fermentação |
| EP4009807A1 (en) | 2019-08-05 | 2022-06-15 | Novozymes A/S | Enzyme blends and processes for producing a high protein feed ingredient from a whole stillage byproduct |
| MX2022006438A (es) | 2019-12-16 | 2022-06-22 | Novozymes As | Procesos para obtener productos de fermentacion. |
| CN115605094A (zh) | 2020-05-15 | 2023-01-13 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司（Nl） | 用于改善动物饲料的营养价值的方法 |
| MX2023001397A (es) | 2020-08-13 | 2023-03-03 | Novozymes As | Variantes de fitasa y polinucleotidos que codifican las mismas. |
| WO2022175262A1 (en) | 2021-02-16 | 2022-08-25 | Dsm Ip Assets B.V. | Methods for reducing pathogenic e coli by selective feed additive intervention comprising enzymes such as muramidase |
| US20240123006A1 (en) | 2021-02-16 | 2024-04-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Methods of selectively promoting animal welfare through modulation of microbiome |
| MX2023009948A (es) | 2021-02-26 | 2023-09-04 | Dsm Ip Assets Bv | Un metodo para estimular la actividad de las carbohidrasas en los alimentos para animales. |
| KR20240124373A (ko) | 2021-12-23 | 2024-08-16 | 노보자임스 에이/에스 | 동물의 암모니아 배출을 감소시키는 방법 |
| WO2024047009A1 (en) | 2022-08-30 | 2024-03-07 | Dsm Ip Assets B.V. | Methods and uses for modifying gut flora in aquatic species |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1492060C3 (de) | 1965-09-08 | 1974-02-21 | Nordmark-Werke Gmbh, 2000 Hamburg | Verfahren zur Stabilisierung wäßriger Pepsinlösungen |
| DE3176491D1 (en) | 1980-03-05 | 1987-11-26 | Miles Lab | Pasteurized therapeutically active protein compositions |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| US5780292A (en) * | 1987-04-29 | 1998-07-14 | Alko Group Ltd. | Production of phytate degrading enzymes in trichoderma |
| ES2056799T3 (es) * | 1987-07-17 | 1994-10-16 | Rhein Biotech Ges Fur Biotechn | Moleculas de adn codante para las regiones de control fmdh y gen estructural para una proteina que tiene una actividad de fmdh y su uso. |
| UA27702C2 (uk) * | 1989-09-27 | 2000-10-16 | Гіст-Брокейдс Н.В. | Фрагмент геномної днк, що кодує фітазу aspergillus niger,фрагмент кднк, що кодує фітазу aspergillus niger, рекомбінантна плазмідна днк для експресії фітази в aspergillus (варіанти), штам aspergillus-продуцент фітази aspergillus (варіанти), спосіб одержання фітази, рекомбінанта фітаза aspergillus niger |
| CZ289014B6 (cs) * | 1989-09-27 | 2001-10-17 | Dsm N. V. | Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy |
| GB9006642D0 (en) | 1990-03-24 | 1990-05-23 | Gibson Timothy D | Enzyme stabilisation |
| IL104704A0 (en) * | 1992-02-13 | 1993-06-10 | Gist Brocades Nv | Stabilized aqueous liquid formulation of phytase |
| CA2141431A1 (en) * | 1992-07-31 | 1994-02-17 | Helena K. M. Nevalainen | Recombinant cells, dna constructs, vectors and methods for expressing phytate degrading enzymes in desired ratios |
| ATE244302T1 (de) | 1993-04-05 | 2003-07-15 | Aveve Nv | Phytate-hydrolyse und enzymatische zusammensetzung für die hydrolyse von phytat |
| DE69427911T2 (de) | 1993-06-21 | 2002-04-04 | Roche Diagnostics Corp., Indianapolis | Stabilisator für diagnostische reagentien |
| EP0684313B1 (en) * | 1994-04-25 | 2006-07-05 | DSM IP Assets B.V. | Polypeptides with phytase activity |
| US6358722B1 (en) | 1994-04-25 | 2002-03-19 | Roche Vitamins, Inc. | Heat tolerant phytases |
| US6291221B1 (en) | 1994-04-25 | 2001-09-18 | Roche Vitamins Inc. | Heat tolerant phytases |
| US5853973A (en) * | 1995-04-20 | 1998-12-29 | American Cyanamid Company | Structure based designed herbicide resistant products |
| ES2216027T3 (es) * | 1995-06-09 | 2004-10-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Produccion de carotenoides fermentativos. |
| MX9702146A (es) | 1995-07-28 | 1997-06-28 | Gist Brocades Bv | Preparaciones de enzimas estabilizadas con sal. |
| JP3143050B2 (ja) | 1995-08-31 | 2001-03-07 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 安定化されたグルコース６リン酸脱水素酵素 |
| CA2231948C (en) | 1997-03-25 | 2010-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified phytases |
| WO1998054980A2 (en) | 1997-06-04 | 1998-12-10 | Dsm N.V. | Carbohydrate-based enzyme granulates |
| NZ330940A (en) | 1997-07-24 | 2000-02-28 | F | Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes |
-
1998
- 1998-07-10 NZ NZ330940A patent/NZ330940A/en unknown
- 1998-07-14 TW TW087111377A patent/TW577921B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-07-15 DK DK98113176T patent/DK0897985T3/da active
- 1998-07-15 DE DE69826944T patent/DE69826944T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-15 EP EP98113176A patent/EP0897985B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-15 ES ES98113176T patent/ES2230639T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-15 EP EP20030024497 patent/EP1403377A1/en not_active Withdrawn
- 1998-07-21 CA CA2238613A patent/CA2238613C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-21 NO NO19983364A patent/NO323106B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-07-23 US US09/121,425 patent/US6153418A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-23 KR KR1019980029633A patent/KR100562603B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-07-23 CN CNA2004100043732A patent/CN1526815A/zh active Pending
- 1998-07-23 CN CNB981179495A patent/CN1163596C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-24 BR BRPI9802576-7A patent/BR9802576B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-07-24 JP JP20906398A patent/JP4177922B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-08-08 US US09/634,493 patent/US6579975B1/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-04-23 US US10/421,112 patent/US7052869B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-05-24 US US11/137,849 patent/USRE39649E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-03-28 US US11/392,781 patent/US20060172390A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW577921B (en) | 2004-03-01 |
| ES2230639T3 (es) | 2005-05-01 |
| US20060172390A1 (en) | 2006-08-03 |
| NO983364D0 (no) | 1998-07-21 |
| US7052869B2 (en) | 2006-05-30 |
| CN1526815A (zh) | 2004-09-08 |
| CA2238613C (en) | 2010-05-25 |
| US6579975B1 (en) | 2003-06-17 |
| EP1403377A1 (en) | 2004-03-31 |
| BR9802576B1 (pt) | 2011-04-19 |
| KR100562603B1 (ko) | 2006-05-25 |
| USRE39649E1 (en) | 2007-05-22 |
| DE69826944T2 (de) | 2005-03-10 |
| EP0897985B1 (en) | 2004-10-13 |
| US20030190677A1 (en) | 2003-10-09 |
| NO983364L (no) | 1999-01-25 |
| EP0897985A3 (en) | 1999-12-22 |
| BR9802576A (pt) | 2001-03-20 |
| KR19990014095A (ko) | 1999-02-25 |
| EP0897985A2 (en) | 1999-02-24 |
| DE69826944D1 (de) | 2004-11-18 |
| US6153418A (en) | 2000-11-28 |
| CA2238613A1 (en) | 1999-01-24 |
| NO323106B1 (no) | 2007-01-02 |
| NZ330940A (en) | 2000-02-28 |
| JPH11146791A (ja) | 1999-06-02 |
| CN1163596C (zh) | 2004-08-25 |
| DK0897985T3 (da) | 2005-01-17 |
| CN1208768A (zh) | 1999-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4177922B2 (ja) | コンセンサスフィターゼ | |
| EP1151088B1 (en) | Improved phytases | |
| KR100498206B1 (ko) | 변형된피테이즈 | |
| CA2319658C (en) | Continuous fermentation process | |
| EP0969089A1 (en) | Phytase formulation | |
| CA2667064C (en) | Clonation, expression and use of acid lysophospholipases | |
| CA2273408A1 (en) | Phytage formulation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040407 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040922 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20061130 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20061204 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070417 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070713 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080304 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20080321 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080604 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080609 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080704 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080707 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20080707 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080709 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080819 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080825 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110829 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110829 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120829 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130829 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |